Характеристика взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Аккуратов, Евгений Евгеньевич

• Аккуратов, Евгений Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Аккуратов, Евгений Евгеньевич

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика Na/K-АТРазы

1.2. Каталитический цикл Na/K-АТРазы

1.3. Соединения класса кардиотонических стероидов

1.4. Участие Na/K-АТРазы в клеточной сигнализации

1.5. NMDA-рецептор: общая характеристика

1.6. Участие NMDA-рецептора в клеточной сигнализации

1.7.Предпосылки взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Получение первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс

2.2. Получение суспензии гранулярных клеток мозжечка крыс

2.3. Инкубация первичной культуры и суспензии гранулярных клеток с лигандами

2.4. Иммунопреципитирование

2.5. Метод Western blotting

2.6. Определение концентрации белка

2.7. Определение активности Na/K-АТРазы по высвобождению неорганического фосфата

2.8. Определение активности Na/K-АТРазы по измерению поглощенного иона Rb+

2.9. Иммуноцитохимические методы

2.10. Метод проточной цитометрии

2.11. Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Характеристика первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс

3.2. Анализ структурного взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора

3.3. Влияние уабаина на активацию сигнальных каскадов при кратковременной инкубации

3.4. Влияние уабаина на активность NMDA-рецепторов

3.5. Эффект долговременной инкубации нейронов с уабаином

2

3.6. Влияние ЫМБА-рецептора на активность Ыа/К-АТРазы

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК — активные формы кислорода БСА — бычий сывороточный альбумин КТС — кардиотонические стероиды ПААГ - полиакриламидный гель Akt - протеинкиназа В

AMP А - 2-амино-3-(5-метил-3-оксо-1,2-оксазол-4-ил)пропановая кислота

ВАРТА - 1,2-ди(2-аминофенокси)этан-М,К,Ы,Ы-тетраацетат

ECL — усиленная хемилюминесценция

EGFR - рецептор эпидерального фактора роста

Fluo-3-AM - пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлор-6-гидрокси-3-оксо-9-

ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси)этан-Ы,Н,М',К'-тетрауксусная кислота

FSC — прямое светорассеивание

МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы

NAC - N-ацетилцистеин

NMDA - N-метил-О-аспартат

PBS - фосфатный буфер

PI - йодистый пропидий

PI3K - фосфоинозитол-3-киназа

РКС - протеинкиназа С

РКА - протеинкиназа А

SSC — боковое светорассеивание

TBS - трис-солевой буфер

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка»

ВВЕДЕНИЕ

Настоящая работа посвящена исследованию потенциального взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора. Na/K-АТРаза долгое время была известна как фермент, способный поддерживать градиент ионов Na+ и К+, однако в 90-е годы XX века было установлено, что Na/K-АТРаза способна функционировать как рецептор, специфическим лигандом которого являются соединения класса кардиотонических стероидов (Kometiani et al., 1998). Было показано, что взаимодействие Na/K-АТРазы с этими соединениями может регулировать экспрессию генов раннего и позднего ответов через активацию транскрипционных факторов (Xie et al., 1999). Несмотря на довольно длительный период, прошедший с момента этого открытия, данных об участии Na/K-АТРазы в процессах сигнализации в нейрональных клетках известно очень мало, причем основные исследования ведутся с использованием кардиомиоцитов, почечного эпителия и фибробластов.

Na/K-АТРаза в нейрональной ткани поглощает огромное количество АТР - до 50% от общего уровня аденозинтрифосфата клетки. В нейрональных клетках а-субъединица Na/K-АТРазы представлена двумя изоформами - КТС-чувствительной аЗ-субъединицей и КТС-резистентной а 1-субъединицей. В литературе активно обсуждается вопрос о том, какими путями разные изоформы способны вовлекаться в различные внутриклеточные сигнальные пути, а также ставится вопрос о наличии в тканях животных соединений класса кардиотонических стероидов и о их возможном синтезе de novo.

Недавно было показано, что белок агрин, участвующий в формировании нервно-мышечного синапса, способен специфически связываться с КТС-чувствительной аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы и вызывать эффекты, аналогичные действию КТС (Hilgenberg et al., 2006). Таким образом, был найден специфический «партнер» для КТС-чувствительной аЗ-субъединицы, которая представлена только в нейрональных клетках, что позволяет говорить о возможных путях регуляции именно КТС-чувствительной аЗ-субъединицы. Мутации в гене, который кодирует эту субъединицу, способны вызывать эпилепсию и паркинсонизм в моделях гетерозиготных мышей по данному гену (Clapcote et al., 2009).

В последнее время начали накапливаться данные о возможной взаимосвязи между

Na/K-АТРазой и глутаматными рецепторами. Недавно показано, что связывание уабаина с

Na/K-АТРазой способно влиять на стабильность ионотропных рецепторов АМРА-класса в

нейронах (Zhang et al., 2009), а также блокировать активность глутаматных переносчиков

GLT-1 и GLAST в клетках глии (Rose et al., 2009). Все это позволяет говорить о

5

возможном участии Ыа/К-АТРазы в функционировании глутаматной системы. Кроме того, накапливаются данные о предпосылках взаимодействия между Ка/К-АТРазой и ионотропными рецепторами КК/ГОА-класса.

ЫМОА-рецепторы представляют собой ионотропные глутаматные рецепторы, которые участвуют в формировании синаптической пластичности и молекулярной памяти. Важным отличием №УГОА-рецепторов от других ионотропных глутаматных рецепторов является то, что их канал проницаем не только для натрия и калия, но и для Са2+, который является вторичным мессенджером и способен модулировать ответ клетки в зависимости от внешнего сигнала.

В литературе показано, что действие соединений класса кардиотонических стероидов приводит к проявлению экзайтотоксических эффектов глутамата ^е^азЬоок е1 а1., 1999). Так как этот эффект снимается антагонистами ЫМОА-рецепторов, было выдвинуто предположение, что КТС способны влиять на функционирование ЫМ.ПА-рецепторов. Было также показано, что активация ЫМВА-рецепторов может приводить к частичному ингибированию активности Ыа/К-АТРазы (Bulygina е1 а1., 2003). Однако на сегодняшний день не установлено, способны ли они взаимодействовать между собой.

Цель и задачи работы

Целью данной работы явилось выявление особенностей структурного и функционального взаимодействия Ма/К-АТРазы и И]УЮА-рецептора в гранулярных клетках мозжечка крыс.

В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать возможное структурное взаимодействие и ко-локализацию Ка/К-АТРазы и ЫМОА-рецептора в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка.

2. Исследовать активацию Ак1 и ЕЯК'/2 киназ при действии различных концентраций уабаина и оценить возможное участие КМБА-рецептора в этих сигнальных каскадах.

3. Выявить механизмы «экзайтотоксического» действия глутамата на фоне действия уабаина.

4. Исследовать процессы долговременной регуляции >ШГОА-рецепторов под действием уабаина на клетки.

5. Оценить возможное влияние NMDA-рецептора на активность Na/K-АТРазы в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка крыс и исследовать общие механизмы этого процесса.

Научная новизна и практическая значимость работы

В представленном исследовании впервые показано, что Na/K-АТРаза и NMDA-рецептор могут формировать функциональный комплекс, в котором могут принимать участие как КТС-чувствительная аЗ-субъединица, так и КТС-резистентная al-субъединица Na/K-АТРазы.

Показано, что кратковременное взаимодействие уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации ERK Vi, а с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы - к активации Akt. NMDA-рецепторы не участвуют в данных сигнальных каскадах. Связывание уабаина с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к усилению функции NMDA-рецепторов за счет фосфорилирования тирозиновых остатков МЯ2В-субъединицы. Долговременная связывание уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к уменьшению количества NMDA-рецепторов в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. Был установлен механизм ингибирования Na/K-АТРазы при активации NMDA-рецепторов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что NMDA-рецептор в гранулярных клетках мозжечка является объектом сложной регуляции и на его активность могут влиять как al-, так и аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы. Полученные данные могут инициировать исследование причин, по которым недостаточность аЗ-субъединицы Na/K-АТРэзы приводит к нейродегенеративным заболеваниям.

Апробация работы и публикации

Результаты диссертационной работы были представлены на II Международном семинаре по исследованию экспрессии, структуры и функции мембранных белков (Флоренция, Италия, 2009), XIII Международной конференции по АТРазам Р-типа, (Пасифик Гров, США, 2011). Диссертация апробирована на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2011). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, среди которых 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика Na/K-АТРазы

Na/K-активируемая Mg-зависимая аденозинтрифосфат фосфогидролаза представляет собой интегральный белок плазматических мембран животных клеток (Skou, Esmann, 1992). Она принадлежит к классу АТРаз Р-типа (группа АТРаз, в каталитическом цикле которых обнаруживается фосфорилированный интермедиат), обеспечивающих активный транспорт различных ионов (Chan et al., 2010). Функция этого фермента заключается в поддержании градиента ионов Na+ и К+ между клеткой и внеклеточной средой. Таким образом, этот фермент является молекулярным насосом, который транспортирует ионы Na+ во внеклеточную среду и ионы К+ внутрь клетки. Перенос ионов происходит против электрохимического градиента, и на перенос трех ионов Na+ и двух ионов К+ расходуется энергия, освобождающаяся при гидролизе одной молекулы АТР.

Несмотря на то, что впервые кристаллическая структура представителя семейства АТРаз Р-типа была установлена в 2000 г. - это было сделано для Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума (Toyoshima et al., 2000), первые данные о кристаллической структуре Na/K-АТРазы (из почек свиньи) были опубликованы только в 2007 г. (Shinoda et al., 2009). Это позволило получить информацию об упаковке Na/K-АТРазы в мембране (см. рис. 1).

Функционально активный протомер Na/K-АТРазы включает 2 субъединицы: а (каталитическая) и (3 (регуляторная), их содержание в очищенном ферменте эквимолярно. В центре комплекса между собой взаимодействуют две а-субъединицы, а Р-субъединицы расположены по бокам и между собой не взаимодействуют (Sarvazyan et al., 1997). В некоторых тканях комплекс включает и у-субъединицу, играющую регуляторную роль.

Методом аналитического ультрацентрифугирования было обнаружено, что молекулярная масса Na/K-АТРазы из солевых желез уток составляет величину свыше 300 кДа (Пиндель, 1992). Были также показаны АТР-индуцируемые переходы протомеров в дипротомеры (Hayashi et al., 1997). Выяснено, что участок P561-Q709 участвует в ассоциации а-субъединиц друг с другом (Koster et al., 1997). Показано, что связи между протомерами в Е2 форме являются более выраженными, чем в Е1 форме (Kunihiro et al., 1994).

