Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-АТРазой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Долгова, Наталия Валерьевна

• Долгова, Наталия Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Долгова, Наталия Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Ыа,К-АТРазы.

Структура Ыа,К-АТРазы.

Механизм функционирования Ыа,К-АТРазы.

Изоформы Ыа,К-АТРазы.

Синтез, топогенез и деградация Ыа,К-АТРазы.

Роль Ыа,К-АТРазы в функционировании различных клеток и тканей.

Роль Иа,К-АТРазы в поддержании ионных градиентов Ыа+ и 1С ив осуществлении связанных с этим функций.

Роль Иа,К-АТРазы в структурной организации клетки и клеточной адгезии.

Р-субъединица Ыа,К-АТРазы -молекула клеточной адгезии.

Разделительные контакты.

Регуляция активности Ыа,К-АТРазы.

Белки семейства FATD.

Регуляция активности Ыа,К-АТРазы путем фосфорилирования/дефосфорилирования.

Регуляция активности Ыа,К-АТРазы посредством изменения количества молекул фермента, расположенных в плазматической мембране.

ЭНДОГЕННЫЕ ИНГИБИТОРЫ Ыа,К-АТРазы.

Разновидности и свойства эндогенных ингибиторов Ка,К-АТРазы.

Параметры, характеризующие взаимодействие эндогенных ингибиторов Ыа,К

АТРазы с ферментом.

Белки крови, связывающие уабаин и уабаин-подобные соединения. Перенос сердечных гликозидов внутрь клетки и обратно.

Ыа,К-АТРаза - РЕЦЕПТОР НОВОГО КЛАССА ГОРМОНОВ

КАРДИОТОНИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ.

Роль Ыа,К-АТРазы в регуляции ионных потоков. Инотропный эффект кардиотонических стероидов.

Токсическое действие уабаина и других кардиотонических стероидов.

Кардиотонические стероиды как стимуляторы роста клеток. Влияние на экспрессию белков.

Влияние кардиотонических стероидов на перестройки плазматической мембраны и внутриклеточных везикул.

Влияние кардиотонических стероидов на прикрепление клеток к субстрату и межклеточную адгезию.

МЕЛИТТИН-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ И ИХ СВЯЗЬ С АТРазами Р-ТИПА.

Структура и свойства мелиттина.

Взаимодействие мелиттина с клеточными белками.

Мелиттин-подобные белки.

МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕСЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕЖБЕЛКОВЫХ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ.

Аффинная хроматография.

Химические сшивки.

Иммунопреципитация.

Лиганд-блоттинг (протеин-оверлей).

Двугибридные системы.

Иммуноцитохимические методы.

Метод флуоресцентного резонанса.

Микрочипы.

Влияние детергентов на белки.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МЕТОДЫ.

МАТЕРИАЛЫ.

ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ.

Получение фракции микросом из почек свиньи.

Получение фракции микросом из солевых желез уток.

Получение препарата очищенной Ыа,К-АТРазы.

Выделение а-субъединицы Ыа,К-АТРазы.

Получение поликлональных сывороток против а1|31-изоферментаЫа,К-АТРазы, а1субъединицы Ыа,К-АТРазы и мелиттина.

Очистка сыворотки от альбуминов путем осаждения белков сульфатом аммония.

Очистка антител на Ыа,К-АТРазу методом аффинной хроматографии.

Очистка антител на мелиттин методом аффинной хроматографии.

Выделение белков гомогената, взаимодействующих с антителами на мелиттин.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assays).

Точечный твердофазный иммуноферментный анализ (dot-ELISA, dot enzyme-linked immunosorbent assays).

Определение концентрации белка.

Электрофорез по методу Леммли.

Окрашивание гелей Кумасси бриллиантовым голубым G-250 (или R-250).

Окрашивание гелей серебром.

Анализ результатов электрофореза.

Иммуноблоттинг.

Иммунопреципитация Ыа,К-АТРазы.

Авторадиография.

Метод протеин-оверлей.

Измерение активности Ыа,К-АТРазы.

Измерение ингибирования Ыа,К-АТРазы мелиттином.

Оценка степени олигомеризации Ыа,К-АТРазы в присутствии мелиттина.

Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Ыа,К-АТРазы солевых желез утки и почек кролика.

Измерение флуоресценции ФИТЦ-меченных препаратов №,К-АТРазы из солевых желез утки и почек кролика.

Подготовка образцов для определения N-концевой последовательности белков по методу Эдмана.

Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа трипсинолизных фрагментов.

Компьютерный анализ последовательностей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение и характеристика поликлональных антител на Ыа,К-АТРазу и мелиттин .70 Выявление белков, взаимодействующих с Ыа,К-АТРазой, с использованием метода иммунопреципитации.

Подбор условий для проведения иммунопреципитации.

Иммунопреципитация Na.K-АТРозы в комплексе со взаимодействующими с ней белками.

Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-ATPa3oñ, с использованием метода протеин-оверлей.

Влияние уабаина на белки, преципитирующие совместно с Na,K-ATPa3oñ.

Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-ATPa3oñ и фосфорилируемых эндогенными протеинкиназами.

Влияние мелиттина на ферментативную активность и олигомерное состояние Na,K

АТРазы.

Исследование взаимодействия Ыа,К-АТРазы с мелиттин-подобными белками.

Выделение мелиттин-подобных белков.

Взаимодействие мелиттин-подобных белков с Na.K-АТРазой.

Идентификация мелиттин-подобного белка 67 кДа.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-АТРазой»

