Исследование фосфорилирования Na, К-АТФазы протеинкиназой А тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Муртазина, Диляра Ахметалимовна

• Муртазина, Диляра Ахметалимовна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Муртазина, Диляра Ахметалимовна

Содержание

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. Общая характеристика К-АТФазы

2. Структура Ма,К-АТФазы

2.1. Субъединичный состав фермента

2.2. Структурная организация а-субъединицы

Первичная структура, изоформы

Топография а-субъединицы

Структура цитоплазматического домена. Организация активного

центра Иа.К-АТФазы

Структура катион-связывающих центров

2.3. Структурная организация Р-субъединицы

2.4. Четвертичная структура К-АТФазы

3. Механизм функционирования К-АТФазы

3.1. Общая характеристика реакции, катализируемой №,К-АТФазой

Субстратная специфичность Ыа,К-АТФазы

3.2. Частные реакции, обеспечиваемые №,К-АТФазой

Окклюдированные катионы

Основные конформационные состояния Иа,К-АТФазы

3.3. Модифицирующее действие АТФ на Ыа,К-АТФазу

4. Механизмы регуляции активности ЫаД-АТФазы

4.1. Участие Ыа,К-АТФазы в осуществлении различных функций клеток

животных

4.2. Изоферменты Ыа,К-АТФазы и их свойства

4.3. Регуляция активности 1Ма,К-АТФазы за счет взаимодействия с липидным бислоем мембраны

4.4. Долгосрочная регуляция активности ИаД-АТФазы

Регуляция количества молекул Иа,К-АТФазы в клетке

4.5. Краткосрочная регуляция активности Ыа,К-АТФазы

Фосфорилирование Ма,К-АТФазы протеинкиназами

4.6. Белки, взаимодействующие с ИаД-АТФазой

Анкирин

Взаимодействие анкирина с Ма,К-АТФазой

Пектины и их влияние на активность Ыа,К-АТФазы

Мелиттин

Цель и задачи исследования

Материалы и методы

Материалы

Получение имидазолъной формы АТФ

I. Препаративные методы

1. Получение очищенного препарата Ыа, К-АТФазы из солевых желез утки

2. Выделение каталитической субъединицы ПКА

Получение холофермента ПКА

Получение каталитической субъединицы ПКА

3. Выделение анкирина из эритроцитов крупного рогатого скота

4. Получение фракции микросом Н,К-АТФазы из слизистой оболочки желудка кролика

П. Аналитические методы

1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН-Иа

2. Вестерн-блоттинг

3. Иммунохимическая идентификация белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране

4. Аффинная очистка моноклональных антител на протеинА-сефарозе

5. Определение концентрации белка

6. Определение активности Nа,К-АТФазы

7. Определение активности каталитической субъединицы ПКА

8. Фосфорилирование очищенного препарата N0, К-АТФазы из солевых желез утки под действием ПКА

9. Определение стехиометрии фосфорширования а-субъединицы Nа,К-АТФазы под действием ПКА

10. Авторадиография

11. Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Ыа,К- и Н,К-АТФазы

12. Измерение флуоресценции ФИТЦ-меченых препаратов Ыа,К- и Н,К-АТФаз

13. Анализ фосфоаминокислот

14. Определение количества гидролизованной АТФ

15. Кинетический анализ ингибирующего действия мелиттина

Результаты и их обсуждение

1. Фосфорилирование а-субъединицы К-АТФазы из солевых желез утки под действием ПКА

2. Подбор условий для фосфорилирования активной Ка,К-АТФазыиз солевых желез

утки под действием ПКА

3. Анализ фосфоаминокислот при фосфорилировании Иа,К-АТФазы из солевых желез утки ПКА

4. Влияние фосфорилирования №,К-АТФазы под действием ПКА на ее активность

5. Фосфорилирование Н,К-АТФазы из слизистой оболочки желудка кролика под действием ПКА

6. Образование комплекса анкирин-№,К-АТФаза и его фосфорилирование под действием ПКА

7. Взаимодействие мелиттина с Ыа,К-АТФазой

8. Влияние антител против (3-субъединицы и конканавалина А на фосфорилирование

Иа,К-АТФазы под действием ПКА

Заключение

Выводы

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфорная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота ГТФ - гуанозинтрифосфорная кислота ДАБ - 3,3' - диаминобензидин ДДС-Na - додецилсульфат натрия ДМФА - диметилформамид ДТТ - дитиотреитол кДа - килодальтон

кДНК - кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота Км - констатна Михаэлиса ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НАДН - никотинамиддинуклеотид восстановленный

ПКА - цАМФ - зависимая протеинкиназа

ПКС - Са фосфолипид зависимая протеинкиназа

C12Eg - w-додециловый эфир октаэтиленгликоля

Трис - трис (гидроксиметил) метиламин

ТХУ - трихлоруксусная кислота

УТФ - уридинтрифосфорная кислота

ФЕП - фосфоенолпируват

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

Фн - неорганический фосфат

ФСБТ - фосфатно-солевой буфер, содержащий Твин-20

цАМФ - циклический аденозин-3 ',5'-монофосфат

ЦТФ - цитидинтрифосфорная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭФ в ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле

CHAPS- 3-[(3-холамидопропил) диметиламмоний-]-1 -пропансульфонат

Ыа,К-АТФаза - Na,K

-активируемая, Mg -зависимая аденозинтрифосфогидролаза PIPES - пиперазин-М,К'-2-этансульфоновая кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование фосфорилирования Na, К-АТФазы протеинкиназой А»

ВВЕДЕНИЕ

Плазматическая мембрана клетки участвует в передаче сигналов, направленных от внешнего источника в клетку, из клетки в окружающую среду, а также внутри самой клетки. Это происходит в результате сложной работы многих белков, часть из которых пронизывает мембрану насквозь, другие лишь погружены в нее, а третьи ассоциированы с мембраной с помощью белок-белковых или белок-липидных взаимодействий.

Одним из интегральных белков плазматической мембраны является Na,K-АТФаза, обеспечивающая активный транспорт ионов Na+ и К+ против электрохимического градиента за счет энергии гидролиза АТФ. Ионные градиенты, создаваемые Ма,К-АТФазой, используются различными клетками для поддержания трансмембранного потенциала, формирования потенциала действия, регуляции клеточного объема, транспорта глюкозы и аминокислот, обратного транспорта нейромедиаторов в нервных окончаниях, а также для функционирования различных систем ионного обмена и котранспорта, обеспечивающих сопряженный с натрием перенос ионов (ТГ, Са2+, СГ). Таким образом, Na-Hacoc является важным звеном в регуляции функции клеток, влияя на которое, можно регулировать эти процессы.

Физиологическая регуляция активности №,К-АТФазы осуществляется различными способами. Кроме стероидных и тиреоидных гормонов, активирующих транскрипцию генов Na, К-АТФ азы, активность этого фермента в различных тканях существенно зависит от катехоламинов и других гормонов, влияющих на систему вторичных посредников (Bertorello, Katz, 1993; Ewarts, Klip, 1995). Имеется информация о том, что G-белки принимают непосредственное участие в передаче гормонального сигнала к №,К-АТФазе (Danilenko et al., 1990). Полученные в настоящее время экспериментальные данные свидетельствуют, что регуляция активности №,К-АТФазы может осуществляться за счет вовлечения этого фермента в классические пути передачи сигнала в клетке, а именно: за счет фосфорилирования протеинкиназами. Выяснение того, как фосфорилирование влияет на активность ЫаД-АТФазы, а также как оно зависит от действия различных эндогенных факторов

позволит представить, каким образом может регулироваться активность этого фермента, от которого зависит функциональная активность многих тканей.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика Na,K-AT<Da3bi.

Na,K-ATOa3a (Na,K-активируемая, Mg-зависимая аденозинтрифосфогидролаза, КФ 3.6.1.3) была впервые описана в 1957 году Йенсом Скоу (Skou, 1957), получившим за это открытие Нобелевскую премию. Фермент присутствует в плазматической мембране всех клеток животных, но содержание его в мембране и активность сильно варьируют в зависимости от типа ткани. Количество Na,K-АТФазы изменяется от нескольких сотен молекул на клетку (например, в эритроците может быть всего лишь 200-250 молекул №,К-АТФазы (Erdmann, Hasse, 1975) до нескольких тысяч молекул на квадратный микрометр мембраны (Jorgensen, 1982). В больших количествах этот фермент содержат ткани, осуществляющие выведение NaCl (наружный медуллярный слой почек млекопитающих, ректальные железы акулы, солевые железы морских птиц и ткани с высокой электрической активностью, например, электрические органы рыб) (Jorgensen, 1982). В меньших, но значительных количествах Ма,К-АТФаза присутствует в возбудимых тканях: в мозге, периферических нервах и мускулатуре различного типа. И, наконец, минимальная концентрация Na,К-АТФазы характерна для невозбудимых тканей.

№,К-АТФаза, или Na-Hacoc, поддерживает высокую концентрацию К+ и низкую концентрацию Na+ внутри клетки (Garrahan, Glynn, 1967), используя для транспорта ионов энергию, запасенную в терминальной фосфатной связи АТФ.

Фермент принадлежит к семейству ион-транспортирующих АТФаз Р-типа -гомологичных ферментов, обнаруженных как у эукариот, так и у прокариот, сходных между собой по структуре и механизму функционирования (Inesi, Kirley, 1992; Lutsenko, Kaplan, 1995; Moller et al., 1996). Эукариотические АТФазы животных включают кроме ЫаД-АТФазы, родственную ей Н,К-АТФазу, ответственную за секрецию Н1" в желудке и, по-видимому, реабсорбцию К+ в тонком кишечнике и собирательных трубочках почек, Са-АТФазы плазматических мембран и сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA АТФазы), обеспечивающие

регуляцшо внутриклеточной концентрации Са (последние обнаружены также у растений). Кроме того, у растений и дрожжей имеется Н-АТФаза, участвующая в Независимом поглощении метаболитов. Представителями прокариотических АТФаз Р-типа являются Kdp-АТФаза Escherichia coli, обеспечивающая аккумуляцию К+ (Altendorf, Epstein, 1994), Mg -АТФаза Staphylococcus typhimurium, участвующая в выведении Mg2+ (Smith et al., 1993), Cd^-АТФаза (Silver et al., 1993) и Си+-АТФаза (Solioz et al., 1994), обнаруженные соответственно у Staphylococcus aureus, и Escherichia hirae и обеспечивающие поглощение этих катионов микроорганизмами. АТФазы, участвующие в аккумуляции некоторых тяжелых металлов, в частности, Си+, обнаружены также у человека, их дефицит приводит к развитию патологий (болезнь Вильсона, болезнь Менке) (Solioz et al., 1994).

Гидролиз АТФ АТФазами Р-типа происходит с образованием промежуточного фосфорилированного интермедиата ЕР, который возникает вследствие переноса терминального фосфорильного остатка АТФ на остаток аспарагиновой кислоты активного центра фермента (отсюда и название - АТФазы Р-типа). Кроме того, в процессе каталитического акта эти ферменты связывают, окклюдируют и транспортируют ионы, последовательно пребывая в двух основных конформациях Е1 и Е2, значительно отличающихся друг от друга (отсюда второе название этих ферментов - АТФазы Е1-Е2 типа).

2. Структура N а, К-АТФ азы.

2.1 Субъединичный состав фермента.

Ка,К-АТФаза в очищенном виде была получена в середине 70-х годов в виде мембранных фрагментов, содержащих два типа субъединиц (Jorgensen, 1974), которые получили название а- и Р-субъединиц фермента. а-Субъединица имеет молекулярную массу около 112 кДа, а р-субъединица представляет собой гликопротеид, и в зависимости от степени гликозилирования ее молекулярная масса в различных тканях составляет от 40 до 60 кДа. а-Субъединица №,К-АТФазы в процессе каталитического цикла подвергается фосфорилированию-дефосфорилированию, содержит участок связывания АТФ, участок связывания уабаина (строфантина G), специфического ингибитора фермента, и катион-связывающие центры (Pedemonte, Kaplan, 1990; Mercer, 1993; Lingrel, Kuntzweiler,

1994). В препаратах фермента два этих белка обнаруживаются в соотношении 1:1 (Liang, Winter, 1977; Craig, Kyte, 1980).

а-Субъединица способна полностью выполнять каталитическую функцию (Blanco et al., 1994). ß-Субъединица является существенным компонентом функциональной 1ч1а,К-АТФазы (McDonough et al., 1990; Blanco et al., 1994; Chow, Forte, 1995) она, по-видимому, вовлечена в окклюзию К+ (Lutsenko, Kaplan 1993). Хотя непосредственного участия в катализе эта субъединица не принимает, она влияет на транспортные функции фермента, изменяя сродство к ионам К+ и Na+ (McDonough et al., 1990; Blanco et al., 1994; Eakle et al., 1994; Hasler et al., 1998). ß-Субъединица №,К-АТФазы в клетках позвоночных может выполнять роль шаперона: она стабилизирует активный aß-комплекс и облегчает адресную доставку вновь синтезированной №,К-АТФазы из эндоплазматического ретикулума к мембране (Geering, 1990; McDonough et al., 1990; Noguchi et al., 1990; Chow, Forte, 1995; Shainskaya, Karlish, 1996; Beggah et al., 1997).

Присутствие в препаратах Na,K-ATOa3bi кроме а- и ß-субъединиц протеолипидного компонента с молекулярной массой 8-14 кДа, который называют у-субъединицей, было впервые обнаружено Форбушем (Forbush et al., 1978). Он показал, что у-субъединица ассоциирована с №,К-АТФазой как в очищенных препаратах, так и в микросомальной фракции. Установлено, что эта субъединица присутствует в препаратах фермента в количествах, эквимолярных количеству aß-димера (Reeves et al., 1980; Hardwicke, Freytag, 1981), и способна взаимодействовать с фотоактивными аналогами уабаина (Forbush et al, 1978; Lowndes et al., 1984). Другим указанием на то, что у-субъединица является компонентом ИаД-АТФазы, служит то, что она обнаруживается совместно с а-субъединицей фермента в сегментах нефронов и соосаждается с aß-комплексом (Mercer et al., 1993). Уровень экспрессии у-субъединицы определяется уровнем экспрессии aß-комплекса (Béguin, et al., 1997). В последнее время появились работы, в которых обсуждается возможная роль протеолипида в функционировании Ш,К-АТФазы: было показано, что при экспрессии у-субъединицы Ка,К-АТФазы человека в клетках ооцитов Xenopus laevis, она активирует ион-селективные каналы (Minor, et al., 1998). Но поскольку роль этого белкового компонента в обеспечении работы №,К-АТФазы недостаточно изучена, считают, что для обеспечения нормального функционирования этого

фермента достаточно двух больших субъединиц (Pedemonte, Kaplan, 1990; Me Donough et al., 1990).

2.2. Структурная организация а-субъединицы.

Первичная структура, изоформы. С использованием методов генной инженерии были определены полные аминокислотные последовательности клонов кЦНК из крысы, соответствующие трем различным изоформам каталитической субъединицы ИаД-АТФазы (al, a2, a3) (Shull et al., 1986; Hara, et al., 1987; Herrera et al., 1987), a также последовательности этой субъединицы из тканей цыпленка (Fambrough, Ваупе, 1983) и человека. Последовательность кДНК а-субъединицы Na,K-AT<Da3bi, полученная из человека, оказалась близкой к кДНК аЗ-изоформы из мозга крысы (Sverdlov et al., 1987; Ovchinnikov et al., 1988; Lingrel et al., 1990). Установлено, что изоформы а-субъединицы являются продуктами различных генов, а не результатом альтернативного сплайсинга. Недавно появилась информация о четвертом гене, который, по-видимому, также кодирует а-субъединицу Na,K-АТФазы в семенниках крысы (Shamraj, Lingrel, 1994), кроме того, выявлено два гена, кодирующих близкую по структуре а-субъединицу Н,К-АТФазы (Grishin et al., 1994). Известно, что гомология в аминокислотной последовательности между al-изоформой №,К-АТФазы и a-субъединицей Н,К-АТФазы составляет около 60% (Sweadner, 1989). Множественные изоформы обнаружены и для Р-субъединицы фермента (Martin-Vasallo et al., 1989). Поскольку наиболее часто исследуются высокоочищенные препараты №,К-АТФазы из медуллярного слоя почек млекопитающих, где представлен фермент al pi -типа, большинство работ по белковой химии выполнено с использованием этого изофермента.

Топография а-субъединицы. Так как до настоящего времени нет данных рентгеноструктурного анализа с высокой степенью разрешения, информация относительно упаковки a-субъединицы была получена с помощью теоретического анализа аминокислотной последовательности, сравнения результатов, полученных при модификации аминокислотных остатков гидрофобными и гидрофильными реагентами, а также ограниченного протеолиза фермента и взаимодействия его с антителами. Данные о трехмерной структуре фермента были получены путем анализа двумерных кристаллов мембранносвязанной №,К-АТФазы методом

электронной микроскопии с разрешением 20-25 А0. Исходя из совокупности этих данных наиболее вероятной является модель, согласно которой полипептидная цепь а-субъединицы пересекает мембрану 5 раз, образуя 10 внутримембранных сегментов (Goldshleger et al., 1995; Moller et al., 1996), состоящих из 17-25 аминокислот, уложенных в а-спираль. N- и С-концевые фрагменты а-субъединицы располагаются в цитоплазме (Antolovic et al., 1991; Canfield, Levenson, 1993; Vladimirova et al., 1995). N-концевая часть полипептидной цепи представляет собой гибкий неспирализованный участок, обогащенный остатками лизина, который принимает участие в конформационных переходах и, возможно, регулирует чувствительность фермента к катионам (Lingrel et al., 1990). В N-концевой половине а-субъединицы присутствуют 4 трансмембранных фрагмента (М1-М4), а в С-концевой половине, по-видимому, еще 6 (М4-М10) (рис. 1). Между трансмембранными фрагментами М2 и МЗ располагается малая цитоплазматическая петля, а между М4 и М5 - большой цитоплазматический домен, в состав которого входит более 400 аминокислотных остатков а-субъединицы. Он содержит участки связывания АТФ и флуоресцеинизотиоцианата. (Stokes et al., 1994). Организация а-субъединицы Na,K-АТФазы в мембране аналогична организации каталитических субъединиц Ca- и Н,К-АТФаз (Moller et al., 1996).

Структура цитоплазматического домена. Организации активного центра Na,K-AT0a3bi.

Характерной особенностью большого цитоплазматического домена а-субъединицы является наличие центрального ядра, представленного ß-структурой, которое окружено а-спиральными участками, соединенными гибкими петлями (Molleretal., 1996).

В большом цитоплазматическом домене а-субъединицы находится фосфорилируемый остаток аспарагиновой кислоты (Asp-369) (Shull et al., 1985). Следующие за ним 6 аминокислотных остатков являются консервативными для всех АТФаз Р-типа (Pedemonte, Kaplan, 1990; Moller et al., 1996). Имеются данные о том, что конформационный переход Е1-Е2 приводит к перемещению фосфорилированного Asp-369 и окружающих его аминокислотных остатков (Jorgensen et al., 1982).

