Определение пространственной структуры человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора 1 класса GPCR тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Лугинина Александра Павловна

• Лугинина Александра Павловна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Лугинина Александра Павловна

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цели и задачи работы

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Объем и структура диссертации

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Определение пространственной структуры рекомбинантных СРСЯ методом рентгеноструктурного анализа

1.1 Рецепторы, сопряженные с О-белком

1.2 Консервативные мотивы GPCR рецепторов класса А

1.3 Генетические конструкции для кристаллизации GPCR

1.4 Экспрессия GPCR

1.5 Очистка GPCR

1.6 Кристаллизация GPCR в липидной кубической фазе

1.7 Источники рентгеновского излучения для исследования пространственной структуры белков

2. Цистеинил-лейкотриеновый рецептор человека

2.1 Биосинтез лейкотриенов

2.2 Су8ЬТ^: характеризация, распределение в тканях, механизм передачи сигнала

2

2

2

Физиологическая роль в организме и связанные с рецептором патологии Лиганды CysLTlR

Анализ первичной последовательности и полиморфизмы CysLTlR

36

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы

1.1 Получение генетических конструкций и бакмиды

1.2 Экспрессия CysLTlR

1.3 Очистка и анализ CysLTlR

1.4 Кристаллизация CysLTlR

1.5 Плазмиды и штаммы клеток

2. Методы

2.1 Приготовление компетентных клеток

2.2 Получение генно-инженерных конструкций CysLTlR

2.3 Ведение клеточной культуры Б/9

2.4 Экспрессия СУБЬТШ в клетках насекомых

2.5 Выделение и очистка CysLTlR

2.6 Методы анализа белка

2.7 Кристаллизация CysLTlR

2.8 Получение дифракционных данных и решение структуры

2.9 Докинг лейкотриена и симуляция различных состояний кармана

2.10 Функциональные тесты

2.11 Исследование натриевого сайта CysLTlR

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Генно-инженерные конструкции Су8ЬТ1Я

1.1 Используемые методы клонирования

1.2 Оптимизация конструкций

1.3 Кристаллизационная конструкция

3

2. Оптимизация условий экспрессии

3. Оптимизация протокола очистки Су8ЬТ1Я

4. Кристаллизация СувЬТ^

4.1 Диффузия в липидной кубической фазе

4.2 Кристаллизация конструкций с К-концевым BRIL

4.3 Получение кристаллов CysLTlR

5. Анализ структуры Су8ЬТ^

5.1 Анализ кристаллографических данных

5.2 Проверка функциональности мутантных форм CysLTlR

5.3 Особенности архитектуры рецептора

5.4 Необычная конформация мотивов

5.5 Сайт связывания натрия

5.6 Лиганд-связывающий карман

5.7 Латеральный вход лиганда в карман

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), составляют важнейшее суперсемейство семиспиральных белков эукариот, состоящее у человека из более 800 представителей. Связываясь с лигандом, рецепторы передают внешний сигнал внутрь клетки [1]. Их роль в организме крайне разнообразна: от улавливания глазом фотонов света до регулирования иммунной системы, и её сложно переоценить. GPCR являются трудными объектами исследования, будучи трансмембранными белками, обладающими низкой стабильностью и уровнем экспрессии, и высокой конформационной подвижностью. Учитывая сложность работы с GPCR, актуальность темы в научном сообществе (более 1 миллиона результатов в Google scholar), а также тот факт, что данный класс белков является основной мишенью современной фармакологической индустрии [2], структурные исследования GPCR были удостоены Нобелевской премии по химии в 2012 году.

Благодаря интенсивным структурным и функциональным исследованиям последних десяти лет, современной науке известна основная модель активации GPCR: после связывания лиганда во внеклеточной половине рецептора происходит ряд перестроений трансмембранных спиралей, вызванных «переключением» консервативных аминокислотных мотивов [3]. Однако с появлением дополнительных пространственных структур в существующую парадигму вносится ряд уточнений, приводящий к появлению новых концепций понимания функционирования этой группы белков.

Ввиду огромного разнообразия лигандов, активирующих GPCR, ортостерический пакет связывания лиганда уникален для каждого рецептора, и зачастую невозможно точно смоделировать его форму без экспериментальных данных, поэтому структура каждого нового GPCR даёт ценную информацию о кармане связывания лиганда и служит подспорьем для дальнейших фармакологических разработок [4].

Решение пространственной структуры является нетривиальной экспериментальной задачей, требующей от команды исполнителей проекта огромного ресурсного вклада, а также современной инфраструктурной оснащенности. Прорывными достижениями современной науки, сделавшими структурные исследования GPCR возможными,

являются: совершенствование методов экспрессии [5] и стабилизации конформационных состояний точечными мутациями [6], разработка методики белковой микрокристаллографии с использованием синхротронного излучения [7], применение кристаллизации in meso [8], разработка белков-партнёров, улучшающих стабильность белка и формирующих кристаллические контакты [9,10], использование нанотел, стабилизирующих комплекс рецептора с G-белком [11], создание программных ресурсов для предсказания генетических конструкций [12,13], а также применение прогрессивных методик, таких как лазер на свободных электронах [14] и крио-электронная микроскопия [15]. Тем не менее, несмотря на все успехи современной науки, рецепторы, сопряженные с G-белком, остаются сложными мишенями для структурных биологов, и появление новых данных вызывает сильный интерес у научного сообщества. Методика определения структуры GPCR кристаллографическим методом включает в себя итерационную оптимизацию генетической конструкции, протоколов очистки и кристаллизации в липидной кубической фазе, а также высокотехнологичную рентгеновскую микрокристаллографию, что будет описано в данной работе (рисунок 1).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение пространственной структуры человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора 1 класса GPCR»

Актуальность темы исследования

Цистеинил-лейкотриеновые рецепторы 1 и 2 (CysLT1-2R) принадлежат к суперсемейству GPCR и контролируют мышечное сокращение бронхов и воспалительные процессы в легких. Поэтому они рассматриваются в качестве основных мишеней при лечении астмы [16]. Согласно данным Центров по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention - CDC), астма является крайне тяжелым хроническим заболеванием, широко распространенным среди детей, влияющим на качество жизни и продуктивность почти 10% населения нашего современного общества и может привести к смерти [17]. По данным медико-демографических показателей министерства здравоохранения Российской Федерации, доступным на сайте mednet.ru, в 2016 году в нашей стране астма вызвала 1447 летальных исходов, а в 2017 году - 1351. Получение более эффективных и безопасных противоастматических лекарственных препаратов является приоритетным направлением современной медицины.

Рисунок 1. Схема структурных исследований ОРСЯ [18].

Цели и задачи работы

Целью данной работы было получение и анализ пространственной структуры Су8ЬТ1 рецептора человека. Для ее реализации стоял ряд задач. Первой задачей был инжениринг генетической конструкции для экспрессии белка на цитоплазматической мембране клеток, используемых для рекомбинантного получения рецептора, обеспечивающей также стабильность и мономерность Су8ЬТ1Я после солюбилизации в мицеллах детергента. Второй задачей проекта являлась наработка целевого белка в клетках насекомых $/9 в достаточном для кристаллизации количестве. Следующим пунктом была оптимизация протоколов очистки Су8ЬТ1Я для получения миллиграммовых количеств чистого белкового препарата, обладающего достаточной стабильностью и монодисперсностью. Третьей задачей была кристаллизация рецептора в липидной

кубической фазе (LCP). Для этого решалась подзадача улучшения диффузии белка в LCP. Дополнительно перед автором стояла задача налаживания общей инфраструктуры для выделения и кристаллизации GPCR в Центре исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ.

Научная новизна

В данной работе впервые получена пространственная структура CysLTi рецептора в комплексе с двумя антагонистами, которая открыла уникальные механизмы функционирования GPCR, не наблюдаемые ранее, а также впервые проанализирована структура промежуточного состояния, позволяющая проследить за путём входа липидного лиганда в связывающий карман через боковую сторону рецептора непосредственно из окружающей мембраны.