Na,K-ATPa3a представляет собой олигомерный интегральный белок плазматической мембраны клеток животных, состоящий из субъединиц двух типов: каталитической асубъединицы с молекулярной массой около 100 кДа и регуляторной Р-субъединицы, являющейся гликопротеидом с молекулярной массой около 55 кДа. Основная функция этого фермента заключается в поддержании гомеостаза ионов натрия и калия: Na,KАТРаза осуществляет АТР-зависимый перенос ионов натрия наружу, а ионов калия внутрь клетки. Образующийся ионный градиент используется для поддержания объема и мембранного потенциала клеток, обеспечения вторичного транспорта различных веществ, например ионов кальция и фосфата, аминокислот, Сахаров и др. Благодаря своей значимости и разнообразию функций, активность Ыа,К-АТРазы во всех тканях тонко регулируется со стороны как нервной, так и эндокринной системы. В течение последних трех десятилетий механизмы регуляции интенсивно изучаются, однако несмотря на это большинство путей регуляции остаются недостаточно изученными, а в некоторых случаях и неизвестными. В течение последнего десятилетия было установлено, что помимо своей классической функции, Na,K-ATPa3a выполняет еще одну, не менее важную участвует в рецепции и передаче клеточных сигналов. Оказалось, что специфические ингибиторы Na,K-ATPa3bi, относящиеся к классу стероидных гликозидов и обнаруженные первоначально в растениях и слизи кожи амбифий, присутствуют также в организме человека и животных. В конце 90-х годов прошлого века бьшо установлено, что такие сердечные гликозиды, как уабаин и дигоксин, синтезируются в надпочечниках и гипоталамусе млекопитающих и являются гормонами, оказывающими различное влияние на разные ткани. В настоящее время наиболее полно изучено влияние уабаина на кардиомиоциты. Связывание этого сердечного гликозида с Ыа,К-АТРазой приводит к активации двух различных, хотя и тесно взаимосвязанных, путей регуляции жизнедеятельности клетки. С одной стороны, ингибирование Ыа,К-АТРазы вызывает повышение внутриклеточной концентрации натрия, в результате чего активируется NaVCa-обменник, который переносит ионы кальция внутрь клетки. За счет увеличения концентрация ионов кальция в цитоплазме усиливается сократимость миоцитов (положительный инотропный эффект уабаина). С другой стороны, взаимодействие уабаина с Ыа,К-АТРазой приводит к активации экспрессии определенных генов, в том числе актина, натриуретического фактора из предсердия, аЗ-субъединицы Ка,К-АТРазы (Kometiani Р. et al., 1998), а также генов раннего ответа, например, c-Fos и c-Jun, и к ингибированию экспрессии маркерных генов позднего ответа (Xie Z., Askari А., 2002). Изменение экспрессии белков в конечном счете приводит к гипертрофии кардиомиоцитов. Показано, что в результате связывания уабаина с Ка,К-АТРазой происходит ее взаимодействие с Src-киназой, сопровождающееся активацией тирозинкиназ, повышается уровень активных форм кислорода, играющих в клетке роль вторичных мессенджеров, активируется МАР-киназный каскад. Известно, что уабаин оказывает похожее влияние на гладкомышечные клетки сосудов и скелетные мышцы (Xie Z., Askari А., 2002). Однако в настоящее время ясно, что в разных тканях уабаин и его аналоги могут вызывать совершенно разные эффекты. На данный момент точный механизм влияния уабаина и причина дифференцированного воздействия сердечного гликозида на клетки различного происхождения неясна. Известно, что АТРазы Р-типа, к которым относится и Na,K-ATPa3a, ингибируются пептидом из яда пчелы, мелиттином, образующим амфипатическую а-спираль. Установлено, что мелиттин влияет на функционирование некоторых белков, участвующих в передаче клеточных сигналов, например активирует фосфолипазу Аг и взаимодействует с кальмодулином, препятствуя связыванию с ним эффекторных белков. Мелиттин непосредственно взаимодействует с каталитической субъединицей Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума и а-субъединицей Н,К- и На,К-АТРаз. Во многих тканях обнаружены белки, взаимодействующие с антителами на мелиттин, то есть имеющие в своем составе структуры, похожие на него. Представителями таких белков являются белки-активаторы фосфолипазы Аг, относящиеся к семейству G-белков, и мелитгин-подобный белок, взаимодействующий с Н,К- и Са-АТРазой. Установлено, что эти белки участвуют в передаче клеточных сигналов, регуляции роста клеток и способны подавлять развитие раковых опухолей. Возможно, что мелиттин-подобные белки способны взаимодействовать с Ыа,К-АТРазой, имеющей в своем составе участок связывания мелиттина, и принимать участие в передаче клеточных сигналов от этого фермента или в регуляции самого ионного насоса. Таким образом, выявление и идентификация белков, непосредственно взаимодействующих с Ыа,К-АТРазой в различных тканях при различных условиях, является очень важной задачей, позволяющей понять механизмы регуляции активности самого фермента, а также его роли в передаче внутриклеточного сигнала. В настоящее время интенсивно развиваются технологии изучения межбелковых взаимодействий, позволяющие понять механизмы передачи клеточных сигналов, однако практически все они направлены на исследование растворимых белков, тогда как межбелковые взаимодействия мембранных белков ввиду отсутствия подходов для их изучения часто остаются неизученными. Поэтому прежде чем приступать к изучению белков, взаимодействующих с Ыа,К-АТРазой, необходимо разработать методы, позволяющие работать с мембранными белками. В настоящей работе предпринята попытка использовать методы иммунопреципитации и протеин-оверлей для выявления комплексов Ыа,К-АТРазы со взаимодействующими белками, исследовать влияние уабаина на взаимодействия белков с этим ферментом и идентифицировать один из белков-партнеров Na,K-ATPa3bi.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Na,K-ATPa3bi Na,K-ATPa3a (На,К-зависимая, Mg-активируемая аденозинтрифосфогидролаза, КФ 3.6.1.3) представляет собой олигомерный интегральный белок плазматической мембраны клеток животных, осуществляющий АТР-зависимый перенос трех иойов натрия из клетки и двух ионов калия внутрь клетки против электрохимического градиента. Na,K-ATPa3a принадлежит к широко распространенному классу АТРаз Р-типа, обеспечивающих активный транспорт различных ионов (Н, Na*, К*, Са% Си, Cd" через мембраны прокариот и эукариот. Для транспорта ионов против электрохимического градиента все эти ферменты используют энергию АТР. Обозначение «Р» отражает уникальную особенность АТРаз этого типа фосфорилировать остаток аспарагиновой кислоты в процессе прохождения каталитического цикла. АТРазы этого типа имеют второе название: Е1-Е2 АТРазы, напоминающее о том, что в процессе каталитического цикла АТРазы постоянно переходят из Ei в Ег конформацию и обратно. Каталитические субъединицы АТРаз Р-типа имеют сходную третичную структуру и несколько практически идентичных доменов. Особенно высокую степень гомологии имеют участки последовательности, принимающие участие в связывании и гидролизе АТР (Blanco G., Mercer R.W., 1998). Структура Na,K-ATPa3bi Na,K-ATPa3a состоит из двух нековалентно связанных субъединиц а- и р- с молекулярными массами около Каталитическая активность 100 и 55-60 кДа, соответственно, являющихся обеспечивается а-субъединицей АТРазы. Эта интегральными белками мембран (рис. 1). субъединица содержит в своем составе 10 трансмембранных сегментов (М1-М10), содержащих 17-25 аминокислотных остатков, формирующих а-спирали. Канал, через который осуществляется перенос ионов натрия и калия через мембрану, образован трансмембранными доменами М4, М5, Мб и М8. N- и С-концевые фрагменты а-субъединицы располагаются в цитоплазме. Nконцевая часть полипептидной цепи это гибкий неспирализованный участок с большим содержанием лизина. Он принимает участие в конформационных переходах и, возможно, регулирует чувствительность фермента к катионам (Mobasheri А., 2000). Между трансмембранными фрагментами М2 и МЗ располагается малая цитоплазматическая й (к 1* Рис. 1. Схематическое изображение структуры а- и Р-субъединиц Na,K-ATPa3bi. петля, а между М4 и М5 большая цитоплазматическая петля, в состав которой входит более 400 аминокислотных остатков (Stokes D.L., 1994). Рентгеноструктурный анализ На,К-АТРазы с большим разрешением до настоящего времени не сделан. Однако такой анализ проведен для Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума (Toyoshima С, 2000), ближайшей родственницы Na,K-ATPa3bi. На основании этого анализа и многочисленных данных о структуре обоих ферментов, полученных с R944 Рис. 2. Модель трехмерной структуры а-субъединицы Na,K-ATPa3bi. использованием различных методов, построена модель возможной третичной структуры а-субъединицы Ка,К-АТРазы (Jorgensen P.L., 2003), которая представлена на рис. 2. Цитоплазматическая часть каталитической субъединицы Ыа,К-АТРазы сформирована большой петлей, расположенной между 4-м и 5-м трансмембранными фрагментами, малой петлей, находящейся между 2-м и 3-м трансмембранными доменами, и N-концевой частью молекулы (рис. 1). В этой части а-субъединицы выделяют 3 домена: нуклеотид-связывающий (N), фосфорилируемый (Р) и активаторный (А), которые на рис. 2 окрашены в зеленый, синий и красный цвета, соответственно. Нуклеотид-связывающий домен содержит в своем составе аминокислотную последовательность от Asp до Asp, образующую участок связывания АТР. По своей третичной структуре этот домен представляет собой Р-складчатый лист. Последовательности, окружающие нуклеотид-связывающий домен, в третичной структуре расположены в непосредственной близости друг от друга и образуют фосфорилируемый (Р) домен (участок полипептидной цепи Ala* -Cys и Asn -Asp Последний содержит традиционную для АТР-связывающих белков структуру складку Россмана ((ЗараР). Как следует из названия, этот домен содержит остаток аспарагиновой кислоты Asp, который в процессе прохождения каталитического цикла подвергается фосфорилированию-дефосфорилированию. Активаторный домен (А) самый маленький из доменов а-субъединицы. Он состоит из N-концевой части полипептидной цепи (Glu -Glu и петли между вторым и третьим Механизм функционирования Na,K-ATPa3bi Механизм функционирования Ыа,К-АТРазы описывается схемой Альбертса-Поста, названной в честь ее создателей (Post R.L. et al., 1972). Согласно этой схеме, перенос ионов натрия и калия через плазматическую мембрану осуществляется по механизму пинг-понга и представляет собой восьмистадийный процесс, в котором происходит чередование двух основных конформаций Ыа,К-АТРазы в фосфорилированном и нефосфорилированном состояниях (рис. 3). NasEi-ATP Ма*цит Е1-АТР 2К*цит--> К2Е1-АТР (Маз)Е1-Р Р-ЕгЫаз К 3Na*i L-2K*B, Р-Е2К2 АТР-Е2(К2)-Е2(К2) Рис. 3. Схема цикла Альбертса-Поста. В реакцию вступает Ерконформация фермента, имеющая высокое сродство к АТР и цитоплазматическим ионам Na. Связывание Na активирует фосфорилирование фермента по остатку аспарагиновой кислоты Asp Такое фосфорилирование обратимо, то есть возможен обратный перенос фосфорильного остатка с фермента на ADP (ATP-ADPобмен), сопровождаемый обменом Na через мембрану (Ыа*-Ыа*-обмен). Добавление с наружной стороны мембраны к фосфоферменту ионов К* активирует гидролиз ацилфосфатной связи и приводит к освобождению неорганического фосфата. Эта стадия также обратима: в присутствии высоких концентраций Mg обнаруживается включение неорганического фосфата в тот же остаток аспарагиновой кислоты. При этом в присутствии неорганического фосфата или негидролизуемого аналога АТР наблюдается обмен ионов К* через мембрану (К*-К-обмен). Таким образом, катион-связывающие участки доступны для цитоплазматических ионов только в нефосфорилированном ферменте, а для внеклеточных ионов только в фосфоферменте. Какой именно ион будет взаимодействовать фермента: Е] или Ег. Наиболее сильным конформационным изменениям в процессе каталитического цикла подвергается домен А, который в конформации Ег взаимодействует с доменами Р и N, а в конформации Ei расположен обособленно (Jorgensen P.L. et al., 2003). Кроме того, изменяются также взаимодействия между цитоплазматической петлей М2-МЗ и Nконцевым доменом Ыа,К-АТРазы (рис. 4). (Segall L., Javaid Z.Z., et al., 2003; Segall L., Lane L.K. et al., 2003; Karlish S.J.D., 2003). с катион-связывающим центром, определяется конформацией Рис. 4. Схема изменений взаимодействий между доменами Ыа,К-АТРазы, происходящих при переходе из конформации Ei в Е2 и обратно в процессе каталитического цикла. О остаток Lys, ковалентно связывающийся с ф луоресцеинизотиоцианатом. Несмотря на существенные различия в свойствах двух конформации фермента, не так просто найти методы, позволяющие зарегистрировать переходы между ними, так как при связывании фермента с ионами существенным структурным изменениям подвергается только часть молекулы. Так, при переходе из конформации Ei в Ег и обратно интенсивность собственной флуоресценции Na,K-ATPa3bi изменяется только на 2-3% (Karlish S.J.D., Yates D.W., 1978). Значительный вклад в изучение различных конформационных состояний был сделан исследованиями с использованием метода флуоресцентных проб, позволившего непосредственно наблюдать переход между конформациями. Одним из наиболее часто применяющихся реагентов является флуоресцеинизотиоцианат. Во всех АТРазах Р-типа флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) связывается с остатком Lys*, расположенным в нуклеотид-связывающем домене N (рис. 4). В конформации Е2(2К") флуоресценция ФИТЦ экранируется доменом А, взаимодействующим с доменами N и Р, тогда как в конформации Ei(3Na) ФИТЦ расположен на поверхности фермента, поэтому его флуоресценция в этой конформации максимальна (Abbott A.J. et al., 1991).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Долгова, Наталия Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. С помощью методов иммунопреципитации и протеин-оверлей с использованием антител против aipi-изоформы ИаДС-АТРазы показано, что в солевых железах уток с Na,K-ATPa3oft взаимодействуют 15 белков с молекулярными массами от 10 до 205 кДа, в наружной медулле почек свиньи — 16-18 белков с молекулярными массами от 10 до 190 кДа. Методом иммунопреципитации с помощью антител против al-субъединицы Na,K-ATPa3U установлено, что в наружной медулле почек крысы с ферментом взаимодействуют 18 белков с молекулярными массами от 10 до 190 кДа.

