Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Попова, Надежда Викторовна

• Попова, Надежда Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Попова, Надежда Викторовна

Оглавление

Введение

Обзор литературы

1.1. 6-белоксопряжённые рецепторы

1.2. Семейство адгезионных рецепторов

1.2.1. Кальций-независимые рецепторы латротоксина СИ*1-

1.3. Эндоцитоз 6-белоксопряжённых рецепторов после связывания слигандом

1.4. Механизм клатрин-опосредованного эндоцитоза

1.5. Основные белки, участвующие в клатрин-опосредованном эндоцитозе

1.5.1. Киназы 6-белоксопряжённых рецепторов и (3-арестины

1.5.2. Клатрин

1.5.3. Адаптерные белковые комплексы АР

1.5.4. Ауксилин

1.5.5. Нбс70

1.6. Другие белки, взаимодействующие с клатрином

1.7. Характеристика белка ТИ1Р8Ь

Экспериментальная часть

2.1. Материалы

2.2. Методы

Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Связывание ТР11Р8Ь с С-концевой частью рецептора СШ1

3.2. Поиск и идентификация белков, взаимодействующих с ТМР8Ь

3.3. Определение в молекуле ТИ1Р8Ь участка, отвечающего за связывание с клатрином

3.4. Влияние мутаций сайтов связывания с клатрином в молекуле ТЯ1Р8Ь на поверхностную экспрессию НСМ1-канала

3.5. Совместная локализация ТШР8Ь с клатрином во внутриклеточных

структурах

3.6. ТШР8Ь напрямую взаимодействует с очищенным клатрином

Выводы

Список литературы

Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b»

Введение

Эндоцитоз является фундаментальным процессом, обеспечивающим поступление в цитоплазму внеклеточных или расположенных на мембране макромолекул. Эндоцитоз необходим для поступления в клетку питательных веществ, регуляции активности трансмембранных рецепторов, а также рециркуляции синаптических пузырьков. Основным механизмом, по которому происходит интернализация липидов, белков и макромолекул, является клатрин-опосредованный эндоцитоз.

Так, для обеспечения цикличности процесса передачи сигнала требуется баланс двух явлений - экзоцитоза и эндоцитоза. Экзоцитоз необходим для выброса нейромедиатора в синаптическую щель. В свою очередь, эндоцитоз требуется как для поддержания постоянства поверхности пресинаптической мембраны и повторного заполнения синаптических пузырьков нейромедиатором, так и для повторной активации рецепторов постсинаптической мембраны. Эндоцитоз синаптических пузырьков после сильной стимуляции нейромышечного синапса происходит по клатрин-зависимому механизму.

При эндоцитозе активированных рецепторов по клатрин-зависимому механизму с рецептором взаимодействуют различные белки-адаптеры, в частности адаптерный комплекс АР-2, которые опосредуют связывание мембранных белков с молекулами клатрина, образующими оболочку пузырька. На настоящий момент известны многие адаптерные белки, принадлежащие к разным классам.

Хотя механизм эндоцитоза в общих чертах известен, постоянно появляются новые данные о регуляции этого процесса, и поиск и изучение новых адаптерных белков, которые могут обеспечивать направленность процесса, является актуальной на сегодняшний день задачей.

Целью настоящей работы являлся поиск и идентификация белков, взаимодействующих с адаптерным белком ТШР8Ь, а также дальнейшая характеристика этого взаимодействия. Первоначальный поиск показал, что мажорным белком, связывающимся с ТВ1Р8Ь, является клатрин, поэтому были сформулированы следующие задачи:

1. Найти в молекуле ТК1Р8Ь структурные детерминаты, отвечающие за связывание с клатрином;

2. Получить очищенные препараты клатрина и ТР1Р8Ь, чтобы подтвердить их прямое взаимодействие;

3. Подтвердить совместную локализацию ТШР8Ь и клатрина с использованием живых клеток.

В результате проведённой работы были найдены и идентифицированы 16 белков и белковых комплексов, взаимодействующих с ТК1Р8Ь, и показано, что клатрин и субъединицы адаптерного комплекса АР-2 являются мажорными белками в элюатах с ТК1Р8Ь-Сефарозы. Проведены эксперименты, подтверждающие, что белок ТШР8Ь напрямую взаимодействует с клатрином. Так, анализ аминокислотной последовательности ТШР8Ь выявил два потенциальных сайта связывания с тяжёлой цепью клатрина, а эксперименты по связыванию очищенного клатрина и мутантов ТШР8Ь, в которых аминокислотные остатки этих сайтов были заменены остатками аланина, подтвердили, что такая замена приводит к нарушению связывания. Также обнаружено, что ТШР8Ь присутствует во фракции выделенных клатрин-покрытых пузырьков. Полученные данные указывают на независимое взаимодействие ТШР8Ь с клатрином и мембранными белками, так как это взаимодействие обеспечивается разными частями молекулы белка. Таким образом, способность ТШР8Ь взаимодействовать как с клатрином, так и с мембранными белками позволяет предполагать, что ТШР8Ь может осуществлять

регуляцию поверхностной экспрессии этих белков за счет модуляции клатрин-опосредованного эндоцитоза.

Полученные в рамках настоящей работы результаты способствуют расширению представлений об участвующих в клатрин-опосредованном эндоцитозе белках-адаптерах, и результаты данной работы могут быть использованы при дальнейшем исследовании механизмов эндоцитоза.

Обзор литературы

1.1. G-белоксопряжённые рецепторы

Суперсемейство G-белоксопряжённых рецепторов (GPCR) является одним из самых

разнообразных белковых семейств (Pierce, Premont et al. 2002). GPCR присутствуют практически во всех эукариотических организмах, включая насекомых (Hill, Fox et al. 2002) и растения (Josefsson 1999). Лигандами GPCR являются ионы, органические одоранты, амины, пептиды, белки, липиды, нуклеотиды и фотоны. Рецепторы этого суперсемейства участвуют в регуляции многих физиологических процессов. Семейство GPCR - наиболее крупная группа белков, которые являются мишенями лекарственных препаратов: приблизительно 30% всех присутствующих на рынке лекарственных средств направлены на GPCR (Hopkins and Groom 2002; Klabunde and Hessler 2002).

Общей структурной особенностью GPCR является наличие семи а-спиральных трансмембранных гидрофобных сегментов, образованных 25-35 аминокислотными остатками (Ovchinnikov Yu 1982). Эти сегменты пронизывают мембрану, образуя компактную эллиптическую структуру. N-концевая часть и три петли между трансмембранными сегментами расположены снаружи клетки, а С-концевая часть и три другие петли обращены в цитоплазму.

Лишь для небольшой доли известных G-белоксопряженных рецепторов доказано их прямое взаимодействие с G-белками. Также имеются данные, что передача сигнала может быть опосредована не только G-белками (Wei, Ahn et al. 2003; Rajagopal, Lefkowitz et al. 2005). Поэтому в последнее время также получил распространение термин семитрансмембранные ("seven-transmembrane") рецепторы.

Существует несколько попыток классифицировать рецепторы внутри семейства GPCR. В настоящее время принята классификация, предложенная Фредриксоном и

коллегами на основании филогенетических критериев (Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003). Согласно этой классификации (акроним GRAFS), большинство GPCR можно отнести к одному из пяти классов: рецепторы группы глутаматного рецептора, группы родопсина, адгезионные рецепторы, так называемые рецепторы Frizzled/Taste2 и рецепторы секретинового семейства.

1.2. Семейство адгезионных рецепторов

Согласно классификации GRAFS к адгезионным рецепторам - второму по

численности классу рецепторов после рецепторов группы родопсина - относят 33 белка (Millar and Newton 2010), для большей части которых лиганд до сих пор неизвестен. Как правило, адгезионные рецепторы имеют протяжённую N-концевую внеклеточную часть, которая обычно сильно гликозилирована (Baud, Chissoe et al. 1995). Анализ аминокислотной последовательности выявил наличие в этой области разнообразных структурных доменов, а именно EGF-подобных доменов, тромбоспондиновых повторов, лейцин-богатых повторов (LRR), лектиновых доменов, иммуноглобулин (^)-подобных доменов, а также кадхериновых повторов. Известно, что в других белках многие из этих доменов вовлечены в белок-белковые взаимодействия и клеточную адгезию. Таким образом, данные рецепторы представляют собой природные гибриды двух классов белков-сигнальных рецепторов и молекул клеточной адгезии (Yona, Lin et al. 2008).

За N-концевым доменом располагается семитрансмембранный домен (7ТМ), а между ними, в непосредственной близости от первого трансмембранного сегмента, находится цистеин-богатый мотив, пол учивший название GPS (G-protein-coupled receptor Proteolysis Site). GPS присутствует во всех адгезионных рецепторах, за исключением GPR123 (Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003). Наличие GPS домена определяет эндогенный протеолитический процессинг рецепторов, который происходит непосредственно после синтеза рецептора в эндоплазматическом ретикулуме (Krasnoperov, Lu et al. 2002;

Volynski, Silva et al. 2004) или ранних отделах Гольджи (Gray, Haino et al. 1996). Процессированный рецептор представляет собой расположенный на клеточной мембране комплекс, состоящий из двух, не связанных ковалентно, субъединиц (Krasnoperov, Bittner et al. 1997).