Внеклеточное пространство

рис.1.Схема, иллюстрирующая упаковку а- и р-субъединиц Na,K-ATOa3bi в мембране

(Blanco, Mercer, 1998)

Область, следующая за Lys-501 (5 аминокислотных остатков), также консервативна у всех АТФаз Р-типа. Во всех АТФазах Р-типа остаток лизина, гомологичный Lys-501 а-субъединицы ЫаД-АТФазы, специфично и ковалентно взаимодействует с ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианатом), что приводит к ингибированию ферментативной активности. АТФ предотвращает как включение метки, так и инактивацию фермента (Farley et al., 1984; Kirley et al., 1984). Кроме Lys-501, существенным для активности является также остаток Lys-480, который взаимодействует с пиридоксальфосфатом, а добавление АТФ предотвращает инактивацию фермента и включение метки (Scheiner-Bobis, Schoner, 1985). Установлено, что Lys-480 и Lys-766, как и Lys-501, могут взаимодействовать с ФИТЦ (Xu, 1989).

Часть АТФ-связывающего центра формируется, по-видимому, аминокислотными остатками, расположенными ближе к С-концевой части цитоплазматического домена (аминокислотные остатки 655-664 и 704-722), Jorgensen, Andersen, 1988). В этом участке находится еще один остаток лизина (Lys-651), который модифицируется азидопроизводными АТФ с ингибированием АТФазной активности (Tran et al., 1994). Роль его в катализе неясна, но гомологичные остатки лизина обнаруживаются во всех АТФазах Р-типа (Moller et al., 1996). Заканчивается большой цитоплазматический домен консервативной последовательностью-шарниром из 23 аминокислот. Функции этой последовательности неизвестны (Moller et al., 1996).

Структура катион-связывающих центров. В начале 90-х годов было обнаружено, что интенсивный протеолиз Ка,К-АТФазы в присутствии К+ или Rb+ приводит к получению мембранного препарата, состоящего из нескольких фрагментов: большого с молекулярной массой 19 кДа и малых с массой 8-11,7 кДа (Karlish et al., 1990). 19-кДа фрагмент представляет собой С-концевую часть полипептидной цепи а-субъединицы, содержащую внутримембранные сегменты М7-М10 (Karlish et al., 1993), а мелкие пептиды являются парами внутримембранных сегментов М5-М6, МЗ-М4 и М1-М2. 19-кДа часть а-субъединицы сохраняет способность окклюдировать ионы К+, но не способна гидролизовать АТФ.

Если протеолиз проводить в отсутствие ионов К+, то способность окклюдировать ионы теряется, причем параллельно из мембраны удаляется шпилька М5-М6

(Lutsenko et al., 1995). Сегмент M5 является одним из двух внутримембранных сегментов, связанных с большим цитоплазматическим доменом, в котором находится гидролитический центр. Таким образом, конформационные изменения, возникающие в активном центре 1Ча,К-АТФазы, могут передаваться к каналу через этот сегмент. Результаты исследований с использованием точечных мутаций в заряженных или содержащих кислородный атом аминокислотных остатках (Jewell-Motz, Lingrel, 1993; Vilsen, 1993; Vilsen, 1995, Kuntzweiler et al., 1995; Koster et al., 1996), а также биохимические данные (Lutsenko et al., 1995) свидетельствуют, что сегменты М5 и Мб наряду с сегментом М4 играют основную роль в окклюзии катионов и их транспорте.

Трансмембранные сегменты а-субъединицы взаимодействуют друг с другом: эксперименты со сшивающими агентами в сочетании с протеолизом показали, что существует близкий контакт между внутримембранными сегментами М1-М2 и MS-MI О (Sarvazyan et al., 1995). По-видимому, это взаимодействие необходимо для обеспечения конформационных переходов, происходящих при связывании или переносе ионов через канал.

2.3. Структурная организация ß-субъединицы.

В настоящее время идентифицировано 4 изоформы ß-субъединицы Na,K-АТФазы, две из которых (ßl и ß2) обнаружены в различных тканях млекопитающих и птиц. ßЗ-Изoфopмa идентифицирована у амфибий, а также у некоторых видов млекопитающих: мыши, крысы и человека (Blanco, Mercer, 1998). Гомология в аминокислотной последовательности между ß3 изоформой Xenopus laevis и ß3 изоформой человека составляет 59% (Malik, et al., 1996).

Все изоформы ß-субъединицы содержат около 300 аминокислотных остатков (ßl-изоформа крысы содержит 304, ß2 - 290 и ß3 - 279 аминокислотных остатков) и имеют схожую топологию, причем по структуре ß-субъединица представляет собой рецептор для лектинов. Ее короткий N-концевой фрагмент расположен в цитоплазме (Geering et al., 1985), а С-концевой - снаружи клетки (рис. 1). Полипептидная цепь ß-субъединицы пересекает мембрану один раз, трансмембранный сегмент находится поблизости от N-концевого фрагмента (Farley et al., 1986). Большая часть ß-субъединицы располагается вне клетки (Dzhandzhugazyan, Jorgensen, 1985).

Полипептидная цепь ß-субъединицы уложена в антипараллельные ß-структуры, а-спиральные участки, по-видимому, отсутствуют (Rost, Sander, 1994). Все изоформы ß-субъединицы содержат три консервативные дисульфидные связи (Cys-121 - Cys-150, Cys-160 - Cys-176, Cys-215 - Cys-278 в ßl-изоформе) (Kirley, 1989; Miller, Farley, 1990). Обработка Ка,К-АТФазы восстанавливающими агентами приводит к инактивации фермента, что свидетельствует о важности дисульфидных связей в функционировании Na,K-Hacoca. Методом точечного мутагенеза было показано, что удаление даже одной дисульфидной связи уменьшает вероятность правильной сборки нативного фермента (Beggah et al., 1997). На внеклеточной части полипептидной цепи имеется от 3 до 6 остатков аспарагина в последовательности Asn-Ser/Thr, которые могут быть потенциально гликозилированы (Schmalzing, Gloor, 1994). Для ß-субъединицы Н,К-АТФазы характерно наличие 7 участков гликозилирования (Shainskaya, Karlish, 1996). ßl - Изоформа человека имеет три участка гликозилирования. Предполагаемые участки для гликозилирования в ß2 изоформе различаются в зависимости от вида: так, ß-субъединица ИаД-АТФазы из цыпленка содержит 4 участка гликозилирования, для ß2-изoфopмы крысы, человека и мыши участков гликозилирования 7, 8 и 9 соответственно (Chow, Forte, 1995).

Разветвленные углеводные цепи ßl-субъединицы №,К-АТФазы содержат в основном галактозу, маннозу и N-ацетилглюкозамин (Treuheit et al., 1993; Владимирова и соавт., 1998), причем для состава Сахаров характерна тканевая специфичность (Владимирова и соавт., 1998). Различная степень гликозилирования приводит к гетерогенности ß-субъединицы, поэтому при электрофорезе она обычно представлена набором белковых полос с молекулярной массой от 50 до 60 кДа.

ß-Субъединица достаточно устойчива к протеолизу, что, по-видимому, обусловлено присутствием в ней дисульфидных связей, однако трипсин способен расщеплять ее на две части: 16-кДа N-концевой и 50-кДа С-концевой гликозилированный пептид (Karlish et al., 1993).

Участки, обеспечивающие взаимодействие ß-субъединицы с а-субъединицей, располагаются, по-видимому, в консервативных областях, поскольку in vitro а-субъединица Ка,К-АТФазы способна взаимодействовать с любой из изоформ ß-субъединицы (включая и ß-субъединицу Н,К-АТФазы) с образованием функционального комплекса (Schmalzing et al., 1991; Horisberger et al., 1991).

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что Р-субъединица 1Ча,К-АТФазы взаимодействует с а-субъединицей фермента во многих участках последней, расположенных во внеклеточной части, а также в трансмембранном сегменте и в цитоплазматическом домене. Имеются данные, показывающие, что важную роль в ассоциации с а-субъединицей играют 10 аминокислотных остатков, расположенных рядом с С-концевым фрагментом. В этой области формируется (3-структура с перемежающимися гидрофильными и гидрофобными аминокислотами. Замена гидрофобных остатков этой последовательности приводит к существенному снижению стабильности а(3-комплекса (В姧а11 е! а1., 1993). Однако удаление большей части С-концевой области Р-субъединицы не нарушает контакты между а- и Р-субъединицами, а только приводит к появлению неактивного или менее стабильного комплекса. С использованием бифункциональных сшивающих агентов получены данные, свидетельствующие о взаимодействии трансмембранного сегмента Р-субъединицы с М8-М10 сегментами а-субъединицы (8агуагуап е! а1., 1995). Кроме того, исследования, проведенные с использованием метода протеолиза, указывают на то, что цитоплазматический 1М-конец Р-субъединицы взаимодействует с а-субъединицей фермента (Оеепг^, et а1., 1996). Удаление 1М- фрагмента Р-субъединицы не влияет на стабильность а-субъединицы, но значительно изменяет сродство фермента для К+ и Иа+ (Наз1ег е1 а1., 1998).

2.4. Четвертичная структура Ш,К-АТФазы.

В настоящее время имеется информация о том, что в мембране Ка,К-АТФаза образует олигомерные комплексы, в состав которых входит 2 и более протомера ар. Для изучения олигомерной организации ЫаД-АТФазы (как и других интегральных мембранных белков) неприменимы классические методы (гель-фильтрация, седиментация), так как даже в очищенном состоянии мембранные белки представляют собой липопротеидные комплексы. Применение классических методов возможно лишь после экстракции мембранных белков из мембран с помощью детергентов, что часто существенно изменяет его свойства. Поэтому для изучения четвертичной структуры мембранных белков используют другие методы (ковалентное "сшивание" отдельных мономеров с использованием

бифункциональных сшивающих агентов с последующим анализом образующихся комплексов методом ЭФ в ПААГ, иммунохимические методы, а также различные физические методы).

Впервые существование олигомерных форм №,К-АТФазы было установлено при изучении двумерных кристаллов фермента, полученных в присутствии некоторых лигандов (Фн или ванадата и Mg ) (Skriver et al., 1981). Единицей такого кристалла обычно является димер, состоящий из двух протомеров (оф)2, хотя обнаружены и протомерные формы кристаллов (оф), причем в процессе инкубации препарата с кристаллизующими лигандами соотношение между протомерными (а(5) и димерными (оф)2 кристаллами может изменяться (Herbert et al., 1985). Реконструкция трехмерной структуры №,К-АТФазы, проведенная с разрешением около 20 А0, показывает, что протомерная форма встроена в липидный бислой мембраны, выступая в сторону цитоплазмы на 40-60 А0 (цитоплазматический домен а-субъединицы), и во внеклеточное пространство на 20 А0 (С-концевая часть (3-субъединицы) (Herbert et al., 1985; Демин и соавт., 1984). Диаметр выступающих в цитоплазму частиц составляет около 40-50 А0, а минимальная длина оф-протомера в направлении, перпендикулярном мембране, - примерно 100 A0 (Herbert et al., 1985; Демин и соавт., 1984). Данные рентгеноструктурного анализа показывают, что в олигомерных комплексах, образующихся в двумерных кристаллах Ка,К-АТФазы, контактируют друг с другом а-субъединицы соседних протомеров, (3-субъединицы взаимодействуют только с а-субъединицами.

Образование олигомерных комплексов ИаД-АТФазы за счет ассоциации а-субъединиц было установлено также с использованием "сшивающих" агентов (Liang, Winter, 1977; Huang, Askari, 1981; Periyasama et al., 1983; Askari, 1987). При проведении "сшивания" в среде с Na+, Mg2+ и АТФ обнаруживаются как аа, так и аР-структуры, тогда как в отсутствие этих лигандов - только а(3 (Huang, Askari, 1981; Periyasamy et al., 1983). Ассоциация между отдельными а-субъединицами в нативной мембране была подтверждена методом иммунопреципитации. С использованием химерных молекул, было показано, что в ассоциации а-субъединиц важную роль играют аминокислотные остатки, расположенные в цитоплазматическом домене в области Pro561-Gln709 (Koster et al., 1995).

Для изучения четвертичной структуры Na,К-АТФ азы был использован метод радиоинактивации (метод молекулярной мишени) (Karlish, Kempner, 1984; Jensen, Norby, 1988; Norby, Jensen, 1989). Этот метод дает возможность оценить молекулярную массу структуры, осуществляющей определенную ферментативную реакцию. Суть метода заключается в том, что при воздействии на молекулы фермента частиц с высокой энергией происходит разрушение структуры, ответственной за ферментативную активность, причем существует определенное соотношение между молекулярной массой такой структуры и дозой энергии, вызывающей ее инактивацию. С использованием метода радиоинактивации было показано, что связывание специфического ингибитора уабаина и АТФ в области низких концентраций обеспечивается структурой, масса которой составляет 100 кДа (Norby, Jensen, 1989). В то же время молекулярная масса Ш,К-АТФазы, которая производит гидролиз АТФ в области насыщающих концентраций, была оценена методом радиоинактивации примерно в 200 кДа, что близко к молекулярной массе димера (а)2 (Norby, Jensen, 1989). Авторы заключили, что поскольку разрушение ß-субъединицы Ш,К-АТФазы не влияет на ее ферментативную активность, метод радиоинактивации дает информацию о молекулярной массе каталитической субъединицы или ее ассоциатов (а)п. По их мнению в состав функционирующей молекулы №,К-АТФазы входит две а-субъединицы, и ее четвертичную структуру можно представить как (aß)2 (Norby, Jensen, 1989).

Методом аналитического центрифугирования была определена молекулярная масса функциональной единицы №,К-АТФазы из ректальных желез акулы, солюбилизированной в неионном детергенте Ci2E8 (я-додециловый эфир октаэтиленгликоля) (Esmann, 1984). Она составила 300 кДа, что близко к молекулярной массе (aß)2. Одновременно были обнаружены и комплексы с молекулярной массой, соответствующей структуре (aß), которые со временем агрегировали, образуя (aß)2 димеры.

Применение гель-фильтрации и лазерного малоуглового светорассеивания показало, что при изменении концентрации С12Е8 от 0,1 до 5 мг/мл молекулярная масса солюбилизированной Na,К-АТФ азы уменьшается от 280 до 150 кДа, то есть происходит диссоциация (aß)2 олигомера до протомера (aß). Фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол вызывают агрегацию протомеров, а АТФ и АДФ

предотвращают ее или вызывает диссоциацию уже образовавшихся олигомеров (Mimura et al., 1993). Константа равновесия между протомерной и олигомерной формой фермента, находящегося в солюбилизированном состоянии, зависит от конформации №,К-АТФазы: в конформации Е2 равновесие сдвинуто в сторону олигомера. Однако считают, что в мембране фермент в обеих конформациях существует в виде олигомера с различной прочностью взаимодействий между субъединицами (Kobayashi et al., 1997).

3. Механизм функционирования Na,K-AT<Da3bi.

3.1. Общая характеристика реакции, катализируемой Na,K-ATOa3oñ .

Na,K-ATOa3a гидролизует АТФ с образованием АДФ и неорганического фосфата. Общая реакция, осуществляемая ферментом, может быть описана следующим уравнением:

АТФ + Mg2+ + 3Na+ вн + 2К+нар о АДФ + Mg2+ + 3Na+Hap +2К+ВН +ФН

Осуществление полного цикла гидролиза АТФ Ыа,К-АТФазой требует присутствия всех субстратов реакции: то есть Na+, К+, Mg2+ и АТФ. При постоянной и достаточно высокой концентрации одного одновалентного катиона (например, К+) зависимость активности №,К-АТФазы от концентрации второго катиона описывается сигмоидой с коэффициентом Хилла около 3 для Na+ и около 2 для К+, что свидетельствует о наличии 3-х взаимодействующих центров связывания ионов Na+ и 2-х - ионов К+ (Robinson, 1975; Robinson, 1977). Ионы лития могут заменять ионы натрия в цитоплазматическом центре связывания ионов, однако они активируют Na,K-AT®a3y менее эффективно, чем ионы натрия. Во внеклеточном центре К+ может быть заменен другими одновалентными катионами, их способность активировать фермент уменьшается в ряду: К+, Rb+, NH/, Cs+, Li+, Na+ (см. Skou, 1992). №,К-АТФаза гидролизует АТФ в отсутствие ионов К+ (Na-АТФазная активность). Максимальная скорость гидролиза АТФ в среде без ионов К+ обычно не превышает 10% от активности, наблюдаемой в присутствии Na+ и К+, зависимость активности от концентрации АТФ имеет вид гиперболы с Км 0,2-0,3 мкМ (Neufeld, Levy, 1969; Campos, Beauge, 1994). Однако в присутствии 3 мМ Фн зависимость активности Na-АТФазы от концентрации АТФ может быть представлена суммой двух гипербол с Км для регуляторного участка 187 мкМ (Campos, Beauge, 1994). В

отсутствие ионов Na+ (в среде с К+ и Mg2+) гидролиз АТФ при нейтральных значениях рН не происходит (Нага, Nakao, 1986).

Субстратом №,К-АТФазной реакции могут быть как свободный АТФ (Км 147

■Л.

мкМ), так и комплекс М§АТФ (Км 224 мкМ). При этом Mg действует и как активатор, и как ингибитор №,К-АТФазы: при низких концентрациях Mg2+ активирует фермент с Ка =7,6 мкМ, а в концентрациях более 3 мМ свободный Mg2+ вызывает ингибирование ферментативной активности, образуя с ферментом неактивный комплекс (Plesner, Plesner, 1981).

Субстратная специфичность Na,K-A ТФазы.

Na,К-АТФ аз а не обладает абсолютной специфичностью по отношению к субстрату. Кроме АТФ этот фермент гидролизует другие нуклеотиды: ЦТФ, ИТФ, ГТФ, УТФ (Boldyrev, Svinukhova, 1982) и фосфорные эфиры: ацетилфосфат, карбамоилфосфат, и-нитрофенилфосфат (Robinson, Flashner, 1979; Gache et al., 1979). Все субстраты гидролизуются с образованием промежуточного фосфорилированного интермедиата, реакция во всех случаях ингибируется уабаином. Гидролиз нуклеотидов требует одновременного присутствия Na+ и К+, однако более высокая активность при относительно низких концентрациях Na+ наблюдается при гидролизе АТФ и ЦТФ.

3.2. Частные реакции, обеспечиваемые Na,K-AT<Da3oii.

Исследования механизма АТФазной реакции, сопряженной с транспортом ионов, привели к обнаружению так называемых "частных реакций", осуществляемых №,К-АТФазой. В начале 60-х годов было установлено, что гидролиз АТФ №,К-АТФазой происходит через промежуточную стадию, в результате которой образуется кислотостабильный фосфорилированный интермедиат, ЕР (Albers et al., 1963; Post et al., 1965). Фосфорильная группа АТФ переносится на остаток аспарагиновой кислоты Asp-369 а-субъединицы фермента (нумерация аминокислотных остатков дана для №,К-АТФазы из почек овцы) с образованием ацилфосфатной ковалентной связи (Shull et al., 1985).

Фосфорилирование остатка аспарагиновой кислоты а-субъединицы происходит в

+ 2 + среде с Na , Mg и АТФ, причем Na действует с внеклеточной стороны мембраны

(Blostein, 1979). №,К-АТФаза имеет высокое сродство к АТФ в реакции

фосфорилирования, Км составляет 0,1 мкМ (Norby et al., 1983). Разрушение

фосфорилированного интермедиата происходит при добавлении ионов К+. Часть фосфофермента способна реагировать с АДФ, образуя АТФ. Последний процесс был назван Ш+-зависимым АТФ/АДФ обменом (Fahn et al., 1968; Kaplan, 1982).