2. С помощью метода иммунопреципитации установлено, что в присутствии 0,5 мМ уабаина изменяется набор белков, образующих комплексы с Иа,К-АТРазой из почек крысы: 5 белков с молекулярными массами от 27 до 105 кДа перестают связываться с АТРазой, а 12 белков с молекулярными массами от 25 до 205 кДа, ранее не взаимодействовавшие с ферментом, образуют комплекс с Na,К-АТРазой.

3. Белок из солевых желез уток с молекулярной массой 44 кДа, взаимодействующий с Na,K-ATPa3ofl, in vitro фосфорилируется эндогенной протеинкиназой в присутствии 0,5 мМ уабаина.

4. Среди белков, взаимодействующих с Na,K-ATPa3oft из почек крысы, обнаружены белки с молекулярными массами 35 и 45 кДа, реагирующие с антителами на мелиттин. Помимо них с антителами на мелитгин реагирует также белок с молекулярной массой 67 кДа, который взаимодействует с Ыа,К-АТРазой только в присутствии уабаина.

5. С использованием ФИТЦ-меченной Na,K-ATPa3bi установлено, что мелиттин-подобный белок непосредственно взаимодействует с Ыа,К-АТРазой из солевых желез уток в присутствии ионов Na+.

6. Определена N-концевая последовательность белка из почек мыши с молекулярной массой 67 кДа, взаимодействующего с Na,K-ATPa3oft и реагирующего с антителами на мелиттин: hppkvrvrslng. Такая аминокислотная последовательность присутствует в семействе белков, имеющих WD- и FYVE-домены, на расстоянии 553 аминокислоты от С-конца этих белков, что соответствует полипептидному фрагменту с молекулярной массой 67 кДа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что несколько лет назад было завершено секвенирование полного генома человека, и базы данных постоянно пополняются новой информацией о структуре геномов различных организмов, структура и функции кодируемых генами белков в подавляющем большинстве случаев остаются неизвестными. Однако в отличие от достаточно хорошо разработанных методов геномики, методы, позволяющие изучать структуру и функцию белков, в настоящее время только разрабатываются. Структура и физико-химические свойства белков настолько разнообразны, что очень трудно, скорее даже невозможно, подобрать универсальные методы, применимые для изучения всех белков. Существующие на сегодяшний день методы в основном применимы к растворимым белкам, и только в редких случаях тот или иной подход можно применить для мембранных белков.

Для того, чтобы понять, как функционирует живая клетка и целый организм, как оказывается, недостаточно знать структуру и функцию генов и белков, необходимо также знать сложные системы регуляции жизнедеятельности клеток и организма. В течение последних 10-15 лет активно изучаются механизмы передачи клеточных сигналов, однако на сегодняшний день в этой области огромное количество белых пятен. Разработанные в настоящее время методы для изучения межбелковых взаимодействий практически всегда дают неоднозначные результаты, требующие подтверждения другими методами, требуют подбора условий для каждого конкретного белка и дорогостоящи. Кроме того, большинство методов невозможно применить для мембранных белков, а в тех случаях, когда их применение теоретически возможно, отсутствуют методики, приспособленные для работы с такими белками.

В настоящей работе подобраны условия для выявления методом иммунопреципитации белков-партнеров Ыа,К-АТРазы, являющейся интегральным белком плазматической мембраны. Кроме того, для изучения взаимодействий этого фермента с другими белками был использован метод лиганд-блоттинга (протеин-оверлей). Оба метода были модифицированы таким образом, чтобы можно было выявить как можно больше белков, взаимодействующих с Иа,К-АТРазой. В экспериментах были использованы разные виды тканей из разных организмов. В солевых железах уток с помощью обоих методов было обнаружено 15 белков-партнеров Ыа,К-АТРазы, а в наружной медулле почек свиньи — 1618 белков. С помощью метода иммунопреципитации в наружной медулле почек крысы были обнаружены 18 белков, взаимодействующих с №,К-АТРазой.

Выявление с помощью метода иммунопреципитации достаточно большого количества белков, взаимодействующих с ферментом, по-видимому, можно объяснить тем, что при проведении иммунопреципитации с антигеном осаждаются целые комплексы белков, которые в клетке образуют функциональные единицы. Так, например, показано, что с помощью антител против /Са -обменника вместе с антигеном осаждается комплекс белков, по-видимому, существующий в интактной клетке и обеспечивающий поддержание определенной концентрации кальция в клетке: сс2- и аЗ-субъединицы Ыа,К-АТРазы, а2-субъединица дигидропиридинового рецептора, анкирин 2, а-фодрин, р-спектрин, а также белки эндоплазматического ретикулума ЗЕЯСА 2 и рецептора инозитол-3-фосфата 1-го типа (Ьепсевоуа Ь. е1 а!., 2004).

Нами показано, что в присутствии уабаина изменяется набор преципитирующих с Ыа,К-АТРазой белков: одни белки, взаимодействующие с ферментом в отсутствие уабаина, перестают с ним взаимодействовать, другие же белки, напротив, связываются с ним. Эти данные свидетельствуют о том, что при связывании с №,К-АТРазой уабаина происходит замена одних белков-партнеров на другие, что может приводить к активации тех или иных сигнальных путей.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что с Ка,К-АТРазой взаимодействуют три мелиттин-подобных белка с молекулярными массами 35, 45 и 67 кДа, причем белок с молекулярной массой 67 кДа взаимодействует с ферментом только в присутствии уабаина. Взаимодействие последнего белка с ферментом было подтверждено с помощью измерения зависимости флуоресценции ФИТЦ-меченной ]Ма,К-АТРазы от концентрации этого белка. Добавление этого белка к ЫаД-АТРазе в присутствии ЫаС1 приводит к увеличению флуоресценции ФИТЦ, что свидетельствует о влиянии мелитгин-подобного белка 67 кДа на конформационное состояние фермента.

Для идентификации мелиттин-подобного белка с молекулярной массой 67 кДа была определена его Ы-концевая последовательность и проведен поиск белков, содержащих эту последовательность, в базах данных пг ЫСВ1 и Б^эРго^ Обнаружено, что Ы-концевой пептид мелиттин-подобного белка содержится в нескольких последовательностях базы данных ЫСВ1 на одинаковом расстоянии от С-конца, соответствующем белку с молекулярной массой 67 кДа (553 аминокислоты). Анализ предположительной последовательности белка с помощью программы КРЗ-ВЬАБТ 2.2.9 показал, что белок может содержать в своем составе два типа доменов - \VD40 и РУУЕ. Присутствие доменов >ЛТ)40 в мелиттин-подобном белка было подтверждено также с помощью масс-спектрометрического анализа фрагментов его трипсинолиза.

Присутствие доменов А\Т)40 и РУУЕ говорит о возможном участии белка в сигнальных каскадах клетки, перестройках цитоскелета, эндо-/экзоцитозе и возможной его регуляции под действием фосфатидилинозитол-3-фосфаткиназы. Из литературы известно, что последняя участвует в регуляции эндоцитоза и экзоцитоза №,К-АТРазы (ЕГепсйеу Я. е1 а1., 2002; BeItowski I. е1 а!., 2004). Возможно, обнаруженный нами белок принимает участие в эндо-/экзоцитозе Ыа,К-АТРазы, происходящем под действием уабаина.

Таким образом, в настоящей работе были найдены методические подходы для изучения межбелковых взаимодействий мембранных белков. С помощью этих методов были обнаружены белки, взаимодействующие с Ка,К-АТРазой в присутствие и в отсутствие уабаина, некоторые из которых были определены как мелиттин-подобные, а для одного из белков с молекулярной массой 67 кДа была определена М-концевая последовательность и проведен масс-спектрометрический анализ. На основании полученных данных в базе данных МСВ1 было выявлено семейство белков, содержащих в своем составе домены \VD40 и БУУЕ, а на С-конце - предполагаемую последовательность мелиттин-подобного белка. Полученные данные позволяют предположить, что мелиттин-подобный белок с молекулярной массой 67 кДа может участвовать в регуляции активности Иа,К-АТРазы путем эндо-/экзоцитоза, а также быть одним из белков, участвующим в переключении сигнальных каскадов под действием уабаина.

Полученные нами данные открывают несколько направлений дальнейших исследований, одн из которых будет связано с изучением функции нового неизвестного ранее белка, а также, возможно, всего семейства родственных ему белков.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Долгова, Наталия Валерьевна, 2005 год

1. Al-Khalili L., Kotova О., Tsuchida H., Ehren I., Feraille E., Krook A., and Chibalin A.V. (2004) ERK1/2 Mediates Insulin Stimulation of Na,K-ATPase by Phosphorylation of the a-Subunit in Human Skeletal Muscle Cells J. Biol. Chem. 279(24): 25211-25218.

2. Abbott A.J., Amler E., Ball W.J. (1991) Immunochemical and spectroscopic characterization of two fluorescein 5-isothiocyanate labeling sites on Na+,K(+)-ATPase. Biochemistry 30: 1692-1701.

3. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

4. Andersson T.L., Vinge E. (1988) Effects of ouabain on 86Rb-uptake, 3H-5-HT-uptake and aggregation by 5-HT and ADP in human platelets. Pharmacol Toxicol. 62(3): 172-6.

5. Andersson T.L., Zygmunt P., Vinge E. (1991) Some substances with proposed digitalis-like effects evaluated on platelet functions sensitive for cardiac glycosides. Gen Pharmacol 22(4): 749-53.

6. Antonipillai I., Schick K., Horton R. (1996) Ouabain is a potent inhibitor of aldosterone secretion and angiotensin action in the human adrenal. J. Clin. Endocrinol. Me tab. 81: 23352337.

7. Aperia A., Ibarra F., Svensson L. В., Klee C., and Greengard P. (1992) Calcineurin mediates a-adrenergic stimulation of Na,K-ATPase activity in renal tubule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 7394-7397.

8. Arystarkhova E., Wetzel R.K. (2003) Gamma structural variants differently regulate Na,K-ATPase properties. Л ли. N.Y. Acad. Sci. 986: 416-419.

9. Arystarkhova E., Wetzel R.K., Asinovski N.K., Sweadner K.J. (1999) The у Subunit Modulates Na+ and K+ Affinity of the Renal Na,K-ATPase. J Biol Chem 274(47): 3318333185.

