Особенности протеолитического процессинга и субъединичной структуры адгезионного G-белоксопряженного рецептора CIRL тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Серова, Оксана Викторовна

• Серова, Оксана Викторовна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Серова, Оксана Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика адгезионных G-белоксопряженных рецепторов

1.1. Рецепторы иммунной системы

1.2. Кальций-независимые рецепторы латротоксина CIRL

1.3. Рецепторы CELSR/Flamingo

1.4. Рецепторы BAI

1.5 Другие адгезионные рецепторы

2. Особенности субъединичной структуры адгезионных GPCR

2.1. Протеолитический процессинг адгезионных GPCR в GPS-домене

2.2. Дополнительный протеолитический процессинг адгезионных GPCR, растворимые фрагменты рецепторов

2.3. GPS-подобные домены в других рецепторах

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности субъединичной структуры рецептора CIRL1

1.1. Диссоциация субъединиц рецептора CIRL1

1.2 Комплекс субъединиц р120/р85 CIRL1 на поверхности клеточной мембраны

1.3 Модель биосинтеза CIRL1

2. Идентификация белков в составе комплексов с рецептором CIRL1

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы

1.1. Реактивы

1.2 Штаммы Е. coli

1.3. Плазмидные конструкции

1.4. Антитела

1.5. Растворы

1.6. Культуральные среды

2. Методы

2.1. Процедуры, использованные при работе с бактериальными клетками

2.2 Методы, использованные при работе с ДНК

2.3. Общие процедуры, использованные при работе с белками

2.4. Процедуры, использованные при работе с эукариотическими клетками

2.5. Получение антител к р85-субъединице CIRL1 и приготовление иммуноаффинного сорбента

2.6. Аффинная хроматография

3. Оборудование

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности протеолитического процессинга и субъединичной структуры адгезионного G-белоксопряженного рецептора CIRL»

ВВЕДЕНИЕ

Передача сигнала в клетке - это часть сложной системы коммуникации, которая управляет основными клеточными процессами и координирует действия клетки. Возможность клеток корректно отвечать на изменения окружающей их среды является основой развития, репарации тканей, иммунитета и системы поддержания гомеостаза в целом. Способность клеток воспринимать внешние сигналы определяется специальным классом белковых молекул - рецепторами. Большое разнообразие типов и подтипов рецепторов обеспечивает широкий динамический диапазон физиологических ответов и высокую информационную емкость путей, передающих сигналы.

G-белоксопряженные рецепторы (G protein-coupled receptors, GPCRs) представляют одно из самых больших и наиболее разнообразных семейств трансмембранных белков, кодируемых геномом многоклеточных животных. Так у человека обнаружено более 800 различных генов, кодирующих G-белоксопряженные рецепторы, среди которых выделяют пять семейств (глутаматные, родопсиновые, адгезионные, Frizzled/taste2 и секретиновые). GPCRs участвуют в передаче сигналов внутрь клетки в ответ на воздействие разнообразных внеклеточных стимулов, включающих физические стимулы (свет, запахи, тепло), химические сигналы в виде ионов (Са2+, Н+), нейромедиаторов (дофамин, норадреналин, адреналин, ацетилхолин, нуклеотиды), пептидов и белковых гормонов (хемокины или опиаты), липидов и эйкозаноидов (сфинголипиды или лейкотриены).

GPCRs опосредуют большое количество физиологических процессов в

эукариотических организмах, нарушение работы этих рецепторов приводит к

возникновению множества различных заболеваний. Около 40 %

фармацевтических препаратов, выпускаемых на рынке, использует в качестве

4

мишеней G-белоксопряженные рецепторы. При этом терапевтическими мишенями являются чуть меньше пятидесяти различных GPCRs, что составляет всего около 5 % от всех известных G-белоксопряженных рецепторов.

В геномах млекопитающих, насекомых и червей было обнаружено около тридцати адгезионных G-белоксопряженных рецепторов, которые содержат GPS-домен [1]. В настоящее время функция большинства адгезионных G-белоксопряженных рецепторов остается невыясненной. Вышесказанное позволяет заключить, что исследование структуры и функций этих белков является актуальной проблемой современной физико-химической биологии.

Основной целью настоящей работы являлось исследование особенностей субъединичной структуры и протеолитического процессинга рецептора CIRL1. Нейрональный рецептор CIRL1 (the calcium-independent receptor of a-latrotoxin 1) является высокоаффинным рецептором природного нейротоксина - а-латротоксина, благодаря чему он и был открыт. Ранее проведенные исследования и пресинаптическая локализация рецептора указывают на его роль в регуляции нейросекреции. Этим определяется интерес к рецептору и интенсивные исследования, направленные на его структурно-функциональную характеристику.

CIRL1 принадлежит к семейству адгезионных G-белоксопряженных рецепторов. Для рецепторов данного семейства характерно наличие двухсубъединичной структуры, которая является результатом эндогенного протеолиза молекулы-предшественника. Образующиеся в результате протеолиза субъединицы рецептора, как предполагают, образуют нековалентно связанный комплекс на поверхности клетки. Однако для CIRL1 недавно была выдвинута гипотеза о независимой локализации субъединиц на

клеточной мембране. Согласно этой гипотезе субъединицы рецептора диссоциируют, но остаются мембраносвязанными. Таким образом, на данный момент актуальным является исследование особенностей субъединичной структуры CIRL1, а также поиск белков, взаимодействующих с рецептором.

В данной работе было показано, что на клеточной мембране рецептор CIRL1 присутствует, главным образом, в виде комплекса двух нековалентно связанных субъединиц р120 и р85. Было установлено, что часть субъединиц рецептора CIRL1 диссоциирует при физиологических условиях, в результате чего р120 секретируется во внеклеточную среду. Данная диссоциация происходит при участии мембрано-связанной протеазы, которая отщепляет N-концевой пептид р85-субъединицы в непосредственной близости от мембраны. В результате протеолиза р120-субъединица секретирует во внеклеточную среду в комплексе с коротким пептидным фрагментом р85. На физиологическую значимость данного явления указывает обнаружение растворимой формы рецептора CIRL1 как in vitro, так и in vivo.

Одним из подходов в изучении физиологической важности рецепторов является поиск их белковых партнеров в клетке. В данной работе был проведен детальный анализ белков, способных взаимодействовать с рецептором CIRL1. Для выделения белковых компонентов рецепторных комплексов была использована аффинная хроматография экстракта мембран мозга крыс на иммобилизованных а-латротоксине и антителах к цитоплазматической части рецептора CIRL1 с последующим масс-спектрометрическим анализом полученных препаратов. В дополнение к ранее известным партнерам рецепторов а-латротоксина был идентифицирован ряд белков, в числе которых структурные белки, внутриклеточные сигнальные белки, а также белки, участвующие в эндоцитозе и транспорте синаптических везикул. Их

анализ в совокупности позволяет предположить участие рецептора СШЫ в процессах эндоцитоза и передачи внутриклеточных сигналов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика адгезионных G-белоксопряженных рецепторов

G-белоксопряженные рецепторы (G protein-coupled receptors, GPCRs) представляют один из самых больших и наиболее разнообразных классов трансмембранных белков, кодируемых геномом многоклеточных животных. Первые представители данного класса были открыты благодаря способности регулировать активность G-белков - внутриклеточных трехсубъединичных ГТФаз. В результате активации рецепторов образуются их комплексы с G-белками, происходит обмен связанного ГДФ на ГТФ и диссоциация G-белков на а-субъединицу со связанным ГТФ и комплекс из Р- и у-субъединиц. В настоящее время доказано, что как а-субъединица, так и комплекс [Зу служат передатчиками сигналов, активируя или ингибируя ферменты и ионные каналы. После взаимодействия с эффектором происходит гидролиз связанного ГТФ и воссоединение а с |3у в трехсубъединичный комплекс со связанным ГДФ, способный вновь связываться с активированными рецепторами.

Одна молекула активированного рецептора способна в свою очередь активировать тысячи молекул G-белка, которые в свою очередь активируют ферменты или ионные каналы. Таким образом, сигнальный каскад, включающий G-белки, обладает уникальным свойством во много раз усиливать полученный клеткой сигнал. Поэтому не удивительно, что G-белоксопряженные рецепторы осуществляют ключевую функцию во многих внутриклеточных процессах. Данные рецепторы вовлечены в гормональную регуляцию клеточной активности: механической подвижности, секреции, скорости метаболизма.

Оказалось, что различные G-белоксопряженные рецепторы имеют существенную гомологию в последовательностях их семи трансмембранных сегментов. На основании множественного выравнивания этих структур в настоящее время выделены пять классов внутри данного суперсемейства (глутаматные, родопсиновые, адгезионные, Frizzled/taste2 и секретиновые) [2]. Лишь для небольшой доли известных G-белоксопряженных рецепторов напрямую доказано их взаимодействие с G-белками.

В конце прошлого века были открыты рецепторы с необычной структурой [3-5]. Они оказались существенно длиннее ранее известных G-белоксопряженных рецепторов, в основном за счет их протяженной N-концевой внеклеточной части. Уникальным примером является, в частности, так наываемый VLGR1 (very large G protein-coupled receptor - очень большой G-белоксопряженный рецептор). Наибольшая из его трех изоформ состоит из 6300 аминокислотных остатков, что составляет около 700 кДа [6]. На данные момент такие рецепторы выделены в отдельный класс G-белоксопряженных рецепторов, так называемые адгезионные G-белоксопряженные рецепторы [7].

Систематический анализ последовательностей белков, кодируемых человеческим геномом, выявил наличие по крайней мере тридцати адгезионных G-белоксопряженных рецепторов с высокой гомологией последовательностей их трансмембранных сегментов (рис. 1). Филогенетический анализ трансмембранных последовательностей данных рецепторов показал, что они образуют шесть кластеров [8]. В состав отдельных кластеров входят минисемейства высокогомологичных белков, сходных не только по трансмембранным сегментам, но и по доменной структуре их протяженной N-концевой внеклеточной части. Примерами таких

минисемейств являются рецепторы CIRL1-3 (обозначены на схеме как LEC1, LEC2 и LEC3), рецепторы BAI1-3, EMR1-4 и CELSR1-3.

Рис. 1. Филогенетический анализ адгезионных G белоксопряженных рецепторов человека по их трансмембранным сегментам [8].

Помимо серии и треонин-богатых доменов, присутствующих во внеклеточной части всех рецепторов, на схеме указаны внеклеточные домены характерные для отдельных рецепторов: GPS (GPCR proteolysis site), EGF (эпидермальный фактор роста), HBD (гормон-связывающий домен), Ig (иммуноглобулиновый), SEA (мотив белка спермы, энтерокиназы и агрина), РТХ (пентраксин), TS (тромбоспондин), Olf (олфактомедин), GBL (галактозо-связывающий лектин), Cad (кадгерин), Lam (ламинин), и LRR (лейцин-богатый повтор).

Анализ аминокислотных последовательностей адгезионных в-белоксопряженных рецепторов выявил наличие в их Ы-концевой внеклеточной части разнообразных структурных доменов, характерных для белков клеточной адгезии (рис. 2).

Рис. 2. Семейство адгезионных вРСЯ - доменная структура [2].

Таким образом, данные рецепторы представляют собой природные гибриды двух классов беков - сигнальных рецепторов и молекул клеточной адгезии. В связи с этим, логично предположить, что физиологическая роль данных рецепторов заключается в активации внутриклеточного сигнального каскада прямыми межклеточными контактами. Известно, что сходную роль

имеют рецептор-подобные тирозинкиназы и тирозинфосфатазы, регулирующие в частности подвижность и пролиферацию клеток в зависимости от их окружения. В отличие от них, гибридные G-белоксопряженные рецепторы, могли бы выполнять более тонкую регуляторную функцию, поскольку они имеют большую чувствительность к сигналам и вызывают очень быстрый клеточный ответ.

Примечательно, что адгезионные GPCR имеют восьмой сегмент гомологии. Этот цистеин-богатый мотив, получивший название GPS, находится в их N-концевой внеклеточной части, в непосредственной близости от первого трансмембранного сегмента. В результате исследований установлено, что наличие GPS-домена определяет эндогенный протеолитический процессинг адгезионных GPCR. Вследствие протеолиза в GPS-домене, рецептор расщепляется на две субъединицы, образующие прочный нековалентный комплекс на поверхности клетки.

В отличие от млекопитающих (рис. 1), в геноме дрозофилы и нематоды присутствует всего лишь два гена, кодирующие длинные гибридные рецепторы с GPS-доменом. Интересно, что наличие одного GPS-содержащего рецептора обнаружено в геноме Monosiga brevicollis, одноклеточного организма, принадлежащего к классу хуанофлагеллят [9]. В расшифрованных геномах бактерий и дрожжей генов GPS-содержащих рецепторов обнаружено не было.