Для получения кристаллической структуры была разработана генетическая конструкция CysLTiR с белком-партнёром, впервые проведено комплексное исследование данного белка in vitro, включающее в себя разработку и применение методологии экспрессии, очистки и кристаллизации CysLTiR. Был измерен эффект связывания лигандов и ионов натрия на стабильность рецептора и нескольких его точечных мутантов.

Дифракционные данные были получены при помощи синхротронного излучения для комплекса с пранлукастом и при помощи лазера на свободных электронах для комплекса с зафирлукастом. Недавно появившийся и бурно развивающийся метод серийной кристаллографии с использованием рентгеновских лазеров на свободных электронах является новым и перспективным подходом для белковой кристаллографии объектов, трудно поддающихся кристаллизации.

Теоретическая и практическая значимость

Две структуры CysLTiR, определенные в данном исследовании, в комплексе с противоастматическими лекарственными препаратами, пранлукастом и зафирлукастом, раскрывают механизм проникновения лиганда в липидные рецепторы и являются важным примером пластичности рецептора при связывании двух химически различных

антагонистов. Структуры предполагают новый механизм активации GPCR, при котором функциональный переключатель P-I-F находится в активной конформации, в то время как рецептор стабилизируется в неактивном состоянии с помощью жестко связанного иона натрия, координированного четырьмя остатками, включающими два остатка аспарагиновых кислот. Кроме того, на основе решенных структур предложен возможный механизм связывания для эндогенных агонистов - цистеинил-лейкотриенов. Таким образом, результаты этой работы представят огромный интерес для фундаментальной науки, а также должны послужить полезным инструментом для рационального дизайна лекарственных средств, мишенью которых является CysLTi рецептор.

Методология и методы исследования

В работе были использованы следующие методы и технологии:

- Генно-инженерные методы модификации белков: отрезания и вставки фрагментов, введение точечных мутаций.

- Бакуловирусная экспрессия мембранных белков в клетках насекомых с применением метода проточной цитофлуориметрии для анализа качества клеток и заражающего вируса, и выхода белка на поверхность клетки.

- Лизис клеток и выделение мембранной фракции путём гомогенизации в гипо- и гипертонических буферах, солюбилизация мембранных белков в мицеллах детергента, очистка рецептора методом металл-аффинной хроматографии, препаративная гель-фильтрация.

- Электрофорез, иммуноблоттинг, аналитическая гель-фильтрационная хроматография, исследование белковой стабильности методом измерения характерных температур плавления.

- Исследование диффузии белка в липидной кубической фазе методом восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания. Кристаллизация в липидной кубической фазе методом in meso, анализ кристаллов методом флуоресцентной микроскопии.

- Микрофокусная кристаллография на синхротронных источниках и серийная фемтосекундная кристаллография с использованием лазеров на свободных электронах.

- Молекулярный докинг и молекулярно-динамические симуляции.

- Измерение передачи сигнала GPCR в клетках млекопитающих: вывод белка на цитоплазматическую поверхность, активация рецептора агонистом, ингибирование агониста антагонистом.

Положения, выносимые на защиту

1) Генетическая конструкция рецептора CysLTi c обрезанным C-концом, химерным белком-партнёром b562RIL в третьей внутриклеточной петле и N-концевыми пептидными фрагментами для бакуловирусной экспрессии, очистки и кристаллизации белка в липидной кубической фазе.

2) Экспериментальный подход, включающий в себя рекомбинантную наработку CysLTiR в клеточной линии Sf9, выделение белка путём солюбилизации в мицеллы детергента и очистки методом металл-аффинной хроматографии, кристаллизацию рецептора методом in meso.

3) Пространственная структура CysLTiR в комплексе с антагонистом пранлукастом, CysLTiR-пран, с разрешением 2,7 Á, полученная методом белковой микрокристаллографии с использованием синхротронного излучения.

4) Пространственная структура CysLTiR в комплексе с антагонистом зафирлукастом, CysLTiR-зафир, с разрешением 2,5 Á, полученная методом серийной фемтосекундной кристаллографии с использованием лазера на свободных электронах.

5) Показано наличие активного состояния у мотивов переключателей при общей неактивной структуре рецептора, координация иона натрия четырьмя аминокислотными остатками, а также вхождение лиганда через трансмембранную область рецептора.

Степень достоверности и апробация результатов

При выполнении и написании работы автором был проведен анализ литературных данных ведущих мировых журналов по теме исследования. В процессе получения

экспериментальных данных качество белкового препарата проверялось различными аналитическими методами. Сбор дифракционных данных осуществлялся на передовых и мощнейших рентгеновских установках во Франции и в США, а обработка результатов велась при помощи современного специализированного программного обеспечения. Анализ структуры проводился с учетом итогов функциональных тестов мутантных форм рецептора. Новые свойства, обнаруженные в рецепторе, не противоречат результатам мирового научного сообщества по исследованию данного класса рецепторов и не являются артефактом эксперимента. Данные экспериментов статистически выверены.

По итогам диссертационной работы опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах, индексируемых базами данных Web of Sciences, Scopus и РИНЦ, включая статью в журнале Science Advances, где исполнитель данной работы является первым автором. Основные результаты были представлены в виде 25 тезисов на международных конференциях, включающих устные доклады и постерные презентации.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описывающего методологию по получению пространственной структуры GPCR рецепторов, а также результаты предыдущих исследований цистеинил-лейкотриенового рецептора 1 человека, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов, списка используемых сокращений и терминов, а также списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 5 таблиц. Список использованных литературных источников насчитывает 187 наименований.

Основная часть работы Обзор литературы

1. Определение пространственной структуры рекомбинантных GPCR методом рентгеноструктурного анализа

1.1 Рецепторы, сопряженные с G-белком

Рецепторы, сопряженные с G-белком - трансмембранные белки эукариот, передающие внешний сигнал внутрь клетки. Эндогенные лиганды, активирующие GPCR, крайне разнообразны: нейромедиаторы, гормоны, пептиды, нуклеотиды, ионы, липиды, пахучие вещества, протеазы, фотоны света и пр. [19].

При активации рецептора лигандом белок претерпевает ряд конформационных

перестроек, которые приводят к активации G-белка, гетеротримерной ГТФазы, состоящей

из a-, ß- и у- субъединиц и связанной с рецептором с внутриклеточной стороны. Альфа-

субъединица в неактивном состоянии связана с ГДФ, при активации ГДФ обменивается на

ГТФ, G-белок распадается на а- и ßy- субъединицы, каждая из которых взаимодействует

со своим эффектором, запуская каскады внутриклеточных реакций. По типу а-субъединиц

G-белки делят на Gas, Gai/o, Gaq/11, Gai2/13, которые также делятся на подгруппы. Эффектором

первых двух групп является аденилат-циклаза: в случае Gas фермент активируется и

уровень цАМФ возрастает, а в случае Gai/o - ингибируется и уровень падает. Активация

Gaq/11 белка приводит к повышению концентрации внутриклеточного кальция путём

расщепления фосфолипазой С фосфатидил-инозитол-бифосфата на инозитол-трифосфат и

диацилглицерин. Последняя группа G-белков активирует факторы обмена гуаниновых

нуклеотидов, стимулируя работу Rho-ГТФаз. ßy- субъединица может запускать

независимые каскады реакций, а также влиять на работу ионных каналов (рисунок 2) [1].

Вариация в конформационных изменениях, вызванная отличающимся способом

связывания лиганда, а также другими факторами, в частности типом клеток, может

12

приводить к смещению активности ОРСЯ в сторону различных О-белков или запускать не связанные с О-белком сигнальные каскады [20].

Рисунок 2. Сигнализация ОРСЯ. При активации рецептора различными стимулами сигнал передается на гетеротримерный О-белок, который, в зависимости от подтипа а-субъединицы, запускает каскад реакций, приводящий к биологическому ответу [1].

