Новые синаптические рецепторы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, доктор химических наук Петренко, Александр Георгиевич

• Петренко, Александр Георгиевич
• доктор химических наук
• 2004

Оглавление диссертации доктор химических наук Петренко, Александр Георгиевич

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1 Семейство семистолбовых рецепторов с GPS доменом и модулями клеточной адгезии — гибридные рецепторы нового типа.

1.1.1. EGF-содержащие гибридные рецепторы иммунной системы.

1.1.2. Кальций-независимые рецепторы латротоксина CIRL.

1.1.3. Рецепторы Flamingo.

1.1.4. Мозговые рецепторы BAI.

1.Ь5— Другие гибридные рецепторы.

1.2. Особенности субъединичной структуры гибридных рецепторов.

1.2.1. Протеолитичеслий процессинг гибридных рецепторов.

1.2.2. GPS-подобные домены в других рецепторах.

2. Результаты и их обсуждение.

2.1. Функциональное семейство рецепторов латротоксина: нейрексины,

CIRL рецепторы и тирозин-фосфатаза сигма.

2.1.1. Выделение рецепторов латротоксина и сопутствующих белков.

2.1.2. Идентификация рецепторных и сопутствующих белков.

2.1.3. Клонирование и доменная структура рецепторов латротоксина.

2.1.4. Экспрессия рецепторов в эукариотических клеточных линиях.

2.1.5. Определение участков связывания латротоксина в рецепторах.

2.1.5.1. Участок связывания CIRL.

2.1.5.2. Участок связывания тирозин-фосфатазы сигма.

2.1.6. Идентификация комплексов латротоксина с рецепторами в мембрнах мозга.

2.1.7. Функциональная экспрессия рецепторов в хромафинных клетках.

2.1.8. Нейрексофилин - эндогенный лиганд нейрексина.

2.1.9. Взаимодействие рецепторов с синаптотагмином и синтаксином.

2.2. Структурные особенности CIRL рецепторов.

2.2.1. Двух-субъединичная структура CIRL - иммунохимический и масс- спектрометрический анализ.

2.2.2. GPS домен - сайт внутриклеточного протеолиза гибридных рецепторов.

2.2.3. Внутриклеточная локализация первичного протеолиза CIRL.

2.2.4. Растворимая форма CIRL рецепторов.

2.2.5. Внеклеточный протеолиз рецепторов и его регуляция.

2.2.6. Модель биосинтеза и протеолитического процессинга CIRL рецепторов.

3. Экспериментальная часть.

4. Список сокращений.

5. Выводы.

6. Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые синаптические рецепторы»

Функционирование нервной системы определяется высоко организованным взаимодействием нервных клеток, образующих развитую сеть межклеточных синаптических контактов. Синапсы служат для направленной, тонко регулируемой передачи сигналов от одной клетки к другой. Направленность передачи сигнала — обеспечивается существованием специальных надмолекулярных структур в месте синаптического контакта - пресинаптического аппарата, обеспечивающего выброс нейромедиатора путем экзоцитоза синаптических пузырьков на одной клетке и постсинаптических рецепторных комплексов на другой клетке. Образование и исчезновение синаптических контактов является регулируемым процессом, обеспечивающим организацию сложных сетей передачи и обработки сигналов в мозгу.

Детальное понимание механизмов синаптической передачи и синаптогенеза требует идентификации и характеристики молекулярных компонентов синапса. Несмотря на прогресс, достигнутый в этой области в течение последних лет, многие молекулы, важные для функционирования синапсов, остаются неизвестными, либо мало изученными. В наибольшей степени данное относится к пресинаптическому аппарату, который осуществляет сложные процессы регулируемого транспорта синаптических пузырьков и их слияние с клеточной мембраной.

Методические сложности изучения молекулярных механизмов выброса нейромедиаторов определяются тем, что в отличие от других биологических процессов таких как, например, ферментативные реакции или трансмембранный транспорт ионов, реконструкция функционального пресинаптического аппарата in vitro остается крайне сложной и в настоящее время неосуществленной задачей. Выделение белковых компонентов пресинапса на основе легко определяемой биохимической характеристики не представляется возможным. В связи с этим, исследователями синаптической передачи были использованы непрямые подходы для идентификации пресинаптических белков, такие как анализ случайных и направленных мутаций в различных организмах, выделение и систематический анализ белковых компонентов синаптических пузырьков, использование пресинаптических нейротоксинов и пр.

