Гибридные белки на основе 10-го домена фибронектина для молекулярной диагностики и терапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.08, кандидат наук Гапизов Султан Шахбанович

• Гапизов Султан Шахбанович
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Гапизов Султан Шахбанович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цель и задачи исследования

1.3. Научная новизна работы

1.4. Практическая значимость исследования

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1.6. Апробация результатов

1.7. Публикации

1.8. Личный вклад автора в проведение исследования

1.9. Структура и объем диссертации

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Молекулярные механизмы воспалительных процессов

2.1.1. Неоангиогенез и его молекулярные маркеры

2.1.1.1. Интегрины

2.1.1.2. Строение и функции УЕОБ и УЕОРЯб

2.1.1.3. Сигнальный путь УЕОБК2 и его роль в формировании сосудов

2.1.2. Роль ФНО в развитии хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваний

2.2. Стратегии молекулярной диагностики и терапии воспалительных заболеваний

2.2.1. Моноклональные антитела и их производные

2.2.2. Иммуноадгезины

2.2.3. Природные и искусственные антагонисты

2.2.4. Альтернативные каркасные белки (АКБ)

2.2.5. Проблемы, связанные с использованием АКБ, и пути их решения

2.3. Использование 10 домена фибронектина 3 типа человека (10Еп3) в качестве искусственного связывающего белка

2.3.1. Характеристика 10Бп3

2.3.2. Методы получения искусственных связывающих белков на основе 10Бп3. Стратегии селекции комбинаторных библиотек

2.3.2.1. мРНК-дисплей

2.3.2.2. ОБ-дисплей

2.3.2.3. Фаговый дисплей

2.3.2.4. Дрожжевой дисплей

2.3.2.5. Двугибридный дрожжевой дисплей

2.3.2.6. Бактериальный дисплей

2.3.3. Применение связывающих белков на основе 10Fn3 в молекулярной диагностике и терапии

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Растворы и реагенты

3.2. Методы

3.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

3.2.2. Рестрикция

3.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.2.4. Выделение плазмидной ДНК из агарозных гелей

3.2.5. Лигирование

3.2.6. Конструирование плазмид

3.2.6. Экспрессия рекомбинантных генов

3.2.7. Трансформация

3.2.8. ПЦР-анализ клонов

3.2.9. Выделение плазмидной ДНК из E.coli

3.2.10. Выделение и анализ фракций, содержащих белки внешней мембраны

3.2.11. Селекция ФНО-связывающих вариантов 10Fn3 методом бактериального дисплея

3.2.12. Анализ эффективности селекции методом ИФА

3.2.13. Клонирование библиотеки генов 10Fn3 в вектор для прямой экспрессии

3.2.14. Анализ библиотеки клонов

3.2.15. Выделение белков

3.2.16. Аналитическая гель-фильтрация

3.2.17. Электрофорез белков в SDS-ПААГ

3.2.18. Вестерн-блот

3.2.19. Определение цитотоксической активности ФНО

3.2.20. Определение Кё комплекса 10Fn3 и ФНО

3.2.21. Цельноклеточная ELISA и измерение эстеразной активности

3.2.22. Измерение спектров флуоресценции

3.2.23. Изучение термической стабильности ABD-содержащих гибридных белков

3.2.24. Конфокальная микроскопия

3.2.25. Исследование образования комплексов между ABD-содержащими гибридными белками и HSA

3.2.26. Исследование времени циркуляции гибридных белков в кровотоке мышей

3.2.27. Исследование биораспределения гибридных белков в организме мышей

3.2.28. Статистическая обработка результатов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Конструирование системы бактериального дисплея на основе гибридного аутотранспортера AT877 Psychrobacter cryohalolentis K5T

4.1.1. Экспрессия 10Fn3 в E. coli с использованием транслокаторного домена AT877

4.1.2. Экспрессия АТ с гибридными пассажирскими доменами, включающими 10Fn3 и Est877 или EstPc

4.1.3. Конструирование и экспрессия комбинаторной библиотеки вариантов генов 10Fn3 в плазмиде pEFN877

4.1.4. Селекция комбинаторной библиотеки методом бактериального дисплея

4.1.5. Получение и характеристика ФНО-связывающих белков

4.2. Гибридные флуоресцентные белки на основе 10Fn3

4.2.1. Конструирование гибридных флуоресцентных белков на основе 10Fn3 и оптимизация их экспрессии в клетках E.coli

4.2.2. Исследование физико-химических свойств ГФБ

4.2.3. Исследование возможности использования гибридных флуоресцентных белков для визуализации целевых лигандов методом конфокальной микроскопии

4.2.4. Исследование возможностей использования ГФБ для визуализации маркеров воспаления эндотелия и неоангиогенеза в 3D культурах клеток Ea.hy926

4.2.4.1. Получение 3D культур на основе клеточной линии Ea.hy926

4.2.4.2. Оценка связывающей способности ГФБ к avßs-интегрину и VEGFR-2 в 2D и 3D (сфероидах) культурах клеточной линии Ea.hy926 методом конфокальной микроскопии

4.2.5. Анализ связывающей способности ГФБ на образцах ткани рака поджелудочной железы человека методом конфокальной микроскопии

4.3. Получение гибридных белков пролонгированного действия на основе альбумин -связывающего домена (ABD) и avß3-интегрин-связывающего варианта 10Fn3

4.3.1 Конструирование и экспрессия гибридных белков

4.3.2. Изучение взаимодействия гибридных белков с альбумином

4.3.3. Исследование связывания гибридных белков с avß3-интегрином методом конфокальной микроскопии

4.3.4. Изучение термической стабильности гибридных белков

4.3.5. Фармакокинетика и биораспределение гибридных белков

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2D культуры - культуры клеток, выращенные на пластиковой поверхности 3D культуры - культуры клеток, выращенные в объеме 10Fn3 - 10 домен фибронектина человека III типа АГ - антиген

АКБ - альтернативные каркасные белки АТФ - аденозинтрифосфат АТ - антитело

а.о. - аминокислотный остаток биоФНО - биотинилированный ФНО БК - болезнь Крона ВМ - внеклеточный матрикс ГДФ - гуанозиндифосфат

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колоние-стимулирующий фактор ГФБ - гибридные флуоресцентные белки ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИЛ - интерлейкин

ИПТГ - изопропил P-D-тиогалактопиранозид

ИФА - иммуноферментный анализ

кПЦР - количественная полимеразная цепная реакция

КФБ - красные флуоресцентные белки

ММП - металлопротеиназа

н. о. - нуклеотидные остатки

ПААГ - полиакриламидный гель

п.о. - пар оснований

РА - ревматоидный артрит

ТЕМЕД - N,N,N',N' - тетраметилэтилендиамин

ФБ - флуоресцентные белки

ФНО - фактор некроза опухолей

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ABD - альбумин-связывающий домен

AT - аутотранспортер

BSA - бычий сывороточный альбумин

COX - циклооксигеназа

CDR - complementarity-determining regions, гипервариабельные участки АТ, которые отвечают за связывание с антигеном.

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay (иммуноферментный анализ) ICAM - внутриклеточная молекула адгезии Ig - иммуноглобулин INF - интерферон

FACS - флуоресцент-активированный клеточный сортинг

FAK - киназа фокальной адгезии

FBS - сыворотка эмбрионов крупного рогатого скота

FADD - Fas-ассоциированный домен смерти (Associated protein with Death Domain)

HIF - фактор, индуцируемый гипоксией

His6 - гексагистидиновая последовательность

HSA - человеческий сывороточный альбумин

МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы

MIP1 - макрофагальный воспалительный белок

MLCK - киназа легкой цепи миозина

MTT - 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид OD - оптическая плотность PBS - фосфатно-солевой буфер

PECAM - тромбоцитарно-эндотелиальная молекула клеточной адгезии

PI3K - фосфоинозитол-3-киназа

PG - простагландин

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

RFP - красные флуоресцентные белки

scFv - одноцепочечный фрагмент вариабельного домена иммуноглобулина

scAb - одноцепочечные антитела

SDS - додецилсульфат натрия

TMB - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин

TNF - фактор некроза опухолей

VCAM - молекула клеточной адгезии сосудов

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

VEGFR - рецептор фактора роста эндотелия сосудов

VWF - фактор фон Виллебранда

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гибридные белки на основе 10-го домена фибронектина для молекулярной диагностики и терапии»

1.1. Актуальность проблемы

Хронические воспалительные и аутоиммунные заболевания человека представляют собой серьезную медицинскую и социальную проблему, которая может быть решена путем использования современных диагностических и терапевтических подходов. Известно, что воспалительный процесс и опухолевый рост сопровождаются образованием и ростом новых кровеносных сосудов в участках воспаления, которые вносят существенный вклад в их дальнейшее усиление благодаря дополнительному поступлению питательных веществ и клеток иммунной системы. Этот процесс опосредуется повышенной экспрессией на эндотелии сосудов специфических молекул адгезии, в частности, avß3-интегрина и рецептора фактора роста эндотелия сосудов-2 (VEGFR2). Также воспаление сопровождается увеличением синтеза фактора некроза опухолей человека (ФНО) - многофункционального провоспалительного цитокина, играющего важную роль в развитии таких заболеваний, как псориаз, болезнь Крона, ревматоидный артрит и других. Одним из возможных путей борьбы с вышеперечисленными заболеваниями является подавление активности ФНО и других белков, участвующих в процессах воспаления и неоангиогенеза, с помощью связывающих белков, наиболее известными представителями которых являются антитела.

Высокая аффинность, специфичность, длительное время полувыведения и безопасность в применении обеспечивают широкую распространенность препаратов на основе рекомбинантных антител, однако для их производства используется эукариотическая система экспрессии, что приводит к высокой стоимости лечения. Кроме того, структурные особенности полноразмерных антител затрудняют их проникновение в ткани и связывание некоторых типов мишеней.

Для получения терапевтических препаратов, обладающих аналогичными связывающими функциями, но лишенных свойственных иммуноглобулинам недостатков, могут быть использованы альтернативные каркасные белки (АКБ) - небольшие полипептидные молекулы, определенные участки которых могут варьироваться с целью обеспечения взаимодействия с целевыми лигандами. Среди АКБ одним из наиболее популярных является 10 домен фибронектина III типа человека (10Fn3). Этот белок характеризуется небольшим размером, отсутствием дисульфидных связей, высокой термостабильностью и растворимостью. Высокоаффинные связывающие белки на основе 10Fn3 могут быть получены путем отбора из комбинаторных библиотек с последующей экспрессией в клетках бактерий. В частности, селекция комбинаторных библиотек

методом бактериального дисплея на основе мембранных белков семейства аутотранспортеров открывает широкие возможности конструирования искусственных связывающих белков с разной специфичностью и высоким уровнем экспрессии в растворимой форме.

Небольшой размер молекул 10Рп3 позволяет модифицировать их структуру путем добавления различных функциональных модулей, например, создавать гибридные флуоресцентные белки для визуализации маркеров воспаления и неоангиогенеза, а также способствует хорошему проникновению в ткани. Однако он же является причиной короткого времени полувыведения таких белков в организме, в то время как для терапевтического применения требуется поддержание эффективной концентрации действующего вещества в течение продолжительного времени. Для белков с молекулярной массой менее 60 кДа, соответственно, необходимо более частое введение и/или использование более высоких концентраций, что затрудняет их применение. Для решения этой проблемы необходима разработка различных стратегий увеличения времени циркуляции, позволяющих улучшить фармакокинетику и фармакодинамические свойства рекомбинантных белков.

1.2. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является конструирование гибридных белков на основе 1аРп3 для диагностики и терапии хронических воспалительных заболеваний и исследование их физико-химических и биологических свойств. Выбор данного каркасного белка определяется его свойствами (небольшой размер, высокая растворимость, низкая иммуногенность, высокая термостабильность), а также его широким использованием в качестве основы для получения искусственных связывающих белков. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Конструирование и оптимизация системы бактериального дисплея на основе гибридного аутотранспортера АТ877 Р$усктоЪас1ег cryohalolentis K5T для получения ФНО-связывающих вариантов 10Рп3.

