Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук Разумов, Иван Алексеевич

• Разумов, Иван Алексеевич
• доктор биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации доктор биологических наук Разумов, Иван Алексеевич

Список использованных сокращений. 6

ВВЕДЕНИЕ. 8

ГЛАВА 1. Обзор данных литературы. 19

1.1. Моноклональные антитела как инструмент изучения вирусных белков.

1.1.1. Моноклональные антитела: получение и основные свойства.

1.1.2. Исследование и картирование антигенных детерминант на вирусных белках с помощью МКА.

1.2. Филовирусы: вирусы Марбург и Эбола.

1.2.1. Классификация, морфология, организация генома, структура и функции белков.

1.2.2. Иммунитет при филовирусных инфекциях.

1.2.3. Вакцинный потенциал филовирусных белков.

1.2.4. МКА к филовирусам: получение, свойства и применение.

1.3. Флавивирусы: вирус Западного Нила (ВЗН).

1.3.1. Общая характеристика ВЗН

1.3.2. Структурные белки флавивирусов и белок Е ВЗН.

1.3.3. Моноклональные антитела против структурных белков ВЗН в изучении флавивирусов.

1.4. Ортопоксвирусы: ВНО, ВОВ, ВОК, ВЭм.

1.4.1. Краткая характеристика ортопоксвирусов.

1.4.2. Некоторые методы исследования ортопоксвирусных белков.

1.4.3. Мембранные белки ортопоксвирусов.

1.4.4. МКА против структурных белков ортопоксвирусов.

1.5. Использование рекомбинантных белков для изучения и картирования антигенных детерминант на вирусных белках.

1.6. Гибридомные МКА и рекомбинантные одноцепочечные, химерные и гуманизированные антитела на их основе.

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть (Материалы и методы). 77

2.1. Исходные материалы.

2.1.1. Материалы и реактивы.

2.1.2. Вирусные препараты.

2.1.3. Клеточные культуры и среды.

2.1.4. Сыворотки и иммуноглобулины.

2.1.5. MICA к вирусным белкам.

2.1.6. Рекомбинантные белки вирусов и рекомбинантные антитела.

2.2. Методы получения гибридом и приготовления MICA.

2.2.1. Иммунизация животных-доноров иммунных спленоцитов

2.2.2. Получение гибридом.

2.2.3. Клонирование гибридом.

2.2.4. Криоконсервация клеточных линий.

2.2.5. Наработка значительных количеств МКА in vivo.

2.2.6. Методы очистки МКА.

2.2.7. Измерение концентрации белковых препаратов.

2.2.8. Определение класса и подкласса моноклональных иммуноглобулинов.

2.2.9. Приготовление конъюгатов антител с биотином.

2.3. Иммунологические методы.

2.3.1. Твердофазный иммуноферментный анализ.

2.3.2. Конкурентный иммуноферментный анализ.

2.3.3. Определение константы аффинности МКА.

2.3.4. Иммуноблот.

2.3.5. Реакция нейтрализации вируса in vitro.

2.3.6. Антителозависимый лизис инфицированных вирусом клеток.

2.3.7. Определение протективной активности МКА при пассивной иммунизации животных.

2.4. Электрофорез.

2.5. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение исследований. 96

3.1. Создание, расширение и изучение коллекции гибридом ГНЦ ВБ

Вектор» » за период с 1982 по 2007 годы.

3.2. Особенности технологии получения гибридом - продуцентов МКА к возбудителям особо опасных инфекций и изучение свойств антител. 103 3.2.1. Исследование препаратов вирусов Марбург и Эбола, используемых для получения гибридом.

3.2.2. Получение коллекции гибридом, продуцирующих MICA к филовирусам, и изучение свойств гибридомных антител.

3.3. Использование МКА в изучении белков филовирусов, их антигенной структуры, биологической активности и иммуногенных свойств.

3.3.1. Применение специфических моноклональных и поликлональных антител для выявления перекрестно-реактивных антигенных детерминант на структурных белках филовирусов Марбург и Эбола.

3.3.2. Выявление иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков NP, VP35 и VP40 ВМ, на репродукцию вируса.

3.3.3. Определение с помощью моноклональных и поликлональных антител иммунодоминантных белков филовирусов, формирующих В-клеточный иммунный ответ.

3.4. Изучение белков филовирусов и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических поликлональных и моноклональных антител. 141

3.4.1. Использование моноклональных антител для сравнительного изучения иммуногенных и антигенных свойств белка VP35 вируса

Эбола и его рекомбинантного аналога.

3.4.2. Изучение белков NP, VP40 и VP35 вируса Марбург и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических моноклональных и поликлональных антител.

3.5. Картирование антигенных детерминант и эпитопов белков филовирусов

Марбург и Эбола, с использованием моноклональных антител, рекомбинантных белков и их фрагментов.

3.5.1. Топологическое картирование антигенных сайтов и эпитопов на белках NP, VP40 и VP35 вируса Марбург.

3.5.2. Картирование антигенных детерминант и эпитопов для МКА на аминокислотной последовательности белков VP35 филовирусов

Марбург и Эбола.

3.6. Изучение перекрестного взаимодействия МКА против ортопоксвирусов с патогенными и непатогенными для человека ортопоксвирусами.

3.6.1. Определение видоспецифических эпитопов ВЭм и родоспецифических эпитопов ВНО, ВОВ, ВОК и ВЭм

3.6.2. Выявление перекрестной нейтрализующей активности МКА, реагирующих с белками слияния 14 кДа вирусов эктромелии ген 129L) и натуральной оспы (ген A30L).