На сегодняшний день, наши знания о структуре пресинаптического аппарата ограничиваются коротким и, очевидно, неполным списком белков, которые предположительно участвуют в процессе выброса нейромедиаторов. Вышеизложенное позволяет заключить, что идентификация и структурно-функциональное исследование пресинаптических белков является актуальной проблемой современной физико-химической биологии.

Основной целью настоящей работы явилась идентификация, структурная и биохимическая характеристика ранее неизвестных белковых компонентов пресинаптического аппарата.

В качестве ключевого методического подхода к решению данной задачи было выбрано использование природного нейротоксина альфа-латротоксина (далее -латротоксина) в качестве инструмента исследования. Латротоксин является пресинаптическим токсином, вызывающим массовый выброс нейромедиатора путем стимуляции экзоцитоза синаптических везикул (Ceccarelli and Hurlbut, 1980; Gorio et al., 1978; Tzeng et al., 1978; Tzeng and Siekevitz, 1978; Tzeng and Siekevitz, 1979a; Tzeng and Siekevitz, 1979b). Латротоксин стимулирует выброс различных нейромедиаторов, в том числе ацетилхолина, глютамата, ГАМК и др. Более того, латротоксин стимулирует экзоцитоз в секреторных клетках, таких как хромафинные и панкреатические клетки (Bittner and Holz, 2000; Bittner et al., 1998; Lang et al., 1998).

Многочисленные исследования указывают на то, что действие латротоксина определяется наличием специфических белков на поверхности клетки, с которыми токсин связывается с высокой аффинностью в наномолярном диапазоне. За данными белками исторически утвердилось наименование «рецепторы латротоксина» (Meldolesi, 1982), хотя, поскольку латротоксин не является физиологическим эндогенным лигандом данных мембранных белков, правильнее было бы их именовать «акцепторами латротоксина».

В результате связывания токсина с мембранными рецепторами, его молекулы частично погружаются в мембрану и образуют катион-селективные поры, что объясняет большинство эффектов латроксина на клетку, включая стимуляцию секреции и цитотоксичность (Grasso et al., 1980; Krasil'nikov et al., 1982; Mironov et al., 1986; Orlova et al., 2000; Robello, 1989; Tse and Tse, 1999). В то же время ряд экспериментов указывает на то, что действие латротоксина возможно в условиях, когда ионные потоки контролируются и повышения кальция внутри клетки не наблюдается (Capogna et al., 1996; Meldolesi et al., 1983; Misler and Falke, 1987; Rosenthal et al., 1990). В частности было предложено, что латротоксин частично проходит через цитоплазматическую мембрану и за счет внутриклеточных взаимодействий активирует гипотетический эффектор, сопряженный с аппаратом экзоцитоза (Khvotchev and Sudhof, 2000).

Несмотря на то, что детальный механизм действия латротоксина остается предметом дискуссии, не вызывает сомнений тот факт, что его рецепторы, присутствующие в нервных тканях в относительно низких концентрациях, являются маркерами зон экзоцитоза и вовлечены в регуляцию нейросекреции. Этим определяется интерес к рецепторам латротоксина и интенсивные исследования в различных лабораториях мира, направленные на их идентификацию и структурно-функциональную характеристику (Rosenthal and Meldolesi, 1989).

Начальные эксперименты по характеристике рецепторов латротоксина показали, что они обратимо связывают латротоксин с высокой аффинностью (Кд порядка Ю~10 М"1), имеют белковую природу и сконцентрированы в зонах пресинаптических контактов (Grasso et al., 1982; Meldolesi, 1982; Tzeng and Siekevitz, 1979b; Ushkarev Iu and Grishin, 1986; Valtorta et al., 1984). Также было показано, что количество латротоксин-связывающих участков уменьшается примерно в два раза при удалении кальция из внешней среды хелатированием (Meldolesi, 1982).

В середине 80-х годов прошлого столетия была предложена методика солюбилизации рецепторов латротоксина неионными детергентами, в частности тритоном Х-100. Солюбилизация сохраняла латротоксин-связывающие свойства рецепторов и открывала возможность для их выделения хроматографическими методами. Первая попытка выделения рецепторов латротоксина завершилась идентификацией мультимерного комплекса массой 200 кДа, состоящего из субъединиц массой 54 и 66 кДа (Scheer and Meldolesi, 1985). Однако, поскольку количество выделенного белка находилось на грани детекции, достоверность идентификации рецепторов вызывала сомнение.