2. Отбор ФНО-связывающих белков из комбинаторной библиотеки вариантов 10Рп3 с помощью метода бактериального дисплея. Характеристика их физико -химических и биологических свойств.

3. Конструирование гибридных полипептидов, содержащих флуоресцентный белок mCherry и avß3-интегрин- или VEGFR2- связывающие белки на основе 10Fn3, изучение их свойств и возможностей использования для визуализации маркеров воспаления и неоангиогенеза.

4. Конструирование гибридных белков пролонгированного действия на основе альбумин-связывающего домена (ABD) и avß3-интегрин-связывающего варианта 10Fn3 (JCL), изучение их физико-химических свойств.

5. Исследование фармакокинетики и биораспределения гибридных белков пролонгированного действия в организме мышей.

1.3. Научная новизна работы

В результате проделанной работы впервые сконструирована система бактериального дисплея на основе гибридного аутотранспортера AT877 Psychrobacter cryohalolentis K5T. Установлено, что расположение холодоактивной эстеразы EstPc на N-конце гибридного пассажирского домена АТ877 повышает уровень экспонирования 10Fn3 в 3 раза по сравнению с другими конструкциями. С использованием данной системы получены новые искусственные связывающие белки, демонстрирующие высокую аффинность к ФНО.

Впервые получен новый тип гибридных молекул, состоящих из красного флуоресцентного белка mCherry и 10Fn3. Установлено, что расположение mCherry на N-конце гибридного белка и предложенная нами модификация его N-концевой аминокислотной последовательности способствуют увеличению уровня синтеза гибридного белка в клетках E. coli в растворимой форме. На основе предложенной конструкции получены гибридные флуоресцентные белки Cherry-JCL и Cherry-CT322, содержащие avß3-интегрин- и VEGFR2-связывающие варианты 10Fn3, соответственно. Продемонстрирована возможность их использования для визуализации avß3-интегрина и VEGFR2 на поверхности различных клеточных линий и на образцах ткани рака поджелудочной железы методом конфокальной микроскопии.

Впервые получены гибридные белки, состоящие из ABD и avß3-интегрин-связывающего варианта 10Fn3 и обладающие увеличенным временем циркуляции в кровотоке. Определена оптимальная конфигурация белков-партнеров и длина линкера в составе гибридного белка. Подтверждена высокая аффинность полученных гибридов по отношению к HSA и avß3-интегрину, а также высокая термическая стабильность белка JCL-L14-ABD, сопоставимая с 10Fn3. Результаты экспериментов по изучению фармакодинамики и биораспределения гибридных белков в организме мышей

продемонстрировали, что их можно использовать для увеличения времени циркуляции искусственных связывающих белков на основе 10Fn3.

1.4. Практическая значимость исследования

Полученные в ходе выполнения данной работы результаты могут быть использованы для создания и оптимизации новых средств диагностики и терапии на основе 10Fn3, а также других каркасных белков. Система бактериального дисплея на основе аутотранспортера AT877 P. cryohalolentis K5T может быть использована для отбора вариантов 10Fn3, связывающих различные целевые лиганды. Гибриды, состоящие из красного флуоресцентного белка mCherry и вариантов 10Fn3, связывающих различные мишени, являются перспективными инструментами визуализации белковых маркеров на поверхности клеток с целью диагностики. Конструирование гибридных белков, включающих альбумин-связывающий домен, может быть использовано для увеличения времени циркуляции в кровотоке терапевтических препаратов на основе 10Fn3.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1. Сконструирована новая система бактериального дисплея на основе гибридного аутотранспортера AT877 P. cryohalolentis K5T

2. Установлено, что расположение холодоактивной эстеразы EstPc на N-конце гибридного пассажирского домена АТ877 способствует увеличению уровня экспонирования 10Fn3 на поверхности клеток E. coli.

3. Методом бактериального дисплея из комбинаторной библиотеки генов 10Fn3 отобраны белки, обладающие высокой ФНО-связывающей активностью. Получен вариант Fn52 с Kd = 35±7нМ.

4. Сконструированы гибридные флуоресцентные белки Cherry-JCL и Cherry-CT322, которые связывают avß3-интегрин и VEGFR2 на поверхности клеток различного происхождения и могут быть использованы для визуализации молекулярных маркеров воспаления и неоангиогенеза (avß3-интегрина и VEGFR2).

5. Сконструирован гибридный белок, содержащий avß3 -интегрин-связывающий вариант 10Fn3 и ABD (JCL-L14-ABD), обладающий повышенной стабильностью и увеличенным временем циркуляции в кровотоке мыши.

1.6. Апробация результатов

Результаты работы были представлены на 7 конференциях:

XXVI Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2014 г.

Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, Москва, 2014 г.

XXVIII Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2016 г.

41st FEBS Congress, Molecular and Systems Biology for a Better Life, Эфес, Турция,

2016 г.

V съезд биохимиков России, Сочи - Дагомыс, 2016 г.

Объединённый научный форум (Международная научная конференция по биоорганической химии, «XII чтения памяти академика Ю. А. Овчинникова», VIII российский симпозиум «Белки и Пептиды»), Москва, 2017 г.

International Forum «Biotechnology: current state and future development. Life Sciences», Москва, 2018 г.

Работа была представлена на межлабораторном семинаре в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

1.7. Публикации

По результатам работы опубликовано 6 статей в рецензируемых научных журналах, индексируемых Web of Science и Scopus. Все статьи опубликованы в журналах, входящих в перечень, принятый МГУ им. М.В. Ломоносова. Получен Патент РФ.

1.8. Личный вклад автора в проведение исследования

Личный вклад заключается в анализе литературных данных, активном участии в

сборе материала, постановке экспериментов, обработке полученных экспериментальных данных и их интерпретации, подготовке публикаций, презентации данных на отечественных и международных конференциях.

1.9. Структура и объем диссертации

Диссертация включает разделы: список используемых сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, состоящий из 244 источников. Работа состоит из 142 страниц машинописного текста, содержит 50 рисунков, 5 таблиц.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Молекулярные механизмы воспалительных процессов

Воспалительный процесс - защитная реакция организма, протекающая с участием лейкоцитов, компонентов комплемента, антител и других белков плазмы, поступающих в очаг инфекции или место повреждения. Процессы острого воспаления включают в себя быстрое привлечение нейтрофилов и приводят к активации эндотелиальных клеток. Покоящиеся эндотелиальные клетки не взаимодействуют с лейкоцитами. Миграции лейкоцитов из кровотока способствуют провоспалительные цитокины, такие как ИЛ-1 и ФНО-а. Они стимулируют экспрессию молекул адгезии на эндотелиальных клетках и лейкоцитах, а также секрецию хемокинов, которые направляют движение лейкоцитов в очаг воспаления. Активация эндотелиальных клеток может быть разделена на быстрый ответ, который не зависит от экспрессии новых генов (I тип активации) и медленный ответ, который зависит от экспрессии новых генов (II тип активации). [1].

Первый тип активации, как правило, опосредован взаимодействием лиганда с внеклеточным доменом гетеротримерного G-белок сопряженного рецептора (GPCR), такого как Ш-гистаминовый рецептор, который передает сигнал через aq субъединицу G-белка. Гуанозиндифосфат (ГДФ), связанный с альфа-субъединицей, заменяется гуанозинтрифосфатом (ГТФ), G-белок диссоциирует на aq субъединицу и Ру-димер, дальше aq-субъединица расщепляет молекулу ГТФ до ГДФ и активирует Р-изоформу фосфолипазы С. Она, в свою очередь, катализирует освобождение инозитол-1,4,5-трифосфата от фосфотидилинозитол-4,5-бисфосфата липида мембраны. Инозитолтрифосфат индуцирует увеличение концентрации внутриклеточного Ca2+ путем высвобождения его из эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Активированный GPCR также содействует обмену ГДФ на ГТФ в RHO, активируя RHO-гуанин-нуклеотидный фактор обмена (RHO-GEF) через Ру субъединицу гетеротримерного G-белка. RHO-активация и увеличение в цитозоле свободного Ca2+ опосредуют I тип активации (Рис. 1). В частности, усиление кровотока приводит к Ca2+-опосредованной активации фосфолипазы А2 (PLА2), которая расщепляет мембранный фосфотидилхолин на лизофосфотидилхолин и арахидоновую кислоту.

Свободная арахидоновая кислота под действием циклооксигеназы-1 (COX-1) быстро преобразуется в простагландин Ш (PGH2) и затем под действием простациклин-синтазы в простагландин Ь (PGI2), который является вазодилататором. Далее Ca2+ в комплексе с кальмодулином активирует NO-синтазу-3, продуцирующую NO. Также комплекс Ca2+-кальмодулин активирует киназу легкой цепи миозина (MLCK), которая,

фосфорилируя миозин легкой цепи (MLC) в несколько стадий, приводит к открытию плотных контактов между клетками и утечке белков плазмы в ткань. Активированный MLC инициирует экзоцитоз P-селектина из телец Вейбла-Паладе на поверхность клетки. Выход P-селектина на клеточную поверхность необходим для обеспечения прикрепления циркулирующих нейтрофилов и их экстравазации в ткань (Рис. 1).

Рисунок 1. I тип активации эндотелиальных клеток. Из [1].

Более устойчивая воспалительная реакция наблюдается при втором типе активации, при котором основными медиаторами выступают ФНО-а и ИЛ-1. Именно в ответ на связывание этих воспалительных цитокинов c соответствующими рецепторами -рецептором первого типа интерлейкина-1 (IL-1R1) и рецептором фактора некроза опухоли-1 (TNFR1) в клетке формируется сигнальный комплекс (Рис. 2). В случае ИЛ-1 этот комплекс инициирует связывание MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88) и Toll/IL-1 рецептор-ассоциированного белка (TIRAP) с цитоплазматическим доменом активированного рецептора. MyD88 быстро диссоциирует от рецептора и взаимодействует с IL-lR-ассоциированной киназой 1 (IRAK1), IRAK4 и с TNFR-ассоциированным фактором (TRAF6). В случае ФНО, стимуляция TNFR1 опосредует взаимодействие с адапторным клеточным белком TRADD через домен смерти, который, в свою очередь, связывает рецептор-взаимодействующий белок 1 (RIP1) и TRAF2; комплекс TRADD-RIP1-TRAF2 затем диссоциирует от интернализованного TNFR1.

Оба сигнальных комплекса, которые образуются при взаимодействии ФНО-а и ИЛ-1 с соответствующими рецепторами, приводят к активации одинаковых групп митоген-активируемых киназ (MAPKs). Именно MAP-киназы инициируют сигналы, которые

приводят к активации ядерного фактора транскрипции-кБ (NF-kB) и белка активации (AP1). Эти факторы инициируют транскрипцию специфических генов в ядре, запускающую экспрессию провоспалительных белков. Среди них молекулы адгезии, которые связывают лейкоциты, такие как Е-селектин, внутриклеточная молекула адгезии-1 (ICAM1) и молекула адгезии сосудистого эндотелия-1 (VCAM1); хемокины; ферменты, такие как COX-2; и неизвестные эффекторные белки, которые перестраивают актиновые филаменты. COX-2 увеличивает эффективность COX-1, преобразуя арахидоновую кислоту в PGI2 в эндотелиальных клетках артериол. Реорганизованные актиновые филаменты в клетках эндотелия могут открывать межклеточные контакты, вызывая утечку белков плазмы из сосудистого русла. Хемокины, секретируемые эндотелиальными или другими типами клеткок, могут быть представлены в связанном состоянии с гепарансульфатпротеогликаном на поверхности эндотелиоцитов, где они могут действовать на лейкоциты. Это взаимодействие, способствующее продвижению лейкоцитов в ткани, опосредовано цитокин-индуцированными молекулами адгезии. Именно эти молекулы и относятся к маркерам воспаления и неоангиогенеза [1].

