Научные основы использования методов санитарно-микробиологической экспертизы и микробной деконтаминации птицепродуктов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.05, доктор наук Абдуллаева Асият Мухтаровна

• Абдуллаева Асият Мухтаровна
• доктор наук
• 2021

Оглавление диссертации доктор наук Абдуллаева Асият Мухтаровна

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1 Птицеводство - как наиболее перспективная отрасль агропромышленного комплекса

1.2 Биологическая и пищевая ценность мяса птицы

1.3 Наиболее распространенные инфекционные болезни птицы

1.4 Токсикоинфекции и токсикозы бактериального происхождения

1.5 Международные стандарты качества и безопасности мяса птицы

1.6 Производственный ветеринарно-санитарный контроль при переработке птицы

1.7 Классификация полуфабрикатов из тушек птицы

1.8 Биоопасность жизнеспособных некультивируемых микроорганизмов, контаминирующих пищевую продукцию

1.9 Применение УФ-излучения в пищевой промышленности

1.10 Использование бактериофагов в пищевой промышленности

1.11 Краткие сведения о бактериоцинах и бактериоциноподобных

веществах

Заключение

2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Объекты исследования

2.1.2 Методы отбора проб мяса птицы и полуфабрикатов

2.1.3 Методы органолептической оценки мяса птицы и полуфабрикатов

2.1.5 Методы бактериологического исследования мяса птицы и полуфабрикатов

2.1.6 Методы идентификации микроорганизмов, выделенных из мяса птицы и полуфабрикатов

2.1.7 Методы выявления жизнеспособных культивируемых и некультивируемых клеток микроорганизмов

2.1.8 Методы изучения обеззараживающей активности УФ-облучения и

озонирования в камерах созревания колбасных изделий их мяса птицы

2.1.9 Методы определения чувствительности микроорганизмов к

бактериофагам и бактериоцинам

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Органолептическая оценка и физико -химические исследования мяса птицы и полуфабрикатов в режиме онлайн

2.2.2 Микробиологический анализ мяса птицы и полуфабрикатов

2.2.3 Микробиологический мониторинг контаминации мяса птицы и птицепродуктов микроорганизмами

2.2.4 Результаты определения жизнеспособных культивируемых и

некультивируемых клеток в продуктах из мяса птицы

2.2.6 Результаты изучения особенностей перехода фагочувствительных и фагорезистентных клеток P. aeruginosa и E. coli в жизнеспособное некультивируемое состояние при длительных стрессовых воздействиях

2.2.6 Влияние УФ-облучения и озонирования на микробиологические показатели мясных продуктов

2.2.7 Эффективность обеззараживающего действия бактериофагов при производстве мяса птицы и изготовлении полуфабрикатов

2.2.8 Изучение антимикробного действия бактериоцина при изготовлении колбасных изделий из мяса птицы

2.2.9 Обсуждение результатов исследования

3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

7 ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Научные основы использования методов санитарно-микробиологической экспертизы и микробной деконтаминации птицепродуктов»

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время особую озабоченность в мире представляет обеспечение возрастающего по численности населения продовольствием и, прежде всего, продуктами животного происхождения. Анализ литературных источников показывает, что в последние годы уже хронически недоедают более 17 % населения нашей планеты и в ближайшее десятилетие голодающими могут стать не менее 25 % людей. От недостатка белка и неправильного питания ежегодно на планете погибает около 5 млн. человек, во многих странах снизились рождаемость и продолжительность жизни населения. Известно, что здоровье любой нации зависит от системы здравоохранения только на 10 -12 %, а от социально-экономических условий - на 55-60 %. По мнению ряда учёных питание является единственным средством, пролонгирующим продолжительность жизни на 25-40 % и более. С помощью полноценного и безопасного питания можно снизить заболеваемость, связанную со старением человека на 80 %, аллергией - на 60 %, сахарным диабетом - на 50 %, заболеваниями сердечно сосудистой системы - на 25 %, болезнями органов зрения - на 20 %. В отдельных случаях полноценное питание позволяет не только сохранить здоровье, но и, в определённой мере, заменить лекарственные препараты [40, 146, 163].

Питание является одним из основных условий существования всех живущих на Земле. В развитых и развивающихся странах основной проблемой, решение которой становится приоритетным, является питание качественными продуктами, в то время как в прошлые столетия было важнее количество пищи. Качественное питание человека невозможно без использования наиболее универсального источника животного белка - мяса [59, 140].

Научные основы полноценного и профилактического питания изложены в трудах Покровского А.А., Тутельяна В.А., Рогова И.А., Лисицына А.Б., Касьянова Г.И., Чеботарёва Л.Ф. и др. Большое значение в политике здорового питания людей в нашей стране имели принятые на государственном уровне «Доктрина продовольственной безопасности Российской Федерации» (2010) и по-

становление Правительства РФ «Концепция государственной политики в области здорового питания населения России на период до 2010 года». В основе этих документов заложена способность государства удовлетворять потребности населения в продовольствии, в объеме, качестве и безопасности, допустимые для нормального физического и социального благополучия человека [146].

Однако современные социально-экономические изменения и неплановое развитие аграрного сектора в Российской Федерации привело к организации мелких фермерских и крестьянских хозяйств, к нестандартным условиям содержания и кормления животных, к переработке на частных предприятиях АПК, что определило новые подходы к контролю безопасности сельскохозяйственной продукции (прежде всего, мясного сырья) на всех этапах оборота, т.е. от производства до реализации. Поэтому, приоритетом и главным направлением в деле сохранения и улучшения здоровья населения нашей страны, являются методическое обеспечение и постоянный контроль безопасности пищевых продуктов. Для этого необходимо совершенствовать методы ветеринарно -санитарного контроля на всех участках производства и разрабатывать новые правила ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов убоя животных и птицы [165].

Актуальность темы исследования. В настоящее время очевидную актуальность для мясоперерабатывающей отрасли все чаще приобретают вопросы повышения безопасности и эффективности контроля пищевых продуктов на всех этапах оборота. Прежде всего это связано с тем, что в России и в других странах мира не уменьшается количество заболеваний пищевого происхождения, в том числе сальмонеллёзом, кампилобактериозом, дизентерией, токсико-инфекциями, бактериальными токсикозами и др. [60, 89, 96, 102]. Качество и безопасность птицепродуктов формируются под воздействием как прижизненных (особенности генотипа птицы, условия содержания и др.), так и после-убойных (технологии переработки, хранения и др.) факторов. Известно, что мясо птицы и птицепродукты являются благоприятной питательной средой для размножения многих микроорганизмов [109, 115]. Как скоропортящиеся орга-

нические субстраты мясо и полуфабрикаты должны контролироваться на всех этапах производства, хранения и реализации.

С целью продления срока годности и предотвращения быстрой порчи мяса и мясной продукции создаются высокоэффективные технологии и различные способы упаковок, длительное хранение охлажденного мяса, применение вакуума и др. Помимо этого, для предохранения птицепродуктов от микробной контаминации ведется поиск новых средств антимикробной защиты мясной продукции. К таким средствам относятся консерванты различной природы [56, 240], упаковка с применением модифицированной газовой атмосферы [2, 17, 32, 106, 340], физико-химические факторы, коммерческие бактериофаги, эффективные в отношении рыбной и мясной (свинина) продукции [5, 36, 176, 341, 347, 356], бактериоцин низин [311, 321, 338, 344]. Однако защита продуктов из мяса птицы с помощью бактериофагов и бактериоцинов экспериментально мало изучена.

Доброкачественность продуктов из мяса птицы и их безопасность для потребителя зависят, прежде всего, от исходного мясного сырья. Вместе с тем ве-теринарно-санитарные показатели в режиме реального времени достаточно часто достигают предельно допустимых уровней или превышают их [146]. Поэтому особое внимание производителям мясных продуктов и контролирующим органам следует обращать на качество и безопасность сырья, готовой продукции, условия их хранения.

Учитывая возрастающую потребность населения в высококачественной и безопасной продукции, мясоперерабатывающие предприятия должны соответствовать требованиям гигиены и санитарии, постоянно совершенствовать методы снижения бактериальной контаминации как сырья, так и готовой мясной продукции на всех участках производства. Это определило необходимость проведения исследований по выбранной нами теме.

Степень разработанности. В последние десятилетия в птицеводческой отрасли произошли определенные изменения, традиционные технологии заметно устарели и требуют дальнейшего совершенствования с учетом современ-

ных достижений отраслевой науки и техники. Основные технологические приемы и методы контроля безопасности мяса и мясных продуктов были разработаны в середине ХХ века. Они отвечали методам разведения и переработки животных и птицы, которые использовали в те времена. Но в последние десятилетия животноводческая отрасль претерпела ряд изменений, что предполагает совершенствование контроля продукции во всех отраслях агропромышленного комплекса, в том числе и в мясоперерабатывающей промышленности. В настоящее время возникла необходимость внедрения инновационных способов как по продлению сроков хранения пищевого сырья, продукции, так и осуществлению их микробной деконтаминации. Такая потребность очевидна прежде всего для птицеводческой отрасли, которая развивается в нашей стране наиболее быстрыми темпами.

Цель и задачи исследования

В связи с вышеизложенным целью наших исследований явилась разработка научно обоснованных и рациональных методов санитарно-микробиологического контроля, а также защиты от контаминации сырья и готовых продуктов из мяса птицы с целью повышения их биологической безопасности. При этом возникла необходимость изучения новых и нетрадиционных подходов к снижению бактериальной загрязненности мясного сырья, мясных полуфабрикатов и готовых мясных продуктов.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- определить в режиме реального времени органолептические, физико -химические и микробиологические показатели мяса птицы и птицепродуктов из торговой сети;

- провести ретроспективный мониторинг уровня и частоты контаминации мяса птицы и птицепродуктов;

- определить наличие жизнеспособных некультивируемых клеток мик-роорганизмов-контаминантов и изучить их выживаемость в продуктах из мяса птицы;

- изучить особенности выявления жизнеспособных некультивируемых клеток отдельных пищевых патогенов и влияние на этот процесс носительства профагов;

- оценить эффективность использования УФ-облучателей и озонаторов для повышения уровня гигиены производственных помещений и снижения бактериальной обсемененности птицепродуктов при хранении;

- исследовать возможность применения промышленно выпускаемых бактериофагов для биозащиты продукции из птицы от гомологичных патогенных микроорганизмов;

- определить эффективность антимикробного действия сухого коммерческого бактериоцина низина для предохранения продуктов из мяса птицы от пищевых патогенов;

- разработать на основании полученных данных предложения по совершенствованию и рациональному применению микробиологического контроля продукции из птицы, а также по снижению ее контаминации различными микроорганизмами с целью повышения уровня безопасности для потребителей.

Научная новизна состоит в том, что на основании органолептических, физико-химических и микробиологических исследований птицепродуктов при хранении дана оценка уровня биологической безопасности мясного сырья и продукции.

Обобщены и достоверно установлены по статистическим данным мониторинга качества мяса птицы и птицепродуктов за 2015 -2019 гг. уровень и частота микробной обсемененности, а также месяцы года, наиболее опасные для пищевых инфекций.

Впервые установлено наличие жизнеспособных некультивируемых клеток бактерий в продукции птицеперерабатывающей промышленности и показано влияние носительства профагов на их образование.

Определена эффективность применения УФ-облучения и озонирования на этапе производства колбасных изделий для повышения гигиены помещений и

защиты колбасных изделий от опасных для здоровья потребителя патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Экспериментально изучена возможность использования промышленно выпускаемых бактериофагов для микробной деконтаминации птицепродукции гомологичными микроорганизмами.

Установлена эффективность антибактериального действия сухого коммерческого бактериоцина низина при хранении продуктов из мяса птицы.

Получены приоритетные данные по выявлению в птицепродуктах жизнеспособных бактерий экспресс-методом, представленные в поданной заявке на изобретение № 2020126113 от 05.08.2020 г.

Объекты и предметы исследования. Объектами исследования служили тушки птицы, полуфабрикаты и колбасные изделия из мяса птицы. Предметом исследования являлись вопросы совершенствования традиционных и разработка инновационных методов ветеринарно-санитарного контроля, обеспечивающих доброкачественность и и биологическую безопасность мяса птицы и продуктов из него.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования

На основании проведенного ретроспективного мониторинга выявлены уровень и частота наибольшей микробной контаминации мяса птицы и птице-продуктов, не отвечающих требованиям ТР ТС 034/2013 и СанПиН 2.3.2.107801 по содержанию МАФАнМ, БГКП, Salmonella spp., Listeria monocytogenes. Материалы мониторинга включены в план мероприятий птицеперерабатывающих предприятий по осуществлению санитарно-дезинфекционных мероприятий и усилению микробиологического контроля в периоды наибольшей инфи-цированности мяса птицы патогенами с целью предотвращения болезней пищевого происхождения.

Разработан метод выявления жизнеспособных микроорганизмов, позволяющий существенно сократить время на исследование и получить достоверные результаты о присутствии/отсутствии микроорганизмов. Приоритетность полученных данных отражена в поданной заявке на изобретение № 2020126113

«Способ экспресс-детекции жизнеспособных микроорганизмов в мясе и мясных продуктах» от 05.08.2020 г. Апробация проведена в ИПЛ АО «ЧМПЗ» с 16.10.19 по 30.10.2019 гг. и на предприятии ООО «Дантон-Птицепром» филиал № 1 «Ржевская Птицефабрика» с 10.06.2020 по 28.06.2020 гг.

Разработан и апробирован в условиях производственных предприятий ПАО «Черкизово» и ООО «Дантон-Птицепром» филиал № 1 «Ржевская Птицефабрика» комплексный метод обработки УФ-облучением и озонированием камер сушки колбасных изделий из мяса птицы с целью их защиты от воздействия бактерий и плесневых грибов.

Доказана возможность использования коммерческих биологических средств (бактериофагов и бактериоцинов) для защиты и повышения безопасности мяса птицы и готовых продуктов из него путем снижения микробной контаминации.