Предметом настоящего обзора является подробное рассмотрение структуры и функции охарактеризованных гибридных рецепторов с GPS-доменом, а также обсуждение имеющихся в настоящее время данных о протеолитическом процессинге GPS-содержащих рецепторов.

1.1. Рецепторы иммунной системы

Первыми обнаруженными представителями семейства адгезионных G-белоксопряженных рецепторов были рецепторы EGF-TM7 [3-5,10]. В настоящее время к этому подсемейству можно отнести пять охарактеризованных рецепторов: CD97, EMRl(F4/80), EMR2, EMR3 и EMR4. Отличительной характеристикой данных рецепторов является наличие в их N-концевой внеклеточной части EGF-доменов (epidermal growth factor; доменов, подобных эпидермальному фактору роста), характерных для рецепторов клеточной поверхности, участвующих в различных физиологических процессах, включающих коагуляцию крови, фибринолиз и клеточную адгезию.

Анализ экспрессии в различных тканях показал, что данные рецепторы экспрессируются главным образом клетками иммунной системы [11]. CD97 экспрессируется в широком спектре кровяных клеток, включая активированные лейкоциты, гранулоциты, моноциты, макрофаги и дендритные клетки [12-14]. Данный рецептор также присутствует в гладких мышцах и злокачественных клетках различных эпителиальных опухолей [1418], в то время как экспрессия EMR рецепторов ограничена клетками костного мозга [19].

Для CD97, EMR1 и EMR2 рецепторов характерно наличие различных изоформ, отличающихся количеством EGF-повторов, что является результатом альтернативного сплайсинга [4, 20, 21]. CD97 и EMR2 экспрессируются в виде трех изоформ, содержащих три (1-2-5), четыре (1-2-3-5) или пять (1-2-3-4-5) EGF-доменов. Внеклеточная часть этих рецепторов содержит сайты связывания клеточных лигандов. Так было показано, что EGF-домены 1 и 2 CD97 связываются с антигеном CD55, также именуемым DAF (decay acceleration factor) - фактором ускорения распада комплемента [22]. Причем самой высокой

аффинностью к CD55 обладает изоформа CD97(l-2-5), а самой низкой - CD97(1-

2-3-4-5) [23, 24]. Интересно, что EMR2 не связывает CD55, хотя первые два EGF-домена этого рецептора отличаются от первых двух EGF-доменов CD97 всего тремя аминокислотными остатками [24, 25].

Другим обнаруженным лигандом является гликозаминогликан хондроитинсульфат. Известно, что гликозаминогликаны, присутствующие во внеклеточном матриксе, вовлечены в такие биологические процессы, как клеточная адгезия, пролиферация, репарация тканей и иммунный ответ. Хондроитинсульфат взаимодействует с четвертым EGF-доменом, который присутствует только в самых больших изоформах CD97(l-2-3-4-5) и EMR2(l-2-

3-4-5) [26, 27]. Кроме того было показано взаимодействие CD97 с интегрином сс5(31 [28]. В случае остальных рецепторов клеточные лиганды не были найдены, однако установлена их локализация. Лиганд рецептора EMR3 был обнаружен на поверхности макрофагов и активированных нейтрофилов [29], а лиганд EMR4 - на поверхности клеточной линии В-лимфомы, А20 [30].

Повышенная экспрессия CD97 и EMR2, наблюдаемая в различных очагах воспаления [20, 31-33] свидетельствует о роли этих рецепторов в защитном и деструктивном иммунных ответах. Было показано, что CD97, связываясь с CD55, стимулирует активацию CD4+ Т-клеток. Данная активация приводит к пролиферации Т-клеток, секреции цитокина IL-10 и повышенной экспрессии маркеров активации [34]. Исследование in vivo с использованием моноклональных антител против CD97 позволило сделать вывод об участии данного рецептора в регуляции миграции нейтрофилов в процессе защитной реакции [35-37], также предполагается, что данный рецептор участвует в процессе ангиогенеза [28]. Физиологическая функция EMR1 рецептора оставалась неясной, до тех пор пока не были получены мыши, нокаутные по

этому гену. Было установлено, что ЕМИ1 играет важную роль в развитии периферической иммунологической толерантности [38].

1.2. Кальций-независимые рецепторы латротоксина СШЬ

Семейство СШЬ состоит из трех высокогомологичных белков, один из которых служит высокоаффинным рецептором природного нейротоксина ос-латротоксина, благодаря которому и был открыт [39].

Латротоксин является пресинаптическим токсином, вызывающим массовый выброс нейромедиаторов путем стимуляции экзоцитоза синаптических везикул [40-42]. Латротоксин стимулирует выброс различных нейромедиаторов, в том числе ацетилхолина, глютамата, ГАМК и др. Более того, латротоксин стимулирует экзоцитоз в секреторных клетках, таких как хромафинные и панкреатические клетки [43-45].

В результате связывания токсина с мембранными рецепторами, его молекулы частично погружаются в мембрану и образуют катион-селективные поры, что объясняет большинство эффектов латроксина на клетку, включая стимуляцию секреции и цитотоксичность [46]. В то же время ряд экспериментов указывает на то, что действие латротоксина возможно в условиях, когда ионные потоки контролируются и повышения кальция внутри клетки не наблюдается [47-49]. В частности было предложено, что латротоксин может частично перемещатся через цитоплазматическую мембрану и, за счет внутриклеточных взаимодействий, активировать гипотетический эффектор, сопряженный с аппаратом экзоцитоза [50].

Несмотря на то, что детальный механизм действия латротоксина остается предметом дискуссии, не вызывает сомнений тот факт, что его рецепторы, присутствующие в нервных тканях в относительно низких

концентрациях, являются маркерами зон экзоцитоза и каким-то образом вовлечены в регуляцию нейросекреции. Этим определяется интерес к рецепторам латротоксина и интенсивные исследования направленные на их идентификацию и структурно-функциональную характеристику [51].

Клонирование кДНК белка CIRL привело к открытию нового нейронального рецептора, члена семейства адгезионных G-белоксопряженных рецепторов [52, 53]. CIRL состоит из двух, не связанных ковалентно, субъединиц (р120 и р85). Субъединица р120 является гидрофильным белком, ориентированным во внеклеточное пространство, а р85 - интегральный мембранный белок с семью трансмембранными сегментами. Обе субъединицы данного рецептора кодируются одним геном, и двухсубъединичная структура CIRL является результатом эндогенного протеолиза белка-предшественника рецептора [52, 54]. В составе большой внеклеточной части CIRL идентифицированы домены, характерные для белков клеточной адгезии: лектиновый, олфактомединовый и муциновый. Таким образом, CIRL является представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии.

Оказалось, что CIRL (CIRL1) имеет два близких гомолога в геномах млекопитающих, CIRL2 и CIRL3. В настоящее время установлены структуры трех рецепторов CIRL из крысы [55, 56], быка [57], мыши [58] и человека. Определение полной последовательности геномов нематоды и мухи позволило выявить наличие в них одного рецептора, родственному семейству CIRL в млекопитающих.

Анализ тканеспецифичного распределения мРНК рецепторов CIRL Нозерн-блоттингом показал, что CIRL-1 и CIRL-3 находятся преимущественно в

головном мозгу и других тканях нервной системы, в то время как СШЬ-2 обнаруживался практически во всех анализированных тканях [55-57].

Для рецептора СШЫ было показано взаимодействие с синаптотагмином и синтаксином [52]. Эндогенный лиганд СШЬ2 и СШЬЗ неизвестен, в то время как было обнаружено взаимодействие СШЫ с тенейрином2 и нейрексином. Тенейрин2 явлется клеточным рецептором и экспрессируется в мозге. СШЫ и тенейрин совместно выделяются из экстрактов мозга крысы. Совместное культивирование клеток, экспрессирующих СШЫ и клеток, экспрессирующих тенейрин2 приводит к образованию множественных межклеточных контактов. Было показано, что С-концевой фрагмент тенейрина вызывает приток ионов кальция внутрь клеток, экспрессирующих СШЫ [59]. Данный эффект был сопоставим с действием латротоксина на клетки, экспрессирующие СШЫ.

Нейрексин также как и СШЫ является нейрональным рецептором. Оба белка являются рецепторами а-латротоксина. Неожиданно было обнаружено взаимодействие между внеклеточными доменами СШЫ и нейрексином, которое регулируется альтернативным сплайсингом нейрексина [60]. Было показано, что СШЫ конкурирует с нейролигином-1 за связывание с нейрексином. Нейролигин-1 является известным лигандом нейрексина. Было показано также, что клетки, экспрессирующие СШЫ и нейрексин образуют межклеточные адгезионные комплексы. Таким образом, СШЫ, имеющий пресинаптическую локализацию, может образовывать комплексы с постсинаптическими белками тенейрином2 и нейрексином, участвуя в образовании синаптических контактов.

Также обнаружен класс белков, взаимодействующих с внутриклеточным С-концевым фрагментом рецепторов СШЬ. Это растворимые белки семейства РгоБАР/ЗЗТШР/БЬапк, принадлежащие к классу мультидоменных скаффолд-

белков с PDZ доменами [61-63]. Считается, что белки этого класса играют ключевую роль в образовании мультимолекулярных комплексов мембранных и цитоскелетных белков в синапсах. Их взаимодействие с CIRL, по всей видимости, определяет расположение рецепторов в зонах экзоцитоза. Кроме этого показано взаимодействие С-концевой части CIRL1 с адапторным белком TRIP8b, в связи с чем была выдвинута гипотеза о том, что TRIP8b, определяет специфичность транспорта CIRL1 с цитоплазматической мембраны в эндосомы, осуществляя таким образом регуляцию концентрации рецептора на поверхности клетки [64].

Возможно, что CIRL2 играет роль в развитии злокачественных опухолей груди. Было показано, что его ген находится в районе частой потери гетерозиготности хромосомы 1р31,1. Анализ различных клеточных линий опухолей груди показал, что наличие данного рецептора в них сильно варьируется - повышено в одних, уменьшено или отсутствует в других [65]. Также были получены данные об участии CIRL2 в процессе миграции эндотелиальных клеток при формировании сердца [66].

Было также предложено, что рецепторы CIRL участвуют в нейродегенерации. Анализ влияния ишемического инсульта на нейроны гиппокампа показал, что нейроны слоя CAI увеличивают экспрессию CIRL, в то время как в слое САЗ уровень экспрессии снижается [67]. Остается непонятным, являются ли данные эффекты непосредственным следствием ишемии или отражают общие некротические и апоптотические процессы в поврежденных нейронах.

1.3. Рецепторы CELSR/Flamingo

Генетические исследования белков, определяющих плоскостную поляризацию клеток и полярность тканей, позволили выявить сигнальные пути, регулирующие данные процессы [68]. Одним из ключевых генов, мутация которого приводит к разрушению полярности тканей в дрозофиле, является flamingo (fini), кодирующий адгезионный G-белоксопряженный рецептор [6971]. Внеклеточная часть данного рецептора содержит девять кадгериновых повторов, шесть EGF-подобных домена, три цистеин-богатых мотива и два ламинин повтора - модули, характерные для белков клеточной адгезии [72, 73]. Мутации гена flamingo в дрозофиле свидетельствуют о ключевой роли рецептора в установлении полярности ткани. В частности, было установлено, что в процессе развития сетчатки глаза и определения полярности клеток, рецептор вовлечен в два хорошо изученных сигнальных пути, контролируемых frizzled и Notch [74]. В нервной системе было показано, что рецептор Flamingo участвует в регуляции направления роста аксонов и формировании правильной сети синаптических контактов [75-78], а также в регуляции направления роста нейрональных дендритов [69, 79, 80].

Млекопитающие имеют три гомолога рецептора Flamingo, CELSR1, CELSR2 CELSR3. Анализ тканеспецифичной экспрессии показал, что данные рецепторы экспрессируются главным образом в головном мозге [73, 81-83]. Во время эмбрионального развития рецепторы CELSR экспрессируются дифференциально, причем их экспрессия находится под жесткой пространственной и временной регуляцией [83-85].

В экспериментах с мышами, мутантными по гену рецептора CELSR1, было показано, что CELSR1 регулирует плоскостную поляризацию клеток микроворсинок внутреннего уха [86]. Установлено, что рецепторы CELSR

играют важную роль в нейрональном развитии [85-87]. Мыши, нокаутные по гену CELSR3, умирали вскоре после рождения [87]. Кроме того, было показано, что рецепторы CELSR2 и CELSR3 регулируют направленный рост аксонов противоположным образом, рецептор CELSR2 стимулирует процесс, тогда как CELSR3 подавляет его [88].