Рисунок 2. II тип активации эндотелиальных клеток. Из [1].

2.1.1. Неоангиогенез и его молекулярные маркеры

Известно, что воспалительный процесс во многих случаях сопровождается образованием и ростом новых кровеносных сосудов в участках воспаления, которые вносят существенный вклад в его дальнейшее усиление благодаря дополнительному

поступлению питательных веществ и клеток иммунной системы. Образование кровеносных сосудов определяется двумя процессами: васкулогенезом и ангиогенезом. Васкулогенез означает дифференцировку ангиобластов (предшественников эндотелиальных клеток) у эмбрионов в кровяных островках, которые после слияния формируют сердечно-сосудистую систему или васкуляризируют энтодермальные органы [2]. Ангиогенез включает в себя пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток в первичных васкулярных структурах и способствует васкуляризации эктодермальных и мезенхимных органов, реконструкции капиллярной сети [3]. Во время ангиогенеза эндотелиальные клетки начинают делиться (скорость удвоения их популяции возрастает почти в 100 раз), образуя эндотелиальную почку. Она прорывает базальную мембрану и внедряется в соединительную ткань [4]. Важное значение после «включения ангиогенеза» имеет разрыв базальных мембран и внеклеточного матрикса, главным образом, в результате повышения активности матричных металлопротеиназ (ММП). Свое название ММП получили за способность специфически гидролизовать основные белки межклеточного матрикса [5]. Эти изменения матрикса способствуют миграции эндотелиальных клеток во внесосудистое пространство и активному протеолизу межклеточного матрикса [6]. В результате происходит организация эндотелиальных клеток в трубочки с просветом и образуется новая капиллярная сеть. Процесс роста капилляров продолжается, пока не будет достигнута достаточная близость с клеткой. Ангиогенез опосредуется воздействием белковых факторов, и прежде всего, взаимодействием фактора роста эндотелия сосудов (УЕОБ) с рецептором фактора роста эндотелия сосудов-2 (УЕОБК2) и повышенной экспрессией специфических молекул адгезии, в частности, интегрина альфаУбетаЗ.

2.1.1.1. Интегрины

Интегрины - это семейство родственных трансмембранных белков с молекулярной массой 100-160 кДа, расположенных на клеточной поверхности. Они взаимодействуют с белками внеклеточного матрикса и передают различные межклеточные сигналы. От них зависит форма клетки, её подвижность, также они участвуют в регуляции клеточного цикла [7].

Многие интегрины проявляют сродство к гликопротеидам базальной мембраны и внеклеточного матрикса. Они являются рецепторами большинства белков внеклеточного матрикса, включая коллаген, фибронектин, витронектин, ламинин, остепонтин, фактор фон Виллебранда, фибриноген, узнавая в них ЯОБ последовательность [8]. Одновременное множественное, но слабое связывание интегринов со своими лигандами

позволяет клеткам исследовать свое окружение, сохраняя способность двигаться, что было бы невозможно при слишком прочных взаимодействиях. Клеточное соединение с помощью интегринов быстрое - в течение минут.

Все белки, входящие в семейство интегринов, являются гетеродимерами и состоят из двух нековалентно связанных субъединиц (альфа и бета). На сегодняшний день у человека описано 18 альфа- и 8 бета-субъединиц, при этом каждая альфа-субъединица образует комплекс только с определённым набором бета-единиц, что в итоге порождает 24 варианта димеров [9]. Экспрессия индивидуального интегрина обуславливает определенные адгезионные свойства какой-либо группы клеток. У позвоночных животных и человека обнаружены следующие основные интегрины (Таблица 1).

Таблица 1. Основные представители семейства интегринов.

Название Синонимы Клеточное распределение Лиганды

шР1 VLA-1 Широкое коллагены, ламинины

агР1 VLA-2, коллагеновый рецептор Широкое коллагены, ламинины

а4в1 VLA-4 Гематопоэтическиеклетки фибронектин, VCAM-1

агР1 VLA-5, фибронектиновый рецептор Широкое фибронектин, протеазы

авР1 VLA-6, ламининовый рецептор Широкое ламинины

аьРг LFA-1 ^лимфоциты ICAM-1, ICAM-2

амРг ШМ, CR3 нейтрофилы и моноциты белкиплазмы, 1САМ-1

анъРэ Гликопротеин ПЬ/Ша тромбоциты фибриноген, фибронектин

ауРэ витронектиновый рецептор активированные эндотелиальные клетки, клетки меланомы и глиобластомы витронектин, фибронектин, фибриноген, остеопонтин , Cyr61

ауРг широкое, в особенности витронектин и

фибробласты, эпителиальные клетки аденовирус

ауРб пролиферирующий эпителий, в особенности лёгких и печени фибронектин, TGFpi, TGFP3

авР4 Эпителиальные клетки ламинин

Обе субъединицы интегринов пронизывают клеточную мембрану. а-цепь состоит из 4 или 5 внеклеточных доменов: семилопастного Р-пропеллера, thigh-домена и двух calf-доменов. Девять из восемнадцати альфа-цепей интегринов содержат а1-домен, расположенный между второй и третьей лопастями Р-пропеллера. Последние 3 или 4 лопасти Р-пропеллера содержат домены, которые связывают ионы Ca2+ и Mg2+, именно от них зависит способность интегринов связываться со своими лигандами. Thigh- и calf-домены обладают Р-складчатой иммуноглобулиноподобной структурой (Рис. 3).

Рисунок 3. Общая схема строения интегринов. Из [10], с модификациями.

Р-цепь образована семью доменами. P-I домен находится в гибридном домене (Hyb), в который в свою очередь интегрирован плексин-семафорин-интегриновый (PSI)

домен. За этими доменами следует 4 цистеин-богатых EGF-подобных домена и концевой Р^И домен [10] (Рис. 3).

Нельзя не отметить важность внутриклеточного домена интегрина, который передает сигнал из внеклеточного матрикса внутрь клетки путем связывания с сериновыми, тирозиновыми, треониновыми киназами, фосфатазами и адапторными белками фокальных контактов. Комплексы фокальных контактов включают в себя интегрины и киназы фокальной адгезии, Src и многие другие киназы, адапторные белки, сигнальные белки, такие как фосфоинозитид-3-киназы, Rho и RacГТФазы и актин-связывающие цитоскелетные белки, такие как талин, а-актинин, паксилин, тенсин и винкулин. Интегриновые сигналы способствуют клеточной миграции, обеспечивая передвижение вдоль внеклеточного матрикса и содействуя разборке актина с помощью ГТФазы [11] (Рис. 4).

Рисунок 4. Интегриновая регуляция клеточной миграции и фокальной адгезии. Из [11].

Collagen

Laminin

Fibronectin

ЕСМ

Cell migration

Распределение аvp3-интегринов в здоровых тканях, как правило, ограничивается высоким уровнем экспрессии на остеокластах, но также они были обнаружены на тромбоцитах, мегакариоцитах, почечном эпителии, сосудах гладкой мускулатуры,

плаценте, дендритных клетках и в различных количествах на клетках здорового эндотелия [12].

Интегрины играют важную роль в развитии опухолей. Уменьшение экспрессии некоторых интегринов (при раке молочной железы, раке предстательной железы, раке толстой кишки) или их избыток (при меланоме, плоскоклеточном раке полости рта, носоглотки, гортани, глиобластоме) сопряжены с высокой степенью злокачественности опухоли [13]. Связывание интегринов с лигандами и сближение клеток необходимы для перестройки базальной мембраны, идущей при ангиогенезе. Взаимодействие интегринов с белками внеклеточного матрикса в некоторых случаях препятствует апоптозу. Так, клетки меланомы избегают апоптоз в дерме за счет связывания avp3-интегрина с коллагеном. Нейтрализация этого интегрина антителами, напротив, способствует апоптозу. Таким образом, информация, которую интегрины передают от внеклеточного матрикса внутрь клетки, в одних случаях стимулирует адгезию и миграцию опухолевых клеток, в других - приводит к их гибели. Иными словами, интегрины играют роль своеобразного «переключателя», определяющего дальнейшую судьбу опухолевой клетки.

Одним из таких «переключателей» является avp3-интегрин, который принимает участие во многих физиологических процессах. Этот рецептор состоит из av-субъединицы (125 кДа) и Р3-субъединицы (105 кДа). Взаимодействие его внутриклеточного домена с филаментами цитоскелета приводит к инициации сигнального каскада, который способствует активации Бгс-киназы через фосфорилирование киназы фокальной адгезии. Помимо взаимодействия с белками внеклеточного матрикса, avp3-интегрин может связываться с фактором роста фибробластов (ЕОБ2), металлопротеиназой (ММР-2), активированным тромбоцитарным фактором роста (РООБ), инсулиновым рецептором и с рецептором фактора роста эндотелия сосудов, что содействует оптимальной активации клеточной пролиферации, инвазии и предотвращению апоптоза [11]. Таким образом, этот белок играет ключевую роль не только в адгезии к белкам внеклеточного матрикса, но также инициирует сигнал, индуцирующий распространение, миграцию, выживаемость, пролиферацию и дифференциацию клеток [12]. Такие процессы, как остеокласт-опосредуемая деградация костной ткани, ангиогенез, патологическое сосудообразование и опухолевое метастазирование также являются avp3-интегрин-зависимыми [14]. Подавление его активности приводит к эффективному ингибированию роста опухоли, ангиогенеза и метастазирования. Недавние исследования показали, что в течение ангиогенеза эндотелиальные клетки прорастают из существующих кровеносных сосудов, прикрепляясь к белкам внеклеточного матрикса через avp3-интегрин [15]. Большую роль

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гапизов Султан Шахбанович, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Pober J. S., Sessa W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation // Nat Rev Immunol. - 2007. - V. 7, № 10. - P. 803-15.

2. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis // Nat Med. - 2000. - V. 6, № 4. - P. 389-95.

3. Dhanabal M., Sethuraman N. Endogenous angiogenesis inhibitors as therapeutic agents: historical perspective and future direction // Recent Pat Anticancer Drug Discov. - 2006. - V. 1, № 2. - P. 223-36.

4. Folkman J. Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Clinical applications of research on angiogenesis // N Engl J Med. - 1995. - V. 333, № 26. - P. 1757-63.

5. Roy R., Louis G., Loughlin K. R., Wiederschain D., Kilroy S. M., Lamb C. C., Zurakowski D., Moses M. A. Tumor-specific urinary matrix metalloproteinase fingerprinting: identification of high molecular weight urinary matrix metalloproteinase species // Clin Cancer Res. - 2008. -V. 14, № 20. - P. 6610-7.

6. Harper J., Moses M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications // EXS. - 2006. № 96. - P. 223-68.

7. Cox D., Brennan M., Moran N. Integrins as therapeutic targets: lessons and opportunities // Nat Rev Drug Discov. - 2010. - V. 9, № 10. - P. 804-20.

8. Buck C. A., Horwitz A. F. Integrin, a transmembrane glycoprotein complex mediating cell-substratum adhesion // J Cell Sci Suppl. - 1987. - V. 8. - P. 231-50.

9. Takada Y., Ye X., Simon S. The integrins // Genome Biol. - 2007. - V. 8, № 5. - P. 215.

10. Campbell I. D., Humphries M. J. Integrin structure, activation, and interactions // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2011. - V. 3, № 3.

11. Desgrosellier J. S., Cheresh D. A. Integrins in cancer: biological implications and therapeutic opportunities // Nat Rev Cancer. - 2010. - V. 10, № 1. - P. 9-22.

12. Liu Z., Wang F., Chen X. Integrin alpha(v)beta(3)-Targeted Cancer Therapy // Drug Dev Res. - 2008. - V. 69, № 6. - P. 329-339.