г

VI

мембрана

межклеточное пространство

Рис. 1. Кристаллическая структура Ла/К-АТРачы (8Ьто{1а с( а1., 2009), А, Б - вид с разных сторон. На данном рисунке представлены и-субъедииица (символ «), р-субъединица (символ р) и у-еубъединица (обозначение РХУ1))

а-субъединица имеет молекулярную массу ] 10 кДа. Она имеет ] 0 трансмембрапных доменов (MI-M10). причем петля М2-МЗ является активаторным доменом (осуществляет процесс дефосфорилирования фермента), а М4-М5 содержит нуклеотидсвязывающи й (связывает молекулу АТР) и фо сфорилирующийся (осуществляет перенос фоефорильной группы с АТР на белок) домены (Mortli et al., 2009). Домены. Пересекающие мембрану, являются a-спиралями и участвуют в формировании ионных центров (Jorgensen el al., 2003). На участках фермента, обнаруживаемых по внешнюю

сторону мембраны, расположены центры связывания специфических ингибиторов, относящихся к классу КТС (Ogawa et а!., 2009).

а-субьедипица фермента в тканях животных (растительные ткани этого фермента не содержат) представлена четырьмя изоформами а1-а4 (Dobretsov el al., 2005). Во всех тканях животных присутствует g]-субъединица, другие изоформы Na/K-АТРэзы являются тканеслецифичными: а2 экспресс и руется в сердце, скелетных мышцах и глиальных клетках, аЗ - в нейрональных клетках, а4 - в семенниках) (Dobretsov el al., 2005), Гомология в их аминокислотной последовательности составляет 85-97% (см. рис. 2). al- и <л2-субъединицы имеют сходные кинетические параметры, тогда как фермент, включающий аЗ-субъедииицу, имеет меньшее сродство к цито плазматическом у Na+ и большее сродство к внеклеточному К'(Blanco, Мсгссг, 1998).

V

межклеточное пространство

V>».< - «Л»..

ЗВ идентичности ■ 2/3 идентичности 9 нет идентичности

цитоплазма

; 4/4 идантичности • Э/4 идентичное™ 2/4 идентичности t нет идентичности

Рис. 2. Гомологии в аминокислотной последовательности Na/K-АТРазы (Blanco, Mercer, 1998). Для а-субъединицы: зеленый цвет - аминокислоты во всех четырех изоформах, синий - в трех, желтый - в двух, красный - только в одной. Для р-субъедипицы: зеленый - в трех изоформах, синий-в двух, красный - в одной.

Различаются изоформы а-субъединицы и по чувствительности к действию окислителей (Болдырев и соавт.., 1995), а также по сродству к кардиотоническим стероидам (Lucking, Nielsen, 1997). Последнее свойство имеет ярко выраженные видовые различия: у крыс и мышей al-субъединица резистентна к действию уабаина (относящемуся к классу кардиотонических стероидов), однако у человека, быка, собаки и кролика она является чувствительной к действию уабаина (Schoner, 2002). Кроме того, а2-и аЗ-субъединицы в клетках крыс более чувствительны к действию окислителей, нежели a 1 -субъединица (Xie et al., 1990; Kurella et al., 1999).

ß-субъединица представляет собой гликопротеид с молекулярной массой около 55 кДа (белковая часть имеет молекулярную массу 35 кДа). ß-субъединица имеет только один трансмембранный домен. Большая часть ее молекулы располагается с внешней стороны мембраны, там расположено 3 дисульфидных мостика. Их восстановление приводит к потере активности фермента.

ß-субъединица имеет три изоформы - ßl (содержится во многих типах тканей), ß2 (встречается в скелетной мускулатуре, эпифизе и нервной ткани) и ß3 (содержится в семенниках, сетчатке, печени и легких). Изоформы менее гомологичны между собой (5060% гомологии) (Blanco, Mercer, 1998). Их различия проявляются в количестве участков гликозилирования; кроме того, наличие той или иной изоформы определяет каталитические свойства а-субъединицы.

ß-субъединица участвует в доставке молекул каталитической субъединицы к мембране и в процессе ее встраивания в мембранный бислой. Кроме того, она вовлекается в связывание ионов К+. Показано, что ß2-субъединица участвует в адгезии клеток в нервной ткани (Gloor et al., 1990).

В ряде тканей в состав Na/K-АТРэзы может также входить также у-субъединица (Sweadner et al., 2000). Это полипептид массой около 10 кДа. Известно 7 различных изоформ, все они принадлежат к семейству FXYD белков (содержащих в своей структуре FXYD мотив) (Garty, Karlish, 2006). Эта субъединица содержит один трансмембранный участок, ее N-конец обращен в межклеточное пространство. Функция этого белка -регуляция работы Na/K-АТРазы (влияние на сродство к ионам Na+ и К+ и на связывание с молекулой ATP) (Arystarkhova et al., 1999). Показано, что белки данного семейства способны взаимодействовать не только с Na/K-АТРазой, но и с другими мембранными белками.

Для сохранения ферментативной активности Na/K-АТРазы необходимо гидрофобное окружение, которое обеспечивается липидным бислоем. Он поддерживает

11

нативную конформацию белка. В препаратах Na/K-АТРазы, полученных после солюбилизации фермента, весовое соотношение белка и липидов близко к 1. Обработка препарата фосфолипазами приводит к потере ферментативной активности (Пиндель, 1992; Ко Чже Чжун, Болдырев, 1978).

1.2. Каталитический цикл Na/K-АТРазы

Общее свойство белков из семейства Р-АТРаз, к которым принадлежит Na/K-АТРаза, заключается в том, что в ходе каталитического цикла они последовательно принимают два конформационных состояния, отличающиеся разным сродством к переносимым катионам. Конформация El Na/K-АТРазы обладает высоким сродством к ионам Na+, а конформация Е2 - высоким сродством к ионам К+. В процессе каталитического цикла происходит фосфорилирование белка аденозинтрифосфатом по аспартату-369, так что в ходе гидролиза молекулы АТР образуется фосфофермент ЕР. Фосфоформа АТРазы также может существовать в 2 разных конформациях - ЕР1 и ЕР2. Таким образом, Na/K-АТРаза катализирует общую реакцию, которую можно описать следующим уравнением (Kaplan, 2002):

ATP + 3Na+in + 2K+out + Mg2+^ ADP + P, + 3Na+out + 2K+in + Mg2+.

Избирательность №+-центров по отношению к Na+ очень высока. Na+ можно заменить только ионами лития, но в таком случае максимальная активность фермента составит лишь 10% от исходной (Болдырев, Твердислов, 1978). Иные ионы могут занимать Na'-центры, однако не могут активировать Na/K-АТРазу. К+-центр менее избирателен, калий может быть заменен на ионы Rb+, NH4+, Cs+, Li+, Tl+. Эти ионы активируют гидролиз АТР и способны транспортироваться, конкурируя с ионами К+. Этим обстоятельством часто пользуются для измерения скорости активного транспорта калия, заменяя в среде 42К+ на более удобный в работе изотоп 86Rb+.

Гидролитический цикл Na/K-АТРазы включает в себя ряд частных реакций, они могут быть «смоделированы» в качестве промежуточных стадий общего процесса: присоединение АТР, обратимое фосфорилирование фермента в присутствии ионов натрия и распад фосфорилированного фермента под действием ионов калия. Впервые такая схема работы фермента была предложена Постом, Альберсом и их коллегами и получила название схема Поста-Альберса (Post, 1972) (см. рис. 3).

Na/Na обмен

К/К обмен

Na+ __ Фн

г

Na-АТФаза

El

АТФ/АДФ обмен

Л +' * Na

И

^NaEl^—^NaEÍ -Р

И

АТФ

к

\( К

Ф

н

К

\(

А

< К Е2 К - Е2Р

п-НФФ I

К-фосфатаза

К+ Ф

н

Рис. 3. Схема Поста-Альберса (Post, 1972)

В среде с Na+ и АТР происходит присоединение к белку терминального фосфата, приводящее к образованию фосфорилированной формы фермента Е1-Р. В присутствии высоких концентраций ионов Mg2+ (больших, чем концентрация АТР) происходит переход Е1-Р в форму Е2-Р и наблюдается изменение сродства к ионам: сродство к Na+ снижается, а к К+, наоборот, повышается. Связывание ферментом ионов К+ приводит к тому, что ацилфосфатная связь приобретает способность атаковаться молекулами воды, фосфат высвобождается в среду, а фермент переходит из конформации Е2 в конформацию Е1. В определенный период осуществления цикла переносимые ионы оказываются недоступны для обмена с окружающей средой. Такое состояние носит название «окклюдированного» (впервые показано И. Глином).

L

Постепенно стали накапливаться экспериментальные данные, не вписывающиеся в схему Поста-Альберса, поэтому позже Кантли была предложена более детальная схема (СапЙеу е! а1., 1987) (см. рис. 4).

Na Е1<—NaEl АТФ < . > Na El - Р

Na+/ К р^

к АТФ

Л

Na К Е2 АТФ

/К

АДФ д

V

V

+ а

К

КЕ2 <-> К - Е2Р <-> КЕ2-Р

Ф

н

Рис. 4. Схема Кантли (Cantley et al., 1987)

По сравнению с предыдущими представлениями в реакционный цикл были внесены следующие изменения: 1) конформационный переход калиевой формы в натриевую является самой медленной стадией цикла, 2) натриевая конформация характеризуется высоким, а калиевая — низким сродством к АТР, 3) связывание АТР с центром низкого сродства на молекуле фермента ускоряет переход Е2 - Е1.

1.3. Соединения класса кардиотонических стероидов

Специфическими ингибиторами Ыа/К-АТРазы являются соединения класса сердечных гликозидов (1Лп$ге1, 2010). Это производные циклопентанпергидрофенантрена, которые содержат в 17-ом положении ненасыщенное лактоновое кольцо. Соединения класса сердечных гликозидов делят на два подкласса: карденелиды, которые имеют в своей структуре 5-членное лактоновое кольцо (уабаин, дигидроуабаин, дигоксин), и буфадиенолиды, которые содержат 6-членное лактоновое кольцо (буфалин, маринобуфагенин) (см. рис. 5).

уабаин R-рамноза

19-норбуфалин

дигоксин-подобный ингибитор R-дигитоксоза

маринобуфагенин

"V

г. г Т 3ß-0H. 14а. 20.21-буфенолид

PSI 2238

проксилларидин-подобный ингибитор

R -рамноза

Рис. 5. Соединения класса кардиотонических стеродидов

Более 200 лет кардиотоническис стероиды (выделяемые из растительных объектов или синтезируемые) используются в качестве лекарственных препаратов для лечения сердечной недостаточности. И только недавние исследования показали, что такое соединение, как уабаин, может си тезироваться в организме человека (Hamlyn et ai., 1998).