Были открыты и другие частные реакции, осуществляемые №,К-АТФазой:

9 4-

фосфорилирование фермента неорганическим фосфатом в присутствии Mg ; Na+/Na+ обмен, обнаруженный в тенях эритроцитов и сопряженный с АТФ/АДФ обменом; К+/К+ обмен, происходящий в присутствии Mg2+ и Фн (Simons, 1974). На основании обнаруженных явлений было сделано предположение о том, что Na,K-АТФазная реакция включает ряд стадий, а перечисленные процессы моделируют отдельные промежуточные реакции: обратимое фосфорилирование фермента в присутствии Na+ и распад фосфорилированного интермедиата под действием К+, а также сопряженные с этими стадиями реакции переноса катионов.

Изучение "частных реакций" расширило представление о механизме функционорования фермента и способствовало построению кинетических схем гидролиза АТФ, которые отличаются друг от друга в основном количеством и последовательностью стадий реакции. Однако практически все имеющиеся в настоящее время кинетические схемы основываются на схеме, первоначально предложенной Постом и Олберсом и их сотрудниками (Fahn et al., 1966; Post et al., 1969; Plesner, Plesner, 1981).

Эта схема предполагает последовательное протекание описанных ранее частных реакций (схема 1). В среде с Na , Mg и АТФ происходит включение в белок терминального фосфата АТФ, приводящее к образованию стабильного фосфорилированного интермедиата Е1Р, который в присутствии высоких концентраций ионов Mg2+ переходит в конформацию Е2Р. Эта стадия сопровождается изменением микроокружения ацилфосфатной связи, вследствие чего она становится доступной для воды. При этом происходит снижение сродства фермента к ионам Na+ и увеличение его сродства к К+. Связывание К+ с ферментом, происходящее с внеклеточной стороны мембраны, приводит к освобождению неорганического фосфата и свободного фермента в Е2-конформации. После перехода Е2-конформации в El цикл может повториться. Таким образом, схема Поста-Олберса включает, по крайней мере, четыре основные конформации фермента El, Е1Р, Е2Р, Е2, последовательно переходящие друг в друга под действием разных

лигандов (Na+, АТФ, Mg2+, К+). При этом конформация Е1Р чувствительна к АДФ, а Е2Р - к К+, и равновесие между ними контролируется ионами Mg2+.

Na+ Mg2+ К+

El+ATP <—»El-P->Е2-Р+Н20<—>E2+P¡ (1) АДР

Согласно этой схеме Na,K-ATФaзa связывает Na+ с внутренней стороны мембраны в состоянии El и освобождает его с наружной только в фосфорилированном состоянии Е1Р. Центры, с которыми происходит связывание К+, находятся на внеклеточной стороне мембраны (Blostein, Chu, 1977). Таким образом, участки, связывание Na+ с которыми обеспечивает активацию первой стадии цикла (фосфорилирование фермента), и участки, связывания К+ с которыми активирует дефосфорилирование фермента, расположены по разные стороны мембраны.

Описанная схема позволяет объяснить также природу АТФ/АДФ обмена и Na+/Na+ обмена, наблюдаемых в присутствии Mg2+, Na+, АТФ и АДФ, а также К+/К+ обмена, происходящего в присутствии Mg2+, Фн, К+ и АТФ. К+/К+ обмен и Na+/Na+ обмен не сопровождаются гидролизом АТФ, присутствие которого, однако, необходимо для протекания этих процессов. Согласно этой схеме энергия АТФ расходуется на стадии конформационного превращения фосфофермента Е1Р в Е2Р.

Окклюдированные катионы. Важным открытем, проливающим свет на механизм переноса ионов №,К-АТФазой, явилось обнаружение окклюдированных форм фермента. Ионы Na+ и К+ при переходе через мембрану в определенный момент времени становятся недоступны с обеих сторон мембраны. Ионы, "запертые" внутри Ыа,К-АТФазы были названы "окклюдированными" (Post et al., 1969; Glynn, Hoffman, 1971). Впервые окклюзия была продемонстрирована для К+ (Beauge, Glynn 1979; Glynn, Richards, 1982). Превращение Е2-формы Ыа,К-АТФазы с окклюдированным К+ в El происходит достаточно медленно. Поэтому после добавления К+ или Rb+ к фосфоферменту можно пропустить его через колонку с ионообменником (для того, чтобы связать свободные катионы), а затем наблюдать освобождение окклюдированного катиона.

Конформационное состояние №,К-АТФазы с окклюдированным К+ возникает, по-видимому, после гидролиза ацилфосфатной связи фосфоинтермедиата, а освобождение окклюдированного К+ предшествует (или совпадает) с переходом

фермента в состояние Е1. Стехиометрия окклюзии составляет 2 иона К+/АТФ-связывающий центр (Forbush, 1987).

Из схемы Поста-Олберса следует, что ионы Na+ окклюдируются Е1-Р формой фермента. Деокклюзия Na+ происходит значительно быстрее, чем деокюпозия К+. Существование El[Na]P формы удалось обнаружить, обрабатывая фермент химотрипсином, N-этилмалеимидом (Glynn, 1985), олигомицином (Esmann, Skou, 1985), или, используя в качестве фосфорилирующего субстрата, СгАТФ. Фосфорилирование фермента этим субстратом, а также обработка перечисленными выше агентами стабилизирует окклюдированную конформацию ElP[Na].

Основные конформационные состояния Ма,К-АТФазы.

Существование различий в конформационном состоянии №,К-АТФазы в присутствии Na+ (конформация Е1) и К+ (конформация Е2) было показано многими методами. Йоргенсен и его коллеги обнаружили, что при трипсинолизе мембраносвязанной Ка,К-АТФазы а-субъединица фермента разрушается, образуя различные продукты в зависимости от того, какой катион присутствует в среде инкубации ((5-субъединица фермента относительно устойчива к действию трипсина) (Jorgensen, 1975; Jorgensen, 1977; Jorgensen, 1988; Jorgensen, Collins, 1986). В Na,K-АТФазе, находящейся в среде К+ (конформации Е2), трипсин разрывает пептидную связь в положении, находящемся в середине полипептидной цепи: между Arg-438 и А1а-439. В результате этого из а-субъединицы (молекулярная масса 112 кДа) образуются два больших фрагмента, имеющих молекулярную массу 48 и 64 кДа. В среде с Na+ гидролизу трипсином подвергаются связи, которые расположены ближе rN-концу белка (Lys-30 - Glu-31, Arg-262 - Ile-263).

Различия в конформации №,К-АТФазы в Е1- и Е2-состояниях были зарегистрированы с помощью флуоресцентных зондов, таких как ФИТЦ (Karlish, 1980; Faller et al., 1991), 5-йодацетамидфлуоресцеин (ИАФ) (Kapakos, Steinberg, 1982), эозин (Karlish, 1980; Skou, Esmann; 1988).

Существуют данные о том, что конформации Е1- и Е2- различаются также по доле спиральных участков в молекуле а-субъединицы (DiNolfo et al, 1985), по реакционной способности ее сульфгидрильных групп при модификации их различными агентами (Shoot et al. 1980).

3.3. Модифицирующее действие АТФ на Na,K-AT<&a3y.

Схема Поста-Олберса описывает "частные реакции" и наличие особого "окклюдированного" состояния фермента, но не объясняет сложной роли АТФ в процессе работы фермента.

В 1974 году Скоу обнаружил, что при повышении концентрации АТФ для проявления полумаксимальной активности фермента требуются меньшие концентрации Na+ (сумма Na+ и К+ = 150 тМ), то есть происходит увеличение кажущегося сродства фермента к ионам Na+ при одновременном уменьшении его к ионам К+. Скоу заключил, что АТФ является не только субстратом, но и модулятором ферментативной активности, облегчая, по всей видимости, Е2-Е1 переход. При этом центр, связывание с которым обеспечивает модулирующее действие, имеет более низкое сродство к АТФ, чем тот центр, связывание АТФ с которым обеспечивает фосфорилирование фермента (Skou, 1974). Аналогичное действие оказывает и защелачивание среды (Skou, 1982). Влияние рН на El- и Е2-конформации №,К-АТФазы показывает, что переход Е2 в El обеспечивается за счет депротонирования фермента. Анализируя эти данные, Скоу пришел к заключению, что модифицирующее действие АТФ объясняется тем, что при высоких концентрациях этот нуклеотид обеспечивает депротонирование той группы, от которой зависит Е2-Е1 -переход (эффект Бора) (Skou, 1982).

Второй феномен, который часто рассматривается как проявление модифицирующего действия АТФ, заключается в том, что зависимость активности Ыа,К-АТФазы от концентрации АТФ в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид двух пересекающихся прямых со значениями Км, равными 1-2 и 100-200мкМ (Neufeld, Levy, 1969; Robmson, Flashner, 1979; Askari, 1987).

Ни один из этих феноменов не описывается схемой Поста-Олберса. В соответствии с этой схемой зависимость скорости гидролиза АТФ от концентрации субстрата должна быть гиперболической. Кроме того, схема Поста-Олберса не предполагает увеличения чувствительности фермента к Na+ при повышении концентрации АТФ, как и активации последней стадии цикла при связывании АТФ в центре низкого сродства (Karlish, Yates, 1978).

Для объяснения модифицирующего эффекта АТФ было предложено несколько гипотез. Они основаны на том, что №,К-АТФаза имеет два центра связывания АТФ

с различным сродством к нуклеотиду. В зависимости от предполагаемой природы второго центра объяснения сводятся к двум гипотезам. Согласно первой молекула фермента имеет аллостерический центр, связываясь с которым АТФ не гидролизуется, но изменяет кинетические параметры Ыа,К-АТФазы (за счет наличия отрицательных кооперативных взаимодействий между АТФ-связывающими центрами) (Post et al., 1972). Второе объяснение предполагает, что молекула фермента имеет один АТФ-связывающий центр, который имеет высокое сродство к АТФ в конформации El и низкое - в конформации Е2. Связывание АТФ с центром низкого сродства ускоряет переход конформации Е2 в El.

4. Механизмы регуляции активности Na,K-ATOa:$bi.

4.1. Участие 1>а,К-АТФазы в осуществлении различных функций клеток

животных.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что поведение Na-Hacoca в различных типах тканей в значительной степени влияет на функцию клеток.

В нейронах работа Na-Hacoca играет важную роль в поддержании нервной проводимости (Greene et al., 1987). На участие Na-Hacoca в функционировании скелетной мускулатуры указывают данные о том, что плотность молекул насоса в плазматической мембране фибробластов, живущих в культуре, после их перехода в микротрубочки увеличивается более, чем в 20 раз (Wolitzky, Fambrough, 1986). От нормального функционирования Na-Hacoca и сопряженных с ним систем ионного обмена зависит сократимость гладкой (Allen, Navran, 1984) и сердечной

(McDonough, Farley, 1993) мышц. В этих типах мускулатуры функционирование Na-

+ 2+

насоса сопряжено с работой Na -Ca обменника, который осуществляет обмен внутриклеточного Na на внеклеточный Ca (Moore et al., 1993). Ингибирование Na-насоса в этих тканях повышает концентрацию внутриклеточного Na+, что в свою очередь за счет активации Na+-Ca2+ обмена увеличивает вход Са2+ в клетку. Входящий Са2+ обеспечивает освобождение Са2+ из внутриклеточных источников (главным образом из саркоплазматического ретикулума), что, в конечном итоге, повышает сократимость гладкой и сердечной мускулатуры (см. McDonough, Farley, 1993). В нервной и мышечной тканях Na,K-AT®a3a играет важную роль в

активный транспорт

се Н Л о с

и

В «

а

н

о Я 5"

а о н а

<и н и 8 и

уабаин

ДРР + Р1 -^о^сг

^^ К+, 2 С1

ча^ Ыа+

сахара или аминокислоты

пассивный транспорт

Иа+ - ио мМ

К -4 мМ СГ - Ю5 мМ

§

о н №

69 Н е п

£ Я в

3

н "в к

я

г>

а

о »в Н м

Рис. 2. Системы вторичного транспорта, работа которых сопряжена с функционированием №-насоса (8кои, 1992).

/ поддержании внеклеточной концентрации К+. При напряженной работе мыщц уровень К+ во внеклеточной среде возрастает до 3 мМ в течение минут, активация Ыа,К-АТФазы ионами К+ приводит к нормализации концентрации ионов К+.

Na-Hacoc обменивает 3 внутриклеточных иона Na+ на два внеклеточных иона К+: таким образом, Na-Hacoc является электрогенным. Изучение вклада Na-Hacoca в мембранный потенциал гладкомышечных клеток в различных условиях показало, что активация Na-Hacoca увеличивает трансмембранный потенциал, в то время как его ингибирование снижает величину потенциала покоя на 5-25 мВ в зависимости от условий эксперимента (Flemming, 1980). Эти данные дают основание предполагать, что Na насос может играть важную роль в механизме возникновения некоторых физиологических явлений, в частности, в появлении постсинаптической сверхчувствительности возбудимых клеток к различным фармакологическим агентам (Flemming, 1980; Smith, 1984).

В эпителии почек №,К-АТФаза локализована в базолатеральной мембране и обеспечивает выброс Na+ из клеток в межклеточное пространство. Снижение концентрации Na+ в клетках почечного эпителия приводит к активации систем Na+-H+ обмена и №+,К+,СГ-котранспорта, которые расположены в апикальной мембране (рис. 2) и обеспечивают перенос Na+ из внутренней полости собирательных трубочек в клетки эпителия (Harris et al., 1986; Aperia et al., 1988; McDonough, Farley, 1993). Благодаря сопряженной работе этих транспортных систем обеспечивается трансэпителиальный транспорт (реабсорбция) Na+ в почках. Кроме того, Na-Hacoc играет существенную роль в регуляции объема клеток почечного эпителия (Harris et al., 1987).

Приведенные здесь данные о том, что в различных клетках №,К-АТФаза вовлечена в выполнение и регуляцию разнообразных функций, предполагают, что должны существовать различные способы регуляции активности этого фермента.

4.2. Изоферменты Na,K-ATOaibi и их свойства.

Одним из подтверждений предположений о том, что Ш,К-АТФаза может регулироваться различными способами, было открытие изоформ а- и р-субъединиц фермента, а также изучение их кинетических свойств и распределения в различных тканях. Как было сказано выше, обнаружено три изоформы а-субъединицы Na,K-

АТФазы (для потенциальной четвертой изоформы пока выявлен только ген) и четыре изоформы (3-субъединицы, из которых у млекопитающих обнаружено только три.

Зрелая информационная РНК, с которой осуществляется трансляция полипептидной цепи al-изоформы Na,К-АТФазы, кодирует 1021-1023 аминокислоты, первичный продукт гена, кодирующего а2-изоформу, состоит из 1017-1020 аминокислотных остатков (Shull et al., 1986). При пострансляционной модификации первые пять N-концевых аминокислот у двух этих изоформ удаляются (Lytton, 1985). аЗ-Изоформа Ш,К-АТФазы содержит 1013 аминокислотных остатков и не подвергается посттрансляционной модификации (Владимирова и соавт., 1995). Гомология в аминокислотной последовательности между al- и а2-изоформами субъединиц №,К-АТФазы, встречающейся у различных видов, составляет 92%, и более 96% для аЗ, что выше, чем гомология между различными изоформами у одного вида (около 87%). Наиболее дивергентной является а4-изоформа: гомология между al- и а4-изоформами составляет 78% (см Blanco, Mercer, 1998).

Для изоформ а-субъединицы характерна избирательная экспрессия в различных органах и тканях взрослой особи, наблюдается также смена изоформ в процессе эмбрионального развития и во время некоторых болезней, обусловленная, по-видимому, различным влиянием на синтез изоформ некоторых гормонов, в частности, тироксина (Sweadner, 1989). al-Изоформа является преобладающей (хотя и не единственной) во всех сегментах почек (Barlet-Bas et al., 1993), а2 представлена в нейрональной ткани, желудочках сердца, адипоцитах и является основной изоформой каталитической субъединицы в скелетных мышцах, хотя в них обнаруживаются все три изоформы (Mercer, 1993). аЗ-Изоформа встречается главным образом в мозге (Lingrel, 1992), хотя присутствует и в других тканях (Barlet-Bas et al., 1993).

Трансфекция субъединиц в клетки HeLa привела к определению специфического сродства к катионам для каждой изоформы. №,К-АТФаза, содержащая al- и а2-субъединицы имеет одинаковое сродство для внеклеточных ионов К+ (К0,5 = 0,2 мМ), что в 3 раза ниже, чем у фермента, содержащего аЗ- изоформу (К0;5 = 0,09 мМ). Для Na,К-АТФазы, в составе которой имеются al- и а2-субъединицы, характерно близкое сродство для внутриклеточных ионов Na+ (К0,5 = 17-19 мМ), что в 3 раза

выше, чем для фермента, содержащего аЗ-изоформу (К0;5 = 63 мМ) (Munzer et al., 1994).

Хотя прослеживается видовая чувствительность к уабаину, Na,K-AT<Da3a одного вида животных, содержащая различные изоформы а-субъединицы, различается по сродству к этому гликозиду. Наименее чувствительна к уабаину №,К-АТФаза, содержащая al-изоформу: так, у млекопитающих 150 для этого изофермента составляет около 10"6 М, а у грызунов - 10"4 М. Более чувствительные к уабаину изоферменты с а2- и аЗ-изоформами характеризуются значениями 150 в ряду 10"7-10"8 M (Sweadner, 1989; Mercer, 1993).

Чувствительность Na,K-ATOa3bi к уабаину в значительной степени зависит от структуры N-концевой части а-субъединицы, она определяется тем, какие аминокислотные остатки расположены в 113 и 124 положении (Price, Lingrel, 1988). Однако чувствительность к уабаину не является единственным критерием для определения принадлежности а-субъединиц №,К-АТФазы к тому или иному типу изоформ, поскольку существуют различия в чувствительности к уабаину для одной и той же изоформы у разных видов. Современная идентификация изоформ каталитической субъединицы основана главным образом на определении N-концевой аминокислотной последовательности. Степень вариабельности этой последовательности для отдельных изоформ выше, чем для одной изоформой различных видов (Shull et al., 1986).