13. Weis S. M., Cheresh D. A. alphaV integrins in angiogenesis and cancer // Cold Spring Harb Perspect Med. - 2011. - V. 1, № 1. - P. a006478.

14. Avraamides C. J., Garmy-Susini B., Varner J. A. Integrins in angiogenesis and lymphangiogenesis // Nat Rev Cancer. - 2008. - V. 8, № 8. - P. 604-17.

15. Somanath P. R., Ciocea A., Byzova T. V. Integrin and growth factor receptor alliance in angiogenesis // Cell Biochem Biophys. - 2009. - V. 53, № 2. - P. 53-64.

16. De S., Razorenova O., McCabe N. P., O'Toole T., Qin J., Byzova T. V. VEGF-integrin interplay controls tumor growth and vascularization // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2005. - V. 102, № 21. - P. 7589-94.

17. Olsson A. K., Dimberg A., Kreuger J., Claesson-Welsh L. VEGF receptor signalling - in control of vascular function // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2006. - V. 7, № 5. - P. 359-71.

18. Fuh G., Li B., Crowley C., Cunningham B., Wells J. A. Requirements for binding and signaling of the kinase domain receptor for vascular endothelial growth factor // J Biol Chem. -1998. - V. 273, № 18. - P. 11197-204.

19. Pugh C. W., Ratcliffe P. J. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system // Nat Med. - 2003. - V. 9, № 6. - P. 677-84.

20. Vilcek J., Lee T. H. Tumor necrosis factor. New insights into the molecular mechanisms of its multiple actions // J Biol Chem. - 1991. - V. 266, № 12. - P. 7313-6.

21. Kruglov A. A., Kuchmiy A., Grivennikov S. I., Tumanov A. V., Kuprash D. V., Nedospasov S. A. Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade: mouse models // Cyt okine Growth Factor Rev. - 2008. - V. 19, № 3-4. - P. 231-44.

22. Eck M. J., Sprang S. R. The structure of tumor necrosis factor-alpha at 2.6 A resolution. Implications for receptor binding // J Biol Chem. - 1989. - V. 264, № 29. - P. 17595-605.

23. Tartaglia L. A., Weber R. F., Figari I. S., Reynolds C., Palladino M. A., Jr., Goeddel D. V. The two different receptors for tumor necrosis factor mediate distinct cellular responses // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1991. - V. 88, № 20. - P. 9292-6.

24. Baud V., Karin M. Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives // Trends Cell Biol. - 2001. - V. 11, № 9. - P. 372-7.

25. Micheau O., Tschopp J. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes // Cell. - 2003. - V. 114, № 2. - P. 181-90.

26. Feldmann M., Maini R. N., Bondeson J., Taylor P., Foxwell B. M., Brennan F. M. Cytokine blockade in rheumatoid arthritis // Adv Exp Med Biol. - 2001. - V. 490. - P. 119-27.

27. Song X. Y., Torphy T. J., Griswold D. E., Shealy D. Coming of age: anti-cytokine therapies // Mol Interv. - 2002. - V. 2, № 1. - P. 36-46.

28. Williams R. O., Feldmann M., Maini R. N. Anti-tumor necrosis factor ameliorates joint disease in murine collagen-induced arthritis // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1992. - V. 89, № 20. - P. 9784-8.

29. Papadakis K. A., Targan S. R. The role of chemokines and chemokine receptors in mucosal inflammation // Inflamm Bowel Dis. - 2000. - V. 6, № 4. - P. 303-13.

30. Fiocchi C. Inflammatory bowel disease: etiology and pathogenesis // Gastroenterology. -1998. - V. 115, № 1. - P. 182-205.

31. Rutgeerts P. Infliximab is the drug we have been waiting for in Crohn's disease // Inflamm Bowel Dis. - 2000. - V. 6, № 2. - P. 132-6.

32. Haddad E., Paczesny S., Leblond V., Seigneurin J. M., Stern M., Achkar A., Bauwens M., Delwail V., Debray D., Duvoux C., Hubert P., Hurault de Ligny B., Wijdenes J., Durandy A., Fischer A. Treatment of B-lymphoproliferative disorder with a monoclonal anti-interleukin-6 antibody in 12 patients: a multicenter phase 1-2 clinical trial // Blood. - 2001. - V. 97, № 6. - P. 1590-7.

33. Klement G., Huang P., Mayer B., Green S. K., Man S., Bohlen P., Hicklin D., Kerbel R. S. Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an anti-VEGFR-2 antibody in multidrug-resistant human breast cancer xenografts // Clin Cancer Res. -2002. - V. 8, № 1. - P. 221-32.

34. Lu D., Jimenez X., Zhang H., Bohlen P., Witte L., Zhu Z. Selection of high affinity human neutralizing antibodies to VEGFR2 from a large antibody phage display library for antiangiogenesis therapy // Int J Cancer. - 2002. - V. 97, № 3. - P. 393-9.

35. Kipriyanov S. M., Le Gall F. Generation and production of engineered antibodies // Mol Biotechnol. - 2004. - V. 26, № 1. - P. 39-60.

36. Elliott M. J., Maini R. N., Feldmann M., Long-Fox A., Charles P., Katsikis P., Brennan F. M., Walker J., Bijl H., Ghrayeb J., et al. Treatment of rheumatoid arthritis with chimeric monoclonal antibodies to tumor necrosis factor alpha // Arthritis Rh eum. - 1993. - V. 36, № 12. - P. 1681-90.

37. Feldmann M., Maini R. N. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned? // Annu Rev Immunol. - 2001. - V. 19. - P. 163-96.

38. Waldmann T. A. Anti-IL-2 receptor monoclonal antibody (anti-Tac) treatment of T-cell lymphoma // Important Adv Oncol. - 1994. - P. 131-41.

39. Raab-Westphal S., Marshall J. F., Goodman S. L. Integrins as therapeutic targets: successes and cancers // Cancers. - 2017. - V. 9, № 9. - P. 110.

40. Danhier F., Le Breton A., Preat V. RGD-based strategies to target alpha(v) beta(3) integrin in cancer therapy and diagnosis // Mol Pharm. - 2012. - V. 9, № 11. - P. 2961-73.

41. Bruggemann M., Neuberger M. S. Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice // Immunol Today. - 1996. - V. 17, № 8. - P. 391-7.

42. Komaki Y., Yamada A., Komaki F., Kudaravalli P., Micic D., Ido A., Sakuraba A. Efficacy, safety and pharmacokinetics of biosimilars of anti-tumor necrosis factor-a agents in rheumatic

diseases; A systematic review and meta-analysis // Journal of autoimmunity. - 2017. - V. 79. -P. 4-16.

43. Falcon B. L., Chintharlapalli S., Uhlik M. T., Pytowski B. Antagonist antibodies to vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) as anti-angiogenic agents // Pharmacol Ther. -2016. - V. 164. - P. 204-25.

44. Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E. B., Bendahman N., Hamers R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains // Nature. -1993. - V. 363, № 6428. - P. 446-8.

45. Coppieters K., Dreier T., Silence K., de Haard H., Lauwereys M., Casteels P., Beirnaert E., Jonckheere H., Van de Wiele C., Staelens L., Hostens J., Revets H., Remaut E., Elewaut D., Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis // Arthritis Rheum. - 2006. - V. 54, № 6. - P. 1856-66.

46. Dooley H. Selection and characterization of naturally occurring single-domain (IgNAR) antibody fragments from immunized sharks by phage display // Molecular Immu nology. - 2003. - V. 40, № 1. - P. 25-33.

47. Deyev S. M., Lebedenko E. N. Multivalency: the hallmark of antibodies used for optimization of tumor targeting by design // Bioessays. - 2008. - V. 30, № 9. - P. 904-18.

48. Wu A. M., Senter P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates // Nat Biotechnol. - 2005. - V. 23, № 9. - P. 1137-46.

49. Engelmann H., Holtmann H., Brakebusch C., Avni Y. S., Sarov I., Nophar Y., Hadas E., Leitner O., Wallach D. Antibodies to a soluble form of a tumor necrosis factor (TNF) receptor have TNF-like activity // J Biol Chem. - 1990. - V. 265, № 24. - P. 14497-504.

50. Stewart M. W., Grippon S., Kirkpatrick P. Aflibercept // Nat Rev Drug Discov. - 2012. - V. 11, № 4. - P. 269-70.

51. Zalevsky J., Secher T., Ezhevsky S. A., Janot L., Steed P. M., O'Brien C., Eivazi A., Kung J., Nguyen D. H., Doberstein S. K., Erard F., Ryffel B., Szymkowski D. E. Dominant-negative inhibitors of soluble TNF attenuate experimental arthritis without suppressing innate immunity to infection // J Immunol. - 2007. - V. 179, № 3. - P. 1872-83.

52. McCoy M. K., Martinez T. N., Ruhn K. A., Szymkowski D. E., Smith C. G., Botterman B. R., Tansey K. E., Tansey M. G. Blocking soluble tumor necrosis factor signaling with dominantnegative tumor necrosis factor inhibitor attenuates loss of dopaminergic neurons in models of Parkinson's disease // The Journal of neuroscience. - 2006. - V. 26, № 37. - P. 9365-9375.

53. De Luca A., Normanno N. Tivozanib, a pan-VEGFR tyrosine kinase inhibitor for the potential treatment of solid tumors // IDrugs. - 2010. - V. 13, № 9. - P. 636-45.

54. Binz H. K., Amstutz P., Pluckthun A. Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains // Nat Biotechnol. - 2005. - V. 23, № 10. - P. 1257-68.

55. Skerra A. Alternative non-antibody scaffolds for molecular recognition // Curr Opin Biotechnol. - 2007. - V. 18, № 4. - P. 295-304.

56. Nygren P. A., Skerra A. Binding proteins from alternative scaffolds // J Immunol Methods. -2004. - V. 290, № 1-2. - P. 3-28.

57. Gill D. S., Damle N. K. Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds // Curr Opin Biotechnol. - 2006. - V. 17, № 6. - P. 653-8.

58. Petrovskaya L. E., Shingarova L. N., Dolgikh D. A., Kirpichnikov M. P. Alternative scaffold proteins // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2011. - V. 37, № 5. - P. 517-526.

59. Gronwall C., Stahl S. Engineered affinity proteins--generation and applications // J Biotechnol. - 2009. - V. 140, № 3-4. - P. 254-69.

60. Skerra A. Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities // FEBS J. - 2008. - V. 275, № 11. -P. 2677-83.

61. Hackel B. J. Alternative Protein Scaffolds for Molecular Imaging and Therapy //. -2014.10.1007/978-1 -4471 -4372-7_13. - P. 343-364.

62. Gille H., Hulsmeyer M., Trentmann S., Matschiner G., Christian H. J., Meyer T., Amirkhosravi A., Audoly L. P., Hohlbaum A. M., Skerra A. Functional characterization of a VEGF-A-targeting Anticalin, prototype of a novel therapeutic human protein class // Angiogenesis. - 2016. - V. 19, № 1. - P. 79-94.

63. Dennis M. S., Lazarus R. A. Kunitz domain inhibitors of tissue factor-factor VIIa. I. Potent inhibitors selected from libraries by phage display // J Biol Chem. - 1994. - V. 269, № 35. - P. 22129-36.

64. Mark S. Dennis R. A. L. Kunitz Domain Inhibitors of Tissue Factor-Factor VIIa // The Journal of Biological Chemistry. - 1994. - V. 269, № 35. - P. 8.

65. Borghouts C., Kunz C., Groner B. Peptide aptamers: recent developments for cancer therapy // Expert Opin Biol Ther. - 2005. - V. 5, № 6. - P. 783-97.