Предложены эффективные методы использования коммерческих биологических средств для защиты и повышения безопасности мяса птицы и готовых продуктов из него путем снижения микробной контаминации. Научно-техническим советом ФГБОУ ВО «МГУПП» утверждены Методические рекомендации «Использование бактериофагов для биозащиты от микробной контаминации продуктов из мяса птицы» (2020 г) и «Использование бактериоцина при изготовлении колбасных изделий из мяса птицы» (2020 г).

Материалы диссертационной работы включены в изданные учебные пособия для студентов высших учебных заведений по направлениям подготовки «Ветеринарно-санитарная экспертиза», «Продукты питания животного происхождения», курсов повышения квалификации и практических специалистов по ветеринарно-санитарной экспертизе и микробиологии: «Ветеринарно-санитарная экспертиза при переработке птицы», Санкт-Петербург, Квадро, 2017 г (награждение серебряной медалью и дипломом II степени на 20 -й Российской Агропромышленной Выставке «Золотая осень-2018»); «Санитарные и ветеринарные правила для предприятий по переработке и реализации мяса, молока, птицы, рыбы», Москва, Издательские технологии, 2019 г (награждение

серебряной медалью и дипломом II степени на 21 -й Российской Агропромышленной Выставке «Золотая осень-2019»); «Практикум по общей микробиологии», Санкт-Петербург, Квадро, 2017 г (награждение серебряной медалью и дипломом II степени на 22-й Российской Агропромышленной Выставке «Золотая осень-2020»); «Производственный ветеринарно-санитарный контроль обработки субпродуктов и изготовления мясных полуфабрикатов», Москва, Издательские технологии, 2020 г; «Возбудители зооантропонозов, пищевых отравлений, порчи сырья и продуктов животного происхождения», Москва, ТД ДеЛи плюс, 2020 г.

Результаты диссертационной работы также используются при обучении студентов (лекции, лабораторные занятия по ветеринарно-санитарной экспертизе и микробиологии), магистров и аспирантов ФГБОУ ВО «МГУПП», РГАУ -МСХА им. К.А. Тимирязева, ФГАОУ ВО РУДН, лаборатории микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

Методология и методы исследования. Методологической основой исследования явились труды отечественных и зарубежных ученых, направленные на улучшение санитарно-гигиенических условий производства птицепродуктов и их антибактериальной защиты с целью повышения их безопасности для потребителей. В работе использованы современные методы микробиологии, химического анализа, ветеринарно-санитарной экспертизы в соответствии с методами национальных и международных стандартов.

Основные положения, выносимые на защиту

- Динамика изменений ветеринарно-санитарных показателей мяса птицы и птицепродуктов при хранении.

- Результаты мониторинга птицепродукции с определением уровня и частоты контаминации, а также месяцев, наиболее опасных для возникновения пищевых инфекций и токсикозов у потребителей.

- Результаты выявления жизнеспособных некультивируемых клеток (ЖНК) микроорганизмов в продукции птицеперерабатывающей промышленно-

сти. Переход фагочувствительных (рИ-) и фагорезистентных (рИ+) клеток в не-культивируемое состояние.

- Результаты применения совместного воздействия УФ-облучения и озонирования для улучшения санитарно-гигиенических условий производства колбасных изделий из мяса птицы.

- Материалы по обработке птицепродукции промышленными бактериофагами для предотвращения контаминации гомологичными микроорганизмами.

- Результаты экспериментального использования коммерческого бакте-риоцина низина для микробной деконтаминации пищевых продуктов из мяса птицы.

Личный вклад автора диссертации. Автору принадлежит ведущая роль и непосредственное участие на всех этапах исследований: в выборе направления и темы исследования; в формулировании цели и задач; в определении объектов и методов изучения; в подготовке обзоров в отечественных и зарубежных изданиях по теме исследования; в подготовке докладов и научных публикаций; в проведении лабораторных исследований; в анализе и интерпретации полученных результатов; в работе по их внедрению в практику.

Степень достоверности результатов диссертации. Достоверность результатов определяется использованием в работе сертифицированного высокоточного оборудования, современных методов исследований микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Научные положения литературно обоснованы, выводы основаны на полученных результатах. При большом объеме лабораторных исследований степень достоверности подтверждена их статистической обработкой и сравнительным анализом с существующими сведениями.

Основные положения и результаты исследований рассмотрены на расширенном заседании кафедры «Ветеринарно-санитарная экспертиза и биологическая безопасность» Института ветеринарии, ветеринарно-санитарной экспертизы и агробезопасности ФГБОУ ВО «МГУПП».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертационная работа соответствует шифру специальности:

06.02.05 - «Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно -санитарная экспертиза» по следующим пунктам областей исследований формулы специальности: п. 2 - организация и проведение исследований по влиянию природных и антропогенных загрязнителей на состояние здоровья животных, качество и безопасность продуктов питания животного происхождения; п. 3 -разработка методов индикации и идентификации патогенных микроорганизмов в объектах ветеринарного надзора; п. 5 - изучение выживаемости патогенных микроорганизмов в почве на поверхностях животноводческих помещений, в кормах и продуктах животноводства; п. 8 - теоретическое обоснование и разработка комплекса зоогигиенических мероприятий по повышению продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, их устойчивости к инфекционным, инвазионным и незаразным заболеваниям; п. 16 - разработка средств и методов ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животноводства и кормов. Отрасль наук: биологические науки.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 7 7 печатных работ, в т. ч. 4 статьи в англоязычных изданиях, 20 статей в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ, 5 учебных пособий для подготовки студентов, из которых 2 утверждены УМО по образованию в области технологии сырья и продуктов животного происхождения, Методические указания к лабораторным занятиям магистров и бакалавров, 2 Методических рекомендаций, утвержденных Научно-техническим советом ФГБОУ ВО «МГУПП».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 295 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована таблицами в количестве - 39 и рисунками - 51. Список литературы включает 363 источника, из которых 187 отечественных и 176 зарубежных авторов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Птицеводство

- как наиболее перспективная отрасль агропромышленного комплекса

В нашей стране объем производства, торговли и потребления мяса птицы постоянно возрастает. Современное промышленное птицеводство является высокодоходной отраслью и относится к динамично развивающемуся сектору отечественного агропромышленного комплекса [60, 147]. Сельскохозяйственная птица отличается быстрыми темпами воспроизводства поголовья, интенсивным ростом и увеличением массы тела, высокой продуктивностью и жизнеспособностью. Выращивание и содержание птицы требует меньших трудозатрат и финансовых вложений по сравнению с другими отраслями животноводства [39, 167].

Впервые кур стали разводить в Индии около 3 тыс. лет назад, затем в Персии, Египте и других странах Африки и Ближнего Востока. Современное птицеводство - одна из отраслей животноводства, основной задачей которой является обеспечение населения мясом, яйцами и другой продукцией [61].

Птицеводство в Российской Федерации вносит весомый вклад в продовольственную безопасность страны как основной производитель мяса и высококачественного животного белка, доля которого в суточном рационе россиян достигает 40 % (за счет потребления яиц и мяса птицы). Доля мяса птицы в общем балансе мясного сырья составляет свыше 30 %, (например, в 2016 г - 48 %), а в некоторых регионах - около 49-74 %. Предполагается, что производство мяса птицы в нашей стране будет увеличиваться ежегодно на 15 -18 %. Высокий спрос мяса птицы объясняется, прежде всего, его диетическими свойствами, высокими потребительскими показателями, приятным вкусом и ароматом [28, 35].

С 2000 г началось восстановление птицеводства в России на системной, научной основе. Важным этапом эффективного развития явилось создание Российского птицеводческого союза, объединившего крупные промышленные птицефабрики, племенные хозяйства и научные учреждения [34].

Основными направлениями птицеводства являются производство мяса и яиц, побочными - пух, перо, мясокостная мука, органические удобрения (помет). В мясном птицеводстве наряду с выращиванием цыплят-бройлеров в настоящее время наблюдается повышенный интерес к промышленному разведению индеек, а также производству мяса водоплавающей птицы. Кроме того, в последние годы увеличивается разведение цесарок, перепелов и страусов не только в личных подворьях, но и в крупных птицефабриках.

По прогнозам аналитиков к 2025 году потребление населением мяса птицы займет первое место в мире. В России прослеживается такая же тенденция. По официальным данным Российского птицеводческого союза потребление мяса птицы и птицепродуктов в нашей стране неуклонно растет и будет расти в будущем.

В настоящее время Россия занимает четвертое место в мире по производству мяса птицы, уступая лишь США, Китаю и Бразилии. Так, в 2017 г всеми категориями хозяйств произведено 4 млн. 940 тыс. тонн мяса птицы в убойной массе, что на 319 тыс. тонн, или на 7 %, больше уровня 2016 г. В первом квартале 2018 г произведено 2 млн. 684 тыс. тонн мяса птицы. Экспорт мяса птицы увеличился в 2018 г на 35,5 %. Кроме России основными странами - потребителями мяса птицы, произведенного в нашей стране, являются Китай, Вьетнам, Гонконг, Иран, ОАЭ и др.

Продукция птицеводства популярна на всех континентах и во всех странах. Она является наиболее дешевым источником важных питательных веществ животного происхождения. Потреблению мяса птицы не препятствуют религиозные и обрядовые барьеры. Мясо здоровой птицы является диетическим, питательным продуктом для человека и наиболее доступным по цене по сравнению с мясом других видов животных [57,58, 167].

От животных птица отличается быстрым продуктивным созреванием, в течение 2-3 месяцев достигает убойной массы с выходом съедобных частей до 55-65 % живого веса. На единицу продукции в птицеводстве затрачивается меньше кормов, средств и труда, чем в животноводстве. Поэтому темпы роста

мирового производства мяса птицы значительно превышают таковые в животноводстве [123, 146].

В России производство птичьего мяса повышается с каждым годом за счет выращивания индейки. Если в 2009 г было получено около 32600 т мяса индейки в пересчете на убойную массу, то в 2013 г его произвели в 3 раза больше, а к 2019 г объемы производства индейки увеличились до 349000 т в год, т.е. за 10 лет производство увеличилось более, чем в 10 раз. Такой прирост объясняется тем, что люди стали больше внимания уделять здоровому и диетическому питанию. Мясо индейки идеально подходит не только для массового диетического, но и детского питания, имеет низкую калорийность и не вызывает аллергию.

По данным Бобылевой Г.А. и Гущина В.В. отечественная птицеводческая отрасль в 2018 г в полном объеме обеспечила потребность в социально значимых и экономически доступных для населения продуктах питания - мясе птицы и яйце. С 2016 по 2018 гг. производство мяса птицы увеличилось на 430 тыс. т. Вместе с этим в последние годы увеличились экспортные поставки мяса птицы не только в страны СНГ, но и в страны дальнего зарубежья (Вьетнам, Саудовскую Аравию, ОАЭ, Бахрейн, Мальдивы, Сербию и др.). Поэтому для дальнейшего развития экспорта необходимо надежно обеспечить биобезопасность всей продукции птицеводства [28].

Эпидемиологическая безопасность и качество мяса зависят от таких факторов как отсутствие инфекции убойного животного, условия его содержания, транспортировка мяса, технология первичной переработки, а также от дальнейших процессов термической обработки, хранения и реализации [157].

Немаловажную родь играет оборудование, используемое в птицеперерабатывающих предприятиях, эффективность и безопасность которого влияет на птицеводческую продукцию. В нашей стране существует несколько предприятий, выпускающих оборудование не только для отечественных птицеводов, но и для экспорта в страны Таможенного союза, в Китай, Иран, Индию, США, Индонезию, Египет, Алжир и др. [86].

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Абдуллаева Асият Мухтаровна, 2021 год

- - Дз

п Дмк'

где Д3 - средний диаметр зоны задержки роста индикаторной культуры (мм), Дмк - средний диаметр макроколонии штамма-продуцента (мм). С целью выделения бактериоциногенных микроорганизмов из ассоциации бактериальных культур целесообразно применять модификацию метода. Для этого на чашки с 1,5 % ПА (питательный агар) вносят смесь из 1 мл суспензии, разведенной до получения единичных колоний, и 1 мл охлажденного до температуры 46-48 °С ПА. После застывания агарового слоя при комнатной температуре чашки выдерживают 4 часа в холодильнике, делают третий слой из 10 мл ПА, затем обрабатывают парами хлороформа 5 мин для стерилизации поверхности агара. После 48 ч инкубирования посевов при оптимальной температуре роста на поверхность чашки в слое 0,7 % агара (4 мл) вносят индикаторный штамм в количестве 0,1 мл суточной культуры индикаторного штамма, смытого 5 мл бульона. Через 24 ч колонии, продуцирующие бактериоцин, будут иметь зону торможения роста индикатора.

Интенсивность диффузии в полуплотные среды лежит в основе различий в величине и морфологии зон угнетения роста чувствительных бактерий, формирующихся вокруг колоний бактериоциногенного штамма и характерных для каждого типа бактериоцинов. Зоны торможения, образующихся под влиянием разных бактериоцинов на газоне индикаторной культуры, имеют характерные особенности. Так, для одних бактериоцинов типично полное отсутствие роста чувствительной культуры вокруг колонии-продуцента, для других - равномерно разреженный, ослабленный рост мелких изолированных колоний, для некоторых характерно формирование нормально развитых отдельных колоний, резистентных к действию бактериоцина [25, 226].

Диффузионный метод считается учеными весьма эффективным скрининг-методом. Он имеет преимущества для количественной оценки действия бакте-риоцинов против индикаторных штаммов, но требует много времени в случае проверки большого количества штаммов. К тому же этот способ не всегда является действенным для проверки молочнокислых микроорганизмов, которые в

процессе роста выделяют молочную кислоту, которая также обладает бактерицидным действием.