Для Р-субъединицы также характерен различный уровень экспрессии в разных тканях, pi-Субъединица №,К-АТФазы широко распространена у млекопитающих, но отсутствует в некоторых типах астроцитов, в вестибулярных клетках и в мышцах, основным источником энергии для которых является гликолиз. (Ewart, Klip, 1995). Р2-Изоформа обнаруживается главным образом в нервной ткани (Martin-Vasallo et al., 1989; Peng et al., 1997), где она идентифицирована также как белок, обеспечивающий адгезию клеток (Gloor et al., 1990). Она встречается также в скелетных мышцах (Lavoie et al, 1997), РЗ характерна для тканей семенников, печени и легких (Arystarkhova, Sweadner, 1997; Malik et al, 1996). Различия в аминокислотной последовательности между изоформами Р-субъединиц более выражены (гомология составляет около 30%), чем различия в последовательности изоформ а-субъединицы (Arguello et al., 1996). Однако степень гомологии для одной

и той же изоформы (3-субъединицы у различных видов высока (около 90%). [31-субъединица по сравнению с другими изоформами имеет добавочные 14 аминокислотных остатков в средней части молекулы. Хотя Р-субъединица не принимает непосредственного участия в катализе, свойства каталитической а-субъединицы зависят от того, с какой Р-формой она ассоциирована. При экспрессиии трех а- и двух Р-изоформ (Р1 и Р2) в клетках насекомых были получены изоферменты, состоящие из различных комбинаций а- и р- (Blanco et al., 1995; Blanco, Mercer, 1998). У таких форм чувствительность к Na+ и К+ определяется в этом случае не только изоформой а-субъединицы, но зависит также от изоформы Р-субъединицы. Изоферменты а2р2 и aip2 по сравнению с aipi изоформой характеризуются более низким сродством к К+ и более высоким сродством к Na+ и АТФ. Так, чувствительность к Na+ уменьшается для изоферментов в следующем ряду : a2p2>a2pi>aipi=a3p2>a3pi. В то же время чувствительность к уабаину у комбинированных форм зависит главным образом от изоформы а-субъединицы: наиболее чувствительными к этому гликозиду являются a3pi- и аЗр2-изоферменты, тогда как a2pi и а2р2 характеризуются промежуточной, а alpi - минимальной чувствительностью (Blanco, Mercer, 1998).

4.3. Регуляция активности Na,K-ATOa3bi за счет взаимодействия с липидным бислоем мембраны.

Для сохранения ферментативной активности КаД-АТФазы, как и всех интегральных белков, необходимо гидрофобное окружение, которое обеспечивают липиды мембран. Фосфолипидный бислой поддерживает конфигурацию молекулы белка. Растворение мембранных структур детергентами приводит к выделению интегральных белков в комплексе с липидами. Растворенная в детергенте Na,K-АТФаза может содержать до 50 молекул фосфолипидов и 40 молекул холестерина на (аР)2 олигомер (Esmann et al., 1980). Удаление липидов приводит к агрегации белка с одновременным снижением ферментативной активности ЫаД-АТФазы, которая может быть восстановлена после релипидизации (Ottolenghi, 1979). При изучении способности фосфолипидов реактивировать делипидированные препараты Na,K-АТФазы было выяснено, что способностью реактивировать фермент обладают разнообразные липиды и не обязательно те, которые окружали его в нативной

мембране (Blanquet, 1983). Однако значительная реактивация обедненного липидами фермента происходит при добавлении отрицательно заряженных фосфолипидов: фосфотидилсерина или фосфатидной кислоты (Goldman, Albers, 1973).

Одна из особенностей регуляции функции мембранных ферментов заключается в том, что активность таких ферментов зависит от состояния липидного бислоя. Изучение №,К-АТФазы и родственной ей Са-АТФазы показало, что изменение микровязкости мембранного бислоя коррелирует с изменением активности фермента: впервые это было отмечено при изучении графиков Аррениуса для мембранных ферментов. Установлено, что графики Аррениуса для Ка,К-АТФазы и Са-АТФазы имеют перегибы в области температуры 18-20° С (Charnock et al., 1971; Grisham, Barnett, 1973; Barnett, Pallazzotto, 1974; Boldyrev et al., 1977 ). В этой же области температур было обнаружено изменение некоторых параметров, характеризующих структурированность липидного бислоя мембраны (Grisham, Barnet, 1973; Barnett, Pallazzo, 1974; Boldyrev et al., 1977). Было высказано предположение, что перегиб на графиках Аррениуса для ион-транспортирующих АТФаз обусловлен фазовыми переходами в липидном бислое мембраны.

Различные воздействия на мембранный бислой, устраняющие структурные перестройки в липидах (например, обработка мембран фосфолипазами, обогащение их холестерином, увеличение концентрации двухвалентных ионов в среде инкубации) приводят к устранению перегибов на графике Аррениуса для Na,K-АТФазы (Charnock et al., 1973; Farias et al., 1975; Болдырев, 1981). Однако ввиду того, что для биологических мембран из-за разнообразия входящих в его состав фосфолипидов не наблюдается чисто фазовых переходов, то, по-видимому, на активность мембранных ферментов воздействует происходящее в мембране разделение фаз или другие структурные перестройки липидного бислоя.

4.4. Долгосрочная регуляция активности Na,K-ATOa3bi.

Регуляция количества молекул Na,K-ATOa3bi в клетке. Количество молекул ЫаД-АТФазы в клетке определяется соотношением скоростей синтеза субъединиц Ыа,К-АТФазы, их встраивания в мембрану и деградации. В середине 70-х годов Кук и соавторы, изучая скорость интернализации комплексов радиоактивного уабаина с Ыа,К-АТФазой в HeLa клетках, определили константу скорости деградации фермента в 0,13 ч"1, что соответствует времени полужизни молекулы фермента 5,4 ч

(Will et al., 1977). В клетках, выдержанных в растворах с низкой ионной силой, время полужизни Na,K-ATOa3bi увеличивается до 12,8 ч. Константы скорости деградации, определенные для a- (Lo, Edelman, 1976) и р-субъединиц (Lo, Lo, 1980) фермента из коркового слоя почек, оказались значительно меньше: 0,05 и 0,09 ч"1. Для Na,K-АТФазы культуры сенсорных нейронов константа скорости деградации равна 0,017 ч"1 (Tamkun, Fambrough, 1986). Таким образом, время полужизни молекул Na,K-АТФазы в зависимости от типа клеток и условий может изменяться более, чем в 30 раз.

Скорость синтеза №,К-АТФазы значительно возрастает через 12-18 ч в ответ на повышение концентрации Na+ внутри клетки, вызванное активацией Na-каналов, но активация синтеза является временным явлением и длится около 36 ч (Wolitzky, Fambrough, 1986). Увеличение внутриклеточной концентрации Na+, вызванное активацией Na-каналов, сначала повышает скорость синтеза молекул Ка,К-АТФазы, после чего наблюдается снижение скорости их деградации. В результате этих процессов происходит увеличение общего количества молекул Ш,К-АТФазы в клеточной мембране. Интересно, что изменение в уровне транскрипции и/или в стабильности мРНК Р-субъединицы может привести к образованию большего числа оф-комплексов вследствие стабилизации а-субъединицы, которая в другом случае деградирует. С другой стороны, в эпителиальных клетках, при мечении метаболитами эндогенных а или Р-субъединиц было показано, что pi-субъединица синтезируется в избытке, но быстро деградирует. Оставшееся число pi-субъединиц определяет количество молекул №,К-АТФазы. Таким образом, регуляция количества молекул №,К-АТФазы в клетке достигается за счет изменения скорости синтеза и деградации субъединиц фермента. Возможность регуляции ферментативной активности за счет изменения скорости встраивания или мобилизации молекул №,К-АТФазы, находящейся в запасенном виде, в настоящее время представляется сомнительной (Pressley, 1988).

Скорость синтеза субъединиц №,К-АТФазы регулируется под действием различных гормонов. Тиреоидные гормоны (Тз) увеличивают количество молекул №,К-АТФазы в таких типах тканей как почки, кишечник, сердечные и скелетные мышцы (Feng et al., 1993). Действие тиреоидных гормонов зависит от стадии развития ткани. Это достигается за счет их эффектов на транскрипционном,

посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях. Установлено, что Т3, связываясь в ядре с рецептором, обладающим высоким сродством к гормону, активирует таким образом транскрипцию ряда генов, в частности, генов №,К-АТФазы. У человека Т3 способен прямо стимулировать транскрипцию (Feng et al., 1993), тогда как в мозге грызунов в период неонатального развития активация происходит за счет регуляции на посттранскрипционном уровне (Corthesy-Theulaz et al., 1991). Трииодтиронин стимулирует синтез новых молекул №,К-АТФазы, по-разному активируя гены, кодирующие различные изоформы фермента. При инъекции нормальным крысам тиреоидных гормонов происходит увеличение активности ИаД-АТФазы, которая высокочувствительна к действию уабаина (вероятно, а2 изоформа). С другой стороны, в скелетных мышцах тиреоидные гормоны не вызывают изменений в количестве al - и ßl-мРНК, тогда как количество а2-мРНК и белка увеличивается в 5 и 3 раза соответственно, а ß2-MPHK и белка ß- субъединицы - в 4 и 2 раза (Azuma et al., 1993). Напротив, количество al-и ßl-субъединиц №,К-АТФазы в почках после 8 дневной обработки гормоном возрастает приблизительно в 1,6 раза. Тиреоидные гормоны не изменяют каталитические свойства фермента.

Механизм стимуляции активности №,К-АТФазы стероидными гормонами также связан с увеличением количества молекул фермента в клетке. Однако в отличие от тиреоидных гормонов, стероиды оказывают свое влияние быстрее (1-12 ч). Показано, что синтез a-субъединицы №,К-АТФазы в почках у животных с удаленными надпочечниками увеличивается через 3 часа после воздействия альдостерона (Knox, Sen, 1974). Рост активности фермента наблюдали также после инкубации изолированных проксимальных канальцев, полученных из почек кролика и крысы с удаленными надпочечниками, с альдостероном в течение 1 ч (Horster et al, 1980; Rayson, Lowther, 1984). Альдостерон увеличивает реабсорбцию Na+ и освобождение К+ в эпителии дистального отдела нефрона, активируя гены, кодирующие а- и ß-субъединицы Ка,К-АТФазы (Horisberger, Rossier, 1992). В большинстве тканей, отвечающих на альдостерон (почки, кишечник, сердечные и скелетные мышцы) в одинаковой степени увеличивается скорость синтеза а- и ß-субъединиц фермента (Ewarts, Klip, 1995). Активация синтеза обусловлена наличием чувствительных к альдостерону элементов, которые присутствуют в промоторных

областях гена а- и ß-субъединиц (Horisberger, Rossier, 1992). Эксперименты по совместной трансфекции а- и ß-субъединиц 1Ча,К-АТФазы в HeLa клетках дают основание полагать, что связывание минералокортикоидов в промоторных областях препятствует транскрипции, которая индуцируется связыванием цАМФ в промоторе гена а 1-субъединицы (Ahmad, Medford, 1995). В большинстве случаев эффект альдостерона на экспрессию ограничивается действием на al и ßl изоформы субъединиц №,К-АТФазы.

Таким образом, долговременная регуляция активности №,К-АТФазы в различных тканях связана с активацией генов, кодирующих субъединицы этого фермента стероидными и тиреоидными гормонами. При этом синтезируются мРНК различных изоформ субъединиц ЫаД-АТФазы. Конечное увеличение активности фермента зависит также от эффективности трансляции вновь синтезированных матриц, соотношения различных субъединиц и их собственной ферментативной активности.

Однако активация Ка,К-АТФазы за счет синтеза новых молекул требует часов и даже суток, в то время как ответ клетки иногда необходимо получить в значительно более короткое время. Это достигается с использованием краткосрочных механизмов регуляции.

4.5. Краткосрочная регуляция активности Na,K-AT<Da3bi.

При нормальной вне- и внутриклеточной концентрации ионов Na+ и К+ Na,K-АТФаза проявляет активность, составляющую около 10-15% от максимально возможной. Резерв активности Na-Hacoca крайне необходим, в частности, при тяжелой мышечной работе, когда мышца теряет ионы К+, и выходящий К+ активирует Na,K-ATPa3y (Pressley, 1988). Кроме того, повышение внутриклеточной концентрации Na+, которое регулярно возникает за счет его входа в клетку через Na-каналы, будет также активировать Ыа,К-АТФазу. Эти изменения в концентрации ионов приводят к быстрому (минуты) изменению активности №,К-АТФазы (Bertorello, Katz, 1993).

Фосфорилирование Na,K-A ТФазы протеинкиназами.

Одним из механизмов, который может обеспечить вовлечение Ыа,К-АТФазы в общие пути передачи сигнала в клетке, является ее посттрансляционная

модификация, к которой относится и фосфорилирование различными протеинкиназами. В настоящее время показано, что Na,K-AT<Da3a фосфорилируется, по-крайней мере, тремя протеинкиназами: цАМФ-зависимой (ПКА), Са2+,фосфолипид-зависимой (ПКС) и Са2+-кальмодулин зависимой протеинкиназами.

По имеющимся в настоящее время данным, кроме регуляции ионами-активаторами, активность №,К-АТФазы находится под контролем других быстродействующих механизмов, обеспечивающих синхронный и быстрый ответ клетки на внешние стимулы. В ряде тканей различные агонисты, действующие на изменение клеточного уровня цАМФ, на уровень и распределение ПКС, на концентрацию эйкозаноидов, модулируют активность Ка,К-АТФазы. Так, появились данные об участии протеинкиназы А в регуляции активности ИаД-АТФазы в миометрии (Turi, Somogyi, 1988) и ректальных железах акулы (Marver et al., 1986), результаты, свидетельствующие о регуляции этого фермента in vivo дибутирильными производными цАМФ и форболовыми эфирами (Vasilets et al., 1990; Vasilets, Schwartz, 1992), а также данные о том, что эффекты нейромедиаторов и гормонов на активность Ыа,К-АТФазы в нейронах и клетках нефронов могут обеспечиваться за счет ее фосфорилирования протеинкиназами (Aperia et al., 1992; Ibarra et al., 1993; Satoh et al., 1992). In vivo , в ответ на стимуляцию ПКА или ПКС наблюдается или активация, или ингибирование активности фермента (см Bertorello, Katz, 1993), однако механизм действия протеинкиназ на этот переносчик ионов до настоящего времени не изучен. Практически в каждой работе выдвигаются гипотезы о роли фосфорилирования молекулы Ка,К-АТФазы, о его возможном влиянии на активность фермента. Тем не менее работ, в которых достоверно продемонстрировано влияние фосфорилирования на активность, мало.

Фосфорилирование Ка,К-АТФазы ПКС.

№,К-АТФаза является мишенью для фосфорилирования ПКС как in vitro (Lowndes et al., 1990; Bertorello et al., 1991; Béguin et al., 1994; Logvinenko et al., 1996); так и in vivo (Pedemonte et al., 1997). Для al-изофермента из Bufo Marinus и крысы были идентифицированы участки, по которым происходит фосфорилирование: они располагаются в N-концевой части а-субъединицы фермента (Béguin et al., 1994; Feschenko, Sweadner, 1995). Вопрос о влиянии фосфорилирования Ш,К-АТФазы под действием ПКС на активность фермента

остается спорным: в зависимости от типа ткани и условий экспериментов показано, что стимуляция ПКС приводит к ингибированию (Vasilets et al., 1990; Bertorello et al., 1991), активации (Middleton et al., 1993) или не влияет (Feschenko, Sweadner, 1994) на активность Na,K-ATOa3bi.

Фосфорилирование №,К-АТФазы ПКА.

Еще в конце 70-х годов было показано, что каталитическая субъединица цАМФ-зависимой протеинкиназы фосфорилирует частично очищенный препарат Na,К-АТФазы из почек кролика. При этом более 50% [у- Р]АТФ от общего ее количества, включившегося в белки препарата, находилось в полипептиде с молекулярной массой 100 кДа, соответствующего а-субъединице фермента (Mardh, 1979). Однако приведенные в цитируемой работе результаты не получили подтверждения в дальнейших исследованиях (например, способность №,К-АТФазы фосфорилироваться ПКА в отсутствие детергента, высокая скорость фосфорилирования). Кроме того, автор не обнаружил влияния фосфорилирования на активность Na,К-АТФазы. В 1991 году вышла работа, в которой было показано, что протеинкиназа А фосфорилирует а-субъединицу №,К-АТФазы из ректальных желез акулы со стехиометрией 1 мольФн /моль а-субъединицы фермента (Bertorello et al., 1991). Под действием протеинкиназы А фосфорилированию подвергался только сериновый остаток. Фосфорилирование №,К-АТФазы под действием ПКА сопровождалось ингибированием ферментативной активности на 40-50%. Кроме того, Берторелло и соавторы показали, что фосфорилирование а-субъединицы Na,K-АТФазы под действием протеинкиназы А возможно только в присутствии детергента (Bertorello et al., 1991), чего не отмечал Мард (Mardh, 1979).

Данные Берторелло и соавторов о том, что фосфорилирование Na-насоса протеинкиназой А происходит только в присутствии детергентов, было подтверждено позднее и другими авторами (Chibalin et al., 1992; Béguin et al., 1994), поэтому возникли сомнения в том, что фосфорилирование фермента ПКА происходит in vivo и что оно может иметь физиологическое значение. В 1994 году усилиями группы профессора К. Гиринг было установлено, что как in vivo, так и in vitro в присутствии детергента, в al-субъединице из Bufo marinus под действием протеинкиназы А фосфорилируется только Ser-943 (Béguin et al., 1994). Было также показано, что после экспрессии в клетках нормальной и мутантной форм а-

субъединицы ШД-АТФазы из почек крысы, в которой Ser-943, гомологичный Ser-938 а-субъединицы КаД-АТФазы из Bufo marinus, был заменен на аланин, активация цАМФ-зависимой протеинкиназы фармакологическими агентами (форсколин и 3-изобутирил 1-метилксантин) вызывает ингибирование КаД-АТФазы только в клетках с немутантной формой а-субъединицы (Fisone et al., 1994). Важность фосфорилирования этого участка подтверждается также тем, что остаток серина, гомологичный Ser-943 al-субъединицы и расположенный в последовательности (KTRRNSVF), которая делает этот серии предпочтительным субстратом для протеинкиназы А, консервативен для всех изоформ а-субъединиц Na,K- иНД-АТФазы (Sweadner, 1989).

Таким образом, фосфорилирование а-субъединицы №Д-АТФазы протеинкиназой А по единственному остатку серина происходит in vivo, однако физиологическая роль фосфорилирования №Д-АТФазы остается неясной. Кроме того, неизвестны оптимальные условия фосфорилирования ЫаД-АТФазы ПКА in vitro, а также функциональные изменения, происходящие с Na-насосом при такой ковалентной модификации.

4.6. Белки, взаимодействующие с №,К-АТФазой.

Тот факт, что участок фосфорилирования ЫаД-АТФазы в клетке доступен для протеинкиназы А, а в очищенном препарате фермента и даже во фракции микросом недоступен для нее (Chibalin et al., 1992), позволяет считать, что конформация фермента в клетке иная, чем после его очистки. Одно из возможных объяснений заключается в том, что в клетке №Д-АТФаза взаимодействует с другими белками, которые влияют на конформацию фермента и, возможно, на его активность или на взаимодействие с ним других регуляторов. Известно, что ЫаД-АТФаза в клетке связывается с анкирином (Nelson, Veshhok, 1987), белком, обеспечивающим взаимодействие интегральных мембранных белков с актин-спектриновым скелетом, расположенным около мембраны со стороны цитоплазмы (рис. 3). В свою очередь цитоскелет в последнее время рассматривается как один из путей передачи сигнала в клетке (Cowin, Burke, 1996). Кроме того, чувствительность АТФазы из некоторых органов к уабаину может изменяться после взаимодействия ЫаД-АТФазы с кальмодулином и тропомиозином, которые сами на активность фермента не влияют

Рис. 3. Схема, иллюстрирующая взаимодействие Ка,К-АТФазы с внешней средой (через Р-субъединицу) и цитоскелетом (через анкирин).