На первом этапе данной работы была поставлена задача вьщеления рецепторов латротоксина и их первичная характеристика белковым электрофорезом. При этом учитывалось, что возможно также со-выделение белков, не являющихся непосредственно рецепторами токсина, но специфически взаимодействующих с ними, а также примесных белков, не имеющих отношения к рецепторам.

В связи с этим, на втором этапе работы планировалось идентифицировать выделенные белки по их аминокислотной последовательности, получить антитела к ним и определить их роль в рецепции латротоксина. Ключевой задачей на этом этапе стало клонирование структурных генов ранее неизвестных белков, определение их нуклеотидной последовательности, и функциональная экспрессия в эукариотических клетках.

Целью следующего этапа исследования стало определение мембранной топологии и доменной структуры найденных рецепторов путем компьютерного анализа их аминокислотной последовательности в сочетании с иммунохимическим анализом. Также была поставлена задача определения участков связывания латротоксина в полипептидных цепях рецепторов.

В ходе данной работы был открыт рецептор, являющийся представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии. Было показано, что данный рецептор, кодируемый одним геном, состоит из двух субъединиц. В связи с этим, была поставлена отдельная задача по детальному изучению механизмов эндогенного протеолиза данного рецептора с целью определения участка расщепления и локализации клеточного отдела протеолитического процессинга.

В процессе исследования нами была разработана оригинальная методика и осуществлено выделение рецепторов латротоксина и ассоциированных с ними белков аффинной хроматографией. Впервые установлено, что латротоксин имеет три типа белковых рецепторов в нервных тканях: нейрексин или кальций-зависимый рецептор, CIRL (Calcium-Independent Receptor of Latrotoxin - кальций-независимый рецептор латротоксина), являющиеся ранее неизвестными белками, и тирозин-фосфатазу сигма РТР а. Интересно, что рецепторы латротоксина не имеют между собой заметной структурной гомологии и принадлежат к трем различным классам рецепторов поверхности клетки. Нейрексин является белком клеточной адгезии с одним трансмембранным сегментом, CIRL - G белок-сопряженным рецептором, а РТРа - мембранной тирозин-фосфатазой.

На основе информации о частичной аминокислотной последовательности осуществлено клонирование полноразмерной кДНК рецептора CIRL. По определенной нуклеотидной последовательности выведена аминокислотная последовательность состоящая из 1471 остатка. Клонированы также два близких гомолога CIRL - CIRL-2 и CIRL-3. Показано, что CIRL-1 и CIRL-3 экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как CIRL-2 встречается практически во всех тканях. Установлено, что рецепторы CIRL принадлежат семейству 11(B) G-белок-сопряженных рецепторов. В составе большой внеклеточной части CIRL идентифицированы домены характерные для белков клеточной адгезии: лектиновый, олфактомединовый и муциновый. Таким образом, CIRL является представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии.

Экспрессией CIRL и РТРо в эукариотических клеточных линиях и хромафинных клетках доказано, что клонированные CIRL и РТРа являются функционально-активными рецепторами латротоксина. Направленным мутагенезом определено расположение основных участков связывания латротоксина в CIRL и РТРо.

Впервые установлено, что CIRL, кодируемый одним геном, состоит из двух различных нековалентно связанных субъединиц - р120 и р85, что необычно для G-белок-сопряженных рецепторов. Обнаружена растворимая форма CIRL, представляющая собой комплекс внеклеточной субъединицы р120 и короткого пептидного N-концевого фрагмента р85. Показано, что двухсубъединичная структура CIRL является следствием эндогенного внутриклеточного протеолиза и определен сайт расщепления рецептора.

Установлено, что сайт протеолиза находится внутри цистеин- и триптофан-богатого домена содержащего ранее неизвестный структурный мотив, характерный для семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии. Поскольку мутации в этом домене приводят к устойчивости CIRL к расщеплению, предложено присвоить данному мотиву наименование GPS (G protein-coupled receptor Proteolysis Site).