Киназы рецепторов, сопряженных с О-белком, (ОЯК) составляют семейство из семи серин/треониновых протеинкиназ, которые специфично распознают и фосфорилируют активированные агонистами рецепторы [21]. Затем аррестины десенсибилизируют фосфорилированные GPCR, блокируя дальнейшую активацию и инициируя интернализацию рецепторов, опосредованную клатрином. Интернализованный белок продолжает сигнализацию внутри клетки, либо деградирует в эндосомах, либо

направляется обратно на клеточную поверхность, что также модулируется аррестинами [22].

Кроме того, аррестины связывают GPCR с несколькими сигнальными путями, включая активацию нерецепторной тирозинкиназы SRC и митоген-активируемой протеинкиназы. В этих каскадах аррестины функционируют в качестве адаптеров и каркасов, обеспечивая последовательное действие киназ вблизи друг друга и рецептора [23]. На функционирование GPCR влияет гомо- и гетеро-димеризация, которая свойственна многим рецепторам, изменяет подвижность белка на клеточной поверхности, транспорт внутрь клетки, а также модулирует передачу сигнала рецептором [24].

Всего в организме человека более 800 различных генов GPCR, что составляет около 4% всего генома. По функциональным и гомологическим признакам рецепторы человека делятся на несколько классов: родопсиноподобные (класс А), секретиновые (класс B), метаботропные глутаматные (класс С), адгезионные и Frizzled/Smoothend (рецепторы, обнаруженные во Frizzled и Smoothened локусах дрозофилы, класс F) и рецепторы горького вкуса. Родопсиноподобные GPCR составляют большую часть (около 90%) всех рецепторов, группа получила своё название, благодаря гомологии со зрительным родопсином, первым GPCR белком с решенной пространственной структурой, название было получено ещё до определения структуры. Родопсин был открыт в 1876 году Францем Боллом [25], а также является первым GPCR рецептором, который был изолирован и клонирован [26]. Класс А делится на а, ß, у и 8 ветви, каждая из которых имеет свои структурно-функциональные особенности [27].

Клеточная сигнализация, обеспечиваемая рецепторами, сопряженными с G-белком, является ключевым звеном большинства физиологических процессов в организме, таких как: настроение и поведение, зрение, обоняние, иммунитет и воспаление,

1 u u и т/»

функционирование вегетативной и центральной нервной системы. Как следствие, неправильное функционирование GPCR приводит к возникновению огромного количества заболеваний, и около 40% современных лекарственных средств действуют на это суперсемейство белков, что делает эти рецепторы привлекательными мишенями для фармакологических исследований [2]. И несмотря на огромную работу, проделанную

учеными по исследованию данного класса белков, остаётся множество вопросов по их функционированию.

1.2 Консервативные мотивы GPCR рецепторов класса А

Общая топология GPCR представляет из себя 7 трансмембранных а-спиралей (ТМ), соединённых тремя внеклеточными (ECL - extracellular loop) и тремя внутриклеточными (ICL - intracellular loop) петлями, N-конец обращен во внеклеточное пространство, а С-конец - в цитозоль [28].

Родопсиноподобные GPCR характеризуются набором консервативных мотивов, а также местом связывания лиганда в «верхней» (находящейся ближе к внеклеточному пространству) половине белка, внутри трансмембранного каркаса [27]. На С-конце располагается короткая, амфифильная 8 спираль, участвующая в передаче сигнала [29]. Класс А изучен лучше остальных: 285 из 321 структур и 52 из 62 структур уникальных рецепторов получены для данной группы белков [12], и известен приблизительный механизм их функционирования. Наиболее вариабельной частью рецептора являются его петли и лиганд-связывающий пакет, в то время как альфа-спиральный остов довольно консервативен.

Конформационные измерения «верхней» части, где происходит связывание лиганда, приводит к перестроению в «нижней» (находящейся ближе к цитоплазме) части, что запускает каскад, опосредованный G-белком, а также аррестинами и другими эффекторами. На трансмембранных спиралях имеются мотивы, присутствующие у большинства рецепторов - группы, переключение которых вызывает активацию рецептора, а отклонения от которых могут ухудшить какие-либо свойства (экспрессию, стабильность в определенном состоянии и т.д.) конкретного рецептора. Чаще всего такие мотивы, именуемые «микропереключателями» представляют из себя внутримолекулярные взаимодействия между спиралями, так называемые «ионные защелки». Также возможны стерические гидрофобные взаимодействия (рисунок 3) [3,30-34].

В центральной части рецепторов класса А находится так называемый натриевый карман, включающий в себя 15 из 34 наиболее консервативных аминокислот. Эффект

натрия в функционировании GPCR был обнаружен около 40 лет назад, когда было показано, что негативно модулировал связывание опиоидных рецепторов с агонистом [35,36]. Было продемонстрировано при помощи мутагенеза, что аспартат на позиции 2.50, определенной по номенклатуре GPCR BaПesteros-Wemstem (где первое число обозначает номер ТМ спирали, а второе - позицию на спирали; при этом номер 50 присваивают самой консервативной аминокислоте на данной спирали, при помощи которой производится выравнивание по всем GPCR соответствующей подгруппы) [37], необходим для наличия эффекта натрия.

Рисунок 3. Основные молекулярные переключатели в GPCR. (А) W6.48 триптофановый тумблер и переключатель передачи в рецепторе серотонина 5-НТ2С (активный: PDB ГО 6BQG; неактивный: PDB ГО 6BQH). (Б) Ионная защелка в DRY мотиве родопсина (активный: PDB ГО 2X72; неактивный: PDB ГО Ш2М). (В) тирозиновый переключатель Y7.53 в мотиве NPxxY А2а рецептора (активный: PDB ГО 2ТОО, неактивный: PDB ГО 3RFM). (Г) Сайт связывания №+ в А2а

рецепторе (активный: PDB ID 3QAK, неактивный: PDB ID 4EIY). (Д) 3-7ТМ защелка цOR (активный: PDB ID 5С1М, неактивный: PDB ГО 4DKL). Неактивные структуры показаны серым

цветом [3].

После получения пространственной структуры аденозинового рецептора с разрешением 1,8 Â был обнаружен ион натрия в участке, отличном от сайта связывания лиганда, а также связанные с ним напрямую либо через молекулы воды аминокислотные остатки: D250, N150, S3 39, N745, S746, N749, Y753. Этот пакет в дальнейшем был обнаружен и в других рецепторах. Было показано, что в активном состоянии ион натрия в кармане отсутствует, предположительно выходя в цитоплазму, а сам карман претерпевает серьезные конформационные изменения. Среди родопсиноподобных рецепторов возможны вариации натриевого кармана, однако в большинстве рецепторов он присутствует в том или ином виде. Исключение составляют обонятельные рецепторы, в которых натриевый карман есть, но сильно отличается от описанного выше, а также зрительные опсины и «несигнализирующие» GPCR, чья функция в организме отлична от стандартной: в них сайта Na+ может не быть. В остальных классах рецепторов натриевый карман также отсутствует. Таким образом, высвобождение иона натрия играет ключевую роль в активации большинства родопсиноподобных GPCR [36].

р5 50_1з40_р644 (pif) мотив характеризуется в большинстве рецепторов класса А как основной переключатель, сопряженный с конформационными изменениями в ортостерическом пакете и вызывающий преобразования в сайтах связывания G-белка и в_ аррестина [34]. На его функционирование влияют и аминокислоты ближайшего окружения, в частности, объемные гидрофобные аминокислоты на позициях 3.41 и 6.48.

D(E)R3 50Y (DRY) мотив высоко консервативен в классе А GPCR. Он находится на 3 трансмембранной спирали, вблизи второй внутриклеточной петли, и стабилизирует белок в неактивном состоянии, путем взаимодействия R3 50 с D349 и иногда с отрицательно заряженным остатком 6.30. При активации рецептора связь рвётся [32].

N749P7 50xxY7 53 (NPxxY) мотив, являясь частью натриевого сайта, также высоко консервативен, он соединяет ТМ 7 с 8 спиралью, и было показано, что аспарагин в позиции 7.49 вовлечен в переход из активного в неактивное состояние, в рецепторе тиреотропного гормона (TSHr) мутация N749D повышает базальную активность белка и увеличивает амплитуду отклика на агониста [30].