3.7. Исследование с использованием гибридомных МКА антигенных взаимоотношений штаммов вируса Западного Нила, изолированных в России и за рубежом.

3.7.1. Получение и характеристика MICA, реагирующих с общими и дифференцирующими антигенными детерминантами ВЗН.

3.7.2. Изучение с использованием нейтрализующих МКА антигенной вариабельности штаммов ВЗН, изолированных из различных регионов России и за рубежом.

3.8. Сравнительный анализ нейтрализующей активности гибридомных

МКА 9Е2 и рекомбинантных одноцепочечных scFv 9Е и гуманизированных Fc-9E2 антител против белка Е ВЗН.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов»

Актуальность проблемы

Только за последние 3-4 десятилетия было выявлено около 30 новых возбудителей инфекционных болезней, поразивших за этот период сотни миллионов человек и унесших миллионы жизней. К их числу относятся несколько возбудителей острых и хронических диарей, гепатитов С и Е, возбудители венесуэльской (вирус Гуанарито) и бразильской (вирус Сабиа) геморрагических лихорадок, СПИДа, геморрагических лихорадок Эбола (вирус Эбола) и Марбург (вирус Марбург) и других заболеваний. Кроме того, инфекционные заболевания расширяют ареал своего распространения. Ярким примером возникновения и распространения в последнее время новых вариантов вирусов является проникновение вируса Западного Нила в Северную Америку (Нью-Йорк) в 1999 году и его повсеместное распространение по территории континентов Северной и Южной Америки. Совместными усилиями правительств многих стран, под эгидой ВОЗ, в 20-м веке удалось ликвидировать только одну вирусную инфекцию - натуральную оспу. Вместе с тем, в настоящее время по ряду причин, включая угрозу биотерроризма и отсутствие современных способов лечения и профилактики, центры по контролю и предотвращению болезней во многих странах снова ставят вирус натуральной оспы на первое место в списке потенциальных агентов массового поражения. Необходимо отметить, что для многих вновь возникающих инфекций нет ни средств специфического лечения, ни эффективных способов профилактики.

Вместе с тем, гибридомная технология, разработанная Kohler & Milstein (1975) для получения клеточных гибридов, гибридом, синтезирующих моноклональные антитела (МКА) предопределенной специфичности и высокого аффинитета, позволила вывести на новый уровень понимание многих структурно-функциональных особенностей биологических объектов, в том числе вирусов. Создание гибридомной технологии и изучение свойств МКА стимулировали проведение исследований на уровне аминокислотной последовательности вирусных белков в отношении многих вирусов патогенных для человека. Использование современных молекулярно-биологических методов в сочетании с МКА позволило получить целый комплекс новых фундаментальных данных: о структуре и функции вирусных белков; о природе взаимодействия антигена и антитела, о структуре вирусных антигенных детерминант и их функциях. Так, изучение взаимодействия МКА с вирусными белками и их рекомбинантными аналогами в системах in vivo и in vitro позволило идентифицировать наиболее важные структурные участки вирусных белков и локализовать их на аминокислотной последовательности, выявить особенности строения вирионов, получить новую информацию о роли вирусных белков в формировании противовирусного иммунитета. Именно с этими исследованиями из области молекулярной вирусологии и иммунной биотехнологии связывается дальнейший прогресс в изучении структуры и функций вирусных белков и на его основе создания новых более эффективных методов иммунодиагностики вирусных заболеваний, способов профилактики и средств специфического лечения. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является получение с помощью моноклональных антител комплекса новых данных о структурно-функциональных свойствах белков вирусов патогенных для человека.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Освоить комплекс методов по технологии получения гибридом и создать коллекцию гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурным белкам вирусов патогенных для человека.

2. Получить и очистить моноклональные антитела, исследовать их иммунобиологические свойства и сформировать представительные панели МКА к структурным белкам вирусов.

3. Провести с помощью панелей моноклональных антител изучение структурных белков вирусов патогенных для человека, в том числе филовирусов, вирус Марбург (ВМ) и вирус Эбола (ВЭ), флавивирусов, вирус Западного Нила (ВЗН), ортопоксвирусов, вирус эктромелии (ВЭм), вирус осповакцины (ВОВ), вирус оспы коров (ВОК), вирус натуральной оспы (ВНО), в следующих направлениях:

- выявление и изучение перекрестно-реактивных антигенных детерминант на белках филовирусов Марбург и Эбола;

- определение иммунобиологической активности МКА, реагирующих с эпитопами белков УР35 и УР40 вируса Марбург (ВМ);

- исследование роли М5, УР35 и УР40 белков филовирусов в формировании противовирусного иммунитета;

- поиск и изучение перекрестно-реактивных и видоспецифических антигенных детерминант и эпитопов белков ортопоксвирусов;

- исследование антигенной изменчивости штаммов ВЗН, выделенных в России и в ближнем зарубежье;

- сравнительное изучение антигенной схожести вирусных белков и их рекомбинантных аналогов;

- детальное картирование эпитопов белка УР35 вирусов Эбола и Марбург и гликопротеина Е ВЗН; проведение сравнительного анализа противовирусной активности гибридомных и рекомбинантных одноцепочечных и гуманизированных антител против белка Е ВЗН. Научная новизна

Создание коллекции гибридных клеточных линий, гибридом, продуцентов антител к вирусным антигенам, и формирование представительных панелей МКА стимулировали исследование вирусов на стыке трех наук, вирусологии, иммунологии и молекулярной биологии. С помощью МКА был проведен цикл работ по изучению антигенной структуры и картированию антигенных детерминант структурных белков флавивирусов, ортопоксвирусов, филовирусов и других вирусов, патогенных для человека. Проведенное исследование позволило получить комплекс новых данных по антигенной структуре изучаемых вирусов и уточнить функции вирусных белков в процессе формирования противовирусного иммунитета.