66. Jonsson A., Wallberg H., Herne N., Stahl S., Frejd F. Y. Generation of tumour-necrosis-factor-alpha-specific affibody molecules capable of blocking receptor binding in vitro // Biotechnol Appl Biochem. - 2009. - V. 54, № 2. - P. 93-103.

67. Lofdahl P. A., Nord O., Janzon L., Nygren P. A. Selection of TNF-alpha binding affibody molecules using a beta-lactamase protein fragment complementation assay // N Biotechnol. -2009. - V. 26, № 5. - P. 251-9.

68. Fleetwood F., Klint S., Hanze M., Gunneriusson E., Frejd F. Y., Stahl S., Lofblom J. Simultaneous targeting of two ligand-binding sites on VEGFR2 using biparatopic Affibody molecules results in dramatically improved affinity // Sci Rep. - 2014. - V. 4. - P. 7518.

69. Sedgwick S. G., Smerdon S. J. The ankyrin repeat: a diversity of interactions on a common structural framework // Trends Biochem Sci. - 1999. - V. 24, № 8. - P. 311-6.

70. Kastrup J. S., Nielsen B. B., Rasmussen H., Holtet T. L., Graversen J. H., Etzerodt M., Thogersen H. C., Larsen I. K. Structure of the C-type lectin carbohydrate recognition domain of human tetranectin // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. - 1998. - V. 54, № Pt 5. - P. 757-66.

71. Ackerman S. E., Currier N. V., Bergen J. M., Cochran J. R. Cystine-knot peptides: emerging tools for cancer imaging and therapy // Expert Rev Proteomics. - 2014. - V. 11, № 5. - P. 56172.

72. Koide A., Bailey C. W., Huang X., Koide S. The fibronectin type III domain as a scaffold for novel binding proteins // J Mol Biol. - 1998. - V. 284, № 4. - P. 1141-51.

73. Trainor K., Gingras Z., Shillingford C., Malakian H., Gosselin M., Lipovsek D., Meiering E. M. Ensemble Modeling and Intracellular Aggregation of an Engineered Immunoglobulin-Like Domain // J Mol Biol. - 2016. - V. 428, № 6. - P. 1365-1374.

74. Parker M. H., Chen Y., Danehy F., Dufu K., Ekstrom J., Getmanova E., Gokemeijer J., Xu L., Lipovsek D. Antibody mimics based on human fibronectin type three domain engineered for thermostability and high-affinity binding to vascular endothelial growth factor receptor two // Protein Eng Des Sel. - 2005. - V. 18, № 9. - P. 435-44.

75. Wu S. J., Luo J., O'Neil K. T., Kang J., Lacy E. R., Canziani G., Baker A., Huang M., Tang Q. M., Raju T. S., Jacobs S. A., Teplyakov A., Gilliland G. L., Feng Y. Structure-based engineering of a monoclonal antibody for improved solubility // Protein Eng Des Sel. - 2010. -V. 23, № 8. - P. 643-51.

76. Hayhurst A., Harris W. J. Escherichia coli skp chaperone coexpression improves solubility and phage display of single-chain antibody fragments // Protein Expr Purif. - 1999. - V. 15, № 3. - P. 336-43.

77. Tang L., Persky A. M., Hochhaus G., Meibohm B. Pharmacokinetic aspects of biotechnology products // Journal of pharmaceutical sciences. - 2004. - V. 93, № 9. - P. 2184-2204.

78. Kontermann R. E. Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies // BioDrugs. - 2009. - V. 23, № 2. - P. 93-109.

79. Wunder A., Muller-Ladner U., Stelzer E. H., Funk J., Neumann E., Stehle G., Pap T., Sinn H., Gay S., Fiehn C. Albumin-based drug delivery as novel therapeutic approach for rheumatoid arthritis // J Immunol. - 2003. - V. 170, № 9. - P. 4793-801.

80. Wunder A., Stehle G., Sinn H., Schrenk H., Hoffbiederbeck D., Bader F., Friedrich E., Peschke P., Maierborst W., Heene D. Enhanced albumin uptake by rat tumors // Int J Oncol. -1997. - V. 11, № 3. - P. 497-507.

81. Home P., Kurtzhals P. Insulin detemir: from concept to clinical experience //. - 2006.

82. Sleep D., Cameron J., Evans L. R. Albumin as a versatile platform for drug half-life extension // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. - 2013. - V. 1830, № 12. -P. 5526-5534.

83. Roovers R. C., Laeremans T., Huang L., De Taeye S., Verkleij A. J., Revets H., de Haard H. J., en Henegouwen P. M. v. B. Efficient inhibition of EGFR signalling and of tumour growth by antagonistic anti-EGFR Nanobodies // Cancer Immunology, Immunotherapy. - 2007. - V. 56, № 3. - P. 303-317.

84. Tijink B. M., Laeremans T., Budde M., Stigter-van Walsum M., Dreier T., de Haard H. J., Leemans C. R., van Dongen G. A. Improved tumor targeting of anti-epidermal growth factor receptor Nanobodies through albumin binding: taking advantage of modular Nanobody technology // Molecular cancer therapeutics. - 2008. - V. 7, № 8. - P. 2288-2297.

85. Müller M. R., Saunders K., Grace C., Jin M., P iche-Nicholas N., Steven J., O'Dwyer R., Wu L., Khetemenee L., Vugmeyster Y. Improving the pharmacokinetic properties of biologics by fusion to an anti-HSA shark VNAR domain // MAbs. - V. 4 -Taylor & Francis, 2012. - P. 673685.

86. Walker A., Dunlevy G., Rycroft D., Topley P., Holt L. J., Herbert T., Davies M., Cook F., Holmes S., Jespers L. Anti-serum albumin domain antibodies in the development of highly potent, efficacious and long-acting interferon // Protein Engineering Design and Selection. -2010. - V. 23, № 4. - P. 271-278.

87. Holt L. J., Basran A., Jones K., Chorlton J., Jespers L. S., Brewis N. D., Tomlinson I. M. Anti-serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs // Protein Engineering Design and Selection. - 2008. - V. 21, № 5. - P. 283-288.

88. Lipovsek D. Adnectins: engineered target-binding protein therapeutics // Protein Eng Des Sel. - 2011. - V. 24, № 1-2. - P. 3-9.

89. Kraulis P. J., Jonasson P., Nygren P.-Ä., Uhlen M., Jendeberg L., Nilsson B., Kördel J. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study // FEBS letters. - 1996. - V. 378, № 2. - P. 190-194.

90. Johansson M. U., Frick I.-M., Nilsson H., Kraulis P. J., Hober S., Jonasson P., Linhult M., Nygren P.-Ä., Uhlen M., Björck L. Structure, specificity, and mode of interaction for bacterial albumin-binding modules // Journal of Biological Chemistry. - 2002. - V. 277, № 10. - P. 81148120.

91. Jonsson A., Dogan J., Herne N., Abrahmsen L., N ygren P.-Ä. Engineering of a femtomolar affinity binding protein to human serum albumin // Protein Engineering Design and Selection. -2008. - V. 21, № 8. - P. 515-527.

92. Frejd F. Half-life extension by binding to albumin through an albumin binding domain // Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. - 2012.

93. Stork R., Müller D., Kontermann R. E. A novel tri-functional antibody fusion protein with improved pharmacokinetic properties generated by fusing a bispecific single-chain diabody with an albumin-binding domain from streptococcal protein G // Protein Engineering Design and Selection. - 2007. - V. 20, № 11. - P. 569-576.

94. Andersen J. T., Pehrson R., Tolmachev V., Daba M. B., Abrahmsen L., Ekblad C. Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain // Journal of Biological Chemistry. - 2011. - V. 286, № 7. - P. 5234-5241.

95. Schlapschy M., Theobald I., Mack H., Schottelius M., Wester H.-J., Skerra A. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life // Protein Engineering Design and Selection. - 2007. -V. 20, № 6. - P. 273-284.

96. Stork R., Campigna E., Robert B., Müller D., Kontermann R. E. Biodistribution of a bispecific single-chain diabody and its half-life extended derivatives // Journal of Biological Chemistry. - 2009. - V. 284, № 38. - P. 25612-25619.

97. Tolmachev V., Orlova A., Pehrson R., Galli J., Baastrup B., Andersson K., Sandström M., Rosik D., Carlsson J., Lundqvist H. Radionuclide therapy of HER2-positive microxenografts using a 177Lu-labeled HER2-specific Affibody molecule // Cancer Research. - 2007. - V. 67, № 6. - P. 2773-2782.

98. Malm M., Bass T., Gudmundsdotter L., Lord M., Frejd F. Y., Stahl S., Löfblom J. Engineering of a bispecific affibody molecule towards HER2 and HER3 by addition of an albumin-binding domain allows for affinity purification and in vivo half-life extension // Biotechnology journal. - 2014. - V. 9, № 9. - P. 1215-1222.

99. Koide S., Koide A., Lipovsek D. Target-binding proteins based on the 10th human fibronectin type III domain ((1)(0)Fn3) // Methods Enzymol. - 2012. - V. 503. - P. 135-56.

100. Main A. L., Harvey T. S., Baron M., Boyd J., Campbell I. D. The three-dimensional structure of the tenth type III module of fibronectin: an insight into RGD-mediated interactions // Cell. - 1992. - V. 71, № 4. - P. 671-8.

101. Petrovskaya L. E., Shingarova L. N., Kryukova E. A., Boldyreva E. F., Yakimov S. A., Guryanova S. V., Novoseletsky V. N., Dolgikh D. A., Kirpichnikov M. P. Construction of TNF-

binding proteins by grafting hypervariable regions of F10 antibody on human fibronectin domain scaffold // Biochemistry (Mosc). - 2012. - V. 77, № 1. - P. 62-70.

102. Xu L., Aha P., Gu K., Kuimelis R. G., Kurz M., Lam T., Lim A. C., Liu H., Lohse P. A., Sun L., Weng S., Wagner R. W., Lipovsek D. Directed evolution of high-affinity antibody mimics using mRNA display // Chem Biol. - 2002. - V. 9, № 8. - P. 933-42.

103. Mamluk R., Carvajal I. M., Morse B. A., Wong H., Abramowitz J., Aslanian S., Lim A. C., Gokemeijer J., Storek M. J., Lee J., Gosselin M., Wright M. C., Camphausen R. T., Wang J., Chen Y., Miller K., Sanders K., Short S., Sperinde J., Prasad G., Williams S., Kerbel R., Ebos J., Mutsaers A., Mendlein J. D., Harris A. S., Furfine E. S. Anti-tumor effect of CT-322 as an adnectin inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor-2 // MAbs. - 2010. - V. 2, № 2.

- P. 199-208.

104. Olson C. A., Liao H. I., Sun R., Roberts R. W. mRNA display selection of a high-affinity, modification-specific phospho-IkappaBalpha-binding fibronectin // ACS Chem Biol. - 2008. -V. 3, № 8. - P. 480-5.

105. Liao H. I., Olson C. A., Hwang S., Deng H., Wong E., Baric R. S., Roberts R. W., Sun R. mRNA display design of fibronectin-based intrabodies that detect and inhibit severe acute respiratory syndrome coronavirus nucleocapsid protein // J Biol Chem. - 2009. - V. 284, № 26.

- P. 17512-20.

106. Richards J., Miller M., Abend J., Koide A., Koide S., Dewhurst S. Engineered fibronectin type III domain with a RGDWXE sequence binds with enhanced affinity and specificity to human alphavbeta3 integrin // J Mol Biol. - 2003. - V. 326, № 5. - P. 1475-88.

107. Karatan E., Merguerian M., Han Z., Scholle M. D., Koide S., Kay B. K. Molecular recognition properties of FN3 monobodies that bind the Src SH3 domain // Chem Biol. - 2004. -V. 11, № 6. - P. 835-44.

108. Hackel B. J., Kapila A., Dane Wittrup K. Picomolar Affinity Fibronectin Domains Engineered Utilizing Loop Length Diversity, Recursive Mutagenesis, and Loop Shuffling // Journal of Molecular Biology. - 2008. - V. 381, № 5. - P. 1238-1252.