Мутагенез консервативных мотивов часто приводит к улучшению свойств рекомбинантных GPCR, таких как уровень экспрессии, стабильность и мономерность. Так,

17

аспарагин в позиции 2.50 вместо более консервативного аспартата существенно повышает уровень поверхностной экспрессии и стабилизирует белок в активном состоянии [30]. Roth мутация заменяет аминокислоту в позиции 3.41 на триптофан или фенилаланин, было показано на бета-2 адренергическом рецепторе человека, что триптофан в этой позиции существенно увеличивает общую и поверхностную экспрессию, а также стабилизирует белок, связанный с антагонистом [31].

1.3 Генетические конструкции для кристаллизации GPCR

Кристаллизация рецепторов, сопряженных с G-белком, требует наличия миллиграммовых количеств белкового препарата, обладающего такими качествами, как: чистота, монодисперсность, стабильность, функциональная активность, а именно, способность связывать лиганд, и возможность образовывать кристаллизационные контакты. Для этого используются генетические модификации белка, позволяющие увеличить уровень экспрессии белка, специфически очищать и детектировать белок, повысить его термостабильность, снизить процент агрегированного препарата и повысить вероятность образования кристаллических контактов: точечные мутации, пептидные последовательности на концах рецептора, называемые далее тагами или хвостами, добавление белка-партнёра [10].

Правильное сворачивание рецептора с сохранением функциональной активности обеспечивается при экспрессии белка на цитоплазматической мембране, так как рецепторы, сопряженные с G-белком, в большинстве случаев, обеспечивают межклеточную сигнализацию именно на клеточной поверхности. Доставка белка на клеточную поверхность зависит от типа клеток, а также от конкретного белка даже в пределах одного семейства [38]. При бакуловирусной экспрессии в клетках насекомых, наиболее часто используемой рекомбинантной системе для дальнейшей кристаллизации, применяется добавление на N-конец сигнальной последовательности HA, фрагмента человеческого вируса гриппа. Аминокислотная последовательность НА-хвоста -KTIIALSYIFCLVFA. Сигнальный пептид направляет экспрессируемый белок в мембрану эндоплазматического ретикулума и там отщепляется сигнальной пептидазой [39]. Кроме

того, повышению поверхностной экспрессии белка могут послужить такие факторы, как N-гликозилирование, определенная заряженность N- и С-концов, а также точечные мутации [40-42]. N-концевая последовательность мускаринового рецептора также используется для улучшения доставки белка на поверхность [43]. Для экспрессии GPCR в клетках млекопитающих подход более индивидуальный для отдельных рецепторов, так для CysLTIR при экспрессии в клетках HEK293 используется Р-глобиновый интрон [40,44].

Для очистки рекомбинантного GPCR наиболее применимый метод - металл-аффинная хроматография. Для нее используется полигистидиновый хвост, состоящий из 6-10 гистидиновых остатков. Данный хвост аффинно связывается с бивалентными катионами никеля или кобальта на смолах, позволяя специфично отделить рекомбинантный GPCR от прочих совыделяющихся белков. Гистидиновый хвост возможно помещать на N- или С-конец белка, в зависимости от дальнейшей задачи [5,8].

Для детектирования белка на клеточной поверхности с целью определения уровня экспрессии, а также детектирования методом иммуноблоттинга используется последовательность FLAG (DYKDDDD(K)), антитела к которой доступны коммерчески. FLAG-таг также применяется для очистки GPCR методом ко-иммунопреципитации [45]. Для отщепления хвостов после очистки белка возможно помещение сайтов щепления протеазами, такими как TEV или PreScission между ними и белком [5,38,46].

Для повышения вероятности образования кристаллизационных контактов рецепторов, сопряженных с G-белком, а также стабилизации белка часто используются белки-партнеры, обладающие следующими свойствами: наличие структуры высокого разрешения, простота сворачивания и отсутствие агрегации, отсутствие посттрансляционных модификаций, размеры белка ~5-20 килодальтон, разница между количеством кислых и щелочных аминокислотных остатков меньше 20%, расстояние между N- и C- концами меньше 15 А. Белки-партнеры чаще всего помещают в 3 внутриклеточную петлю, так как она наиболее неструктурирована и соединяет подвижные трансмембранные спирали 5 и 6, или на N-конец, однако возможна вставка и в другие петли, а также использование нескольких белков-партнёров одновременно [47]. Невозможно точно предсказать, какое именно положение будет позитивно влиять на

19

стабилизацию и кристаллизацию белка, поэтому проводится оптимизация генетических конструкций путем перебора. Наиболее часто используемые белки-партнёры: C-концевой фрагмент T4 лизоцима и его модификации (T4L), апоцитохром b562 (BRIL), рубредоксин (Rub), флаводоксин (Fla), ксиналаза (Xyn), а также каталитический домен гликоген-синтазы из Pyrococcus abyssi (PGS) [10,48]. Первые структуры GPCR были получены с T4L, а поиск альтернативных белков-партнеров облегчил задачу кристаллизации данного суперсемейства, резко увеличив число опубликованных структур (рисунок 4) [8,10,38].

GPCRdb - современный онлайн ресурс, интегратор данных по исследованию GPCR, позволяющий анализировать аминокислотные последовательности рецепторов, содержащий статистические данные и инструменты для прогнозирования генетических конструкций для кристаллографических исследований [12].

Рисунок 4. Белки-партнёры для стабилизации и кристаллизации GPCR. Пространственная структура остова полипептидной цепи A2AAR-BRIL с разрешением 1,7 А (PDB ГО 5NM4), GPCR цепь покрашена синим цветом, белки-партнеры - розовым. Пространственные координаты белков-партнеров взяты из кристаллических структур GPCR [8,49-52].

Ярким примером успешного применения белка-партнёра можно назвать комплекс BRIL с аденозиновым рецептором A2A человека (структура 4EIY в PDB), где была получена структура с разрешением 1,8 А и альфа-спиральный BRIL является продолжением 5 и 6

трансмембранных спиралей, таким образом жестко их фиксируя. При помощи точечных мутаций разрешение удалось повысить до 1,7 А (структура 5КМ4 в РББ), что до сих пор является рекордным для данного класса белков (рисунок 4) [49]. Однако такое положение БЯГЬ трудно достижимо, поэтому, помимо перебора места вставки в 3 внутриклеточной петле, часто используется подвижная О8- или Л8- вставка, позволяющая, наоборот, избежать неоптимальной фиксации белком-партнёром 5 и 6 спиралей ОРСЯ. Также возможно использование менее структурированных белков, например, рубредоксина [53]. О8-вставка также применима и для К-концевых инсерций с целью обеспечения оптимальной упаковки кристаллов [53].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лугинина Александра Павловна, 2019 год

Список используемой литературы

[1] Dorsam RT, Gutkind JS. G-protein-coupled receptors and cancer. Nat. Rev. Cancer. 2007;7:79-94.

[2] Filmore D. It's a GPCR world. Mod. Drug Discov. 2004;7:24-27.

[3] Filipek S. Molecular switches in GPCRs. Curr. Opin. Struct. Biol. 2019;55:114-120.

[4] Stevens RC, Cherezov V, Katritch V, et al. The GPCR Network: a large-scale collaboration to determine human GPCR structure and function. Nat. Rev. Drug Discov. 2013;12:25-34.

[5] Hanson MA, Brooun A, Baker KA, et al. Profiling of membrane protein variants in a baculovirus system by coupling cell-surface detection with small-scale parallel expression. Protein Expr. Purif. 2007;56:85-92.

[6] Segala E, Guo D, Cheng RKY, et al. Controlling the Dissociation of Ligands from the Adenosine A2A Receptor through Modulation of Salt Bridge Strength. J. Med. Chem. 2016;59:6470-6479.

[7] Cusack S, Belrhali H, Bram A, et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nat. Struct. Biol. 1998;5:634-637.

[8] Cherezov V, Rosenbaum DM, Hanson MA, et al. High-Resolution Crystal Structure of an Engineered Human b2-Adrenergic G Protein-Coupled Receptor. Science. 2007;318:1258-1265.