В семействе адгезионных рецепторов выделяют также подсемейства EGF-содержащих гибридных рецепторов иммунной системы (CD97, EMR1, EMR2, EMR3 и EMR4), рецепторов BAI (BAI-1, BAI-2 и BAI-3), рецепторов flamingo/CELSR (CELSR1, CELSR2 и CELSR3), lgG-подобных рецепторов (GPR116, GPR124, GPR125), а также рецепторов латротоксина CIRL (CIRL1, CIRL2 и CIRL3).

1.2.1. Кальций-независимые рецепторы латротоксина CIRL

Одним из представителей группы адгезионных рецепторов является рецептор CIRL,

также называемый латрофилином (Lph) или лектомедином (Lee) (Sudhof 2001). Семейство

CIRL состоит из трех высокогомологичных белков - CIRL1, CIRL2 и CIRL3. CIRL1 является

высокоаффинным рецептором нейротоксина латротоксина.

Альфа-латротоксин - нейротоксин, содержащийся в яде паука черная вдова.

Латротоксин вызывает массовый выброс различных нейромедиаторов из

пресинаптических окончаний путем стимуляции экзоцитоза синаптических везикул (Gorio,

Rubin et al. 1978; Tzeng, Cohen et al. 1978; Tzeng and Siekevitz 1978; Tzeng and Siekevitz 1979;

Tzeng and Siekevitz 1979; Ceccarelli and Hurlbut 1980). Также латротоксин стимулирует

экзоцитоз в секреторных клетках, таких как хромафинные и панкреатические клетки

(Bittner, Krasnoperov et al. 1998; Lang, Ushkaryov et al. 1998; Bittner and Holz 2000).

CIRL состоит из двух, не связанных ковалентно, субъединиц (Krasnoperov, Bittner et

al. 1997; Lelianova, Davletov et al. 1997). Субъединица pl20 является гидрофильным

внеклеточным белком, а субъединица р85 - интегральный мембранный белок, состоящий

из семи трансмембранных сегментов и внутриклеточной части. Обе субъединицы

рецептора кодируются одним геном, и двухсубъединичная структура СШЬ является результатом эндогенного протеолиза белка-предшественника рецептора (Кгаэпорегоу, Вгйпег е1 а1. 1997; Krasnoperov, 1_и е1 а1. 2002). В составе большой внеклеточной части С1т идентифицированы домены, характерные для белков клеточной адгезии: лектиновый, олфактомединовый и муциновый (рис. 1.1).

01Й

1П

|Ш

1да

те

V V V

( С

с С

ййу

Субъединица р120

Субъединица р85

СИ^Ы С^ЬЗ С\И1-2

«кв. вРЭ |: 1 ЭТР-бОГаТЫЙ домвн

Лектиновый рщкшцма Олфактомединовый

домен домен

0 Ы-концевой домен С^ЬЗ

Рисунок 1.1. Схематическое изображение рецепторов СИЗ!..

С-концевая цитоплазматическая область не содержит никаких определённых доменных структур, за исключением множественных сайтов пальмитоилирования и фосфорилирования, а также нескольких PEST-последовательностей (последовательности, богатые пролином, глутаминовой кислотой, серином и треонином) (Matsushita, Lelianova et al. 1999). Предполагается, что наличие PEST-последовательностей связано со свойством быстрой деградации белков за счёт протеолиза (Rogers, Wells et al. 1986; Roth, Sullivan et al. 1998; Sekhar and Freeman 1998), поэтому содержащие их белки считаются короткоживущими.

CIRL-1 имеет два близких гомолога в геномах млекопитающих: CIRL-2 и CIRL-3. Анализ тканеспецифичного распределения мРНК рецепторов CIRL показал, что CIRL-1 и CIRL-3 находятся преимущественно в головном мозге и других тканях нервной системы, в то время как CIRL-2 обнаруживался практически во всех анализированных тканях (Sugita, Ichtchenko et al. 1998; Ichtchenko, Bittner et al. 1999; Matsushita, Lelianova et al. 1999).

Было показано, что с цитоплазматической частью CIRL-1 из солюбилизатов мозгов крыс соочищаются G-белки, а именно Ga0 (Lelianova, Davletov et al. 1997; Rahman, Ashton et al. 1999) и Gaq/n (Rahman, Ashton et al. 1999). Другими белками, которые взаимодействуют с внутриклеточным С-концевым фрагментом рецепторов CIRL, являются растворимые белки семейства ProSAP/SSTRIP/Shank, принадлежащие к классу мультидоменных скаффолд-белков с PDZ доменами (Kreienkamp, Zitzer et al. 2000; Tobaben, Sudhof et al. 2000; Kreienkamp, Soltau et al. 2002). Считается, что белки этого класса играют ключевую роль в образовании мультимолекулярных комплексов мембранных и цитоскелетных белков в синапсах. Их взаимодействие с CIRL, по всей видимости, определяет расположение рецепторов в зонах экзоцитоза.

Возможно, что CIRL-2 играет роль в развитии злокачественных опухолей молочной железы. Было показано, что его ген находится в районе частой потери гетерозиготности

хромосомы 1р31.1. Анализ различных клеточных линий опухолей молочной железы показал, что уровень рецептора в них сильно различается: повышен в одних, уменьшен или отсутствует в других (White, Varley et al. 1998). Также были получены данные об участии CIRL-2 в процессе миграции эндотелиальных клеток при формировании сердца (Doyle, Scholz et al. 2006).

Было также высказано предположение, что рецепторы CIRL участвуют в нейродегенерации. Анализ влияния ишемического инсульта на нейроны гиппокампа показал, что нейроны слоя CAI увеличивают экспрессию CIRL, в то время как в слое САЗ уровень экспрессии снижается (Bin Sun, Rúan et al. 2002). Остается непонятным, являются ли данные эффекты непосредственным следствием ишемии или отражают общие некротические и апоптотические процессы в поврежденных нейронах.

Кроме того, было продемонстрировано, что у мышей с отсутствием CIRL-1 снижена забота о потомстве, что приводило к повышенной смертности потомства, хотя по внешним признакам мутантные мыши не отличались от мышей дикого типа (Tobaben, Sudhof et al. 2002). Данный результат позволяет предположить, что нокаут гена CIRL-1 не вызывает существенных нарушений функции мозга, но имеет некоторые поведенческие последствия.

В 2010 г. впервые была показана связь между рецепторами CIRL и СДВГ (синдром дефицита внимания и гиперактивности) (Arcos-Burgos, Jain et al. 2010). СДВГ - наиболее распространённое расстройство поведения у детей, которое встречается у 8-12% детей по всему миру (Biederman and Faraone 2005). Экспрессия CIRL-3 в областях мозга, наиболее затрагиваемых при СДВГ, - миндалине, хвостатом ядре полосатого тела, гиппокампе, коре головного мозга и клетках Пуркинье мозжечка (Krain and Castellanos 2006; Arcos-Burgos, Jain et al. 2010) - подтверждает предложенную роль рецептора.

Таким образом, появляются данные, позволяющие связать рецепторы CIRL с физиологией мозга. И хотя точная функция этих рецепторов до сих пор неизвестна, их участие в экзоцитозе нейромедиаторов, профиль экспрессии, а также уникальные структурные свойства выступают в поддержку гипотезы об участии данных белков в межнейронной коммуникации (Martinez, Muenke et al. 2011).

1.3. Эндоцитоз G-белоксопряжённых рецепторов после связывания с л и га н дом

При связывании лиганда с рецептором и его активации образуется комплекс с G-белками, происходит обмен связанного ГДФ на ГТФ и диссоциация G-белков на а субъединицу, связанную с ГТФ, и комплекс из ß и у субъединиц. В настоящее время доказано, что как а субъединица, так и комплекс ßy служат передатчиками сигналов, активируя или ингибируя ферменты и ионные каналы (Clapham and Neer 1993). После взаимодействия с эффектором происходит гидролиз связанного ГТФ и воссоединение а субъединицы с ßy в трех-субъединичный комплекс со связанным ГДФ, способный вновь взаимодействовать с активированными рецепторами (Oldham and Hamm 2008).

Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационным изменениям, которые дают начало не только опосредованной G-белками передаче сигнала, но также превращают рецептор в субстрат для GRK (киназы G-белоксопряжённых рецепторов). В результате активированный лигандом рецептор фосфорилируется по остаткам серина или треонина, расположенным в цитоплазматической части и/или в третьей цитоплазматической петле. Затем с активированным лигандом, фосфорилированным киназами рецептором связываются ß-арестины (Shenoy and Lefkowitz 2003).

ß-Арестины играют существенную роль в процессе интернализации GPCR, так как это связывание приводит к клатрин-зависимому эндоцитозу рецептора за счёт их

взаимодействия с компонентами эндоцитозного механизма - клатрином и адаптерным белком АР-2 (Goodman, Krupnick et al. 1996; Laporte, Oakley et al. 1999).