Для определения молочнокислых бактерий-продуцентов бактериоцинов используют двуступенчатый экспресс-метод с нейтрализацией молочной кислоты в микроячеечных планшетах [352]. Для этого супернатант культуральной жидкости продуцента, после выращивания в течение 24 ч при оптимальной для продуцента температуре, нейтрализуют NaOH, фильтруют через мембранный фильтр и помещают в ячейки микролуночного планшета в количестве 100 мкл. Туда же добавляют питательный бульон с клетками тест-культуры. Инкубируют 24 ч при оптимальной температуре для роста тест-штамма. Процент подавления роста индикаторных штаммов вычисляют путем сравнения значений измерений оптической плотности до и после культивирования с учетом роста в контрольных ячейках. Положительным считают результат, при котором инги-бирование роста индикатора больше 50 %. Эти штаммы отбирают для второй ступени скрининга, на которой супернатант перед культивированием с тест -штаммом обрабатывают протеазой, разрушающей киллерный белковый компонент.

Известен другой фотометрический метод определения активности бакте-риоцинов [312]. Авторы сравнивали этот метод с диффузным на агаровых средах, используя 4 бактериоцина (энтероцин 1146, лактококкцин 140, леококцин F10 и низин). В качестве индикаторных культур использовали Pediococcus acidilactici и Listeria monocytogenes. Исследователи Li, Тао и Hong [278] в качестве тест-культуры использовали Micrococcus и показали, что микрококки очень чувствительны к низину при концентрации 50 МЕ/мл. Для определения активности бактериоцинов устанавливали титр стандартных растворов бакте-риоцинов, ингибирующих рост бактериальной суспензии в стадии логарифмического роста индикаторных культур. Затем определяли уровень активности по шкале пересчета активности ингибирования культур с учетом изменения плот-

ности бактериальной суспензии со стандартными растворами бактериоцинов [330].

Существует новый метод определения бактериоцинов, основанный на флюоресценции алкалоидов берберина при его внутриклеточной локализации. Установлено, что берберин флюоресцирует, связавшись с различными биомолекулами, включая ДНК и глюкозаминогликаны. Молекула берберина меньше биомолекулы АТФ и может проникать в клетку через поры или при разрушении цитоплазматической мембраны. Предполагается, что мембранное разрушение, вызванное бактериоцинами, является причиной внутриклеточной локализации алкалоида, поэтому данный метод применим для бактериоцинов, которые формируют поры либо нарушают целостность мембраны. Данные в этом случае могут быть получены в течение часа [301].

Выделение очищенных препаратов бактериоцинов требует применения сложных биохимических методов, которые основаны на химическом экстрагировании с использованием различных сорбентов, хроматографии и т.д., а также требуют дорогостоящего оборудования, поэтому не многим исследователям удается выделить, изучить и идентифицировать синтезируемые молочнокислыми бактериями бактериоцины. Большая часть проводимых в этом направлении работ посвящена описанию антагонистического действия различных видов молочнокислых бактерий без установления природы этого явления. При этом используется общеупотребимый в молочной промышленности термин «антибиотическая активность», под которым подразумевается не только действие специфических антибиотиков, но и других антибиотических веществ, продуцируемых молочнокислыми бактериями. Так, без раскрытия природы антибактериальной активности мезофильных молочнокислых бактерий, описано действие некоторых штаммов L. lactis и L. lactis. БиЬвр. cremoris на нежелательную микробиоту в процессе производства кисломолочных продуктов [84].

Успех обнаружения бактериоцинов существенно зависит от чувствительности индикаторного штамма. Поэтому необходимо использовать эталонные

культуры международных коллекций, применяемые для выделения уже известных бактериоцинов.

Для получения бактериоцинов применяют следующие питательные среды: МПБ, среду с казаминовыми кислотами, триптический соевый бульон, сердечно-мозговой бульон, среду МРС и другие среды, в том числе специально подобранного состава с различными добавками для стимулирования роста. Однако синтетические и полусинтетические среды позволяют получить незначительное количество бактериоцинов, поэтому поиск эффективных безбелковых или низкобелковых сред продолжается [25, 343].

В связи с расширением использования бактериоцинов в качестве пищевых консервантов [153, 220] целесообразно рассмотреть некоторые публикации о влиянии NaCl и NaNO2 на процесс биосинтеза бактериоцинов. Хлорид и нитрит натрия являются незаменимыми компонентами мясных изделий, обеспечивающие их стабильную окраску, вкус и аромат [220]. Нитрит натрия не влиял на синтез бактериоцина, но замедлял рост изученных бактерий и усиливал ин-гибирующее действие молочной кислоты [274, 275, 276].

По мнению Brook I. введение живых продуцентов с продуктами питания, в виде аэрозолей или мазей в качестве пробиотиков, изменяющих в желательном направлении микробный биоценоз, эффективно для терапии и профилактики инфекционных заболеваний пищеварительного тракта, дыхательных путей, среднего уха и кожи [211].

В настоящее время наиболее актуальным для стран с развитой пищевой промышленностьюявляется поиск безопасных для потребителей, безвредных и эффективных биологических антибактериальных препаратов (или их комбинации) на основе бактериоцинпродуцирующих микроорганизмов и бактериоци-нов.Однако в России потенциал применения бактериоцинов как антиконтами-нантов пищевых продуктов мало изучен [184]. Ежегодно фиксируется большое количество заболеваний, связанных с пищевыми отравлениями. Бактерии, вызывающие порчу пищевых продуктов, наиболее часто относятся к видам и ро-

дам Salmonella enterica Enteritidis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Escherichia coli O157:H7, Campylobacter jejuni [212]. Помимо традиционных химических консервантов с целью увеличения срока хранения продуктов питания начали применять бактериоцины, а также бактерии их продуцирующие. Многие изученные бактериоцины, синтезируемые молочнокислыми бактериями, относятся к классу I или II. Тот факт, что они термоустойчивы, делает их интересными для использования в качестве консервантов пищевых продуктов [236]. Применение молочнокислых бактерий в качестве стартовых культур позволяет не только снизить риск микробиологической порчи, продлить сроки хранения продуктов, но и повлиять на ход технологического процесса, сокращая сроки созревания и улучшая органолептические свойства готового продукта [154, 188, 220, 223, 311].

Страны с развитой пищевой промышленностью нуждаются в безвредных и эффективных препаратах, защищающих от контаминации, продлевающих сроки хранения продуктов питания. Кроме традиционно используемых химических консервантов для этого стали применять бактериоцины и бактерии -продуценты [69, 188, 220, 291, 321].

Заключение

Основным приоритетом нашего государства является сохранение и улучшение здоровья населения за счет обеспечения безопасности и доброкачественности пищевых продуктов. Известно, что питание является эффективным средством, пролонгирующим продолжительность жизни, а полноценное питание позволяет не только сохранить здоровье, но и, в определённой мере, заменить лекарственные препараты. Качественное питание человека невозможно без использования источника животного белка - мяса.

В настоящее время одним из основных производителей высококачественного животного белка является птицеперерабатывающая отрасль. Это связано с

тем, что в отличие от других животных птица имеет более быстрое продуктивное созревание. В течение 2-3 месяцев она достигает убойной массы, выход съедобных частей достигает 55-65 % живого веса, а на ее производство затрачивается меньше кормов, средств и труда. Поэтому в нашей стране промышленное птицеводство относится к динамично развивающемуся сектору отечественного агропромышленного комплекса и является высокодоходной отраслью. Продукция птицеводства является источником важных питательных веществ животного происхождения, относится к диетическим, полезным для здоровья и наиболее доступным по цене продуктам. С этим связана, прежде всего, доля мяса птицы и птицепродуктов в суточном рационе россиян, которая в некоторых регионах достигает от 40 до 74 %.

В связи с этим ключевыми понятиями в птицеводстве являются эффективность и биобезопасность. Получить высокие показатели продуктивности и качества продукции можно только от здоровой птицы, поэтому в современном промышленном птицеводстве особую роль играют инновации в области ветеринарной науки. В круг вопросов, входящих в компетенцию ветеринарной службы, входит контроль гигиены производства, ветеринарно-санитарная экспертиза и оценка продуктов убоя птицы, выбраковка мяса при различных болезнях и состояниях, транспортировка и хранение мяса птицы, определение режимов утилизации и уничтожения мяса птицы, не пригодного для использования в пищевых и кормовых целях.

Оценка эпизоотической ситуации в стране показала, что среди сельскохозяйственной птицы наиболее распространенными являются бактериальные болезни, которые возникают при ослаблении естественной резистентности организма, в результате дефицита жизненно важных питательных веществ, при попадании в организм токсических веществ, в результате травм, физического стресса и множества других факторов. К наиболее распространенным бактериальным заболеваниям птицы относятся стрептококкоз, туберкулез, кампило-

бактериоз, сальмонеллез, респираторный микоплазмоз, пастереллез и колибак-териоз.

В тушки птицы и птицепродукты патогенные микроорганизмы попадают при убое больной птицы и переработке продуктов убоя. Развивающиеся в тушках и птицепродуктах патогены, вызывают опасные пищевые токсикозы (интоксикации) и токсикоинфекции.

В связи с этим возрастающую актуальность для птицеперерабатываюшей промышленности приобретают вопросы повышения микробиологической эффективности контроля птицепродуктов. Прежде всего это связано с тем, что в России и в других странах мира, в том числе развитых регистрируются заболевания пищевого происхождения, представляющие большую проблему для здравоохранения. Пищевые отравления наносят большой ущерб птицеперерабатывающей промышленности в связи с выбраковкой и утилизацией продукции в больших объемах.

Наиболее распространенными возбудителями токсикоинфекций, связанных с продуктами птицепереработки, являются сальмонеллы, БГКП, кампило-бактерии, протей, листерии, стафилококки, которые вызывают вспышки заболеваний, охватывающие большое количество людей, употребивших контами-нированные продукты питания. Наиболее опасными и представляющими серьезную угрозу для здоровья человека, являются возбудители кишечных инфекций, источниками которых являются больные сельскохозяйственные, домашние и дикие животные, птица, а также лица - сальмонеллоносители. Патогенное действие сальмонелл зависит от вида и биологических особенностей возбудителя. Сальмонеллы обладают высокой устойчивостью, легко переносят низкие температуры, в замороженных птицепродуктах сохраняют жизнеспособность в течение нескольких месяцев (до 13 мес.), выдерживая 5-6 кратное оттаивание и замораживание.

Кроме того, в птицепродуктах от больной колибактериозом птицы выявляют энтеропатогенные штаммы E. coli и серовар E. coli О157:Н7, продуци-

рующий вероцитотоксин - возбудитель геморрагического колита. Е. coli сохраняются в мясных продуктах при низких температурах. При наличии в мясе бактерий снижается доброкачественность мяса птицы. В замороженном мясе птицы бактерии рода Proteus сохраняются в течение 6 месяцев, перенося неоднократное замораживание и оттаивание. Протей считается показателем низкого уровня гигиены производственных участков.

Campylobacter jejuni, находящийся вжелудочно-кишечном тракте птицы, также является возбудителями пищевых токсикоинфекций. Для предотвращения кампилобактериоза необходимо минимизировать фекальное загрязнение птицы в процессе переработки и раздельный убой зараженного и незараженно-го поголовья.

Listeria monocytogenes, которые обнаруживаются на различных этапах производства представляют наибольшую угрозу при попадании во время упаковки готовых к реализации птицепродуктов. На птицепродуктыпатогены попадают воздушно-капельным путем и при непосредственном контакте инфицированных рук рабочих. Например, стафилококки, попавшие таким способом на поверхность продуктов, остаются жизнеспособными при хранении в охлажденном состоянии более 4 месяцев, а в замороженных птицепродуктах они сохраняют жизнеспособность в течение более длительного срока.

Микроорганизмы, развивающиеся внутри или на поверхности мясного сырья, в т. ч. патогенные микробные клетки, под влиянием стрессовых факторов, к которым относятся низкая/высокая температура, УФ-облучение, изменение рН, лиофилизация, действие химических веществ и консервантов переходят в жизнеспособное некультивируемое состояние. На сегодняшний день известно более 60 видов бактерий, способных переходить в некультивируемое состояние. По мнению ряда ученых у ЖНК в отличие от отмирающих клеток поражена мембрана, нарушена целостность генетического материала, клетки измельчены, изменяют морфологию. В таком состоянии патогены сохраняют не только вирулентность и способность синтезировать токсины, но и способны

возвращаться к активному состоянию и вызывать заболевания, создавая угрозу здоровью животных и человека. Образование ЖНК возможно при любом стрессовом воздействии на микроорганизмы.

В связи с этим нами проведен поиск ЖНК в мясе птицы и птицепродук-ции и проведено изучение особенностей микробных популяций, длительно существовавших в некультивируемом состоянии.

За рубежом в настоящее время уделяется большое внимание бактериофа-говому биопроцессингу (применение бактериофагов или фагосодержащих пищевых добавок). Биопрепараты на основе бактериофагов имеют определенную перспективу для снижения контаминации сырья и продукции опасными для потребителей микроорганизмами.

В настоящее время фаговые препараты являются одними из самых экологичных средств микробной деконтаминации, они не имеют ограничений в употреблении. К преимуществам очищенных бактериофагов можно отнести следующие свойства: ограниченное во времени существование (пока не исчезнет гомологичная популяция микроорганизмов), специфическое воздействие на микробную клетку, включая лекарственно -устойчивые бактерии, как правило, отсутствие дисбиотических, токсических и аллергических реакций на частицы фага; определенная устойчивость к факторам окружающей среды.

Поэтому коммерческие стандартные фаги выбраны нами для исследования как средства деконтаминации птицепродуктов. Помимо бактериофагов к безвредным, физиологичным антибактериальным средствам относятся бактериоцины. Хотя бактериоцин низин давно используется в пищевой промышленности (чаще как консервант), его применение в птицеперерабатывающей промышленности не получило распространения. По нашему мнению, этот вопрос требует всестороннего изучения.

Известно, что проблема безопасности продуктов питания для населения важна во всём мире. Она обсуждается на всех континентах и во многих стра-

нах. На Всемирном саммите по продовольственной безопасности главы государств и правительств приняли Декларацию о принятии необходимых мер продовольственной безопасности. В области птицепереработки существуют международные и национальные стандарты РФ, которые приведены в соответствие с ИСО в целях повышения их совместимости и формулируют определенные требования к системе менеджмента качества и безопасности пищевой продукции. В цепи производства мяса птицы и птицепродуктов участвуют различные организации, занимающиеся производством кормов, гигиеной оборудования, производством чистящих средств, выращиванием и переработкой птицы.