Так использование моноклональных антител позволило получить приоритетные данные по антигенной структуре нуклеокапсидных, МР и УР35, и матриксного УР40 белков вирусов Марбург и Эбола и ее роли в формировании противовирусного иммунитета.

Впервые обнаружено наличие общей перекрестно-реактивной антигенной детерминанты на нуклеотидных белках 1чГР и УРЗ 5 вирусов Марбург и Эбола.

С помощью МКА проведено топологическое картирование эпитопов белков ЫР, УР40 и УРЗ 5 вируса Марбург. Установлено, что 7 эпитопов на структурных белках УРЗ5 и УР40 вируса Марбург, взаимно перекрываясь, образуют функциональный домен, индуцирующий синтез МКА. Именно эти МКА проявляли антивирусную активность - в присутствии комплемента они вызывали лизис клеток, инфицированных вирусом Марбург. В ходе уточнения роли антигенных детерминант на белке УР40 ВМ было выявлено 2 эпитопа, которые индуцируют синтез протективных антител В-клетками. Предварительное введение этих МКА в морских свинок защищает их от гибели при заражении ВМ.

В результате исследования закономерностей формирования противовирусного иммунитета на белки филовирусов обнаружено, что иммунный ответ, как на введение вирусного антигена, так и, по-видимому, в процессе начального развития филовирусной инфекции у выживших животных, формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные КР и УРЗ 5 белки и УР40 матриксный белок.

Анализ антигенной структуры белков филовирусов (ЫР, УР40, УРЗ 5 ВМ и УРЗ 5 ВЭ) и их рекомбинантных аналогов показал, что не только рекомбинантные белки, но и их фрагменты могут сохранять антигенную конформацию вирусных белков. Используя МКА и фрагменты рекомбинантных аналогов вирусных белков, впервые удалось провести картирование антигенных детерминант и эпитопов на аминокислотной последовательности УР35 белков вирусов Марбург и Эбола.

В результате анализа взаимодействия МКА с ортопоксвирусами была выявлена высокая перекрестная реактивность МКА против ВЭм с патогенными для человека ортопоксвирусами - ВОВ, ВОК и вирусом натуральной оспы. Было обнаружено, что белки слияния ВЭм (ген 129Ь), ВОВ (ген А27Ь), ВОК и ВНО (ген АЗОЬ) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и ВНО; исследованные рекомбинантные полипептиды рг129Ь (ВЭм) и ргАЗОЬ (ВНО) имитируют эти вирусные эпитопы.

С помощью нейтрализующих МКА против штамма У^99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов ВЗН, циркулирующих в Евразии. Многие штаммы вели себя как типичные антигенные мутанты и были способны избегать нейтрализующего действия МКА, например, штаммы Нр-94 и Тиг-2914, у которых выявлены различия в нейтрализации по 7 эпитопам. Даже штаммы У^99-27889 и У^00-27924, выделенные в Волгограде с интервалом в один год, показывали вариабельность в реакции нейтрализации по 4 эпитопам.

В результате анализа взаимодействия МКА с рекомбинантными пептидами белка Е ВЗН продемонстрировано наличие двух дискретных районов, вовлеченных в процессы (РН и РТГА) взаимодействия вируса с клеткой. Это район 321-466 ао белка Е ВЗН, несущий эпитопы для МКА, нейтрализующих все исследуемые штаммы ВЗН, и включающий домен III (305-394 ао) белка Е ВЗН. Второй район взаимодействия нейтрализующих МКА был локализован между 1-126 ао, которые включают аминокислотные остатки I и II доменов Е белка и, в частности, пептид слияния (98-113 ао) белка Е ВЗН, который участвует в проникновении вируса в клетку.

В результате сравнительного изучения иммунобиологической активности МКА 9Е2 и их рекомбинантных аналогов (одноцепочечных и гуманизированных антител) было обнаружено, что рекомбинантные аналоги сохранили конформацию вариабельного домена исходных гибридомных антител, определяющего способность взаимодействовать с эпитопами гликопротеина Е ВЗН и нейтрализовать in vitro инфекционность вирионов ВЗН. Нейтрализующая активность полученных гуманизированных антител Fc-9Е2 в разведении 1/1024000 против 100 ТЦД50 ВЗН была сравнима с таковой гибридомных антител.

Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены патентами и авторскими свидетельствами: № 2142507; № 2281327; №2265658; № 2144565 и отражены в публикациях в реферируемых отечественных и зарубежных журналах и изданиях.

Практическая ценность работы.

В результате проделанной работы был успешно создан банк гибридом ГНЦ ВБ "Вектор", в котором депонировано более чем 700 гибридом, секретирующих моноклональные антитела (МКА) к различным биологически активным молекулам и к структурным белкам патогенных для человека вирусов: к вирусам Японского энцефалита, Венесуэльского энцефаломиелита лошадей; восточного энцефаломиелита лошадей, клещевого энцефалита, к белку р24 вируса иммунодефицита человека типа 1, к вирусу иммунодефицита человека типа 2, к вирусам полиомиелита тип 2, гепатита В, гепатита А, а также к филовирусам, вирус Марбург и вирус Эбола; к ортопоксвирусам, включая вирус эктромелии, вирус осповакцины, вирусы оспы коров; к флавивирусам, вирус Западного Нила. Полученные гибридомы и в настоящее время могут быть успешно использованы, как штаммы-продуценты для получения МКА.