10. Askari A. (2000) in Na,K-ATPase and Related ATPases (Tanigush K. and Kaya S. etc.) Elsevir Science, Amsterdam, 17-26.

11. Assaf A., Hamlyn J.M., and Blaustein M.P. (2000) Ouabain augments Ca2+ -transients in arterial smooth muscle without raising cytosolic Na+. Am J Physiol Heart Circ Physiol 279: H679-H691.

12. Aydemir-Koksoy A., Allen J.C. (2001) Regulation of Na+ pump expression by vascular smooth muscle cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: HI 869-H1874.

13. Azuma K.K., Hensley C.B., Tang M.J., McDonough A.A. (1993) Thyroid hormone specifically regulates skeletal muscle Na(+)-K(+)-ATPase alpha 2- beta 2-isoformes. Am J Physiol 265(3 Pt 1): C680-C687.

14. Balzan S., D'Urso G., Ghione S., Martinelli A., Montali U. (2000) Selective inhibition of human erythrocyte Na+/K+ ATPase by cardiac glycosides and by a mammalian digitalis like factor. Life Sci 67(16): 1921-8.

15. Batrukova M.A., Betin V.L., Rubtsov A.M., Lopina O.D. (2000) Ankyrin: structure, properties, and functions. Biochemistry (Mosc). 65(4): 395-408.

16. Beguin P., Beggah A., Cotecchia S., and Geering K. (1996) Adrenergic, dopaminergic, and muscarinic receptor stimulation leads to PKA phosphorylation of Na,K-ATPase. Am. J. Physiol. 270: C131-C137.

17. Beltowski J, Marciniak A, Wojcicka G, Gorny D. (2003) Nitric oxide decreases renal medullary Na+, K+-ATPase activity through cyclic GMP-protein kinase G dependent mechanism. J Physiol Pharmacol. 54(2): 191-210.

18. Beltowski J., Marciniak A., Wojcicka G. (2004) Leptin decreases renal medullary Na+,K+-ATPase activity through phosphatidylinositol 3-kinase dependent mechanism. Journal of physiology and pharmacology 55(2): 391-407.

19. Belusa R., Aizman O., Andersson R.M., Aperia A. (2002) Changes in Na+-K+-ATPase activity influence cell attachment to fibronectin. Am J Physiol Cell Physiol 282: C302-C309.

20. Bennett D.C., Hughes M.R. (2003) Comparison of renal and salt gland function in three species of wild ducks The Journal of Experimental Biology 206: 3273-3284.

21. Blanco G., Mercer R.W. (1998) Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am J Physiol Renal Physiol 275: F633-F650.

22. Blanco G., Sanchez G., and Mercer R.W. (1998) Differential regulation of Na,K-ATPase isozymes by protein kinases and arachidonic acid. Arch Biochem Biophys 359: 139-150.

23. Blaustein M.P., and Lederer W.J. (1999) Sodium/Calcium Exchange: Its Physiological Implications. Physiol. Rev. 79: 763-854.

24. Borst P., Evers R., Kool M., Wijnholds J. (2000) A Family of Drug Transporters: the Multidrug Resistance-Associated Proteins J Natl Cancer Inst 92(16): 1295-1302.

25. Bortner C.D., Gomez-Angelats M, Cidlowski J.A. (2001) Plasma membrane depolarization without repolarization is an early molecular event in apoptosis mediated by the inactivation of the Na/K-ATPase. J Biol Chem 276:4304- 4314.

26. Bose A., Robida S., Furcinitti P.S., Chawla A., Fogarty K., Corvera S., Czech M.P. (2004) Unconventional Myosin Myolc Promotes Membrane Fusion in a Regulated Exocytic Pathway. Molecular and Cellular Biology 24(12): 5447-5458.

27. Brodie C., Tordai A., Saloga J., Domenico J., Gelfand E.W. (1995) Ouabain induces inhibition of the progression phase in human T-cell proliferation. J Cell Physiol. 165(2):246-53.

28. Bucci C., Thomsen P., Nicoziani P., McCarthy J., and van Deurs B. (2000) Rab 7, a key to lysosomes biogenesis. Mol. Biol. Cell 11:467-480.

29. Bullough D.A., Cecarelli E.A. Verburg J.G., Allison W.S. (1989) Inhibition of the bovine-heart mitochondrial Fl-ATPase by cationic dyes and amphipathic peptides. J. Biol. Chem. 264:9155-9163.

30. Capasso J.M., Rivard C., and Berl T. (2001) The expression of the y subunit of Na-K-ATPase is regulated by osmolality via C-terminal Jun kinase and phosphatidylinositol 3-kinasedependent mechanisms PNAS 98(23): 13414-13419.

31. Capella L.S., Gefe M., Silva E.F., Morales M.M., Affonso-Mitidieri O., Lopes A.G., Rumjanek V.M., Capella M.A. (2001) Reduced glutathione protect cells from ouabain toxicity. Biochim Biophys Acta 1526(3): 293-300.

32. Causier B. (2004) Studying the interactome with the yeast two-hybrid system and mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 23(5): 350-367.

33. Chibalin A.V., Katz A.I., Berggren P.-O., Bertorello A.M. (1997) Receptor-mediated inhibition of renal Na(+)-K(+)-ATPase is associated with endocytosis of its alpha- and beta-subunits. Am. J. Physiol. 273: C1458-C1465.

34. Chibalin A.V., Pedemonte C.H., Katz A.I., Feraille E., Berggren P.O., Bertorello A.M. (1998) Phosphorylation of the catalytic a-subunit constitutes a triggering signal for Na+/K+-ATPase endocytosis. J. Biol Chem. 273: 8814-8819.

35. Chibalin A.V., Zierath J.R., Katz A.I., Berggren P.O., Bertorello A.M. (1998a) PhosphotidyIinpsitol-3-kinase-mediated endocytosis of renal Na+/K+-ATPase a-subunit in response to dopamine. Mol. Biol. Cell 9: 1209-1220.

36. Chopra A.K., Ribardo D.A., Wood T.G., Prusak D.J., Xu X.J., Peterson J.W. (1999) Molecular characterization of cDNA for phospholipase A2-activating protein. Biochim BiophysActa. 1444(1): 125-30.

37. Chopra A.K., Ribardo D.A., Wood T.G., Prusak D.J., Xu X.J., Peterson J.W. (1999) Molecular characterization of cDNA for phospholipase A2-activating protein. Biochim BiophysActa 1444(1): 125-30.

38. Clark M.A., Conway T.M., Shorr R.G.L., Crooke S.T. (1987) Identification and isolation of a mammalian protein which is antigenically and functionally related to the phospholipase A2 stimulatory peptide melittin J. Biol. Chem. 262:4402-4406.

39. Clark M.A., Ozgur L.E., Conway T.M., Dispoto J., Crooke O.T., Bomalaski J.S. (1991) Cloning of a phospholipase A2-activating protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5418-5422.

40. Clausen T. (2003) Na+-K+ Pump Regulation and Skeletal Muscle Contractility. Physiol Rev 83: 1269-1324.

41. Colo wick S.P., Kaplan N.O. (1988) Methods in Enzymology v. 156, pp. 35-36.

42. Comte M., Maulet Y., Cox J.A. (1983) Ca -dependent high-affinity complex formation between calmodulin and melittin. Biochem. J. 209: 269-272.

43. Conner S.D., Schmid S.L. (2003) Regulated portals of entry into the cell. Nature 422: 37-44.

44. Contreras R.G., Shoshani L., Flores-Maldonado C., Lázaro A. and Cereijido M. (1999) Relationship between Na+,K+-ATPase and cell attachment Journal of Cell Science 112, 4223-4232.

45. Corvera S. (2001) Phosphatidylinositol 3-Kinase and the Control of Endosome Dynamics: New Players Defined by Structural Motifs Traffic 2: 859-866.

46. Crambert G., Fuzesi M., Garty H., Karlish S., Geering K. (2002) Phospholemman (FXYD1) associates with Na,K-ATPase and regulates its transport properties. Proc Natl Acad Sci USA 99: 11476-11481.

47. Crambert G., Hasler U., Beggah A.T., Yu Ch., Modyanov N.N., Horisberger J.-D., Lelievre L., Geering K. (2000) Transport and Pharmacological Properties of Nine Different Human Na,K-ATPase Isozymes. J Biol Chem 275(3): 1976-1986.

48. Crambert G., Schaer D., Roy S., Geering K. (2004) New molecular determinants controlling the accessibility of ouabain to its binding site in human Na,K-ATPase alpha isoforms. Mol Pharmacol. 65(2): 335-41.

49. Cuppoletti J. (1990) ,25J. Azidosalicylyl melittin binding domains: evidence from a polypeptide receptor on the gastric (H+-K+)-ATPase. Arch. Biochem. Biophys. 278: 409415.

50. Cuppoletti J., Abbot A.J. (1990) Interaction of melittin with (Na+-K+)-ATPase: evidence for a melittin induced conformational change. Arch. Biochem. Biophys. 283:249-257.

51. Cuppoletti J., Blumental K.M., Malinowska D.H. (1989) Melittin inhibition of the gastric (H+K)ATPase and photoaffinity labeling with 125J. azidosalicylyl melittin. Arch. Biochem. Biophys. 275: 263-270.

52. Cuppoletti J., Chernyak B.V., Huang P., Malinowska D.H. (1992) Structure-function Relationships in the Interaction of Amphipathic Helical Polypeptides with the Gastric H/K ATPase. Annals of the New York Academy of Sciences 671:443-445.

53. Cuppoletti J., Huang P., Kaetzel M.A., Malinowska D.H. (1993) Stimulus-associated protein in gastric parietal cell detected using antimelittin antibody. Am. J. Physiol. 264 (Gastrointest. Liver Physiol. 27): G637-G644.

54. Cuppoletti J., Malinowska D.H. (1992) Interaction of polypeptides with the gastric (H^+K^ATPase: melittin, synthetic analogs, and a potential intracellular regulatory protein Molecular and Cellular Biochemistry 114: 57-63.

55. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP 1 A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron 43(2): 169—175.