(Lelievre et al., 1985). Среди тех кандидатов на роль регуляторных белков, которые могут непосредственно взаимодействовать с ЫаД-АТФазой, есть и G-белок, который, по-видимому, вовлечен в обеспечение ингибирования фермента при активации мускариновых рецепторов (Danilenko et al., 1990).

Анкирин. На сегодняшний день установлено, что как в опытах in vitro, так и в тканях, анкирин взаимодействует со следующими интегральными белками: амилорид- и потенциалзависимыми №+-каналами; Ка+/Са2+обменником из сердца, СГ/НС03-обменником эритроцитов (он же белок полосы 3), Na,K- и Н,К-АТФазами и молекулами, обеспечивающими клеточную адгезию (семейство нейрофасцинов -ABG205) (Bennett, 1993).

Анкирин был впервые обнаружен в эритроцитах, но позже выявлен в мозге и эпителиальной ткани. С помощью техники молекулярного клонирования было обнаружено 3 гена, кодирующих различные изоформы анкиринов, которые экспрессируютя в клетках позвоночных. Продуктами гена ANK1 являются изоформы анкирина эритроцитов (Ankl или AnkR) с молекулярной массой 210-220 кДа и множественные изоформы анкирина в скелетных мышцах. ANK2 кодирует семейство белков из мозга (Ank2 или AnkB). В эпителиальных клетках (базолатеральная поверхность эпителия почек, кишечника и других эпителиальных клеток, апикальная поверхность эндотелиальных клеток сетчатки), в аксонном холмике и перехватах Ранвье были обнаружены изоформы анкиринов, кодируемых геном ANK3. Продукты этого гена взаимодействуют с мембранными белками, такими как №,К-АТФаза, эпителиальная изоформа С17НС03" обменника, амилорид-чувствительный Na-канал, Е-кадгерин (Peters, Lux, 1993). Совсем недавно появилась информация о новой изоформе анкирина (Ankol90), экспрессируемой в почках и легких (Thevananter et al., 1998).

Молекула анкирина состоит из 3-х доменов: N-концевого (мембраносвязывающего) домена с молекулярной массой 89 - 95 кДа (Michaely, Bennett, 1993), спектрин-связывающего домена с молекулярной массой 62-72 кДа (Bennett, 1992) и С-концевого домена с молекулярной массой 55 кДа, который в эритроцитарном анкирине выполняет регуляторную функцию. С-концевой фрагмент представляет собой 20 кДа субдомен, который удаляется под действием протеазы кальпаина. Этот субдомен обуславливает некоторую асимметрию в целом

правильной глобулярной молекулы анкирина. В составе молекулы анкирина имеется ковалентно связанная жирная кислота, функция которой неясна (возможно, она необходима для взаимодействия с мембраной) (Hall, Bennett, 1987). Аминокислотные повторы, очень напоминающие анкириновые повторы в N-концевом домене, выявлены во многих, совершенно разных белках: в белках, управляющих клеточным циклом, регулирующих дифференцировку тканей, в некоторых факторах транскрипции, в токсине из яда паука "чёрная вдова", а также мембранном белке, ответственном за транспорт ионов К+ в растениях. Этот повтор выглядит следующим образом: -G-TPLH-AA--GH—V/A--LL--GA--N/D—(Peters, Lux, 1993). С-конец анкирина является наиболее иммуногенной частью молекулы.

Взаимодействие анкирина с Ма,К-АТФазой. На сегодняшний день о взаимодействии этих двух белков известно не так много, и практически нет информации о влиянии анкирина на активность и конформацию №,К-АТФазы. In vitro анкирин связывается с №,К-АТФазой в молярном соотношении 1:4 с Кд=2,6*10"6 М (Morrow et al., 1989), по другим данным: в соотношении 1: 20 (Nelson, Veschnock, 1987). Известно, что в почечных клетках Na,K-ATOa3a, фодрин (аналог эритроцитарного спектрина) и анкирин совместно располагаются в базолатеральной части клетки только после достижения клетками зрелого состояния. До этого момента перечисленные белки распределяются в клетке различным образом: Na,K-АТФаза в плазматической мембране, фодрин в цитоплазме, анкирин ассоциирован с мембранами, как с плазматической, так и с внутренними (Morrow et al., 1989). Поляризация наступает вследствие деградации фермента, не связанного с анкирином (Marrs et al., 1993). В экспериментах №,К-АТФаза из почек и 43кДа цитоплазматический домен белка полосы 3 конкурируют за ассоциацию с анкирином, но заметных гомологий в первичной структуре этих белков не обнаружено (Morrow et al., 1989). Малая цитоплазматическая петля и большой цитоплазматический домен №,К-АТФазы взаимодействуют с анкирином in vitro (как с Ankl, так и с Ank 3), причем малая петля (кодоны 140-290) проявляет большее сродство, чем большой цитоплазматический домен (кодоны 345-784) (Devarajan et al 1994). Первичная структура малой цитоплазматической петли высококонсервативна между видами и изоформами фермента, включая и Н,К-АТФазу (75% гомологии) и ограниченный участок в Са-АТФазе (195-247 остатки). Гомологии с другими анкирин-связывающими интегральными белками не обнаружено. Связывание Na,K-

АТФазы с анкирином не зависит от того, в какой конформации (El, или Е2) находится фермент (Nelson, Veshnock, 1987). Методом иммунопреципитации было показано, что анкирин и а-субъединица №,К-АТФаза образуют комплекс in vivo (Thevananter et al., 1998)

Пектины и их влияние на активность Na,К-А ТФазы. Лектины - это большое семейство гомологичных белков, участвующих в связывании углеводов. Лектины принимают участие в регуляции процессов адгезии и пролиферации клеток. Они различаются по специфичности связывания углеводов, но похожи по своим физико-химическим свойствам. Лектины состоят из 2-4х субъединиц с молекулярной массой 25-30 кДа, каждая из которых содержит один участок связывания с углеводами. Для проявления связывающей активности требуются ионы Ca или Mn (Sharon, Lis, 1990). Первоначально лектины были выделены из семян растений. Недавно было показано, что белки со свойствами лектинов имеются не только у растений, но и у животных (так называемые галектины) (Kasai, Hirabayashi, 1996). Биологическая значимость галектинов в настоящее время изучена недостаточно. Известно, что галектины вовлечены в дифференцировку и морфогенез. Галектины и лектины (в частности, конканавалин А) имеют общую топологию несмотря на отсутствие гомологий в аминокислотной последовательности. ß-Субъединица №,К-АТФазы по своей структуре весьма сходна с рецептором для лектинов и является фактором адгезии клеток (Gloor et al., 1990). Из литературных данных известно, что препараты Na,К-АТФазы, выделенные из почек собаки, электрического органа угря и ректальных желез акулы образуют комплексы с конканавалином А (лектин из Canavalii ensiformis). Однако существуют противоречивые данные о влиянии конканавалина А на активность №,К-АТФазы. С одной стороны, было показано, что конканавалин А в соотношении 1 молекула №,К-АТФазы к 4 молекулам лектина ингибирует активность фермента из почек собаки (Zaheer et al., 1981) и из электрического органа угря (Swan, et al., 1975), но практически не влияет на активность очищенных препаратов из ректальных желез акулы и электрического органа угря (Perrone, Hokin, 1978). В то же время, инкубация лимфоцитов человека с конканавалином А вызывает увеличение внутриклеточной концентрации ионов Na+ и уменьшение внеклеточной концентрации ионов К+, что,

по-видимому, происходит вследствие увеличения активности Na-насоса (Averdunk, Gunter, 1980).

Мелиттин. Возможным регулятором активности ИаД-АТФазы и других АТФаз Р-типа может оказаться белок, получивший название мелиттин. Известно, что три наиболее изученных АТФазы Р-типа: №,К-АТФаза (Raynor et al., 1991; Cuppoletti, Abbot, 1990), Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (Mahaney, Thomas, 1991; Baker et al., 1995) и Н,К-АТФаза из слизистой оболочки желудка (Cuppoletti et al., 1989; Cuppoletti, 1990) ингибируются мелиттином. Мелиттин представляет собой 26-членный амфипатический пептид из яда пчелы Apis mellifera. Центральная часть молекулы мелиттина состоит из гидрофобных аминокислот, при этом суммарный заряд его молекулы составляет +6 (4 из них расположены в С-концевом участке молекулы мелиттина (K-R-K-R), один представляет собой аминогруппу и еще один - К-7 в N-концевой последовательности). Отрицательно заряженных аминокислот в мелиттине нет. Первичная структура мелиттина

представлена ниже:

+ + + + + +

nh2g-i-g-a-v-l-k-ví-t-t-g-l-p-a-l-i-s-t-i-k-r-k-r-q-q-cooh

Несмотря на высокое содержание гидрофобных аминокислот мелиттин хорошо растворим в воде. В водном растворе он существует как мономер с неупорядоченной структурой или как тетрамер с преобладанием a-спиральной структуры. Мономерная форма мелиттина преобладает при низких значениях pH, а также при низкой концентрации пептида, если раствор имеет низкую ионную силу при нейтральных и щелочных pH. При высокой ионной силе или при высоких концентрациях мелиттина преобладающей формой является тетрамер. Димер в водном растворе практически не формируется (Dempsey, 1990).

Мелиттин взаимодействует с различными белками и с фосфолипидами. Он способен индуцировать повышение ионной проницаемости липидных мембран под влиянием отрицательного трансмембранного потенциала за счет формирования потенциал-зависимых каналов. Образующиеся каналы обладают предпочтительной

проницаемостью для анионов, хотя способны пропускать и катионы. Это, по-

K'ï'*^ . ,''«

у ч ~ < Э ' >-

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Муртазина, Диляра Ахметалимовна

выводы.

1. Очищенные препараты Na,K-ATOa3bi из солевых желез утки не фосфорилируются в отсутствие детергента под действием ПКА. При добавлении детергентов ПКА фосфорилирует а-субъединицу фермента.

2. Подобран детергент (CHAPS), обеспечивающий минимальную потерю активности Na,K-ATOa3bi и индуцирующий фосфорилирование а-субъединицы фермента по остатку серина.

3. Фосфорилирование №,К-АТФазы в среде, содержащей CHAPS, сопровождается ингибированием ее ферментативной активности.

4. В присутствии тритона Х-100 ПКА фосфорилирует а-субъединицу Н,К-АТФазы из слизистой оболочки желудка кролика.

5. Мелиттин необратимо ингибирует №,К-АТФазу. Кинетический анализ ингибирования свидетельствует о взаимодействии пептида с двумя типами центров, расположенными на молекуле Ыа,К-АТФазы. Ингибирование, вызванное связыванием пептида с одним из них, устраняется под действием АТФ и анкирина.

6. В отсутствие детергентов связывание с №,К-АТФазой мелиттина, анкирина и антител против (3-субъединицы фермента не влияет на доступность участка фосфорилирования для ПКА.

7. Образование комплекса конканавалин А-Ыа,К-АТФаза обеспечивает фосфорилирование фермента протеинкиназой А в отсутствие детергентов.

Заключение

Классическим подходом, используемым до настоящего времени в биохимических исследованиях, является изучение свойств индивидуальных, высокоочищенных белков (иногда органелл или их фрагментов). В свою очередь процедура очистки белков или белковых фракций часто приводит к изменению конформации и свойств исследуемого объекта. Кроме того, в процессе очистки удаляются клеточные компоненты, которые могут влиять на свойства изучаемых белков. Для того, чтобы устранить этот недостаток, в биохимических исследованиях все чаще используются методы, позволяющие регистрировать изменение активности соотвествующих белков (ферментов) в ответ на внешние сигналы непосредственно в живой клетке. Однако такой подход также имеет свои недостатки. Дело в том, что внешний сигнал в большинстве случаев вызывает в клетке множественные реакции. В связи с этим трудно установить, какая из этих реакций приводит в конечном итоге к изменению исследуемой активности. Поэтому в настоящее время принято использовать комбинацию обоих подходов. Сравнение полученных результатов может приблизить исследователя к пониманию того, каким образом внешний сигнал воздействует на исследуемый объект (белок или фермент).

В настоящее время во многих лабораториях мира показано, что протеинкиназа А фосфорилирует а-субъединицу Ш,К-АТФазы как in vitro (Bertorello et al., 1991; Chibalin et al., 1992; Feschenko, Sweadner, 1994; Cornelius, Logvinenko, 1996), так и in vivo (Béguin et al., 1994), причем фосфорилированию подвергается один и тот же остаток серина, расположенный в С-концевой части а-субъединицы фермента. Возникает вопрос о том, каково влияние фосфорилирования на функцию №,К-АТФазы. Тот факт, что фосфорилирование может иметь физиологическое значение косвенно подтверждается тем, что участок фосфорилирования консервативен для всех изоформ Na,К АТФазы и а-субъединицы Н,К-АТФазы, являющейся фактически четвертой изоформой этого белка (Sweadner, 1989; Grishin et al., 1994).

Полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что в живой клетке факторы, приводящие к активации ПКА, во многих случаях обеспечивают ингибирование активности Na,К-АТФазы (Bertorello et al., 1991;

Fisone et al., 1994; Cheng et al., 1997; MacDonald, Storey, 1999). Однако имеются также данные о том, что активация ПКА в живой клетке сопровождается активацией активности Na,K-ATOa3bi (Gao et al., 1994; Singh Linas, 1996; Carranza et al., 1996; Carranza et al., 1998). В связи с этим особое значение приобретают эксперименты, в которых устанавливается, как фосфорилирование очищенной Na,K-ATфермент фосфорилируется только в присутствии детергента или после реконструкции его в липосомы (Bertorello et al., 1991; Chibalin et al., 1992; Cornelius, Logvinenko, 1996). На наш взгляд это объясняется тем, что конформация фермента изменяется в процессе его выделения.

В настоящей работе мы попытались исследовать влияние фосфорилирования на активность очищенной №,К-АТФазы in vitro в условиях, когда обеспечивается достаточная стехиометрия фосфорилирования и сохраняется активность Na,K-ATOa3bi. Были подобраны условия (высокая концентрация АТФ, CHAPS, KCl), в которых осуществлялось фосфорилирование а-субъединицы №,К-АТФазы по остатку серина со стехиометрией 0,5 моль Фн/ моль Ка,К-АТФазы. В этих же условиях активность нефосфорилированного фермента ингибировалась не более, чем на 50%. Представленные на рис. 12 данные ясно показывют, что фосфорилирование №,К-АТФазы под действием ПКА in vitro сопровождается падением ее ферментативной активности. Одно из возможных замечаний, которое может быть предъявлено к этому эксперименту заключается в том, что фосфорилированный под действием ПКА фермент может подвергаться более значительной инактивации под действием детергента. Однако данные, представленные на рис. 13 показывают, что как фосфорилированная под действием ПКА, так и нефосфорилированная №,К-АТФаза ведут себя в присутствии CHAPS одинаково.

Полученные нами данные подтверждаются экспериментами с точечными мутациями по остатку серина, который фосфорилируется под действием ПКА (Fisone et al., 1994). Замена этого серина на аланин приводит к тому, что ингибироавние Ыа,К-АТФазы, обусловленное активацией ПКА, не наблюдается,

Таким образом, совокупность полученных экспериментальных данных свидетельствует о том, что результатом фосфорилирования а-субъединицы Na,К

АТФазы по остатку серина является ингибирование ее ферментативной активности. Тот факт, что in vivo в некоторых случаях наблюдается активация фермента, можно объяснить тем, что ПКА влияет на дополнительные факторы, воздействующие на активность №,К-АТФазы (например, ПКА фосфорилирует белок, который в фосфорилированном виде активирует №,К-АТФазу).

Второй этап нашей работы был связан с попыткой реконструкции конформации фермента, которая бы делала участок фосфорилирования доступным для ПКА. Поскольку в клетке ИаД-АТФаза может быть связана с различными белками (например с анкирином, обеспечивающим связь Na,K-АТФазы с цитоскелетом), мы изучили как белковые и пептидные факторы, взаимодействующие с а- или Р-субъединицей фермента влияют на его фосфорилирование под действием ПКА. Мы обнаружили, что участок фосфорилирования становится доступным для ПКА после связывания с Na,K-АТФазой лектина (конканавалина А), взаимодействующего с р-субъединицей фермента. Этот факт свидетельствует о наличии еще одного уровня регуляции активности №,К-АТФазы, а именно: регуляции появления (исчезновения) центра, по которому обеспечивается фосфорилирование №,К-АТФазы ПКА. Взаимодействие с другими клетками или галектинами может приводить к экспонированию этого центра, после чего происходит его фосфорилирование, сопровождающееся ингибированием ШД-АТФазы. Это объясняет экспериментальные данные о том, что конканавалин А обеспечивает ингибирование активности неочищенных препаратов фермента, в которых, по-видимому, присутствует эндогенная ПКА (Swan, et al., 1975; Zaheer et al, 1981), но не влияет на очищенную Na,K-AT®a3y (Perrone, Hokin, 1978). С другой стороны, если центр не экспонирован, то даже активированная цАМФ ПКА не сможет оказать ингибирующего действия на 1Ча,К-АТФазу.

Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что активность №,К-АТФазы может ингибироваться фосфорилированием под действием ПКА, что в свою очередь обусловлено внешним сигналом, передаваемым через (3-субъединицу фермента. Физиологическое значение этого феномена остается пока неясным. Недавние эксперименты указывают, что активность Na,К-АТФазы значительно ингибируется у гибернирующих сусликов. Ингибирование активности коррелирует с фосфорилированием фермента под действием ПКА (MacDonald, Storey, 1999). Возможно, вторым фактором, обеспечивающим эффект этого фосфорилирования на активность №,К-АТФазы являются субстанции, взаимодействующие с Р-субъединицей фермента.

Совершенно ясно, что невзирая на уже полученную к настоящему времени информацию, изучение регуляции №,К-АТФазы под действием ПКА необходимо продолжить с тем, чтобы получить ясное представление о вовлечении этого фермента в общие пути передачи сигнала в клетке и регуляции клеточных функций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Муртазина, Диляра Ахметалимовна, 1999 год

Литература

1. Болдырев А.А. (1981) Na+ - К+-зависимая АТФаза. Успехи физиологических наук. 12, 91-130.

2. Владимирова Н.М., Муравьева Т.И., Овчинникова Т.В., Потапенко Н.А., Ходова О.М. (1998) Изоферменты Na,K-ATOa3bi серого вещества из ствола мозга теленка. Биол. мембраны, 15, 349-352.

3. Владимирова Н.М., Потапенко Н.А., Модянов Н.Н. (1995) Структурный анализ изоформ Na+,K+-AT<Da3bi в мозге теленка. Биоорганич. химия. 21, 483-491.

4. Демин В.В., Барнаков А.Н., Лунев А.В. Джанджугазян К.Н., Кузин А.П., Модянов Н.Н., Ховмюллер С., Фарратс Г. (1984) Электронная микроскопия мембранных белков. I. Три формы двумерных кристаллов Na+,K+-активируемой аденозинтрифосфатазы. Биол. мембр., 1, 831-837.

5. Котлобай, А. А. (1989) Некоторые биохимические и физиологические характеристики крыс с наследственной, индуцированной стрессом, артериальной гипертензией. Кандидатская диссертация, М., МГУ, 214

6. Abdel-Monem, М., Hoffmann-Berling, Н. (1976) Enzymatic unwinding of DNA. 1. Purification and characterization of a DNA-dependent ATPase from Esherichia coli. Eur. J. Biochem., 65, 431-440.