Сформированная коллекция гибридом и полученные панели МКА с изученными свойствами к структурным белкам вирусов могут быть использованы для развития прикладных исследований в области иммунодиагностики вирусных инфекций: в диагностических целях для создания диагностических препаратов и тест-систем; в качестве средств контроля в производстве иммунобиологических препаратов; в качестве лигандов для аффинной хроматографии и с целью очистки биомолекул из сложных биологических смесей.

В то же время, представленные научные результаты по изучению антигенной структуры и функций вирусных белков могут способствовать развитию и созданию не только иммунодиагностических, но и иммубиологических препаратов для профилактики и защиты от патогенных для человека вирусов.

Исследуемые в работе рекомбинантные белки и полипептиды филовирусов (вирусы Марбург и Эбола), ортопоксвирусов (ВНО и ВЭм) и флавивирусов (ВЗН) могут быть использованы в качестве антигена, как для разработки иммунодиагностических тест-систем, так и профилактических препаратов.

Полученные и описанные в работе гуманизированные вируснейтрализующие антитела против ВЗН являются, на наш взгляд, перспективными для разработки препаратов нового поколения для профилактики и терапии лихорадки Западного Нила.

В представляемой диссертационной работе на защиту выносятся следующие положения:

1. Создание оригинальной коллекции гибридом, которые и в настоящее время могут быть успешно использованы как штаммы-продуценты, секретирующие моноклональные антитела к структурным белкам вирусов патогенных для человека, позволяет обеспечивать научные и экспериментально-производственные исследования стабильными, очищенными, гомогенными и высокоаффинными препаратами антител с определенной специфичностью.

2. Наборы очищенных препаратов МКА с изученными свойствами, панели МКА, могут быть успешно использованы для изучения структурных белков вирусов патогенных для человека, включая филовирусы (вирусы Марбург и Эбола), флавивирусы (вирус Западного Нила), ортопоксвирусы (ВЭм, ВОВ, ВОК и ВНО).

3. Нуклеокапсидные, и УР35, и матриксные УР40 белки филовирусов играют значительную роль в формировании защитного иммунного ответа организма: так в процессе развития филовирусной инфекции иммунный ответ у переболевших животных формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные, и УР35, и УР40 матриксный белки филовирусов, что, возможно, является определяющим фактором выживания.

4. Белки слияния ВЭм (ген 129Ь), ВОВ (ген А27Ь), ВОК и ВНО (ген АЗОЪ) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и вируса натуральной оспы.

5. Современные штаммы ВЗН, циркулирующие в Евразии, обладают значительными антигенными отличиями: с помощью панели МКА против штамма У^99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, на структурных белках ВЗН выделено не менее 13 различных эпитопов (11 из которых расположено на Е гликопротеине). Кроме того, выявлены максимальные антигенные различия в реакции нейтрализации у штаммов Нр-94 (год выделении 1963) и Тиг-2914 (год выделении 1973), у которых, по-видимому, изменено по 7 эпитопов на белке Е ВЗН.

6. Получены МКА с нейтрализующей активностью против 7 исследованных штаммов ВЗН, которые являются перспективными для создания иммунодиагностических наборов и, возможно, для разработки препаратов для иммунотерапии тяжелых случаев лихорадки Западного Нила. Так, на наш взгляд, высоко активные гуманизированные нейтрализующие антитела Рс-9Е2 привлекательны для будущего конструирования и создания нового антивирусного препарата для лечения лихорадки Западного Нила.

7. Используемая нами методология, включающая объединенное применение двух инструментов исследования, панели МКА и набора антисывороток, а также рекомбинантных белков и их фрагментов, с изученными свойствами, позволяет расширить наши возможности при картировании и перейти к локализации эпитопов связывания с МКА на аминокислотной последовательности вирусных белков.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на следующих международных или всесоюзных конференциях, симпозиумах, семинарах:.

Third Congress of the European Society for Veterinary Virology, Immunobiology of Viral Infection, Interlaken, Switzerland, September 4-7, 1994; First European Meeting of Virology, Wurzburg, Germany, September 10-13, 1995; Vth International Congress on the Impact of Viral Diseases in the Developing World, Johannesburg, South Africa, July9-14, 1995; Xth International Congress of Virology (Jerusalem, Izrael, 1996); Russian-German colloquium on filoviruses: the modern state of problem (Koltsovo, Novosibirsk region, Russia, 1997); Vlth Biological Medical Defense Conference (Munich, Germany, 1999); Inauguration of the Swedish Containment Laboratories (Stockholm, Sweden, 2000); IX Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии (Крым, Гурзуф, Украина, 2001); VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций, ИБХ РАН (Москва, Россия, 2001); 3-й Ежегодный семинар, посвященный рассмотрению программы научных исследований в области биозащиты (Санкт-Петербург, Россия, 2003).