Вначале было обнаружено, что фактор, циркулирующий в крови человека и

иягибирующий Na/K-АТРззу, способен влиять на кровяное давление. Позже уабаин был

найден практически во всех тканях, однако наибольшая его концентрация обнаруживалась

в надпочечниках, гипофизе и гипоталамусе (Schoner, 2002). Уабаин или его изомер был

также выделен из плазмы крови человека (Mathews el al„ I991). Выло показано, что в

15

клеточных культурах уабаин синтезируется de novo (Qazzaz et al., 2000). К примеру, клетки надпочечников секретируют уабаин под действием АКТГ и ангиотензина II, повышая его исходный уровень в десять и более раз. Агонист рецептора ангиотензина II GGP42112 стимулирует выработку уабаина, а антагонист PD123319 ингибирует его синтез (Laredo et al., 1995). Показано, что физические упражнения быстро приводят к возрастанию концентрации уабаина в венозной крови человека и собаки, а в процессе отдыха его уровень быстро снижается (Antolovic et al., 2000). Повышение концентрации уабаина в плазме крови было также показано при дисбалансе концентрации ионов Na+, при преклампсии, гиперальдостеронизме, сердечной недостаточности и хронической почечной недостаточности (Gottlieb et al., 1992). Ионотропный эффект уабаина выражается в увеличении частоты сердечных сокращений. Долговременный эффект уабаина выражается в экспрессии белков в клетках сердечной мускулатуры.

Рядом исследователей было также показано наличие в плазме крови человека маринобуфагенина, относящегося к подклассу буфадиенолидов, который был исходно выделен из кожи жаб. Было показано его увеличение в ходе преклампсии, соль-чувствительной гипертензии и при хронической почечной недостаточности (Bagrov et al., 2009). Было показано, что действие маринобуфагенина на фибробласты приводит к синтезу коллагена первого типа. В клетках PC-12 был обнаружен синтез маринобуфотоксина, являющегося субероиларгининовым эфиром маринобуфагенина (Yoshika et al., 2011).

Все стероидные гормоны в крови транспортируются в связанной с глобулинами форме (Rosner et al., 1999). Был описан специфический белок глобулиновой природы, способный связываться с кардиотоническими стероидами, - пентадимер с массой 85кДа, который способен связывать сердечные гликозиды с отрицательной кооперативностью (величина Ка варьирует от 1,5 до 75 нМ). Он был найден не только в плазме крови, но и в печени, почках и скелетных мышцах (Antolovic et al., 1998).

Структурно молекулу уабаина можно разделить на 3 части - лактонное кольцо, стероидную часть и углеводный компонент. За связывание с лактоновым кольцом отвечают участки петли М4. Насыщенность лактонового кольца влияет на ориентацию стероидной части при взаимодействии с белком-мишенью и, таким образом, влияет на сродство к сердечному гликозиду в целом. За связывание гидрофобной стероидной части отвечают аминокислоты петель М4-М6. За связывание углеводного компонента отвечают аминокислоты петли М4 и домена L7/L8 (Ogawa et al., 2009) (см. рис. 6). Методом кристаллографии было показано, что Na/K-АТРаза связывает уабаин в конформации Е2 (Sandter et al., 2011).

Рис. 6. Кристаллическая структура N а/К-АТ Разы со связанным с ней уабаипом (0«а«а а!., 2009). А — схематическое расположение ^/К-АТРазы в мембране, В -расположение молекулы уабаина между петлями М1, М2, М4-М6, С - структурная формула уабаина

Среди кардиотонических стероидов в лабораторных исследованиях наиболее часто используется уабаии (строфантин С), что объясняется его относительно хорошей растворимостью к водных растворах.

1.4. Участие ^/К-АТРазы в клеточной сигнализации

За счет белок-бел ко пых взаимодействий Na/K-ATPaзa способна передавать

информацию о своем функциональном состоянии цито плазм этическим белкам. По этой

причине при взаимодействии сердечных гликозидов с ферментом запускаются

внутри клеточные сигнальные каскады и происходит активация ряда протеин кии аз и

17

транскрипционных факторов - таким образом Na/K-АТРаза может участвовать во внутриклеточной сигнализации.

Таким образом, Na/K-АТРаза является объектом сложной регуляции, в которой принимают участие различные белки клетки. Кратковременная регуляция осуществляется за счет доступности и концентрации ионов Na+ и К+, а также за счет изменения концентрации ATP (Boldyrev et al., 1998). Долговременная регуляция осуществляется протеинкиназами/протеинфосфатазами, фосфорилирующими и дефосфорилирующими фермент по остаткам тирозина, серина и треонина. Так, фосфорилирование Ser-938 (сАМР-зависимой протеинкиназой А), а также Ser-11 и Ser-18 (Са-фосфолипид-зависимой протеинкиназой С) приводит к ингибированию фермента (Лопина, 2001). Соответствующие протеинфосфатазы, вызывая дефосфорилирование фермента, могут приводить к восстановлению его активности. Известна долгосрочная регуляция Na/K-АТРазы и на гормональном уровне, она реализуется через запуск синтеза новых молекул Na/K-АТРазы, например, при помощи альдостерона. Кроме того, в первичной структуре Na/K-АТРазы был обнаружен мотив, участвующий в связывании актина (Mobasheri et al., 2000). Это говорит о возможной регуляции фермента со стороны цитоскелета.

Ингибирование активности Na/K-АТРазы сердечными гликозидами приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ионов Na+, при этом Na-градиент может использоваться для активации Na/Са-обменника, приводящей к восстановлению внутриклеточного фонда кальция. В кардиомиоцитах это вызывает рост частоты сердечных сокращений, а при длительном воздействии приводит к гипертрофии клеток (Xie, Askari, 2002). Последнее обстоятельство связывают с отсроченным ответом ткани, при котором индуцируется Са2+-зависимая экспрессия генов раннего ответа (c-fos, c-jun) и запускается ERK 1/2 каскад, в котором принимают участие митоген-активируемые протеинкиназы (Schoner, 2002). Было показано, что активация этого сигнального каскада происходит независимо от изменения концентрации ионов Na+ (Liu et al., 2000). Так, в нейронах низкие концентрации уабаина стимулируют рост сАМР в цитоплазме и Na/Ca-обмен. Высокие концентрации уабаина приводят к увеличению цитоплазматического натрия, кальция и закислению цитоплазмы.

У крыс уабаин-чувствительные изоформы а-субъединицы (а2 и аЗ) встречаются только в некоторых органах (в сердце, мозге). Таким образом, возможно, что начинающийся на клеточной мембране сигнал, который вовлекает молекулы Na/K-АТРазы в передачу информации внутрь клетки, является тканеспецифичным. Сигнал, образующийся на мембране при связывании уабаина с Na/K-АТРазой, передается внутриклеточным белкам, способным взаимодействовать с ферментом. В клетках разных

18

тканей в передаче сигнала от фермента внутрь клетки, по-видимому, могут принимать участие различные белки с формированием разнообразных сигнальных каскадов. Наличие в разных тканях различных изоформ Na/K-АТРазы, различающихся по своим свойствам (сродство к уабаину, устойчивость к окислению) и структурным последовательностям, которые могут содержать мотивы для связывания специфичных белков, может подтверждать правильность этой гипотезы. Это обстоятельство придает особое значение тканевой специфичности экспрессии в клетках различных изоформ Na/K-АТРазы, различающихся по сродству к уабаину, устойчивости к окислению и особенностям вовлечения в механизмы клеточной сигнализации (Xie, Cai, 2003).

Связывание с Na/K-АТРэзой уабаина и родственных ему соединений, относящихся к классу сердечных гликозидов, вызывает экспрессию генов, рост и пролиферацию клеток (Aizman et al., 2000). Взаимодействие фермента с рядом растворимых и мембранных белков необходимо для осуществления функции клеточной сигнализации, а не для выполнения насосной функции, как считалось ранее. В структуре Na/K-АТРазы обнаружены два кавеолин-связывающих мотива, причем один расположен рядом с уабаин-связывающим центром (Zundel et al., 2001). Существует предположение о наличии в клетке двух пулов Na/K-АТРазы: один выполняет преимущественно насосную функцию, второй же в основном играет рецепторную роль и зависит от связи с кавеолином (Liang et al., 2007). При ингибировании синтеза кавеолина наблюдается усиление насосной функции Na/K-АТРазы, в то же время ее рецепторная роль в клетке снижается. Однако это было бы слишком простым обяснением, и, действительно, недавно были опубликованы данные, противоречащие выщеуказанному предположению (Liu et al.,

Рис. 7. Участки возможного взаимодействия al-еубъедииицы Na/K-АТРазы с кавеолином (Xie и Cai, 2003). М1-М10 - трансмембранные сегменты, СВМ -кавеолин связывающие мотивы

2011).

С

Xie и коллеги постулировали существование рецепторного комплекса между Na/K-АТРазой и Src-киназой, которая относится к семейству нерецепторных тирозиновых киназ (Tian et al., 2006). В составе Src-киназы выделяют несколько функциональных доменов: 1) БШ-домен, способный связываться с мембраной, 2) БЮ-домен, связывающий полипролиновый мотив, 3) 8Н2-домен, взаимодействующий с фосфорилированными остатками тирозина, 4) линкерный участок, связывающий 8Н2-домен и SH1-домен и отвечающий за регулирование киназной активности, 5) SH1-домен - консервативный киназный домен, 6) регуляторный С-концевой участок. Для киназной активности необходимо образование солевого мостика между Е312 и К297. В клетке киназную активность способны регулировать два консервативных остатка тирозина - Y418 и Y529. Автофосфорилирование по Y418 стабилизирует Src-киназу в активном состоянии. Фосфорилирование по Y529 приводит к взаимодействию этого остатка с 8Н2-доменом, что препятствует образованию солевого мостика между Е312 и К297 и приводит к дезактивации Src-киназы. Na/K-АТРаза вместе с Src-киназой присутствует в кавеолярной фракции, их взаимодействие было также выявлено методом ко-локализации, FRET и GST pull-down. Было показано, что взаимодействие Na/K-АТРазы с Src-киназой удерживает последнюю в неактивном состоянии, что осуществляется путем взаимодействия CD3-домена (входящего в состав N-домена) al-субъединицы Na/K-АТРэзы и SH1 -домена Src-киназы. СБ2-домен (входящий в состав А-домена) al-субъединицы Na/K-АТРазы и SH2-домен Src-киназы также могут взаимодействовать между собой.