Следует отметить, что лиганды/агонисты для рецепторов Flamingo/CELSR на данный момент неизвестны.

1.4. Рецепторы BAI

К подсемейству рецепторов BAI (brain angiogenesis inhibitor) относят три рецептора ВАН, BAI2 и BAI3. Рецепторы BAI характеризуются наличием ряда функциональных доменов как во внеклеточной, так и во внутриклеточной области. Внеклеточная часть рецепторов BAI содержит консервативный GPS-домен (GPCR proteolysis site), гормон-связывающий домен (hormone-binding domain, HBD), множественные сайты гликозилирования. Кроме этого во внеклеточной части присутствуют тромбосподиновые повторы типа 1. Известно, что данные домены регулируют анти-ангиогенную активность тромбосподина 1 [89]. ВАН содержит пять тромбосподиновых повторов, a BAI2 и BAI3 по четыре повтора. Характеристикой, уникальной для внеклеточной части BAI1, является наличие интегрин-связывающего Arg-Gly-Asp (RGD) мотива. На С-конце внутриклеточной части рецепторов присутствует консервативный Gln-Thr-Glu-Val (QTEV) мотив, который, как известно, взаимодействует с белками, содержащими PDZ-домены, которые вовлечены в такие функции как регулирование цитоскелета, транспорт и локализацию белков [90]. Кроме того, только ВАН содержит в своей внутриклеточной части пролин-богатую область, которая взаимодействует с белками, содержащими

SHS-домены (Src homology 3) и регулирует внутриклеточную передачу сигнала [91].

Большая часть mRNA рецептора ВАИ обнаружена в головном мозге. Клетками, экспрессирующими BAI1 являются главным образом нейроны [92] и макрофаги [93]. Рецепторы BAI2 и BAI3 кроме головного мозга обнаружены в сердце и спинном мозге, a BAI2 обнаружен также в скелетных мышцах [11]. Кроме того недавно было показано, что BAI3 экспрессируется в желудочно-кишечном тракте [94].

Множество экспериментальных данных свидетельствует о том, что BAI1 является регулятором ангиогенеза. В ранних работах была показана анти-ангиогенная активность синтетических пептидов, содержащих тромбосподиновые повторы 2-4 и 3-5 этого рецептора [95]. Также было показано, что BAI1 ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток, блокируя ау[В5-интегрин [96]. Позже было установлено, что ВАИ подвергается протеолитическому расщеплению в GPS-домене, в результате которого отщепляется внеклеточная часть рецептора, содержащая пять тромбоспондиновых повторов. Отщепляемый фрагмент, названный васкулостатином, способен ингибировать миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток in vitro, а также ангиогенез in vivo [97-99]. Кроме того пониженная экспрессия рецепторов BAI в клетках мозга наблюдалась при индуцированной ишемии [100-102]. Уменьшение экспрессии BAI и как следствие уменьшения ингибирующего ангиогенез действия, судя по всему, способствует образованию новых сосудов в поврежденных тканях мозга.

Исследования на макрофагах показали, что BAI1 специфично узнает фосфатидилсерин на поверхности апоптозных клеток [93]. Связывание фосфатидилсерина с тромбосподиновыми повторами ВАИ приводит к

активации внутриклеточного сигнального комплекса ELM0/Dockl80/Rac, регулирующего перестройку актинового цитоскелета при фагоцитозе, и последующему поглощению клетки-мишени фагоцитом. Недавно было показано высокоаффинное взаимодействие тромбосподиновых доменов BAI3 с белками Clql [103]. Clql представляют собой маленькие секретируемые белки, экспрессирующиеся в мозге. Известно четыре гомолога Clql - Clqll-4, для каждого из которых было показано взаимодействие с BAI3. Добавление Clql белков к культуре нейронов вызывало значительное уменьшение синаптической плотности. При одновременном добавлении Clql и фрагмента BAI3, содержащего тромбосподиновый повтор, уменьшения синаптической плотности не наблюдалось.

Сигнальные каскады, регулируемые рецепторами BAI, слабо охарактеризованы на данный момент. Большинство известных взаимодействий было показано только для BAI1. Было идентифицировано несколько белков, взаимодействующих с внутриклеточным С-концевым доменом BAI1. Первый из них, названный ВАР1 (BAI1 associated protein 1) является скаффолд-белком, содержащим набор PDZ доменов. ВАР1 принадлежит к семейству скаффолд-белков MAGUK (Membrane-associated guanylate kinase), которые обычно обнаруживаются в постсинаптической плотности нейрональных окончаний. ВАР1 связывается непосредственно с QTEV мотивом, локализованным на С-конце ВАН. Было обнаружено, что ВАР1 колокализуется с ВАН в местах межклеточных контактов и таким образом может определять локализацию BAI1 в синапсах [104].

Другой белок, взаимодействующий с С-концом BAI1 - BAIAP2 является гомологом IRS, субстрата инсулин-рецептор киназы [91]. Взаимодействие BAIAP2 с рецептором определяется наличием SH3 домена, связывающегося с

пролин-богатыми последовательностями BAU. BAIAP2 присутствует преимущественно в нейронах и способен взаимодействовать с mDial -эффектором RhoA белка, вовлеченного в клеточную подвижность и регуляцию цитоскелетных нитей напряжения [105]. В совокупности со способностью BAI1 активировать внутриклеточный сигнальный комплекс ELMO/Dockl80/Rac, данные исследования подкрепляют гипотезу о том, что BAI1 играет важную роль в регуляции цитоскелета.

Третьим BAI-взаимодействующим белком является ВАРЗ. Данный белок экспрессируется преимущественно в мозге, содержит два С2 домена и обладает гомологией с синаптотагмином и белком Muncl3 [106]. В белке ВАРЗ локализован участок, взаимодействующий с BAI1, это аминокислотные остатки с 569 по 882. Данная область гомологична функциональному домену Muncl3. Кроме того наличие С2 доменов, которые вовлечены в слияние пресинаптических везикул с мембраной, предполагает участие BAI1 в регуляции выброса нейромедиаторов.

Четвертым известным белоком, взаимодействующим с BAI1, является ВАР4. ВАР4 экспрессируется в мозге, где взаимодействует с фитаноил-СоА альфа-гидроксилазой [100]. Данный фермент подвержен мутациям при болезни Рефсума, связанной с нарушениями в метаболизме липидов, приводящими к серьезным поражениям нервной системы. Было высказано предположение, что взаимодействие ВАР4 с ВАН определяет нейрологические проявления болезни Рефсума [100]. Установлено, что ВАР4 специфично взаимодействует с С-концевым фрагментом только BAI1, но не с BAI2 и BAI3.

BAU связывается также еще с одним скаффолд белком, содержащим PDZ-домены, PSD95 (post synaptic density protein of 95 kDa) [107]. PSD-95 является

ключевым молекулярным компонентом синапсов, который регулирует локализацию многих рецепторов в нейронах.

Суммируя известные данные о белках, взаимодействующих с рецептором, можно предположить, что функция BAI1 помимо ингибирования ангиогенеза заключается в регуляции таких процессов, как внутриклеточная передача сигнала, клеточная адгезия, направленный рост аксонов и выброс нейромедиаторов [92].

Экспрессия BAI1 возможно регулирует злокачественное перерождение опухолей. Так BAI1 не был обнаружен в 28 клеточных линиях глиомы и в большинстве глиом [108]. Пониженная экспрессия ВАН по сравнению с нормальными тканями наблюдалась также в образцах легочной аденокарциномы, злокачественных новообразований желудка и толстой кишки [109-112]. Для BAI3 было показано приблизительно 50 % уменьшение экспрессии в клеточных линиях глиобластомы [113]. Кроме того при анализе геномов различных опухолевых клеток были выявлены множественные точечные мутации рецепторов BAI [114]. Соматические мутации BAI3 были обнаружены в 13 % клеток чешуйчатой легочной карценомы и 5 % легочной аденокарциномы, а соматические мутации BAI1 и BAI2 были в найдены в опухолях легких, молочных желез и яичников.

Было показано, что экзогенная экспрессия BAI1 ингибирует ангиогенез в опухолях и задерживает их рост [110, 115-118]. Такой же эффект на раковые клетки был продемонстрирован для отщепляемого внеклеточного фрагмента ВАН [97-99, 119]. Данные наблюдения открывают возможности для использования рецепторов BAI в генной терапии опухолей.

1.5 Другие адгезионные рецепторы

Самый высокий уровень экспрессии рецептора GPR116 (Ig-Hepta) был обнаружен в легких [120]. Иммуногистохимическим анализом установлено, что Ig-Hepta локализован на стенках альвеол. Помимо легких, данный рецептор присутствует также в небольших концентрациях в сердце и почках, где он обнаружен в интеркалирующих клетках дистальных канальцев. Тканевая и клеточная локализация рецептора позволила предположить, что он может играть роль в поддержании кислотно-щелочного баланса в легких и почках.

Ig-Hepta существует в виде гомодимера, субъединицы которого связаны между собой дисульфидными мостиками [120]. Во внеклеточной части рецептора присутствуют два иммуноглобулиновых повтора, GPS-домен, а также так называемый SEA-домен (впервые обнаруженный в белке спермы морского ежа).

Рецептор VLGR1 (very large G protein-coupled receptor - очень большой G белок-сопряженный рецептор) является уникально большим рецептором поверхности клетки. Белок экспрессируется в виде трех изоформ (VLGRla, b, с), самая длинная из которых VLGRlb состоит из 6307 аминокислот [6, 121]. Внеклеточный домен рецептора содержит множество повторов, похожих на регуляторные домены №+/Са2+-каналов, один мотив пентраксина и EAR-домен (epilepsy associated repeat, повтор связанный с эпилепсией). Наличие повторов кальций-обменного белка может также свидетельствовать о том, что он определяет кальций-зависимую агрегацию клеток [6].

Высокий уровень экспрессии VLGR1 наблюдается в центральной нервной системе в период ее развития. Было установлено, что VLGR1 участвует в развитии микроворсинок или стереоцилий на поверхности волосковых клеток внутреннего уха [122]. А мутации этого рецептора приводят к синдрому

Ушера 2-го типа, заболеванию, характеризующемуся абсолютной глухотой и слепотой [123].

Эндогенный лиганд VLGR1 не известен, но в то же время обнаружено взаимодействие рецептора с PDZ-содержащим скаффолд-белком, whirlin, мутации которого также являются причиной потери слуха [124] и миозином Vila [125]. Белок whirlin образует комплекс с VLGRlb, миозином Vila а также с трансмембранным белком USH2A, содержащим ламининовые, фибронектиновые и EGF повторы. При этом большие внеклеточные части USH2A и VLGRlb, как предполагается, являются важнейшими молекулярными компонентами волокон, посредством которых осуществляется взаимодействие между соседними стереоцилиями волосковых клеток внутреннего уха [122, 125, 126]. Кроме того было показано, что внеклеточные части USH2A и VLGRlb образуют похожие структуры, связывающие мембраны внутреннего сегмента и связующего отдела фоторецепторных клеток [127].

Другой большой гибридный рецептор ETL был обнаружен в результате поиска белков, участвующих в развитии кардиомиоцитов [128]. Данный рецептор содержит EGF-подобные модули во внеклеточной части, а также серин/треонин-богатый домен. ETL экспрессируется главным образом клетками гладких мышц. Причем экспрессия рецептора регулируется во время развития сердца, что предполагает важную роль ETL на стадии роста и развития сердечной мышцы [128]. Лиганды ETL и ассоциированные с ним белки остаются неизвестными.

Рецептор GPR56 экспрессируется в различных тканях, самые высокие концентрации обнаружены в мозге, щитовидной железе и сердце [129-131]. Была продемонстрирована роль GPR56 в развитии коры головного мозга человека [132, 133], мутации функциональных остатков рецептора вызывают

специфическое заболевание, известное как двусторонняя лобно-теменная полимикрогирия. Полимикрогирия - это порок развития головного мозга, характеризующийся наличием многочисленных мелких извилин и обычно проявляющийся умственной отсталостью. Было установлено, что лигандом GPR56 является коллаген III. У мышей, нокаутных по гену коллагена III, наблюдался такой же фенотип, как и у мышей с нокаутом GPR56 [134].

Рецептор GPR56 экспрессируется в высоких концентрациях в предшественниках нейрональных клеток и способен ингибировать миграцию этих клеток за счет связывания с Gai2/i3 белком и последующей активации Rho-зависимого сигнального пути [135]. Эти данные также предполагают важную роль рецептора в развитии центральной нервной системы.

С помощью биохимических и генетических исследований была показана роль GPR56 в регуляции клеточной адгезии. У мышей, нокаутных по GPR56, в мозжечковых гранулярных клетках наблюдалась пониженная адгезия к ламинину, ключевому компоненту базальной мембраны [136]. Кроме того было показано взаимодействие GPR56 с белками, участвующими в регуляции клеточной адгезии.