С учетом большого спроса населения мясо птицы и птицепродукты должны контролироваться на всех этапах их производства, хранения и реализации. Доброкачественность и безопасность мяса птицы зависят, прежде всего, от здоровья птицы. Поэтому особое внимание контролирующим органам надо обращать на происхождение и состояние мяса и мясных продуктов, на сроки их реализации. По истечении установленных сроков хранения или при выявлении хотя бы отдельных признаков изменения органолептических, физико -химических или микробиологических показателей птицепродукты необходимо снимать с реализации и направлять на промышленную переработку с термическим воздействием, обеспечивающим безопасность для человека или животных получаемой из них продукции.

Биобезопасность продуктов питания - это сложная комплексная государственная проблема, требующая для своего решения усилий как со стороны микробиологов, токсикологов, так и со стороны производителей, государственной ветеринарной и санитарно-эпидемиологической службы.

Поэтому с целью снижения контаминации продукции патогенными микроорганизмами на производстве пищевой продукции используют систему ХАССП, которая является предупреждающей системой контроля. Она обеспечивает контроль на каждом технологическом этапе производства, а также при хранении и реализации готовой продукции. Использование системы ХАССП

позволяет выпускать продукцию, соответствующую требованиям безопасности в нашей стране и за рубежом. С целью повышения эффективности ХАССП в российских условиях нами были выполнены исследования по использованию различных (физических, биологических) средств для деконтаминации птице-продукции на некоторых этапах ее выпуска и хранения.

Таким образом, анализ литературы по выбранной нами теме свидетельствует о ее актуальности, приоритетности поставленных задач и практической направленности.

2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы и методы 2.1.1 Объекты исследования

Работа выполнена в период с 2014 по 2020 гг. на кафедре «Ветеринарно-санитарная экспертиза и биологическая безопасность» ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, в ФГБУ «ЦНМВЛ» и в лаборатории микробиологических питательных сред ФГБНУ «Научно -исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова».

Для проведения исследований была разработана специальная схема (рис. 1), согласно которой исследования выполнялись поэтапно.

Сначала проводили органолептические, физико -химические и микробиологические исследования. Материалом для микробиологических исследований служили тушки птицы и птицепродукты (полуфабрикаты, колбасные изделия и др.) в различной упаковке, разных производителей. Пробы отбирали в розничных торговых сетях г. Москвы и птицеперерабатывающих предприятиях Московской области в режиме реального времени. Исследования проводились в рамках научно-исследовательской работы целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно -технологического комплекса России на 2014-2020 годы» по проекту № 14.574.21.0191 по теме «Разработка технологии получения новых полимерных композиционных материалов для создания smart-упаковок, обеспечивающих пролонгацию сроков хранения и безопасность пищевой продукции и экологии» за 2019 г.

Всего для исследования было отобрано 857 образцов мяса и птицепро-дуктов в разные сезоны года в течение 6 лет. Для ретроспективного изучения уровня контаминации микроорганизмами по 4899 образцам птицепродуктов использовали данные автоматизированной системы учета лабораторных

•Выбор методов и объектов исследования. Отбор проб

•Органолептическая оценка мяса птицы и полуфабрикатов

•Определение физико-химических показателей мяса птицы и птицепродуктов

•Микробиологический анализ мяса птицы и полуфабрикатов

•Микробиологический мониторинг контаминации мяса птицы и птицепродуктов

•Определение жизнеспособных культивируемых и некультивируемых клеток в продуктах из мяса птицы

Изучение влияния УФ-облучения и озонирования на микробиологические показатели колбасных изделий из мяса птицы

Определение чувствительности бактерий-контаминантов птицепродуктов к коммерческим бактериофагам

Изучение антимикробного действия бактериоцина низина на микроорганизмы-контаминанты колбасных изделий из мяса птицы

Обработка и анализ полученных результатов исследования

Рисунок 1 - Схема проведения исследований

исследований «Веста» с 2015 по 2019 гг. Экспериментальные исследования проведены в разные месяцы и сезоны года. Условия опытов отвечали решению поставленных задач.

Ветеринарно-санитарную экспертизу тушек птицы и птицепродуктов осуществляли общепринятыми методами соглано действующим на территории РФ и стран Таможенного союза ЕАЭС, правилам и другим нормативно -техническим документам. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили в соответствии с определителем бактерий «Bergey's Manual of Systematic Bacteriology» (2010).

В работе использовали штаммы-контаминанты мяса птицы, бактериофаги отечественного производства, коммерческий бактериоцин, разрешенный к использованию в пищевой промышленности в качестве консерванта Е234 низин, различные питательные среды, необходимые реактивы, приборы, инструменты и тест-системы.

Штаммы бактерий, использованные в работе. В экспериментах использовали штаммы-контаминанты мяса птицы и птицепродуктов: E. coli, Salmonella enterica Typhimurium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 209Р и некультивируемые клетки грамотрицательных неспоро-образующих штаммов бактерий: фагочувствительный Pseudomonas aeruginosa PAO1 (ph-), лизогенезированный фагом G101, субштамм P. aeruginosa PAO1 (G101) (ph+), фагочувствительный штамм Salmonella enterica Typhimurium (ph'), тот же штамм, лизогенезированный фагом Salmonella enterica Typhimurium (ph+), Escherichia coli AB1157 нелизогенный и лизогенизированный фагом из коллекции лаборатории микробиологических питательных сред ФГБНУ НИ-ИВС им. И.И. Мечникова.

В качестве ингибиторов условно-патогенных микроорганизмов использовали коммерческие бактериофаги отечественного производства: Колипротей-ный (сер. Н31), Интести (сер. Н68), Стафилококковый (сер. Н54, Пиобактерио-фаг (сер. Н27).

Аппаратура, материалы, реактивы. Для проведения исследования использовали следующие приборы, аппаратуру и материалы: холодильник бытовой электрический, автоклавы, морозильная камера, термостаты (t 30 °C; 37 °C; 41 °C), водяная баня, вортекс Biosan (Латвия), высокоточные лабораторные весы «A&D» серия HL-100 (Япония), центрифуга «Eppendorf» (Германия), световые микроскопы «Микмед» фирмы «ЛОМО» (Россия) (увеличение х400), люминесцентный микроскоп «Opton» (Германия) (увеличение х320), фотоколориметр КФК-3-01 «ЗОМЗ» (Россия), УФ-облучатели 0БН-150, ОЗУФ, компьютеры, камера Горяева, тест-системы по ВСЭ, стеклянные бюксы с крышками, пробирки, резиновые пробки, пипетаторы, перчатки одноразовые, стерильные инструменты (пинцет, скальпель, ножницы), бактериологические петли, шпатели пластмассовые одноразовые, стерильная посуда, дистиллированная вода, химические стаканы, спирт этиловый 70 %, горелка спиртовая и газовая, кони-

3 3

ческие колбы емкостью 100 и 200 см , мерные стаканы емкостью 100 и 250 см , ватные тампоны, стеклянная воронка, фильтровальная бумага, чашки Петри, пробирки и пипетки пластиковые стерильные разного объема фирмы «Costar» (США), автоматические пипетки «Eppendorf» (Германия), петли бактериологические из никеля, хрома и пластиковые диаметром 3 мм, предметные и покровные стекла и др.

Питательные среды отечественного (Оболенск, Россия) и зарубежного производства HiMedia, Индия и др.: МПА, МПБ, Сабуро, Мюллер -Кауфман, Палкам, RVC, XLD-агар, Рамбах, Фразер 1, Фразер 2, Кесслера, Эндо, Китта -Тароцци, магниевая, висмут-сульфит агар, Плоскирева, трехсахарный агар Олькеницкого, среды Гисса, Клиглера, Ресселя-ГРМ, TSI-arap, плазма кроличья сухая цитратная (Микроген, Россия), 0,9 % физиологический раствор, забуфе-ренная пептонная вода, тест-пластины 3M™ Petrifilm® (США), тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов, набор красок для окраски по Граму, стрипы (50, 25), реагенты для приготовления буферов, сред оте-

чественного производства, иммерсионное масло, ДНК-тропный краситель Live/Dead double staining kit Baclight™ (США) и др.

2.1.2 Методы отбора проб мяса птицы и полуфабрикатов

Отбор проб для бактериологических, физико -химических, гистологических и органолептических исследований проводили согласно ГОСТ 31467-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям», ГОСТ Р 50396.0-2013 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям» с соблюдением асептических условий с использованием стерильных инструментов, посуды, материалов и пр., предотвращающих микробную контаминацию с объектов внешней среды. Тушки птицы приобретали на предприятиях торговой сети и на птицефабриках в охлажденном или замороженном виде.

Взятие образцов мяса птицы механической обвалки (МПМО) и фарша из мяса птицы проводили из разных мест, не менее трех точечных проб по 10-50 г массой общей пробы не менее 300 г. Точечные пробы охлажденного МПМО отбирали на разной глубине от двух и более блоков тары массой не менее 1000 г. Пробы замороженного МПМО в блоках отбирали вырезанием куска на всю толщину блока, т.к. поверхностные слои МПМО подвержены быстрой порче, по сравнению с внутренними.

Перед исследованием упакованных в потребительскую тару образцов, сначала протирали этиловым спиртом упаковку, затем вскрывали и извлекали материал из упаковки с помощью стерильных инструментов, помещали в стерильный лоток для последующего исследования.

Для микробиологических исследований готовили пробы следующими методами:

- методом смыва (ополаскивания) с образца без обжига поверхности,

- отбор проб в опытах с использованием упаковки с содержанием низина различной концентрации;

- методом свабирования отбирали пробы в опытах с УФ-лампами;

- методом вырезания (иссечения) кусочков тканей определяли соответствие гигиеническим требованиям безопасности тушек птицы и птицепродуктов по микробиологическим показателям.

Смывы с поверхности мясного сырья и колбасных изделий из мяса птицы брали без обжига поверхности перед упаковкой и при хранении в охлажденном виде упакованных образцов в опытах с низином. В качестве смывной жидкости использовали стерильный 0,9 % физиологический раствор в различном соот-

-5

ношении (1:1, 1:0,5 или 1:10). В 1 см смывной жидкости определяли КМА-

Л

ФАнМ, КОЕ/г или ОМЧ (общее микробное число), БГКП, в 25 см - наличие патогенных микроорганизмов (сальмонелл и листерий).

Методом свабирования проводили отбор проб с поверхности образцов в опытах с УФ-лампами и бактериоцином. Для этого брали стерильные ватные тампоны и проволочные рамки-трафареты различной площади. ОМЧ определя-

3 3

ли в 1 см3 смывной жидкости, присутствие сальмонелл и листерий - в 25 см3.

Л

Расчет ОМЧ проводили на 1 см поверхности образца.

При отборе проб методом вырезания кусочков тканей из глубины поверхность исследуемых образцов обжигали подожженным ватно-марлевым тампоном, смоченным этиловым спиртом. Удалив поверхностный обожженный слой, на всей глубине образца из разных мест (не менее трех точечных проб массой 10-50 г) вырезали кусочки мышечной ткани, определяли микробиологические показатели безопасности согласно действующим нормативным документам.

2.1.3 Методы органолептической оценки мяса птицы и полуфабрикатов

Органолептическую оценку проводили в соответствии с ГОСТ Р 51944 -2002 «Мясо птицы. Методы определения органолептических показателей, тем-

пературы и массы». Замороженные образцы птицепродуктов сначала размораживали при комнатной температуре до достижения температуры от 0-4 °С в толще мышц. Качественные показатели определяли согласно Приложению А ГОСТ Р 51944-2002 (таблица 2.1.1, 2.1.2). Затем определяли общую оценку исследуемых проб.

Внешний вид и цвет мяса, подкожной и внутренней жировой ткани определяли внешним осмотром. Вид и цвет мышц на разрезе определяли в глубинных слоях грудных и бедренных мышц. Особое внимание обращали на наличие липкости под крыльями, в пахах и складках кожи. Влажность и сочность поверхности мяса определяли прикладыванием к ткани полоски фильтровальной бумаги.

На свежем разрезе испытуемого образца легким надавливанием пальца определяли консистенцию, отмечая время выравнивания ямки. Консистенцию фарша и МПМО определяли сжиманием и растиранием кусочка пробы пальцами. Отмечали рыхлость, крошкообразование, жесткость, упругость и наличие твердых частиц.

Аромат и запах тушек птицы и птицепродуктов устанавливали сначала в поверхностном слое пробы, затем скальпелем делали разрез и сразу определяли запах в глубинных слоях, обращая особое внимание на запах мышечной ткани, прилегающей к кости. Признаки доброкачественности мяса птицы подразделяли на 3 группы:

- свежее мясо;

- мясо с признаками порчи I степени;

- мясо с признаками порчи II степени (таблица 2.1.1).

Для определения аромата и прозрачности бульона пробу каждого образца отдельно пропускали через мясорубку с диаметром отверстий решетки 2 мм, полученный фарш тщательно перемешивали. На лабораторных весах взвешивали 20 г полученного фарша с погрешностью ± 0,2 г, помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, заливали 60 мл дистиллированной воды, тщатель-

но перемешивали, закрывали часовым стеклом и ставили в кипящую водяную баню на 10 мин.