56. De Wardener H.E. (2001) The Hypothalamus and Hypertension. Physiological Reviews 81(4): 1599-1658.

57. Diraviyam K., Stahelin R.V., Cho W., Murray D. (2003) Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. J Mol Biol. 328(3):721-36.

58. Dmitrieva R.I., Doris P.A. (2002) Cardiotonic Steroids: Potential Endogenous Sodium Pump Ligands with Diverse Function. Exp Biol Med 227(8): 561-569.

59. Dmitrieva R.I., Doris P.A. (2003) Ouabain is a potent promoter of growth and activator of ERK1/2 in ouabain-resistant rat renal epithelial cells. J Biol Chem. 278(30): 28160-28166.

60. Donnet C., Arystarkhova E., Sweadner K.J. (2001) Thermal Denaturation of the Na,K-ATPase Provides Evidence for a-a Oligomeric Interaction and y Subunit Association with the C-terminal Domain. J Biol Chem 276(10): 7357-7365.

61. Dorn G.W. 2nd, Mochly-Rosen D. (2002) Intracellular transport mechanisms of signal transducers. Annu. Rev. Physiol 64: 407-429.

62. Dostanic I., Lorenz J.N., Schultz J.E.J., Grupp I.L., Neumann J.C., Wani M.A., Lingrel J.B. (2003) The a2 Isoform of Na,K-ATPase Mediates Ouabain-induced Cardiac Inotropy in Mice. J Biol Chem 278(52): 53026-53034.

63. Dubyak, G.R. (2004) Ion homeostasis, channels, and transporters: an update on cellular mechanisms. Adv Physiol Educ 28: 143-154.

64. Dunbar L., Caplan M.J. (2001) Ion Pumps in Polarized Cells: Sorting and Regulation of the Na+,K+- and H+.K^ATPase. J Biol Chem 276(32): 29617-29620.

65. Duran M.-J., Pierre S.V., Carr D.L., Pressley T.A. (2003) Role of the isoform-specific region of the Na,K-ATPase catalytic subunit. Ann. N.Y. Acad. Sei. 986: 258-259.

66. Echevarria-Lima J.; Giestal de Araüjo E.; Leopoldo de Meis; Rumjanek V.M. (2003) Ca Mobilization Induced by Ouabain in Thymocytes Involves Intracellular and Extracellular Ca2+ Pools Hypertension 41:1386.

67. Efendiev R., Bertorello A.M., Pedemonte C.H. (1999) PKC-beta and PKC-zeta mediate opposing effects on proximal tubule Na+,K+-ATPase activity. FEES Lett. 456:45-48.

68. Eklof A.C., Holtback U., Svennilson J., Fienberg A., Greengard P., Aperia A. (2001) Increased blood pressure and loss of anp-induced natriuresis in mice lacking DARPP-32 gene. Clin Exp Hypertens. 23(6): 449-60.

69. Ellis D.Z., Nathanson J.A., Sweadner K.J. (2000) Carbachol inhibits Na+-K+-ATPase activity in choroid plexus via stimulation of the NO/cGMP pathway. Am J Physiol Cell Physiol 279: C1685-C1693.

70. El-Masri M.A., Clark B.J., Qazzaz H.N., Valdes R. Jr. (2002) Human Adrenal Cells in Culture Produce Both Ouabain-like and Dihydroouabain-like Factors. Clinical Chemistry 48(10): 1720-1730.

71. Fedorova O.V., Kolodkin N.I., Agalakova N.I., Lakatta E.G., Bagrov A.Y. (2001) Marinobufagenin, an endogenous alpha-l sodium pump Iigand, in hypertensive Dahl saltsensitive rats. Hypertension 37:462-466.

72. Fedorova O.V., Lakatta E.G., Bagrov A.Y. (2000) Endogenous Na, K pump ligands are differentially regulated during acute NaCl loading of Dahl rats. Circulation 102: 3009-3014.

73. Feraille E., Carranza M. L., Buffin-Meyer B., Rousselot M., Doucet A., and Favre H. (1995) Protein kinase C-dependent stimulation of Na(+)-K(+)-ATPase in rat proximal convoluted tubules. Am. J. Physiol. 268 (5, Pt 1): C1277-C1283.

74. Ferrandi M., Manunta P., Balzan S., Hamlyn J.M., Bianchi G., Ferrari P. (1997) Ouabain-like factor quantification in mammalian tissues and plasma: comparison of two independent assays. Hypertension 30: 886-896.

75. Feschenko M.S. and Sweadner K.J. (1997) Phosphorylation of Na,K-ATPase by protein kinase C at Serl8 occurs in intact cells but does not result in direct inhibition of ATP hydrolysis. J Biol Chem 272(28), pp. 17726-17733.

76. Feschenko M.S., Donnet C., Wetzel R.K., Asinovski N.K., Jones L.R., Sweadner K.J. (2003) Phospholemman, a Single-Span Membrane Protein, Is an Accessory Protein of Na,K-ATPase in Cerebellum and Choroid Plexus The Journal ofNeuroscience 23(6): 2161-2169.

77. Feschenko M.S., Stevenson E., and Sweadner K.J. (2000) Interaction of Protein Kinase C and cAMP-dependent Pathways in the Phosphorylation of the Na,K-ATPase J Biol Chem 275(44), pp. 34693-34700.

78. Garty H., Lindzen M., Fuzesi M., Aizman R., Goldshleger R., Asher C., Karlish S.J.D. (2003) A specific finctional interaction between CHIF and Na,K-ATPase. Role of FXYD proteins in the cellular regulation of the pump. Ann. N.Y. Acad. Sei. 986: 395-400.

79. Geering K., Beguin P., Garty H., Karlish S., Fuzesi M., Horisberge J.-D., Crambert G. (2003) FXYD proteins: new tissue- and isoform-specific regulators of Na,K-ATPase. Ann N Y Acad Sei 986: 388-394.

80. Gentile D.A., Braun E., Skoner D.P. (1996) Modulation of histamine release by sodium, potassium adenosine triphosphatase inhibition. Ann Allergy Asthma Immunol. 77(4): 320-6.

81. Gentile D.A., Brown C., Skoner D.P. (1993) In vitro modulation of platelet sodium, potassium adenosine triphosphatase enzyme activity by antiallergy drugs. J Lab Clin Med. 122(1): 85-91.

82. Gentile D.A., Skoner D.P. (1996) A role for the sodium, potassium adenosine triphosphatase (Na+,K+ ATPase) enzyme in degranulation of rat basophilic leukaemia cells. Clin Exp Allergy 26(12): 1449-60.

83. Gloor S., Antonicek H., Sweadner K.J., Pagliusi S., Frank R., Moos M., Schachner M. (1990) The Adhesion Molecule on Glia (AMOG) Is a Homologue of the 0 Subunit of the Na,K-ATPase. J Cell Biol 110: 165-174.

84. Golemis E. //Protein-protein interactions: a molecular cloning manual (2002). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

85. Gonzalez-Mariscal L., Chavez de Ramirez B., Cereijido M. (1985) Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK). J Membr Biol. 86(2): 113-25.

86. Green H.J., Barr D.J., Fowles J.R., Sandiford S.D., Ouyang J. (2004) Malleability of human skeletal muscle Na+-K+-ATPase pump with short-term training J Appl Physiol 97: 143-148.

87. Haas M., Askari A., Xie Z. (2000) Involvement of Src and epidermal grow factor receptor in the signal transducing function of Na+/K+-ATPase. J. Biol. Cell. 275: 2783227837.

88. Hajnoczky G., Csordas G., Hunyady L., Kalapos M.P., Balla T., Enyedi P., Spat A. (1992) Angiotensin-II inhibits Na+,K+-pump in rat adrenal glomerulosa cells: possible contribution to stimulation of aldosterone production. Endocrinology 130, 1637-1644.

89. Hamlyn J.M., Blaustein M.P., Bova S., Ducharme D.W., Harris D.W., Mandel F., Mathews W.R., Ludens J.H. (1991) Identification and characterization of a ouabain-like compound from human plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6259-6263.

90. Hamlyn J.M., Hamilton B.P., Manunta D. (1996) Endogenous ouabain, sodium-balance and blood pressure: a review and a hypothesis. J Hypertens 14:151-167.

91. Hao M., Maxfield F.R. (2000) Characterization of rapid membrane internalization and recycling. J. Biol. Chem. 275: 15279-15286.

92. Harlow D., Lane D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

93. Heinz M.K., Gray D.A. (2001) Role of plasma ANG II in the excretion of acute sodium load in a bird with salt glands (Anas platyrhynchos). Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol 281: R346-R351.

94. Hinson J.P., Harwood S., Dawnay A.B. (1998) Release of ouabain-like compound (OLC) from the intact perfused rat adrenal gland. Endocr Res 24: 721-4.

95. Huan Y., van Adelsberg J. (1999) Polycystin-1, the PKDlgene product, is in a complex containing E-cadherin and the catenins. J. Clin. Invest. 104: 1459-1468.

96. Huang B.S., Ganten D., Leenen F.H.H. (2001) Responses to Central Na+ and Ouabain Are Attenuated in Transgenic Rats Deficient in Brain Angiotensinogen Hypertension 37part 2.: 683-686.

97. Huang B.S., Leenen F.H.H. (1996b) Blockade of brain "ouabain" prevents sympathoexcitatory and pressor responses to high sodium in SHR. Am J Physiol Heart Circ Physiol 271: H103-H108.

98. Huang B.S., Leenen F.H.H. (1998) Both brain Ang II and "ouabain" contribute to sympathoexcitation and hypertension in Dahl S rats on high salt intake. Hypertension 32: 1028-1033.

99. Huang B.S., Leenen F.H.H. (1999) Brain Renin-Angiotensin System and Ouabain-Induced Sympathetic Hyperactivity and Hypertension in Wistar Rats. Hypertension 34: 107112.

100. Huang B.S., Sancho J., Garcia-Robles R., Leenen F.H.H. (1997) Sympathoexcitatory effect of hypothalamic hypophysary inhibitory factor in rats. Hypertension 29:1291-1295.