Связывание уабаина приводит к конформационным изменениям Na/K-АТРазы и высвобождает киназный домен, происходит автофосфорилирование по Y418 и Src-киназа активируется. При этом изменения фосфорилирования по Y529 домену не происходит (Li, Xie, 2008). Был синтезирован пептид pNaKtide, содержащий 20 аминокислот и способный ингибировать действие уабаина через Na/K-ATPa3a/Src рецепторный комплекс путем взаимодействия с Src-киназой в этом комплексе (Li et al., 2009).

Было показано, что активация Src-киназы под действием уабаина приводит к фосфорилированию по тирозиновым остаткам множества белков, одним из которых является рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), который, в свою очередь, активирует ряд белков She, Grb2, Sos и Ras (см. рис. 8) (Kometiani et al., 1998). Последний является нетипичным G-белком и способен активировать сигнальный каскад Ras/Raf/ERKl/2. ERK 1/2 относится к семейству МАР-киназ.

клеточная адгезия, межклеточные взаимодействия

©I—А

синтез гликогена, дифференцировка клеток клеточный цикл

ядро

..................

__цАР-1 У

пп

активация генов, синтез белков

Рис. 8. Участие Na/K-АТРйзы в процессах передачи сигнала в клетке (Schoner, Schciner-Bobis, 2007).

Митоген-активируемые протеинкиназы (МАР-киназы) представляю собой класс серин-треонииовых протеи ншназ. Они играют важную роль в регуляции экспрессии генов. Получение ими активационного сигнала приводит к развитию ii клетке каскада реакций фосфорилирования. которые управляют работой факторов транскрипции или других регуляторных белков, что приводит к изменению экспрессии соответствующих генов (Pearson el а!., 2001). Существует несколько основных классов МАР-кипаз: киназы, регулируемые внеклеточными сигналами (уже упомянутые TRK1 и ERK2 - extracellular signal-regulated kinases, две изоформы), киназы N-конценой части фактора транскрипции Jim и киназы, активируемые при стрессорных воздействиях на клетки (JNK - NH2-terminal Juii kinase/SARC - stress-activatcd protein kinases) и группа МАРК p38. МАР-кипазы в свою очередь активируются киназами МАР-кипаз: МЕКI (МКК1 )/МГ.К2(МКК2) для ERK, JNKKI/SEK1/MKK4/MKK7 для JNK/SARC и МККЗ/МКК6 для МАРК р38. 1 [олипептидные цепи МАР-киназ обладают четко выраженной гомологией.

МАР-киназа способна действовать тремя путям и: 1) в результате транслокации в ядро с последующим фосфорилированием соответствующих факторов транскрипции; 2) путем фосфорилирования фактора трансприпции в цитоплазме, который сам проникает в ядро; 3) вследствие фосфорилирования ингибитора фактора транскрипции (который

находится в комплексе с фактором транскрипции), которое приводит к высвобождению и активации фактора транскрипции (Canman, Kastan, 1996).

Кроме того, существуют киназы МАРК- МАРКК киназы (или МАРККК). Их активирующее действие неспецифично, и в качестве их мишени могут выступать белки семейства Raf, МЕК-киназы (МЕКК), c-Mos и MLK (multilineage protein kinase). Повышение активности МАРК может происходить и за счет действия протеинкиназы С, которая участвует в передаче сигнала на фактор c-fos (Davis, 1993). Для активации ERK 1/2 под действием уабаина необходима совместная активация Ras и Са2+-зависимой протеинкиназы С (Azzi et al., 1992).

В дальнейшем было выявлено множество других внутриклеточных эффектов, происходящих в клетке в результате аппликации уабаина. Так, обнаружилось увеличение митохондриального уровня АФК, происходящее при участии Ras, при этом оно не зависит от уровня внутриклеточного Са2+ (Liu et al., 2000). АФК, в свою очередь, выступают в нейронах в качестве вторичного мессенджера (Bulygina et al., 2003) и приводят к активации генов позднего ответа. Снижение уровня АФК при действии антиоксидантов, таких, как N-ацетилцистеин, приводит к снижению активации ERK 1/2 (Xie et al., 1999). Даже небольшие дозы уабаина приводят к повышению уровня внутриклеточного кальция, который в свою очередь приводит к активации фактора транскрипции NF-kappa В (Aizman et al., 2001).

al-субъединица Na/K-АТРазы способна взаимодействовать с инозитол-3-фосфатным рецептором. Действие уабаина приводит к осцилляциям Са-токов, обусловленным этим взаимодействием (Miyakawa-Naito et al.). Уабаин вызывал структурные изменения, и это усиливало сигнал FRET, что объяснялось сближением двух белков. «Усечение» N-конца Na/K-АТРазы устраняло и Са-осцилляции, и активацию NF-kappa В. Было установлено, что N-концевой участок Na/K-АТРазы является регулятором инозитол-3-фосфатного рецептора (Liu et al., 2008).

Было показано, что действие уабаина приводит к активации фосфоинозитол-3-киназы (PI3K). Эта активация способна запускать сигнальный каскад, который приводит к активации протеинкиназы В (Akt) (Zhou et al., 2001). Это семейство серин/треониновых протеинкиназ, играющих ключевую роль в процессах метаболизма глюкозы, клеточной пролиферации, апоптоза и клеточной миграции. Активирование Akt приводит к увеличению синтеза белка, а также к блокированию апоптоза (Chen et al., 2005). Недавние исследования на клеточной линии мышиных фибробластов SYF, характеризующихся отсутствием трех киназ из Src-семейства (Src, Yes и Fyn), показали, что активация Akt

происходит и в этих типах клеток, что является доказательством независимости активации PI3K-Akt сигнального пути под действием уабаина от Src-киназы (Wu et al., 2011).

В нейрональных клетках некоторые нейромедиаторы и гормоны способны модулировать функционирование Na/K-АТРазы. Так, например, норадреналин, действующий через alA-адренорецепторы, активирует насосную функцию Na/K-АТРазы через дефосфорилирование фермента с помощью кальцийнейрина (Mallick et al., 2010). Морфин увеличивает активность Na/K-АТРазы в полосатом теле через допаминергические механизмы (Wu et al., 2007). Этанол ингибирует Na/K-АТРазу, что приводит к увеличению активности клеток Гольджи в мозжечке, характерному для алкоголь-вызванной атаксии (Botta et al., 2010).

Водный канал, создаваемый в мембране аквапорином 4 (AQP4), экспрессируется в астроцитах и играет ключевую роль в переносе ионов К+ и глутамата, высвобождающихся и клеток в результате нейрональной активности. Есть доказательства, что AQP4 формирует макромолекулярный комплекс с метаботропным глутаматным рецептором mGluR5 и Na/K-АТРазой, формируя транспортный микродомен в астроцитах (Illarionova et al., 2010). Никотиновый ацетилхолиновый рецептор и а2-изоформа Na/K-АТРазы способны взаимодействовать друг с другом (Heiny et al., 2010). аЗ-субъединица при связывании с агрином способна регулировать экспрессию и локализацию постсинаптических никотиновых рецепторов в нервно-мышечном синапсе (Doi,Iwasaki,

2008). В миелинизированных аксонах Na/K-АТРаза участвует в процессах восстановления мембранного потенциала. Взаимодействие лигандов с аксоном изменяет экспрессию Na/K-АТРазы в миелинизированных клетках - как олигодендроциты, так и шванновские клетки синтезируют одну и ту же а2-субъединицу Na/K-АТРазы, однако ß-субъединицы в ферментативных ансамблях различны (Fink et al., 1996).

При повреждениях нейрональных и глиальных клеток снижение активности Na/K-АТРазы лежит в основе развития гипоксии, ишемии, гипогликемии и других отклонений, связанных с повреждениями функции митохондрий (Benarroch, 2011). Изменение концентрации ионов Na+ и К+ в нейронах ведет к изменению мембранного потенциала, снижению активности глутаматных транспортеров, захвату клетками ионов Са2+, СГ и воды. Активация глутаматных и потенциал-зависимых каналов ведет к обращению активности Na/Са-обменника и снижению выброса Са2+ из клетки, и это может быть непосредственной причиной повреждения серого и белого вещества мозга (Kahle et al.,

2009).

Эпилепсия может быть вызвана мутацией в аЗ-субъединице Na/K-АТРазы - эта мутация понижает насосную функцию Na/K-АТРазы и приводит к повышенной

23

возбудимости нейронов (Clapcote et al., 2009). При мутациях в гене, кодирующем а2-субъединицу, наблюдается изменение электрических характеристик клетки, снижение аккумуляции К+ и глутамата клетками глии. Это лежит в основе одной из разновидностей мигрени (de Vries et al., 2009). При паркинсонизме также выявлены мутации в аЗ-субъединице Na/K-АТРэзы (de Carvalho et al., 2004). При рассеянном склерозе также снижается активность Na/K-АТРазы, что приводит к накоплению внеклеточного Na+ и Са2+ и вызывает дегенерацию аксонов (Black et al., 2007). Кроме того, снижение функции Na/K-АТРазы может играть важную негативную роль в хронической диемилизации аксонов (Mahad et al., 2009).

Было показано, что синтезирующийся в ЦНС белок агрин способен связываться только с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы и запускать все те же процессы, что активируются при действии кардиотонических стероидов, что является подтверждением того, что нейрональные клетки действительно используют Na/K-АТРазу как регулятор внутриклеточных процессов. Протеолитический фрагмент такого белка способен блокировать участок связывания КТС и агрина и, таким образом, выступать в качестве ингибитора действия КТС (Hilgenberg et al., 2006).

Na/K-АТРаза принимает участие в обмене глутамата. Благодаря созданию Na+-градиента Na/K-АТРаза обеспечивает обратный захват глутамата в астроцитах. Было показано взаимодействие между глутаматными транспортерами GLT-1 и GLAST и а2-субъединицей Na/K-АТРазы (Rose et al., 2009).

Было показано, что увеличение концентрации глутамата приводит к увеличению на клеточной поверхности белков GLAST и у-субъединицы Na/K-АТРазы и это приводит к увеличению захвата глутамата и активации насосной функции клеток (Gegelashvili et al., 2007). Na/K-АТРаза может регулировать активность глутаматных транспортеров через механизмы фосфорилирования. Эти факты указывают на возможное существование макромолекулярных комплексов с участием Na/K-АТРазы и глутаматных транспортеров, которые могут работать на клеточной мембране как единая функциональная единица.

Было также обнаружено, что Na/K-АТРаза способна образовывать функциональный комплекс с ионотропными глутаматными рецепторами АМРА-класса. Связывание уабаина с Na/K-АТРазой приводит к протеолизу АМРА-рецепторов в нейронах, что замедляет процесс передачи сигнала в синапсах (Zhang et al., 2009). В литературе существуют также некоторые данные о возможном взаимодействии Na/K-АТРазы и ионотропных глутаматных рецепторов NMDA-класса (Болдырев и соавт.., 2004).