В клетках нейробластомы GPR56 взаимодействует с белком CD81, который способствует образованию комплекса GPR56-CD81-Gaq/u [137]. CD81 принадлежит к семейству тетраспанинов. Тетраспанины являются трансмембранными скаффолд-белками, взаимодействующими с другими белками клеточной поверхности, такими как интегрины, IgSF белки, протеогликаны, рецепторы факторов роста, мембраносвязанные факторы роста и другие тетраспанины. Данные белки играют важную роль в клеточной адгезии. Тетраспанины образуют на мембране мультимолекулярные комплексы, ассоциированные с внутриклеточными сигнальными белками, и

таким образом осуществляют передачу внешнего сигнала внутрь клетки [138, 139]. Кроме того, тетраспанины известны как белки, способные стимулировать или подавлять развитие злокачественных опухолей [139].

Также было показано взаимодействие N-концевой части рецептора GPR56 с трансглутаминазой 2 (TG2), основным сшивающим ферментом во внеклеточном матриксе [140]. Образование ковалентных связей между белками внеклеточного матрикса стабилизирует его и предотвращает деградацию белков протеазами. Была показана роль TG2 в миграции клеток и клеточной адгезии [141, 142]. Кроме того в экспериментах с мышами, нокаутными по гену трансглутаминазы 2, было показано, что этот белок способствует подавлению роста опухоли [143].

Рецептор GPR56 вовлечен в развитие рака, что согласуется с ролью рецептора в клеточной адгезии, а также с данными об участии взаимодействующих с рецептором белков, CD81 и TG2 в развитии или подавлении роста опухолей. В клеточных линиях меланомы наблюдалась пониженная экспрессия рецептора, повышенная экспрессия которого в этих клетках приводила к подавлению роста меланомы и метастазов [140], что свидетельствует об ингибирующей роли GPR56 в развитии рака. Однако в клетках глиобластомы была обнаружена повышенная, по сравнению с нормальными клетками, экспрессия GPR56 [131], что предполагает возможное участие рецептора в развитии рака на ранних стадиях.

Рецептор НЕ6 (human epididymis-specific protein 6 или GPR64) имеет высокоспецифичную локализацию в организме. Он обнаруживается только в эпидидимисе, на апикальной стороне эпителиальных клеток канальцев [144, 145]. Роль рецептора была установлена в экспериментах с нокаутными животными. Самцы мышей, нокаутных по рецептору НЕ6, оказались

бесплодными [146]. Исходя из фенотипа этих животных, была предположена роль рецептора в контроле водного баланса и реабсорбции жидкости.

Рецептор GPR124 изначально был охарактеризован как раковый эндотелиальный маркер 5 (tumor endothelial marker 5, ТЕМ5). GPR 124 экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток и был открыт как фактор, экспрессия которого повышена в эндотелиальных клетках некоторых злокачественных образований [147, 148]. В исследованиях in vitro была показана роль рецептора в регуляции выживания и роста эндотелиальных клеток [149, 150], а также в миграции этих клеток [151]. Недавно была показано, что в развивающейся центральной нервной системе GPR124 необходим для правильного развития кровеносных сосудов [152].

GPR124 взаимодействует с некоторыми гликозаминогликанами. Предполагается, что растворимая внеклеточная часть рецептора отделяется от поверхности клетки во время ангиогенеза и связывается с гликозаминогликанами, которые присутствуют во внеклеточном матриксе и на клеточной поверхности. Более того дальнейший протеолитический процессинг GPR56 металлопротеазой ММР-9 приводит к образованию субъединицы белка, которая опосредует выживание эндотелиальных клеток, связываясь с гликозаминогликанами и интегрином аУ|Зз [149].

В результате полной расшифровки структуры человеческого генома дополнительно были найдены ранее неизвестные адгезионные G-белоксопряженные рецепторы с GPS-доменом. Они получили названия GPR97, GPR110, GPR111, GPR112, GPR113, GPR114, GPR115, GPR123, GPR126, GPR128, GPR133, GPR144. В составе их внеклеточных N-концевых частей, помимо GPS, обнаружены серин/треонин богатые домены, иммуноглобулиновые повторы, домен пентраксина [8,153,154].

2. Особенности субъединичной структуры адгезионных GPCR

2.1. Протеолитический процессинг адгезионных GPCR в GPS-домене

Многочисленные экспериментальные данные указывают на то, что адгезионные GPCR расщепляются с образованием двух субъединиц, адгезионной (внеклеточной) и рецепторной (семитрансмембранной). Для некоторых рецепторов сайт расщепления точно установлен и находится на расстоянии около 20 а.о. от первого трансмембранного сегмента [20, 30, 54, 71, 128, 145, 155]. Этот сайт находится внутри консервативного мотива, содержащего четыре консеравативных остатка Cys и два консервативных Тгр, названного GPS-доменом (GPCR proteolysis site) (рис. 3). GPS-домен обнаружен во всех адгезионных GPCR, за исключением GPR123 [8]. Менее консервативные GPS-подобные домены были обнаружены также в других рецепторах, в полицистине-1, рецепторе suREJ3 [156,157].

Во всех гомологичных GPCR рецепторах, GPS домен расположен во внеклеточной части рецепторов, непосредственно примыкающей к первому трансмембранному сегменту. Множественное выравнивание GPS доменов разных рецепторов (рис. 3) выявило наличие следующих консервативных остатков: четыре цистеина, включая мотив СХС, и два триптофана. В других положениях предпочтительно наблюдаются малые, гидрофобные, либо ароматические остатки. В частности, короткий кластер гидрофобных остатков найден на С-конце мотива, после сайта расщепления. Самое простое описание GPS мотива - CX2WX6-16WX4CX10-22CXC.

Множественное выравнивание GPS доменов (рис. 3) свидетельствует о том, что остатки, непосредственно окружающие сайт расщепления, варьируются. N-концевой остаток сайта расщепления как правило незаряжен и

не является ароматическим, в то время как С-концевой остаток малого размера и гидрофильный.

i

GI C--W------------ - -G-W---GC-------- ------C-C-H---FAVLM

2239297 CSFWNYSERSML---- --GYWSTQGCRLVESNK- --THTTCACSHLTNFAVLM CIRL1 (RAT)

3766205 CSFWNYSERTMM---- - -GYWSTQGCKLVDTNK- --TRTTCACSHLTNFAILM CIRL2 (RAT)

3882981 CSFWSYSKRTMT---- --GYWSTQGCRLLTTNK- --THTTCSCNHLTNFAVLM CIRL3 (RAT)

12313916 CSFWNYSERTMM---- --GYWSTQGCKLVDTNK- --TRTTCACSHLTNFAILM LECTOMEDIN- -1 (HUMAN)

7662324 CSFWNYSERSML---- --GYWSTQGCRLVESNK- --THTTCACSHLTNFAVLM LECTOMEDIN- - 2 (HUMAN)

14149677 CSFWSYSKRTMT---- --GYWSTQGCRLLTTNK- --THTTCSCNHLTNFAVLM LECTOMEDIN- -3 (HUMAN)

14423362 CAFWNYS VDAMNN--- --GXWSTEGCELTHSND- --THTSCRCSHLTHFAILM ETL1 (MOUSE)

11560111 CAFWNYS VDDMNN--- - -GSWSSEGCELTYSND- --THTSCRCSHLTHFAILM ETL (RAT)

11545908 CAFWNYSPDTMN---- --GSWSSEGCELTYSNE- --THTSCRCNHLTHFAILM ETL (HUMAN)

753408 CVFWNHSLDTGGT--- --GGWSAKGCELLSRNR- --THVTCQCSHSASCAVLM G-TYPE RECEPTOR (MOUSE)

4469185 CVFWNHSLAVGGT--- --GGWSARGCELLSRNR- - -THVACQCSHTASFAVLM ORF (HUMAN)

2935597 CVFWEHGQN-GC---- --GHWATTGCSTIGTRD- --TMTSCDCTHLTHFAVLM GPCR (C •ELEGANS)

2495072 CVSWSTDVK-G----- --GRWTS FGCVILEAS E- --TYTICSCNQMANLAVIM EMR1 (HUMAN)

7305025 CVFWEHGQN-GC---- --GHWATTGCSTIGTRD- - - TSTICRCTHLSS FAVLM EMR2 (HUMAN)

13183149 CVYWKSTGQ-G----- --SQWSRDGCFLIHVNK- --SHTMCNCSHLSSFAVLM EMR3 (MOUSE)

15528829 CVHWEGSEE-G----- --GSWSTKGCSHVYTNN- --SYTICKCFHLSSFAVLM EMR4 (MOUSE)

5031733 CVFWDLGRNGGR---- --GGWSDNGCSVKDRRL- --NETICTCSHLTSFGVLL HE -6 (HUMAN)

15638633 CAFWKHDGSNG----- --GHWATSGCRILGNGN- --DSTTCQCNHLSSFAILV CD97 antigen (SUS SCROFA)

6226566 CAFWKSDSDRG----- --GHWATEVCQVLGSKN- --GSTTCQCSHLSSFTILM CD 9 7 (HUMAN)

61223769 CVSWNTDVED------ --GRWTPSGCEIVEASE- --THTVCSCNRMANLAIIM F4/80 (MOUSE)

5031725 CVFWVED PTLS S P--- --GHWSSAGCETVRRE-- --TQTSCFCNHLTYFAVLM GPCR-56 (HUMAN)

10719900 CILWDETDVPSSSAPPQLGPWSWRGCRTVPLDA- --LRTRCLCDRLSTFAILA BAI1 (HUMAN)

10719903 CASWDYSRADASS--- --GDWDTENCQTLETQA- --AHTRCQCQHLSTFAVLA BAI2 (HUMAN)

12643618 CVLWDDSKTNESL--- --GTWSTQGCKTVLTDA- --SHTKCLCDRLSTFAILA BAI3 (HUMAN)

1665821 CVFWNHSILV-SGT-- - -GGWSARGCEWFRNE- --SHVSCQCNHMTSFAVLM ORF (HUMAN)

3449298 CVQWDPPGLAEQH--- --GVWTARDCELVHRNG- --SHARCRCSRTGTFGVLM MEGF2 (HUMAN)

6681360 CVFWNHSILV-SGT-- - -GGWSARGCEWFRNE- --SHVSCQCNHMTSFAVLM MEGF3 (RAT)

5525078 CVFWNFSLANNT---- --GGWDS SGCTVEDDGRDNRDRVFCKCNHLTSFSILM IG-HEPTA (RAT)

13786140 CVQWDPPGPADQH--- --GMWTARDCELVHRNG- --SHARCRCSRTGTFGVLM RECEPTOR 3 (RAT)

9663052 CSWWDTED-------- --MKWSTSGCSLQSHNS- --THTVCACSHMTHFAVLM 110-R (H . CONTORTUS)

11359914 CAFLDFSS--GE---- --GVWSNHGCALTRGNL- --TYSVCRCTHLTNFAILM ORF (HUMAN)

7304025 CVFWNYID-------- --HAWSANGCSLESTNR- - -THSVCS CNHLTNFAI LM ORF (DROSOPHILA)

7494834 CVYWDLME-------- --SKWSTLGCTLIATSS- - -NSSQCSCTHLTSFAILM ORF (C. ELEGANS)

16549885 CVFWDFSH-------- --LQWNDAGCHLVNETQ- --DIVTCQCTHLTSFSILM ORF (HUMAN)

19882213 CLLWNQAAAS------ --WLSDSQFCKVIEETA- --DYVECACSHMSVYAVYA VLGR-1 (HUMAN)

1353653 CNFWNEDQ-------- --QEWDSTGCKVGPLSK- -PSTTHCLCNHLTGFFGSS REJ (STRONGYLOCENTROTUS)

5832705 CVRWNSFT-------- --NRWTRLGCQTEIPDF-1 QAILVNCSCTHISSYAVIV FMI (DROSOPHILA)

2627436 CQYFSESE-------- --KQWRTDGMVPLAETN- -ASRAVCRTRHLTAFAAGL PKD1 (TAKIFUGU RUBRIPES)

1176908 CYFYQKTS-------- --DVFNS EGMYPSDGQG- -MQFVNCSTDHLTMFSVGA ZK945.9 (C. ELEGANS)

1586345 CQYFSEED-------- --MVWRTEGLLPLEETS- -PRQAVCLTRHLTAFGASL POLYCYSTIN (HUMAN)

7499172 CVRFDEKS-------- --GTWTARGAALIGLNL- --THAACEYNRIGVFTMFV ORF (C. ELEGANS)

Рис. 3. Множественное выравнивание GPS-доменов адгезионных GPCR. Слева указан номер доступа последовательности в базе данных GenBank [54].