101. Huang B.S., Veerasingham S.J., Leenen F.H.H. (1998) Brain "ouabain" ANG II, and sympathoexcitation by chronic central sodium loading in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol 21 A: H1269-H1276.

102. Huang B.S., Wang H., Leenen F.H. (2001) Enhanced sympathoexcitatory and pressor responses to central Na+ in Dahl salt-sensitive vs -resistant rats. Am J Physiol. 281 :H 1881-H1889.

103. Huang L., Kometiani P., Xie Z. (1997) Differential regulation of Na/K-ATPase a-subunit isoform gene expressions in cardiac myocytes by ouabain and other hypertrophic stimuli. J. Mol. Cell. Cardiol. 29: 3157-3167.

104. Huang L., Li H., Xie Z. (1997) Ouabain-induced hypertrophy in cultured cardiac myocytes is accompanied by changes in expression of several late response genes. J. Mol. Cell Cardiol 29: 429-437.

105. Huang P., Malinowska D.H., Clark M., Blumental K., Cupoletti J. (1996) Polypeptide binding to the gastric H/K-ATPase and synthetic fragments representing the binding regions. Biophys. J. 66: A235.

106. Ishida T., Matsuura H., Ishida-Kainouchi M., Ozono R., Watanabe M., Kajiyama G. (1993) Na+-Ca2+ exchange modulates Ca2+ handling of human platelets by altering intracellular Ca2+ store size. J. Hypertens. 11: 1089-1095.

107. Ishii T, Takeyasu K. (1995) The C-terminal 165 amino acids of the plasma membrane Ca(2+)-ATPase confer Ca2+/calmodulin sensitivity on the Na+,K(+)-ATPase alpha-subunit. EMBOJ. 14(l):58-67.

108. Ivanov A.V., Gable M.E., Askari A. (2004) Interaction of SDS with Na/K-ATPase. SDS-solubilized enzyme retains partial structure and function. J Biol Chem 279(28): 2983229840.

109. Jogl G., Shen Y., Gebauer D., Li J., Wiegmann K., Kashkar H., Kronke M., Tong L. (2002) Crystal structure of the BEACH domain reveals an unusual fold and extensive association with a novel PH domain. EMBO J. 21(18):4785-95.

110. Johansen T., Knudsen T., Bertelsen H. (1990) Reversal by EGTA of the enhanced secretory responsiveness of mast cells due to treatment with ouabain. FEBS Lett. 262: 228230.

111. Jorgensen P.L. (1988) Methods Enzymol. 156: 29-43.

112. Juel C., Grunnet L., Holse M., Kenworthy S., Sommer V., WulfTT. (2001). Reversibility of exercise-induced translocation of Na+-K+ pump subunits to the plasma membrane in rat skeletal muscle. Pflugers Archiv 443: 212-217.

113. Juhaszova M. and Blaustein M.P. (1997) Distinct distribution of different Na+ pump a subunit isoforms in plasmalemma: physiological implications. Ann NY Acad Sci 834: 524536.

114. Kaetzel M.A., Dedman J.R. (1987) Affinity purification melittin antibody recognizes the calmodulin binding domain on calmodulin target proteins. J. Biol Chem. 262: 3726-3729.

115. Kang W., Weiss M. (2002) Digoxin Uptake, Receptor Heterogeneity, and Inotropic Response in the Isolated Rat Heart: A Comprehensive Kinetic Model The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 302(2): 577-583.

116. Kawamura A., Guo J., Itagaki Y., Bell Ch., Wang Y., Haupert G.T., Jr., Magil Sh., Gallagher R.T., Berova N., Nakanishi K. (1999) On the structure of endogenous ouabain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6654-6659.

117. Kenworthy A.K. (2001) Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods 24(3): 289-96.

118. Kolla V. and Litwack G. (2000) Transcriptional regulation of the human Na/K ATPase via the human mineralocorticoid receptor. Mol Cell Biochem 204: 35—40.

119. Kolla V., Robertson N.M., and Litwack G. (1999) Identification of a mineralocorticoid/glucocorticoid response element in the human Na/K ATPase alphal gene promoter. Biochem Biophys Res Commun 266: 5-14.

120. Kometiani P., Li J., Gnudi L., Kahn B.B., Askari A., Xie Z. (1998) Multiple signal transduction pathways link Na+/K+-ATPase to growth-related genes in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 273:15249-15256.

121. Komiyama Y., Nishimura N., Nishino N., Okuda K., Munakata M., Kosaka C., Masuda M., Takahashi H. (1998) Purification and characterization of ouabain-binding protein in human plasma. Clin. Exp. Hypertens. 20: 683-690.

122. Koumanov K., Momchilova A., Wolf C. (2003) Bimodal regulatory effect of melittin and phospholipase A2-activating protein on human type II secretory phospholipase A2. Cell Biol Int. 27(10): 871-7.

123. Krick S., Platoshyn O., Sweeney M., Kim H., and Yuan J.X.-J. (2001) Activation of K+ channels induces apoptosis in vascular smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol 280: C970-C979.

124. Kurihara K., Nakanishi N., Ueha T. (2000) Regulation of Na+-K+-ATPase by cAMP-dependent protein kinase anchored on membrane via its anchoring protein. Am J Physiol Cell Physiol 279: C1516-C1527.

125. Kurosawa M., Numazawa S., Tani Y., and Yoshida T. (2000) ERK signaling mediates the induction of inflammatory cytokines by bufalin in human monocytic cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 278: C500-C508.

126. Kurosawa M., Tani Y., Nishimura S., Numazawa S., and Yoshida T. (2001) Distinct PKC isozymes regulate bufalin-induced differentiation and apoptosis in human monocytic cells. Am J Physiol Cell Physiol 280: C459-C464.

127. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

128. Laski ME, Kurtzman NA. (1996) The renal adenosine triphosphatases: functional integration and clinical significance. Miner Electrolyte Metab. 22(5-6): 410-22.

129. Lee W.C., Lee K.H. (2004) Applications of affinity chromatography in proteomics. Anal Biochem. 324(1): 1-10.

130. Lei J., Nowbar S., Mariash C.N., Ingbar D.H. (2003) Thyroid hormone stimulates Na-K-ATPase activity and its plasma membrane insertion in rat alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 285: L762-L772.

131. Lencesova L., O'Neill A., Resneck W.G., Bloch R.G., Blaustein M.P. (2004) Plasma Membrane-Cytoskeleton-Endoplasmic Reticulum Complexes in Neurons and Astrocytes. J Biol Chem 279(4): 2885-2893.

132. Li C., Grosdidier A., Crambert G., Horisberger J.-D., Michielin O., Geering K. (2004) Structural and Functional Interaction Sites between Na,K-ATPase and FXYD Proteins. J Biol Chem 279(37): 38895-38902.

133. Li X., Matsuoka Y., Bennett V. (1998) Adducin Preferentially Recruits Spectrin to the Fast Growing Ends of Actin Filaments in a Complex Requiring the MARCKS-related Domain and a Newly Defined Oligomerization Domain J Biol Chem 273(30): 19329-19338.

134. Lichtstein D., Gati I., Ovadia H. (1993) Digitalis-like compounds in the toad Bufo viridis: interactions with plasma proteins. J Cardiovasc Pharmacol 22: S102-S105.

135. Liu J., Periyasamy S.M., Gunning W., Fedorova O.V., Bagrov A.Y., Malhotra D., Xie Z., Shapiro J.I. (2002) Effects of cardiac glycosides on sodium pump expression and function in LLC-PK1 and MDCK cells. Kidney Int. 62(6): 2118-25.

136. Liu J., Tian J., Haas M., Shapiro J.I., Askari A., Xie Z. (2000) Ouabain interaction with cardiac Na+/K+-ATPase initiates signal cascades independent of changes in intracellular Na+ and Ca2+ concentrations. J. Biol. Chem. 275: 27828-27844.

137. Liu L., Abramowitz J., Askari A., Allen J.C. (2004) Role of caveolae in ouabain-induced proliferation of cultured vascular smooth muscle cells of the synthetic phenotype. Am J Physiol Heart Circ Physiol 287: H2173-H2182.

138. Lopina O.D. (2000) Na,K-ATPase: Structure, Mechanism, and Regulation. Membr. Cell Biol. 13(6): 721-744.

139. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951) J. Biol Chem. 193: 265275.

140. Magyar J.P. and Schachner M. (1990) Genomic structure of the adhesion molecule on glia (AMOG, Na/K-ATPase 02 subunit). Nucleic Acids Research 18(22): 6695.

141. Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004), "CD-Search: protein domain annotations on the fly.", Nucleic Acids Res. 32: W327-331.

142. Marsigliante S., Muscella A., Elia M.G., Greco S., Storelli C. (2003) Angiotensin II ATI receptor stimulates Na+-K+ATPase activity through a pathway involving PKC-£ in rat thyroid cells J Physiol 546.2: 461-470.

143. McGowan M.H., Russell P., Carper D.A., Lichtstein D. (1999) Na+,K+-ATPase Inhibitors Down-Regulate Gene Expression of the Intracellular Signaling Protein 14-3-3 in Rat Lens. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 289(3): 1559-1563.

144. McKee M., Scavone C. and Nathanson J.A. (1994) Nitric Oxide, cGMP, and Hormone Regulation of Active Sodium Transport. Proceedings of the National Academy of Sciences 91: 12056-12060.

145. McKenna M.J., Gissel H., Clausen T. (2003) Effects of electrical stimulation and insulin on Na+-K+-ATPase (3H.ouabain binding) in rat skeletal muscle J Physiol 547(2): 567-580.

146. Menezes J.C., Dichtchekenian V. (2003) Digoxin antibody prevents cerebral hemorrhage-induced hypertension. Am JHypertens. 16(12): 1062-1065.

147. Middleton J.P. (1996) Direct Regulation of the Na,K Pump by Signal Transduction Mechanisms. Miner Electrolyte Metab 22: 293-302.

148. Mobasheri A., Avila J., Cozar-Castellano I., Brownleder M.D., Trevan M., Francis M.J., Lamb. J.F., Martin-Vassallo P. (2000) Biosci. Rep., 20: 51-91.