Связь выполненной работы с планом научных исследований

Работа выполнена в ГНЦ ВБ «Вектор» (1982-2007 гг) в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению «Изучение структурно-функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных» и ряда других научно-исследовательских работ и научно-технических программ Центра. Исследования были также поддержаны государственной программой «Новейшие методы биоинженерии», «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов», контракт № 43.035.11.1529 (рук. Чепурнов A.A.); проектами Международного научно-технического центра (МНТЦ) ISTC № 1198 (рук. Покровский А.Г.) и ISTC № 2087 (рук. Локтев В.Б.), грантами российского фонда фундаментальных исследований № 97-04-49697-а (рук. Разумов И.А.), №98-04-49439-а (рук. Нетесов C.B.), 01-04-49877-а (рук. Качко A.B.), №01-04-48972-а (рук. Разумов И.А.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 35 статей, получено 4 патента на изобретения штаммов гибридных клеток, представлено более 35 тезисов. Все исследования выполнены в ГНЦ ВБ «Вектор». Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом, под его руководством и в соавторстве с дбн В.Б. Локтевым (глава 3), кбн Е.В. Агапов (раздел 3.1), кбн A.B. Перебоев (раздел З.1., 3.8), Е.Е. Коноваловым (раздел З.1., 3.7), кбн В.А. Святченко (раздел 3.1 и 3.8), кбн Е.В. Протопопова (раздел 3.1 и 3.7), кбн Е.И. Казачинская (раздел 3.1 - 3.5., 3.7 и 3.8), дбн, чл-корр. РАН C.B. Нетесов (раздел 3.1-3.5), кбн A.A. Букреев (раздел 3.2, 3.4 и

3.5), кбн A.A. Чепурнов (раздел 3.2-3.5), кбн A.A. Беланов (раздел 3.2, 3.3 и

3.6), Н.И. Бормотов (раздел 3.2, 3.3 и 3.6), кбн A.B. Качко (раздел 3.4., 3.5., 3.7 и 3.8), кбн A.B. Сорокин (раздел 3.4., 3.5 и 3.8), A.B. Иванова (раздел 3.4., 3.5 и

3.7), дбн Е.И. Рябчикова (раздел 3.4), кбн В.А. Терновой (раздел 3.4 и 3.5), Т.Н. Рудзевич (раздел 3.4 и 3.5), дбн С.Н. Щелкунов (раздел 3.6), кбн И.П. Гилева (раздел 3.6), кбн Г.В. Кочнева (раздел 3.6), М.А. Васильева (раздел 3.6), кбн Т.С. Непомнящих (раздел 3.6), а также с некоторыми другими соавторами, ссылки на которых даны в тексте данной работы при описании конкретных результатов исследований. Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам за сотрудничество.

Искренне признателен за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту д.б.н., проф. Локтеву Валерию Борисовичу.

Выражаю глубокую благодарность за критические замечания и помощь при обсуждении и оформлении диссертационной работы моим коллегам д.х.н., проф. Малыгину Эрнст Георгиевичу и д.б.н. Татькову Сергею Ивановичу.

Объем и структура работы Диссертация изложена на 329 страницах, включающих 33 рисунка и 51 таблицу и список литературы (316 ссылок). Работа состоит из введения, трех глав (глава 1 - «Обзор данных литературы»; глава 2 - «Экспериментальная часть»; глава 3 - «Результаты и обсуждение исследований»), заключения, выводов, списка литературы и приложения.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Разумов, Иван Алексеевич

ВЫВОДЫ.

1. Созданы и заложены на хранение (-196°С) в банк гибридом ГНЦ ВБ "Вектор" уникальные коллекции гибридных клеток-продуцентов, более чем 700 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к различным биологически активным молекулам и к структурным белкам патогенных для человека вирусов, в том числе, к филовирусам, вирус Марбург (ВМ) (21 гибридома) и вирус Эбола (ВЭ) (38 гибридом); к ортопоксвирусам, вирус эктромелии (ВЭм) (125 гибридом), вирус осповакцины (ВОВ) (27 гибридом), вирусы оспы коров (ВОК) (9 гибридом); к флавивирусам, вирус Западного Нила (ВЗН) (25- гибридом).

2. В результате использования панели МКА против структурных белков вирусов Марбург и Эбола получены приоритетные данные по антигенной структуре нуклеокапсидных, NP и VP35, и матриксного VP40 белков и их роли в формировании иммунного ответа:

- впервые показано, что белки NP и YP35 вирусов Марбург и Эбола содержат перекрестно-реактивные антигенные детерминанты, взаимодействующие с моноклональными и поликлональными антителами против филовирусов;

- впервые установлено, что МКА к NP, VP35 и VP40 белкам ВМ обладают антивирусной активностью - вызывают in vitro лизис инфицированных клеток в присутствии комплемента; а предварительное введение морским свинкам МКА к белку VP40 ВМ ингибирует развитие филовирусной инфекции у животных;

- обнаружено, что иммунный ответ, как при иммунизации инактивированным вирусом, так и в процессе развития филовирусной инфекции у выживших животных, формируется, прежде всего, на нуклеокапсидные, NP и VP35, и VP40 матриксный белки;

- выявлено, что вирусные белки (NP, VP40, YP35 ВМ и VP35 ВЭ) и их рекомбинантные аналоги, полученные в результате экспрессии полноразмерного гена вирусного белка в E.coli, при введении в животных индуцируют синтез противовирусных антител, которые перекрестно реагируют с этими белками, что указывает на близкое сходство антигенной структуры вирусных белков и их рекомбинантных аналогов.

3. Впервые на структуре белка УР35 ВМ выявлено две антигенных детерминанты, по одной на ]Ч-концевой и С-концевой части последовательности, соответственно. Одна антигенная детерминанта локализована между 251-278 ао с помощью МКА, а вторая между 1-174 ао с помощью поликлональных антител;

- при картировании белка УР35 ВЭ впервые показано, что первые 86 аминокислотных остатков Ы-концевой части последовательности принципиально важны для формирования антигенной структуры белка. Причем первые 36 ао 1\[-концевой части УР35 определяют формирование не менее двух эпитопов для МКА.