Таблица 2.1.1 - Характерные признаки птицепродуктов по органолептиче-

ским показателям

Наименова- Характерный признак

ние показателя свежее мясо мясо с признаками порчи I степени мясо с признаками порчи II степени

Внешний вид и цвет: - поверхности тушки Беловато-желтого цвета с розовым оттенком, у нежирных тушек желтовато- серого цвета с красноватым оттенком; у тощих - серого цвета с синюшным оттенком Липкая под крыльями, в пахах и в складках кожи; беловато-желтого цвета с серым оттенком Покрыта слизью, особенно под крыльями, в пахах и в складках кожи; беловато-желтого цвета с серым оттенком, местами с темными или зеленоватыми пятнами

- подкожной и внутренней жировой ткани Бледно-желтого или желтого цвета Бледно-желтого или желтого цвета Бледно-желтого цвета, а внутренняя желтовато-белого цвета с серым оттенком

- серозной оболочки грудобрюшной полости Влажная, блестящая, без слизи и плесени Без блеска, липкая, возможно наличие небольшого количества слизи и плесени Покрыта слизью, возможно наличие плесени

Мышцы на Слегка влажные, не Влажные, остав- Влажные, остав-

разрезе оставляют влажного ляют влажное ляют влажное пят-

пятна на фильтровальной бумаге; бледно-розового цвета - у кур и индеек, красного - у уток и гусей пятно на фильтровальной бумаге, слегка липкие, более темного цвета, чем у свежих тушек но на фильтровальной бумаге, липкие, более темного цвета, чем у свежих тушек

Консистенция Мышцы плотные, упругие, при надавливании пальцем образующаяся ямка быстро выравнивается Мышцы менее плотные и менее упругие, при надавливании пальцем образующаяся ямка выравнивается медленно (в течение одной мины) Мышцы дряблые, при надавливании пальцем образующаяся ямка не выравнивается

Запах Специфический, свойственный свежему мясу птицы Затхлый в грудобрюшной полости Гнилостный с поверхности тушки и внутри мышц, наиболее выражен в грудобрюшной полости

Прозрачность и аромат бульона Прозрачный, ароматный Прозрачный или мутноватый с легким неприятным запахом Мутный с большим количеством хлопьев и резким неприятным запахом

Запах мясного бульона определяли в процессе нагревания до 80-85 °С в момент появления паров, выходящих из приоткрытой колбы. Для определения прозрачности 20 мл бульона наливали в мерный цилиндр вместимостью 25 мл,

имеющий диаметр 20 мм, и визуально устанавливали степень его наваристости, прозрачности. Органолептическую оценку проводили по 9-балльной шкале, разработанной ВНИИПП (1993) (таблица 2.1.2).

Таблица 2.1.2 - Дегустационный лист оценки птицепродуктов

Шифр пробы Оценка в Баллах Органолептические показатели

Внешний вид Запах (аромат) Вкус Консистенция (нежность, жесткость) Сочность Общая оценка качества

9 Очень приятный Очень приятный, сильный Очень вкусное Очень нежная Очень сочное Отличное

8 Очень хороший Приятный и сильный Вкусное Нежная Сочное Очень хорошее

7 Хороший Приятный, не сильный Достаточно вкусное Достаточно нежная Достаточно сочное Хорошее

6 Недостаточно хороший Недостаточно ароматный Недостаточно вкусное Недостаточно нежная Недостаточно сочное Выше среднего

5 Средний (удовлетвори- Средний (удовлетвори- Средний (удовлетвори- Средний (удовлетвори- Средний (удовлетвори- Среднее (удовлетвори-

тель- тель- тель- тельная) тельная) тельное)

ный) ный) ный)

4 Немного непри-влека- Без аромата (прием- Безвкусное (прием- Жесткая (приемлемая) Суховатая (прием- Ниже среднего

тельный лемый) лемый) лемая)

Немного

3 Неприятный (приемлемый) неприятный, посторонний (приемлемый) Немного неприятный (приемлемый) Немного жесткая (приемлемая) Немного сухая (приемлемая) Плохое (приемлемое)

Непри- Плохой, Плохой,

ятный, посто- непри- Жесткая Сухая Плохое

2 плохой ронний ятный (непри- (непри- (непри-

(непри- (непри- (непри- емле- емле- емле-

емле- емле- емле- мая) мая) мое)

мый мый) мый)

1 Очень неприятный, плохой (совсем непри-емле-мый) Очень неприятный, посторонний (сосем непри-емле-мый) Очень неприятный (совсем непри-емле-мый) Очень жесткая (совсем непри-емле-мая) Очень сухая (совсем непри-емле-мая) Очень плохое (совсем непри-емле-мое)

Органолептическую оценку мяса и полуфабрикатов можно определять по 5-ти балльной шкале. Но, в условиях гиподинамии у птицы повышается упитанность и часто развиваются признаки изменения обменных процессов, что отражается на сенсорных показателях мяса. Поэтому наиболее достоверную ор-ганолептическую оценку мяса, по нашему мнению, можно получить при использовании 9-балльной шкалы, разработанной ВНИИПП (1993).

2.1.4 Методы физико-химических исследований мяса птицы

и птицепродуктов

Физико-химическое исследование мяса птицы и птицепродуктов проводили методами, рекомендованными ГОСТ 31470-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы органолептических и физико -химических исследований» и «Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» (1988). В образцах определяли pH, количество летучих жирных кислот, кислотное и перекисное число жира, с помощью реактива Несслера, продукты первичного распада белков в реакции с сернокислой медью и с бензидином.

2.1.5 Методы бактериологического исследования мяса птицы

и полуфабрикатов

Микроскопическое исследование. Бактериоскопию мяса птицы и полуфабрикатов проводили согласно ГОСТ 31931 -2012 «Мясо птицы. Методы гистологического и микроскопического анализа».

При микроскопическом анализе мяса птицы и птицепродуктов готовили мазки-отпечатки, для приготовления которых поверхность исследуемого продукта обжигали тампоном, смоченным в этиловом спирте. Затем стерильными

ножницами вырезали кусочки размером 2,0*1,5x2,5 см из поверхностных и глубинных слоев исследуемой пробы. Вырезанные кусочки массой 2-3 г поверхностями свежесрезанных срезов прикладывали к предметному стеклу (по три отпечатка на двух предметных стеклах), высушивали на воздухе, фиксировали над пламенем горелки, окрашивали методом Грама и микроскопировали не менее чем в 20-25 разных полях зрения, визуально оценивая присутствие микробиоты и состояние мышечной ткани. Среднее количество микроорганизмов определяли путем сложения всех клеток и деления их на число полей. Оценку проводили согласно таблице 2.1.3.

Таблица 2.1.3 - Оценка свежести мяса птицы микроскопическим методом

Степень свежести мяса Показатели микроскопического исследования

Свежее мясо Микроорганизмы не обнаружены или в поле зрения мазка -отпечатка из поверхностного слоя видны единичные кокки, дрожжи или палочки (не более 10 клеток), а в глубинных слоях мяса - микробы отсутствуют. Следов распада мышечной ткани в мазках-отпечатках не наблюдается, окраска мазка незаметна.

Мясо с признаками порчи I степени Не более 30 кокков, дрожжей или палочек. Заметны следы распада мышечной ткани (ядра мышечных волокон в состоянии распада, исчерченность волокон выражена слабо).

Мясо с признаками порчи II степени Количество микробных клеток более 30, с преобладанием палочковидных форм, наблюдается значительный распад мышечной ткани (почти полное исчезновение ядер и исчерчен-ности мышечных волокон).

При сомнении в оценке свежести мяса проводили гистологический анализ. Для этого из отобранных проб вырезали вторичные точечные пробы мыЛ

шечной ткани площадью не менее 1 см на всю глубину образца из мест, наиболее быстро подвергающихся порче и любых других сомнительных по свежести участков тушек. Готовили гистологические препараты, окрашивали смесью спиртовых растворов метиленового синего и эозина массовой долей 1 % и водного раствора метиленового синего с бурой. После окрашивания препараты обезвоживали, покрывали покровным стеклом и просматривали сначала при малом увеличении, затем под иммерсионным объективом.

При микроскопическом исследовании отмечали состояние ядер клеток и наличие микробных клеток: ядра клеток - темно-синие, протоплазма клеток -бледно-синяя с розоватым оттенком, бактерии - фиолетовые. Бактерии по размерам значительно уступают клеточным ядрам, они имеют шаровидную или палочковидную форму, или располагаются скоплениями.

Результаты гистологического анализа проб сопоставляли с микроструктурными характеристиками, приведенными в таблице 2.1.4.

Бактериологические методы исследования мяса птицы и птицепродуктов, проводили с помощью посевов на различные питательные среды с последующей идентификацией выделенных микробных клеток. При этом, согласно таблице 2.1.5 определяли:

- количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), КОЕ/г;

- бактерии группы кишечных палочек (БГКП) (колиформные бактерии);

- патогенные бактерий, в т.ч. сальмонеллы;

- L. monocytogenes;

- S. aureus;

- сульфитредуцирующие клостридии.

- бактерии рода Proteus;

Таблица 2.1.4 - Микроструктурная характеристика мяса птицы различной

степени свежести

Наименование показателя Микроструктурная характеристика мяса птицы

свежее с признаками порчи I степени с признаками порчи II степени

Состояние структуры ядер Структура ядер мышечных волокон четко выражена Структура ядер мышечных волокон плохо различима - кариопик-ноз (сжатие ядер) Кариорексис - распад ядер или ка-риолизис - растворение их в большинстве мышечных волокон

Состояние поперечной и продольной исчер-ченности в мышечных волокнах Поперечная и продольная ис-черченность четко выражена Поперечная и продольная исчерчен-ность слабо выражена Полное исчезновение поперечной и продольной исчер-чености мышечных волокон

Способность мышечных волокон к окраске Окраска мышечных волокон яркая, равномерная Окраска мышечных волокон понижена и неравномерна Окраска мышечных волокон слабо выражена

Локализация и размножение микроорганизмов в мышечной ткани Допускаются единичные очаги кокковых и палочковидных микроорганизмов в местах разреза и прослойках рыхлой соединительной ткани Многочисленные очаги кокковых и палочковидных микроорганизмов проникают в эн-домизий и пери-мизий мышечных волокон Усиленное размножение палочковидных микроорганизмов и проникание ее вглубь мышечных волокон

Кроме того для проведения ретроспективного анализа уровня и частоты сверхнормативной контаминации мяса птицы и птицепродуктов микроорганизмами использовали данные автоматизированной системы учета лабораторных исследований «Веста» за 5-летний период (2015 по 2019 гг.). В образцах определяли сверхнормативные показатели МАФАнМ, листерии, сальмонеллы и суммарно прочие микробы. Частоту контаминации продукции (в %) рассчитывали как отношение выявленного количества зараженных проб к общему числу (12 мес. каждого года) исследованных образцов.

Таблица 2.1.5 - Микробиологические показатели мяса птицы и

птицепродуктов

Наименование продукции Микробиологические показатели Допустимые уровни

Тушки и части тушек птицы и изделия из них запеченные, варено-копченые, копченые, сырокопченые, сыровяле-ные; в том числе рубленые КМАФАнМ, КОЕ/г, не более 1х103

БГКП (колиформы), не допускаются в массе продукта, г 1,0

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, не допускаются, г 25

L. monocytogenes, не допускаются, г 25

Колбасные изделия вареные, выработанные из сырья второго, третьего сорта, в том числе нарезанные КМАФАнМ, КОЕ/г, не более 2,5х103

БГКП (колиформы), не допускаются в массе продукта, г 1,0

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, не допускаются, г 25

L. monocytogenes, не допускаются, г 25

Паштеты из птичьей печени; Ливерные колбасы из мяса птицы и субпродуктов; Фарш куриный тепловой сушки; Яйцо куриное столовое и др. видов птицы КМАФАнМ, КОЕ/г, не более 5х103

БГКП (колиформы), не допускаются в массе продукта, г 0,1

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, не допускаются, г 25

L. monocytogenes, не допускаются, г 25

Тушки и мясо птицы охлажденное; Сушеные продукты из мяса птицы, в том числе фарш цыплят сублимационной сушки КМАФАнМ, КОЕ/г, не более 1х104

БГКП (колиформы), не допускаются в массе продукта, г 0,1

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, не допускаются, г 25

L. monocytogenes, не допускаются, г 25

Тушки и мясо птицы за-мороженое; Полуфабрикаты из мяса птицы натуральные: мясокостные, бескостные без панировки КМАФАнМ, КОЕ/г, не более 1х105

БГКП (колиформы), не допускаются в массе продукта, г 0,01

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, не допускаются, г 25

L. monocytogenes, не допускаются, г 25

Тушки и мясо птицы фасованное охлажденное, подмороженое, заморо-женое; КМАФАнМ, КОЕ/г, не более 5х105

БГКП (колиформы), не допускаются в массе продукта, г 0,01

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, 25

не допускаются, г

L. monocytogenes, не допускаются, г 25

Полуфабрикаты из мяса птицы рубленые (охлажденные, подмороженные, замороженные); Кожа птицы; Субпродукты птицы и полуфабрикаты из них КМАФАнМ, КОЕ/г, не более 1х106

БГКП (колиформы), не допускаются в массе продукта, г 0,001

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, не допускаются, г 25

L. monocytogenes, не допускаются, г 25

Мясо замороженое механической обвалки; Полуфабрикаты мясные, мясо-содержащие и из мяса птицы мясокостные, рубленые, формованные в т.ч. панированные, в тестовой оболочке, фаршированные; Фарши КМАФАнМ, КОЕ/г, не более 1х106

БГКП (колиформы), не допускаются в массе продукта, г 0,0001

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, не допускаются, г 25

L. monocytogenes, не допускаются, г 25

Колбасные изделия мясные (мясосодержащие) вареные, варено-копченые КМАФАнМ, КОЕ/г, не более 1х103

БГКП (колиформы), не допускаются в массе продукта, г 1

Патогенные, в т.ч. сальмонеллы, не допускаются, г 25

L. monocytogenes, не допускаются, г 25

Сульфитредуцирующие клост- 0,01

ридии, не допускаются, г

S. aureus, не допускаются, г 1

2.1.6 Методы идентификации микроорганизмов, выделенных из мяса

птицы и полуфабрикатов

Определение количества мезофильных аэробных и факультативно -анаэробных микроорганизмов. КМАФАнМ определяли согласно ГОСТ Р 50396.1-2010 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно -анаэробных микроорганизмов».