[9] Rosenbaum DM, Cherezov V, Hanson M a, et al. GPCR Engineering Yields HighResolution Structural Insights into 2-Adrenergic Receptor Function. Science. 2007;318:1266-1273.

[10] Chun E, Thompson AA, Liu W, et al. Fusion Partner Toolchest for the Stabilization and Crystallization of G Protein-Coupled Receptors. Structure. 2012;20:967-976.

[11] Rasmussen SGF, Choi H-J, Fung JJ, et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the ß2 adrenoceptor. Nature. 2011;469:175-180.

[12] Pandy-Szekeres G, Munk C, Tsonkov TM, et al. GPCRdb in 2018: adding GPCR structure models and ligands. Nucleic Acids Res. 2018;46:440-446.

[13] Popov P, Peng Y, Shen L, et al. Computational design of thermostabilizing point mutations for G protein-coupled receptors. Elife. 2018;7:1-22.

[14] Zhang H, Unal H, Gati C, et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 2015;161:833-844.

[15] Liang Y-L, Khoshouei M, Radjainia M, et al. Phase-plate cryo-EM structure of a class B GPCR-G-protein complex. Nature. 2017;546:118-123.

[16] Back M, Dahlen S-E, Drazen JM, et al. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXXIV: Leukotriene Receptor Nomenclature, Distribution, and Pathophysiological Functions. Pharmacol. Rev. 2011;63:539-584.

[17] Most Recent Asthma Data. CDC.gov (www.cdc.gov). 2018.

[18] Stauch B, Cherezov V. Serial Femtosecond Crystallography of G Protein-Coupled Receptors. Annu. Rev. Biophys. 2018;47:377-397.

[19] Sakmar TP, Kenakin T, Jazayeri A, et al. G-PROTEIN COUPLED RECEPTORS. Chem. Rev. American Chemical Society; 2017.

[20] Seyedabadi M, Ghahremani MH, Albert PR. Biased signaling of G protein coupled receptors (GPCRs): Molecular determinants of GPCR/transducer selectivity and therapeutic potential. Pharmacol. Ther. 2019;200:148-178.

[21] Ribas C, Penela P, Murga C, et al. The G protein-coupled receptor kinase (GRK) interactome: Role of GRKs in GPCR regulation and signaling. Biochim. Biophys. Acta -Biomembr. 2007;1768:913-922.

[22] Peterson YK, Luttrell LM. The Diverse Roles of Arrestin Scaffolds in G Protein-Coupled Receptor Signaling. Michel MC, editor. Pharmacol. Rev. 2017;69:256-297.

[23] Pierce KL, Lefkowitz RJ. Classical and new roles of ß-arrestins in the regulation of G-PROTEIN-COUPLED receptors. Nat. Rev. Neurosci. 2001;2:727-733.

[24] Lohse MJ. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr. Opin. Pharmacol. 2010;10:53-58.

[25] Hubbard R. 100 years of rhodopsin. Trends Biochem. Sci. 1976;1:154-158.

[26] Nathans J, Hogness DS. Isolation, sequence analysis, and intron-exon arrangement of the gene encoding bovine rhodopsin. Cell. 1983;34:807-814.

[27] Fredriksson R. The G-Protein-Coupled Receptors in the Human Genome Form Five Main Families. Phylogenetic Analysis, Paralogon Groups, and Fingerprints. Mol. Pharmacol. 2003;63:1256-1272.

[28] van Rhee AM, Jacobson KA. Molecular architecture of G protein-coupled receptors. Drug Dev. Res. 1996;37:1-38.

[29] Kirchberg K, Kim T-Y, Moller M, et al. Conformational dynamics of helix 8 in the GPCR rhodopsin controls arrestin activation in the desensitization process. Proc. Natl. Acad. Sci. 2011;108:18690-18695.

[30] Urizar E, Claeysen S, Deupi X, et al. An activation switch in the rhodopsin family of G protein-coupled receptors: The thyrotropin receptor. J. Biol. Chem. 2005;280:17135-17141.

[31] Roth CB, Hanson MA, Stevens RC. Stabilization of the Human ß2-Adrenergic Receptor TM4-TM3-TM5 Helix Interface by Mutagenesis of Glu1223.41, A Critical Residue in GPCR Structure. J. Mol. Biol. 2008;376:1305-1319.

[32] Flanagan CA. A GPCR that is not "DRY." Mol. Pharmacol. 2005;68:1-3.

[33] Liu W, Chun E, Thompson AA, et al. Structural Basis for Allosteric Regulation of GPCRs by Sodium Ions. Science. 2012;337:232-236.

[34] Schönegge A-M, Gallion J, Picard L-P, et al. Evolutionary action and structural basis of the allosteric switch controlling ß2AR functional selectivity. Nat. Commun. 2017;8 (2169):1-12.

[35] Pert CB, Pasternak G, Snyder SH. Opiate Agonists and Antagonists Discriminated by Receptor Binding in Brain. Science. 1973;182:1359-1361.

[36] Katritch V, Fenalti G, Abola EE, et al. Allosteric sodium in class A GPCR signaling. Trends Biochem. Sci. 2014;39:233-244.

[37] Ballesteros JA, Weinstein H. Integrated methods for the construction of three-dimensional models and computational probing of structure-function relations in G protein-coupled receptors. Methods Neurosci. 1995;25:366-428.

[38] Lv X, Liu J, Shi Q, et al. In vitro expression and analysis of the 826 human G proteincoupled receptors. Protein Cell. 2016;7:325-337.

[39] Guan X, Kobilka TS, Kobilka BK. Enhancement of Membrane Insertion and Function in a Type IIIb Membrane Protein following Introduction of a Cleavable Signal Peptide. J. Biol. Chem. 1992;267:21995-21998.

[40] Shepard BD, Natarajan N, Protzko RJ, et al. A Cleavable N-Terminal Signal Peptide Promotes Widespread Olfactory Receptor Surface Expression in HEK293 Cells. PLoS One. 2013;8:1-14.

[41] Wheatley M, Hawtin SR. Glycosylation of G-protein-coupled receptors for hormones central to normal reproductive functioning : its occurrence and role. Hum. Reprod. Update. 1999;5:356-364.

[42] Tetreault M, Bourdin B, Briot J, et al. Identification of Glycosylation Sites Essential for Surface Expression of the CaVa281 Subunit and Modulation of the Cardiac Ca V 1 . 2 Channel Activity. J. Biol. Chem. 2016;291:4826-4843.

[43] Glukhova A, Thal DM, Nguyen AT, et al. Structure of the Adenosine A1 Receptor Reveals the Basis for Subtype Selectivity. Cell. 2017;168:867-877.

[44] Yaddaden L, Véronneau S, Thompson MD, et al. Cellular signalling of cysteinyl leukotriene type 1 receptor variants CysLT1-G300S and CysLT1-I206S. Prostaglandins, Leukot. Essent. Fat. Acids. 2016;105:1-8.

[45] Shihoya W, Nishizawa T, Okuta A, et al. Activation mechanism of endothelin ETB receptor by endothelin-1. Nature. 2016;537:363-368.

[46] Kobilka BK. Amino and Carboxyl Terminal Modifications to Facilitate the Production and Purification of a G Protein-Coupled Receptor. Anal. Biochem. 1995. p. 269-271.

[47] Johansson LC, Stauch B, McCorvy JD, et al. XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity. Nature. 2019;569:289-292.

[48] Yin J, Mobarec JC, Kolb P, et al. Crystal structure of the human OX2 orexin receptor bound to the insomnia drug suvorexant. Nature. 2015;519:247-250.

[49] Weinert T, Olieric N, Cheng R, et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nat. Commun. 2017;8:1-11.

[50] Shao Z, Yin J, Chapman K, et al. High-resolution crystal structure of the human CB1 cannabinoid receptor. Nature. 2016;540:602-606.

[51] Hua T, Vemuri K, Pu M, et al. Crystal Structure of the Human Cannabinoid Receptor CB1. Cell. 2016;167:750-762.e14.