109. Hackel B. J., Ackerman M. E., Howland S. W., Wittrup K. D. Stability and CDR composition biases enrich binder functionality landscapes // J Mol B iol. - 2010. - V. 401, № 1. -P. 84-96.

110. Gilbreth R. N., Esaki K., Koide A., Sidhu S. S., Koide S. A dominant conformational role for amino acid diversity in minimalist protein-protein interfaces // J Mol Biol. - 2008. - V. 381, № 2. - P. 407-18.

111. Koide A., Abbatiello S., Rothgery L., Koide S. Probing protein conformational changes in living cells by using designer binding proteins: application to the estrogen receptor // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2002. - V. 99, № 3. - P. 1253-8.

112. Diem M. D., Hyun L., Yi F., Hippensteel R., Kuhar E., Lowenstein C., Swift E. J., O'Neil K. T., Jacobs S. A. Selection of high-affinity Centyrin FN3 domains from a simple library diversified at a combination of strand and loop positions // Protein Eng Des Sel. - 2014. - V. 27, № 10. - P. 419-29.

113. Altshuler E. P., Serebryanaya D. V., Katrukha A. G. Generation of recombinant antibodies and means for increasing their affinity // Biochemistry (Moscow). - 2011. - V. 75, № 13. - P. 1584-1605.

114. Roberts R. W., Szostak J. W. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1997. - V. 94, № 23. - P. 12297-302.

115. Zahnd C., Spinelli S., Luginbuhl B., Amstutz P., Cambillau C., Pluckthun A. Directed in vitro evolution and crystallographic analysis of a peptide-binding single chain antibody fragment (scFv) with low picomolar affinity // J Biol Chem. - 2004. - V. 279, № 18. - P. 18870-7.

116. Lipovsek D., Pluckthun A. In-vitro protein evolution by ribosome display and mRNA display // J Immunol Methods. - 2004. - V. 290, № 1-2. - P. 51-67.

117. Ullman C. G., Frigotto L., Cooley R. N. In vitro methods for peptide display and their applications // Brief Funct Genomics. - 2011. - V. 10, № 3. - P. 125-34.

118. Odegrip R., Coomber D., Eldridge B., Hederer R., Kuhlman P. A., Ullman C., FitzGerald K., McGregor D. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2004. - V. 101, № 9. - P. 2806-10.

119. Tikunova N. V., Morozova V. V. Phage display on the base of filamentous bacteriophages: application for recombinant antibodies selection // Acta Naturae. - 2009. - V. 1, № 3. - P. 20-8.

120. Weiss G. A., Sidhu S. S. Design and evolution of artificial M13 coat proteins // J Mol Biol. - 2000. - V. 300, № 1. - P. 213-9.

121. Li M. Applications of display technology in protein analysis // Nat Biotechnol. - 2000. - V. 18, № 12. - P. 1251-6.

122. Buonpane R. A., Churchill H. R., Moza B., Sundberg E. J., Peterson M. L., Schlievert P. M., Kranz D. M. Neutralization of staphylococcal enterotoxin B by soluble, high-affinity receptor antagonists // Nat Med. - 2007. - V. 13, № 6. - P. 725-9.

123. Huang G., Zhang M., Erdman S. E. Posttranslational modifications required for cell surface localization and function of the fungal adhesin Aga1p // Eukaryot Cell. - 2003. - V. 2, № 5. - P. 1099-114.

124. Tanaka T., Yamada R., Ogino C., Kondo A. Recent developments in yeast cell surface display toward extended applications in biotechnology // App l Microbiol Biotechnol. - 2012. -V. 95, № 3. - P. 577-91.

125. Chao G., Lau W. L., Hackel B. J., Sazinsky S. L., Lippow S. M., Wittrup K. D. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display // Nat Protoc. - 2006. - V. 1, № 2.

- P. 755-68.

126. Gai S. A., Wittrup K. D. Yeast surface display for protein engineering and characterization // Curr Opin Struct Biol. - 2007. - V. 17, № 4. - P. 467-73.

127. Kimura R. H., Levin A. M., Cochran F. V., Cochran J. R. Engineered cystine knot peptides that bind alphavbeta3, alphavbeta5, and alpha5beta1 integrins with low-nanomolar affinity // Proteins. - 2009. - V. 77, № 2. - P. 359-69.

128. Maple J., Moller S. G. Yeast two-hybrid screening // Methods Mol Biol. - 2007. - V. 362. -P. 207-23.

129. Parrish J. R., Gulyas K. D., Finley R. L., Jr. Yeast two-hybrid contributions to interactome mapping // Curr Opin Biotechnol. - 2006. - V. 17, № 4. - P. 387-93.

130. Lee S. Y., Choi J. H., Xu Z. Microbial cell-surface display // Trends Biotechnol. - 2003. -V. 21, № 1. - P. 45-52.

131. Jose J., Meyer T. F. The autodisplay story, from discovery to biotechnical and biomedical applications // Microbiol Mol Biol Rev. - 2007. - V. 71, № 4. - P. 600-19.

132. Taylor I. M., Harrison J. L., Timmis K. N., O'Connor C. D. The TraT lipoprotein as a vehicle for the transport of foreign antigenic determinants to the cell surface of Escherichia coli K12: structure-function relationships in the TraT protein // Mol Microbiol. - 1990. - V. 4, № 8.

- P. 1259-68.

133. Dhillon J. K., Drew P. D., Porter A. J. Bacterial surface display of an anti-pollutant antibody fragment // Lett Appl Microbiol. - 1999. - V. 28, № 5. - P. 350-4.

134. Mejare M., Ljung S., Bülow L. Selection of cadmium specific hexapeptides and their expression as OmpA fusion proteins in Escherichia coli // Protein engineering. - 1998. - V. 11, № 6. - P. 489-494.

135. van Bloois E., Winter R. T., Kolmar H., Fraaije M. W. Decorating microbes: surface display of proteins on Escherichia coli // Trends Biotechnol. - 2011. - V. 29, № 2. - P. 79-86.

136. Bingle W. H., Nomellini J. F., Smit J. Cell-surface display of a Pseudomonas aeruginosa strain K pilin peptide within the paracrystalline S-layer of Caulobacter crescentus // Mol Microbiol. - 1997. - V. 26, № 2. - P. 277-88.

137. Majander K., Korhonen T. K., Westerlund-Wikstrom B. Simultaneous display of multiple foreign peptides in the FliD capping and FliC filament proteins of the Escherichia coli flagellum // Appl Environ Microbiol. - 2005. - V. 71, № 8. - P. 4263-8.

138. Samuelson P., Gunneriusson E., Nygren P. A., Stahl S. Display of proteins on bacteria // J Biotechnol. - 2002. - V. 96, № 2. - P. 129-54.

139. Klauser T., Kramer J., Otzelberger K., Pohlner J., Meyer T. F. Characterization of the Neisseria Iga beta-core. The essential unit for outer membrane targeting and extracellular protein secretion // J Mol Biol. - 1993. - V. 234, № 3. - P. 579-93.

140. Akoh C. C., Lee G. C., Liaw Y. C., Huang T. H., Shaw J. F. GDSL family of serine esterases/lipases // Prog Lipid Res. - 2004. - V. 43, № 6. - P. 534-52.

141. van den Berg B. Crystal structure of a full-length autotransporter // J Mol Biol. - 2010. - V. 396, № 3. - P. 627-33.

142. Oomen C. J., van Ulsen P., van Gelder P., Feijen M., Tommassen J., Gros P. Structure of the translocator domain of a bacterial autotransporter // EMBO J. - 2004. - V. 23, № 6. - P. 1257-66.

143. Barnard T. J., Dautin N., Lukacik P., Bernstein H. D., Buchanan S. K. Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes // Nat Struct Mol Biol. - 2007. - V. 14, № 12. - P. 1214-20.

144. Petrovskaya L. E., Novototskaya-Vlasova K. A., Kryukova E. A., Rivkina E. M., Dolgikh D. A., Kirpichnikov M. P. Cell surface display of cold-active esterase EstPc with the use of a new autotransporter from Psychrobacter cryohalolentis K5(T) // Extremophiles. - 2015. - V. 19, № 1. - P. 161-70.

145. Henderson I. R., Navarro-Garcia F., Desvaux M., Fernandez R. C., Ala'Aldeen D. Type V protein secretion pathway: the autotransporter story // Microbiol Mol Biol Rev. - 2004. - V. 68, № 4. - P. 692-744.

146. Ruiz-Perez F., Henderson I. R., Leyton D. L., Rossiter A. E., Zhang Y., Nataro J. P. Roles of periplasmic chaperone proteins in the biogenesis of serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae // J Bacteriol. - 2009. - V. 191, № 21. - P. 6571-83.

147. Robert V., Volokhina E. B., Senf F., Bos M. P., Van Gelder P., Tommassen J. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif // PLoS Biol. - 2006. - V. 4, № 11. - P. e377.

148. Dautin N., Bernstein H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway // Annu Rev Microbiol. - 2007. - V. 61. - P. 89-112.

149. Leyton D. L., Rossiter A. E., Henderson I. R. From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis // Nature Reviews Microbiology. - 2012. - V. 10, № 3. - P. 213.

150. Noinaj N., Kuszak A. J., Gumbart J. C., Lukacik P., Chang H., Easley N. C., Lithgow T., Buchanan S. K. Structural insight into the biogenesis of ß-barrel membrane proteins // Nature. -2013. - V. 501, № 7467. - P. 385.

151. Braselmann E., Clark P. L. Autotransporters: the cellular environment reshapes a folding mechanism to promote protein transport // The journal of physical chemistry letters. - 2012. - V. 3, № 8. - P. 1063-1071.

152. Shingarova L. N., Petrovskaya L. E., Zlobinov A. V., Gapizov S. S., Kryukova E. A., Birikh K. R., Boldyreva E. F., Yakimov S. A., Dolgikh D. A., Kirpichnikov M. P. Construction of Artificial TNF-Binding Proteins Based on the 10th Human Fibronectin Type III Domain Using Bacterial Display // Biochemistry (Moscow). - 2018. - V. 83, № 6. - P. 708-716.

153. Leo J. C., Grin I., Linke D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. - 2012. - V. 367, № 1592. - P. 1088-101.

154. Kj^rgaard K., Hasman H., Schembri M. A., Klemm P. Antigen 43-mediated autotransporter display, a versatile bacterial cell surface presentation system // Journal of bacteriology. - 2002. -V. 184, № 15. - P. 4197-4204.

155. Lofblom J. Bacterial display in combinatorial protein engineering // Biotechnol J. - 2011. -V. 6, № 9. - P. 1115-29.

156. Veiga E., de Lorenzo V., Fernández L. A. Neutralization of enteric coronaviruses with Escherichia coli cells expressing single-chain Fv-autotransporter fusions // Journal of virology. -2003. - V. 77, № 24. - P. 13396-13398.

157. Wang L.-X., Mellon M., Bowder D., Quinn M., Shea D., Wood C., Xiang S.-H. Escherichia coli surface display of single-chain antibody VRC01 against HIV-1 infection // Virology. - 2015. - V. 475. - P. 179-186.

158. Veiga E., De Lorenzo V., Fernández L. A. Structural tolerance of bacterial autotransporters for folded passenger protein domains // Molecular microbiology. - 2004. - V. 52, № 4. - P. 1069-1080.

159. Binder U., Matschiner G., Theobald I., Skerra A. High-throughput sorting of an Anticalin library via EspP-mediated functional display on the Escherichia coli cell surface // Journal of molecular biology. - 2010. - V. 400, № 4. - P. 783-802.

160. Park M., Bong J.-H., Yoo G., Jose J., Kang M.-J., Pyun J.-C. Flow cytometric immunoassay using E. coli with autodisplayed Z-domains // Enzyme and microbial technology. - 2013. - V. 53, № 3. - P. 181-188.