Далее клатрин-покрытые пузырьки (CCV), содержащие рецептор, отсоединяются от цитоплазматической мембраны за счет работы белка динамина (Doherty and McMahon 2009). Интернализованный комплекс рецептора с лигандом двигается далее по пути эндоцитоза. Первой стадией на этом пути являются ранние эндосомы. Считается, что каноническими ранними эндосомами являются структуры, содержащие белки Rab5 и ЕЕА1 (антиген ранних эндосом). Во многих случаях интернализованный рецептор всё ещё может быть доступен для молекул дальнейшего сигнального каскада и, следовательно, Агонист

/

Рисунок 1.2. Схема трафика рецептора после активации.

может передавать сигнал так же, как и в случае локализации на мембране (Calebiro, Nikolaev et al. 2010). Далее возможен один из двух вариантов. Рецептор или отделяется от лиганда и повторно направляется к поверхности клетки или переходит в поздние эндосомы и подвергается деградации в лизосомах (рис. 1.2).

Возврат на цитоплазматическую мембрану может происходить по быстрому маршруту через КаЬ4-содержащие эндосомы или медленно через Rabll-содержэщие циркулирующие эндосомы (Stenmark 2009).

Принято считать, что в поздние эндосомы попадают рецепторы, предназначенные для деградации. Переход от ранних эндосом к поздним сопровождается заменой белка Rab5 белком Rab7-TaK называемая «Rab-конверсия» (Poteryaev, Datta et al. 2010).

1.4. Механизм клатрин-опосредованного эндоцитоза

Клатрин-покрытый пузырёк является трёхслойной структурой, где внешний слой

образован клатрином, внутренний - это липидная мембрана, а между ними находятся адаптерные белки. Адаптерные белковые комплексы напрямую взаимодействуют с липидным бислоем, а клатрин, в свою очередь, связывается с адаптерами (Young 2007).

Предполагается, что эндоцитоз начинается с образования на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны покрытых ямок, содержащих клатрин, АР-2 и вспомогательные белки (Ehrlich, Boll et al. 2004). Субъединицы адаптерного комплекса локализуют образование клатриновой решётки в определённых сайтах цитоплазматической мембраны и опосредуют взаимодействие клатрина с белком, предназначенным для эндоцитоза (Ohno, Stewart et al. 1995). АР-2 играет важную роль в выборе мишени для эндоцитоза, связываясь непосредственно с трансмембранным белком, содержащим необходимые последовательности, или опосредованно через вспомогательные белки, такие как ß-арестины (Edeling, Mishra et al. 2006). Связывание AP-2 с мембраной является двухступенчатым процессом. Сначала а-субъединица слабо

связывается с фосфатидилинозитол-4,5-дифосфатом (Ptdlns(4,5)P2). Аффинность АР-2 к соответствующим эндоцитозным мотивам увеличивается при фосфорилировании остатка треонина в его ц2-субъединице (Honing, Ricotta et al. 2005) адаптор-ассоциированной киназой 1 (Lauritsen, Menne et al. 2000; Ricotta, Conner et al. 2002). Такое фосфорилирование позволяет ц2-субъединице связаться с мотивами «груза» и Ptdlns(4,5)P2 мембраны, создавая основу для формирования клатрин-покрытого пузырька. Далее с адаптерным комплексом могут связаться другие вспомогательные белки, например CALM, который необходим для образования правильной клатриновой решётки (Meyerholz, Hinrichsen et al. 2005). Одновременно с полимеризацией клатрина в процесс вовлекается множество других белков, требуемых для контроля впячивания цитоплазматической мембраны в процессе образования ямки. Считается, что этот процесс обеспечивают белки, содержащие BAR-домены (Bin/amphiphysin/Rvs) (Blood and Voth 2006), такие как амфифизин (Takei, Slepnev et al. 1999) и эндофилин (Farsad, Ringstad et al. 2001).

Дальнейшая деформация мембраны и полимеризация клатрина приводит к тому, что покрытый пузырёк остаётся связанным с основной частью мембраны через узкий перешеек, и для полного отсоединения пузырька необходима ГТФаза динамин. Амфифизин, уже находящийся в составе пузырька, имеет сайты связывания как с клатрином, так и с динамином. Предполагается, что они «привлекает» к формирующемуся пузырьку динамин и облегчает его олигомеризацию (Yoshida, Kinuta et al. 2004). Динамин связывается своим плекстрин-гомологичным доменом с мембраной, олигомеризуется, стягивая перешеек, и вызывает отделение пузырька от остальной мембраны (Sever, Damke et al. 2000).

Удаление клатриновой оболочки с поверхности пузырька необходимо для дальнейшего слияния пузырька с целевой мембраной и доставки эндоцитированного

«груза» к месту назначения. Основными белками, участвующими в этом процессе, являются Hsc70 и ауксилин. Ауксилин, гомолог Hsp40, связывает клатрин и притягивает Hsc70, который взаимодействует с его J-доменом. В результате взаимодействия с ауксилином возрастает АТФазная активность Hsc70, он сильнее связывается с клатрином, искажая конформацию и способствуя разборке решётки на отдельные молекулы (Ungewickell, Ungewickell et al. 1995; Barouch, Prasad et al. 1997). Слой, образованный адаптерным комплексом, возможно, удаляется за счёт дефосфорилирования АР фосфатазами, как это было показано для |л1-субъединицы АР-1 (Ghosh and Kornfeld 2003). Белки синаптоянин и эндофилин могут дефосфорилировать фосфолипиды мембраны, таким образом уменьшая сродство адапторов к пузырькам (Verstreken, Koh et al. 2003).

1.5. Основные белки, участвующие в клатрин-опосредованном эндоцитозе

1.5.1. Киназы G-белоксопряжённых рецепторов и ß-арестины

Хотя описано большое количество белков, способных напрямую

взаимодействовать с G-белоксопряжёнными рецепторами (например, обзор (Bockaert, Fagni et al. 2004)), кроме G-белков известны только два класса белков, специфично взаимодействующих с активированными лигандом рецепторами: киназы G-белоксопряжённых рецепторов (GRK) и ß-арестины (Lefkowitz and Shenoy 2005).

Семейство GRK включает 7 различных генов. Экспрессия GRK1 и -7 ограничена палочками и колбочками сетчатки, соответственно, GRK4 экспрессируется только в мозжечке, семенниках и почках. GRK2, -3, -5 и -6, напротив, имеют широких профиль экспрессии в тканях млекопитающих. На основании гомологии аминокислотных последовательностей семь киназ подразделяют на 3 подсемейства: GRK1 и -7; GRK2 и -3, которые содержат плекстрин-гомологичный домен и локализация которых на клеточной мембране зависит от взаимодействия с Gßy-субъединицей G-белков и

фосфатидилинозитол-4,5-бифосфатом; и GRK4, -5 и -6, которые постоянно ассоциированы с мембраной (Pitcher, Freedman et al. 1998).

К арестинам относят четыре белка. Арестин 1 и арестин 4 (х-арестин) экспрессируются в палочках и колбочках сетчатки, соответственно. Арестин 2 и арестин 3 (также известные как Р-аррестин 1 и (3-аррестин 2) экспрессируются во всех тканях (Shenoy and Lefkowitz 2003). GRK и арестины управляют активностью GPCR на трёх уровнях: (1) сайленсинг: функциональное отсоединение рецептора от его G-белка; (2) трафик: удаление рецептора с цитоплазматической мембраны (интернализация), повторное возвращение на мембрану («ресенситизация») и/или деградация; и (3) сигналирование: активация или ингибирование внутриклеточных сигнальных путей независимо от G-белков. N-концевая часть арестина 1 (Gurevich and Benovic 1993), а также арестинов 2 и 3 (Gurevich, Richardson et al. 1993; Gurevich, Dion et al. 1995) содержит области, отвечающие за узнавание активированных агонистами фосфорилированных G-белоксопряжённых рецепторов. Далее, согласно предложенной модели (Gurevich and Gurevich 2006), заряженные фосфатные группы рецептора разрушают полярное ядро арестина, что в результате приводит к высвобождению С-концевой части молекулы, которая отвечает за связывание с эндозитозными белками - клатрином и АР-2.

1.5.2. Клатрин

Клатрином был назван мажорный белок из выделенных Пирс и соавторами окаймлённых пузырьков в связи со сходством их структуры с упорядоченной сеткой или «клатратами» (Pearse 1975). Молекула клатрина напоминает трискелион и состоит из трёх тяжёлых и трёх лёгких цепей (Fotin, Cheng et al. 2004) (рис. 1.3).

Терминальный домен

Рисунок 1.3. Молекула клатрина (трискелион).

Обозначены сегменты тяжёлой цепи клатрина. N-концевым доменом является терминальный домен, а С-концевые домены располагаются в центре молекулы. Положение лёгких цепей указано схематично. Рисунок из Fotin, А. et al., Nature, 2004.