7. Ahmad, M., Medford, R.M. (1995) Evidence for the regulation of Na,K-ATPase alpha 1 gen through the interaction of aldosterone and cAMP-inducible transcriptional factors. Steroids 60, 147-152.

8. Albers, R.W., Fahn, S., Koval, G.J. (1963) The role of sodium ions in the activation of Electrophorus electric organ adenosine triphosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50,474-481.

9. Allen, J.C., Navran, S.S. (1984) Role of Na-pump in smooth muscle contractile regulation. TIPS, 462-465.

10. Altendorf, K., Epstein, W. (1994) Kdp ATPase of Escherichia coli. Cell Physiol. Biochem. 4, 160-168.

11. Anner, B.M. (1985) The receptor function of the Na+,K+-activated adenosine triphosphatase system. Biochem. J., 227, 1-11.

12. Antolovic, R., Bruller, H-J., Bunk, S., Linder, D., Schoner, W. (1991) Epitope mapping by amino-acid-sequence-specific antibodies reveals that both ends of the a-subunit of Na+/K+-ATPase are located on the cytoplasmic side of the membrane. Eur. J. Biochem., 199, 195-202.

13. Aperia, A., Ibarra, F., Swensson, L.B., Klee, C., Grrengard, P. (1992) Calcineurin mediates alpha-adrenergic stimulation of Na+, K(+)-ATPase activity in renal tubule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7394-7397.

14. Aperia, A., Fukuda, Y., Lechene, C. (1988) Ontogenic increase of Na,K-ATPase in rat proximal convoluted tubule (RPCT) Kidney Int. 33,415-419.

15. Arguello, J.M., Peluffo, R.D., Feng, J., Lingrel, J.B., Berlin, J.R. (1996) Substitution of glutamic 779 with alanine in the Na,K-ATPase alpha subunit removes voltage dependence of ion transport. J. Biol. Chem., 271, 24611-24616.

16. Arystarkhova, E., Sweadner, K. J. (1997) Tissue-specific expression of the Na,K-ATPase P-subunit. The presence of P3 in lung and liver addresses the problem of the missing subunit. J. Biol. Chem., 272, 22405-22408.

17. Askari, A. (1987) (Na++K+)-ATPase: on the number of the ATP sites of the functional unit. J. Bioenerg. Biomembr., 19, 359-373.

18. Averdunk, R., Gunter, T. (1980) Effect of concanavaline A on intracellular K+and Na concentration and K transport of human lymphocytes. Immunology, 157, 132-144.

19. Azuma, K.K., Hensley, C.B., Tang, M-J., Mcdonough, A. ( 1993) Thyroid hormone specifically regulates skeletal muscle Na+,K+-ATPase a2- and P2-isoforms. Am.J. Physiol., 265, 680-687.

20. Baker, K.J., East, J.M., Lee, A.G. (1995) Mechanism of the inhibition of the Ca-ATPase by melittin. Biochemistry, 34, 3596-3604.

21. Barlet-Bas, C., Arystarkhova, E., Chevall, E., Marsy, S., Sweadner, K., Modyanov, N., Doucet, A. (1993) Are there several isoforms of Na,K-ATPase alpha subunit in the rabbit kidney? J. Biol. Chem. 268, 11512-11515.

22. Barnett, R., Palazzotto, J. (1974) Mechanism of the effects of lipid phase transitions of the Na,K-ATPase and the role of protein conformational changes. Ann. N.Y. Ac. Sci., 242, 69-76.

23. Beauge, L.A., Glynn, I.M. (1979) Occlusion of K ions in the unphosphorylated sodium pump. Nature, 280, 510-512.

24. Bechtel, P.J., Beavo, J.A., Krebs, E.G. (1977) Purification and characterization of catalytic subunit of skeletal muscle adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase. J. Biol. Chem., 252,2691-2698.

25. Beggah, A.T., Beguin, P., Jaunin, P., Peitsch, M.C., Geering, K. (1993) Hydrophobic C-terminal amino acids in the beta-subunit are involved in assambly with the alpha-subunit of Na,K-ATPase. Biochemistry, 32, 14117-14124.

26. Beggah, A.T., Jaunin, P., Geering, K (1997) Role of glycozilation and disulfide bond formation in the p-subunit in the folding and functional expression of Na,K-ATPase. J.Biol. Chem. 272, 10318-10326.

27. Beguin, P., Beggah, A.T., Chibalin, A.V., Burgener-Kairuz, P., Jassier, F. Methews, P.M., Rossier, B.C. Cottecchia, S., Geering, K. (1994) Phosphorylation of the Na,K-ATPase a-subunit by protein kinase A and C in vitro and in intact cells. J. Biol. Chem. 269, 24437-24445.

28. Beguin, P., Wang, X., Firsov, D., Puoti, A., Clayes, D., Horisberger, J.D., Geering, K. (1997) The gamma subunit is a specific component of Na, K-ATPase and modulates its transport function. EMBO J., 16, 4250-4260.

29. Bennett V. (1983) Proteins involved in membrane-cytoskeleton association in human erythrocytes: spectrin, ankyrin, and band 3. Methods Enzymol., 96, 313322.

30. Bennett, V (1992) Ankyrins. Adaptors between diverse plasma membrane proteins and cytoplasm. J. Biol. Chem., 267, 8703-8706.

31. Bennett, V. (1993) Cytoskeleton, Acad.Press

32. Bertorello, A.M., Aperia, A., Walaas, S.I., Nairn, A.C., Greengard, P. (1991) Phosphorylation of the catalytic subunit of Na+,K(+)-ATPase inhibits the activity of the enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11359-11362.

33. Bertorello, A.M., Katz A.I. (1993) Short term regulation of renal Na,K-ATPase activity: physiological relevance and cellular mechanisms. Am. J. Physiol., 265, 743-755.

34. Blanco, G., De Tomasso, A.W., Koster, G., Xie, Z.H., Mercer, R.W. (1994) The ot-subunit of the Na,K-ATPase has catalytic activity independent of the (3-subunit. J. Biol. Chem., 269,23420-23425.

35. Blanco, G., Koster, J., Sanchez, G., Mercer, R.W. (1995) Kinetic properties of the a2pi and a2p2 isozymes of the Na,K-ATPase. Biochemistry, 34, 319-325.

36. Blanco, G., Mercer, R.W. (1998) Izozymes of Na,K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol., 275, F633-650.

37. Blanquet, P (1983) Regulation of surface-membrane enzymes by lipid ordering. A model based on allosteric transition theory. Biochem. J., 213, 479-484.

38. Blostein, R. (1979) Side specificic effect of sodium on Na,K-ATTase. Studies with inside-out red cell membrane vesicles. J. Biol. Chem. 254, 6673-6677.

39. Blostein, R., Chu, L. (1977) Sidedness of (sodium-potassium)-adenosine triphosphate of inside-out red cell membrane vesicles. Interaction with potassium. J. Biol. Chem., 252, 3035-3043.

40. Boldyrev, A.A., Ruuge, E., Smirnova, I., Tabak, M. (1977) Na,K-ATPase: the role of state of lipids and Mg ions in activity regulation. FEBS Lett., 80, 303-307.

41. Boldyrev, A.A., Svinukhova, I.A. (1982) Na,K-dependent adenosine triphosphatase. Two types of kinetics. Biochim. Biophys. Acta, 707, 167-170.

42. Boyle, W.G., Van der Geer, P., Hunter, T. (1991) Phosphopeptide mapping and phosphoamino acid analysis by two dimentional separation on thin-layer cellulose plates. Methods Enzymol., 201. 110-149.

43. Campos, M., Beauge, L. (1994) Na+-ATPase activity of Na+,K+-ATPase. J. Biol. Chem., 269, 18028-18036.

44. Canfield, V.A., Levenson, R. (1993) Transmembrane organization of the Na,K-ATPase determined by epitope addition. Biochemistry, 32, 13782-13786.

45. Carafoli, E. (1991) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev. 71, 121153.

46. Carranza, M.L., Feraille, E., Kyroitcheva, M., Rousselot, M., Favre, H. (1996) Stimulation of oubain-sensitive 86Rb+ uptake and Na+,K+-ATPase a-subunit phosphorylation by cAMP-dependent signalling pathway in intact cells from rat kidney cortex. FEBS Lett., 396, 309-314.

47. Carranza, M.L., Rousselot, M., Chibalin, A.V., Bertorello, A., Favre, H., Feraille, E. (1998) Protein kinase A induces recruitment of active Na+, K+-ATPase units to the plasma membrane of rat proximal convoluted tubule cells. J. Physiol. (London), 511,235-243.

48. Charnock, J.C., Cook, D.A., Almeida, A.F., To, R. (1973) Activation energy and phospholipid requirements of membrane-bound adenosine triphosphatases. Arch. Biochem. Biophys. 159, 393-399.

49. Charnock, J.C., Cook, D.A., Opit, L.J. (1971) Role of energized states of (Na+K)-ATPase in the sodium pump. Nature, 233, 171-172.

50. Cheng, X-J., Fisone, G., Aizman, 0., Aizman, R., Levenson, R., Greengard, P., Aperia, A. (1997) PKA-mediated phosphorylation and inhibition of Na+-K+-ATPase in response to [3-adrenergic hormone. Am. J. Physiol., 273 (Cell Physiol. 42), C893-901.

51. Chetverin, A.B. (1986) Evidence for a diprotomeric structure of Na,K-ATPase. Accurate determination of protein concentration and quantitive end-group analysis. FEBSLett. 196, 121-125.

52. Chew, C.G., Nakamura, K., Ljungstrom, M. (1992) Calcium signaling mechanisms in the gastric parietal cell. Yale J. Biol and Med., 65, 561-567.

53. Chibalin, A.V., Vasilets, L.A., Hennekes, H., Pralong, D., Geering, K. (1992) Phosphorylation of Na,K-ATPase a-subunits in microsomes and in homogenate of Xenopus oocytes resulting from the stimulation protein kinase A and protein kinase C. J. Biol. Chem. 267, 22378-22384.

54. Chow, D.C., Forte, J.G. (1995) Functional significance of the P-subunit for heterodimeric P-type ATPases. J. Exp. Biol., 198, 1-17

55. Clague, M.J., Cherry, R.J. (1989) A comparative study of band 3 aggregation in erythrocyte membranes by melittin and other cationic agent. Biochim. J. 252, 791794.

56. Clark, M.A., Conway, T.M., Schore, R.G., Crooke, S.T. (1987) Identification and isolation of a mammalian protein which is antigenically and functionally related to the phospholipase A2 stimulatory peptide melittin. J. Biol. Chem. 262, 4402-4406.

57. Cornelius, F., Logvinenko, N. (1996) Functional regulation of reconstituted Na,K-ATPase by protein kinase A phosphorylation. FEBS lett., 380,277-280.

58. Corthesy-Theulaz, I., Merillat, A.M., Honegger, P., Rossier., B.C. (1991) Differential regulation of Na,K-ATPase isoform gene expression by T3 during rat brain development. Am. J. Physiol., 261, C124-C131.

59. Cowin, P., Burke, B. (1996) Cytoskeleton-membrane interactions. Curr. Opinion Cell. Biol. 6, 56-65.

60. Craig, W.S., Kyte, J. (1980) Stoichiometry and molecular weight of the minimum asymmetric unit of canine renal sodium and potassium ion-activated adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem., 255, 6262-6269.

61. Cuppoletti, J., Malinowska, D., Sachs, G. (1988) Gactric H+ secretion: histamine (cAMP-mediated) activation of protein phosphorylation. Biochim. Biophys. Acta, 972, 95-105

62. Cuppoletti, J. (1990) [125I]Azidosalicylil melittin binding domains: evidence for a polypeptide receptor on the gastric H,K-ATPase. Arch. Biochem. Biophys. 278, 405-415.

63. Cuppoletti, J., Abbot, A.J. (1990) Interaction of melittin with the (Na+K)-ATPase: Evidence for a melittin-induced conformational change. Arch. Biochem. Biophys. 283, 249-257.

64. Cuppoletti, J., Blumenthal, K.M., Malinowska, D.H. (1989) Melittin inhibition of the gastric (H+ +K+) ATPase and photoaffmity labeling with [125I] azidosalicylyl melittin. Arch. Biochem. Biophys. 275, 263-270.

65. Cuppoletti, J., Huang, P., Kaetzel, M.A., Malinowska, D.H. (1993) Stimulus-associated protein in gastric parietal cell detected using antimelittin antibody. Am. J. Physiol. 264, G637-G644.

66. Danilenko, M.P., Panchenko, M.P., Yesirev, O.V., Tkachuk, V.A. (1990) Involvement of pertussin-toxin-sensitive G-protein in muscarinic-receptor-mediated inhibition of K-activated 4-nitrophenylphosphatase activity of cardiac sarcolemma. Eur. J. Biochem. 194, 155-160.

67. Dempsy, C.E. (1990) The action of melittin on membranes. Biochim. Biophys. Acta 1031, 143-161.

68. Devarajan, P., Scaramuzzino, D.A., Morrow, J.S. (1994) Ankyrin binds to the distinct cytoplasmic domains of Na,K-ATPase a-subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 2965-2969.

69. DiNolfo, T., Gresabfi, T. J., Wallace, B. A. (1985) Ligand-induced changes in membrane-bound and solubilized forms of Na,K-ATPase: a circular dichroism study. In: The Sodium Pump (Eds. Glynn I, Ellory C), Cambridge, Company of Biologists, Ltd., 63-72.

70. Dzhandzhugazyan, K.N., Jorgensen, P.L., (1985) Asymmetric orientation of amino groups in the alpha-subunit and the beta-subunit of (Na+ + K+)-ATPase in tight right-side-out vesicles of basolateral membranes from outer medulla. Biochim. Biophys. Acta, 817, 165-173.

71. Eakle, K.A., Kabalin, M.A., Wang, S. G., Farley, R.A. (1994) The influence of beta-subunit structure on the stability of Na/K-ATPase complexes and interaction with K+. J. Biol. Chem., 269, 6550-6557.

72. Erdmann, E., Hasse, W. (1975) Quantitative aspects of ouabain binding to human erythrocyte and cardiac membranes. J. Physiol. (London) 251, 671-682.

73. Esmann, M. (1984) The distribution of Ci2E8 - solubilized oligomers of Na,K-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 787, 81-89.

74. Esmann, M., Christiansen, C., Karlsson, K-A., Hansson, G.C., Skou, J.C. (1980) Hydrodynamic properties of solubilized (Na+K)-ATPase from rectal glands of Squalus acanthias. Biochim. Biophys. Acta 603, 1-18.

75. Esmann, M., Skou, J.C. (1985) Occlusion of Na by the Na,K-ATPase in the presence of oligomicin. Biochim. Biophys. Res. Commun., 127, 857-863.

76. Ewarts, Y.S., Klip, A. (1995) Hormonal regulation of Na,K-ATPase: mechanism underlying rapid and sustained changes in pump activity. Am. J. Physiol. 269, C295-C313.

77. Fahn, S., Koval, G.J., Albers, R.W. (1966) Sodium-potassium activated adenosine triphosphatase of Electrophorus electric organ. An associated sodium-activated transphosphorylation. J. Biol. Chem. 241, 1882-1889.

78. Fahn, S., Koval, G.J., Albers, R.W. (1968) Sodium-potassium activated adenosine triphosphatase of Electrophorus electric organ. V. Phosphorylation by adenosine triphosphate-32?. J. Biol. Chem. 243, 1993-2002.

79. Faller, L., Diaz, R., Scheiner-Bobis, G., Farley, R.A. (1991) Temperature dependence of the rates of conformational changes reported by fluorescein 5'-isothiocyanate modification of H,K- and Na,K-ATPases. Biochemistry 30, 35033510.

80. Fambrough, D.M., and Bayne, E.K. (1983) Multiple forms of (Na+ + K+)-ATPase in the chicken. Selective detection of the major nerve, skeletal muscle, and kidney form by a monoclonal antibody. J.Biol. Chem., 258, 3926-3935.

81. Farias, R.N., Bloj, B., Morero, R.D., Sineriz, F., Trucco, R.E. (1975) Regulation of allosteric membrane-bound enzymes through changes in membrane lipid composition. Biochim. Biophys. Acta, 415, 231-251.

82. Farley, R.A., Goldman, D.W., Bayley, H. (1986) Identification of regions of the catalytic subunit of (Na,K)-ATPase embedded within the cell membrane. J. Biol. Chem. 255, 860-864.

83. Farley, R.A., Tran, C.M., Carilli, C.T., Hawke, D., Shively, J.E. (1984) Amino acid sequence of a fluorescein-labeled peptide from the active site of (Na,K)-ATPase. J. Biol. Chem., 259,9532-9535.

84. Feng, J., Orlowski, J., Lingrel, J.B. (1993) Identification of a functional thyroid hormone response elements in upstream flanking region of the human Na,K-ATPase pi gen. Nucleic. Acids Res., 21,2619-2626.

85. Feschenko, M.S., Sweadner, K.J. (1994) Conformation-dependent phosphorylation of Na,K-ATPase by protein kinase A and protein kinase C. J. Biol.Chem., 269, 30436-30444.

86. Feschenko, M.S., Sweadner, K.J. (1995) Structural basis for spesies-specific difference in the phosphorylation of Na,K-ATPase by protein kinase C. J. Biol. Chem., 270, 14072-14077.

87. Fisone, G., Cheng, S., Nairn, A., Czernik, A., Bergman, T., Jornvall, H., Aperia, A., Greengard, P. (1994) Identification of the phosphorylation site for cAMP-dependent protein kinase on Na,K-ATPase and effects of site directed mutagenesis. J. Biol. Chem. 269,9368-9373.

88. Flemming, W.W. (1980) The electrogenic Na+,K+-pump in smooth muscle: physiologic and pharmacologic significance. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 20, 129-149.

89. Fletcher, J.E., Tripolitis, L., Beech, J. (1992) Bee venom melittin is a potant toxin for reducing the threshold for calcium-induced release in human and equine skeletal muscle. Life Sci. 51, 1731-1738.

90. Forbush, B. (1987) Rapid release of 42K and 86Rb from two distinct transport sites on the Na,K-pump in the presence of P; or VO4. J. Biol. Chem. 262, 11116-11127.

91. Forbush, B., Kaplan, J.H., Hoffman, J.F. (1978) Characterization of a new photoaffinity derivative of ouabain: labeling of the large polypeptide and of a proteolipid component of the Na,K-ATPase. Biochemistry, 17, 3667-3676.

y/ Freytag, J.W. (1983) The (Na , K )-ATPase exhibits enzymatic activity in the absence of the glycoprotein subunits. FEBS Lett., 159, 280-284.

93' Gache, C., Rossi, B., Leone, F.A., Lazdunski, M. (1979) Pseudo-substrates to analyze the reaction mechanism of the Na,K-ATPase. In: Na,K-ATPase. Structure and kinetics. Eds. Skou, J.C., Norby, J.G. Acad. Press, London, 3301-3314.

94 Gao, J., Cohen, I.S., Mathias, R.T., Baldo, G.J. (1994) Regulation of the stimulation of the Na+, K+-pump current in guinea-pig ventricular myocytes by cAMP-depndent PKA pathway. J. Physiol. (London), 477, 373-380.