1.5. NMDA-рецептор: общая характеристика

Глутаматергические нейроны составляют более 50% всех возбуждающих нейронов ЦНС. Они обеспечивают такие функции головного мозга, как обучение, выработка поведенческих реакций, запоминание. По механизму передачи сигнала в клетку глутаматные рецепторы подразделяются на два основных подтипа - метаботропные и ионотропные (Michaelis, 1998).

Метаботропные глутаматные рецепторы действуют через систему вторичных посредников, сопряженных с G-белками на мембране клеток. По типу агонистов и внутриклеточных сигнальных механизмов данные рецепторы подразделяются на три группы (Gerber et al., 2007). Метаботропные рецепторы I группы осуществляют Са2+-зависимую передачу возбуждения и действуют посредством образования инозитол-1,4,5-трисфосфата и диацилглицерола (Ribeiro et al., 2010). Метаботропные рецепторы II и III групп осуществляют Са2+-независимую передачу сигнала, их вторичными мессенджерами являются сАМР и cGMP (Carlton et al., 2011). Основной функцией метаботропных глутаматных рецепторов является метаболическая регуляция внутриклеточных процессов, в том числе и регуляция работы ионотропных рецепторов (Asztely, Gustafsson, 1996).

Ионотропные рецепторы изменяют мембранную проницаемость для катионов, что приводит к деполяризации мембраны и возникновению возбуждающего потенциала. По структуре и названию специфических агонистов выделяют NMDA-активируемые (NMDA - N-метил-О-аспартат), АМРА-активируемые (2-амино-3-(5-метил-3-оксо-1,2-оксазол-4-ил)пропановая кислота) и каинатные рецепторы (Stawski et al., 2010). Каналы NMDA-рецепторов высоко проницаемы для Са2+, в то время как АМРА-рецепторы практически непроницаемы для этого иона, хотя обладают проводимостью для Na+ и К+. AMP А- и каинатные рецепторы участвуют в большинстве видов быстрой синаптической передачи (Brauner-Osborne, 2000). Ионы Mg2+ блокируют NMDA-рецептор.

NMDA-рецепторы участвуют в формировании памяти и выработке поведенческих реакций (Morris, Davis, 1994). Они располагаются в кортикальных структурах, базальных ганглиях и сенсорно-ассоциативных системах. Кроме того, в нашей лаборатории было показано наличие NMDA-рецепторов в лимфоцитах (Mashkina et al., 2007) и нейтрофилах (Брюшкова и соавт.., 2011), что может свидетельствовать об участии этих рецепторов в реализации связи нервной и иммунной систем.

NMDA-рецепторы представляют собой олигомерный комплекс, формируемый комбинацией двух субъединиц NRi и двух субъединиц NR2 (Grimwood et al., 1995). Иногда в состав комплекса входит также и №1з-субъединица. Каждая из субъединиц

25

NMDA-рецептора представлена рядом изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга (Chen, Lipton, 2006). Природным лигандом NMDA-рецепторов являегся L-глутамат, который связывается с N R i-су бъе д и н и це й. В качестве природных ко-агонистов NMDA-рецепторов выступают глицин и/или D-серин, которые связываются с NRi-субъединицей.

В настоящее время идентифицированы нуоеотидные последовательности всех компонентов NMDA-рецепторо»: это постоянно эКСПрессйруемая NR]-субъсдиница. семейство NRi-субъсдиниц (NRiA - NRiD) и два варианта NR^-субп.единипы (NR3A и NR3B) (Mcllhinney et al., 2003). Каждая субъсдиница рецептора представляет собой интегральный белок, состоящий из трех пронизывающих мембрану доменов (обозначены I, III, IV на рис. 9) и одного «ложного» траисмембранного домена (II на рис. 7). заякоренного в мембране (re-entrant loop). N-конец белка выходит во внеклеточное пространство, а С-конец локализован в цитоплазме.

• Агомисты О Конкурентные антагонисты : Канальные а Коагонисты © Глициновые антагонисты ^блокагоры

Д Полиамииовые антагонисты

■ Модуляторы

О

П. Zn2'

Рис. 9. NMDA-рецептор (Danysz, Parsons, 1998)

NRl-cyбъединица может существовать в восьми изоформах. образующихся за счет наличия трех участков сплайсинга. В последовательности, кодирующей |-субъединицу, па ТМ-конце расположена вставка из 63 пар нуклеотидов, гак называемая N1-«кассета» (экзон 5), а на С-конце расположены две С-концевых «кассеты»: С|-«кассета» (экзон 21) и С2-«каесета» (экзон 22). Результатом сплайсинга но этим регионам являются 8 изоформ N К1 -субъединицы (!а,Ь;2а,Ь;За,Ь;4а,Ь) (/икт. Веппеи, 1995). Участок связывания глицина находится на N К | -субъедин и це.

ЫКг-субъединица содержит участок связывания глутамата. NR2B-, С- и D-субъединицы имеют сплайс-варианты по 5 нетранслируемым регионам. Для NR2A-субъединицы сплайс-вариантов на сегодняшний день не найдено. Наиболее часто экспрессируются NR2A и NR2B субъединицы, уровень экспрессии всех субъединиц зависит от стадии развития организма и от вида ткани. М^А-субъединица вовлекается в развитие долговременной потенциации (long-term potentiation), a NR2 В-субъед и ни ца - в развитие долговременной депрессии (long-term depression) (Massey et al., 2004). Однако различия в функциональной активности у изоформ N И^-субъединицы достаточно четко не установлены.

ЫЯз-субъедииица не является обязательной для формирования функционально активного рецептора, но оказывает значительное регулирующее влияние на его работу. Так, ряд исследований свидетельствует о снижении Са-тока через канал NMDA-рецептора при формировании рецепторного комплекса, имеющего состав NR |/NR7X(A-D)/NR^A(B) (Matsuda et al., 2003). В модельной системе (Xenopus oocytes) совместная экспрессия субъединиц NR] и NR3A или NR3B (в отсутствие субъединиц NR2) приводит к формированию катионного канала с низкой проницаемостью для кальция, активируемого глицином и не чувствительного к агонистам - глутамату или NMDA (Chatterton JE, et al.., 2002).

В экспериментальной работе наиболее часто используются 2 ингибитора NMDA-рецептора. Соединение D-AP5 (0-2-амино-5-фосфонопентаноевая кислота) выступает в качестве селективного антагониста NMDA-рецептора, который способен связываться с участком связывания глутамата на №12В-субъединице (Davies et al., 1981). Соединение МК-801 (дизоцилпин) выступает в качестве блокатора ионного канала NMDA-рецептора (Gill et al., 1987).

В передаче сигнала в глутаматергических нейронах участвуют помимо NMDA-рецепторов АМРА-рецепторы и ГАМК-рецепторы. Однако NMDA-рецепторы играют в этом процессе ключевую роль, и в случае их блокирования (например, с помощью ионов Mg2+) развивается слабый сигнал, опосредованный активацией одних только АМРА-рецепторов. Такие синапсы называются «тихими синапсами» (Liao et al., 1995).

Деполяризация, вызванная АМРА-рецепторами, приводит к удалению ионов Mg2+ и, соответственно, к снятию блока с NMDA-рецепторов (Akerman, Cline, 2006). Этот процесс необходим для реализации долговременных процессов в глутаматергическом синапсе.

В формирующихся синапсах NR2-cyбъeдиницa NMDA-рецептора представлена М^В-субъединицей. Будет ли экспрессироваться М12А-субъединица, зависит от

27

характера электрической активности в этом синапсе (Barria, Malinow, 2002). Дополнительная экспрессия N R2A -субъеди н ицы к №12В-субъединице является признаком развития нервной системы. Синаптические АМРА-рецепторы под влиянием NMDA-рецепторов подвергаются постоянной рециркуляции, при этом активация эндоцитоза может способствовать развитию долговременной депрессии (Beattie et al., 2000), а усиление процессов встраивания в мембрану - индукции долговременной потенциации (Shi et al., 2001).

После выделения в синаптическую щель L-глутамата первыми открываются каналы АМРА-рецепторов, которые обеспечивают быструю и краткую деполяризацию мембраны (Clements et al., 1998). NMDA-рецепторы, вследствие наличия так называемого М£2+-блока, вступают в процесс электрической активности с временной задержкой (Wyllie et al., 1998). Вызванная АМРА-рецептором деполяризация обеспечивает удаление из

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Аккуратов, Евгений Евгеньевич

выводы

1. Методами ко-иммунопреципитации и иммуноцитохимии показано структурное взаимодействие между al- и аЗ-субъединицами Na/K-АТРазы и NMDA-рецептором.

2. Показано, что связывание уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации ERK 1А, а связывание уабаина с a 1-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации Akt. NMDA-рецепторы не принимают участие в данных процессах.

3. Показано, что инкубация клеток с 1 цМ уабаина приводит к фосфорилированию N R2 В-су бъсдини цы NMDA-рецептора и усилению функции NMDA-рецептора, обеспечивающему увеличение входа Са2+ в нейрональную клетку.

4. Долговременная инкубация (более 1 ч) гранулярных клеток мозжечка с низкими концентрациями уабаина ведет к деградации NMDA-рецепторов, что отражает участие аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы в регуляции стабильности NMDA-рецепторов.

5. Показано, что активация NMDA-рецепторов в гранулярных клетках ведет к ингибированию a 1-субъединицы Na/K-АТРазы через увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и активацию протеинкиназы С.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность профессору Александру Александровичу Болдыреву за научное руководство диссертацией. Особую благодарность выражаю Карповой JI.B. и Степановой М.С., которые помогали мне на разных этапах выполнения работы. Благодарю профессора А. Веренинова и сотрудников его лаборатории за предоставленную возможность совместных исследовании в Институте Цитологии РАН, Санкт-Петербург. Благодарю профессора А. Аскари и сотрудников его лаборатории за предоставленную возможность совместных исследовании в University of Toledo, Огайо, США. Я признателен коллективу кафедры биохимии Биологического факультета МГУ за критические замечания, полезную дискуссию и дружескую профессиональную помощь, которуя я ощущал на всем протяжении работы над диссертацией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ma/if-АТРаза в нервной ткани тратит на свою работу около 50% ЛТР всей клетки. В нашей работе было показано, что одной из функций, выполняемой ею в гранулярных клетках мозжечка крысы, является регуляция работы NMDA-рецепторов. Действие кардиотонических стероидов, которые были найдены в мозге, способно влиять на функциональные свойства NMDЛ-рецептора через две изоформы а-субъединицы Na'K-АТРазы. Пели связывание уабаина с уабаин-чувствительной «3-субъединицей приводит к долговременной регуляции NMDA-рецептора и вызывает уменьшение молекул NMDA-рецептора в нейрональных клетках, то связывание уабаина с уабаин-резистентной а 1 -еубъединицей приводит к кратковременной регуляции NMDA-рецептора за счет тирозинового фосфорилирования ^2-субъсдиницы и усилению функции NMDA-рецептора. В свою очередь, активация NMDA-рецепторов приводит к ингибированию al-субъединицы Na/fC-АТРазы. Общая схема полученных результатов представлена на рис. 38. т§§\ш г ^: 1 час шмт

Рис. 38. Общая схема полученных результатов. Синими стрелками обозначено действие уабаина, красными -действие NJV1DA,

В последние годы в различных лабораториях независимо было показано, что Na/K-АТРаза играет ключевую роль в поддержании внутриклеточных сигнальных процессов в нейрональных клетках. Так, мутации в аЗ-субъединице приводили к развитию эпилепсии у мышей. Недавние исследования выявили, что агрин (белок, синтезирующийся исключительно в ЦНС) способен специфически связываться с аЗ-субъединицей, вызывая при этом те же эффекты, что и уабаин (Hilgenberg et al., 2006).