Тяжёлая цепь клатрина, выделенного из мозга крысы, состоит из 1675

аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 191569 Да (при проведении SDS-

гель электрофореза в ПААГ приблизительно 180 кДа). Последовательности тяжёлой цепи

клатрина из мозга человека, крысы и быка высококонсервативны (~99%) (Keen 1990).

Тяжёлые цепи клатрина также были также выделены из окаймлённых пузырьков у

дрожжей (Mueller and Branton 1984) и растений (Wiedenhoeft, Schmidt et al. 1988).

Каждая тяжёлая цепь клатрина находится в комплексе с одной из лёгких цепей: LCa

или LCb, кодируемых разными генами. Подвижность на SDS-гель электрофорезе в ПААГ

лёгких цепей, состоящих из 230-250 аминокислотных остатков, соответствует

приблизительно 30-40 кДа. В лёгкой цепи выделяют консервативный С-концевой домен,

центральный а-спиральный домен и кислый N-концевой домен. Аминокислотные

последовательности обеих цепей имеют примерно 60%-ю гомологию (Keen 1990). Между видами последовательности лёгких цепей довольно консервативны (95-98%). Консервативными областями являются последовательность из 22 аминокислотных остатков, расположенная в N-конце молекулы, сайт связывания с тяжёлой цепью клатрина, остатки цистеина вблизи С-концевой части и только в лёгкой цепи LCb серин-богатый сайт фосфорилирования казеинкиназой II (Jackson and Parham 1988). Лёгкие цепи связываются с проксимальными доменами тяжёлых цепей клатрина (Ungewickell 1983), основное связывание обеспечивается 1267-1522 аминокислотными остатками тяжёлой цепи и 93-160 лёгкой цепи LCa и 90-157 лёгкой цепи LCb (Chen, Reese et al. 2002).

Центр пересечения тяжёлых цепей клатрина содержит области, необходимые для тримеризации тяжёлых цепей, связывания лёгких цепей, а также образования клатриновой сетки (Blank and Brodsky 1986; Blank and Brodsky 1987). Домен, обеспечивающий тримеризацию тяжёлых цепей, находится между 1488 и 1587 аминокислотными остатками.

Сайты связывания клатрина с адаптерными белками находятся в N-терминальном домене. С первым сайтом связывания взаимодействуют пептиды, содержащие «клатрин-бокс» мотив (L0X0[D/E], где 0 - крупная гидрофобная аминокислота). Известными примерами белков, содержащих такой мотив, являются ß-адаптины (последовательности LLNLD находятся в ß-адаптинах 1 и 2, сайт LLDLD - в ß-адаптине 3), ß-арестины 1 (HELD) и 2 (LIEFE) и амфифизины 1 и 2 (LLDLD) (ter Haar, Harrison et al. 2000). Co вторым сайтом связываются пептиды, содержащие W-бокс мотив (PWXXW, где X - любая аминокислота), например содержащиеся в молекулах уже упоминавшихся амфифизина 1 и 2 (Ramjaun and McPherson 1998).

Рисунок 1.4. Модель гексагонального клатринового пузырька (разрешение 7,9А).

Указаны только тяжёлые цепи клатрина. Рисунок из Fotin, A. etal., Nature, 2004.

В слабокислых, Са2+-содержащих буферах с низкой ионной силой молекулы клатрина спонтанно самоорганизуются, образуя гетерогенную популяцию замкнутых многогранных структур, напоминающих решётку (Crowther, Finch et al. 1976; Kartenbeck 1978). Вершина каждого трискелиона располагается в вершине решётки. «Ноги» тяжёлых цепей и связанные с ними лёгкие цепи отходят наружу от вершины, образуя рёбра решётки (рис. 1.4). Все тяжелые цепи образуют два смежных ребра многогранной решетки. «Ноги», по всей видимости, взаимодействуют через проксимальные и дистальные домены, каждое ребро состоит из двух антипараллельных проксимальных доменов, под которыми лежат два антипараллельных дистальных домена (Wakeham, Chen et al. 2003). Фрагменты клатрина, полученные искусственной экспрессией и состоящие из проксимального домена и участка, необходимого для тримеризации,

способны самостоятельно формировать тримеры, но не могут образовывать решётки. Для образования клатриновой решётки необходимы дистальные домены, правильно ориентируемые за счёт связывания терминальных доменов с адаптерными белками (Greene, Liu et al. 2000). В образованной решётке терминальные домены выступают внутрь по направлению к центру и находятся под вершиной, расположенной на расстоянии двух вершин от центра трискелиона. То есть, терминальные домены здесь принимают вид крюков-выступов, обеспечивающих точки контакта с внутренним слоем, образованным адаптерными белками (Smith, Grigorieff et al. 1998).

1.5.3. Адаптерные белковые комплексы АР

Вторым мажорным белком клатрин-покрытых пузырьков является адаптерный

белковый комплекс. Он был открыт благодаря своей способности стимулировать сборку клатриновой решётки в физиологических условиях (Keen, Willingham et al. 1979). Хорошо изучены как минимум два адаптерных комплекса - АР-1 и АР-2. Они являются структурно похожими, состоят из двух отличающихся высокомолекулярных субъединиц массой ~100кДа (обычно их называют адаптинами), двух субъединиц среднего размера (4750 кДа) и двух низкомолекулярных субъединиц (17-19 кДа). В комплекс АР-2 входят следующие субъединицы: а и ß2 (или ß) адаптины, 50-кДа субъединица |а,2 или АР50 и 17-кДа субъединица а2 или АР17. Аналогично, комплекс АР-1 содержит у и ßl (или ß') адаптины, АР47 (или ц1) и АР19 (или al) (Schmid 1997).

Одинаковые буквы греческого алфавита отражают структурное и, предположительно, функциональное сходство субъединиц комплексов АР-1 и АР-2 (Gallusser and Kirchhausen 1993; Stepp, Pellicena-Palle et al. 1995). а- и у-адаптины наиболее различаются (~30% гомология аминокислотной последовательности), в то время как ц- и с-субъединицы комплекса АР-1 в значительной степени (~50%) гомологичны

соответствующим (л- и о-субъединицам комплекса АР-2, а (31 и р2-адаптины высокогомологичны (>90%). Немного позднее были открыты комплексы АР-3 и АР-4, которые имеют похожий состав субъединиц: 5 и рз, |дЗ, аЗ в АР-3 комплексе и б и Р4, ц4, а4 в АР4 комплексе (Simpson, Peden et al. 1997; Dell'Angelica, Mullins et al. 1999).

Комплекс субъединиц образует структуру, напоминающую голову Микки Мауса (рис. 1.5), где центр образован субъединицами ц и б, а два «уха» состоят из С-концевых доменов двух больших субъединиц а и Р, соединённых с «головой» гибким перешейком (Robinson and Bonifacino 2001).

áftlУхо

7 P1

©Q

Голова

P

а P2

©0

AP1

AP2

P

0

AP3

AP4

Рисунок 1.5. Схематическое изображение АР комплексов.

Все комплексы состоят из двух больших субъединиц, одной средней и одной малой субъединицы. Рисунок из Robinson and Bonifacio, Curr. Opin. Cell Biol., 2001.

Хотя сборка клатриновой решётки происходит на цитоплазматической мембране, давно известно, что сам клатрин не имеет сродства ни к каким компонентам мембраны. Поэтому считается, что привлечение клатрина к мембране обеспечивается другими белками (Aridor and Traub 2002; Wilbur, Hwang et al. 2005).

Во многих работах было найдено, что АР-2 является основным белковым адаптером на цитоплазматической мембране, участвующим в образовании клатрин-покрытых пузырьков при эндоцитозе. Использование иммуноэлектронной и иммунофлуоресцентной микроскопии показало, что АР-1, -3 и -4 локализуются в эндосомах и комплексе Гольджи (Peden, Oorschot et al. 2004). АР-1 опосредует транспорт белков из комплекса Гольджи в ранние или поздние эндосомы.

АР-1 и АР-2 напрямую взаимодействуют с N-концевым доменом тяжёлой цепи за счёт сайта связывания с клатрином, который находится в р-цепи. В 1998 году с помощью криоэлектронной микроскопии было получено представление о структуре комплекса АР-2 с клатрином (Smith, Grigorieff et al. 1998). АР-2 образует оболочку непрерывной плотности в центре решётки. Эта непрерывность даёт возможность говорить о его плотной упаковке внутри решётки. На основании полученных изображений также был сделан вывод о том, что АР-2 образует контакты с терминальными доменами клатриновой решётки. И действительно, в 2000 году рентгеноструктурным анализом было подтверждено, что (3-субъединицы АР-1, АР-2 и АР-3, содержащие клатрин-связывающий мотив, взаимодействуют с терминальным доменом тяжёлой цепи клатрина (ter Haar, Harrison et al. 2000).