Таким образом, наличие GPS домена определяет новое семейство гибридных GPCR рецепторов с белками клеточной адгезии. В тоже время

следует отметить наличие GPS-подобных мотивов в нескольких других рецепторах (рис. 3, 6 последовательностей снизу), не являющихся GPCR.

GPS-процессинг отличается от обычного протеолитического процессинга фурин-подобными протеиназами не только характеристикой сайта расщепления, но также и тем, что он происходит на ранних стадиях биосинтеза либо в эндоплазматическом ретикулуме или в ранних компартментах Гольджи, еще до гликозилирования молекулы [20, 54,158]. Более того, из-за присутствия цис-протеолитического мотива в GPS-домене, была выдвинута гипотеза об автокаталитическом механизме GPS-протеолиза [159]. Для рецептора CD97 было показано влияние N-гликозилирования в GPS-домене на автопротеолиз рецептора [160].

Было установлено, что для протеолитического расщепления рецептора EMR2 в GPS-домене необходимо наличие целой внеклеточной части и всего 8 а.о. трансмембранной субъединицы. Так альтернативно сплайсированные изоформы EMR2 с укороченной внеклеточной частью не подвергались протеолизу, таким образом, было высказано предположение, что альтернативный сплайсинг может служить средством регулирования GPS-протеолиза [161].

2.2. Дополнительный протеолитический процессинг адгезионных GPCR, растворимые фрагменты рецепторов

В результате протеолиза в GPS-домене образуется комплекс из двух, не

связанных ковалентно субъединиц. Одна из которых мембраносвязанная, а

другая является гидрофильным белком, ориентированным наружу клетки. Для

некоторых рецепторов показано также наличие свободной N-концевой части

рецептора, не связанной с мембранной субъединицей. Так, в результате

32

протеолиза рецептора CD97 образуется растворимая субъединица CD97ct, которая обнаруживается в очагах воспаленния [20].

Протеолитический процессинг BAI1 приводит к отщеплению внеклеточной части рецептора, содержащей пять тромбоспондиновых повторов. Отщепляемый фрагмент, названный васкулостатином, способен ингибировать миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток in vitro, а также ангиогенез in vivo [97]. Недавние исследования выявили, что рецептор BAI1 подвергается вторичному протеолизу. В данном процессе фурин активирует металлопротеиназу 14, которая расщепляет внеклеточную часть рецептора, с образованием 40 кДа фрагмента, названного васкулостатином-40. Было показано, что этот фрагмент обладает значительной антиангиогенной активностью как in vitro, так и in vivo [90].

Помимо протеолиза в GPS-домене, Ig-Hepta расщепляется также в районе консервативного SEA мотива [155]. В результате отщепляется фрагмент массой 20 кДа, названный proEGF2. Данный фрагмент подвергается дальнейшему протеолитическому процессингу фурином, в результате чего образуется фрагмент, названный EGF2, который, как предполагается, участвует в клеточном сигналировании [162].

Дополнительному протеолизу подвергается лишь небольшая часть молекул рецепторов. Из чего можно заключить, что эти события являются строго контролируемыми, регуляторными процессами.

2.3. GPS-подобные домены в других рецепторах

GPS-подобный мотив был также обнаружен в полицистине-1. Это большой рецептор поверхности клетки, подверженный мутациям при полицистической почечной болезни [163, 164]. Этот рецептор, не являющийся

GPCR, вместе с несколькими гомологичными белками морского ежа suREJ3 [165] и другими рецепторами, содержит мотив, напоминающий GPS [156]. Хотя один из консервативных цистеинов и один из триптофанов GPS-мотива отсутствуют в этом небольшом семействе, в целом они существенно гомологичны GPS-содержащим G-белоксопряженным рецепторам. Более того, данные белки подвергаются внутриклеточному протеолизу в GPS-подобном домене и имеют двух-субъединичную структуру [157, 164, 166]. Для полицистина-1, также как и для EMR2 был предположен цис-автокаталитический механизм протеолиза, не исключающий участия других белков в ускорении или блокировании расщепления [167].

Подобно CIRL, мутации в GPS-подобной области полицистина-1 ингибируют внутриклеточное расщепление [164]. Кроме того, существование растворимой формы полицистина-1 свидетельствует о потенциальном внеклеточном протеолизе, который разделяет комплексы с двумя субъединицами. Таким образом, вероятно, что, несмотря на некоторую структурную разницу между мотивом GPS в G-белоксопряженных рецепторах и сходными мотивами в других рецепторах, они по существу определяют схожие механизмы протеолитического процессинга рецепторов, который является важным фактором, определяющим функционирование рецепторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности субъединичной структуры рецептора СИПЛ

СШЬ1 принадлежит к семейству адгезионных С-белоксопряженных рецепторов. Данные рецепторы являются природными гибридами двух классов белков - сигнальных рецепторов и молекул клеточной адгезии. Подобно другим членам семейства СИПЛ состоит из двух субъединиц -внеклеточной гидрофильной субъединицы р120, содержащей модули клеточной адгезии, и трансмембранной субъединицы р85, участвующей в передаче сигнала (рис. 4).

CIRL1

внешняя внутренняя

пм

Рис. 4. Схематичное изображение белка CIRL1. Здесь и далее ПМ - плазматическая мембрана.

Двухсубъединичная структура является результатом протеолитического расщепления молекулы предшественника. Установлено, что сайт протеолиза располагается внутри консервативного домена, в непосредственной близости от первого трансмембранного сегмента. Этот домен получил название GPS (G protein-coupled receptor Proteolysis Site) и был обнаружен у всех гомологичных адгезионных G-белоксопряженных рецепторов, за исключением GPR123. Сайт протеолиза является высоко консервативным: в положении Р 2 остаток His, в положении Р"1 остаток Leu, в положении P+1 - либо Ser, либо Thr. Кроме этого GPS-домен содержит четыре консервативных остатка Cys и два Тгр. На данный

момент не идентифицирована протеаза, осуществляющая гидролиз в СРБ-домене. СР5-протеолиз отличается от обычного посттрансляционного протеолитического процессинга фуриновыми протеазами тем, что проходит на ранних стадиях биосинтеза, в эндоплазматическом ретикулуме, до гликозилирования рецептора.

Большинство данных свидетельствует о том, что две субъединицы адгезионных С-белоксопряженных рецепторов образуют прочный нековалентный комплекс на поверхности клетки. Одним из доказательств этому является то, что внеклеточная гидрофильная субъединица обнаруживается в мембранной фракции, тогда как при экспрессии этой субъединицы как отдельного белка, она является растворимым секретируемым белком. Кроме того, обе субъединицы эффективно копреципитируются специфичными антителами после солюбилизации клеток детергентом.

Однако анализ экспрессии и внутриклеточного транспорта рецептора СШЫ с использованием антител, специфичных к отдельным субъединицам, указывает на то, то фрагменты СШЫ не полностью колокализованы на поверхности клетки. В связи с этим была выдвинута гипотеза о независимой локализации субъединиц СШЫ на клеточной мембране. Согласно этой гипотезе субъединицы рецептора диссоциируют, но остаются мембрано-связанными и ведут себя как независимые мембранные белки. Вместе с тем природа независимого расположения гидрофильной субъединицы р120 на плазматической мембране остается непонятной.

Для того чтобы согласовать выше изложенные противоположные наблюдения, мы исследовали возможность диссоциации двухсубъединичного комплекса СШЬ1 при физиологических условиях.

1.1. Диссоциация субъединиц рецептора CIRL1

В случае если происходит диссоциации субъединиц CIRL1, гидрофильная субъединица р120 должна секретироваться во внеклеточную среду. Для проверки возможности существования растворимой формы CIRL1 in vivo, водные экстракты мозга крыс были подвергнуты хроматографии на а-латротоксин-агарозе. Сорбированные белки элюировали и анализировали с использованием Вестерн-блоттинга с последующей окраской антителами к р120-субъединице. В качестве отрицательного контроля была использована хроматография на BSA-агарозе. Этот белок, подобно а-латротоксину, имеет гидрофобные домены и близкое значение pl. Значительное количество р120 было обнаружено только в элюатах с а-латротоксин-агарозы (рис. 5).

Рис. 5. Вестерн-блоттинг белков, выделенных из растворимого экстракта мозга крысы (LTx - на латротоксин-агарозе, BSA - на BSA-агарозе). Окрашивание антителами к р120-субъединице CIRL1. Слева указано anti-pi20 CtRLI положение белковых маркеров в геле.

Затем была проанализирована экспрессия растворимой и мембранной форм СШЬ1 и мутанта СШЬ1 Т/Р в трансфецированных СОБ-клетках. СШЫ Т/Р содержит точечную замену Т838 на Р в СРБ-домене рецептора, которая препятствует протеолитическому расщеплению молекулы предшественника. Ранее было показано, что эта мутация полностью блокирует протеолиз в СР5-домене рецептора, при этом полноразмерная мутантная форма рецептора на поверхности клетки отсутствует. В случае диссоциации субъединиц, р120-

субъединица мутантного рецептора не должна обнаруживаться во внеклеточной среде.

Для преципитации внеклеточных белков среду, на которой росли трансфецированные клетки, отбирали и подвергали хроматографии на а-латротоксин-агарозе. Сорбированные белки анализировали с использованием Вестерн-блоттинга с последующей окраской антителами к р120 субъединице СШЫ. Значительное количество растворимого р120 было обнаружено в среде клеток, экспрессирующих рецептор дикого типа. Однако даже большее количество р120 присутствовало в среде клеток, экспрессирующих мутантную форму рецептора (рис. 6, левая панель), что контрастировало с данными об отсутствии полноразмерной мутантной формы СШЬ1 Т/Р на поверхности клетки.

170 — 13095 — 72 —

Рис. 6. Вестерн-блоттинг лизатов клеток (средняя и правая панель) и белков, преципитированных из внеклеточной среды (левая панель). К нетрансфецированные клетки, \¥Т - клетки, экспрессирующие С1ШЛ, Т/Р - клетки, экспрессирующие СШЫ Т/Р. Снизу указаны антитела, которыми окрашены соответствующие блоты. Слева указано положение белковых маркеров в геле.

Дополнительно был проанализирован трафик растворимых делеционных мутантов СШЫ. Был экспрессирован белок есСШЬ, который представляет собой растворимый эктодомен рецептора СШЫ, состоящий из р120-субъединицы и небольшого Ы-концевого фрагмента р85, и содержит на С-

К Т/Р \лгг К Т/Р ДОТ К Т/Р \лгг

—

ап1»-р120 С1Ш_1 апй-р120 С1Ш_1 ап^-р85 С^И

конце Мус- и бхШз-таги (рис. 7А). Кроме того была получена похожая конструкция, содержащая точечную замену Т838 на Р в вРБ-домене белка (есСШЬ Т/Р).

ecCIRL

ecCIRL Т/Р

р120

р120

GPS

GPS Т/Р

внешняя т—г внутренняя

пм

170 130

95 72

ecCIRL ecCIRL т/р _.m ecCIRL ecCIRL т/р

а-р120 CIRL а-Мус

Рис. 7. А. Схематичное изображение делеционных конструкций есСШЬ и есСШЬ Т/Р.

Б. Вестерн-блоттинг белков, сорбированных из внеклеточной среды на ШвА-агарозе, окрашенных антителами к р120-субъединице СЖЫ и к Мус-тагу.

При экспрессии в COS-клетках оба белка секретировались во внеклеточную среду. Белки из внеклеточной среды сорбировали на WGA-агарозе (Wheat germ agglutinin). Данный сорбент используется для очистки гликозилированных белков. Связавшиеся белки элюировали буфером, содержащим 0.5 М Ы-ацетил-Б-глюкозамин и анализировали с использованием Вестерн-блоттинга. Белок ecCIRL успешно подвергался протеолизу в GPS-домене, тогда как ecCIRL Т/Р не расщеплялся совсем так же, как и полноразмерный белок, содержащий аналогичную мутацию в GPS домене (рис. 7Б). Следовательно, внутриклеточный протеолиз не является необходимым условием для секреции растворимой формы CIRL1.