161. Chen T. F., de Picciotto S., Hackel B. J., Wittrup K. D. Engineering fibronectin-based binding proteins by yeast surface display // Methods Enzymol. - 2013. - V. 523. - P. 303-26.

162. Duan J., Wu J., Valencia C. A., Liu R. Fibronectin type III domain based monobody with high avidity // Biochemistry. - 2007. - V. 46, № 44. - P. 12656-64.

163. Schmidt S. R. Fusion-proteins as biopharmaceuticals-applications and challenges // Curr Opin Drug Discov Devel. - 2009. - V. 12, № 2. - P. 284-295.

164. Kontermann R. E. Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics // Current opinion in biotechnology. - 2011. - V. 22, № 6. - P. 868-876.

165. Petrovskaya L. E., Gapizov S. S., Shingarova L. N., Kryukova E. A., Boldyreva E. F., Yakimov S. A., Svirschevskaya E. V., Lukashev E. P., Dolgikh D. A., Kirpichnikov M. P. Fluorescent fusion proteins derived from the tenth human fibronectin domain // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2014. - V. 40, № 4. - P. 375-382.

166. Bloom L., Calabro V. FN3: a new protein scaffold reaches the clinic // Drug Discov Today.

- 2009. - V. 14, № 19-20. - P. 949-55.

167. Mamluk R., Carvajal I. M., Morse B. A., Wong H., Abramowitz J., Aslanian S., Lim A.-C., Gokemeijer J., Storek M. J., Lee J., Gosselin M., Wright M. C., Camphausen R. T., Wang J., Chen Y., Miller K., Sanders K., Short S., Sperinde J., Prasad G., Williams S., Kerbel R. S., Ebos J., Mutsaers A., Mendlein J. D., Harris A. S., Furfine E. S. Anti-tumor effect of CT-322 as an Adnectin inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor-2 // mAbs. - 2010. - V. 2, № 2.

- P. 199-208.

168. Mitchell T., Chao G., Sitkoff D., Lo F., Monshizadegan H., Meyers D., Low S., Russo K., DiBella R., Denhez F. Pharmacologic profile of the Adnectin BMS-962476, a small protein biologic alternative to PCSK9 antibodies for low-density lipoprotein lowering // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 2014. - V. 350, № 2. - P. 412-424.

169. Madireddi M., Malone H., Kukral D., Chimalakonda A., Kozhich A., Xiling Y., Swain J., Yamniuk A., Ahlijanian M. BMS-986089 is a high affinity anti-myostatin adnectin that increases muscle volume in three preclinical species // Neuromuscular Disorders. - 2016. - V. 26. - P. S94-S95.

170. Brockmann E. C., Akter S., Savukoski T., Huovinen T., Lehmusvuori A., Leivo J., Saavalainen O., Azhayev A., Lovgren T., Hellman J., Lamminmaki U. Synthetic singleframework antibody library integrated with rapid affinity maturation by VL shuffling // Protein Eng Des Sel. - 2011. - V. 24, № 9. - P. 691-700.

171. Petrovskaya L., Novototskaya-Vlasova K., Kryukova E., Rivkina E., Dolgikh D., Kirpichnikov M. Cell surface display of cold-active esterase EstPc with the use of a new autotransporter from Psychrobacter cryohalolentis K5 T // Extremophiles. - 2015. - V. 19, № 1.

- P. 161-170.

172. Novototskaya-Vlasova K., Petrovskaya L., Yakimov S., Gilichinsky D. Cloning, purification, and characterization of a cold-adapted esterase produced by Psychrobacter cryohalolentis K5T from Siberian cryopeg // FEMS microbiology ecology. - 2012. - V. 82, № 2.

- P. 367-375.

173. Petrovskaya L., Zlobinov A., Shingarova L., Boldyreva E., Gapizov S. S., Novototskaya-Vlasova K., Rivkina E., Dolgikh D., Kirpichnikov M. Fusion with the cold-active esterase facilitates autotransporter-based surface display of the 10th human fibronectin domain in Escherichia coli // Extremophiles. - 2018. - V. 22, № 1. - P. 141-150.

174. Studier F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures // Protein expression and purification. - 2005. - V. 41, № 1. - P. 207-234.

175. Martineau P. Affinity measurements by competition ELISA // Antibody engineeringSpringer, 2010. - P. 657-665.

176. Webb C. T., Lithgow T. Identification of BamC on the Surface of E. coli // The BAM ComplexSpringer, 2015. - P. 215-225.

177. Petrovskaya L. E., Novototskaya-Vlasova K. A., Gapizov S. S., Spirina E. V., Durdenko E. V., Rivkina E. M. New member of the hormone-sensitive lipase family from the permafrost microbial community // Bioengineered. - 2017. - V. 8, № 4. - P. 420-423.

178. Boyer J. L. Bile formation and secretion // Comprehensive physiology. - 2013. - V. 3, № 3.

- P. 1035-1078.

179. Riches A., Sharp J., Thomas D. B., Smith S. V. Blood volume determination in the mouse // The Journal of physiology. - 1973. - V. 228, № 2. - P. 279-284.

180. Lofblom J. Bacterial display in combinatorial protein engineering // Biotechnology journal.

- 2011. - V. 6, № 9. - P. 1115-1129.

181. Lipovsek D. Adnectins: engineered target-binding protein therapeutics // Protein Engineering, Design & Selection. - 2010. - V. 24, № 1-2. - P. 3-9.

182. Chen T. F., De Picciotto S., Hackel B. J., Wittrup K. D. Engineering fibronectin-based binding proteins by yeast surface display // Methods in enzymologyElsevier, 2013. - P. 303-326.

183. van Bloois E., Winter R. T., Kolmar H., Fraaije M. W. Decorating microbes: surface display of proteins on Escherichia coli // Trends in biotechnology. - 2011. - V. 29, № 2. - P. 7986.

184. Bakermans C., Ayala-del-Rio H. L., Ponder M. A., Vishnivetskaya T., Gilichinsky D., Thomashow M. F., Tiedje J. M. Psychrobacter cryohalolentis sp. nov. and Psychrobacter arcticus sp. nov., isolated from Siberian permafrost // International journal of systematic and evolutionary microbiology. - 2006. - V. 56, № 6. - P. 1285-1291.

185. Petrovskaya L. E., Zlobinov A. V., Shingarova L. N., Boldyreva E. F., Gapizov S. S., Novototskaya-Vlasova K. A., Rivkina E. M., Dolgikh D. A., Kirpichnikov M. P. Fusion with the cold-active esterase facilitates autotransporter-based surface display of the 10th human fibronectin domain in Escherichia coli // Extremophiles. - 2018. - V. 22, № 1. - P. 141-150.

186. Miroux B., Walker J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels // Journal of molecular biology. - 1996. - V. 260, № 3. - P. 289-298.

187. Jose J., von Schwichow S. Autodisplay of active sorbitol dehydrogenase (SDH) yields a whole cell biocatalyst for the synthesis of rare sugars // Chembiochem. - 2004. - V. 5, № 4. - P. 491-499.

188. Jose J., Maas R. M., Teese M. G. Autodisplay of enzymes—molecular basis and perspectives // Journal of biotechnology. - 2012. - V. 161, № 2. - P. 92-103.

189. Plaxco K. W., Spitzfaden C., Campbell I. D., Dobson C. M. A comparison of the folding kinetics and thermodynamics of two homologous fibronectin type III modules1 // Journal of molecular biology. - 1997. - V. 270, № 5. - P. 763-770.

190. Brockmann E.-C., Akter S., Savukoski T., Huovinen T., Lehmusvuori A., Leivo J., Saavalainen O., Azhayev A., Lovgren T., Hellman J. Synthetic single-framework antibody library integrated with rapid affinity maturation by VL shuffling // Protein Engineering, Design & Selection. - 2011. - V. 24, № 9. - P. 691-700.

191. Fellouse F. A., Esaki K., Birtalan S., Raptis D., Cancasci V. J., Koide A., Jhurani P., Vasser M., Wiesmann C., Kossiakoff A. A. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries // Journal of molecular biology. - 2007. -V. 373, № 4. - P. 924-940.

192. Hackel B. J., Kapila A., Wittrup K. D. Picomolar affinity fibronectin domains engineered utilizing loop length diversity, recursive mutagenesis, and loop shuffling // Journal of molecular biology. - 2008. - V. 381, № 5. - P. 1238-1252.

193. Main A. L., Harvey T. S., Baron M., Boyd J., Campbell I. D. The three-dimensional structure of the tenth type III module of fibronectin: an insight into RGD-mediated interactions // Cell. - 1992. - V. 71, № 4. - P. 671-678.

194. Dickinson C. D., Veerapandian B., Dai X.-P., Hamlin R. C., Xuong N.-h., Ruoslahti E., Ely K. R. Crystal structure of the tenth type III cell adhesion module of human fibronectin // Journal of molecular biology. - 1994. - V. 236, № 4. - P. 1079-1092.

195. Gilbreth R. N., Esaki K., Koide A., Sidhu S. S., Koide S. A dominant conformational role for amino acid diversity in minimalist protein-protein interfaces // Journal of molecular biology. - 2008. - V. 381, № 2. - P. 407-418.

196. Xu L., Aha P., Gu K., Kuimelis R. G., Kurz M., Lam T., Lim A. C., Liu H., Lohse P. A., Sun L. Directed evolution of high-affinity antibody mimics using mRNA display // Chemistry & biology. - 2002. - V. 9, № 8. - P. 933-942.

197. Piatkevich K. D., Efremenko E. N., Verkhusha V. V., Varfolomeev S. D. Red fluorescent proteins and their properties // Russian Chemical Reviews. - 2010. - V. 79, № 3. - P. 243.

198. Chudakov D. M., Matz M. V., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues // Physiological reviews. - 2010. - V. 90, № 3. -P. 1103-1163.

199. Giepmans B. N., Adams S. R., Ellisman M. H., Tsien R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function // science. - 2006. - V. 312, № 5771. - P. 217-224.

200. Desplancq D., Rinaldi A.-S., Stoessel A., Sibler A.-P., Busso D., Oulad-Abdelghani M., Van Regenmortel M. H., Weiss E. Single-chain Fv fragment antibodies selected from an intrabody library as effective mono-or bivalent reagents for in vitro protein detection // Journal of immunological methods. - 2011. - V. 369, № 1-2. - P. 42-50.

201. Sakamoto S., Taura F., Pongkitwitoon B., Putalun W., Tsuchihashi R., Kinjo J., Tanaka H., Morimoto S. Development of sensitivity-improved fluorescence-linked immunosorbent assay using a fluorescent single-domain antibody against the bioactive naphthoquinone, plumbagin // Analytical and bioanalytical chemistry. - 2010. - V. 396, № 8. - P. 2955-2963.

202. Casey J. L., Coley A. M., Tilley L. M., Foley M. Green fluorescent antibodies: novel in vitro tools // Protein engineering. - 2000. - V. 13, № 6. - P. 445-452.

203. Griep R. A., van Twisk C., van der Wolf J. M., Schots A. Fluobodies: green fluorescent single-chain Fv fusion proteins // Journal of immunological methods. - 1999. - V. 230, № 1-2. -P. 121-130.

204. Oelschlaeger P., Srikant-Iyer S., Lange S., Schmitt J., Schmid R. D. Fluorophor-linked immunosorbent assay: a time-and cost-saving method for the characterization of antibody fragments using a fusion protein of a single-chain antibody fragment and enhanced green fluorescent protein // Analytical biochemistry. - 2002. - V. 309, № 1. - P. 27-34.

205. Schwalbach G., Sibler A.-P., Choulier L., Deryckère F., Weiss E. Production of fluorescent single-chain antibody fragments in Escherichia coli // Protein expression and purification. -2000. - V. 18, № 2. - P. 121-132.