[52] Tan Q, Zhu Y, Li J, et al. Structure of the CCR5 Chemokine Receptor-HIV Entry Inhibitor Maraviroc Complex. Science. 2013;341:1387-1390.

[53] Zhang D, Gao Z-G, Zhang K, et al. Two disparate ligand-binding sites in the human P2Y1 receptor. Nature. 2015;520:317-321.

[54] J. B. The Role of Glycosylation in Receptor Signaling. Glycosylation. InTech; 2012. p.

127

Chapter 12.

[55] Contreras-Gómez A, Sánchez-Mirón A, García-Camacho F, et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Prog. 2014;30:1-18.

[56] Yamaji H. Production of Antibody in Insect Cells. In: Al-Rubeai M, editor. Dordrecht: Springer Netherlands; 2011. p. 53-76.

[57] Yeliseev AA. Methods for recombinant expression and functional characterization of human cannabinoid receptor CB2. Comput. Struct. Biotechnol. J. 2013;6:1-9.

[58] He Y, Wang K, Yan N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 2014;5:658-672.

[59] Palczewski K, Kumasaka T, Hori T, et al. Crystal Structure of Rhodopsin: A G Protein -Coupled Receptor. Science. 2000;289:739-745.

[60] Okada T, Trong I Le, Fox BA, et al. CRYSTALLIZATION NOTE X-Ray Diffraction Analysis of Three-Dimensional Crystals of Bovine Rhodopsin Obtained from Mixed Micelles. J. Struct. Biol. 2000;130:73-80.

[61] Thompson AA, Liu JJ, Chun E, et al. GPCR stabilization using the bicelle-like architecture of mixed sterol-detergent micelles. Methods. 2011;55:310-317.

[62] Dong C, Filipeanu CM, Duvernay MT, et al. Regulation of G protein-coupled receptor export trafficking. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 2007;1768:853-870.

[63] Rasmussen SGF, DeVree BT, Zou Y, et al. Crystal structure of the ß2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 2011;477:549-555.

[64] Schneider EH, Seifert R. Coexpression Systems as Models for the Analysis of Constitutive GPCR Activity. Methods Enzymol. Elsevier Inc.; 2010. p. 527-557.

[65] Shukla AK, Westfield GH, Xiao K, et al. Visualization of arrestin recruitment by a G-protein-coupled receptor. Nature. 2014;512:218-222.

[66] Kang Y, Zhou XE, Gao X, et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 2015;523:561-567.

[67] Rasmussen SGF, Choi H-J, Rosenbaum DM, et al. Crystal structure of the human ß2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature. 2007;450:383-387.

[68] Caffrey M, Cherezov V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 2009;4:706-731.

[69] Landau EM, Rosenbusch JP. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 1996;93:14532-14535.

[70] Grabe M, Neu J, Oster G, et al. Protein Interactions and Membrane Geometry. Biophys. J. 2003;84:854-868.

[71] Caffrey M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Commun. 2015;71:3-18.

[72] Van Grieken RE, Markowicz AA. Handbook of X-Ray Spectrometry. Handb. X-Ray Spectrom. Second Ed. CRC Press; 2001.

[73] Helliwell JR. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 1998;5:614-617.

[74] ROSENBAUM G, HOLMES KC, WITZ J. Synchrotron Radiation as a Source for X-ray Diffraction. Nature. 1971;230:434-437.

[75] Duke EMH, Johnson LN. Macromolecular crystallography at synchrotron radiation sources: current status and future developments. Proc. R. Soc. A Math. Phys. Eng. Sci. 2010;466:3421-3452.

[76] Chen Y, Review A. The circles of light. Nat. Rev. Mater. 2018;3:281-282.

[77] Yabashi M, Tanaka H. The next ten years of X-ray science. Nat. Photonics. 2017;11:12-14.

[78] Mishin A, Gusach A, Luginina A, et al. An outlook on serial femtosecond crystallography application in drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 2019;14:1-13.

[79] Chapman HN, Fromme P, Barty A, et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 2011;470:73-77.

[80] Kabsch W. Processing of X-ray snapshots from crystals in random orientations. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2014;70:2204-2216.

[81] White TA, Kirian RA, Martin A V., et al. CrystFEL : a software suite for snapshot serial crystallography. J. Appl. Crystallogr. 2012;45:335-341.

[82] Barty A, Kirian RA, Maia FRNC, et al. Cheetah : software for high-throughput reduction and analysis of serial femtosecond X-ray diffraction data. J. Appl. Crystallogr. 2014;47:1118-1131.

[83] FELDBERG W, KELLAWAY CH. LIBERATION OF HISTAMINE AND

129

FORMATION OF LYSOCITHIN-LIKE SUBSTANCES BY COBRA VENOM. J. Physiol. 1938;94:187-226.

[84] Brocklehurst BYWE, Hill M. SLOW-REACTING SUBSTANCE ( SRS-A ) DURING ANAPHYLACTIC SHOCK. J. Physiol. 1960;416-435.

[85] Dahlén S-E, Hedqvist P, Hammarström S, et al. Leukotrienes are potent constrictors of human bronchi. Nature. 1980;288:484-486.

[86] Samuelsson B. Prostaglandins, thromboxanes, and leukotrienes: formation and biological roles. Harvey Lect. 1979;75:1-40.

[87] Brink C. International Union of Pharmacology XXXVII. Nomenclature for Leukotriene and Lipoxin Receptors. Pharmacol. Rev. 2003;55:195-227.

[88] Capra V, Ambrosio M, Riccioni G, et al. Cysteinyl-Leukotriene Receptor Antagonists: Present Situation and Future Opportunities. Curr. Med. Chem. 2006;13:3213-3226.

[89] Denis D, Charleson S, Rackham A, et al. Synthesis and biological activities of leukotriene F4 and leukotriene F4 sulfone. Prostaglandins. 1982;24:801-814.

[90] Reddanna P, Sandeep Prabhu K, Whelan J, et al. Carboxypeptidase A-catalyzed direct conversion of leukotriene C4 to leukotriene F4. Arch. Biochem. Biophys. 2003;413:158-163.

[91] Lynch KR, O'Neill GP, Liu Q, et al. Characterization of the human cysteinyl leukotriene CysLT1 receptor. Nature. 1999;399:789-793.

[92] Sarau HM, Ames RS, Chambers J, et al. Identification, molecular cloning, expression, and characterization of a cysteinyl leukotriene receptor. Mol Pharmacol. 1999;56:657-63.

[93] Schiöth HB, Fredriksson R. The GRAFS classification system of G-protein coupled receptors in comparative perspective. Gen. Comp. Endocrinol. 2005;142:94-101.

[94] Nielsen C, Campbell J, Morgelin M, et al. A Novel Localization of the G-Protein-Coupled CysLT 1 Receptor in the Nucleus of Colorectal Adenocarcinoma Cells. Cancer Res. 2005;65:732-742.

[95] Shirasaki H, Seki N, Fujita M, et al. Agonist- and TH2 cytokine-induced up-regulation of cysteinyl leukotriene receptor messenger RNA in human monocytes. Ann. Allergy, Asthma Immunol. 2007;99:340-347.

[96] Bäck M, Powell WS, Dahlén S-E, et al. Update on leukotriene, lipoxin and oxoeicosanoid receptors: IUPHAR Review 7. Br. J. Pharmacol. 2014;171:3551-3574.

[97] Ravasi S, Citro S, Viviani B, et al. CysLT 1 receptor-induced human airway smooth muscle cells proliferation requires ROS generation , EGF receptor transactivation and ERK1 / 2 phosphorylation. Respir Res. 2006;18:1-18.

[98] Capra V, Ravasi S, Rosa M, et al. CysLT 1 signal transduction in differentiated U937 cells involves the activation of the small GTP-binding protein Ras. Biochem. Pharmacol. 2004;67:1569-1577.

[99] Thompson C, Cloutier A, Bosse Y, et al. CysLT1 Receptor Engagement Induces Activator Protein-1 - and NF- kB - Dependent IL-8 Expression. Am J Respir Cell Mol Biol. 2006;35:697-704.