4. В результате анализа взаимодействия панели МКА с ортопоксвирусами выявлено наличие родоспецифических антигенных детерминант, определяющих перекрестную реактивность МКА против ВЭм с патогенными для человека ортопоксвирусами - ВОВ, ВОК и вирусом натуральной оспы:

- так 112 типов МКА 90%), из 125 исследованных МКА против ВЭм, перекрестно взаимодействовали с антигенными детерминантами ВОВ и ВОК, и лишь 12 типов МКА (~ 10%) реагировали только с видоспецифическими детерминантами белка слияния ВЭм (ген 129Ь);

- белки слияния ВЭм (ген 129Ь), ВОВ (ген А27Ь), ВОК и ВНО (ген АЗОЬ) содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против ВОВ и ВНО; исследованные рекомбинантные полипептиды рг129Ь (ВЭм) и ргАЗОЬ (ВНО) имитируют эти вирусные эпитопы.

5. С помощью панели МКА против штамма У^99-27889, выделенного в 1999 году в Волгограде, выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов ВЗН, циркулирующих в Евразии:

-на структурных белках ВЗН выделено не менее 13 различных эпитопов (11 из которых расположено на Е гликопротеине), которые разделены на 4 группы при обобщении данных по перекрестной реактивности МКА с вирионами 7 штаммов ВЗН и вирусом КЭ. МКА, взаимодействующие с группой I, способны нейтрализовать все 7 исследуемых штаммов ВЗН. Нейтрализующая активность МКА групп II-IV являлась вариабельной. Максимальные различия в реакции нейтрализации выявлены у штаммов Нр-94 и Tur-2914, у которых, по-видимому, изменены 7 эпитопов.

6. Продемонстрировано наличие двух дискретных районов белка Б ВЗН, вовлеченных в реакции (РН и РТГА) взаимодействия вируса с клеткой. Это район ао 321-466, включающий домен III (305-394 ао) белка Е ВЗН и несущий эпитопы для МКА, нейтрализующих все исследуемые штаммы ВЗН. Второй район взаимодействия нейтрализующих МКА был локализован между ао 1-126. Эта последовательность включает аминокислотные остатки I и II доменов Е белка и, в частности, пептид слияния (98-113 ао) белка Е ВЗН, который участвует в проникновении вируса в клетку.

7. Получены рекомбинантные аналоги нейтрализующих МКА 9Е2, одноцепочечные scFv 9Е2 и гуманизированные Fc-9E2 антитела, которые сохранили способность взаимодействовать с эпитопами гликопротеина Е ВЗН и нейтрализовать in vitro инфекционность вирионов ВЗН. Нейтрализующая активность полученных гуманизированных антител Fc-9E2 сравнима с таковой у гибридомных антител.

Заключение.

В ходе проделанной работы был освоен комплекс методов по получению гибридом и характеристике антител и на основании этой технологии был создан банк гибридом ГНЦ ВБ "Вектор", в котором хранятся уникальные коллекции гибридных клеток-продуцентов, более чем 700 гибридом ('— более 5000 ампул), секретирующих моноклональные антитела (МКА) к различным антигенам, в том числе, к патогенным для человека агентам: к вирусам полиомиелита тип 2, гепатита В, гепатита А, вируса иммунодефицита человека типа 2, к белку р24 вируса иммунодефицита человека типа 1 и к структурным белкам альфавирусов (вирусы венесуэльского энцефаломиелита лошадей и восточного энцефаломиелита лошадей), флавивирусов (вирусы клещевого энцефалита, лихорадки Западного Нила и Японского энцефалита), ортопоксвирусов (вирусы эктромелии, осповакцины, оспы коров) и филовирусов (вирусы Марбург и Эбола).

Одним из подходов, используемых в ходе выполнения данной работы, является применение МКА специфичных к вирусным белкам, как инструмента для изучения антигенной структуры и роли определённых вирусных белков в формировании иммунного ответа. МКА с этой целью были получены и охарактеризованы по ряду свойств. Получение и использование панели МКА с определенными свойствами для изучения структурных белков филовирусов, вирусы Марбург (штамм Popp) и Эбола (штамм Mayinga), в направлении: выявление антигенной и перекрестно-реактивной структуры, биологической (противовирусной) активности и закономерностей формирования противовирусного иммунитета позволили получить ряд принципиально новых результатов: впервые была показана взаимная перекрестная активность поликлональных и моноклональных антител, специфичных к ВЭ с антигеном ВМ, а антител поликлональных сывороток, специфичных к ВМ, с антигеном ВЭ. Кроме того, методом иммуноблота с использованием поликлональных и моноклональных антител против вируса Эбола нами были выявлены, что белки NP и VP35 филовирусов содержат перекрестно-реактивные антигенные структуры;

- впервые было установлено, что МКА, специфичные к нуклеокапсидным (NP и VP35) и матриксному (VP40) белкам вируса Марбург обладают антивирусной активностью in vitro - вызывают специфический лизис инфицированных клеток в присутствии комплемента;

- анализ полученных нами данных, по пассивной защите животных, сероконверсии вируса, а так же патоморфологии внутренних органов экспериментальных животных, позволяет утверждать, что введение антивирусных МКА 5G9 и 5G8, специфичных к матриксному белку VP40 ВМ, ингибирует развитие инфекционного заболевания на ранних стадиях, предохраняя организм морских свинок от летального развития патологического процесса. Подобный феномен указывает, по нашему мнению, на наличие способности белка VP40 вируса Марбург индуцировать синтез защитных антител B-клетками при иммунизации животных; с помощью МКА и поликлональных антител позитивных сывороток было обнаружено, что при иммунизации животных инактивированными препаратами филовирусов формируется иммунный ответ, прежде всего на внутренние NP и VP35 нуклеокапсидные белки и VP40 матриксный белок.