Чаще всего в литературе обсуждается вопрос о том, что взаимодействие уабаина с Na/K-АТРазой может включать различные сигнальные пути в нервной клетке. При этом упор в обсуждении делается на то, какие факторы являются специфическими или неспецифическими сигнальными молекулами для этого фермента (КТС, белки-партнеры или, возможно, неблагоприятные условия, например, недостаток АТР). Реже обращаетсявнимание на вероятность обратных взаимоотношений — невозможность развития сигнальных механизмов в нейроне в условиях активной Na/K-АТРазы. Этот аспект открывает совершенно новую страницу в изучении функции данного фермента и еще требует своего осмысления.

Так или иначе, результаты, полученные в нашей работе, представляются существенными для теоретической нейрохимии, так как они свидетельствуют о том, что организм способен через Na/K-АТРазу регулировать работу NMDA-рецепторов, играющих ключевую роль в синаптической пластичности и молекулярной памяти.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Аккуратов, Евгений Евгеньевич, 2012 год

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Болдырев А., Булыгина Е., Еерасимова О., Ляпина Л., Шонер В. (2004) Функциональная взаимосвязь между Na/K-АТРазой и NMDA-рецепторами в гранулярных клетках мозжечка крыс. Биохимия, 69 (4): 530 — 536.

2. Болдырев А.А. (1998) Механизмы возбуждения, повреждения и гибели нейронов. Природа, 7: 10-18.

3. Болдырев А.А. (2001). Na/K-АТРаза как олигомерный ансамбль. Биохимия, 66(8): 1013-1025.

4. Болдырев А.А., Булыгина Е.Р., Волынская Е.А., Курелла Е.Е., Тюлина О.В. (1995). Влияние пероксида водорода и гипохлорита на активность Na,K-ATPa3bi мозга. Биохимия, 60, 1618-1626.

5. Брюшкова Е.А., Владыченская Е.А., Степанова М.С., Болдырев А.А. (2011). Влияние гомоцистеина на свойства нейтрофилов, активированных in vivo. Биохимия, 76(4): 467-472.

6. Булыгина Е.Р., Ляпина Л.Ю., Болдырев А.А. (2002). Активация глутаматных рецепторов ингибирует Na/K-АТРазу гранулярных клеток мозжечка. Биохимия, 67, 1209-1214.

7. Булыгина, Е.Р., Карпова, Л.В., Степанова, М.С., Болдырев, А.А. (2009). Экспериментальная нейрохимия. Практические работы (электронная версия). Москва, «Икар».

8. Ко Чже Чжун, Болдырев А.А. (1978). Исследование влияния фосфолипаз на активность Na,К-АТРазы. Биохимия, 43, 2100-2104.

9. Лопина О.Д. (1999). Na/K-АТРаза: структура, функция, регуляция активности. Биол. мембр., 16: 584-603.

10. Лопина О.Д. (2001). Взаимодействие каталитической субъединицы №,К-АТРазы с клеточными белками и другими эндогенными регуляторами. Биохимия, 66 (10): 1122-1131

11. Пиндель, Е.В. (1992). Влияние лигандов на конформационного состояние Na/K-АТРазы. Дисс. канд. биол. наук, Москва.

12. Aizman О., Uhlen Р, Lal M., Brismar H., Aperia A. (2001) Ouabain, a steroid hormone that signais with slow calcium oscillations. Proc Natl Acad Sci USA., 98(23): 1342013424

13.Akerman CJ, Cline HT (2006). Depolarizing GABAergic conductances regulate the balance of excitation to inhibition in the developing retinotectal circuit in vivo. J. NeuroscL, 26: 511-517.

14. Antolovic R., Kost H., Mohadjerani M., Linder D., Linder M., Schoner W.( 1998) A specific binding protein for cardiac glycosides exists in bovine serum. J. Biol. Chem., 273,16259-16264.

15. Antolovic, R., Bauer, N., Mohadjerani, M., Kost, H., Neu, H., Kirch, U., Grunbaum, E.G. h Schoner, W. (2000) Endogenous ouabain and its binding globulin: effect of physical exercise andstudy on its tissue distribution. Hyperten Res. 593 —598.

16. Arystarkhova, E., Wetzel, R.K., Asinovski, N.K., Sweadner, KJ.(1999). The gamma subunit modulates Na(+) and K(+) affinity of the renal Na/K-ATPase. J. Biol. Chem., 21 A: 33183-33185.

17. Asztely F., Gustafsson B. (1996). Ionotropic glutamate receptors: Their role in the expression of hippocampal synaptic plasticity. MolNeurobioL, 12: 1-11.

18. Azzi A., Boscoboinik D., Hensey C. (1992) The protein kinase C family. European Journal of Biochemistry, 208: 181-191.

19. Bagrov AY, Shapiro JI, Fedorova OV. (2009) Endogenous cardiotonic steroids: physiology, pharmacology, and novel therapeutic targets. Pharmacol Rev., 61(1): 9-38.

20. Barria A, Malinow R. (2002). Subunit-specific NMDAR trafficking to synapses. Neuron, 35:3-45.

21. Beattie EC, Carroll RC, Yu X, Morishita W, Yasuda H, von Zastrow M, Malenka RC. (2000). Regulation of AMPA receptor endocytosis by a signaling mechanism shared with LTD. Nat Neurosci., 3(12): 1291-1300.

22. Benarroch EE. (2011). Na+, K+-ATPase: functions in the nervous system and involvement in neurologic disease. Neurology, 76(3): 287-293.

23. Bersier MG, Miksztowicz V, Peña C, Rodríguez de Lores Arnaiz G. (2005). Modulation of aspartate release by ascorbic acid and endobain E, an endogenous Na+, K+ -ATPase inhibitor. Neurochem Res., 30(4): 479-486.

24. Bersier MG, Peña C, Rodríguez de Lores Arnaiz G. (2008). The expression of NMD A receptor subunits in cerebral cortex and hippocampus is differentially increased by administration of endobain E, a Na+, K+-ATPase inhibitor. Neurochem Res., 33(1): 6672.

25. Black JA, Newcombe J, Trapp BD, Waxman SG. (2007). Sodium channel expression within chronic multiple sclerosis plaques. JNeuropathol Exp Neurol., 66(9): 828-837.

26. Boldyrev AA, Bulygina ER. (1997). Na/K-ATPase and oxidative stress. Ann N Y Acad Sci., 834: 666-668.

27. Botta P, de Souza FM, Sangrey T, De Schutter E, Valenzuela CF. (2010). Alcohol excites cerebellar Golgi cells by inhibiting the Na+/K+ ATPase. Neuropsychopharmacology, 35(9): 1984-1996.

28. Brauner-Osborne H. (2000) Ligands for glutamate receptors: design and therapeutic prospects. MedChem, 43:2609-2645.

29. Canman C.E., Kastan M.B. (1996) Three paths to stress relief. Nature, 384: 213-214.

30. Carlton SM, Zhou S, Govea R, Du J. (2011). Group II/III Metabotropic Glutamate Receptors Exert Endogenous Activity-Dependent Modulation of TRPV1 Receptors on Peripheral Nociceptors. JNeurosci., 31(36): 12727-12737.

31. Chan H, Babayan V, Blyumin E, Gandhi C, Hak K, Harake D, Kumar K, Lee P, Li TT, Liu HY, Lo TC, Meyer CJ, Stanford S, Zamora KS, Saier MH Jr. (2010). The p-type ATPase superfamily. J. Mol Microbiol Biotechnol. 19(1-2): 5-104.

32. Chatterton JE, Awobuluyi M, Premkumar LS, Takahashi H, Talantova M, Shin Y, Cui J, Tu S, Sevarino KA, Nakanishi N, Tong G, Lipton SA, Zhang D. (2002). Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature, 415(6873): 793-798.

33. Chen J, Somanath PR, Razorenova O, Chen WS, Hay N, Bornstein P, Byzova TV (2005). «Aktl regulates pathological oncogenesis, vascular maturation and permeability in vivo». Nat. Med., 11 (11): 1188-96

34. Chen, H.S., Lipton, S.A. (2006). The chemical biology of clinically tolerated NMDA receptor antagonists. J. Neurochem., 97: 1611-1626.

35. Clapcote SJ, Duffy S, Xie G, Kirshenbaum G, Bechard AR, Rodacker Schack V, Petersen J, Sinai L, Saab BJ, Lerch JP, Minassian BA, Ackerley CA, Sled JG, Cortez MA, Henderson JT, Vilsen B, Roder JC. (2009). Mutation 1810N in the alpha3 isoform of Na+,K+-ATPase causes impairments in the sodium pump and hyperexcitability in the CNS. Proc Natl Acad Sci USA, 106(33): 14085-14090.

36. Clements JD, Feltz A, Sahara Y and Westbrook GL (1998) Activation kinetics of AMPA receptor channels reveal the number of functional agonist binding sites. J Neurosci, 18: 119-127.

37. Danysz W, Parsons CG. (1998). Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacol Rev., 50(4): 597-664.

38. Davies J, Francis AA, Jones AW, Watkins JC. (1981). 2-Amino-5-phosphonovalerate (2APV), a potent and selective antagonist of amino acid-induced and synaptic excitation. Neurosci Lett., 21(1): 77-81.

39. Davis R.J. (1993) The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. The Journal of Biological Chemistry, 268: 14553-14556.

40. de Carvalho Aguiar P, Sweadner KJ, Penniston JT, Zaremba J, Liu L, Caton M, Linazasoro G, Borg M, Tijssen MA, Bressman SB, Dobyns WB, Brashear A, Ozelius LJ. (2004). Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP 1 A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron, 43(2): 169-175.