95. Garrahan, P.J., Glynn, I.M. (1967a) The stoichiometry of the sodium pump. J. Physiol. (London) 192, 217-235.

96. Geering, K. (1990) Subunit assembly and functional maturation of Na,K-ATPase. J.Membr. Biol. 115, 109-121.

97. Geering, K., Beggah, A., Good, P., Girardet, S., Roy, S., Schaer, D., Jaunin, P. (1996) Oligomerization and maturation of Na,K-ATPase: functional interaction of the cytoplasmic NH2 terminus of the beta subunit with the alpha subunit. J. Cell Biol., 133, 1193-204.

98. Geering, K., Meyer, D.I., Paccolat, M. P., Kraehenbuhl, J. P, Rossier, B.C. (1985) Membrane insertion of alpha- and beta-subunits of Na,K-ATPase. J. Biol. Chem. 260,5154-5160.

99. Gloor, S., Antonicek, H., Sweadner, K.J., Pagliusi, S., Frank, R., Moos, M., Schachner, M. (1990) The adhesion molecule on glia (AMOG) is a homologue of the (3-subunit of the Na,K-ATPase. J. Cell. Biol., 110,165-174.

100. Glynn, I.M. (1985) The Na,K-transporting adenosine triphosphatase. The enzymes of biological membrane, ed. Martonosi A. N., Plenum Press, N-Y, v. 3, 35-114.

101. Glynn, I.M., Hoffman, J.F. (1971) Nucleotide requirements for sodium-sodium exchange catalysed by the sodium pump in human red cells. J. Phisiol. (London), 218, 239-256.

102. Glynn, I.M., Richards, D.E. (1982) Occlusion of rubidium ions by the sodium-potassium pump: its implications for the mechanism of potassium transport. J. Physiol. 330, 17-43.

103. Goldman, R., Albers, R. (1973) Sodium-potassium-activated adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem., 248, 867-874.

104. Goldshleger, R., Tal, D.M., Karlish, S.J. (1995) Topology of the alpha-subunit of Na,K-ATPase based on proteolysis. Lability of the topological organization. Biochemistry, 34, 8668-8679.

105. Greene, D.A., Lattimer, S.A., Sima, A.A. (1987) Sorbitol, phosphoinositides, and sodium-potassium ATPase in the pathogenesis of diabetic complications. N. Engl. J.Med. 316, 599-606.

106. Grisham, C.M., Barnett, R.E. (1973) The role of lipid-phase transition in the regulation of the (sodium + potassium) adenosine triphosphatase. Biochemistry, 12, 2635-2637.

107. Grishin, A.V., Sverdlov, V.E., Kostina, M.B., Modyanov, N.N. (1994) Cloning and characterization of the entire cDNA encoded by ATP1AL1- a member of the human Na,K/H,K-ATPase gene family. FEBS Lett., 349, 144-150.

108. Hall, T. G., Bennett, V. (1987) Regulatory domains of erythrocyte ankyrin. J. Biol. Chem., 262, 10537-10545.

109. Hara, J., Nakao, N. (1986) ATP-dependent proton uptake by proteoliposomes reconstituted with purified Na+,K+-ATPase. J. Biol. Chem., 261, 12655-12658.

110. Hara, Y., Urayama, O., Kawakami, K., Nojima, H., Nagamune, H., Kojima, T., Ohta. T., Nagano, K., Nakao, M. (1987) Primary structures of two types of alpha-subunit of rat brain Na+,K+-ATPase deduced from cDNA sequences. J. Biochem. (Tokyo), 102, 43-58.

111. Hardwicke, P.M., Freytag, J.W. (1981) A proteolipid associated with Na,K-ATPase is not essential for ATPase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 102, 250-257.

112. Harris, R.C., Savin, V.J., Lechene, C. (1987) Rat renal proximal tubular cells (RPTC) increase net ionic content following return to isotonicity from hypotonisity. Kidney. Int. 31, 435a.

113. Harris, R.C., Seifer, J.L., Lechene, C. (1986) Coupling ofNa-H exchange andNa-K pump activity in cultured rat proximal tubular cells. Am. J. Physiol., 251, C815-C824.

114. Hasler, U., Wang, X., Crambert, G., Beguin, P., Jassier, F., Horisberger, J-D., Geering, K. (1998) Role of subunit domains in the assembly, stable expression, intracellular routing, and functional properties of Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 273, 30826-30835.

115. Herbert, H., Skriver, E., Maunsbach, A.B. (1985) Three-dimensional structure of renal Na,K-ATPase determined by electron microscopy of membrane crystals. FEBS Lett., 187, 182-186

116. Herrera, V.L., Emanuel, J.R., Ruiz-Opazo, N., Levenson, R., Nadal-Ginard, B. (1987) Three differentially expressed Na,K-ATPase alpha subunit isoforms: structural and functional implications. J. Cell. Biol., 105, 1855-1865.

117. Hopkins, B.E, Wagner, HJr., Smith, T.W. (1976) Sodium and potassium-activated adenosine triphosphatase of the nasal salt gland of the duck (Anas platyrhynchos). Purification, characterization and NH2-terminal amino acid sequence of the phosphorylated polypeptide. J. Biol. Chem., 251, 4365-4371.

118. Horisberger, J.D., Jaunin, P., Reuben, M.A., Lasater, L.S., Chow, D.C., Forte, J.G., Sachs, G., Rossier, B.C., Geering, K. (1991) The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-ATPase. J. Biol. Chem. 266, 1913119134.

119. Horisberger, J.D., Rossier, B.C. (1992) Aldosterone regulation of gene transcription leading to control of ion transport. Hypertension 19, 221-227.

120. Horster, M., Schmid, H., Schmidt, U. (1980) Aldosterone in vitro restores nephron Na-K-ATPase of distal segments from adrenalectomized rabbits. Pflugers Arch. 384, 203-206.

121. Huang, W-H, Askari, A. (1981) Phosphorylation-dependent cross-linking of the a-

I

subunits in the presence of Cu and o-phenantroline. Biochim. Biophys. Acta, 645, 54-58.

122. Ibarra, F., Aperia, A., Swensson, L.B., Eklof, A.C. (1993) Bidirectional regulation of Na,K-ATTase activity by dopamin and an a-adrenergic agonist. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,21-24.

123. Inesi, G., Kirley, M.R. (1992) Structural features of cation transport ATPases. J. Bioenerg. Biomembr. 24, 271-283.

124. Jackson, R.J., Mendlein, J., Sachs, G. (1983) Interaction of fluorescein isothiocyanate with the (H+ +K+)-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 731, 9-15.

125. Jensen, J., Norby, J.G. (1988) Membrane-bound Na,K-ATPase: target size and radiation inactivation size of some of its enzymatic reactions. J. Biol. Chem., 263, 18063-18070.

126. Jewell-Motz, E.A., Lingrel, J.B. (1993) Site-directed mutagenesis of the Na,K-ATPase: consequences of substitutions of negatively-charged amino acids localized in the transmembrane domains. Biochemistry, 14, 13523-13530.

127. Jimenez, J.C., Kupfer, A., Gani, V., Shaltiel, S. (1982) Salt-induced conformational changes in the catalytic subunit of adenosine cyclic 3',5'-phosphate dependent protein kinase. Use for establishing a connection between one sulfhydrryl group and the y-P subsite in the ATP site of this subunit, Biochemistry 21, 1623-1630.

128. Jorgensen, P.L. (1974) Purification and characterization of (Na++K+)-ATPase. III. Purification from the outer medulla of mammalian kidney after selective removal of membrane components by sodium dodecylsulphate. Biochim. Biophys. Acta, 356, 36-52.

129. Jorgensen, P.L. (1975) Purification and characterization of (Na++K+)-ATPase. V. Conformational changes in the enzyme. Transitions between the Na-form and K-form studied with tryptic digestion as a tool. Biochim. Biophys. Acta, 401, 399415.

130. Jorgensen, P.L. (1977) Purification and characterization of (Na++K+)-ATPase. VI. Differential tryptic modification of catalytic functions of the purified enzyme in the presence ofNaCl andKCl. Biochim. Biophys. Acta, 597, 305-317.

131. Jorgensen, P.L. (1982) Mechanism of the (Na++K+)-ATPase. Protein structure and conformation of the pure (Na++K+)-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 694, 27-68.

132. Jorgensen, P.L. (1988) Purification of Na,K-ATPase: enzyme sources, preparative problems, and preparation from mammalian kidney. Methods Enzymol., 156, 2943.

133. Jorgensen, P.L., and Andersen, J.P. (1988) Structural basis for E1-E2 conformational transition in Na,K-pump and Ca-pump protein. J. Membr. Biol., 103, 95-120.

134. Jorgensen, P.L., Collins, J.H. (1986) Tryptic and chymotryptic cleavage sites in sequence of alpha-subunit of (Na+ +K+)-ATPase from outer medulla of mammalian kidney. Biochim. Biophys. Acta, 860, 570-576.

135. Jorgensen, P.L., Petersen, J. (1985) Chymotryptic cleavage of the P-subunit in El form of renal (Na+K)ATPase: effect on enzymatic properties, ligand binding and cation exchange. Biochim. Biophys. Acta., 821, 319-333.

136. Jorgensen, P.L., Skriver, E., Herbert, H., Maunsbach, A.D. (1982) Structure of the Na,K-pump, crystallization of pure membrane-bound Na,K-ATPase and identification of functional domains of the a-subunit. Ann. N.-Y. Acad. Sci. 402, 207-224.

137. Kapakos, J.G., Steinberg, M. (1982) Fluorescent labeling of Na+,K+-ATPase by 5-iodacetamidofluorescein. Biochim. Biophys. Acta, 693, 493-496.

138. Kaplan, J.H. (1982) Sodium pump mediated ATP-ADP exchange. J. Gen. Physiol. 80, 915-937.

139. Karlish, S.J., Goldshleger, R., Stein, W.D. (1990) A 19-kDa C-terminal tryptic fragment of the alpha chain of Na/K-ATPase is essential for occlusion and transport of cations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4566-4570.

140. Karlish, S.J., Kempner, E.S. (1984) Minimal functional unit for transport and enzyme activities of (Na+ + K+)-ATPase as determined by radiation inactivation. Biochim. Biophys. Acta, 776, 288-298.

141. Karlish, S.J.D. (1980) Characterization of conformational changes in Na,K-ATPase labeled with fluorescein in the active site. J. Bioenerg. Biomembr. 12, 11136.

142. Karlish, S.J.D., Goldschleger, R., Jorgensen, P.L. (1993) Location of Asn-831 of the a chain of Na/K-ATPase at the cytoplasmic surface. Implication for topological model. J. Biol. Chem., 268, 3471-3478.

143. Karlish, S.J.D., Yates, D.W. (1978) Tryptophan fluorescence of (Na++K+)-ATPase as a tool for study of the enzyme mechanism. Biochim. Biophys. Acta 527, 115130.

144. Kasai, K., Hirabayashi, J. (1996) Galectins: a family of animal lectins that decipher glycosides. Biochem (Tokyo), 119, 1-8.

145. Kataoka, M., Head, J.F., Seaton, B.A., Engelman, D.M. (1989) Melittin binding causes a large calcium-dependent conformational change in calmodulin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6944-6948.

146. Kirley, T.L., Wallick, E.T., Lane, L.K. (1984) The amino acid sequence of the fluorescein isothiocyanate reactive site of lamb and rat kidney Na- and Independent ATPase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 125, 767-773.

147. Kirley, T.L. (1989) Determination of three disulfide bonds and one free sulfhydryl in the P-subunit of (Na,K)-ATPase. J. Biol. Chem., 264, 7185-7192.

148. Knox, W.H., Sen, A.K. (1974) Mechanism of action of aldesterone with particular reference to Na,K-ATPase. Ann. N. Y. Acad. Sci., 242,471-488.

149. Kobayashi, T., Hagiwara, E., Shinji, N., Hayashi, Y. (1997) pH-dependent change in the oligomeric structure of the solubilized Na+/K(+)-ATPase. Ann. N. Y. Acad. Sci., 834, 132-134.

150. Koster, J.C., Blanco, G., Mercer, R.W. (1995) A cytoplasmic region of the Na,K-ATPase alpha-subunit is necessary for specific alpha/alpha association. J. Biol. Chem., 270, 14332-14339.

151. Koster, J.C., Blanco, G., Mills, P.B., Mercer, R.W. (1996) Substitutions of glutamate 781 in the Na,K-ATPase alpha subunit demonstrate reduced cation selectivity and an increased affinity for ATP. J. Biol. Chem., 271,2413-2421

152. Kuntzweiler, T.A., Wallick, E.T., Johnson, C.L., Lingrel, J.B. (1995) Glutamic acid 327 in the sheep alpha 1 isoform of Na+,K(+)-ATPase stabilizes a K(+)-induced conformational change. J. Biol. Chem., 270,2993-3000

153. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

154. Lavoie, L., Levenson, R., Martin-Vasallo, P., Klip, A. (1997) The molar ratios of a and P subunits of the Na+-K+-ATPase differ in distinct subcellular membranes from rat skeletal muscle. Biochemistry, 36, 7726-7732.

155. Lelievre, L.G., Potter, J.D., Piascik, M., Wallick, E.T., Schwartz, A., Charlemagne, D., Geny, B. (1985) Specific involvement of calmodulin and non-

specific effect of tropomyosin in the sensitivity to ouabain of Na+,K+-ATPase in murine plasmocytoma cells. Eur. J. Biochem. 148, 13-19.

156. Liang, S.-M., Winter, C.G. (1977) Digitonin-induced changes in subunit arrangement in relation to some in vitro activities of the (Na+K)-ATPase. J. Biol. Chem. 252, 8278-8284.

157. Lingrel, J.B. (1992) Na,K-ATPase: isoform structure, function and expression. J. Bioenerg. Biomembr. 24, 263-270.

158. Lingrel, J.B., and Kuntzweiler, T. (1994) Na+,K+-ATPase. J.Biol. Chem., 269, 19659-19662.

159. Lingrel, J.B., Orlowski, J., Shull, M.M., Price, E.M. (1990) Molecular genetics of Na,K-ATPase. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 38, 37-89.

160. Lo, C.S., Edelman, I.S. (1976) Effect of triiodothyronine on the synthesis and degradation of renal cortical (Na+ + K+)-adenosine triphospahtase. J. Biol. Chem. 251,7834-7840.

161. Lo, C.S., Lo, T.N. (1980) Effect of triiodothyronine on the synthesis and degradation of the small subunit of renal cortical (Na+ + K+)-adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem. 255,2131-2136.

162. Logvinenko, N.S., Dulubova, I., Fedosova, N., Larsson, S.H., Nairn, A.,C., Esmann, M., Greengard, P., Aperia, A. (1996) Phosphorylation by protein kinase C of serine-23 of the a-1 subunit of rat Na,K-ATPase affects its conformational equilibrium. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 93, 9132-9137.

163. Lowndes, J., Hokin-Neaverson, M., Bertics, P. (1990) Kinetics of phosphorylation of Na/K-ATPase by protein kinase C. Biochim. Biophys. Acta 1052, 143-151.

164. Lowndes, J.M., Hokin-Neaverson, M., Ruoho, E.A. (1984) Photoaffinity labelling of (Na+,K+)-ATPase with [125I]iodoazidocyramin. J. Biol. Chem., 259, 1053310538.

165. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951) Protein measurement with Folin reagent. J. Biol. Chem., 193,265-275.

166. Lutsenko, S., Anderko, R., Kaplan, J.H. (1995) Membrane disposition of the M5-M6 hairpin of Na+,K(+)-ATPase alpha subunit is ligand dependent. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 7936-7940.

167. Lutsenko, S., Kaplan, J.H. (1993) An essential role for the extracellular domain of the Na,K-ATPase beta-subunit in cation occlusion. Biochemistry, 32, 6737-6743.

168. Lutsenko, S., Kaplan, J.H. (1995) Organization of P-type ATPases: significance of structural diversity. Biochemistry, 34, 15607-15613.

169. Lytton, J. (1985) The catalytic subunits of the (Na+, K+)-ATPase alpha and alpha(+) isozymes are the products of different genes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 132, 764-769.

170. MacDonald, J.A., Storey, K.B. (1999) Regulation of ground squirrel Na+ ,K+-ATPase activity by reversible phosphorylation during hybernation. Biochem. Biophys. Res. Comm., 254, 424-429.

171. Mahaney, J. E., Thomas, D.D. (1991) Effects of melittin on molecular dynamics and Ca-ATPase activity in sarcoplasmic reticulum membranes; electron paramagnetic resonance. Biochemistry, 30, 7171-7180.

172. Malik, N., Canfield, V.A., Beckers, M-C., Gros, P., Levenson, R (1996) Identification of the mammalian Na,K-ATPase P3-subunit. J. Biol. Chem., 271, 22754-22758.

173. Mardh, S. (1979) Phosphorylation of kidney preparation of Na,K-ATPase by the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. In: Na,K-ATPase: structure and kinetics. Eds. Skou, J.C., Norby, J.G., Acad. Press, N.-Y., 359-370.

174. Marrs, J. A., Napolitano, E.W., Murphy-Erdson, C., Mays, R.W., Reichardt, L.F., Nelson, W. J. (1993) Distinguishing roles of the membrane-cytoskeleton and cadherin mediated cell-cell adhesion in generating different Na+,K+-ATPase distributions in polarized epithelia. J. Cell. Biol., 123, 149-164.

175. Martin-Vasallo, P., Dackowski, W., Emanuel, J.R., Levenson, R. (1989) Identification of putative isoform of the Na,K-ATPase f3-subunit. J. Biol. Chem., 264, 4613-4618.

176. Marver, D., Lear, S., Marver, L.T., Silva, P., Epstein, F.H. (1986) Cyclic AMP-dependent stimulation of Na,K-ATPase in shark rectal gland. J. Membrane Biol. 94, 205-215.

177. McDonough, A.A., Farley, R.A. (1993) Regulation of Na,K-ATPase activity. Curr. Opinion Nephrology & Hypertension 2, 725-734.

178. McDonough, A.A., Geering, K., Farley, R.A. (1990) The sodium pump needs its (3 -subunit. FASEB. J. 4, 1598-1605.

179. Mercer, R.W. (1993) The structure of Na,K-ATPase. Int. Rev. Cytol. 137C, 139168.

180. Mercer, R.W., Biemesderfer, D., Bliss, D.P., Collins, J.H., Forbush, B. (1993) Molecular cloning and immunological characterization of the y-polipeptid. A small protein associated with the Na,K-ATPase. J. Cell. Biol., 121, 579-586.

181. Michaely, P., Bennett, V. (1993) The membrane-binding domain of ankyrin contains four independently folded subdomains, each comprised of six ankyrin repeats. J. Biol. Chem., 268, 22703-22709

182. Middleton, J.P. (1996) Direct regulation of the Na,K-pump by signal transduction mechanisms. Miner. Electrolyte Metab. 22, 293-302.

183. Middleton, J.P., Khan, W.A., Collinsworth, G., Hannun, Y.A., Medford, R.M. (1993) Heterogeneity of protein kinase C-mediated rapid regulation of Na/K-ATPase in kidney epithelial cells. J. Biol. Chem., 268, 15958-15964.

184. Miller, R.P., Farley, R.A. (1990) Beta-subunit of (Na+ + K+)-ATPase contains three disulfide bonds. Biochemistry, 29, 1524-1532.