С целью изучения антигенной структуры индивидуальных вирусных белков, мы использовали рекомбинантные белки и МКА, как инструмент выявления и идентификации эпитопов на вирусных и рекомбинантных белках. В результате сравнительного изучения вирусных белков, NP, VP40, VP35 вируса Марбург и VP35 вируса Эбола, и их рекомбинантных аналогов с помощью специфических моноклональных и поликлональных антител было обнаружено,

- вирусные и рекомбинантные белки, полученные в результате экспрессии полноразмерного гена белка в E.coli, имеют выраженные иммуногенные структуры, которые активно распознаются иммунной системой животных.

Причем индукция антител к вышеуказанным вирусным белкам возникает как в ответ на введение вирусного антигена, так и, по-видимому, в процессе развития филовирусной инфекции при инфицировании животных.

- противовирусные антитела, которые индуцируются у животных в ответ на введение вирусного белка или его рекомбинантного аналога, обладают перекрестной реактивностью по отношению к данным белкам, что указывает на близкое сходство, если не идентичность их антигенной структуры.

Детальное картирование эпитопов структурных вирусных белков, используя моноклональные антитела, рекомбинантные белки и их фрагменты; позволили получить новые данные:

- построены топологические карты антигенной структуры трех белков ВМ, УР35, УР40 и 1МР: на нуклеопротеине определено 2 сайта, включающих 4 эпитопа; на УР35 - 2 сайта (4 эпитопа); на УР40 - 2 сайта (7 эпитопов). В результате сравнения перекрывания на топографичекой карте эпитопов этих сайтов было обнаружено, что 7 эпитопов этих белков (2 эпитопа М5, 3 эпитопа УР40 и 2 УР35) взаимно перекрываются, образуют функциональный домен, индуцирующий комплемент-зависимый лизис инфицированных клеток и синтез защитных антител (МКА 5в9 и 508);

- впервые на структуре белка УР35 ВМ было выявлено две антигенных детерминанты, по одной на И-концевой и С-концевой части последовательности, соответственно. Один антигенный участок, названный нами доминантным антигенным районом (ДАР) был локализован между 251278 ао с помощью моноклональных антител. Месторасположения другого антигенного участка было выявлено между 1 и 174 ао с помощью поликлональных антител антивирусных сывороток;

- результаты по картированию белка УР35 ВЭ впервые показали, что первые 86 аминокислотных остатков 1Ч-концевой части УР35 ВЭ принципиально важны для формирования антигенной структуры УР35 и содержат, по-видимому, эпитопы различных антигенных детерминант. Причем первые 36 аминокислотных остатков Ы-концевой части УР35 предопределяют формирование двух эпитопов для МКА 1С6 и 6Р7.

В результате анализа перекрестного взаимодействия анти-ортопоксвирусных МКА с патогенными и непатогенными для человека ортопоксвирусами было обнаружено,

- из 125 исследованных МКА против ВЭм 112 типов МКА перекрестно взаимодействовали с антигенными детерминантами ВОВ и ВОК и лишь 12 типов МКА реагировали только с вирусом эктромелии (штамм К1);

- детальный анализ взаимодействия панели МКА против ортопоксвирусов с белками слияния 14 кДа вирусов эктромелии (ген 129Ь) и натуральной оспы (ген АЗОЬ) и их рекомбинантными аналогами, рг129Ь и ргАЗОЬ, указывает на наличие, как минимум, трех различных групп эпитопов на белке слияния ортопоксвирусов. Группа эпитопов 1 является видоспецифической, так как МКА (12 типов) к ней взаимодействуют только с ВЭм. А остальные эпитопы групп 2 и 3 могут быть отнесены к родоспецифическим. МКА (10 типов) к этим эпитопам перекрестно-реагируют с такими ортопоксвирусами как ВЭм, ВОВ, ВОК и ВНО. Кроме того, эпитопы группы 3, распознаваемые 5 типами МКА, вовлечены в индукцию вируснейтрализующих антител.

- белки слияния ВЭм, ВОВ, ВОК и ВНО содержат общие перекрестно-реактивные эпитопы, способные индуцировать синтез В-клетками вируснейтрализующих антител против вируса натуральной оспы, и что рекомбинантные полипептиды рг129Ь (ВЭм) и ргАЗОЬ (ВНО) имитируют эти эпитопы.

Проведенное исследование с использованием нейтрализующих МКА антигенной вариабельности штаммов ВЗН, изолированных из различных регионов России и за рубежом, позволило заключить:

- впервые создана коллекция из шестнадцати гибридом, продуцирующих нейтрализующие МКА против штамма У^99-27889 ВЗН, выделенного в 1999 году от погибшего человека в течение вспышки лихорадки Западного Нила в Волгограде, Россия. Нейтрализующие МКА были разделены на 4 группы на основе перекрестной реактивности в реакции нейтрализации, иммуноблоте, РТГА, реактивности в ИФА с 7 штаммами ВЗН. Обобщение данных по перекрестной реактивности МКА с вирионами этих штаммов ясно указывает, что на структурных белках ВЗН имеется не менее 13 различных эпитопов, узнаваемых нейтрализующими МКА, большинство из которых расположено на Е гликопротеине;