Полученные нами результаты имеют не только научное, но и прикладное значение. Основная масса широко используемых в настоящее время лекарств, в качестве мишеней, используют G белок-сопряженные рецепторы. Поэтому, каждый вновь открытый G белок-сопряженный рецептор представляет собой потенциальный объект для создания новых лекарств. Структурный и предварительный функциональный анализ CIRL позволяет предположить, что химические соединения, являющиеся его агонистами либо антагонистами, могут быть использованы для лечения неврологических и психических заболеваний, сопровождающихся нарушениями нейросекреции. Также возможно, что модуляция активности членов семейства рецепторов CERL позволит контролировать рост злокачественных опухолей. В связи с потенциальной практической значимостью рецептора CIRL на его открытие был получен патент.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Петренко, Александр Георгиевич

140 ВЫВОДЫ

1. Разработана оригинальная методика и осуществлено выделение нейрональных рецепторов пресинаптического нейротоксина латротоксина. Открыты два ранее неизвестных белка: нейрексин и CIRL (Calcium-Independent Receptor of Latrotoxin), являющиеся высокоаффинными рецепторами латротоксина. Впервые показано, что ранее известный белок тирозин-фосфатаза сигма (РТРо) также является рецептором латротоксина. Таким образом, латротоксин является уникальным примером природного токсина, имеющего три независимые и структурно отличные мишени, принадлежащие к трем различным классам рецепторов поверхности клетки.

2. Осуществлено клонирование полноразмерной кДНК рецептора CIRL, определена ее нуклеотидная последовательность и выведена полная аминокислотная последовательность рецептора CIRL из мозга крысы, состоящая из 1471 остатка.

3. Показано, что CIRL принадлежит к семейству 11(B) G белок-сопряженных рецепторов. В составе большой внеклеточной части CIRL обнаружены структурные домены, характерные для белков клеточной адгезии: лектиновый, олфактомединовый и муциновый. Таким образом, CIRL является представителем ранее неизученного класса природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии.

4. Клонированы кДНК и определены полные аминокислотные последовательности двух других рецепторов, высоко гомологичных CIRL - CIRL-2 и CIRL-3. Показано, что CIRL (CIRL-1) и CIRL-3 экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как CIRL-2 присутствует практически во всех тканях.

5. Осуществлена экспрессия CIRL в эукариотических клеточных линиях и хромафинных клетках. Анализом трансфецированных клеток доказано, что клонированный CIRL действительно является высокоаффинным рецептором латротоксина, в то время как CIRL-2 - низкоаффинным рецептором латротоксина. Функциональная экспрессия данных рецепторов в хромафинных клетках подтвердила, что взаимодействие с ними латротоксина приводит к стимуляции экзоцитоза.

6. Определено местоположение основного участка связывания латротоксина в районе 467770 аминокислотных остатков N-концевой внеклеточной части CIRL.

7. Установлено, что CIRL состоит из двух нековалентно связанных субъединиц - р120 и р85, кодируемых одним геном. Показано, что двухсубъединичная структура CIRL является следствием эндогенного внутриклеточного протеолиза рецептора.

8. Определен участок протеолитического расщепления CIRL, находящийся в его внеклеточной части между остатками Leug37 и ТЬгюв. Компьютерным анализом показано, что данный сайт протеолиза находится внутри цистеин- и триптофан-богатого домена с ранее неизвестным структурным мотивом CX2WX6-16WX4CX10-22CXC, получившим наименование GPS (Q protein-coupled receptor Eroteolysis Site). Мутации в GPS домене приводят к устойчивости CIRL к протеолизу. Предложена гипотеза, что наличие GPS домена является ключевым фактором, определяющим эндогенный протеолиз и двух-субъединичную структуру гибридных G белок-сопряженных/адгезивных рецепторов.

9. Открыт новый секретируемый гликопротеин нейрексофилин, способный образовывать комплексы с нейрексином, и определена его полная аминокислотная последовательность по структуре кДНК крысы и быка. Структурные особенности нейрексофилина свидетельствуют о том, что он является эндогенным лигандом нейрексина.

10. Обнаружено взаимодействие рецепторов латротоксина с синаптотагмином и синтаксином, указывающее на то, что рецепторы латротоксина являются компонентами пресинаптических комплексов вовлеченных в экзоцитоз.

БЛАГОДАРНОСТИ

Осуществлению намеченных планов и завершению работы над диссертацией во многом способствовали плодотворные дискуссии с академиками РАН Вадимом Тихоновичем Ивановым и Анатолием Ивановичем Мирошниковым, членами Национальной Академии США Томасом Зюдофом и Йосифом Шлессенджером, а также с членами-корреспондентами РАН Евгением Васильевичем Гришиным и Александром Габйбовичем Габибовым, за что автор им искренне признателен.