149. Mohammadi K, Liu L, Tian J, Kometiani P, Xie Z, Askari A. (2003) Positive inotropic effect of ouabain on isolated heart is accompanied by activation of signal pathways that link Na+/K+-ATPase to ERK1/2. J Cardiovasc Pharmacol 41(4): 609-614.

150. Mohammadi K., Kometiani P., Xie Z., Askari A. (2001) Role of protein kinase C in the signal pathways that link Na+/K+-ATPase to ERK^. J. Biol. Chem. 276: 42050-42056.

151. Murata Y., Matsuda T., Tamada K., Hosoi R., Asano S, Takuma K, Tanaka K, Baba A. (1996) Ouabain-induced cell proliferation in cultured rat astrocytes. Jpn J Pharmacol. 1996 Dec;72(4):347-53.

152. Murtazina D.A., Mast N.V., Rubtsov A.M., O.D. Lopina (1997) Mechanism of inhibition of E1-E2 ATPases by melittin. Biochemistry (Moscow) 67: 54-61.

153. Murtazina D.A., Petukhov S.P., Rubtsov A.M., Storey K.B., Lopina O.D. (2001) Phosphorylation of the alpha-subunit of Na,K-ATPase from duck salt glands by cAMP-dependent protein kinase inhibits the enzyme activity. Biochemistry (Mosc). 66(8):865-74.

154. Nelson W.J., Veshnock P.J. (1987) Ankyrin binding to (Na++K+)ATPase and implications for the organization of membrane domains in polarized cells. Nature 328(6130): 533-536.

155. Nishio M., Ruch SW, Kelly JE, Aistrup GL, Sheehan K, Wasserstrom JA. (2004) Ouabain increases sarcoplasmic reticulum calcium release in cardiac myocytes. J Pharmacol ExpTher. 308(3): 1181-90.

156. N06 B., Hagenbuch B., Stieger G., Meier P.J. (1997) Isolation of a multispecific organic anion and cardiac glycoside transporter from rat brain. Proc Natl Acad Sci USA 94: 1034610350.

157. Norby J.G. (1988) Coupled assay of Na,K-ATPase activity. In: Methods in enzymology. Part B: ATP-Driven Pumps and Related Transport: The Na,K-Pump. (Eds. Fleischer S., Flesher B.) Acad. Press. Inc., 116-119.

158. Nunez-Duran H., Fernandez P. (2004) Evidence for an intracellular site of action in the heart for two hydrophobic cardiac steroids. Life Sci. 74(11): 1337-44.

159. The alpha 1-Na/K pump does not mediate the involvement of ouabain in the development of hypertension in rats. Blood Press. 11(1): 56-62.

160. Pagel P., Zatti A., Kimura T., Duffield A., Chauvet V., Rajendran V., Caplan M.J. (2003) Ion Pump-Interacting Proteins: Promising New Partners. Ann. N. Y. Acad. Sci. 986: 360-368.

161. Parhami-Seren B., Haberly R., Margolies M.N., Haupert G.T. (2002) Ouabain-Binding Protein(s) From Human Plasma. Hypertension 40: 220-228.

162. Parker W., Song P.S. (1992) Protein structures in SDS micelle-protein complexes. BiophysJ. 61(5): 1435-9.

163. Peng M., Huang M., Xie Z., Huang W.-H., Askari A. (1996) Partial inhibition of Na+/K+-ATPase by ouabain induces the Ca2+-dependent expressions of early-response genes in cardiac myocytes. J. Biol Chem. 271: 10372-10378.

164. Piepenhagen P.A., Nelson W.J. (1998) Biogenesis of Polarized Cells During Kinney Development in Situ: Roles of E-Cadherin-mediated Cell-Cell Adhesion and Membrane Cytoskeleton Organization. Molecular Biology of the Cell 11: 3161-3177.

165. Pierre S.V., Duran M.-J., Carr D.-L., Pressley T.A. (2002) Structure/function analysis of Na+-K+-ATPase central isoform-specific region: involvement in PKC regulation. Am J Physiol Renal Physiol 283: F1066-F1074.

166. Ragolia L., Cherpalis B., Srinivasan M., Begum N. (1997) Role of Serine/Threonine Protein Phosphatases in Insulin Regulation of Nal/Kl-ATPase Activity in Cultured Rat Skeletal Muscle Cells. J Biol Chem 272(38): 23653-23658.

167. Rajasekaran S.A., Ball W.J. Jr., Bander N.H., Liu H., Pardee J.D., Rajasekaran A.K.1999) Reduced expression of beta-subunit of Na,K-ATPase in human clear-cell renal cell1 >carcinoma J Urol 162(2): 574-80.

168. Rajasekaran S.A., Gopal J., Rajasekaran A.K. (2003) Expression of Na,K-ATPase p-Subunit in Transformed MDCK Cells Increases the Translation of the Na.K-ATPase a-Subunit. Ann. N.Y. Acad. Sci. 986: 652-654.

169. Rajasekaran S.A., Gopal J., Willis D., Espineda C., Twiss J.L., Rajasekaran A.K. (2004) Na,K-ATPase {beta} 1-Subunit Increases the Translation Efficiency of the {alpha} 1-Subunit in MSV-MDCK Cells. Mol Biol Cell. 15(7): 3224-3232.

170. Rajasekaran S.A., Palmer L.G., Moon S.Y., Soler A.P., Apodaca G.L., Harper J.F., Zheng Y., Rajasekaran A.K. (2001a) Na,K-ATPase Activity Is Required for Formation of

171. Tight Junctions, Desmosomes, and Induction of Polarity in Epithelial Cells Molecular Biology of the Cell 12: 3717-3732.

172. Rayson B. M. (1993). Calcium: A mediator of the cellular response to chronic Na+/K+-ATPase inhibition. J. Biol. Chem. 268: 8851-8854.

173. Reuter H., Henderson S.A., Han T., Ross R.S., Goldhaber J.I., Philipson K.D. (2002) The Na+-Ca2+ Exchanger Is Essential for the Action of Cardiac Glycosides. Circulation Research 90: 305-308.

174. Ribardo D.A., Kuhl K.R., Peterson J.W., Chopra A.K. (2002) Role of melittin-like region within phospholipase A(2)-activating protein in biological function. Toxicon. 40(5): 519-26.

175. Rodman J.S., Wandlinger-Ness A. (2000) Rab GTPases coordinate endocytosis. J. Cell Sci. 113: 183-192.

176. Rodriguez-Sargent C., Estape E.S., Fernandez N., Irizarry J.E., Cangiano J.S., Candia O.A. (1996) Altered lens short-circuit current in adult cataract-prone Dahl hypertensive rats. Hypertension 28: 440-443.

177. Rosen H., Glukhman V., Feldmann T., Fridman E, Lichtstein D. (2004) Cardiac Steroids Induce Changes in Recycling of the Plasma Membrane in Human NT2 Cells. Molecular Biology of the Cell 15:1044-1054.

178. Roth M.G. (2004) Phosphoinositides in Constitutive Membrane Traffic Physiol. Rev. 84: 699-730.

179. Samuelov S., Lichtstein D. (1997) Digitalis-like compounds and Na+,K+-ATPase activity in bovine lens. PJlu 'gers Arch. 433: 435-441.

180. Saunders R, Scheiner-Bobis G. (2004) Ouabain stimulates endothelin release and expression in human endothelial cells without inhibiting the sodium pump. Eur J Biochem. 271(5): 1054-62.

181. Schneider R.,Wray V., Nimtz M., Lehmanni W.D., Antolovic U.K.R., Schoner W. (1998) Bovine Adrenals Contain, in Addition to Ouabain, a Second Inhibitor of the Sodium Pump J. Biol. Chem. 273(2): 784-792.

182. Schoner W. (2002) Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones. Eur. J. Biochem. 269: 2440-2448.

183. Schoner W., Bauer N., Muller-Ehmsen J., Kramer U., Hambarchian N., Schwinger R., Moeller H., Kost H., Weitkamp C., Schweitzer T., Kirch U., Neu H., Grunbaum E.-G. (2003) Ouabain as a mammalian Hormone. Ann. N. Y. Acad Sci. 986: 678-684.

184. Serebriiskii IG, Kotova E. (2004) Analysis of protein-protein interactions utilizing dual bait yeast two-hybrid system. Methods Mol Biol. 261: 263-96.

185. Shah J.R., Laredo J., Hamilton B.P., Hamlyn J.M. (1999) Effects of angiotensin II on sodium potassium pumps, endogenous ouabain, and aldosterone in bovine zona glomerulosa cells. Hypertension 33(1 pt 2): 373-377.

186. Shibayama T., Nakaya K., Nakamura Y. (1993) Differential binding activity of erythrocyte ankyrin to the alpha-subunits of Na+,K+-ATPases from rat cerebral and axonal membrane. Cell Struct. Funct. 18(1): 79-85.

187. Shorina E., Mast N., Lopina O., Rubtsov A. (1997) Melittin-induced inhibition and aggregation of Ca-ATPase in skeletal muscle sarcoplasmic reticulum: a comparative study. Biochemistry 36:13455-13460.

188. Slepnev V.I., De Camilli P. (2000) Accessory factors in clathrin-dependent synaptic vesicle endocytosis. Nat. Rev. Neurosci. 1: 161—172.

189. Smith T.F., Gaitatzes Ch., Saxena K., Neer E.J. (1999) The WD repeat: a common architecture for diverse functions TIBS 24:181-185.t

190. Smith T.W. (1988) Methods Enzymol. 156:46-48.

191. Sonnichsen B., De Renzis S., Nielsen E., Reitdorf J., and Zerial M. (2000). Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rabl 1. J. Cell Biol. 149: 901-913.

192. Sophocleous A., Elmatzoglou I., Souvatzoglou A. (2003) Circulating endogenous digitalis-like factor(s) (EDLF) in man is derived from the adrenals and its secretion is ACTH-dependent J Endocrinol Invest. 26(7): 668-74.

193. Sophocleous A., Elmatzoglou I., Souvatzoglou A. (2003) Circulating endogenous digitalis-like factor(s) (EDLF) in man is derived from the adrenals and its secretion is ACTH-dependent. J Endocrinol Invest. 26(7):668-74.