41. de Vries B, Frants RR, Ferrari MD, van den Maagdenberg AM. (2009). Molecular genetics of migraine. Hum Genet., 126(1): 115-132.

42. Dingledine R, Borges K, Bowie D, Traynelis SF. (1999). The glutamate receptor ion channels. Pharmacol Rev., 51(1): 7-61.

43. Dobretsov, M., Stimers, J.R. (2005). Neuronal function and alpha3 isoform of the Na/K-ATPase. Frontiers in Bioscience, 10: 2373-2396.

44. Doi M, Iwasaki K. (2008). Na+/K+ ATPase regulates the expression and localization of acetylcholine receptors in a pump activity-independent manner. Mol Cell Neurosci., 38(4): 548-558.

45. Emptage, N., Bliss, T.V., Fine, A. (1999). Single synaptic events evoke NMDA receptor-mediated release of calcium from internal stores in hippocampal dendritic spines. Neuron, 22: 115-124.

46. English LH, White B, Cantley LC. (1987) Membrane biochemistry of the ouabain-resistant potassium transport system. Hypertension, 10(5/2): 193-194.

47. Fink D, Knapp PE, Mata M. (1996). Differential expression of Na,K-ATPase isoforms in oligodendrocytes and astrocytes. DevNeurosci., 18(4): 319-326.

48. Garty H, Karlish SJ (2006). Role of FXYD proteins in ion transport. Annu Rev Physiol, 68:431-59.

49. Gegelashvili M, Rodriguez-Kern A, Sung L, Shimamoto K, Gegelashvili G. (2007). Glutamate transporter GLAST/EAAT1 directs cell surface expression of FXYD2/gamma subunit of Na, K-ATPase in human fetal astrocytes. Neurochem Int., 50(7-8): 916-920.

50. Gerber U, Gee CE, Benquet P. (2007). Metabotropic glutamate receptors: intracellular signaling pathways. Curr Opin Pharmacol. ,7(1): 56-61.

51. Gill R, Foster AC, Woodruff GN. (1987). Systemic administration of MK-801 protects against ischemia-induced hippocampal neurodegeneration in the gerbil. J Neurosci., 7: 33-43.

52. Gloor S., Antonicek H., Sweadner K.J., Pagliusi S., Frank R., Moos M., Schachner M. (1990). The adhesion molecule on glia (AMOG) Is a homologue of the |3 subunit of the Na,K-ATPase. J Cell Biol, 110: 165-174.

53. Gottlieb, S. S., Rogowski, A. C., Weinberg, M., Krichten, C.M., Hamilton, B.C.h Hamlyn, J.M.(1 992) Elevated concentrations of endogenous ouabain in patients with congestive heart failure. Circulation, 86, 420-425.

54. Grimwood S, Kulagowski JJ, Mawer IM, Rowley M, Leeson PD, Foster AC. (1995). Allosteric modulation of the glutamate site on the NMDA receptor by four novel glycine site antagonists. Eur J Pharmacol., 290(3): 221-226.

55. Gustavo Blanco and Robert W. Mercer (1998). Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am J Physiol Renal Physiol, 275: 633650.

56. Hamlyn, J.M. ,Lu, Z. , Manunta, P., Ludens, J. H., Kimura, K. ,Shah, J.R., Laredo, J., Hamilton, J. P. , Hamilton, M. J., Hamilton, B.P. (1998) Observations on the nature, biosynthesis, secretion and significance of endogenous ouabain. Clin. Exp. Hypertens. 20, 523-533.

57.Hatashi Y., Kameyama K., Kobayashi T., Hagiwara E., Shinji N., Takagi T. (1997). Oligomeric structure of solibilized Na+/K+-ATPase linked to E1/E2 conformation. Annals of the New York Academy of Sciences 834: 19-29.

58. Heiny JA, Kravtsova VV, Mandel F, Radzyukevich TL, Benziane B, Prokofiev AV, Pedersen SE, Chibalin AV, Krivoi II. (2010). The nicotinic acetylcholine receptor and the Na,K-ATPase alpha2 isoform interact to regulate membrane electrogenesis in skeletal muscle. J Biol Chem., 285(37): 28614-28626.

59. Hilgenberg LG, Su H, Gu H, O'Dowd DK, Smith MA. (2006). Alpha3Na+/K+-ATPase is a neuronal receptor for agrin. Cell, 125(2): 359-369.

60. Illarionova NB, Gunnarson E, Li Y, Brismar H, Bondar A, Zelenin S, Aperia A. (2010). Functional and molecular interactions between aquaporins and Na,K-ATPase. Neuroscience, 168(4): 915-925.

61. Inoue N, Soga T, Kato T. (1999). Glutamate receptors mediate regulation of Na pump isoform activities in neurons. Neuroreport, 10(16): 3289-3293.

62. J. David Sweatt (1999). Toward a Molecular Explanation for Long-Term Potentiation. Learn. Mem., 6: 399-416

63. Jorgensen, P. L., Hakansson, K.O., Karlish, S. J. D. (2003). Structure and mechanism of Na/K-ATPase: Functional sites and their interactions. Annu. Rev. Physiol, 65: 817-849.

64. Kahle KT, Simard JM, Staley KJ, Nahed BV, Jones PS, Sun D. (2009). Molecular mechanisms of ischemic cerebral edema: role of electroneutral ion transport. Physiology (Bethesda), 24: 257-265.

65. Kaplan, J.H. (2002). Biochemistry of Na/K-ATPase. Annu. Rev. Biochem., 71: 511-535.

66. Kometiani, P., Li, J., Gnudi, L., Kahn, B.B., Askari, A., Xie, Z. (1998). Multiple signal transduction pathways link Na/K-ATPase to growth-related genes in cardiac myocytes. J. Biol. Chem., 273: 15249-15256.

67. Koster J.C., Hatfield W.R., Blanco G., Mercer R.W. (1997). Characterization of Na,K-ATPase a/a oligomerization. Annals of the New York Academy of Sciences 834: 135138.

68. Krapivinsky G., Krapivinsky L., Manasian Y., Ivanoy A., Tyzio R., Pellegrino C., Ben-Ari Y., Clapham D. E. and Medina I. (2003). The NMDA receptor is coupled to the ERK pathway by a direct interaction between NR2B and RasGRF 1. Neuron, 40: 775-784.

69. Kunihiro M., Hideo M., Toshio T., Yutaro H. (1993). Change of oligomeric structure of solibilized Na+/K+-ATPase induced by octaethylene glycol dodecyl ether, phosphatidylserine and ATP. Biochimia et Biophysica Acta, 1145: 63-74.

70. Kurella EG, Tyulina OV, Boldyrev AA. (1999). Oxidative resistance of Na/K-ATPase. Cell Mol NeurobioL, 19(1): 133-140.

71. Laredo, J., Hamilton, J.P. h Hamlyn, J.M. (1995) Secretion of endogenous ouabain from bovine adrenal cells.Ro le of zona glomerulosa and zona fasciculata. Biochem. Biophys. Res. Commun., 212, 487-493

72. Lau LF, Huganir RL. (1995). Differential tyrosine phosphorylation of N-methyl-D-aspartate receptor subunits. J Biol Chem., 270(34): 20036-20041.

73. Leonard AS, Hell JW. (1997). Cyclic AMP-dependent protein kinase and protein kinase C phosphorylate N-methyl-D-aspartate receptors at different sites. J Biol Chem., 272(18): 12107-12115.

74. Li Z, Cai T, Tian J, Xie JX, Zhao X, Liu L, Shapiro JI, Xie Z. (2009). NaKtide, a Na/K-ATPase-derived peptide Src inhibitor, antagonizes ouabain-activated signal transduction in cultured cells. J Biol Chem., 284(31): 21066-21076

75. Li Z., Xie Z. (2008) The Na,K-ATPase/Src complex and cardiotonic steroid-activated protein kinase cascades. Pfliigers Archiv - European Journal of Physiology, 457(3): 635644.

76. Liang M, Tian J, Liu L, Pierre S, Liu J, Shapiro J, Xie ZJ. (2007) Identification of a pool of non-pumping Na/K-ATPase. J Biol Chem., 282(14): 10585-10593.

77. Liao D, Hessler NA, Malinow R. (1995). Activation of postsynaptically silent synapses during pairing-induced LTP in CA1 region of hippocampal slice. Nature, 375-400.

78. Lieberman DN, Mody I. (1994). Regulation of NMDA channel function by endogenous Ca(2+)-dependent phosphatase. Nature, 369(6477): 235-239.

79. Lingrel JB (2010) The physiological significance of the cardiotonic steroid/ouabain-binding site of the Na,K-ATPase. Annu Rev Physiol72: 395-412.

80. Liu L, Ivanov AV, Gable ME, Jolivel F, Morrill GA, Askari A. (2011). Comparative properties of caveolar and noncaveolar preparations of kidney Na/K-ATPase. Biochemistry (in press).

81. Liu, J., Tian, J., Haas, M., Shapiro, J.I., Askari, A., Xie, Z. (2000). Ouabain interaction with cardiac Na/K-ATPase initiates signal cascades independent of changes in intracellular Na+ and Ca2+ concentrations. J. Biol. Chem., 275: 27838-27844.

82. Liu, X., Spicarova, Z., Rydholm, S., Li, J., Brismar, H., Aperia, A. (2008). Ankyrin B modulates the function of Na/K-ATPase/Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor signaling microdomain, J. Biol. Chem., 283: 11461-11468.

83. Low CM, Lyuboslavsky P, French A, Le P, Wyatte K, Thiel WH, Marchan EM, Igarashi K, Kashiwagi K, Gernert K, Williams K, Traynelis SF, Zheng F. (2003). Molecular determinants of proton-sensitive N-methyl-D-aspartate receptor gating. Mol Pharmacol., 63(6): 1212-1222.

84. Lucking K., Nielsen J.M. (1997). Abundance of a3, a2, and al isoforms of Na,K-ATPase in rat kidney as estimated by competitive RT-PCR and [3H] ouabain binding. Annals of the New York Academy of Sciences 834: 107-109.

85. Mahad DJ, Ziabreva I, Campbell G, Lax N, White K, Hanson PS, Lassmann H, Turnbull DM. (2009). Mitochondrial changes within axons in multiple sclerosis. Brain, 132(Pt 5): 1161-1174.

86. Mallick BN, Singh S, Singh A. (2010). Mechanism of noradrenaline-induced stimulation of Na-K ATPase activity in the rat brain: implications on REM sleep deprivation-induced increase in brain excitability. Mol Cell Biochem., 336(l-2):3-16.

87. Mashkina A.P., Tyulina O.V., Solovyova T.I., Kovalenko E.I., Kanevski M., Johnson P., Boldyrev A. A. (2007) The excitotoxic effect of NMDA on human lymphocyte immune function. Neurochem. Int, 51: 356-360.