[100] McMAHON B, MITCHELL D, SHATTOCK R, et al. Lipoxin, leukotriene, and PDGF receptors cross-talk to regulate mesangial cell proliferation. FASEB J. 2002;16:1817-1819.

[101] Audette K, Larrivee J, Thompson C, et al. Internalization of CysLT1 Receptor Through the Clathrin Endocytic Pathway. J. Allergy Clin. Immunol. 2007;119:S132.

[102] Laidlaw TM, Boyce JA. Cysteinyl leukotriene receptors, old and new; implications for asthma. Clin. Exp. Allergy. 2012;42:1313-1320.

[103] Jiang Y, Borrelli LA, Kanaoka Y, et al. CysLT2 receptors interact with CysLT1 receptors and down-modulate cysteinyl leukotriene dependent mitogenic responses of mast cells. Blood. 2007;110:3263-3270.

[104] Rovati GE, Capra V. Cysteinyl-leukotriene receptors and cellular signals. ScientificWorldJournal. 2007;7:1375-1392.

[105] Capra V, Thompson MD, Sala A, et al. Cysteinyl-leukotrienes and their receptors in asthma and other inflammatory diseases: Critical update and emerging trends. Med. Res. Rev. 2007;27:469-527.

[106] Shirasaki H, Himi T. Role of cysteinyl leukotrienes in allergic rhinitis. Adv. Otorhinolaryngol. 2016;77:40-45.

[107] Shokouhi F, Meymaneh Jahromi A, Majidi MR, et al. Montelukast in Adenoid Hypertrophy: Its Effect on Size and Symptoms. Iran. J. Otorhinolaryngol. 2015;27:443-448.

[108] Lee W, Su Kim H, Lee GR. Leukotrienes induce the migration of Th17 cells. Immunol. Cell Biol. 2015;93:472-479.

[109] Gelosa P, Colazzo F, Tremoli E, et al. Cysteinyl Leukotrienes as Potential Pharmacological

131

Targets for Cerebral Diseases. Mediators Inflamm. 2017;2017:1-15.

[110] Yu X-B, Dong R-R, Wang H, et al. Knockdown of hippocampal cysteinyl leukotriene receptor 1 prevents depressive behavior and neuroinflammation induced by chronic mild stress in mice. Psychopharmacology (Berl). 2016;233:1739-1749.

[111] Blanco M-J, Benesh DR, Knobelsdorf JA, et al. Discovery of dual positive allosteric modulators (PAMs) of the metabotropic glutamate 2 receptor and CysLT1 antagonists for treating migraine headache. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2017;27:323-328.

[112] Wu S, Zhu X, Jin Z, et al. The protective role of montelukast against intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Sci. Rep. 2015;5:1-9.

[113] Korkmaz K, Gedik HS, Budak AB, et al. Effect of montelukast on spinal cord ischemia/reperfusion injury. Turk. Neurosurg. 2014;757-765.

[114] Bäck M, Hansson GK. Leukotriene receptors in atherosclerosis. Ann. Med. 2006;38:493-502.

[115] Tsai M-J, Wu P-H, Sheu C-C, et al. Cysteinyl Leukotriene Receptor Antagonists Decrease Cancer Risk in Asthma Patients. Sci. Rep. 2016;6:1-11.

[116] Mehdawi L, Osman J, Topi G, et al. High tumor mast cell density is associated with longer survival of colon cancer patients. Acta Oncol. (Madr). 2016;55:1434-1442.

[117] Magnusson C, Mezhybovska M, Lörinc E, et al. Low expression of CysLTiR and high expression of CysLT2R mediate good prognosis in colorectal cancer. Eur. J. Cancer. 2010;46:826-835.

[118] El-Sisi AEE, Sokar SS, Salem TA, et al. Role of cysteinyl leukotriene receptor-1 antagonists in treatment of experimentally induced mammary tumor: Does montelukast modulate antitumor and immunosuppressant effects of doxorubicin? Toxicol. Ind. Health. 2015;31:1024-1036.

[119] Matsuyama M, Yoshimura R. Cysteinyl-leukotriene1 receptor is a potent target for the prevention and treatment of human urological cancer. Mol. Med. Rep. 2010;3:245-251.

[120] Lukic A, Wahlund CJE, Gómez C, et al. Exosomes and cells from lung cancer pleural exudates transform LTC4 to LTD4, promoting cell migration and survival via CysLT1. Cancer Lett. 2019;444:1-8.

[121] Syu G-D, Wang S-C, Ma G, et al. Development and application of a high-content virion

132

display human GPCR array. Nat. Commun. 2019;10:1-12.

[122] Fischer J, Ganellin CR, Rotella DP. Analogue-based Drug Discovery III. 2012.

[123] Augstein J, Farmer J, Lee T, et al. Selective inhibitor of slow reacting substance of anaphylaxis. Nat. New Biol. 1973;245:215-217.

[124] Wechsler ME. Pulmonary Infiltrates, Eosinophilia, and Cardiomyopathy Following Corticosteroid Withdrawal in Patients With Asthma Receiving Zafirlukast. JAMA. 1998;279:455.

[125] www.drugs.com.

[126] www.fda.gov.

[127] Hand L. FDA Panel Rejects OTC Use of Montelukast (Singulair Allergy). Medscape.com. 2014.

[128] Keam SJ, Lyseng-Williamson KA, Goa KL. Pranlukast. Drugs. 2003;63:991-1019.

[129] Yonetomi Y, Sekioka T, Kadode M, et al. Effects of ONO-6950, a novel dual cysteinyl leukotriene 1 and 2 receptors antagonist, in a guinea pig model of asthma. Eur. J. Pharmacol. 2015;765:242-248.

[130] Itadani S, Takahashi S, Ima M, et al. Discovery of a potent, orally available dual CysLT1 and CysLT2 antagonist with dicarboxylic acid. Bioorg. Med. Chem. 2015;23:2079-2097.

[131] Rael E. Unraveling the complexity of leukotriene and prostaglandin inflammatory signaling. J. Allergy Clin. Immunol. 2016;137:299-300.

[132] Ernst P, Ernst G. Neuropsychiatric adverse effects of montelukast in children. Eur. Respir. J. 2017;50:1-3.

[133] Law SWY, Wong AYS, Anand S, et al. Neuropsychiatric Events Associated with Leukotriene-Modifying Agents: A Systematic Review. Drug Saf. 2018;41:253-265.

[134] Noonan MJ, Chervinsky P, Brandon M, et al. Montelukast, a potent leukotriene receptor antagonist, causes dose-related improvements in chronic asthma. Eur. Respir. J. 1998;11:1232-1239.

[135] Kuo C-H, Yang S-N, Kuo H-F, et al. Cysteinyl leukotriene receptor antagonist epigenetically modulates cytokine expression and maturation of human myeloid dendritic cells. Pulm. Pharmacol. Ther. 2016;39:28-37.

[136] Lin Y-C, Huang M-Y, Lee M-S, et al. Effects of montelukast on M2-related cytokine and chemokine in M2 macrophages. J. Microbiol. Immunol. Infect. 2018;51:18-26.

[137] Thompson MD, Capra V, Clunes MT, et al. Cysteinyl Leukotrienes Pathway Genes, Atopic Asthma and Drug Response: From Population Isolates to Large Genome-Wide Association Studies. Front. Pharmacol. 2016;7:1-17.

[138] Thompson MD, Cole DEC, Capra V, et al. Pharmacogenetics of the G Protein-Coupled Receptors. In: Yan Q, editor. Methods Mol. Biol. Totowa, NJ: Humana Press; 2014. p. 189-242.

[139] Thompson MD, Capra V, Takasaki J, et al. A functional G300S variant of the cysteinyl leukotriene 1 receptor is associated with atopy in a Tristan da Cunha isolate. Pharmacogenet. Genomics. 2007;17:539-549.

[140] Woolley MJ, Conner AC. Understanding the common themes and diverse roles of the second extracellular loop (ECL2) of the GPCR super-family. Mol. Cell. Endocrinol. 2017;449:3-11.