Для приготовления взвеси из объединенной измельченной пробы отбирали навеску массой не менее 10 г, измельчали, добавляли 0,9 % физиологический раствор в соотношении 1:10. После отстаивания взвеси в течение 10 мин готовили ряд 10-кратных разведений. Посевы проводили в чашки Петри глубинным агаровым методом и на тест-пластины 3Мтм РеМШш®. После застывания МПА чашки с посевами помещали в термостат вверх дном, инкубировали при 30 °С. Учет результатов посевов проводили через 72 ч. Подсчет колоний на чашках производили невооруженным глазом и с помощью прибора для подсчета колоний. Учитывали в разведениях, где выросло от 15 до 300 колоний. Количество микроорганизмов в 1 г продукта определяли средневзвешенным значением из подсчетов двух последовательных разведений по следующей формуле:

у-

V{n{ +0,1 n2)d

где X С - сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы в одной из них содержалось не менее 15 колоний;

V - объем посевного материала, внесенного в чашку, мл; nj - число отобранных для подсчета чашек первого выбранного разведения;

n2 - число отобранных для подсчета чашек последующего разведения; d - коэффициент разбавления, соответствующий первому выбранному разведению.

Для ускоренного выявления и определения КМАФАнМ использовали тест-пластины Petrifilm® (АС) для учета КМАФАнМ, которые позволили получить результат в течение 48±2 ч и тест-пластины Petrifilm® (ЯАС) для быстрого подсчета КМАФАнМ в течение 24 ч. Обработку результатов проводили, подсчитывая красные колонии визуально и/или при помощи прибора Petrifilm Plate Reader, позволяющего в течение 4 секунд провести автоматический учет количества выросших на тест-пластинах Petrifilm® колоний.

Полученные результаты выражали числом колониеобразующих единиц (КОЕ) от 1,0 до 9,9, умноженным на 10n и записывали «КМАФАнМ N х 10n КОЕ/г продукта».

Выявление и идентификация БГКП (колиформных бактерий). БГКП в тушках птицы, субпродуктах и полуфабрикатах из мяса птицы определяли согласно ГОСТ Р 54374-2011 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)».

Для посева использовали массу продукта (1 г, 0,1 г и т.д.), в котором нормативными документами предусмотрено отсутствие БГКП. Посев материала в десятикратных разведениях проводили в пробирках с лактозосодержащей средой Кесслера с трубками Дюрхема («поплавок») (бродильная проба). Пробирки

инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч. При наличии пузырьков газа, помутнении и/или обесцвечивании среды Кесслера отмечали положительную реакцию, которая косвенно указывала на присутствие в данной пробе колиформных бактерий, ферментирующих лактозу. При отсутствии признаков роста (газа в «поплавке» или помутнения среды) продолжали дальнейшее инкубирование еще в течение 24 ч.

Для дальнейшего подтверждения принадлежности выявленных бактерий, выросших в среде Кесслера с образованием газа и помутнением среды, к коли-формным бактериям проводили пересев штрихом на поверхность плотной дифференциально-диагностической среды (Эндо, Левина). Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч, отмечали рост типичных и атипичных колоний. Типичные колонии колиформных бактерий на среде Эндо образуют красные, розовые, бледно-розовые колонии, с металлическим блеском; на среде Левина - черные колонии с металлическим блеском, темные с черным центром или сиреневые с темным центром).

При наличии характерного для БГКП роста готовили мазки, окрашивали по Граму и микроскопировали. Для точного определения и подтверждения присутствия колиформных бактерий использовали пластины биохимические, дифференцирующие энтеробактерии (ПБДЭ).

Для проведения анализа на ПБДЭ сначала проводили высев выросших на среде Эндо колоний на поверхность скошенного МПА и инкубировали при температуре 37 °С в течение 18-24 ч. Из выросших колоний делали суспензию и закапывали несколько капель в каждую лунку ПБДЭ. Учет результатов проводили в соответствии с цветовым указателем, приложенным к ПБДЭ. Идентификацию культур микроорганизмов осуществляли с использованием таблицы биохимических свойств энтеробактерий, диагностического «ключа».

В качестве экспресс-определения БГКП в посевах параллельно с посевами в чашки Петри на агаризованные среды использовали высокочувствительные тест-пластины: Petrifilm® (HSCC) для определения колиформных бактерий в течение 24 ч; тест-пластины Petrifilm® (ЕС) для обнаружения Е. coli

/колиформных бактерий в течение 24-48 ч; тест-пластины Petrifilm® (ЕВ) для учета бактерий семейства Enterobacteriaceae через 24 ч.

Результаты исследований записывали как «БГКП обнаружены/не обнаружены в регламентированной массе продукта».

Выявление и идентификация бактерий рода Salmonella. Выявление бактерий рода Salmonella проводили согласно ГОСТ 31468-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл».

Навеску продукта массой 25 г из объединенной пробы вносили в 225 мл забуференной пептонной воды (ЗПВ) или другую в среду для предварительного неселективного обогащения. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 16-20 ч.

Затем 1 мл культуры из ЗПВ пересевали в две среды для селективного обогащения: магниевую и тетратионатный бульон (Мюллера-Кауфмана), инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Для выделения чистой культуры после селективного обогащения высевали образцы штрихом на поверхность двух агаризованных дифференциально -диагностических сред: на XLD-агар и висмут-сульфитный агар. Чашки помещали в термостат дном вверх и инкубировали при температуре 37 °С. Предварительный учет результатов проводили через 24 ч, окончательный - через 48 ч.

Для дифференциации сальмонелл от других И23-продуцирующих колоний (Citrobacter или Proteus) высев делали на Рамбах-агар, который позволяет выявить сальмонеллы со специфичностью 99 % и чувствительностью 97-99 %.

При отсутствии на дифференциально-диагностических средах типичных колоний, работу с посевами прекращали, а результат считали отрицательным.

При наличии хотя бы на одной среде типичной или подозрительной колонии, похожей на сальмонеллы, проводили дальнейшие исследования для подтверждения бактерий рода Salmonella. Для идентификации микроорганизмов брали только чистые культуры со скошенного МПА в пробирке, готовили мазки и окрашивали по Граму. Для определения биохимических свойств проводи-

ли посев уколом по центру столбика на среды: трехсахарный агар Олькеницко-го, среды Гисса, Клиглера, Ресселя-ГРМ, TSI-arap. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Интерпретацию результатов биохимических испытаний культур проводили, пользуясь таблицами биохимических характеристик бактерий рода Salmonella.

Для определения вида микроорганизма использовали реакцию агглютинации (РА) на предметном стекле. Для постановки реакции агглютинации на предметное стекло наносили с помощью пастеровской пипетки каплю поливалентной сальмонеллезной сыворотки и рядом каплю физиологического раствора. Бактериологической петлей вносили исследуемую бактериальную культуру, снятую с поверхности плотной питательной среды, в сыворотку и физиологический раствор.

Внесенную культуру тщательно растирали до получения равномерной взвеси. При положительной реакции агглютинации (наличии О-антигенов) в капле

сыворотки через 1 -2 мин образуются хлопья и комочки из-за склеивания бактериальной массы, а жидкость просветляется частично или полностью. В контрольном физиологическом растворе наблюдается равномерное помутнение.

При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образуется гомогенную смесь. Результаты учитывали через 2-4 мин.

При получении положительного результата проводили РА с адсорбированными поли- и моновалентными сыворотками для определения вида и биологического варианта сальмонелл. Наличие Vi - и Н-антигенов определяют при необходимости по санитарно-эпидемиологическим показаниям.

Результаты выявления бактерий рода Salmonella в 25 г продукта записывали: «Бактерии рода Salmonella обнаружены/не обнаружены в 25 г продукта».

Выявление и идентификация Staphylococcus aureus. Выявление Staphylococcus aureus в тушках птицы и птицепродуктах проводили согласно ГОСТ Р 54674-2011 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления и определения Staphylococcus aureus».

Для обнаружения S. aureus 1 мл взвеси (0,1 г продукта) высевали в жидкую селективную среду (солевой бульон) в соотношении 1:10. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч. При отсутствии помутнения среды и легко суспендируемого осадка, характерного для стафилококков, инкубирование продолжали еще 24 ч.

Для получения изолированных колоний культуральную жидкость из пробирки с солевым бульоном пересевали штрихом на селективно -диагностическую среды: агар Байрда-Паркера и/или желточно-солевой агар (ЖСА), инкубировали в течение 48 ч при температуре 37 °С.

Из отобранных типичных колоний готовили мазки, окрашивали по методу Грама, микроскопировали, изучали морфологию и проверяли чистоту выделенной культуры. Затем пересевали на скошенный МПА, культивировали при температуре 37 °С в течение 24 ч.

С целью подтверждения принадлежности выявленных кокков к S. aureus определяли способность проводили реакцию плазмокоагуляции. Реакцию считали отрицательной при отсутствии свертывания плазмы крови кролика, пол о-жительной - при появлении отдельных нитей. Положительную реакцию оценивали как «++» - при образовании небольшого сформировавшегося компактного сгустка; «+++» - при образовании большого компактного сгустка; «++++» -при коагулировании всей плазмы (сгусток не меняет своего положения при переворачивании пробирки).

При положительной реакции плазмокоагуляции крови кролика определяли биохимические свойства: способность культуры образовывать ацетоин (реакция Фогеса-Проскауэра) на среде Кларка; ферментировать мальтозу в аэробных условиях и маннит в анаэробных условиях на среде Гисса.

В качестве экспресс-определения патогенных стафилококков для посевов, выявления и подтверждения Staphylococcus aureus в течение 24-28 ч использовали высокочувствительные тест-пластины Petrifilm® (STX).

Результаты выявления Staphylococcus aureus в регламентированной массе продукта записывали: «Бактерии рода S. aureus обнаружены/не обнаружены в 1 г продукта».

Выявление и идентификация бактерий рода Proteus. Выявление бактерий рода Proteus в мясе птицы и птицепродуктах проводили согласно ГОСТ 7702.2.7-2013 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы выявления бактерий рода Proteus».

Для выявления Н-форм бактерий рода Proteus проводили посевы на МПА приготовленный по Шукевичу; О-форм - на среду Плоскирева. Посевы инкубировали при температуре 37 °С, предварительный учет результатов проводили через 24 ч, окончательный - через 48 ч.

Для подтверждения принадлежности выявленных микроорганизмов к бактериям рода Proteus готовили мазки, окрашивали по Граму, микроскопиро-вали, определяя морфологические свойства.

В дальнейшем после пересева с МПБ или со скошенного МПА изучали биохимические свойства бактерий рода Proteus (способность ферментировать глюкозу, дезаминировать фенилаланин и образовывать сероводород).

Результаты исследований записывали: «обнаружены/не обнаружены в 1 г продукта».

Выявление и определение сульфитредуцирующих клостридий. Анаэробных клостридий в тушках птицы и птицепродуктах выявляли согласно ГОСТ 7702.2.6-2015 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы выявления и определения количества сульфитредуцирующих клостридий».

Сначала для определения сульфитредуцирующей способности 1 г пробы или 1 мл ее последовательных разведений высевали в пробирки со средой Вильсона-Блера или железосульфитного агара с заливкой столбиком высотой 10-12 см. Посевы инкубировали в анаэростате. При наличии сульфитредуцирующей способности у выделенных культур происходило почернение сульфитной среды.

Не менее пяти колоний темно-серого и/или черного цвета пересевали в пробирки со средой Китта-Тароцци, инкубировали при температуре 37 °С в течение 24-72 ч. При помутнении среды, выделении газа и появлении постороннего запаха готовили мазки, окрашивали по методу Шеффера-Фултона, микро-скопировали, определяли каталазную активность на предметном стекле, нанося каплю перекиси водорода. Выделение пузырьков газа свидетельствует о ката-лазной активности. Сульфитредуцирующие клостридии каталазы не образуют.

Для подтверждения анаэробного роста сульфитредуцирующих клостри-дий культуру из среды Китта-Тароцци пересевали в стерильные чашки Петри глубинным способом на МПА. Застывшую среду накрывали стерильным предметным стеклом, чашки переворачивали вверх дном, инкубировали при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Рост колоний в глубине агара на 2-3 мм от края стекла свидетельствует о принадлежности микроорганизмов к клостридиям.

Для выделения спор сульфитредуцирующих клостридий пробирки с исследуемой пробой на среде Китта-Тароцци нагревали в водяной бане до температуры 80 °С в течение 20 мин. Затем пробирки охлаждали водопроводной водой, переносили 1 мл культуральной жидкости на среду Вильсона-Блера или железосульфитный агар. Изучали также культуральные, морфологические и биохимические свойства.

Результаты выявления сульфитредуцирующих клостридий в исследуемой пробе записывали: сульфитредуцирующие клостридии обнаружены/не обнаружены, при этом указывали массу продукта в граммах.

Выявление и определение Listeria monocytogenes. Выявление Listeria monocytogenes в мясе птицы и птицепродуктах проводили согласно ГОСТ 32031-2012 «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes».

Выделение листерий проводили в 4 этапа:

- первичное обогащение;

- вторичное обогащение;

- пересев на плотную селективную среду;

- идентификация отобранных колоний.

Первичное обогащение проводили в полуконцентрированном бульоне Фразера для выявления небольшого количества возбудителя и «поврежденных» клеток в исследуемом образце, т.к. листерии находятся в мясе птицы в небольшом количестве из-за значительного количества микробов других родов.

Для вторичного обогащения 0,1 мл посевного материала вносили в пробирку, содержащую 10 мл бульона Фразера 2 с полной концентрацией селективных компонентов. Посевы культивировали при температуре 37 °С в течение 48 ч.

После культивирования проводили пересев на агар ALOA (агар Listeria по Оттавиани и Агости) и Палкам агар. Посевы культивировали при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.

При отсутствии роста характерных колоний бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes на плотных селективных средах исследования прекращали, в заключении указывали отсутствие в исследуемой пробе продукта бактерий Listeria monocytogenes.

При наличии характерного для Listeria и Listeria monocytogenes роста готовили мазки, окрашивали, микроскопировали, определяли бета -гемолитическую и лецитиназную активность и ферментативные свойства с помощью различных тест-систем для ускоренной идентификации выделенных микроорганизмов (КАМП-тест, Listeria Latex Kit, Singlepath Listeria, VIDAS Listeria Duo (LDUO) и др.).