Самым простым объяснением присутствия растворимой формы CIRL1 во внеклеточной среде могла бы быть диссоциация р120- и р85-субъединиц. Однако это не согласуется с обнаружением растворимой формы непротеолизируемого мутантного рецептора (рис. 6, левая панель). В связи с этим было выдвинуто предположение, что CIRL1 может дополнительно подвергаться протеолизу, приводящему к диссоциации комплекса р120/р85. Наиболее вероятным казалось предположение, что сайты первичного и вторичного протеолиза отличаются. И в том случае, если сайт вторичного протеолиза находится между сайтом первичного протеолиза и первым трансмембранным сегментом, мы должны детектировать отщепленный пептидный фрагмент, связанный с р120. Удалось обнаружить этот фрагмент, связанный с растворимой р120-субъединицей. Из внеклеточной среды COS-клеток, экспрессирующих CIRL1, на а-латротоксин-агарозе была выделена р120-субъединица, а затем полученный образец был проанализирован масс-спектрометрией. Был обнаружен пептид с m/z 1750.9 (рис. 8), что соответствует рассчитанной массе протонированного 15-ти членного пептида TNFAVLMAHREIYQG (1751.0), который мог образовываться в результате двухступенчатого протеолиза в GPS-домене, по связям L837-T838 и G852-R853.

Для того чтобы подтвердить физиологическую значимость наблюдаемого явления масс-спектрометрией был проанализирован растворимый фрагмент CIRH, выделенный из водного экстракта крысиного мозга. Был обнаружен пептид такой же массы, его последовательность была далее подтверждена MS/MS анализом (рис. 9).

Рис. 8. МАЬБЬТОР спектр пептида, выделенного совместно с р120-субъединицей из внеклеточной среды СОБ-клеток, экспрессирующих СИПЛ. В качестве внутренних стандартов были использованы ангиотензин ($1апс1аг1 I, М + Н+ 1297.5) и синтетический пептид (51апс1а11 II, М + Н+ 2752.3).

bions — 216.10 363.17 434.20 533.27 646.36 777.40 848.43 985.49 1141.59 1270.64 1383.72 1546.78 1674.84

H- TN F А V L M AH R E f Y QG-OH

y ions — 1648.83 1534.78 1387.72 1316.68 1217.61 1104.53 973.49 902.45 765.39 609.29 480.25 367.16 204.10 76.04

100

75 ■

о О С Я5 TS

с

3

-О <

ф

> 50

SS

ч

ее

25

Ь4

434.25

ЬЗ

363.11

уз 367.33

774.11 Ы32+

Ы2!*

692.27

: уб ;

765.53:

Ь5

533.38

Ь112* j

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Серова, Оксана Викторовна

выводы

1. Показано, что на клеточной мембране рецептор СШЬ1 присутствует, главным образом, в виде комплекса двух нековалентно связанных субъединиц р120 и р85.

2. Обнаружено, что малая часть комплексов рецептора С1ШЛ диссоциирует с поверхности клетки с образованием растворимого эктодомена рецептора, который представляет собой комплекс р120-субъединицы и короткого внеклеточного фрагмента р85-субъединицы

3. Показано, что диссоциация субъединиц рецептора является результатом вторичного протеолиза в СРБ-домене рецептора по связи, локализованной в области между сайтом первичного протеолиза и первым трансмембранным сегментом.

4. Проведен поиск белков, способных взаимодействовать с рецептором СЛИЛ. Идентифицирован ряд белков, в числе которых структурные белки, внутриклеточные сигнальные белки, а также белки, участвующие в эндоцитозе и транспорте синаптических везикул. Выдвинуто предположение об участии рецептора СПИЛ в процессах эндоцитоза и передачи внутриклеточных сигналов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Серова, Оксана Викторовна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Yona, S., et al., Adhesion-GPCRs: emerging roles for novel receptors. Trends Biochem Sci, 2008. 33(10): p. 491-500.

2. Lagerstrom, M.C. and H.B. Schioth, Structural diversity of G protein-coupled receptors and significance for drug discovery. Nat Rev Drug Discov, 2008. 7(4): p. 339-57.

3. van Lier, R.A., W. Eichler, and J. Hamann, Sevenspan transmembrane molecules: novel receptors involved in leukocyte adhesion. Immunol Lett, 1996. 54(2-3): p. 185-7.

4. McKnight, A.J. and S. Gordon, The EGF-TM7 family: unusual structures at the leukocyte surface.J Leukoc Biol, 1998. 63(3): p. 271-80.

5. McKnight, A.J. and S. Gordon, EGF-TM7: a novel subfamily of seven-transmembrane-region leukocyte cell-surface molecules. Immunol Today, 1996. 17(6): p. 283-7.

6. McMillan, D.R., et al., Very large G protein-coupled receptor-1, the largest known cell surface protein, is highly expressed in the developing central nervous system. J Biol Chem, 2002. 277(1): p. 785-92.

7. Fredriksson, R., et al., The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol, 2003. 63(6): p. 1256-72.

8. Fredriksson, R., et al., There exist at least 30 human G-protein-coupled receptors with long Ser/Thr-rich N-termini. Biochem Biophys Res Commun, 2003. 301(3): p. 725-34.

9. King, N., C.T. Hittinger, and S.B. Carroll, Evolution of key cell signaling and adhesion protein families predates animal origins. Science, 2003. 301(5631): p. 361-3.

10. Kwakkenbos, M.J., et al., The human EGF-TM7 family member EMR2 is a heterodimeric receptor expressed on myeloid cells. J Leukoc Biol, 2002. 71(5): p. 854-62.

11. Bjarnadottir, T.K., R. Fredriksson, and H.B. Schioth, The adhesion GPCRs: a unique family of G protein-coupled receptors with important roles in both central and peripheral tissues. Cell Mol Life Sci, 2007. 64(16): p. 2104-19.

12. Hamann, J., et al., Expression cloning and chromosomal mapping of the leukocyte activation antigen CD97, a new seven-span transmembrane molecule of the secretion receptor superfamily with an unusual extracellular domain. J Immunol, 1995.155(4): p. 1942-50.

13. Eichler, W., J. Hamann, and G. Aust, Expression characteristics of the human CD97 antigen. Tissue Antigens, 1997. 50(5): p. 429-38.

14. Jaspars, L.H., et al., Tissue distribution of the human CD97 EGF-TM7 receptor. Tissue Antigens, 2001. 57(4): p. 325-31.

15. Aust, G., et al., CD97: a dedifferentiation marker in human thyroid carcinomas. Cancer Res, 1997. 57(9): p. 1798-806.

16. Aust, G., et al., CD97, but not its closely related EGF-TM7 family member EMR2, is expressed on gastric, pancreatic, and esophageal carcinomas. Am J Clin Pathol, 2002.118(5): p. 699-707.

17. Steinert, M., et al., Expression and regulation of CD97 in colorectal carcinoma cell lines and tumor tissues. Am J Pathol, 2002.161(5): p. 1657-67.

18. Davies, J.Q., et al., Leukocyte adhesion-GPCR EMR2 is aberrantly expressed in human breast carcinomas and is associated with patient survival. Oncol Rep, 2011. 25(3): p. 619-27.

19. Kwakkenbos, M.J., et al., The EGF-TM7 family: a postgenomic view. Immunogenetics, 2004. 55(10): p. 655-66.

20. Gray, J.X., et al., CD97 is a processed, seven-transmembrane, heterodimeric receptor associated with inflammation. J Immunol, 1996.157(12): p. 5438-47.

21. Stacey, M., et al., LNB-TM7, a group of seven-transmembrane proteins related to family-B G-protein-coupled receptors. Trends Biochem Sei, 2000. 25(6): p. 2849.

22. Hamann, J., et al., The seven-span transmembrane receptor CD97 has a cellular ligand (CD55, DAF). J Exp Med, 1996.184(3): p. 1185-9.

23. Hamann, J., et al., Characterization of the CD55 (DAF)-binding site on the seven-span transmembrane receptor CD97. Eur J Immunol, 1998. 28(5): p. 1701-7.

24. Lin, H.H., et al., Molecular analysis of the epidermal growth factor-like short consensus repeat domain-mediated protein-protein interactions: dissection of the CD97-CD55 complex.} Biol Chem, 2001. 276(26): p. 24160-9.

25. Lin, H.H., et al., Human EMR2, a novel EGF-TM7 molecule on chromosome 19pl3.1, is closely related to CD97. Genomics, 2000. 67(2): p. 188-200.

26. Stacey, M., et al., The epidermal growth factor-like domains of the human EMR2 receptor mediate cell attachment through chondroitin sulfate glycosaminoglycans. Blood, 2003.102(8): p. 2916-24.

27. Kwakkenbos, M.J., et al., Expression of the largest CD97 and EMR2 isoforms on leukocytes facilitates a specific interaction with chondroitin sulfate on B cells. J Leukoc Biol, 2005. 77(1): p. 112-9.

28. Wang, T., et al., CD97, an adhesion receptor on inflammatory cells, stimulates angiogenesis through binding integrin counterreceptors on endothelial cells. Blood, 2005.105(7): p. 2836-44.

29. Stacey, M., et al., Human epidermal growth factor (EGF') module-containing mucin-like hormone receptor 3 is a new member of the EGF-TM7 family that recognizes a ligand on human macrophages and activated neutrophils. J Biol Chem, 2001. 276(22): p. 18863-70.

30. Stacey, M., et al., EMR4, a novel epidermal growth factor [EGFJ-TM7 molecule up-regulated in activated mouse macrophages, binds to a putative cellular ligand on B lymphoma cell line A20. J Biol Chem, 2002. 277(32): p. 29283-93.

31. Hamann, J., et al., Expression of the activation antigen CD97 and its ligand CD55 in rheumatoid synovial tissue. Arthritis Rheum, 1999. 42(4): p. 650-8.

32. Visser, L., et al., Expression of the EGF-TM7 receptor CD97 and its ligand CD55 [DAF] in multiple sclerosis. J Neuroimmunol, 2002.132(1-2): p. 156-63.

33. Kop, E.N., et al., Identification of the epidermal growth factor-TM7 receptor EMR2 and its ligand dermatan sulfate in rheumatoid synovial tissue. Arthritis Rheum, 2005. 52(2): p. 442-50.

34. Capasso, M., et al., Costimulation via CD55 on human CD4+ T cells mediated by CD97. J Immunol, 2006.177(2): p. 1070-7.

35. Leemans, J.C., et al., The epidermal growth factor-seven transmembrane (EGF-TM7) receptor CD97 is required for neutrophil migration and host defense. J Immunol, 2004.172(2): p. 1125-31.

36. Kop, E.N., et al., CD97 neutralisation increases resistance to collagen-induced arthritis in mice. Arthritis Res Ther, 2006. 8(5): p. R155.

37. van Pel, M., et al., Differential role of CD97 in interleukin-8-induced and granulocyte-colony stimulating factor-induced hematopoietic stem and progenitor cell mobilization. Haematologica, 2008. 93(4): p. 601-4.

38. Lin, H.H., et al., The macrophage F4/80 receptor is required for the induction of antigen-specific efferent regulatory T cells in peripheral tolerance. J Exp Med, 2005. 201(10): p. 1615-25.

39. Krasnoperov, V.G., et al., The calcium-independent receptor of alpha-latrotoxin is not a neurexin. Biochem Biophys Res Commun, 1996. 227(3): p. 868-75.

40. Gorio, A., L.L. Rubin, and A. Mauro, Double mode of action of black widow spider venom on frog neuromuscular junction. J Neurocytol, 1978. 7(2): p. 193-202.

41. Tzeng, M.C., R.S. Cohen, and P. Siekevitz, Release of neurotransmitters and depletion of synaptic vesicles in cerebral cortex slices by alpha-latrotoxin from black widow spider venom. Proc Natl Acad Sci USA, 1978. 75(8): p. 4016-20.

42. Tzeng, M.C. and P. Siekevitz, The effect of the purified major protein factor (alpha-latrotoxin) of black widow spider venom on the release of acetylcholine and norepinephrine from mouse cerebral cortex slices. Brain Res, 1978.139(1): p. 190-6.

43. Bittner, M.A., et al., A Ca2+-independent receptor for alpha-Iatrotoxin, CIRL, mediates effects on secretion via multiple mechanisms. J Neurosci, 1998. 18(8): p. 2914-22.

44. Lang, J., et al., Ca2+-independent insulin exocytosis induced by alpha-latrotoxin requires latrophilin, a G protein-coupled receptor. Embo J, 1998. 17(3): p. 64857.

45. Bittner, M.A. and R.W. Holz, Latrotoxin stimulates secretion in permeabilized cells by regulating an intracellular Ca2+ - and ATP-dependent event: a role for protein kinase C. J Biol Chem, 2000. 275(33): p. 25351-7.

46. Ushkaryov, Y.A., A. Rohou, and S. Sugita, alpha-Latrotoxin and its receptors. Handb Exp Pharmacol, 2008(184): p. 171-206.

47. Meldolesi, J., et al., The effect of alpha-latrotoxin on the neurosecretory PC12 cell line: studies on toxin binding and stimulation of transmitter release. Neuroscience, 1983.10(3): p. 997-1009.