Кроме взаимодействия с клатрином, комплексы АР взаимодействуют с интегральными мембранными белками. Сигнал YXX0, расположенный во внутриклеточных доменах многих рецепторов, узнаётся ц-субъединицей всех АР-комплексов (Bonifacino and Traub 2003). С последовательностями [DE]XXXL[LI], также

находящимися в цитоплазматическом домене рецепторов, связываются ß-субъединицы AP-комплексов, причём наблюдается разное их сродство к разным последовательностям [DE]XXXL[LI]. Например, АР-1 и АР-2, но не АР-3, взаимодействуют с сайтами DDQRDLI и NEQLPML (Hofmann, Honing et al. 1999). А с сигналами DERAPLI и EEKQPLL взаимодействует АР-3, но не АР-1 и АР-2 (Honing, Sandoval et al. 1998).

Также адаптерные белковые комплексы способны взаимодействовать с липидами клеточной мембраны. Хорошо описаны связывающие липиды домены, содержащиеся в а- и ц2-субъединицах АР-2 (Maldonado-Baez and Wendland 2006).

1.5.4. Ауксилин

Ауксилин - многодоменный белок массой 100 кДа, содержащий клатрин-связывающий домен, J-домен и область, имеющую гомологию с фосфоинозитидфосфатазой PTEN (рис. 1.6) (Ahle and Ungewickell 1990; Ungewickell, Ungewickell et al. 1997). N-концевой домен связывается с производными фосфоинозитола и фосфатидилинозинол-(4,5)-дифосфатом (PIP2) (Lee, Wu et al. 2006) (Massol, Boll et al. 2006). Центральный домен ауксилина взаимодействует с клатрином, комплексом АР-2 (Scheele, Kalthoffet al. 2001) и динамином (Newmyer, Christensen et al. 2003).

Криоэлектронной микроскопией с разрешением 20 Ä было получено изображение

полноразмерного ауксилина, связанного с клатриновой решёткой (Smith, Dafforn et al.

2004). Ауксилин формирует оболочку плотности внутри решётки с точками

соприкосновения с терминальными доменами клатрина. Ауксилин способен

взаимодействовать с терминальным доменом тяжёлой цепи клатрина посредством

мотива (LLGLE), включающего 496-500 аминокислотные остатки. В 2004 году были

опубликованы результаты криоэлектронной микроскопии с разрешением 20 Ä комплекса

функционального фрагмента ауксилина (549-910) с клатриновой решёткой (Fotin, Cheng et

al. 2004). Оказалось, что фрагмент ауксилина, содержащий J-домен и клатрин-

связывающий домен, контактирует с двумя «лодыжками» тяжёлой цепи клатрина в точке их пересечения и с дальнейшим терминальным доменом. То есть, ауксилин связывается с областью, обеспечивающей стабильность решётки. Расположение J-домена ауксилина является таковым, что мотив, необходимый для взаимодействия с белком Hsc70, экспонирован наружу от решётки. Связывание ауксилина с клатриновой решёткой приводит к тому, что терминальные домены выворачиваются наружу вследствие изменения положения «лодыжки». Это изменение положения терминальных доменов вызывает глобальные изменения во всей решётке, увеличивая её диаметр. Считается, что к этим областям, важным для взаимодействия внутри решётки, ауксилин привлекает Hsc70, где Hsc70, как предполагается, может связываться с последовательностью QLMLT, расположенной в С-концевой части клатрина (Smith, Grigorieff et al. 1998; Fotin, Cheng et al. 2004).

Ауксилин 1

Липид- Кпатрин- Hsc70-

связывающий связывающий связывающий

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Попова, Надежда Викторовна

Выводы

1. Методом аффинной хроматографии на ТР1Р8Ь-Сефарозе проведён поиск и последующая идентификация белков из препаратов растворимых и мембранных белков мозга крысы, способных взаимодействовать с ТК1Р8Ь. Обнаружено образование комплексов белка ТК1Р8Ь с клатрином.

2. Получен препарат очищенного клатрина. Показано, что взаимодействие ТВ1Р8Ь с клатрином является непосредственным.

3. Локализованы участки, определяющие взаимодействие ТЮР8Ь с клатрином, которые находятся в 1\1-концевой части ТК1Р8Ь. Показано, что замена аминокислотных остатков в сайтах связывания приводит к нарушению взаимодействия ТШР8Ь с клатрином.

4. Было показано, что при экспрессии в клетках эукариот, когда ТШР8Ь вызывает перемещение НС1\11 канала с клеточной мембраны в крупные внутриклеточные структуры, в них также находятся ТР1Р8Ь и клатрин. С помощью внутриклеточных маркеров было установлено, что эти структуры являются лизосомами. Также было найдено, что мутации сайтов связывания с клатрином в молекуле ТШР8Ь не блокируют эндоцитоз НС1М1, но приводят к исчезновению в этих структурах клатрина.

5. Полученные данные указывают на независимое взаимодействие ТШР8Ь с клатрином и мембранными белками НС1М1 или ОРЯ, так как это взаимодействие обеспечивается разными частями молекулы белка: с мембранными белками ТШР8Ь взаимодействует ТРВ-содержащей С-концевой частью, а с клатрином - с помощью двух сайтов, расположенных в Ы-конце молекулы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Попова, Надежда Викторовна, 2012 год

Список литературы

1. Aguilar, R. С., Н. A. Watson, et al. (2003). "The yeast Epsin Entl is recruited to membranes through multiple independent interactions." J Biol Chem 278(12): 10737-10743.

2. Ahle, S. and E. Ungewickell (1990). "Auxilin, a newly identified clathrin-associated protein in coated vesicles from bovine brain." J Cell Biol 111(1): 19-29.

3. Amery, L., H. Sano, et al. (2001). "Identification of PEX5p-related novel peroxisome-targeting signal 1 (PTSl)-binding proteins in mammals." Biochem J 357(Pt 3): 635-646.

4. Arcos-Burgos, M., M. Jain, et al. (2010). "A common variant of the latrophilin 3 gene, LPHN3, confers susceptibility to ADHD and predicts effectiveness of stimulant medication." Mol Psychiatry 15(11): 1053-1066.

5. Aridor, M. and L. M. Traub (2002). "Cargo selection in vesicular transport: the making and breaking of a coat." Traffic 3(8): 537-546.

6. Aronheim, A., E. Zandi, et al. (1997). "Isolation of an AP-1 repressor by a novel method for detecting protein-protein interactions." Mol Cell Biol 17(6): 3094-3102.

7. Barouch, W., K. Prasad, et al. (1997). "Auxilin-induced interaction of the molecular chaperone Hsc70 with clathrin baskets." Biochemistry (Mosc) 36(14): 4303-4308.

8. Barouch, W., K. Prasad, et al. (1994). "ATPase activity associated with the uncoating of clathrin baskets by Hsp70." J Biol Chem 269(46): 28563-28568.

9. Baud, V., S. L. Chissoe, et al. (1995). "EMR1, an unusual member in the family of hormone receptors with seven transmembrane segments." Genomics 26(2): 334-344.

10. Biederman, J. and S. V. Faraone (2005). "Attention-deficit hyperactivity disorder." Lancet 366(9481): 237-248.

11. Bin Sun, H., Y. Ruan, et al. (2002). "Involvement of the calcium-independent receptor for alpha-latrotoxin in brain ischemia." Brain Res Mol Brain Res 104(2): 246-249.

12. Bittner, M. A. and R. W. Holz (2000). "Latrotoxin stimulates secretion in permeabilized cells by regulating an intracellular Ca2+ - and ATP-dependent event: a role for protein kinase C." J Biol Chem 275(33): 25351-25357.

13. Bittner, M. A., V. G. Krasnoperov, et al. (1998). "A Ca2+-independent receptor for alpha-latrotoxin, CIRL, mediates effects on secretion via multiple mechanisms." J Neurosci 18(8): 2914-2922.

14. Blank, G. S. and F. M. Brodsky (1986). "Site-specific disruption of clathrin assembly produces novel structures." EMBO J 5(9): 2087-2095.

15. Blank, G. S. and F. M. Brodsky (1987). "Clathrin assembly involves a light chain-binding region." J Cell Biol 105(5): 2011-2019.

16. Blatch, G. L. and M. Lassie (1999). "The tetratricopeptide repeat: a structural motif mediating protein-protein interactions." Bioessays 21(11): 932-939.

17. Blondeau, F., B. Ritter, et al. (2004). "Tandem MS analysis of brain clathrin-coated vesicles reveals their critical involvement in synaptic vesicle recycling." Proc Natl Acad Sci U S A 101(11): 3833-3838.

18

19

20

21

22

23

24

25

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

Blood, P. D. and G. A. Voth (2006). "Direct observation of Bin/amphiphysin/Rvs (BAR) domain-induced membrane curvature by means of molecular dynamics simulations." Proc Natl Acad Sci U S A 103(41): 15068-15072.

Bockaert, J., L. Fagni, et al. (2004). "GPCR interacting proteins (GIP)." Pharmacol Ther 103(3): 203221.

Bonifacino, J. S. and L. M. Traub (2003). "Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes." Annu Rev Biochem 72: 395-447.

Brodin, L., P. Low, et al. (2000). "Sequential steps in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis." CurrOpin Neurobiol 10(3): 312-320.