88. Massey PV, Johnson BE, Moult PR, Auberson YP, Brown MW, Molnar E, Collingridge GL, Bashir ZI. (2004). Differential roles of NR2A and NR2B-containing NMDA receptors in cortical long-term potentiation and long-term depression. J Neuroscl, 24(36): 7821-7828.

89. Mathews, W.R.,DuCharme, D.W.,Hamlyn, J.M.,Harris, D.W., Mandel, F., Clark, M.A. h Ludens, J.A. (1991) Mass spectral characterization of an endogenous digitalis-like factor from human plasma. Hypertension, 17, 930-935.

90. Matsuda K, Fletcher M, Kamiya Y, Yuzaki M. (2003). Specific assembly with the NMDA receptor 3B subunit controls surface expression and calcium permeability of NMDA receptors. JNeuroscl, 23(31): 10064-10073.

91. Mayer ML, Vyklicky L Jr, Clements J. (1989). Regulation of NMDA receptor desensitization in mouse hippocampal neurons by glycine. Nature, 338(6214): 425-427.

92. Mcllhinney, R.A., Philipps, E., Le Bourdelles, B., Grimwood, S., Wafford, K., Sandhu, S., et al.. (2003). Assembly of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Biochem. Soc. Trans., 31: 865-868.

93. Michaelis EK. (1998). Molecular biology of glutamate receptors in the central nervous system and their role in excitotoxicity, oxidative stress and aging. Prog Neurobiol., 54(4): 369-415:

94. Miyakawa-Naito, A., Uhlen, P., Lai, M., Aizman, O., Mikoshiba, K., Brismar, H., Zelenin, S., Aperia, A. (2003). Cell signaling microdomain with Na/K-ATPase and Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor generates calcium oscillations, J.Biol.Chem., 278: 50355-50361.

95.Mobasheri A., Avila J., Cozar-Castellano I., et al.l. (2000) Na,K-ATPase isozyme diversity; Comparative biochemistry and psysiological implications of novel functional interaction. Bioscience Reports, 20: 51-91.

96. Morris, R.G.M., Davis. M. (1994). The role of NMDA receptors in learning and memory. 2nd ed. New York: Oxford University Press.

91. Morth, J. P., Poulsen, H., Toustrup-Jensen, M.S., Rodacker Schack, V., Egebjerg, J., Andersen, J.P., Vilsen, B., Nissen P. (2009). The structure of the Na/K-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations. Phil. Trans. R. Soc., 364: 217-227.

98. Moseley AE, Williams MT, Schaefer TL, Bohanan CS, Neumann JC, Behbehani MM, Vorhees CV, Lingrel JB. (2007). Deficiency in Na,K-ATPase alpha isoform genes alters spatial learning, motor activity, and anxiety in mice. J Neuroscl, 27(3): 616-626.

99. Ogawa H, Shinoda T, Cornelius F, Toyoshima C. (2009). Crystal structure of the sodium-potassium pump (Na+,K+-ATPase) with bound potassium and ouabain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(33): 13742-13747.

100. Pearson G., Robinson F., Gibson Т. В., Xu В., Karandikar M., Berman K., Cobb M. H. (2001) Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions. Endocrine Reviews, 22(2): 153-183.

101. Post R.L, Hegyvary C, Kume S. Activation by adenosine triphosphate in the phosphorylation kinetics of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase (1972). J Biol Chem., 247(20): 6530-6540.

102. Qazzaz,H.M., El-Masri,M.A. и Valdes, RJ. (2000) Secretion of a lactone-hydrogenated ouabain-like effector of sodium, potassium-adenosine triphosphatase activity by adrenal cells. Endocrinology, 141, 3200—3209.

103. Rei^s А, Репа C, Rodriguez de Lores Arnaiz G. (2001). [3H]dizocilpine binding to N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor is modulated by an endogenous Na+, K+-ATPase inhibitor. Comparison with ouabain. Neurochem Int., 39(4): 301-310.

104. Ribeiro FM, Paquet M, Cregan SP, Ferguson SS. (2010). Group I metabotropic glutamate receptor signalling and its implication in neurological disease. CNS Neurol Disord Drug Targets., 9(5): 574-595.

105. Rose EM, Koo JC, Antflick JE, Ahmed SM, Angers S, Hampson DR. (2009). Glutamate transporter coupling to Na,K-ATPase. JNeurosci., 29(25): 8143-8155.

106. Rosner W., Hryb D.J., Khan M.S., Nakhla A.M., Romas N.A. (1999) Sex hormone-binding globulin mediates steroid hormone signal transduction at the plasma membrane. J. SteroidBiochem. Mol. Biol., 69, 481^185.

107. Salter MW, Kalia LV. (2004). Src kinases: a hub for NMDA receptor regulation. Nat Rev Neurosci. ,5(4): 317-328.

108. Sandtner W, Egwolf B, Khalili-Araghi F, Sanchez-Rodriguez JE, Roux B, Bezanilla F, Holmgren M. (2011). Ouabain binding site in a functioning Na+/K+ ATPase. J Biol Chem. (в печати)

109. Sarvazyan NA, Ivanov A, Modyanov NN, Askari A (1997). Ligand-sensitive interactions among the transmembrane helices of Na+/K+-ATPase. J Biol Chem., 272(12): 7855-7858.

110. Schoner W, Scheiner-Bobis G. (2007). Endogenous and exogenous cardiac glycosides: their roles in hypertension, salt metabolism, and cell growth. Am J Physiol Cell Physiol., 293(2): 509-536.

111. Schoner, W. (2002). Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones. Eur. J. Biochem., 269: 2440-2448.

112. Shi S, Hayashi Y, Esteban JA, Malinow R. (2001). Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell, 105(3): 331-343.

113. Shinoda, T., Ogawa, H., Cornelius, F., Toyoshima. C., (2009). Crystal structure of the sodium-potassium pump at 2.4A° resolution, Nature, 459: 446-451.

114. SkouJC, EsmannM. (1992). The Na,K-ATPase. Bioenerg Biomembr. 24(3): 249-61.

115. Stawski P, Janovjak H, Trauner D. (2010). Pharmacology of ionotropic glutamate receptors: A structural perspective. Bioorg Med Chem., 18(22): 7759-7772.

116. Stelmashook, E.V., Weih, M., Zoro, D., Victorov, I., Dirnagl, U., Isaev, N. (1999). Short-term block of Na./K.-ATPase in neuro-glial cell cultures of cerebellum induces glutamate dependent damage of granule cells. FEBS Letters, 456: 41-44.

117. Sweadner, K.J., Rael, E. (2000). The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression. Genomics, 68: 41—56.

118. Tian J, Cai T, Yuan Z, Wang H, Liu L, Haas M, Maksimova E, Huang XY, Xie ZJ. (2006) Binding of Src to Na+/K+-ATPase forms a functional signaling complex. Mol Biol Cell., 17(1): 317-326.

119. Tong G, Jahr CE. (1994). Regulation of glycine-insensitive desensitization of the NMDA receptor in outside-out patches. JNeurophysiol., 72(2): 754-761.

120. Tong G, Shepherd D, Jahr CE. (1995). Synaptic desensitization of NMDA receptors by calcineurin. Science, 267(5203): 1510-1512.

121. Toyoshima, C., Nakasako, M., Nomura, H., Ogawa, H. (2000). Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6A resolution. Nature, 405: 647-655.

122. Van Dongen AM, editor (2009). Biology of the NMDA Receptor. CRC Press

123. Wang J.Q., Fibuch E.E., Mao L. (2007). Regulation of mitogen-activated protein kinases by glutamate receptors. Journal ofNeurochemistry, 100: 1-11.

124. Wang, J. Q., Tang, Q., Parelkar, N. K., Liu, Z., Samdani, S., Choe, E. S., Yang, L., Mao, L. (2004). Glutamate signaling to Ras-MAPK in striatal neurons. Mol. Neurobiol., 29: 1-14.

125. Wu ZQ, Chen J, Chi ZQ, Liu JG. (2007). Involvement of dopamine system in regulation of Na+,K+-ATPase in the striatum upon activation of opioid receptors by morphine. Mol Pharmacol., 71(2): 519-530.

126. Wyllie DJA, Behe P and Colquhoun D (1998) Single-channel activations and concentration jumps: Comparison of recombinant NRla/NR2A and NRla/NR2D NMDA receptors. J Physiol (Lond), 510: 1-18.

127. Xie Z., Askari A. (2002). Na+/K+-ATPase as a signal transducer. Eur. J. Biochem., 269: 2434-2439.

128. Xie Z., Cai T. (2003). Na+-K+-ATPase-mediated signal transduction: from protein interaction to cellular function. Mol Interv., 3(3): 157-168.

129. Xie, Z., Kometiani, P., Liu, Li, J.J., Shapiro, J.I., Askari, A. (1999). Intracellular reactive oxygen species mediate the linkage of Na/K-ATPase to hypertrophy and its marker genes in cardiac myocytes. J.Biol.Chem., 274: 19323-19328.

130. Xie, Z., Wang Y., Askari, A., Huang, W., Klaunig, J.E., Askari, A. (1990). Studies on the specificity of the oxygen free radical effects on cardiac sodium pump. J. Mol. Cell. Cardiol, 22: 911-920.

131. Yoshika M, Komiyama Y, Takahashi H. (2011) Isolation of marinobufotoxin from the supernatant of cultured PC12 cells. Clin Exp Pharmacol Physiol., 38(5) 334-337

132. Zhang D, Hou Q, Wang M, Lin A, Jarzylo L, Navis A, Raissi A, Liu F, Man HY. (2009). Na,K-ATPase activity regulates AMPA receptor turnover through proteasome-mediated proteolysis. JNeurosci., 29(14): 4498-4511.

133. Zheng F, Gingrich MB, Traynelis SF, Conn PJ. (1998). Tyrosine kinase potentiates NMDA receptor currents by reducing tonic zinc inhibition. Nat Neurosci., 1(3): 185-191.

134. Zhou, X., Jiang, G., Zhao, A., Bondeva, T., Hirszel, P., Balla, T. (2001). Inhibiton of Na/K-ATPase activates PI3 kinase and inhibits apoptosis in LLC-PK1 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 285: 46-51.

135. Zukin RS and Bennett MVL (1995) Alternatively spliced isoforms of the NMDARI receptor subunit. Trends Neurosci, 18: 306—313.

136. Zundel W., Swiersz L., Giaccia A. (2000). Caveolin Mediated Regulation of Receptor Tyrosine Kinase-Associated Phosphatidylinosytol 3-Kinase Activity by Ceramide. Mol Cell Biol., 1507-1514.