48. Rosenthal, L., et al., Mode of action of alpha-latrotoxin: role of divalent cations in Ca2(+)-dependent and Ca2(+)-independent effects mediated by the toxin. Mol Pharmacol, 1990. 38(6): p. 917-23.

49. Capogna, M., B.H. Gahwiler, and S.M. Thompson, Calcium-independent actions of alpha-latrotoxin on spontaneous and evoked synaptic transmission in the hippocampus. J Neurophysiol, 1996. 76(5): p. 3149-58.

50. Khvotchev, M. and T.C. Sudhof, alpha-latrotoxin triggers transmitter release via direct insertion into the presynaptic plasma membrane. Embo J, 2000. 19(13): p. 3250-62.

51. Rosenthal, L. and J. Meldolesi, Alpha-latrotoxin and related toxins. Pharmacol Ther, 1989. 42(1): p. 115-34.

52. Krasnoperov, V.G., et al., alpha-Latrotoxin stimulates exocytosis by the interaction with a neuronal G-protein-coupled receptor. Neuron, 1997.18(6): p. 925-37.

53. Lelianova, V.G., et al., Alpha-latrotoxin receptor, latrophilin, is a novel member of the secretin family ofG protein-coupled receptors. J Biol Chem, 1997. 272(34): p. 21504-8.

54. Krasnoperov, V., et al., Post-translational proteolytic processing of the calcium-independent receptor of alpha-latrotoxin (CIRL), a natural chimera of the cell adhesion protein and the G protein-coupled receptor. Role of the G proteincoupled receptor proteolysis site (GPS) motif. J Biol Chem, 2002. 277(48): p. 46518-26.

55. Sugita, S., et al., alpha-Latrotoxin receptor CIRL/latrophilin 1 (CL1) defines an unusual family of ubiquitous G-protein-linked receptors. G-protein coupling not required for triggering exocytosis.J Biol Chem, 1998. 273(49): p. 32715-24.

56. Ichtchenko, K., et al., A novel ubiquitously expressed alpha-latrotoxin receptor is a member of the CIRL family of G-protein-coupled receptors. J Biol Chem, 1999. 274(9): p. 5491-8.

57. Matsushita, H., V.G. Lelianova, and Y.A. Ushkaryov, The latrophilin family: multiply spliced G protein-coupled receptors with differential tissue distribution. FEBS Lett, 1999. 443(3): p. 348-52.

58. Tobaben, S., T.C. Sudhof, and B. Stahl, Genetic analysis of alpha-latrotoxin receptors reveals functional interdependence of CIRL/latrophilin 1 and neurexin 1 alpha. J Biol Chem, 2002. 277(8): p. 6359-65.

59. Silva, J.P., et al., Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/teneurin-2 form a high-affmity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities. Proc Natl Acad Sci USA, 2011.108(29): p. 12113-8.

60. Boucard, A.A.,}. Ko, and T.C. Sudhof, High-affinity neurexin binding to the cell-adhesion G-protein coupled receptor CIRLl/Latrophilin-1 produces an intercellular adhesion complex. J Biol Chem, 2012.

61. Tobaben, S., T.C. Sudhof, and B. Stahl, The G protein-coupled receptor CL1 interacts directly with proteins of the Shank family. J Biol Chem, 2000. 275(46): p. 36204-10.

62. Kreienkamp, H.J., et al., The calcium-independent receptor for alpha-latrotoxin from human and rodent brains interacts with members of the ProSAP/SSTRIP/Shank family of multidomain proteins. J Biol Chem, 2000. 275(42): p. 32387-90.

63. Kreienkamp, H.J., et al., Interaction of G-protein-coupled receptors with synaptic scaffolding proteins. Biochem Soc Trans, 2002. 30(4): p. 464-8.

64. Popova, N.V., et al., Interaction of calcium-independent latrotoxin receptor with intracellular adapter protein TRIP8b. Dokl Biochem Biophys, 2007. 414: p. 149-51.

65. White, G.R., J.M. Varley, and J. Heighway, Isolation and characterization of a human homologue of the latrophilin gene from a region oflp31.1 implicated in breast cancer. Oncogene, 1998.17(26): p. 3513-9.

66. Doyle, S.E., et al., Latrophilin-2 is a novel component of the epithelialmesenchymal transition within the atrioventricular canal of the embryonic chicken heart. Dev Dyn, 2006. 235(12): p. 3213-21.

67. Bin Sun, H., et al., Involvement of the calcium-independent receptor for alpha-latrotoxin in brain ischemia. Brain Res Mol Brain Res, 2002.104(2): p. 246-9.

68. Fanto, M. and H. McNeill, Planar polarity from flies to vertebrates. J Cell Sei, 2004.117(Pt 4): p. 527-33.

69. Gao, F.B., et al., Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev, 1999.13(19): p. 2549-61.

70. Lu, B., et al., Flamingo controls the planar polarity of sensory bristles and asymmetric division of sensory organ precursors in Drosophila. Curr Biol, 1999. 9(21): p. 1247-50.

71. Usui, T., et al., Flamingo, a seven-pass transmembrane Cadherin, regulates planar cell polarity under the control of Frizzled. Cell, 1999. 98(5): p. 585-95.

72. Fung, S., et al., Expression profile of the Cadherin family in the developing Drosophila brain. J Comp Neurol, 2008. 506(3): p. 469-88.

73. Hadjantonakis, A.K., et al., Celsrl, a neural-specific gene encoding an unusual seven-pass transmembrane receptor, maps to mouse chromosome 15 and human chromosome 22qter. Genomics, 1997. 45(1): p. 97-104.

74. Das, G., J. Reynolds-Kenneally, and M. Mlodzik, The atypical Cadherin Flamingo links Frizzled and Notch signaling in planar polarity establishment in the Drosophila eye. Dev Cell, 2002. 2(5): p. 655-66.

75. Lee, R.C., et al., The protocadherin Flamingo is required for axon target selection in the Drosophila visual system. Nat Neurosci, 2003. 6(6): p. 557-63.

76. Senti, K.A., et al., Flamingo regulates R8 axon-axon and axon-target interactions in the Drosophila visual system. Curr Biol, 2003.13(10): p. 828-32.

77. Bao, H., et al., The atypical cadherin flamingo regulates synaptogenesis and helps prevent axonal and synaptic degeneration in Drosophila. Mol Cell Neurosci,

2007. 34(4): p. 662-78.

78. Chen, P.L. and T.R. Clandinin, The cadherin Flamingo mediates level-dependent interactions that guide photoreceptor target choice in Drosophila. Neuron,

2008. 58(1): p. 26-33.

79. Gao, F.B., et al., Control of dendritic field formation in Drosophila: the roles of flamingo and competition between homologous neurons. Neuron, 2000. 28(1): p. 91-101.

80. Kimura, H., et al., Potential dual molecular interaction of the Drosophila 7-pass transmembrane cadherin Flamingo in dendritic morphogenesis. J Cell Sci, 2006. 119(Pt 6): p. 1118-29.

81. Nakayama, M., et al., Identification of high-molecular-weight proteins with multiple EGF-like motifs by motif-trap screening. Genomics, 1998. 51(1): p. 2734.

82. Formstone, C.J., et al., Chromosomal localization of Celsr2 and Celsr3 in the mouse; Celsr3 is a candidate for the tippy (tip) lethal mutant on chromosome 9. Mamm Genome, 2000.11(5): p. 392-4.

83. Formstone, C.J. and P.F. Little, The flamingo-related mouse Celsr family (Celsrl-3) genes exhibit distinct patterns of expression during embryonic development. Mech Dev, 2001.109(1): p. 91-4.

84. Tissir, F., et al., Developmental expression profiles of Celsr (Flamingo) genes in the mouse. Mech Dev, 2002.112(1-2): p. 157-60.

85. Shima, Y., et al., Regulation of dendritic maintenance and growth by a mammalian 7-pass transmembrane Cadherin. Dev Cell, 2004. 7(2): p. 205-16.

86. Curtin, J.A., et al., Mutation of Celsr 1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Curr Biol, 2003. 13(13): p. 1129-33.

87. Tissir, F., et al., Protocadherin Celsr3 is crucial in axonal tract development. Nat Neurosci, 2005. 8(4): p. 451-7.

88. Shima, Y., et al., Opposing roles in neurite growth control by two seven-pass transmembrane Cadherins. Nat Neurosci, 2007.10(8): p. 963-9.

89. de Fraipont, F., et al., Thrombospondins and tumor angiogenesis. Trends Mol Med, 2001. 7(9): p. 401-7.

90. Cork, S.M. and E.G. Van Meir, Emerging roles for the BAI1 protein family in the regulation of phagocytosis, synaptogenesis, neurovasculature, and tumor development. J Mol Med, 2011.

91. Oda, K., et al., Identification ofBAIAP2 (BAI-associated protein 2), a novel human homologue of hamster !RSp53, whose SH3 domain interacts with the cytoplasmic domain of BAll. Cytogenet Cell Genet, 1999. 84(1-2): p. 75-82.

92. Mori, K., et al., Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAll) is expressed in human cerebral neuronal cells. Neurosci Res, 2002. 43(1): p. 69-74.

93. Park, D., et al., BAll is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELM0/Dockl80/Rac module. Nature, 2007. 450(7168): p. 430-4.

94. Ito, J., et al., Anatomical and histological profiling of orphan G-protein-coupled receptor expression in gastrointestinal tract of C57BL/6J mice. Cell Tissue Res, 2009. 338(2): p. 257-69.

95. Nishimori, H., et al., A novel brain-specific p53-target gene, BAI1, containing thrombospondin type 1 repeats inhibits experimental angiogenesis. Oncogene, 1997.15(18): p. 2145-50.

96. Koh, J.T., et al., Extracellular fragment of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 suppresses endothelial cell proliferation by blocking alpha(v)beta(5) integrin. Exp Cell Res, 2004. 294(1): p. 172-84.

97. Kaur, B., et al., Vasculostatin, a proteolytic fragment of brain angiogenesis inhibitor 1, is an antiangiogenic and antitumorigenic factor. Oncogene, 2005. 24(22): p. 3632-42.

98. Kaur, B., et al., Vasculostatin inhibits intracranial glioma growth and negatively regulates in vivo angiogenesis through a CD36-dependent mechanism. Cancer Res, 2009. 69(3): p. 1212-20.

99. Klenotic, P.A., et al., Histidine-rich glycoprotein modulates the anti-angiogenic effects of vasculostatin. Am J Pathol, 2010.176(4): p. 2039-50.

100. Koh, J.T., et al., Characterization of mouse brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1) and phytanoyl-CoA alpha-hydroxylase-associated protein 1, a novel BAI1-binding protein. Brain Res Mol Brain Res, 2001.87(2): p. 223-37.

101. Kee, H.J., et al., Expression of brain-specific angiogenesis inhibitor 2 (BAI2) in normal and ischemic brain: involvement of BAI2 in the ischemia-induced brain angiogenesis. J Cereb Blood Flow Metab, 2002. 22(9): p. 1054-67.

102. Kee, H.J., et al., Expression of brain-specific angiogenesis inhibitor 3 (BAI3) in normal brain and implications for BAI3 in ischemia-induced brain angiogenesis and malignant glioma. FEBS Lett, 2004. 569(1-3): p. 307-16.

103. Bolliger, M.F., D.C. Martinelli, and T.C. Sudhof, The cell-adhesion G proteincoupled receptor BAI3 is a high-affinity receptor for Clq-like proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 2011.108(6): p. 2534-9.

104. Shiratsuchi, T., et al., Cloning and characterization of BAl-associated protein 1: a PDZ domain-containing protein that interacts with BAI1. Biochem Biophys Res Commun, 1998. 247(3): p. 597-604.

105. Fujiwara, T., et al., Rho small G-protein-dependent binding of mDia to an Src homology 3 domain-containing IRSp53/BAIAP2. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 271(3): p. 626-9.

106. Shiratsuchi, T., et al., Cloning and characterization of BAP3 (BAl-associated protein 3), a C2 domain-containing protein that interacts with BAll. Biochem Biophys Res Commun, 1998. 251(1): p. 158-65.

107. Lim, I.A., D.D. Hall, and J.W. Hell, Selectivity and promiscuity of the first and second PDZ domains ofPSD-95 and synapse-associated protein 102.J Biol Chem, 2002. 277(24): p. 21697-711.

108. Kaur, B., et al., Brain angiogenesis inhibitor 1 is differentially expressed in normal brain and glioblastoma independently of p53 expression. Am J Pathol, 2003.162(1): p. 19-27.

109. Hatanaka, H., et al., Vascularization is decreased in pulmonary adenocarcinoma expressing brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAll). Int J Mol Med, 2000. 5(2): p. 181-3.