185. Mimura, K., Matsui, H., Takagi, T., Hayasi, Y. (1993) Change in oligomeric structure of solubilized Na,K-ATPase induced by octaethylene glycol dodecyl ether, phosphatidylserine and ATP. Biochim. Biophys. Acta, 1145, 63-74.

186. Minor, N.T., Sha, Q., Nicholos, C.G., Mercer, R.W. (1998) The gamma subunit of Na,K-ATPase induces cation channel activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95., 6521-6525.

187. Moller, J., Juul, D., le Maire, M. (1996) Structural organization, ion transport and energy transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta, 1286, 1-51.

188. Moore, E.D., Etter, E.F., Philipson, K.D., Carrington, W. A., Fogarty, K.E., Lifshitz, L.M., Fay, F.S. (1993) Coupling of the Na+/Ca2+ exchanger, Na+/K+ pump and sarcoplasmic reticulum in smooth muscle. Nature, 365, 657-660.

189. Morrow, J.S., Cianci, C.D., Ardito, T., Mann, A.S., Kashgarian, M. (1989) Ankyrin links fodrin to the alpha subunit of Na,K-ATPase in Madin-Darby canine kidney cells and in intact renal tubule cells. Cell. Biol., 108, 445-465.

190. Munzer, J.S., Daly, S.E., Jewell-Morz, E.A., Lingrel, J.B., Blostein, R. (1994) Tissue and isoform-specific kinetic behavior of the Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 269, 16668-16676.

191. Nelson, W.J., Veshnock, P. (1987) Ankyrin binding to (Na+K)-ATPase and implications for the organization of membrane domains in polarized cells. Nature 328, 533-537.

192. Netticadan, T., Kato, K., Tappia, P., Elimban, V., Dhalla, N.. S. (1997) Phosphorylation of cardiac Na+-K+ ATPase by Ca2+/calmodulin dependent protein kinase. Biochem. Biophys. Res. Comm., 238, 544-548.

193. Neufeld, A.H. and Levy, H.M. (1969) A second ouabain-sensitive Na-ATPase in brain microsomes. J. Biol. Chem., 244, 6493-6497.

194. Noguchi, S., Higashi K., Kawamura, M. (1990) Assembly of the a-subunit of Torpedo californica Na/K-ATPase with its preexisting P-subunitin Xenopus oocytes. Biochim. Biophys. Acta, 1023, 247-253.

195. Norby, J.G., Jensen, J. (1989) A model for the stepwise radiation inactivation of the a2-dimer of Na,K-ATPase. J. Biol. Chem. 264, 19548-19558.

196. Norby, J.G., Klodos, I., Christiansen, N.O. (1983) Kinetics of Na-ATPase activity by the Na,K-pump. Interaction of the phosphorylated intermediates with Na+, Tris+ andK+. J. Gen. Physiol. 82, 725-729.

197. O'Brian, C.A., Ward, N.E. (1989) ATP-sensitive binding of melittin to the catalytic domain of protein kinase C. Mol. Pharmacol. 36,355-359.

198. Ottolenghi, P. (1979) The relipidation of delipidated Na,K-ATPase. An analysis of complex formation with dioleoylphosphatidylethanolamine. Eur. J. Biochem. 99, 113-131.

199. Ovchinnikov, Yu.A., Monastyrskaya, G.S., Broude, N.E., Ushkaryov, Yu.A., Melkov, A.M., Smirnov, Yu.V., Malyshev, I.V., Allikmets, R.L., Kostina, M.B., Dulubova, I.E., Kiyatkin, N.I., Gryshin, A.V, Modyanov, N.N., Sverdlov, E.D. (1988) Family of human Na+, K+-ATPase genes structure of the gene for the catalytic subunit (alpha Ill-form) and its relationship with structural features of the protein FEBS Lett., 233, 87-94.

200. Pauls H., Serpersu, E.H., Kirch, U., and Schoner, W. (1986) Chromium(III) ATP inactivating Na,K-ATPase supports Na-Na and Rb-Rb exchange in inverted red blood cells but not Na,K-transport. Eur. J. Biochem. 157, 585-595.

201. Pedemonte, C.H., Kaplan, J. (1990) Chemical modification as an approach to elucidation of sodium pump structure-function relations. Am. J. Physiol., 258, (Cell Pysiol. 27) C1-C23.

202. Pedemonte, C.H., Pressley, T.A., Lokhandwala, M.F., Cinelli, A.R. (1997) Regulation of Na,K-ATPase transport activity by protein kinase C. J.Membrane Biol., 155,219-227.

203. Peng, L., Martin-Vasallo, P., Sweadner, KJ. (1997) Isoforms of Na,.K-ATPAse a and p subunits in the rat cerebellum and in granule cell cultures. J. Membr. Biol., 155,219-227.

204. Periyasamy, S.M., Huang, W.H., Askari, A. (1983) Subunit associations of (Na+ + K+)-dependent adenosine triphosphatase. Chemical cross-linking studies. J. Biol. Chem., 258, 9878-9885.

205. Perrone, J.R., Hokin, L.E. (1978) Effects of wheat germ agglutinin and concanavalin A on parameters of highly purified sodium-potassium adenosine triphosphatase from Squalus acanthias and Electrophorus electricus. Biochim. Biophys. Acta, 525,446-454.

206. Peters, L., Lux, S.E. (1993) Ankyrins: structure and function in normal cells and hereditary spherocytes. Seminars in Hematology, 30 (2), 85-118.

207. Peitsch, M., Burner, C., Tschopp, J. (1993) Sequence similarity of phospholipase A2 activating protein and the G protein P-subunits: a new concept of effector protein activation in signal transduction? TIBS, 18, 292-293.

208. Plesner, L., Plesner, J. (1981) The steady-state kinetic mechanism of ATP hydrolysis by membrane-bound (Na+ + K+)-ATPase from ox brain. Substrate identity. Biochim. Biophys. Acta, 643, 449-462.

209. Post, R. L., Hegyvary, C., Kume, S. (1972) Activation by adenosine triphosphate in the phosphorylation kinetics of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem. 247, 6530-6540.

210. Post, R.L., Kume, S., Tobin, T., Orcutt, B., Sen, A.K. (1969) Flexibility of an active center in sodium-plus-potassium adenosine triphosphatase. J. Gen. Physiol. 54, 306-326S.

211. Post, R.L., Sen, A.K., Rosenthal, A.S. (1965) A phosphorylated intermediate in adenosine triphosphate dependent sodium and potassium transport across kidney membranes. J. Biol. Chem. 240, 1437-1445.

212. Pressley, T.A. (1988) Ion concentration-dependent regulation of Na,K-pump abundance. J. Membr. Biol, 105,187-195.

213. Price, E.M.., Lingrel, J.B. (1988) Structure-function relationships in the Na,K-ATPase a-subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-11 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistent enzyme. Biochemistry, 27, 8400-8408.

214. Rabon, E., Im, W.-B., Sachs, G. (1988) Preparation of gastric H+,K+-ATPase. Methods Enzymol. 157, 649-654.

215. Raynor, R.J., Zheng, B., Kuo, J.F.(1991) Membrane interaction of amphiphilic polypeptides mastoparan, melittin, polymixin B, and cardiotoxin. J. Biol. Chem. 266, 2753-2758.

216. Rayson, B.M., Lowther, S.O. (1984) Steroid regulation of Na+-K+-ATPase: differential sensitivities along the nephron. Am. J. Physiol., 246, F656-662

217. Reeves, A.S., Collins, J.H., Schwartz,A (1980) Isolation and characterization of (Na,K)-ATPase proteolipid. Biochem. Biophys. Res. Commun., 95,1591-1598

218. Richards, D.E., Ellory, J.C., Glynn, I.M. (1981) Radiation inactivation of (Na+K)-ATPase. A small target size for the K-occluding mechanism. Biochim. Biophys. Acta 648, 284-286.

219. Robinson, J.D. (1975) Functionally distinct classic of K+ sites on the Na,Independent ATPase. Biochim. Biophys. Acta 384, 250-264.

220. Robinson, J.D. (1977) Na+ sites of the Na,K-dependent ATPase. Biochim. Biophys. Acta 482, 427-437.

221. Robinson, J.D., Flashner, M.S. (1979) Cation and nucleotide interaction with the Na,K-ATPase. In: Na,K-ATPase. Structure and kinetics. Eds. Skou, J.C., Norby, J.G. Acad. Press, London, p. 275-285.

222. Rost, B., Sander, C. (1994) Combining evolutionary information and neural networks to predict protein secondary structure. Proteins, 19, 55-72.

223. Sachs, G., Munson, K., Balaji, V.N., Aures-Fisher, D., Hersey, S.J., Hall., K. (1989) Functional domains of the gastric H,K-ATPase. J. Bioenerg. Biomembr., 21, 573-588.

224. Sachs, J.R. (1980) The order of addition of sodium and release of potassium at the inside of the sodium pump of the human red cell. J. Physiol. 302,219-240.

225. Sachs, J.R. (1981) Mechanistic implication of the potassium-potassium exchange carried out by the sodium-potassium pump. J. Physiol. (London) 316,263-277.

226. Sarvazyan, N.A., Modynov, N. N., Askari, A. (1995) Intersubunit and intrasubunit contact regions of Na+/K+-ATPase revealed by controlled proteolysis and chemical cross-linking. J. Biol. Chem. 270, 26528-26532.

227. Satoh, T., Cohen, H.T., Katz, A.I., (1992) Intracellular signalling in the regulation of renal Na,K-ATPase. I. Role of cyclic AMP and phospholipase A2. J. Clin. Invest., 89,1496-1500.

228. Scheiner-Bobis, G., Schoner, W. (1985) Demonstration of Mg2+-induced conformational change by photoaffinity labeling of the high-affinity ATP-binding site of (Na+K)-ATPase with 8-azido-ATP. Eur. J. Biochem., 152, 739-746.

229. Schmalzing, G, Gloor, S., Omay, H., Kroner, S., Appelhans, H., Schwarz, W. (1991) Up-regulation of sodium pump activity in Xenopus laevis oocytes by expression of heterologous beta 1 subunits of the sodium pump. Biochem. J., 279, 329-336.

230. Schmalzing, G., Gloor, S. (1994) Na/K pump (3-subunit. Structure and function. Cell Physiol. Biochem., 14, 96-114.

231. Schoot, B.M., Van Emst-de Vries, S.T., van Haard, P.M., (1980) Studies on (Na+ + K+)-activated ATPase. Biohim. Biophys. Acta, 602,144-154.

232. Sen, A.K., and Post, R.L. (1964) Stoichiometry and localization of adenosine triphosphate-dependent sodium and potassium transport in the erythrocyte. J. Biol. Chem. 239, 345-352.

233. Sen, P.C., Kapakos, J.G., Steinberg, M. (1981) Modification of (Na+ + K+)-dependent ATPase by fluorescein isothiocyanate: evidence for the involvement of different amino acid groups at different pH values. Arch. Biochem. Biophys., 211 (2), 652-661.

234. Shainskaya, A., Karlish, S.J.D. (1996) Chymotriptic digestion of the cytoplasmic domain of the (3 subunit of Na/K-ATPase alters kinetics of occlusion of Rb+ions. J. Biol. Chem., 271, 10309-10316.

235. Shamraj, O.I., Lingrel, J.B. (1994) A putative fourth Na+,K(+)-ATPase alpha-subunit gene is expressed in testis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12952-12956.

236. Sharon, N., Lis, H. (1990) Legume lectins a large family of homologous proteins. FASEB. J., 4,3198-3208.

237. Shull, G.E., Greeb, J., Lingrel, J.B. (1986) Molecular cloning of three distinct forms of the (Na+K)-ATPase a-subunit from rat brain Biochemistry, 25, 81258132.

238. Shull, G.E., Schwarts A., Lingrel J.B. (1985) Amino-acid sequence of the catalytic subunit of the (Na++K+)ATPase deduced from a complementary DNA. Nature, 316, 691-695.

239. Silver, S,. Nucifora, G., Phang, L.T. (1993) Human Menkes X-chromosome disease and the staphylococcal cadmium-resistance ATPase: a remarkable similarity in protein sequences. Mol. Microbiol. 10, 7-12.

240. Simons, T.J.B. (1974) Potassium: potassium exchange catalyzed by the sodium pump in human red cells. J. Physiol. 244, 731-739.

241. Singh, H., Linas, S. (1996) (^-adrenergic function in cultured rat proximal tubule epithelial cells. Am. J. Physiol, 40, 71-77.

242. Skou, J. C (1957) The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from priferal nerves. Biochim. Biophys. Acta, 23, 394-401.

243. Skou, J.C. (1974) Effect of ATP on the intermediary steps of the reaction of the (Na+ plus K+) - dependent enzyme system. II. Effect of a variation in the ATP-Mg2+ ratio. Biochim. Biophys Acta 339, 246-257.

244. Skou, J.C. (1982) The effect of pH, of ATP and modification with pyridoxal phosphate on the conformational transition between the Na+-form and the K+-form of the (Na++K+)-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 688, 369-380.

245. Skou, J.C. (1992) The Na-K pump. News in physiological Sciences, 7, 95-100.

246. Skou, J.C., Esmann, M. (1988) Eosin as a fluorescence probe for measurement of conformational states of Na+,K+-ATPase. In Methods Enzymol., 156, 278-81

247. Skriver, E., Maunsbach, A.B., Jorgensen, P.L. (1981) Formation of two-dimensional crystals in pure mebrane-bound Na+, K+-ATPase. FEBS Lett., 131, 219-222.

248. Smith, D.L., Tao, T., Maguire, M.E. (1993) Membrane topology of a P-type ATPase. The Mgt B magnesium transport protein of Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 268., 22469-22479.

249. Smith, P.A., (1984) Does the electrogenic Na/K pump play a role in the neuronal effects of catecholamines. NIPS, 422-425. (october).

250. Solioz, M., Odermatt, A., Krapf, R. (1994) Cupper pumping ATPases: common concept in bacteria and man. FEBS Letters, 346, 44-47.

251. Stokes, D.L., Taylor, W.R., Green, N.M. (1994) Structure, transmembrane topology and helix packing of P-type ion pumps. FEBS Letters, 346, 32-38.

252. Sverdlov, E.D., Monastyrskaya, G.S., Broude, N.E., Ushkaryov, Yu., Allikmets, R.L., Melkov, A.M., Smirnov, Yu.V., Malyshev, I.V., Petrukhin, K.E. (1987) The family of human Na+,K+-ATPase genes. FEBS Lett., 217, 275-278.

253. Swan, A.C., Daniel, A., Albers, R.W., Koval, C.J. (1975) Interactions of lectins with (Na+ +K+)-ATPase of eel electric organ. Biochim. Biophys. Acta, 401, 299306.

254. Sweadner, K. (1989) Isozymes of the Na/K-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 988, 185-220.

255. Tamkun, M.M., Fambrough, D.M. (1986) The (Na+K)-ATPase of chick sensory neurons. Studies on biosynthesis and intrcellular transport. J. Biol. Chem., 261, 1009-1119.

256. Taylor, S.S., Buechler, J.A., Yonemoto, W. (1990) cAMP-dependent protein kinase: framework for a diverse family of regulatory enzymes. Annu. Rev. Biochem., 59, 971-1005.

257. Thevananther, S., Kolli, A.H., Devarajan, P. (1998) Identification of a novel ankyrin isoform (AnkG190) in kidney and lung that associates with the plasma membrane and binds alpha-Na, K-ATPase J. Biol. Chem., 273, 23952-23958

258. Thomas, R.C. (1972) Electrogenic sodium pump in nerve and muscle cells. Physiol. Rev. 52, 563-594.

259. Tran, C.M., Huston, E.E., Farley, R.A. (1994) Photochemical labeling and inhibition of Na,K-ATPase by 2-Azido-ATP. Identification of an aminoacid located with the ATP binding site. J. Biol. Chem., 269, 6558-6565.

260. Treuheit, M.J., Costello, L.F., Kirley, T.L. (1993) Structure of the complex glycans found on the beta-subunit of (Na,K)-ATPase. J. Biol. Chem., 268, 13914-13919.

261. Turi, A., Somogyi, J. (1988) Possible regulation of the myometrial Na/K-ATPase

/j I

activity by Ca and cAMP-dependent protein kinase. Biochim. Biophys. Acta, 940, 77-84.

262. Vasiletz, L.A., Schmalzing, G., Madefessel, K, Haase, W., Schwartz, W. (1990) Activation of protein kinase C by phorbol ester induces downregulation of the Na/K-ATPase in oocytes ofXenopus laevis. J. Membr. Biol. 118,131-142.

263. Vasiletz, L.A., Scwartz, W. (1992) Regulation of endogenous and expressed Na/K pumps in Xenopus oocytes by membrane potential and stimulation of protein kinases. J. Membr. Biol. 125, 119-132.

264. Vilsen, B (1993) Glutamate 329 located in the fourth transmembrane segment of the alpha-subunit of the rat kidney Na+,K+-ATPase is not an essential residue for active transport of sodium and potassium ions. Biochemistry, 32, 13340-13349

265. Vilsen, B. (1995) Mutant Glu781 Ala of the rat kidney Na+,K(+)-ATPase displays low cation affinity and catalyzes ATP hydrolysis at a high rate in the absence of potassium ions. Biochemistry, 34,1455-1463.

266. Vladimirova, N.M, Potapenko, N.N, Sachs, G., Modyanov, N.N. (1995) Determination of the sidedness of the carboxy-terminus of the Na+/K+-ATPase alpha-subunit using lactoperoxidase iodination. Biochim. Biophys. Acta, 1233, 175-184.

267. Will, P.C., Longworth, J.W., Brake, E.T., Cook, J.S. (1977) Analysis of intracellular drug (ouabain) sequestration as a mechanism of detoxication. Mol. Pharmacol., 13, 161-171.

268. Wolitzky, B.A., Fambrough, D.M. (1986) Regulation of the (Na+K)-ATPase in cultured chick skeletal muscle. Modulation of expression by the demand for ion transport. J. Biol. Chem. 261, 9990-9999.

269. Xu, K-Y. (1989) Any of several lysines can react with 5-isothiocyanatofluorescein to inactivate sodium and potassium ion activated adenosine triphosphatase. Biochemistry, 28, 5764-5772.

270. Zaheer, A., Elting, J., Montgomery, R. (1981) (Na+ +K+)-stimulated ATPase inhibition by cesalin and macromycin. J. Biol. Chem., 256, 1786-1792.

В заключение я хочу выразить благодарность всем сотрудникам и преподавателям кафедры биохимии МГУ за полученные мною знания и навыки, без которых выполнение этой работы было бы невозможным.

Я глубоко признательна своему научному руководителю Ольге Дмитриевне Лопиной за большую помощь и постоянное внимание к моей работе.

Я искренне и глубоко признательна Сергею Петровичу Петухову за помощь в планировании и постановке экспериментов по фосфорилированию ферментов и участие в обсуждении полученных результатов.

Также я хочу выразить благодарность Александру Михайловичу Рубцову за постоянную помощь и неоценимые советы.

Я благодарна Александру Александровичу Болдыреву, без участия и помощи которого эта работа не была бы выполнена.

Выражаю благодарность сотрудникам лаборатории ПНИЛ химии ферментов за помощь, оказанную мне в освоении иммунохимических методов.

Благодарю всех сотрудников и аспирантов лаборатории за помощь и теплое отношение ко мне.