206. Luria Y., Raichlin D., Benhar I. Fluorescent IgG fusion proteins made in E. coli // mabs. -V. 4 -Taylor & Francis, 2012. - P. 373-384.

207. Aoki T., Takahashi Y., Koch K. S., Leffert H. L., Watabe H. Construction of a fusion protein between protein A and green fluorescent protein and its application to Western blotting // FEBS letters. - 1996. - V. 384, № 2. - P. 193-197.

208. Gapizov S. S., Petrovskaya L. E., Shingarova L. N., Svirschevskaya E. V., Dolgikh D. A., Kirpichnikov M. P. The Effect of TNF and VEGF on the Properties of Ea.hy926 Endothelial Cells in a Model of Multi-Cellular Spheroids // Acta Naturae. - 2018. - V. 10, № 1. - P. 34-42.

209. De Smit M. H., Van Duin J. Control of prokaryotic translational initiation by mRNA secondary structure // Progress in nucleic acid research and molecular biologyElsevier, 1990. -P. 1-35.

210. Campbell R. E., Tour O., Palmer A. E., Steinbach P. A., Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. A monomeric red fluorescent protein // Proceedings of the National Academy of Sciences.

- 2002. - V. 99, № 12. - P. 7877-7882.

211. Gross L. A., Baird G. S., Hoffman R. C., Baldridge K. K., Tsien R. Y. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2000. - V. 97, № 22. - P. 11990-11995.

212. Shcherbo D., Murphy C. S., Ermakova G. V., Solovieva E. A., Chepurnykh T. V., Shcheglov A. S., Verkhusha V. V., Pletnev V. Z., Hazelwood K. L., Roche P. M. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues // Biochemical journal. - 2009. - V. 418, № 3. - P. 567-574.

213. Shaner N. C., Campbell R. E., Steinbach P. A., Giepmans B. N., Palmer A. E., Tsien R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein // Nature biotechnology. - 2004. - V. 22, № 12. - P. 1567.

214. Schoenenberger C.-A., Zuk A., Zinkl G. M., Kendall D., Matlin K. S. Integrin expression and localization in normal MDCK cells and transformed MDCK cells lacking apical polarity // Journal of Cell Science. - 1994. - V. 107, № 2. - P. 527-541.

215. Sheppard D. Epithelial integrins // Bioessays. - 1996. - V. 18, № 8. - P. 655-660.

216. Ohsaka A., Hirota-Komatsu S., Shibata M., Ezaki J., Shinohara F., Yoshida T. Specific association of increased vascular endothelial growth factor expression and its receptors with macrophage differentiation of HL-60 leukemia cells // Biochem Biophys Res Commun. - 2008.

- V. 368, № 3. - P. 543-9.

217. Laitinen I., Saraste A., Weidl E., Poethko T., Weber A. W., Nekolla S. G., Leppänen P., Yla-Herttuala S., Hölzlwimmer G., Walch A. Evaluation of avß3 integrin-targeted positron emission tomography tracer 18F-galacto-RGD for imaging of vascular inflammation in atherosclerotic mice // Circulation: Cardiovascular Imaging. - 2009. - V. 2, № 4. - P. 331-338.

218. Desgrosellier J. S., Cheresh D. A. Integrins in cancer: biological implications and therapeutic opportunities // Nature Reviews Cancer. - 2010. - V. 10, № 1. - P. 9.

219. Eliceiri B. P., Cheresh D. A. The role of av integrins during angiogenesis: insights into potential mechanisms of action and clinical development // The Journal of clinical investigation. - 1999. - V. 103, № 9. - P. 1227-1230.

220. van Oost B. A., Edgell C. J., Hay C. W., MacGillivray R. T. Isolation of a human von Willebrand factor cDNA from the hybrid endothelial cell line EA.hy926 // Biochem Cell Biol. -1986. - V. 64, № 7. - P. 699-705.

221. Edgell C. J., McDonald C. C., Graham J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1983. - V. 80, № 12. - P. 3734-7.

222. Bauer J., Margolis M., Schreiner C., Edgell C. J., Azizkhan J., Lazarowski E., Juliano R. L. In vitro model of angiogenesis using a human endothelium-derived permanent cell line: contributions of induced gene expression, G-proteins, and integrins // J Cell Physiol. - 1992. -V. 153, № 3. - P. 437-49.

223. Heiss M., Hellstrom M., Kalen M., May T., Weber H., Hecker M., Augustin H. G., Korff T. Endothelial cell spheroids as a versatile tool to study angiogenesis in vitro // FASEB J. - 2015. -V. 29, № 7. - P. 3076-84.

224. Shcheglovitova O. N., Skliankina N. N., Boldyreva N. V., Babaiants A. A., Frolova I. S., Kapkaeva M. P. [Human interferon modulates infected vascular endothelium function] // Vestn Ross Akad Med Nauk. - 2014. № 3-4. - P. 31-5.

225. Riesbeck K., Billstrom A., Tordsson J., Brodin T., Kristensson K., Dohlsten M. Endothelial cells expressing an inflammatory phenotype are lysed by superantigen-targeted cytotoxic T cells // Clin Diagn Lab Immunol. - 1998. - V. 5, № 5. - P. 675-82.

226. Chao C. Y., Lii C. K., Tsai I. T., Li C. C., Liu K. L., Tsai C. W., Chen H. W. Andrographolide inhibits ICAM-1 expression and NF-kappaB activation in TNF-alpha-treated EA.hy926 cells // J Agric Food Chem. - 2011. - V. 59, № 10. - P. 5263-71.

227. Hirschhaeuser F., Menne H., Dittfeld C., West J., Mueller-Klieser W., Kunz-Schughart L. A. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again // J Biotechnol. -2010. - V. 148, № 1. - P. 3-15.

228. Fennema E., Rivron N., Rouwkema J., van Blitterswijk C., de Boer J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues // Trends Biotechnol. - 2013. - V. 31, № 2. - P. 108-15.

229. Page H., Flood P., Reynaud E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond // Cell Tissue Res. - 2013. - V. 352, № 1. - P. 123-31.

230. Breslin S., O'Driscoll L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery // Drug Discov Today. - 2013. - V. 18, № 5-6. - P. 240-9.

231. Ma X., Sickmann A., Pietsch J., Wildgruber R., Weber G., Infanger M., Bauer J., Grimm D. Proteomic differences between microvascular endothelial cells and the EA.hy926 cell line forming three-dimensional structures // Proteomics. - 2014. - V. 14, № 6. - P. 689-98.

232. Ma X., Wehland M., Schulz H., Saar K., Hubner N., Infanger M., Bauer J., Grimm D. Genomic approach to identify factors that drive the formation of three-dimensional structures by EA.hy926 endothelial cells // PLoS One. - 2013. - V. 8, № 5. - P. e64402.

233. Grimm D., Bauer J., Ulbrich C., Westphal K., Wehland M., Infanger M., Aleshcheva G., Pietsch J., Ghardi M., Beck M., El-Saghire H., de Saint-Georges L., Baatout S. Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity // Tissue Eng Part A. - 2010. - V. 16, № 5. - P. 1559-73.

234. Kim J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology // Semin Cancer Biol. - 2005. - V. 15, № 5. - P. 365-77.

235. Doi Y., Yashiro M., Yamada N., Amano R., Noda S., Hirakawa K. VEGF -A/VEGFR-2 signaling plays an important role for the motility of pancreas cancer cells // Annals of surgical oncology. - 2012. - V. 19, № 8. - P. 2733-2743.

236. Max R., Gerritsen R. R., Nooijen P. T., Goodman S. L., Sutter A., Keilholz U., Ruiter D. J., De Waal R. M. Immunohistochemical analysis of integrin avß3 expression on tumor-associated vessels of human carcinomas // International journal of cancer. - 1997. - V. 71, № 3. - P. 320324.

237. Zhao H. L., Xue C., Wang Y., Li X. Y., Xiong X. H., Yao X. Q., Liu Z. M. Circumventing the heterogeneity and instability of human serum albumin-interferon-a2b fusion protein by altering its orientation // Journal of biotechnology. - 2007. - V. 131, № 3. - P. 245-252.

238. Christensen T., Amiram M., Dagher S., Trabbic-Carlson K., Shamji M. F., Setton L. A., Chilkoti A. Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins // Protein Science. - 2009. - V. 18, № 7. - P. 1377-1387.

239. Li R., Yang H., Jia D., Nie Q., Cai H., Fan Q., Wan L., Li L., Lu X. Fusion to an albumin-binding domain with a high affinity for albumin extends the circulatory half-life and enhances

the in vivo antitumor effects of human TRAIL // Journal of Controlled Release. - 2016. - V. 228. - P. 96-106.

240. Stork R., Campigna E., Robert B., Muller D., Kontermann R. E. Biodistribution of a bispecific single-chain diabody and its half-life extended derivatives // J Biol Chem. - 2009. - V. 284, № 38. - P. 25612-9.

241. Orlova A., Jonsson A., Rosik D., Lundqvist H., Lindborg M., Abrahmsen L., Ekblad C., Frejd F. Y., Tolmachev V. Site-specific radiometal labeling and improved biodistribution using ABY-027, a novel HER2-targeting affibody molecule-albumin-binding domain fusion protein // J Nucl Med. - 2013. - V. 54, № 6. - P. 961-8.

242. Tolmachev V., Wallberg H., Andersson K., Wennborg A., Lundqvist H., Orlova A. The influence of Bz-DOTA and CHX-A''-DTPA on the biodistribution of ABD-fused anti-HER2 Affibody molecules: implications for (114m)In-mediated targeting therapy // Eur J Nucl Med Mol Imaging. - 2009. - V. 36, № 9. - P. 1460-8.

243. Jacobs S. A., Gibbs A. C., Conk M., Yi F., Maguire D., Kane C., O'Neil K. T. Fusion to a highly stable consensus albumin binding domain allows for tunable pharmacokinetics // Protein Engineering, Design and Selection. - 2015. - V. 28, № 10. - P. 385-393.

244. Hopp J., Hornig N., Zettlitz K. A., Schwarz A., Fuß N., Müller D., Kontermann R. E. The effects of affinity and valency of an albumin-binding domain (ABD) on the half-life of a single-chain diabody-ABD fusion protein // Protein Engineering Design and Selection. - 2010. - V. 23, № 11. - P. 827-834.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю огромную благодарность моим научным руководителям Ладе Евгеньевне Петровской и Дмитрию Александровичу Долгих. Дмитрию Александровичу за отзывчивость, возможность реализовывать научные идеи, за помощь в планировании работы и трактовке данных, за полезные советы, за редактирование данной рукописи.

Петровской Ладе Евгеньевне за бесценный вклад в развитие творческих и научно -исследовательских навыков, оптимистический настрой, отзывчивость и доброжелательность, за помощь в трактовке данных и написании статей, за ценные советы и замечания, за редактирование диссертации, за помощь в создании презентации.

Благодарю своих коллег из Института биоорганической химии за помощь в проведении экспериментов и обработке результатов, за доверие и теплую, дружественную атмосферу в лаборатории: Шингарову Людмилу Николаевну, Крюкову Елену Александровну, Болдыреву Елену Филипповну, Злобинова Александра, Якимова Сергея Александровича.

Благодарю нашего коллегу с кафедры биофизики МГУ Лукашева Евгения Павловича за получение спектров флуоресценции гибридных белков и за исследование их термической стабильности.

Особую благодарность выражаю старшему научном сотруднику лаборатории клеточных взаимодействий ИБХ РАН Свирщевской Елене Викторовне за то, что научила многим методам клеточной биологии и работе с лабораторными животными, за терпение и отзывчивость, за помощь в работе и в написании статей, за преданность своему делу.

Также выражаю благодарность своим друзьям и близким за поддержку и веру в

меня.