Bushlin, I., R. S. Petralia, et al. (2008). "Clathrin assembly protein AP180 and CALM differentially control axogenesis and dendrite outgrowth in embryonic hippocampal neurons." J Neurosci 28(41): 10257-10271.

Calebiro, D., V. O. Nikolaev, et al. (2010). "Signaling by internalized G-protein-coupled receptors." Trends Pharmacol Sci 31(5): 221-228.

Ceccarelli, B. and W. P. Hurlbut (1980). "Ca2+-dependent recycling of synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction." J Cell Biol 87(1): 297-303.

Chen, C. Y., M. L. Reese, et al. (2002). "Clathrin light and heavy chain interface: alpha-helix binding superhelix loops via critical tryptophans." EMBO J 21(22): 6072-6082.

Chen, S., M. C. Liang, et al. (2001). "Rab8b and its interacting partner TRIP8b are involved in regulated secretion in AtT20 cells." J Biol Chem 276(16): 13209-13216.

Clapham, D. E. and E. J. Neer (1993). "New roles for G-protein beta gamma-dimers in transmembrane signalling." Nature 365(6445): 403-406.

Crowther, R. A., J. T. Finch, et al. (1976). "On the structure of coated vesicles." J Mol Biol 103(4): 785-798.

D'Andrea, L. D. and L. Regan (2003). "TPR proteins: the versatile helix." Trends Biochem Sci 28(12): 655-662.

Dell'Angelica, E. C., J. Klumperman, et al. (1998). "Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin." Science 280(5362): 431-434.

Dell'Angelica, E. C., C. Mullins, et al. (1999). "AP-4, a novel protein complex related to clathrin adaptors." J Biol Chem 274(11): 7278-7285.

DiFrancesco, D. (1993). "Pacemaker mechanisms in cardiac tissue." Annu Rev Physiol 55: 455-472.

Doherty, G. J. and H. T. McMahon (2009). "Mechanisms of endocytosis." Annu Rev Biochem 78: 857-902.

Doyle, S. E., M. J. Scholz, et al. (2006). "Latrophilin-2 is a novel component of the epithelial-mesenchymal transition within the atrioventricular canal of the embryonic chicken heart." Dev Dyn 235(12): 3213-3221.

Edeling, M. A., S. K. Mishra, et al. (2006). "Molecular switches involving the AP-2 beta2 appendage regulate endocytic cargo selection and clathrin coat assembly." Dev Cell 10(3): 329-342.

Ehrlich, M., W. Boll, et al. (2004). "Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits." CeN 118(5): 591-605.

37. Eisenberg, E. and L. E. Greene (2007). "Multiple roles of auxilin and hsc70 in clathrin-mediated endocytosis." Traffic 8(6): 640-646.

38. Farsad, K., N. Ringstad, et al. (2001). "Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions." J Cell Biol 155(2): 193-200.

39. Fotin, A., Y. Cheng, et al. (2004). "Structure of an auxilin-bound clathrin coat and its implications for the mechanism of uncoating." Nature 432(7017): 649-653.

40. Fotin, A., Y. Cheng, et al. (2004). "Molecular model for a complete clathrin lattice from electron cryomicroscopy." Nature 432(7017): 573-579.

41. Fredriksson, R., M. C. Lagerstrom, et al. (2003). "The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints." Mol Pharmacol 63(6): 1256-1272.

42. Gallusser, A. and T. Kirchhausen (1993). "The beta 1 and beta 2 subunits of the AP complexes are the clathrin coat assembly components." EMBO J 12(13): 5237-5244.

43. Ghosh, P. and S. Kornfeld (2003). "AP-1 binding to sorting signals and release from clathrin-coated vesicles is regulated by phosphorylation." J Cell Biol 160(5): 699-708.

44. Girard, M., P. D. Allaire, et al. (2005). "Isolation of clathrin-coated vesicles by differential and density gradient centrifugation." Curr Protoc Cell Biol Chapter 3: Unit 3 13.

45. Goodman, 0. B., Jr., J. G. Krupnick, et al. (1996). "Beta-arrestin acts as a clathrin adaptor in endocytosis of the beta2-adrenergic receptor." Nature 383(6599): 447-450.

46. Gorio, A., L. L. Rubin, et al. (1978). "Double mode of action of black widow spider venom on frog neuromuscular junction." J Neurocytol 7(2): 193-202.

47. Gray, J. X., M. Haino, et al. (1996). "CD97 is a processed, seven-transmembrane, heterodimeric receptor associated with inflammation." J Immunol 157(12): 5438-5447.

48. Greene, B., S. H. Liu, et al. (2000). "Complete reconstitution of clathrin basket formation with recombinant protein fragments: adaptor control of clathrin self-assembly." Traffic 1(1): 69-75.

49. Greene, L. E. and E. Eisenberg (1990). "Dissociation of clathrin from coated vesicles by the uncoating ATPase." J Biol Chem 265(12): 6682-6687.

50. Gurevich, V. V. and J. L. Benovic (1993). "Visual arrestin interaction with rhodopsin. Sequential multisite binding ensures strict selectivity toward light-activated phosphorylated rhodopsin." J Biol Chem 268(16): 11628-11638.

51. Gurevich, V. V., S. B. Dion, et al. (1995). "Arrestin interactions with G protein-coupled receptors. Direct binding studies of wild type and mutant arrestins with rhodopsin, beta 2-adrenergic, and m2 muscarinic cholinergic receptors." J Biol Chem 270(2): 720-731.

52. Gurevich, V. V. and E. V. Gurevich (2006). "The structural basis of arrestin-mediated regulation of G-protein-coupled receptors." Pharmacol Ther 110(3): 465-502.

53. Gurevich, V. V., R. M. Richardson, et al. (1993). "Binding of wild type and chimeric arrestins to the m2 muscarinic cholinergic receptor." J Biol Chem 268(23): 16879-16882.

54. Han, Y., Y. Noam, et al. (2011). "Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing

55

56

57

58

59

60

61

62.

63.

64.

65.

66.

67.

68.

69.

70.

71.

72.

Rab8b-¡nteract¡ng protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites." J Biol Chem 286(23): 2082320834.

Hart!, F. U. and M. Hayer-Hartl (2002). "Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein." Science 295(5561): 1852-1858.

Hill, C. A., A. N. Fox, et al. (2002). "G protein-coupled receptors in Anopheles gambiae." Science 298(5591): 176-178.

Hofmann, M. W., S. Honing, et al. (1999). "The leucine-based sorting motifs in the cytoplasmic domain of the invariant chain are recognized by the clathrin adaptors API and AP2 and their medium chains." J Biol Chem 274(51): 36153-36158.

Honing, S., D. Ricotta, et al. (2005). "Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate regulates sorting signal recognition by the clathrin-associated adaptor complex AP2." Mol Cell 18(5): 519-531.

Honing, S., I. V. Sandoval, et al. (1998). "A di-leucine-based motif in the cytoplasmic tail of LIMP-II and tyrosinase mediates selective binding of AP-3." EMBO J 17(5): 1304-1314.

Hopkins, A. L. and C. R. Groom (2002). "The druggable genome." Nat Rev Drug Discov 1(9): 727-730.

Horvath, C. A., D. Vanden Broeck, et al. (2007). "Epsin: inducing membrane curvature." Int J Biochem Cell Biol 39(10): 1765-1770.

Hutterer, A. and J. A. Knoblich (2005). "Numb and alpha-Adaptin regulate Sanpodo endocytosis to specify cell fate in Drosophila external sensory organs." EMBO Rep 6(9): 836-842.

Ichtchenko, K., M. A. Bittner, et al. (1999). "A novel ubiquitously expressed alpha-latrotoxin receptor is a member of the CIRL family of G-protein-coupled receptors." J Biol Chem 274(9): 54915498.

Jackson, A. P. (1993). "The isolation of clathrin-coated vesicles and purification of their protein components." Methods Mol Biol 19: 83-96.

Jackson, A. P. and P. Parham (1988). "Structure of human clathrin light chains. Conservation of light chain polymorphism in three mammalian species." J Biol Chem 263(32): 16688-16695.

Josefsson, L. G. (1999). "Evidence for kinship between diverse G-protein coupled receptors." Gene 239(2): 333-340.

Kartenbeck, J. (1978). "Preparation of membrane-depleted polygonal coat structures from isolated coated vesicles." Cell Biol Int Rep 2(5): 457-464.

Keen, J. H. (1990). "Clathrin and associated assembly and disassembly proteins." Annu Rev Biochem 59: 415-438.

Keen, J. H., M. C. Willingham, et al. (1979). "Clathrin-coated vesicles: isolation, dissociation and factor-dependent reassociation of clathrin baskets." Cel] 16(2): 303-312.

Klabunde, T. and G. Hessler (2002). "Drug design strategies for targeting G-protein-coupled receptors." Chembiochem 3(10): 928-944.

Krain, A. L. and F. X. Castellanos (2006). "Brain development and ADHD." Clin Psychol Rev 26(4): 433-444.