110. Fukushima, Y., et al., Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 expression is inversely correlated with vascularity and distant metastasis of colorectal cancer. Int J Oncol, 1998.13(5): p. 967-70.

111. Yoshida, Y., et al., Expression of angiostatic factors in colorectal cancer. Int J Oncol, 1999.15(6): p. 1221-5.

112. Miyamoto, N., et al., Differential expression of angiogenesis-related genes in human gastric cancers with and those without high-frequency microsatellite instability. Cancer Lett, 2007. 254(1): p. 42-53.

113. Shiratsuchi, T., et al., Cloning and characterization of BAI2 and BAI3, novel genes homologous to brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1). Cytogenet Cell Genet, 1997. 79(1-2): p. 103-8.

114. Kan, Z., et al., Diverse somatic mutation patterns and pathway alterations in human cancers. Nature, 2010.466(7308): p. 869-73.

115. Kang, X., et al., Antiangiogenic activity of BAI1 in vivo: implications for gene therapy of human glioblastomas. Cancer Gene Ther, 2006.13(4): p. 385-92.

116. Nam, D.H., et al., Expression of VEGF and brain specific angiogenesis inhibitor-1 in glioblastoma: prognostic significance. Oncol Rep, 2004.11(4): p. 863-9.

117. Kudo, S., et al., Inhibition of tumor growth through suppression of angiogenesis by brain-specific angiogenesis inhibitor 1 gene transfer in murine renal cell carcinoma. Oncol Rep, 2007.18(4): p. 785-91.

118. Yoon, K.C., et al., Lipid-mediated delivery of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 gene reduces corneal neovascularization in an in vivo rabbit model. Gene Ther, 2005.12(7): p. 617-24.

119. Hardcastle, J., et al., Enhanced antitumor efficacy of vasculostatin (Vstatl20) expressing oncolytic HSV-1. Mol Ther, 2010.18(2): p. 285-94.

120. Abe, J., et al., Ig-hepta, a novel member of the G protein-coupled hepta-helical receptor (GPCR) family that has immunoglobulin-like repeats in a long N-terminal extracellular domain and defines a new subfamily of GPCRs. } Biol Chem, 1999. 274(28): p. 19957-64.

121. Nikkila, H., et al., Sequence similarities between a novel putative G proteincoupled receptor and Na+/Ca2+ exchangers define a cation binding domain. Mol Endocrinol, 2000.14(9): p. 1351-64.

122. McGee, J., et al., The very large G-protein-coupled receptor VLGR1: a component of the ankle link complex required for the normal development of auditory hair bundles.J Neurosci, 2006. 26(24): p. 6543-53.

123. Weston, M.D., et al., Mutations in the VLGR1 gene implicate G-protein signaling in the pathogenesis of Usher syndrome type II. Am J Hum Genet, 2004. 74(2): p. 357-66.

124. van Wijk, E., et al., The DFNB31 gene product whirlin connects to the Usher protein network in the cochlea and retina by direct association with USH2A and VLGR1. Hum Mol Genet, 2006.15(5): p. 751-65.

125. Michalski, N., et al., Molecular characterization of the ankle-link complex in cochlear hair cells and its role in the hair bundle functioning. J Neurosci, 2007. 27(24): p. 6478-88.

126. Adato, A., et al., Usherin, the defective protein in Usher syndrome type 1IA, is likely to be a component of interstereocilia ankle links in the inner ear sensory cells. Hum Mol Genet, 2005.14(24): p. 3921-32.

127. Maerker, T., et al., A novel Usher protein network at the periciliary reloading point between molecular transport machineries in vertebrate photoreceptor cells. Hum Mol Genet, 2008.17(1): p. 71-86.

128. Nechiporuk, T., L.D. Urness, and M.T. Keating, ETL, a novel seven-transmembrane receptor that is developmental regulated in the heart. ETL is a member of the secretin family and belongs to the epidermal growth factor-seven-transmembrane subfamily. J Biol Chem, 2001. 276(6): p. 4150-7.

129. Liu, M., et al., GPR56, a novel secretin-like human G-protein-coupled receptor gene. Genomics, 1999. 55(3): p. 296-305.

130. Zendman, A.J., et al., TM7XN1, a novel human EGF-TM7-like cDNA, detected with mRNA differential display using human melanoma cell lines with different metastatic potential. FEBS Lett, 1999. 446(2-3): p. 292-8.

131. Shashidhar, S., et al., GPR56 is a GPCR that is overexpressed in gliomas and functions in tumor cell adhesion. Oncogene, 2005. 24(10): p. 1673-82.

132. Piao, X., et al., G protein-coupled receptor-dependent development of human frontal cortex. Science, 2004. 303(5666): p. 2033-6.

133. Jin, Z., et al., Disease-associated mutations affect GPR56 protein trafficking and cell surface expression. Hum Mol Genet, 2007.16(16): p. 1972-85.

134. Luo, R., et al., G protein-coupled receptor 56 and collagen III, a receptor-ligand pair; regulates cortical development and lamination. Proc Natl Acad Sci USA, 2011.108(31): p. 12925-30.

135. Iguchi, T., et al., Orphan G protein-coupled receptor GPR56 regulates neural progenitor cell migration via a G alpha 12/13 and Rho pathway. J Biol Chem, 2008. 283(21): p. 14469-78.

136. Koirala, S., et al., GPR56-regulated granule cell adhesion is essential for rostral cerebellar development. J Neurosci, 2009. 29(23): p. 7439-49.

137. Little, K.D., M.E. Hemler, and C.S. Stipp, Dynamic regulation of a GPCR-tetraspanin-G protein complex on intact cells: central role ofCD81 in facilitating GPR56-Galpha q/11 association. Mol Biol Cell, 2004.15(5): p. 2375-87.

138. Levy, S. and T. Shoham, The tetraspanin web modulates immune-signalling complexes. Nat Rev Immunol, 2005. 5(2): p. 136-48.

139. Richardson, M.M., L.K. Jennings, and X.A. Zhang, Tetraspanins and tumor progression. Clin Exp Metastasis, 2011. 28(3): p. 261-70.

140. Xu, L., et al., GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(24): p. 9023-8.

141. Balklava, Z., et al., Analysis of tissue transglutaminase function in the migration of Swiss 3T3 fibroblasts: the active-state conformation of the enzyme does not affect cell motility but is important for its secretion. J Biol Chem, 2002. 277(19): p. 16567-75.

142. Jones, R.A., et al., Reduced expression of tissue transglutaminase in a human endothelial cell line leads to changes in cell spreading, cell adhesion and reduced polymerisation offibronectin. J Cell Sci, 1997.110 ( Pt 19): p. 2461-72.

143. Jones, R.A., et al., Matrix changes induced by transglutaminase 2 lead to inhibition of angiogenesis and tumor growth. Cell Death Differ, 2006. 13(9): p. 1442-53.

144. Osterhoff, C., R. Ivell, and C. Kirchhoff, Cloning of a human epididymis-specißc mRNA, HE6, encoding a novel member of the seven transmembrane-domain receptor superfamily. DNA Cell Biol, 1997.16(4): p. 379-89.

145. Obermann, H., et al., HE6, a two-subunit heptahelical receptor associated with apical membranes of efferent and epididymal duct epithelia. Mol Reprod Dev, 2003. 64(1): p. 13-26.

146. Davies, B., et al., Targeted deletion of the epididymal receptor HE6 results in fluid dysregulation and male infertility. Mol Cell Biol, 2004. 24(19): p. 8642-8.

147. St Croix, B., et al., Genes expressed in human tumor endothelium. Science, 2000. 289(5482): p. 1197-202.

148. Carson-Walter, E.B., et al., Cell surface tumor endothelial markers are conserved in mice and humans. Cancer Res, 2001. 61(18): p. 6649-55.

149. Vallon, M. and M. Essler, Proteofytically processed soluble tumor endothelial marker (TEM) 5 mediates endothelial cell survival during angiogenesis by linking integrin alpha(v)beta3 to glycosaminoglycans. J Biol Chem, 2006. 281(45): p. 34179-88.

150. Vallon, M., et al., Tumor endothelial marker 5 expression in endothelial cells during capillary morphogenesis is induced by the small GTPase Rae and mediates contact inhibition of cell proliferation. Exp Cell Res, 2010. 316(3): p. 412-21.

151. Kuhnert, F., et al., Essential regulation of CNS angiogenesis by the orphan G protein-coupled receptor GPR124. Science, 2010. 330(6006): p. 985-9.

152. Anderson, K.D., et al., Angiogenic sprouting into neural tissue requires Gprl24, an orphan G protein-coupled receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 2011. 108(7): p. 2807-12.

153. Fredriksson, R., et al., Novel human G protein-coupled receptors with long N-terminals containing GPS domains and Ser/Thr-rich regions. FEBS Lett, 2002. 531(3): p. 407-14.

154. Gloriam, D.E., R. Fredriksson, and H.B. Schioth, The G protein-coupled receptor subset of the rat genome. BMC Genomics, 2007. 8: p. 338.

155. Abe, J., T. Fukuzawa, and S. Hirose, Cleavage oflg-Hepta at a "SEA" module and at a conserved G protein-coupled receptor proteolytic site. J Biol Chem, 2002. 277(26): p. 23391-8.

156. Ponting, C.P., K. Hofmann, and P. Bork, A latrophilin/CL-l-like GPS domain in polycystin-1. Curr Biol, 1999.9(16): p. R585-8.

157. Mengerink, K.J., G.W. Moy, and V.D. Vacquier, suRE]3, a polycystin-1 protein, is cleaved at the GPS domain and localizes to the acrosomal region of sea urchin sperm.J Biol Chem, 2002. 277(2): p. 943-8.

158. Volynski, K.E., et al., Latrophilin fragments behave as independent proteins that associate and signal on binding ofLTX(N4C). Embo J, 2004. 23(22): p. 4423-33.

159. Lin, H.H., et al., Autocatalytic cleavage of the EMR2 receptor occurs at a conserved G protein-coupled receptor proteolytic site motif. J Biol Chem, 2004. 279(30): p. 31823-32.

160. Hsiao, C.C., et al., Site-specific N-glycosylation regulates the GPS auto-proteolysis of CD97. FEBS Lett, 2009. 583(19): p. 3285-90.

161. Chang, G.W., et al., Proteolytic cleavage of the EMR2 receptor requires both the extracellular stalk and the GPS motif FEBS Lett, 2003. 547(1-3): p. 145-50.

162. Fukuzawa, T. and S. Hirose, Multiple processing of lg-Hepta/GPR116, a G protein-coupled receptor with immunoglobulin (Ig)-like repeats, and generation of EGF2-likefragment. J Biochem, 2006.140(3): p. 445-52.

163. Kierszenbaum, A.L., Polycystins: what polycystic kidney disease tells us about sperm. Mol Reprod Dev, 2004. 67(4): p. 385-8.

164. Qian, F., et al., Cleavage of polycystin-1 requires the receptor for egg jelly domain and is disrupted by human autosomal-dominant polycystic kidney disease 1-associated mutations. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(26): p. 16981-6.

165. Hughes, J., et al., Identification of a human homologue of the sea urchin receptor for egg jelly: a polycystic kidney disease-like protein. Hum Mol Genet, 1999. 8(3): p. 543-9.

166. Moy, G.W., et al., The sea urchin sperm receptor for egg jelly is a modular protein with extensive homology to the human polycystic kidney disease protein, PKD1. ] Cell Biol, 1996.133(4): p. 809-17.

167. Wei, W., et al., Characterization of cis-autoproteolysis of polycystin-1, the product of human polycystic kidney disease 1 gene. J Biol Chem, 2007. 282(30): p. 21729-37.

168. Poison, A., et al., Improvements in the isolation oflgYfrom the yolks of eggs laid by immunized hens. Immunol Invest, 1985.14(4): p. 323-7.

169. Petrenko, A.G., et al., Isolation and properties of the alpha-Iatrotoxin receptor. Embo J, 1990. 9(6): p. 2023-7.

170. Hlubek, M.D., et al., Calcium-independent receptor for alpha-latrotoxin and neurexin lalpha [corrected] facilitate toxin-induced channel formation: evidence that channel formation results from tethering of toxin to membrane. Mol Pharmacol, 2000. 57(3): p. 519-28.

171. Krasnoperov, V., et al., Structural requirements for alpha-latrotoxin binding and alpha-latrotoxin-stimulated secretion. A study with calcium-independent receptor of alpha-latrotoxin (CIRL) deletion mutants. J Biol Chem, 1999. 274(6): p. 3590-6.

172. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

173. Terry, D.E., E. Umstot, and D.M. Desiderio, Optimized sample-processing time and peptide recovery for the mass spectrometric analysis of protein digests. J Am Soc Mass Spectrom, 2004.15(6): p. 784-94.