Автор считает своим приятным долгом поблагодарить коллег и друзей, совместно с которыми были получены экспериментальные результаты, составившие основу данной работы: Валерия Красноперова, Константина Ищенко, Виктора Коваленко, Юрия Ушкарева и Олега Чепурного

Работа выполнялась при поддержке Программы по Физико-Химической Биологии РАН, Национальных Институтов Здоровья (США) и Медицинского Института Говарда Хьюза (США).

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Петренко, Александр Георгиевич, 2004 год

1. Abe, J., Fukuzawa, Т., and Hirose, S. (2002). Cleavage of Ig-Hepta at a "SEA" module and at a conserved G protein-coupled receptor proteolytic site. J Biol Chem 277,23391-23398.

2. Aicher, В., Lerch, M. M., Muller, Т., Schilling, J., and Ullrich, A. (1997). Cellular redistribution of protein tyrosine phosphatases LAR and PTPsigma by inducible proteolytic processing. J Cell Biol 138,681-696.

3. Aust, G., Eichler, W., Laue, S., Lehmann, I., Heldin, N. E., Lotz, O., Scherbaum, W. A., Dralle, H., and Hoang-Vu, C. (1997). CD97: a dedifferentiation marker in human thyroid carcinomas. Cancer Res 57,1798-1806.

4. Aust, G., Steinert, M., Schutz, A., Boltze, C., Wahlbuhl, M., Hamann, J., and Wobus, M. (2002). CD97, but not its closely related EGF-TM7 family member EMR2, is expressed on gastric, pancreatic, and esophageal carcinomas. Am J Clin Pathol 118,699-707.

5. Bin Sun, H., Ruan, Y., Xu, Z. C., and Yokota, H. (2002). Involvement of the calcium-independent receptor for alpha-latrotoxin in brain ischemia. Brain Res Mol Brain Res 104,246249.

6. Bittner, M. A., and Holz, R. W. (2000). Latrotoxin stimulates secretion in penneabilized cells by regulating an intracellular Ca2+ and ATP-dependent event: a role for protein kinase C. J Biol Chem 275,25351-25357.

7. Bittner, M. A., Krasnoperov, V. G., Stuenkel, E. L., Petrenko, A. G., and Holz, R. W. (1998). A Ca2+-independent receptor for alpha-latrotoxin, CIRL, mediates effects on secretion via multiple mechanisms. J Neurosci 18,2914-2922.

8. Capogna, M., Gahwiler, В. H., and Thompson, S. M. (1996). Calcium-independent actions of alpha-latrotoxin on spontaneous and evoked synaptic transmission in the hippocampus. J Neurophysiol 76, 3149-3158.

9. Ceccarelli, В., and Hurlbut, W. P. (1980). Ca2+-dependent recycling of synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol 87,297-303.

10. Das, G., Reynolds-Kenneally, J., and Mlodzik, M. (2002). The atypical cadherin Flamingo links Frizzled and Notch signaling in planar polarity establishment in the Drosophila eye. Dev Cell 2, 655-666.

11. Davletov, B. A., Shamotienko, O. G., Lelianova, V. G., Grishin, E. V., and Ushkaiyov, Y. A. (1996). Isolation and biochemical characterization of a Ca2+-independent alpha-latrotoxin-binding protein. J Biol Chem 271,23239-23245.

12. Eichler, W. (2000). CD97 isoform expression in leukocytes. J Leukoc Biol 68, 561-567.

13. Eichler, W., Hamann, J., and Aust, G. (1997). Expression characteristics of the human CD97 antigen. Tissue Antigens 50,429-438.

14. Fanto, M., and McNeill, H. (2004). Planar polarity from flies to vertebrates. J Cell Sci 117, 527533.

15. Formstone, C. J., and Little, P. F. (2001). The flamingo-related mouse Celsr family (Celsrl-3) genes exhibit distinct patterns of expression during embryonic development. Mech Dev 109, 9194.

16. Fredriksson, R., Gloriam, D. E., Hoglund, P. J., Lagerstrom, M. C., and Schioth, H. B. (2003). There exist at least 30 human G-protein-coupled receptors with long Ser/Thr-rich N-termini. Biochem Biophys Res Commun 301,725-734.

17. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Hoglund, P. J., and Schioth, H. B. (2002). Novel human G protein-coupled receptors with long N-terminals containing GPS domains and Ser/Thr-rich regions. FEBS Lett 531,407-414.

18. Fujiwara, Т., Mammoto, A., Kim, Y., and Takai, Y. (2000). Rho small G-protein-dependent binding of mDia to an Src homology 3 domain-containing IRSp53/BAIAP2. Biochem Biophys Res Commun 271,626-629.

19. Gao, F. В., Brenman, J. E., Jan, L. Y., and Jan, Y. N. (1999). Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev 13,2549-2561.

20. Gao, F. В., Kohwi, M., Brenman, J. E., Jan, L. Y., and Jan, Y. N. (2000). Control of dendritic field formation in Drosophila: the roles of flamingo and competition between homologous neurons. Neuron 28,91-101.

21. Gorio, A., Rubin, L. L., and Mauro, A. (1978). Double mode of action of black widow spider venom on frog neuromuscular junction. J Neurocytol 7,193-202.

22. Grasso, A., Alema, S., Rufini, S., and Senni, M. I. (1980). Black widow spider toxin-induced calcium fluxes and transmitter release in a neurosecretory cell line. Nature 283,774-776.

23. Grasso, A., Pelliccia, M., and Alema, S. (1982). Characterization of alpha-latrotoxin interaction with rat brain synaptosomes and PC12 cells. Toxicon 20,149-156.

24. Hamann, J., Hartmann, E., and van Lier, R. A. (1996a). Structure of the human CD97 gene: exon shuffling has generated a new type of seven-span transmembrane molecule related to the secretin receptor superfamily. Genomics 32,144-147.

25. Hamann, J., van Zeventer, C., Bijl, A., Molenaar, C., Tesselaar, K., and van Lier, R. A. (2000). Molecular cloning and characterization of mouse CD97. Int Immunol 12,439-448.

26. Hamann, J., Vogel, В., van Schijndel, G. M., and van Lier, R. A. (1996b). The seven-span transmembrane receptor CD97 has a cellular ligand (CD55, DAF). J Exp Med 184,1185-1189.

27. Hamann, J., Wishaupt, J. O., van Lier, R. A., Smeets, T. J., Breedveld, F. C., and Так, P. P. (1999). Expression of the activation antigen CD97 and its ligand CD55 in rheumatoid synovial tissue. Arthritis Rheum 42,650-658.

28. Jaspars, L. H., Vos, W., Aust, G., Van Lier, R. A., and Hamann, J. (2001). Tissue distribution of the human CD97 EGF-TM7 receptor. Tissue Antigens 57,325-331.

29. Kaur, В., Brat, D. J., Calkins, С. C., and Van Meir, E. G. (2003). Brain angiogenesis inhibitor 1 is differentially expressed in normal brain and glioblastoma independently of p53 expression. Am J Pathol 162,19-27.

30. Khvotchev, M., and Sudhof, Т. C. (2000). alpha-latrotoxin triggers transmitter release via direct insertion into the presynaptic plasma membrane. Embo J19, 3250-3262.

31. Kierszenbaum, A. L. (2004). Polycystics: what polycystic kidney disease tells us about sperm. Mol Reprod Dev 67,385-388.

32. King, N., Hittinger, С. Т., and Carroll, S. B. (2003). Evolution of key cell signaling and adhesion protein families predates animal origins. Science 301,361-363.

33. Kirchhoff, C., Osterhoff, С., Pera, I., and Schroter, S. (1998). Function of human epididymal proteins in sperm maturation. Andrologia 30,225-232.

34. Krasil'nikov, О. V., Ternovskii, V. I., and Tashmukhamedov, B. A. (1982). Channel formation properties of black widow venom. Biofizika 27,72-75.

35. Krasnoperov, V. G., Beavis, R., Chepumy, O. G., Little, A. R., Plotnikov, A. N., and Petrenko, A. G. (1996). The calcium-independent receptor of alpha-latrotoxin is not a neurexin. Biochem Biophys Res Commun 227,868-875.

36. Kreienkamp, H. J., Soltau, M., Richter, D., and Bockers, T. (2002). Interaction of G-protein-coupled receptors with synaptic scaffolding proteins. Biochem Soc Trans 30,464-468.