[141] Dupre DJ, Gouill C Le, Gingras D, et al. Inverse Agonist Activity of Selected Ligands of the Cysteinyl- Leukotriene Receptor 1. Pharmacology. 2004;309:102-108.

[142] Renzette N. Generation of Transformation Competent E. coli. Curr. Protoc. Microbiol. 2011;22:A.3L.1-A.3L.5.

[143] Galleno M, Sick AJ. BACULOVIRUS EXPRESSION VECTOR SYSTEM. Gene Expr. Syst. Elsevier; 1999. p. 331-363.

[144] Monsma SA, Oomens AGP, Blissard GW. The GP64 Envelope Fusion Protein Is an Essential Baculovirus Protein Required for Cell-to-Cell Transmission of Infection. J. Virol. 1996;70:4607-4616.

[145] Massotte D. G protein-coupled receptor overexpression with the baculovirus-insect cell system: a tool for structural and functional studies. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 2003;1610:77-89.

[146] Schägger H. Tricine-SDS-PAGE. Nat. Protoc. 2006;1:16-22.

[147] Stott DI. Immunoblotting and dot blotting. J. Immunol. Methods. 1989;119:153-187.

[148] Alexandrov AI, Mileni M, Chien EYT, et al. Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins. Structure. 2008;16:351-359.

[149] Liu W, Ishchenko A, Cherezov V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat. Protoc. 2014;9:2123-2134.

[150] Weierstall U, James D, Wang C, et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane

134

protein serial femtosecond crystallography. Nat. Commun. 2014;5 (3309):1-15.

[151] Fenalti G, Abola EE, Wang C, et al. Fluorescence Recovery After Photobleaching in Lipidic Cubic Phase (LCP-FRAP). Membr. proteins Eng. Purif. Cryst. 1st ed. Elsevier Inc.; 2015. p. 417-437.

[152] Henrich B, Bergamaschi A, Broennimann C, et al. PILATUS: A single photon counting pixel detector for X-ray applications. Nucl. Instruments Methods Phys. Res. Sect. A Accel. Spectrometers, Detect. Assoc. Equip. 2009;607:247-249.

[153] Bourenkov GP, Popov AN. A quantitative approach to data-collection strategies. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2006;62:58-64.

[154] Kabsch W. XDS. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010;66:125-132.

[155] Giordano R, Ricardo MF, Bourenkov GP, et al. The application of hierarchical cluster analysis to the selection of isomorphous crystals. Acta Crystallogr. Sect. D. 2012;68:649-658.

[156] Hart P, Boutet S, Carini G, et al. The Cornell-SLAC pixel array detector at LCLS. IEEE Nucl. Sci. Symp. Conf. Rec. 2012;538-541.

[157] Yefanov O, Mariani V, Gati C, et al. Accurate determination of segmented X-ray detector geometry. Opt. Express. 2015;23:28459-28470.

[158] McCoy AJ, Grosse-Kunstleve RW, Adams PD, et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 2007;40:658-674.

[159] Emsley P, Lohkamp B, Scott WG, et al. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010;66:486-501.

[160] Bricogne G, Blanc E, Brandl M, et al. BUSTER version 2.10.3. Cambridge, United Kingdom; 2017. p. http://www.globalphasing.com/buster.

[161] Adams PD, Afonine P V., Bunkoczi G, et al. PHENIX : a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010;66:213-221.

[162] Burley SK, Berman HM, Bhikadiya C, et al. RCSB Protein Data Bank: biological macromolecular structures enabling research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology and energy. Nucleic Acids Res. 2019;47:464-474.

[163] Halgren TA. Force Fields: MMFF94. Encycl. Comput. Chem. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd; 2002.

[164] Abagyan R, Totrov M, Kuznetsov D. ICM - A new method for protein modeling and design: Applications to docking and structure prediction from the distorted native conformation. J. Comput. Chem. 1994;15:488-506.

[165] Zhang H, Han GW, Batyuk A, et al. Structural basis for selectivity and diversity in angiotensin II receptors. Nature. 2017;544:327-332.

[166] Jo S, Kim T, Iyer VG, et al. CHARMM-GUI: A web-based graphical user interface for CHARMM. J. Comput. Chem. 2008;29:1859-1865.

[167] Lomize MA, Pogozheva ID, Joo H, et al. OPM database and PPM web server: resources for positioning of proteins in membranes. Nucleic Acids Res. 2012;40:370-376.

[168] Abraham MJ, Van der Spoel D, Lindahl E, et al. GROMACS User Manual version 2018. 2018. p. www.gromacs.org.

[169] Zhang J, Zhang K, Gao Z, et al. Agonist-bound structure of the human P2Y12 receptor. Nature. 2014;509:119-122.

[170] van der Horst E, Peironcely JE, IJzerman AP, et al. A novel chemogenomics analysis of G protein-coupled receptors (GPCRs) and their ligands: a potential strategy for receptor de-orphanization. BMC Bioinformatics. 2010;11:1-12.

[171] Metkar SS, Wang B, Aguilar-Santelises M, et al. Cytotoxic Cell Granule-Mediated Apoptosis. Immunity. 2002;16:417-428.

[172] Palsdottir H, Hunte C. Lipids in membrane protein structures. Biochim. Biophys. Acta -Biomembr. 2004;1666:2-18.

[173] Xu F, Liu W, Hanson MA, et al. Development of an Automated High Throughput LCP-FRAP Assay to Guide Membrane Protein Crystallization in Lipid Mesophases. Cryst. Growth Des. 2011;11:1193-1201.

[174] Luginina A, Gusach A, Marin E, et al. Structure-based mechanism of cysteinyl leukotriene receptor inhibition by antiasthmatic drugs. Sci. Adv. 2019;5:eaax2518.

[175] Chen VB, Arendall WB, Headd JJ, et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2010;66:12-21.

[176] Trinquet E, Bouhelal R, Dietz M. Monitoring Gq-coupled receptor response through inositol phosphate quantification with the IP-One assay. Expert Opin. Drug Discov. 2011;6:981-994.

[177] Wheatley M, Wootten D, Conner M, et al. Lifting the lid on GPCRs: the role of extracellular loops. Br. J. Pharmacol. 2012;165:1688-1703.

[178] Katritch V, Cherezov V, Stevens RC. Structure-Function of the G Protein-Coupled Receptor Superfamily. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2013;53:531-556.

[179] Stauch B, Johansson LC, McCorvy JD, et al. Structural basis of ligand recognition at the human MT1 melatonin receptor. Nature. 2019;569:284-288.

[180] Massink A, Gutierrez-de-Teran H, Lenselink EB, et al. Sodium Ion Binding Pocket Mutations and Adenosine A2A Receptor Function. Mol. Pharmacol. 2015;87:305-313.

[181] Zhang C, Srinivasan Y, Arlow DH, et al. High-resolution crystal structure of human protease-activated receptor 1. Nature. 2012;492:387-392.

[182] Cheng RKY, Fiez-Vandal C, Schlenker O, et al. Structural insight into allosteric modulation of protease-activated receptor 2. Nature. 2017;545:112-115.

[183] Hori T, Okuno T, Hirata K, et al. Na+-mimicking ligands stabilize the inactive state of leukotriene B4 receptor BLT1. Nat. Chem. Biol. 2018;14:262-269.

[184] Srivastava A, Yano J, Hirozane Y, et al. High-resolution structure of the human GPR40 receptor bound to allosteric agonist TAK-875. Nature. 2014;513:124-127.

[185] Hanson MA, Roth CB, Jo E, et al. Crystal Structure of a Lipid G Protein-Coupled Receptor. Science. 2012;335:851-855.

[186] Cao C, Tan Q, Xu C, et al. Structural basis for signal recognition and transduction by platelet-activating-factor receptor. Nat. Struct. Mol. Biol. 2018;25:488-495.

[187] Taniguchi R, Inoue A, Sayama M, et al. Structural insights into ligand recognition by the lysophosphatidic acid receptor LPA6. Nature. 2017;548:356-360.