Krasnoperov, V., Y. Lu, et al. (2002). "Post-translational proteolytic processing of the calcium-independent receptor of alpha-latrotoxin (CIRL), a natural chimera of the cell adhesion protein and

the G protein-coupled receptor. Role of the G protein-coupled receptor proteolysis site (GPS) motif." J Biol Chem 277(48): 46518-46526.

73. Krasnoperov, V. G., M. A. Bittner, et al. (1997). "alpha-Latrotoxin stimulates exocytosis by the interaction with a neuronal G-protein-coupled receptor." Neuron 18(6): 925-937.

74. Kreienkamp, H. J., M. Soltau, et al. (2002). "Interaction of G-protein-coupled receptors with synaptic scaffolding proteins." Biochem Soc Trans 30(4): 464-468.

75. Kreienkamp, H. J., H. Zitzer, et al. (2000). "The calcium-independent receptor for alpha-latrotoxin from human and rodent brains interacts with members of the ProSAP/SSTRIP/Shank family of multidomain proteins." J Biol Chem 275(42): 32387-32390.

76. Laemmli, U. K. (1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature 227(5259): 680-685.

77. Lang, J., Y. Ushkaryov, et al. (1998). "Ca2+-independent insulin exocytosis induced by alpha-latrotoxin requires latrophilin, a G protein-coupled receptor." Embo J 17(3): 648-657.

78. Laporte, S. A., R. H. Oakley, et al. (1999). "The beta2-adrenergic receptor/betaarrestin complex recruits the clathrin adaptor AP-2 during endocytosis." Proc Natl Acad Sci U S A 96(7): 3712-3717.

79. Lauritsen, J. P., C. Menne, et al. (2000). "beta2-adaptin is constitutively de-phosphorylated by serine/threonine protein phosphatase PP2A and phosphorylated by a staurosporine-sensitive kinase." Biochim Biophys Acta 1497(3): 297-307.

80. Le Borgne, R. (2006). "Regulation of Notch signalling by endocytosis and endosomal sorting." Curr Opin Cell Biol 18(2): 213-222.

81. Lee, D. W., X. Wu, et al. (2006). "Recruitment dynamics of GAK and auxilin to clathrin-coated pits during endocytosis." J Cell Sci 119(Pt 17): 3502-3512.

82. Lefkowitz, R. J. and S. K. Shenoy (2005). "Transduction of receptor signals by beta-arrestins." Science 308(5721): 512-517.

83. Lelianova, V. G., B. A. Davletov, et al. (1997). "Alpha-latrotoxin receptor, latrophilin, is a novel member of the secretin family of G protein-coupled receptors." J Biol Chem 272(34): 21504-21508.

84. Lewis, A. S., E. Schwartz, et al. (2009). "Alternatively spliced isoforms of TRIP8b differentially control h channel trafficking and function." J Neurosci 29(19): 6250-6265.

85. Lewis, A. S., S. P. Vaidya, et al. (2011). "Deletion of the Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channel Auxiliary Subunit TRIP8b Impairs Hippocampal Ih Localization and Function and Promotes Antidepressant Behavior in Mice." J Neurosci 31(20): 7424-7440.

86. Ludwig, A., X. Zong, et al. (1998). "A family of hyperpolarization-activated mammalian cation channels." Nature 393(6685): 587-591.

87. Ma, Y., T. Greener, et al. (2002). "Identification of domain required for catalytic activity of auxilin in supporting clathrin uncoating by Hsc70." J Biol Chem 277(51): 49267-49274.

88. Maldonado-Baez, L. and B. Wendland (2006). "Endocytic adaptors: recruiters, coordinators and regulators." Trends Cell Biol 16(10): 505-513.

89. Martinez, A. F., M. Muenke, et al. (2011). "From the black widow spider to human behavior: Latrophilins, a relatively unknown class of G protein-coupled receptors, are implicated in psychiatric disorders." Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 156(1): 1-10.

90. Massol, R. H., W. Boll, et al. (2006). "A burst of auxilin recruitment determines the onset of clathrin-coated vesicle uncoating." Proc IMatl Acad Sci U S A 103(27): 10265-10270.

91. Matsushita, H., V. G. Lelianova, et al. (1999). "The latrophilin family: multiply spliced G proteincoupled receptors with differential tissue distribution." FEBS Lett 443(3): 348-352.

92. McPherson, P. S. and B. Ritter (2005). "Peptide motifs: building the clathrin machinery." Mol Neurobiol 32(1): 73-87.

93. Meyerholz, A., L. Hinrichsen, et al. (2005). "Effect of clathrin assembly lymphoid myeloid leukemia protein depletion on clathrin coat formation." Traffic 6(12): 1225-1234.

94. Millar, R. P. and C. L. Newton (2010). "The year in G protein-coupled receptor research." Mol Endocrinol 24(1): 261-274.

95. Morgan, J. R., X. Zhao, et al. (1999). "A role for the clathrin assembly domain of AP180 in synaptic vesicle endocytosis." J Neurosci 19(23): 10201-10212.

96. Mueller, S. C. and D. Branton (1984). "Identification of coated vesicles in Saccharomyces cerevisiae." J Cell Biol 98(1): 341-346.

97. Newmyer, S. L., A. Christensen, et al. (2003). "Auxilin-dynamin interactions link the uncoating ATPase chaperone machinery with vesicle formation." Dev Cell 4(6): 929-940.

98. Ohno, H., J. Stewart, et al. (1995). "Interaction of tyrosine-based sorting signals with clathrin-associated proteins." Science 269(5232): 1872-1875.

99. Oldham, W. M. and H. E. Hamm (2008). "Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors." Nat Rev Mol Cell Biol 9(1): 60-71.

100. Ovchinnikov Yu, A. (1982). "Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure-function relationships." FEBS Lett 148(2): 179-191.

101. Owen, D. J., B. M. Collins, et al. (2004). "Adaptors for clathrin coats: structure and function." Annu Rev Cell Dev Biol 20: 153-191.

102. Pearse, B. M. (1975). "Coated vesicles from pig brain: purification and biochemical characterization." J Mol Biol 97(1): 93-98.

103. Pearse, B. M. and M. S. Robinson (1984). "Purification and properties of 100-kd proteins from coated vesicles and their reconstitution with clathrin." Embo J 3(9): 1951-1957.

104. Peden, A. A., V. Oorschot, et al. (2004). "Localization of the AP-3 adaptor complex defines a novel endosomal exit site for lysosomal membrane proteins." J Cell Biol 164(7): 1065-1076.

105. Pierce, K. L., R. T. Premont, et al. (2002). "Seven-transmembrane receptors." Nat Rev Mol Cell Biol 3(9): 639-650.

106. Piskorowski, R., B. Santoro, et al. (2011). "TRIP8b Splice Forms Act in Concert to Regulate the Localization and Expression of HCN1 Channels in CA1 Pyramidal Neurons." Neuron 70(3): 495-509.

107. Pitcher, J. A., N. J. Freedman, et al. (1998). "G protein-coupled receptor kinases." Annu Rev Biochem 67: 653-692.

108. Polo, S. and P. P. Di Fiore (2006). "Endocytosis conducts the cell signaling orchestra." Cell 124(5): 897-900.

109. Poteryaev, D., S. Datta, et al. (2010). "Identification of the switch in early-to-late endosome transition." Ceil 141(3): 497-508.

110. Rahman, M. A., A. C. Ashton, et al. (1999). "Norepinephrine exocytosis stimulated by alpha-latrotoxin requires both external and stored Ca2+ and is mediated by latrophilin, G proteins and phospholipase C." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 354(1381): 379-386.

111. Rajagopal, K., R. J. Lefkowitz, et al. (2005). "When 7 transmembrane receptors are not G proteincoupled receptors." J Clin Invest 115(11): 2971-2974.

112. Ramjaun, A. R. and P. S. McPherson (1998). "Multiple amphiphysin II splice variants display differential clathrin binding: identification of two distinct clathrin-binding sites." J Neurochem 70(6): 2369-2376.

113. Rapoport, I., W. Boll, et al. (2008). "A motif in the clathrin heavy chain required for the Hsc70/auxilin uncoating reaction." Mol Biol Cell 19(1): 405-413.

114. Reiter, E. and R. J. Lefkowitz (2006). "GRKs and beta-arrestins: roles in receptor silencing, trafficking and signaling." Trends Endocrinol Metab 17(4): 159-165.

115. Ricotta, D., S. D. Conner, et al. (2002). "Phosphorylation of the AP2 mu subunit by AAK1 mediates high affinity binding to membrane protein sorting signals." J Cell Biol 156(5): 791-795.

116. Robinson, M. S. (2004). "Adaptable adaptors for coated vesicles." Trends Cell Biol 14(4): 167-174.

117. Robinson, M. S. and J. S. Bonifacino (2001). "Adaptor-related proteins." CurrOpin Cell Biol 13(4): 444-453.

118. Robinson, R. B. and S. A. Siegelbaum (2003). "Hyperpolarization-activated cation currents: from molecules to physiological function." Annu Rev Physiol 65: 453-480.