194. Stockand J.D. (2002) New ideas about aldosterone signaling in epithelia. Am J Physiol Renal Physiol 282: F559-F576.

195. Su Y., Balice-Gordon R.J., Hess D.M., Landsman D.S., Minarcik J., Golden J., Hurwitz I., Liebhaber S.A., Cooke N.E. (2004) Neurobeachin is essential for neuromuscular synaptic transmission. JNeurosci. 24(14):3627-36.

196. Sweadner K.J. (1990) Anomalies in the electrophoretic resolution of Na+/K(+)-ATPase catalytic subunit isoforms reveal unusual protein-detergent interactions. Biochim Biophys Acta 1029(1): 13-23.

197. Sweadner K.J., Arystarkhova E., Donnet C., Wetzel R.K. (2003) FXYD proteins as regulators of the Na,K-ATPase in the kidney. Ann. N. Y. Acad. Sci. 986: 382-387.

198. Sweadner K.J., Feschenko M.S. (2001) Predicted location and limited accessibility of protein kinase A phosphorylation site on Na-K-ATPase. Am J Physiol Cell Physiol 280: C1017-C1026.

199. Sweadner K.J., Wetzel R.K., Arystarkhova E. (2000) Genomic organization of the human FXYD2 gene encoding the y subunit of the Na,K-ATPase. Biochem Biophys Res Commiun 29: 196-201.

200. Takeyasu K., Kawase T., Yoshimura S.H. (2003) Intermolecular interaction between Na+/K+-ATPase a subunit and glycogen phosphorylase. Ann N. Y. Acad. Sci. 986: 522-524.

201. Tanigawara Y., Okamura N., Hirai M., Yasuhara M., Ueda K., Kioka N., Komano T., Hori R. (1992) Transport of digoxin by human P-glycoprotein expressed in a porcine kidney epithelial cell line (LLC-PK1). JPharm Exp Ther. 263: 840-845.

202. Tao Q.-F., Hollenberg N.K., Graves S.W. (1999) Sodium Pump Inhibition and Regional Expression of Sodium Pump a-Isoforms in Lens. Hypertension 34: 1168-1174.

203. Thaminy S., Miller J., Stagljar I. (2004) The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods Mol Biol. 261: 297-312.

204. Tian J., Gpng X., Xie Z. (2001) Signal-transducing function of Na+-K+-ATPase is essential for ouabain's effect on Ca2+.i in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 281: HI 899-H1907.

205. Tompa P. (2002) Intrinsically unstructured proteins. Trends Biochem Sci. 27(10):527-33.

206. Treuheit M.J., Costellog C.E., Kirley T.L. (1993) Structures of the Complex Glycans Found on the P-Subunit of (Na,K)-ATPase. J Biol Chem 268(19): 13914-13919.

207. Tricarico D, Montanari L, Conte Camerino D. (2003) Involvement of 3Na+/2K+ ATPase and Pi-3 kinase in the response of skeletal muscle ATP-sensitive K+ channels to insulin. Neuromuscul Disord. 13(9): 712-719.

208. Ueda K., Okamura N., Hirai M., Tanigawara Y., Saeki T., Kioka N., Komano T., Hon R. (1992) Human P-glycoprotein transports Cortisol, aldosterone, and dexamethasone, but not progesterone. J Biol Chem. 267:24248-24252.

209. Uhlen P. (2003) Visualization of Na,K-ATPase Interacting Proteins Using FRET Technique. Ann. N.Y. Acad. Sei. 986: 514-518.

210. Urayama O., Shutt H., Sweadner K.J. (1989) Identification of Three Isozyme Proteins of the Catalytic Subunit of the Na,K-ATPase in Rat Brain. J Biol Chem 264(14): 8271-8280.

211. Valente R.C., Capella L.S., Monteiro R.Q., Rumjanek V.M., Lopes A.G., Capella M.A.M. (2003) Mechanisms of ouabain toxicity. The FASEB Journal 17(12): 1700-1702.

212. Varela M., Herrera M., Garvin J.L. (2004) Inhibition of Na-K-ATPase in thick ascending limbs by NO depends on O2 and is diminished by a high-salt diet. Am J Physiol Renal Physiol 287: F224-F230.

213. Vladimirova N.M., Sautkina E.N., Ovchinnikova T.V., Potapenko N.A. (2002) Interaction between Tubulin and Na+,K+-ATPase in Brain Stem Neurons. Biochemistry (Moscow) 67(4): 503-509.

214. Voss J.C., Birmachu W., Hussey D.M., Thomas D.D. (1991) Effects of melittin onij .molecular dynamics and Ca -ATPase activity in sarcoplasmic reticulum membranes: time-resolved optical anisotropy. Biochemistry 30: 7489-7506.

215. Wang H., Leenen F.H.H. (2002) Brain Sodium Channels Mediate Increases in Brain"Ouabain" and Blood Pressure in Dahl S Rats Hypertension 40: 96-100.

216. Wang J., Velotta J.B., McDonough A.A., and Farley R.A. (2001) All human Na+-K+-ATPase a-subunit isoforms have a similar affinity for cardiac glycosides. Am J Physiol Cell Physiol 1U-. C1336-C1343.

217. Ward D.M., Shiflett S.L., Kaplan J. (2002) Chediak-Higashi syndrome: a clinical and molecular view of a rare lysosomal storage disorder. Curr Mol Med. 2(5): 469-77.

218. Ward S.C., Hamilton B.P., Hamlyn J.M. (2002) Novel Receptors for Ouabain: Studies in Adrenocortical Cells and Membranes Hypertension 39part 2.: 536-542.

219. Watabe M, Masuda Y, Nakajo S, Yoshida T, Kuroiwa Y, and Nakaya K. (1996) The cooperative interaction of two different signaling pathways in response to bufalin induces apoptosis in human leukemia U937 cells. J Biol Chem 271: 14067-14072.

220. Welling P.A., Caplan M., Sutters M., and Giebisch G. (1993) Aldosterone-mediated Na/K-ATPase Expression Is al Isoform Specific in the Renal Cortical Collecting Duct J Biol Chem 268(31): 23469-23476.

221. Wille B. (1989) A preparation of melittin depleted of phospholipase A2 by ion exchange chromatography in denaturating solvents. Anal. Biochem. 178:118-120.

222. Wilson P.D. (2001) Polycystin: new aspects of structure, function, and regulation. J Am Soc Nephrol. 12(4): 834-845.

223. Wright P.E., Dyson H.J. (1999) Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. J Mol Biol. 293(2): 321-31.

224. Xiao A.Y., Wei L., Xia S., Rothman S., and Yu S.P. (2002) Ionic Mechanism of Ouabain-Induced Concurrent Apoptosis and Necrosis in Individual Cultured Cortical Neurons The Journal ofNeuroscience, 22(4): 1350-1362.

225. Xie Z., Askari A. (2002) Na+/K+-ATPase as a signal transducer. Eur. J. Biochem. 269: 2434-2439.

226. Xie Z., Kometiani P., Liu J., Li J., Shapiro J.I., Askari A. (1999) Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na+/K+-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 274: 19323-19328.

227. Yingst D.R., Davis J., Schiebinger R. (2000) Inhibitors of tyrosine phosphatases block angiotensin II inhibition of Na+-pump European Journal of Pharmacology 406: 49-52.

228. Yoshimura S.H., Takeyasu K. (2003) Differential degradation of the Na+/K+-ATPase subnit in the plasma membrane. Ann. N.Y.Acad. Sci. 986: 378-381.

229. Yuan С., Manunta P., Hamlyn J.M., Chen S., Bohen E., Yeun J.E. (1993) Long term ouabain administration produces hypertension in rats. Hypertension 22: 178-187.

230. Yuan W.Q., Lu Z.R., Wang H., Yuan Y.K., Ren H.X. (2000) Effects of endogenous ouabain on the development of hypertension in lklc hypertensive rats. Hypertens Res. 23 Suppl: S61-5.

231. Yudowski G.A., Efendiev R., Pedemonte C.H., Katz A.I., Berggren P.-O., Bertorello A.M. (2000) Phosphoinositide-3 kinase binds to a proline-rich motif in the Na+,K+-ATPase a subunit and regulates its trafficking PNAS 97(12): 6556-6561.

232. Zolotaijova N, Ho C, Mellgren RL, Askari A, Huang WH. (1994) Different sensitivities of native and oxidized forms of Na+/K(+)-ATPase to intracellular proteinases Biochim BiophysActa. 1192(1): 125-31.

233. Буларгина T.B.W Практикум по биохимии: Учеб. пособие/Под ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А.- М.: Изд-во МГУ, 1989.

234. Мает Н.В., кандидатская диссертация, 2000.

235. Сафронова М.И. и др.\\Практикум по биохимии: Учеб. пособие/Под ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А.- М.: Изд-во МГУ, 1989, стр. 81.

236. Чибалин А.В., Лопина О.Д., Петухов С.П., Василец JI.A. (1991) Фосфорилирование Na,K-ATPa3bi протеинкиназой С и цАМФ-зависимой протеинкиназой. Биол. мембраны, 8: 1140-1141.

237. В заключение я хотела бы выразить искреннюю благодарность всем сотрудникам и преподавателям кафедры биохимии за те знания и навыки, которые я получила на годы обучения.

238. Я глубоко благодарна своему научному руководителю Ольге Дмитриевне Лопиной за постоянное внимание и неоценимую помощь в выполнении работы, и особенно за предоставленную мне возможность работать над очень интересной научной проблемой.

239. Я благодарю профессора Александра Михайловича Рубцова за постоянную помощь в постановке экспериментов и критическое обсуждение полученных результатов.

240. Я очень благодарна Наталье Владимировне Мает, Ольге Алексеевне Акимовой и Юлии Владимировне Каманиной за живой интерес к моей работе и помощь в постановке экспериментов.

241. Благодарю всех сотрудников, аспирантов и студентов лаборатории за поддержку и теплое отношение.

242. Хочу выразить сердечную признательность членам моей семьи за понимание и помощь.