При выявлении сапрофитных микроорганизмов их количество учитывали при определении общего микробного числа (КМАФАнМ, КОЕ/г).

2.1.7 Методы выявления жизнеспособных культивируемых и некульти-

вируемых клеток микроорганизмов

Получение жизнеспособных некультивируемых клеток микроорганизмов. Количественный высев исследуемого материала на плотные питательные среды в чашки Петри с последующим подсчетом выросших колоний является самым распространенным методом оценки микробного обсеменения различных объектов. Для определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) микроорганизмы культивировали на МПА с последующим инкубированием в термостате при температуре 37 °C в течение 72 часов, затем производили подсчет колоний.

Для индукции перехода клеток в некультивируемое состояние (НС) использовали искусственную морскую воду (стресс голодания в безбелковой среде). Для получения посевной культуры штаммы условно-патогенных микроорганизмов P. aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 (G101), E. coli AB1157, Salmonella enterica Typhimurium 79, Staphylococcus aureus 209P дважды пассировали на МПБ во флаконах, содержащих 100 мл среды при температуре 37 °C в течение (22±2) ч без перемешивания.

Затем во флакон, содержащий 300 мл морской воды (безбелковая среда), вносили суспензию, отобранную из 100 мл флаконов, в количестве (1:10). Флаконы укупоривали резиновыми пробками с дыхательными пластмассовыми трубками, инкубировали в темноте при температуре 20 °C в течение необходимого для эксперимента времени (до 116-315 дней) (рис. 2).

Рисунок 2 - Флаконы с дыхательной трубкой на пробке для культивирования ЖНК

Получение жизнеспособных некультивируемых клеток Pseudomonas aeruginosa PAO1. Для получения посевной культуры штаммы фагочувстви-тельного Pseudomonas aeruginosa PAO1 (ph-) и лизогенезированного фагом G101, субштамма P. aeruginosa PAO1 (ph+) дважды пассировали на МПБ во флаконах, содержащих 100 мл среды при температуре 37 °C в течение (22 ± 2) ч без перемешивания.

Посевную культуру концентрировали при 10000 об/мин в течение 12 мин на центрифуге, аккуратно сливали супернатант, оставляя осадок, который, впоследствии ресуспендировали в физиологическом растворе. Затем во флаконы с 4 % концентрацией искусственной морской воды (300 мл) для создания условий трофического и осмотического стресса инокулировали бактериальную суспензию штамма объемом 0,9 % от объема среды. С целью

создания аэробных условий флаконы укупоривали просверленными резиновыми пробками с дыхательными пластмассовыми трубочками, заткнутыми ватой. Флаконы инкубировали в темноте при температуре 20 °C в течение 116 суток.

Получение лизогенного штамма Escherichia coli AB1157 и жизнеспособных некультивируемых клеток. С целью получения лизогенного штамма, чувствительного к фагу X, клетки (ph-) фагочувствительной Escherichia coli AB1157 заражали умеренным фагом X. Далее из сформированной на агаре фаговой колонии, из ее мутного центра, отбирали культуру (лизогенную), которую размножали на питательных средах. Культуры (лизогенные ph+) и (нелизо-генные ph-) тестировали на способность формировать ЖНК. Для получения посевных культур клетки культивировали в МПБ в течение 18 ч, затем концентрировали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 12 мин при комнатной температуре. Супернатант сливали и ресуспендировали клетки осадка в физиологическом растворе. Затем бактериальную суспензию штамма инокули-ровали во флаконы с 3 % NaCl (300 мл) для создания условий трофического и осмотического стресса. Объем инокулята составил приблизительно 0,9 % от объема среды. Для создания аэробных условий флаконы закрывали стерильными просверленными резиновыми пробками с пластмассовыми трубочками, предварительно заткнутыми ватой. Длительную инкубацию (315 суток) проводили при комнатной температуре. Определяли под микроскопом ОМЧ, количество микроорганизмов, способных образовывать колонии (КОЕ/мл), определяли под люминесцентным микроскопом количество жизнеспособных и мертвых бактериальных клеток, а также рассчитывали количество жизнеспособных не-культивируемых клеток.

Выявление жизнеспособных культивируемых и некультивируемых клеток Staphylococcus aureus 209P. В экспериментах использовали культуры Staphylococcus aureus 209P, клетки которого на 99,9 % перешли в состояние

ЖНК после инкубации в условиях трофического и осмотического стрессов (3 % раствор NaCl). С целью выявления ЖНК микроорганизмов в птицепродуктах проводили эксперименты с куриным фаршем. Для этого образцы фарша массой 5 г суспендировали в 5 мл стерильного питательного бульона, затем смесь размешивали на вортексе, предназначенном для тщательного встряхивания и перемешивания в лабораториях, делали серию 10-кратных разведений в 0,9 % физиологическом растворе с последующими высевами на питательную среду и тест-пластины Petrifilm®. Искусственно зараженные стафилококками образцы куриного фарша готовили добавлением по 5 г куриного фарша в пробирки с 5 мл суточной бульонной культуры Staphylococcus aureus 209P. Исследования проводили в двух точках: 0 ч и 5 ч.

В каждой из смесей (смесь фарша с МПБ; смесь фарша с бульонной культурой S. aureus 209P) определяли ОМЧ с помощью камеры Горяева, делали высевы из разведений этих смесей в физиологическом растворе на 1,5 % МПА и на пластины Petrifilm® для определения КОЕ/мл. Для детекции уровня жизнеспособных бактерий в 1 мл тестируемых суспензий фарша подсчитывали в люминесцентном микроскопе количество живых и мертвых клеток, окрашенных с помощью красителя Live/Dead. На основании совокупных данных рассчитывали количество ЖНК.

Выявление жизнеспособных культивируемых и некультивируемых клеток E. coli AB1157 и Salmonella enterica Typhimurium. В экспериментах использовали культуры E. coli AB1157, клетки которого на 99,9 % перешли в состояние ЖНК после 10 месяцев инкубации в условиях трофического и осмотического стрессов (3 % раствор NaCl), а также штамм Salmonella enterica Typhimurium, клетки которого инкубировали в искусственной морской воде. Популяция сальмонелл имела 99,99 % ЖНК. В качестве белкового субстрата использовали куриный фарш (производства «Мираторг») с действующим сроком годности.

Для подсчёта жизнеспособных клеток в образцы фарша массой 5 г вносили 10 мл взвеси ЖНК каждой из культур. Перемешивали на вортексе и делали высевы (время 0 часов) из каждой смеси и при инкубировании в течение 5 часов при комнатной температуре. Контролем служили образцы каждого из компонентов смеси с соответствующими высевами на чашки Петри с 1,5 % МПА и тест-пластины РеМШш® - для подсчета КОЕ/г. Помимо КОЕ/г определяли общее микробное число бактерий (ОМЧ) в образцах фарша и его центрифугата, а также число жизнеспособных и мёртвых клеток в популяциях и ЖНК. Смесь фарша с микроорганизмом оставляли на 5 часов при температуре 20 °С и вновь производили определение показателей.

Определение общего числа клеток. Для подсчета общего числа клеток с помощью счетной камеры Горяева на выступающие боковые края камеры по обе стороны от сетки Горяева наносили по капле спирта, сверху накладывали обезжиренное покровное стекло, протирая его большими пальцами до появления Ньютоновских радужных колец. Пространство между камерой и стеклом заполняли суспензией. Подсчет производили через 1 - 2 минуты. Клетки считали в 20 малых квадратах несколько раз для получения точных результатов. Количество клеток в 1 мл суспензии определяли по формуле:

_ п X 1000 ~ /гх5

где X - число клеток в 1 мл суспензии,

п - среднее число клеток в квадрате сетки,

И - глубина камеры Горяева в 1/10мм,

2 3

5 - площадь квадрата сетки 1/25 мм , 1000 мм = 1 мл.

Определение соотношения живых и мертвых клеток. В исследованиях использовали световой микроскоп фирмы «Микмед» (Россия) и люминесцентный микроскоп «Ор/оп» (Германия). Люминесцентная

микроскопия позволила выявить живые и мертвые клетки, изучить мембранные структуры и получить высококонтрастные цифровые изображения микроорганизмов.

Для определения соотношения живых и мертвых клеток в суспензии в пробирки Эппендорф вносили 1,5 мл суспензии и центрифугировали при 13 тыс. оборотов в течение 10 мин. Удаляли супернатант до отметки 0,5 мл, ресуспедировали и вносили 3 мкл люминесцентного ДНК-тропного красителя Live/Dead (Baclight™). Коммерческий набор красителя представляет собой смесь витального (CYTO-9) и йодида пропидия, который не проникает через интактную мембрану клетки. Для приготовления рабочего раствора краситель разводили в дистиллированной воде 1:10. Раствор хранили при температуре минус 18 °С.

Суть метода заключается в окрашивании живых бактерий зеленым флуоресцентным красителем (SYTO9) и окрашивании мертвых или поврежденных бактерий с использованием иодида пропидия (PI) (оранжево-красная флуоресценция). Готовую смесь оставляли на 15 мин в темном месте. Затем на предметное стекло наносили каплю окрашенной смеси, прикрывали покровным стеклом и микроскопировали при увеличении *320 (8*40).

2.1.8 Методы изучения обеззараживающей активности УФ-облучения и озонирования в камерах созревания колбасных изделий их мяса птицы

-5

В экспериментах использовали сушильную камеру объемом 200 м , снабженную УФ-облучателями ОБН-150 с двумя источниками облучения по 30 Вт, закрепленными на стенах и УФ-облучателями - озонаторами ОЗУФ 40 Вт. Озонатор-облучатель ОЗУФ является рециркулятором, благодаря чему он способен обеззараживать воздух в «застойных зонах» помещениях. Его УФ-лампа находится в закрытом корпусе с вентилятором, который прогоняет воздух около лампы и дезинфицирует его УФ-лучами и озоном. Это исключает нежела-

тельное окисление жиров в поверхностном слое колбасных изделий. Наибольшим бактерицидным действием в отношении микроорганизмов обладает спектр лучей 240-280 нм.

Сушильные камеры имели воздушные кондиционеры с регламентированными уровнями температуры и влажности. Работу кондиционеров дополнительно контролировали психрометрами и термометрами. Облучение проводили в темноте в течение 30, 60 и 90 минут. Колбасные изделия для сушки размещали ярусами в несколько рядов, так, чтобы обеспечить свободную циркуляцию воздуха между колбасными батонами одинакового размера.

Для изучения влияния УФ-облучения на способность инактивировать микробиоту камеры использовали сырокопченую колбасу, имеющую в своем

-5

составе мясо птицы. Определение ОМЧ и плесневых грибов в 1 м камеры выполняли после забора проб воздуха с помощью пробоотборного устройства

-5

(ПУ-1Б) российского производства и учетом выросших колоний (КОЕ/м ) на чашках Петри с МПА. Отбор проб через ПУ -1Б происходил через конические насадки с многими соплами и отверстиями, под которые помещали чашки Петри со средамии МПА и Сабуро. Струи воздуха из сопла, содержащие микро-биоту, попадая на поверхность питательной среды, инфицировали ее. Через 24 -72 ч инкубации при 37 °С учитывали выросшие бактерии, а через 4-5 суток плесневые грибы. Количественные показатели общего числа бактерий и плес-

-5

невых грибов рассчитывали на 1 м воздуха.

2.1.9 Методы определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам и бактериоцинам

Определение чувствительности микроорганизмов к бактериофагам.

Для определения чувствительности бактерий, выделенных нами в тушках птицы и птицепродуктах, использовали отечественные коммерческие бактериофа-

ги, произведенные в ФГУП «Микроген», Москва: Колипротейный бактериофаг, Пиобактериофаг, Интести-бактериофаг, Стафилококковый бактериофаг. Активность фагов определяли на чувствительных к ним бактериях спот-тестом (нанесением капли бактериофага на предварительно посеянную, но еще не инкубированную культуру) или методом разведений (литическую активность -титр бактериофагов по Аппельману), присутствие фага в тестируемом образце - по наличию зон торможения роста вокруг образца на штаммах -контаминантах на МПА.

Вначале исследования определяли чувствительность выявленных бактериальных культур-контаминантов к указанным бактериальным фагам согласно методу определения литической активности бактериофага по Аппельману. Сущность метода заключается в установлении максимального разведения бактериофага, в котором исследуемый фаг проявляет свое литическое действие в виде отсутствия роста тест-штамма микроорганизма. В ряд из 8 стерильных пробирок одинакового диаметра наливали по 4,5 мл МПБ. В первую пробирку вносили 0,5 мл испытуемого бактериофага. Далее проводили последовательные десятикратные разведения фага, перенося отдельными пипетками из пробирки в пробирку по 0,5 мл смеси фага со средой. Из последней пробирки 0,5 мл смеси удаляли. Во все пробирки вносили по 0,1 мл заранее приготовленной 18 -часовой бульонной культуры бактерий с калибровкой по ОСО мутности на 10 ед. Культуры бактерий выбирали в соответствии со специфичностью применяемого бактериофага, например, E. coli и Proteus vulgaris - Колипротейный бактериофаг, сер. Н31; Pseudomonas aeruginosa - Пиобактериофаг, сер. Н27; Staphylococcus aureus - Стафилококковый бактериофаг, сер. Н54; Salmonella enterica Typhimurium - Интести-бактериофаг, сер. Н68. Контролем служили культуры штаммов-контаминантов без фага.

Приготовленные пробирки со смесью бактериофага и культуры инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 12 ч. Затем определяли оптическую плотность, проводили учет результатов.