119. Rogers, S., R. Wells, et al. (1986). "Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis." Science 234(4774): 364-368.

120. Roth, A. F., D. M. Sullivan, et al. (1998). "A large PEST-like sequence directs the ubiquitination, endocytosis, and vacuolar degradation of the yeast a-factor receptor." J Cell Biol 142(4): 949-961.

121. Santoro, B., S. G. Grant, et al. (1997). "Interactive cloning with the SH3 domain of N-src identifies a new brain specific ion channel protein, with homology to eag and cyclic nucleotide-gated channels." Proc Natl Acad Sci U S A 94(26): 14815-14820.

122. Santoro, B., L. Hu, et al. (2011). "TRIP8b regulates HCN1 channel trafficking and gating through two distinct C-terminal interaction sites." J Neurosci 31(11): 4074-4086.

123. Santoro, B., D. T. Liu, et al. (1998). "Identification of a gene encoding a hyperpolarization-activated pacemaker channel of brain." Cell 93(5): 717-729.

124. Santoro, B., R. A. Piskorowski, et al. (2009). "TRIP8b splice variants form a family of auxiliary subunits that regulate gating and trafficking of HCN channels in the brain." Neuron 62(6): 802-813.

125. Santoro, B., B. J. Wainger, et al. (2004). "Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction." J Neurosci 24(47): 10750-10762.

126. Scheele, U., C. Kalthoff, et al. (2001). "Multiple interactions of auxilin 1 with clathrin and the AP-2 adaptor complex." J Biol Chem 276(39): 36131-36138.

127.Schmid, S. L. (1997). "Clathrin-coated vesicle formation and protein sorting: an integrated process." Annu Rev Biochem 66: 511-548.

128.

129.

130,

131

132,

133,

134,

135,

136

137,

138,

139,

140,

141,

142,

143.

144.

Sekhar, K. R. and M. L. Freeman (1998). "PEST sequences in proteins involved in cyclic nucleotide signalling pathways." J Recept Signal Transduct Res 18(2-3): 113-132.

Seroussi, E.; H. Q. Pan, et al. (1998). "Characterization of the human NIPSNAP1 gene from 22ql2: a member of a novel gene family." Gene 212(1): 13-20.

Sever, S., H. Damke, et al. (2000). "Dynamin:GTP controls the formation of constricted coated pits, the rate limiting step in clathrin-mediated endocytosis." J Cell Biol 150(5): 1137-1148.

Shenoy, S. K. and R. J. Lefkowitz (2003). "Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling." Biochem J 375(Pt 3): 503-515.

Simpson, F., A. A. Peden, et al. (1997). "Characterization of the adaptor-related protein complex, AP-3." J Cell Biol 137(4): 835-845.

Smith, C. J., T. R. Dafforn, et al. (2004). "Location of auxilin within a clathrin cage." J Mol Biol 336(2): 461-471.

Smith, C. J., N. Grigorieff, et al. (1998). "Clathrin coats at 21 A resolution: a cellular assembly designed to recycle multiple membrane receptors." EMBO J 17(17): 4943-4953.

Stenmark, H. (2009). "Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic." Nat Rev Mol Cell Biol 10(8): 513-525.

Stepp, J. D., A. Pellicena-Palle, et al. (1995). "A late Golgi sorting function for Saccharomyces cerevisiae Apmlp, but not for Apm2p, a second yeast clathrin AP medium chain-related protein." Mol Biol Cell 6(1): 41-58.

Sudhof, T. C. (2001). "alpha-Latrotoxin and its receptors: neurexins and CIRL/latrophilins." Annu Rev Neurosci 24: 933-962.

Sugita, S., K. Ichtchenko, et al. (1998). "alpha-Latrotoxin receptor CIRL/latrophilin 1 (CL1) defines an unusual family of ubiquitous G-protein-linked receptors. G-protein coupling not required for triggering exocytosis." J Biol Chem 273(49): 32715-32724.

Takei, K., V. I. Slepnev, et al. (1999). "Functional partnership between amphiphysin and dynamin in clathrin-mediated endocytosis." Nat Cell Biol 1(1): 33-39.

ter Haar, E., S. C. Harrison, et al. (2000). "Peptide-in-groove interactions link target proteins to the beta-propeller of clathrin." Proc Natl Acad Sci USA 97(3): 1096-1100.

Tobaben, S., T. C. Sudhof, et al. (2000). "The G protein-coupled receptor CL1 interacts directly with proteins of the Shank family." J Biol Chem 275(46): 36204-36210.

Tobaben, S., T. C. Sudhof, et al. (2002). "Genetic analysis of alpha-latrotoxin receptors reveals functional interdependence of CIRL/latrophilin 1 and neurexin 1 alpha." J Biol Chem 277(8): 63596365.

Tzeng, M. C., R. S. Cohen, et al. (1978). "Release of neurotransmitters and depletion of synaptic vesicles in cerebral cortex slices by alpha-latrotoxin from black widow spider venom." Proc Natl Acad Sci U S A 75(8): 4016-4020.

Tzeng, M. C. and P. Siekevitz (1978). "The effect of the purified major protein factor (alpha-latrotoxin) of black widow spider venom on the release of acetylcholine and norepinephrine from mouse cerebral cortex slices." Brain Res 139(1): 190-196.

145. Tzeng, M. С. and P. Siekevitz (1979). "Action of alpha-latrotoxin from black widow spider venom on a cerebral cortex preparation: release of neurotransmitters, depletion of synaptic vesicles, and binding to membrane." Adv Cytopharmacol 3: 117-127.

146.Tzeng, M. C. and P. Siekevitz (1979). "The binding interaction between alpha-latrotoxin from black widow spider venom and a dog cerebral cortex synaptosomal membrane preparation." J Neurochem 33(1): 263-274.

147. Ungewickell, E. (1983). "Biochemical and immunological studies on clathrin light chains and their binding sites on clathrin triskelions." EMBO J 2(8): 1401-1408.

148. Ungewickell, E., H. Ungewickell, et al. (1997). "Functional interaction of the auxilin J domain with the nucleotide- and substrate-binding modules of Hsc70." J Biol Chem 272(31): 19594-19600.

149. Ungewickell, E., H. Ungewickell, et al. (1995). "Role of auxilin in uncoating clathrin-coated vesicles." Nature 378(6557): 632-635.

150. Verstreken, P., T. W. Koh, et al. (2003). "Synaptojanin is recruited by endophilin to promote synaptic vesicle uncoating." Neuron 40(4): 733-748.

151. Volynski, K. E., J. P. Silva, et al. (2004). "Latrophilin fragments behave as independent proteins that associate and signal on binding of LTX(N4C)." Embo J 23(22): 4423-4433.

152. Wakeham, D. E., C. Y. Chen, et al. (2003). "Clathrin self-assembly involves coordinated weak interactions favorable for cellular regulation." EMBO J 22(19): 4980-4990.

153. Wei, H., S. Ahn, et al. (2003). "Independent beta-arrestin 2 and G protein-mediated pathways for angiotensin II activation of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2." Proc Natl Acad Sci U S A 100(19): 10782-10787.

154. White, G. R., J. M. Varley, et al. (1998). "Isolation and characterization of a human homologue of the latrophilin gene from a region of lp31.1 implicated in breast cancer." Oncogene 17(26): 35133519.

155. Wiedenhoeft, R. E., G. W. Schmidt, et al. (1988). "Dissociation and reassembly of soybean clathrin." Plant Physiol 86(2): 412-416.

156. Wilbur, J. D., P. K. Hwang, etal. (2005). "New faces of the familiar clathrin lattice." Traffic 6(4): 346350.

157. Wolfe, B. L. and J. Trejo (2007). "Clathrin-dependent mechanisms of G protein-coupled receptor endocytosis." Traffic 8(5): 462-470.

158. Xing, Y., T. Bocking, et al. (2010). "Structure of clathrin coat with bound Hsc70 and auxilin: mechanism of Hsc70-facilitated disassembly." EMBO J 29(3): 655-665.

159. Xiong, Y. and T. A. Steitz (2006). "A story with a good ending: tRNA З'-end maturation by CCA-adding enzymes." CurrOpin Struct Biol 16(1): 12-17.

160. Yona, S., H. H. Lin, et al. (2008). "Adhesion-GPCRs: emerging roles for novel receptors." Trends Biochem Sci 33(10): 491-500.

161. Yoshida, Y., M. Kinuta, et al. (2004). "The stimulatory action of amphiphysin on dynamin function is dependent on lipid bilayer curvature." EMBO J 23(17): 3483-3491.

162. Young, A. (2007). "Structural insights into the clathrin coat." Semin Cell Dev Biol 18(4): 448-458.

163. Zhang, B., Y. H. Koh, et al. (1998). "Synaptic vesicle size and number are regulated by a clathrin adaptor protein required for endocytosis." Neuron 21(6): 1465-1475.

164. Zolles, G., D. Wenzel, et al. (2009). "Association with the auxiliary subunit PEX5R/Trip8b controls responsiveness of HCN channels to cAMP and adrenergic stimulation." Neuron 62(6): 814-825.