37. Matsushita, H., Lelianova, V. G., and Ushkaryov, Y. A. (1999). The latrophilin family: multiply spliced G protein-coupled receptors with differential tissue distribution. FEBS Lett 443,348352.

38. McKnight, A. J., and Gordon, S. (1996). EGF-TM7: a novel subfamily of seven-transmembrane-region leukocyte cell-surface molecules. Immunol Today 17,283-287.

39. McKnight, A. J., and Gordon, S. (1998). The EGF-TM7 family: unusual structures at the leukocyte surface. J Leukoc Biol 63,271-280.

40. McMillan, D. R., Kayes-Wandover, К. M., Richardson, J. A., and White, P. C. (2002). Very large G protein-coupled receptor-1, the largest known cell surface protein, is highly expressed in the developing central nervous system. J Biol Chem 277, 785-792.

41. Meldolesi, J. (1982). Studies on alpha-latrotoxin receptors in rat brain synaptosomes: correlation between toxin binding and stimulation of transmitter release. J Neurochem 38,1559-1569.

42. Meldolesi, J., Madeddu, L., Torda, M., Gatti, G., and Niutta, E. (1983). The effect of alpha-latrotoxin on the neurosecretory PC12 cell line: studies on toxin binding and stimulation of transmitter release. Neuroscience 10,997-1009.

43. Mengerink, K. J., Moy, G. W., and Vacquier, V. D. (2002). suREJ3, a polycystin-1 protein, is cleaved at the GPS domain and localizes to the acrosomal region of sea urchin sperm. J Biol Chem 277,943-948.

44. Mironov, S. L., Sokolov Yu, V., Chanturiya, A. N., and Lishko, V. K. (1986). Channels produced by spider venoms in bilayer lipid membrane: mechanisms of ion transport and toxic action. Biochim Biophys Acta 862,185-198.

45. Misler, S., and Falke, L. C. (1987). Dependence on multivalent cations of quantal release of transmitter induced by black widow spider venom. Am J Physiol 253, C469-476.

46. Mori, K., Kanemura, Y., Fujikawa, H., Nakano, A., Ikemoto, H., Ozaki, I., Matsumoto, Т., Tamura, K., Yokota, M., and Arita, N. (2002). Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1) is expressed in human cerebral neuronal cells. Neurosci Res 43,69-74.

47. Obermann, H., Samalecos, A., Osteihoff, C., Schroder, В., Heller, R., and Kirchhoff, C. (2003). HE6, a two-subunit heptahelical receptor associated with apical membranes of efferent and epididymal duct epithelia. Mol Reprod Dev 64,13-26.

48. Osteihoff, C., Ivell, R., and Kirchhoff, C. (1997). Cloning of a human epididymis-specific mRNA, HE6, encoding a novel member of the seven transmembrane -domain receptor superfamily. DNA Cell Biol 16,379-389.

49. Ovchinnikov Yu, A. (1982). Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure-function relationships. FEBS Lett 148,179-191.

50. Petrenko, A. G., Kovalenko, V. A., Shamotienko, O. G., Surkova, I. N., Tarasyuk, T. A., Ushkaryov Yu, A., and Grishin, E. V. (1990a). Isolation and properties of the alpha-latrotoxin receptor. Embo J 9,2023-2027.

51. Pierce, K. L., Premont, R. Т., and Lefkowitz, R. J. (2002). Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol 3,639-650.

52. Ponting, C. P., Hofmann, K., and Bork, P. (1999). A latrophilin/CL-l-like GPS domain in polycystic 1. Curr Biol 9, R585-588.

53. Robello, M. (1989). Dependence of the conductance of the alpha-latrotoxin channel on applied potential and potassium concentration. Biochim Biophys Acta 978,179-184.

54. Rosenthal, L., and Meldolesi, J. (1989). Alpha-latrotoxin and related toxins. Pharmacol Ther 42, 115-134.

55. Rosenthal, L., Zacchetti, D., Madeddu, L., and Meldolesi, J. (1990). Mode of action of alpha-latrotoxin: role of divalent cations in Ca2(+)-dependent and Ca2(+)-independent effects mediated by the toxin. Mol Pharmacol 38, 917-923.

56. Scheer, H., and Meldolesi, J. (1985). Purification of the putative alpha-latrotoxin receptor from bovine synaptosomal membranes in an active binding form. Embo J 4,323-327.