Определение чувствительности микроорганизмов к бактериофагам при искусственной контаминации птицепродуктов. Для изучения действия коммерческих бактериофагов искусственно контаминировали образцы куриного фарша микроорганизмами-контаминантами. С этой целью в стерильные пробирки с 1 г исследуемого продукта (5 проб) вносили по 1 мл неразведенного исследуемого коммерческого фага в соответствии с литической активностью бактерии-контаминанта. Смесь хорошо перемешивали и помещали на 2 ч в термостат при температуре 37 ° С для лучшего взаимодействия фага с продуктом. Через 2 ч в каждую из пробирок вносили по 0,1 мл тест-культуры, специфичной для каждого фага и стандартизованной по ОСО мутности как указано при контроле титра фагов. Затем на поверхность 5 чашек с 1,5 % МПА, в каждую из которых предварительно внесли по 0,1 мл бактериальной тест -культуры, помещали образцы контаминированного микроорганизмами образца продукта. Для этого прокаленной, калиброванной на 2 цл бактериологической петлей брали образец, пропитанный смесью фага с микробом, и вносили его на чашку с соответствующей бактериальной культурой. Снова инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 °С. Затем учитывали результат по наличию зон ингибиции тест-культур. Контролем в экспериментах служили образцы продукта без изучаемых добавок.

Кроме того по методу Аппельмана выполняли 10-кратные разведения в МПБ этих инкубированных 2 -х часовых смесей образца продукта со штамма-ми-контаминантами и фагом. Пробирки выдерживали 24 ч при температуре 37 °С и учитывали литическую активность бактериофагов. Эффект действия фагов на контаминирующие птицепродукты оценивали по количеству оставшихся микробов в образце продукта по сравнению с контролем без добавления фага.

Фотометрическое определение оптической плотности. Для определения воздействия бактериофага на микробные клетки в жидкой среде через 24 ч

измеряли оптическую плотность (ОП) культур-контаминантов на фотоколориметре КФК-3-01 «ЗОМЗ» (Россия). Для этого в кюветы с рабочим расстоянием между гранями 5 мм, длиной волны Х=540 нм вносили 3,5 мл суспензии. В качестве контрольного раствора использовали дистиллированную воду.

Определение чувствительности микроорганизмов к бактериоцинам.

С целью определения чувствительности микроорганизмов, выделенных из пищевого сырья к бактериоцинам, использовали разрешенный в пищевой промышленности в качестве консерванта пищевую добавку Е234 - низин, произведенный в Китае компанией Sunergy Pharmachem Group Co., Limited, Shanghai China под торговым названием Nisin (2,5 in NaCl).

Антимикробное действие низина на колбасные изделия из мяса птицы устанавливали методом смывов ватным тампоном с поверхности продукта физиологическим раствором. Ватный тампон ополаскивали в 9 мл 0,9 % физиологического раствора. Общее микробное число (ОМЧ) определяли в 1 г продукта путём высева на чашку Петри с 1,5 % МПА разведений смыва в физиологическом растворе и на тест-пластины Petrifilm® для определения КМАФАнМ (АС) в течение 48-72 ч и для ускоренного КМАФАнМ (ЯЛС) в течение 24 ч.

Исследования с низином проводили в несколько этапов. На первом этапе испытуемые образцы птицепродуктов (колбасные изделия вареные и полукопченые из мяса птицы) взвешивали на высокоточных лабораторных весах «A&D», серия HL-100 (Япония), упаковывали в полиэтиленовую пленку, присыпанную порошком коммерческого консерванта низина. Порошок наносили на внутреннюю поверхность полиэтиленовой пленки каждой пробы в соотношении 1:1000 (т. е. 0,1 мг на 1000 мг продукции). Края упаковки спаивали, образцы хранили при температуре от 0 до + 2 °C в охлажденном состоянии в течение 34 дней. Контролем служили образцы, упакованные в необработанную низином пленку. Микробиологические показатели определяли в сравнении при хранении образцов в течение 5, 7, 12 и 34 дней при температуре (0±2) °C.

На втором этапе совместно с кафедрой прикладной механики и инжиниринга технических систем создали полимерную упаковку с содержанием 2 % и 5 % низина, в которую упаковывали исследуемые птицепродукты. В качестве контроля использовали упаковку без содержания низина. Микробиологические показатели определяли в сравнительном аспекте при хранении исследуемых образцов при температуре от 0 до +2 °С в камере бытового холодильника.

Статистическая обработка результатов экспериментальных данных. Все опыты проводили не менее 3-х кратной повторностей, обеспечивающих получение воспроизводимых и достоверных результатов. Результаты, полученные в ходе эксперимента, построение графиков и диаграмм проводили с помощью статических методов с использованием программы Excel. Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли с использ о-ванием критерия Стьюдента.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием параметрических критериев: средней арифметической (X), ее ошибки (m) и доверительного интервала колебания величины средней арифметической (I95) для достоверности (p <0,05) (Урбах В.Ю., 1964).

Достоверность различия показателей, определенных параметрическими и непараметрическими методами, считалась подтвержденной при уровне значимости «р» не выше 0,05.

2.2 Результаты собственных исследований

Собственные исследования осуществлялись согласно ранее поставленной цели и задачам, в которых были предусмотрены поэтапные лабораторные, мониторинговые и экспериментальные исследования, отражающие важность микробиологического контроля сырья и продукции животного происхождения. Исследования, представленные в разделах 2.2.1 - 2.2.3, были направлены не только на анализ качества выпускаемой в настоящее время птицепродукции, но и на обоснование необходимости проведения антимикробной и санитарной обработки продуктов из мяса птицы предлагаемыми нами адекватными или рациональными методами.

2.2.1 Органолептическая оценка и физико -химические исследования мяса птицы и полуфабрикатов в режиме онлайн

Для решения поставленных задач проводили мониторинговые органолеп-тические, физико-химические, микроскопические и бактериологические исследования отобранных охлажденных тушек птицы, мясокостных и бескостных полуфабрикатов из мяса птицы без панировки, отобранные из розничных торговых сетей «Ашан», «Магнит», «Пятерочка», «Перекресток» и др. основных производителей мяса птицы: АО «Петелинская птицефабрика», АО «Приоско-лье», ООО Птицефабрика «Элинар-бройлер», АО «Моссельпром» в режиме реального времени.

Результаты органолептических исследований. Органолептические показатели мяса (внешний вид, цвет, запах, консистенцию, вкус, сочность) и бульона (внешний вид, аромат, вкус и наваристость) определяли по 9 -ти балльной шкале в 3-4-кратной повторности каждого образца. Для микроскопического анализа готовили мазки-отпечатки, для бактериологического - посевы на соот-

ветствующие питательные среды. Все исследования проводили в два этапа. Первый этап включал определение органолептических, физико-химических и микробиологических показателей испытуемых образцов в первый день после приобретения образцов в торговой сети. На втором этапе определяли эти же показатели при хранении образцов в охлажденном состоянии в течение 5 дней при температуре от 0 до +2 °С. Результаты проведенных органолептических исследований представлены в таблицах 2.2.1 - 2.2.4 и диаграммах (рис. 3, 4).

Таблица 2.2.1 - Органолептическая оценка мяса птицы и полуфабрикатов по 9-балльной шкале в 1-й день исследования

№№ образ цов Внешний вид, цвет Запах (аромат) Консистенция (нежность, жесткость) Вкус Сочность Средний балл

№ 1 8,2±0,12 7,3±0,12 7,6±0,08 8,2±0,07 8,3±0,12 7,92±0,10

№ 2 7,6±0,13 7,8±0,09 7,9±0,11 8,3±0,11 8,1±0,11 7,94±0,11

№ 3 8,3±0,16 7,7±0,13 8,3±0,13 8,1±0,06 8,2±0,10 8,12±0,10

№ 4 7,5±0,19 7,8±0,12 7,6±0,09 7,9±0,05 7,7±0,15 7,70±0,12

№ 5 7,3±0,15 7,4±0,10 7,8±0,15 7,4±0,06 8,2±0,06 7,62±0,10

№ 6 6,2±0,18 8,1±0,13 7,2±0,11 7,5±0,08 7,5±0,09 7,30±0,12

№ 7 8,1±0,15 8,7±0,11 8,6±0,08 8,1±0,09 8,1±0,13 8,32±0,11

№ 8 7,5±0,12 7,8±0,13 8,1±0,07 7,8±0,08 7,1±0,15 7,66±0,11

№ 9 8,2±0,17 7,9±0,11 8,2±0,06 7,8±0,11 7,7±0,13 7,96±0,12

№ 10 6,8±0,14 6,9±0,12 7,8±0,11 7,5±0,09 7,2±0,18 7,24±0,13

№ 11 7,5±0,10 8,2±0,10 8,1±0,13 7,7±0,08 8,3±0,12 7,96±0,11

№ 12 7,4±0,15 7,6±0,09 7,5±0,06 7,9±0,07 7,8±0,11 7,64±0,10

№ 13 6,7±0,14 7,2±0,13 7,3±0,12 7,2±0,12 6,8±0,09 7,04±0,12

№ 14 7,8±0,13 7,8±0,12 8,1±0,08 8,1±0,06 7,6±0,12 7,88±0,10

№ 15 7,6±0,16 7,8±0,09 8,2±0,10 7,8±0,06 7,8±0,11 7,84±0,10

Х±т 7,51±0,15 7,73±0,11 7,89±0,10 7,82±0,08 7,76±0,12 7,74±0,11

Х±195 7,51±0,33 7,73±0,23 7,89±0,21 7,82±0,17 7,76±0,25 7,74±0,26

Таблица 2.2.2 - Органолептическая оценка мяса птицы и полуфабрикатов по 9-балльной шкале при хранении в течение 5 дней при температуре от 0 до +2 °С

Конси-

№№ образца Внешний вид, цвет Запах (аромат) стенция (нежность, жесткость) Вкус Сочность Средний балл

№ 1 6,9±0,10 6,2±0,12 6,5±0,06 6,5±0,12 6,3±0,13 6,46±0,11

№ 2 6,3±0,11 7,1±0,16 6,8±0,15 6,6±0,15 6,1±0,15 6,56±0,14

№ 3 6,7±0,12 6,9±0,17 7,1±0,12 6,7±0,18 7,2±0,14 6,94±0,15

№ 4 5,8±0,13 5,7±0,18 5,6±0,09 5,9±0,12 6,6±0,08 5,94±0,12

№ 5 6,3±0,16 5,8±0,14 6,8±0,12 5,6±0,16 5,4±0,12 5,98±0,12

№ 6 5,7±0,12 5,3±0,12 6,1±0,11 4,6±0,18 5,8±0,15 5,50±0,14

№ 7 6,7±0,12 6,2±0,14 6,7±0,14 5,7±0,12 6,3±0,18 6,32±0,14

№ 8 5,8±0,09 6,9±0,19 6,6±0,05 5,2±0,13 6,1±0,15 6,12±0,12

№ 9 6,4±0,12 6,5±0,13 7,1±0,14 5,3±0,11 5,8±0,13 6,26±0,13

№ 10 5,3±0,16 5,8±0,15 5,9±0,19 5,3±0,17 5,6±0,08 5,56±0,11

№ 11 6,2±0,11 6,3±0,17 6,8±0,13 5,8±0,16 5,7±0,14 6,16±0,14

№ 12 5,9±0,11 5,9±0,15 6,3±0,13 5,9±0,19 6,1±0,10 6,02±0,14

№ 13 5,7±0,08 5,1±0,12 5,6±0,07 5,6±0,12 5,7±0,11 5,56±0,10

№ 14 5,8±0,14 5,9±0,14 6,5±0,09 6,3±0,16 6,7±0,13 6,28±0,13

№ 15 6,5±0,12 6,3±0,15 6,7±0,15 5,8±0,18 5,9±0,14 6,12±0,15

Х±т 6,13±0,12 6,13±0,15 6,49±0,12 5,78±0,15 6,09±0,12 6,12±0,13

Х±195 6,13±0,25 6,13±0,31 6,49±0,26 5,78±0,31 6,09±0,26 6,12±0,28

Данные, представленные в таблицах 2.2.1, 2.2.2 свидетельствуют, что при сравнительной органолептической оценке тушки птицы и птицепродукты при хранении в течение 5 -ти дней в холодильнике имели выраженную разницу в ряде регламентированных показателей по сравнению с исходными данными исследуемых образцов. Во всех случаях органолептическая оценка исследуемых проб при хранении в охлажденном виде в течение пяти дней была ниже по сравнению с оценкой образцов в 1 -й день исследования птицепродуктов.

По внешнему виду оценка проб при хранении была на 1,1 - 1,2 балла ниже, чем оценка исходного мяса. Оценка запаха (аромата) мяса птицы и птице-продуктов при хранении в охлажденном виде в течение 5 дней также была ниже в среднем на 1,6 баллов по сравнению с оценкой проб в начале исследования. В консистенции мышечной ткани выявлены такие же различия в показателях. В мясе и продуктах из мяса птицы в первый день исследования консистенция составляла 7,2 - 8,6 баллов, а после 5-дневного хранения не превышала 5,6 - 7,1 балл. Средняя оценка в баллах всех образцов в начале исследования составила (7,74±0,11) балла, при хранении в течение 5-ти дней - (6,12±0,13) балла, т.е. снизилась на 1,62 балла (рис. 3).

При пробе варкой (табл. 2.2.3 - 2.2.4) средняя оценка бульона не имела существенных различий. Органолептическая оценка бульона по всем показателям в среднем составила (7,45±0,16) баллов, а при хранении птицепродуктов в охлажденном виде при температуре от 0 до +2 °С в течение 5 дней - (6,85±0,12) баллов, т.е. ниже на 0,60 баллов (рис. 4).

1

(аромат)

Средний балл Сочность Вкус Консистенция Запах Внешний вид,

(нежность, цвет

жесткость)

■ 1-й день исследования ■ 5-й день исследования

Рисунок 3 - Средняя органолептическая оценка мяса птицы и полуфабрикатов по 9-балльной шкале

Таблица 2.2.3 - Органолептическая оценка бульона из мяса птицы и полу-

фабрикатов (проба варкой) по 9-балльной шкале в 1 -й день исследования

№№ образцов Внешний вид, цвет Запах (аромат) Вкус Наваристость Средняя оценка образца

№ 1 7,5±0,11 7,8±0,12 8,2±0,15 7,9±0,16 7,85±0,13