57. Senti, K. A., Usui, Т., Войске, К., Greber, U., Uemura, Т., and Dickson, B. J. (2003). Flamingo regulates R8 axon-axon and axon-target interactions in the Drosophila visual system. Curr Biol 13, 828-832.

58. Shiratsuchi, Т., Futamura, M., Oda, К., Nishimori, H., Nakamura, Y., and Tokino, T. (1998a). Cloning and characterization of BAI-associated protein 1: a PDZ domain-containing protein that interacts with BAI1. Biochem Biophys Res Commun 247,597-604.

59. Steinert, M., Wobus, M., Boltze, C., Schutz, A., Wahlbuhl, M., Hamann, J., and Aust, G. (2002). Expression and regulation of CD97 in colorectal carcinoma cell lines and tumor tissues. Am J Pathol 161,1657-1667.

60. Sudhof, Т. C. (2001). alpha-Latrotoxin and its receptors: neurexins and CIRL/latrophilins. Annu Rev Neurosci 24,933-962.

61. Tobaben, S., Sudhof, Т. C., and Stahl, B. (2000). The G protein-coupled receptor CL1 interacts directly with proteins of the Shank family. J Biol Chem 275,36204-36210.

62. Tobaben, S., Sudhof, Т. C., and Stahl, B. (2002). Genetic analysis of alpha-latrotoxin receptors reveals functional interdependence of CIRL/latrophilin 1 and neurexin 1 alpha. J Biol Chem 277, 6359-6365.

63. Tse, F. W., and Tse, A. (1999). Alpha-latrotoxin stimulates inward current, rise in cytosolic calcium concentration, and exocytosis in at pituitary gonadotropes. Endocrinology 140,30253033.

64. Tzeng, M. C., Cohen, R. S., and Siekevitz, P. (1978). Release of neurotransmitters and depletion of synaptic vesicles in cerebral cortex slices by alpha-latrotoxin from black widow spider venom. Proc Natl Acad Sci U S A 75,4016-4020.

65. Tzeng, M. C., and Siekevitz, P. (1978). The effect of the purified major protein factor (alpha-latrotoxin) of black widow spider venom on the release of acetylcholine and norepinephrine from mouse cerebral cortex slices. Brain Res 139,190-196.

66. Tzeng, M. C., and Siekevitz, P. (1979a). Action of alpha-latrotoxin from black widow spider venom on a cerebral cortex preparation: release of neurotransmitters, depletion of synaptic vesicles, and binding to membrane. Adv Cytopharmacol 3,117-127.

67. Tzeng, M. С., and Siekevitz, P. (1979b). The binding interaction between alpha-latrotoxin from black widow spider venom and a dog cerebral cortex synaptosomal membrane preparation. J Neurochem 33,263-274.

68. Ushkarev Iu, A., and Grishin, E. V. (1986). Neurotoxin of the black widow spider and its interaction with receptors from the rat brain. Bioorg Khim 12,71-80.

69. Usui, Т., Shima, Y., Shimada, Y., Hirano, S., Burgess, R. W., Schwarz, T. L., Takeichi, M., and Uemura, T. (1999). Flamingo, a seven-pass transmembrane cadherin, regulates planar cell polarity under the control of Frizzled. Cell 98,585-595.

70. Visser, L., de Vos, A. F., Hamann, J., Melief, M. J., van Meurs, M., van Lier, R. A., Laman, J. D., and Hintzen, R. Q. (2002). Expression of the EGF-TM7 receptor CD97 and its Ugand CD55 (DAF) in multiple sclerosis. J Neuroimmunol 132,156-163.

71. White, G. R., Varley, J. M-, and Heighway, J. (1998). Isolation and characterization of a human homologue of the latrophilin gene from a region of lp31.1 implicated in breast cancer. Oncogene 17,3513-3519.

72. Yan, H., Grossman, A., Wang, H., D*Eustachio, P., Mossie, K., Musacchio, J. M., Silvennoinen, O., and Schlessinger, J. (1993). A novel receptor tyrosine phosphatase-sigma that is highly expressed in the nervous system. J Biol Chem 268,24880-24886.

73. Zhang, W. R., Hashimoto, N., Ahmad, F., Ding, W., and Goldstein, B. J. (1994). Molecular cloning and expression of a unique receptor-like protein-tyrosine-phosphatase in the leucocyte-common-antigen-related phosphate family. Biochem J 302 ( Ptl), 39-47.