- выявлена значительная антигенная вариабельность современных штаммов вируса Западного Нила, циркулирующих в Евразии. Так МКА группы I были способны нейтрализовать следующие штаммы ВЗН Vlg99-27889, VlgOO-27924, Нр-94 (Астраханская обл.), А-1640 (Азербайджан), А-72 (Россия), Tur-2914 (Туркмения) и EglOl. Нейтрализующая активность МКА групп II-IV по отношению к этим штаммам ВЗН была вариабельной. Многие штаммы вели себя как типичные антигенные мутанты и были способны избегать нейтрализующего действия МКА. Даже штаммы Vlg99-27889 и VlgOO-27924, выделенные в Волгограде с интервалом в один год, показывали необычную вариабельность в реакции нейтрализации при использовании "полученной панели нейтрализующих гибридомных антител;

- мозаичная нейтрализующая активность МКА и взаимодействие в ИФА указывают, по-видимому, на два вида антигенной вариабельности характерной для штаммов ВЗН. Первый тип антигенной вариабельности связан с наличием эпитопов для взаимодействия МКА, но отсутствием нейтрализующего эффекта. Второй тип антигенной вариабельности связан со структурными изменениями эпитопов и потерей способности МКА, взаимодействовать с этими эпитопами;

В ходе детального изучения антигенной структуры белка Е ВЗН было продемонстрировано наличие двух дискретных районов белка Е, вовлеченных в процесс нейтрализации ВЗН и ингибирования (торможения) реакции гемагглютинации. Это район 321-466 ао, в который входит домен III (304-395 ао), белка Е, несущий эпитопы для МКА 9Е2, 7G9, 11G3 и 7Е6 из группы 1а (взаимодействие с пептидом 260-466 ао и не реагирование с пептидом 1-321 оа), нейтрализующих все исследуемые штаммы. Второй район взаимодействия нейтрализующих МКА (реагирование МКА с пептидами 1-86 и 53-126 ао) был локализован между аминокислотными остатками 1-126, которые включают аминокислотные остатки I и II доменов Е белка. Внутри этой последовательности расположен пептид слияния (98-113 ао) белка Е ВЗН, который участвует в процессе проникновения вируса в клетку.

Совокупность представленных нами результатов по сравнительному изучению свойств гибридомных МКА 9Е2 и их рекомбинантных аналогов, одноцепочечных бсРу 9Е2 и гуманизированных Рс-9Е2 антител, позволяют утверждать:

- полученные рекомбинантные антитела сохранили конформацию вариабельного домена исходных МКА 9Е2 и способны взаимодействовать с эпитопами поверхностного гликопротеина Е ВЗН, штаммов У1§99-27889 и У1§00-27924, циркулирующих на территории России;

- при взаимодействии с ВЗН рекомбинантные антитела (бсБу 9Е2 и Рс-9Е2) проявляют свойство гибридомных МКА 9Е2, способность нейтрализовать инфекционность вирионов ВЗН, исследуемых штаммов У1§99-27889 й Е^ДОГ. Нейтрализующая активность полученных гуманизированных антител Рс-9Е2 в разведении 1/1024000 против 100 ТЦД50 вирионов штаммов У1§99-27889 и Eg 101 ВЗН сравнима с таковой гибридомных антител и лишь несколько ниже (в разведении 1/12800 для Рс-9Е2 вместо 1/1024000 для МКА 9Е2) против 1000 ТЦД50 штамма У^99-27889 ВЗН;

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Разумов, Иван Алексеевич, 2008 год

1. Агафонов А.П. Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов вируса Марбург: Автореферат диссертации канд. биол. наук. Кольцово. 1996.-21с.

2. Агафонов А.П., Игнатьев Г.М., Кузьмин В.А., Акименко 3.JL, Косарева Т.В., Кашенцева Е.А. // Иммуногенные свойства белков вируса Марбург. -Вопр. вирусол. 1992. - Т.31, N1. - С. 58-61.

3. Беклемишев А.Б. 1995. Протективная активность белков оболочки вируса осповакцины, выделенных с использованием неионных детергентов. //Вопр. Вирусол. 40(4), 154-158.

4. Берзовски Д., Берковер Д. Взаимодействие антиген- антитело. // Иммунология (под ред. У.Пол). Мир, Москва (1989). Том 3, с.5-89.

5. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. под ред. - М., Медицина, 1982. - С. 46-87.

6. Борисевич В.Н., Михайлов В.В., Краснянский Б.П. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулинов против лихорадки Эбола. //Журнал «Вопросы вирусологии» N6 (1996). Том 41, с.270-273.

7. Ю.Букреев A.A., Скрипченко A.A., Гусев Ю.М. и др. Перспективный метод препаративной наработки и очистки вируса Марбург. //Журнал «Вопросы вирусологии» N 4 (1995). Т. 40,-с. 161-165.

8. Волкова Т.Д., Вольпина О.М., Иванова В.Т., Рубин С.Г., Семашко И.В., Каравано A.C. (1998) Изучение антигенной структуры вируса клещевого энцефалита с помощью синтетических пептидов. //Биорганическая химия, Т.24, №2, С. 100-111.).

9. Гайдамович С.Я., Логинов Н.Б. Общая и частная вирусология. Под ред. 1982. Семейство Togaviridae., M., Т.2.-С.49-94.

10. Н.Гендон Ю.З. Прогресс в разработке вирусных полинуклеотидных (ДНК) вакцин. //Журнал «Вопросы вирусологии» N4 (2001). Том 44, сЛ48-1547

11. Дебабов Д.В. Гетерологичная секреция в системе Escherichia coli. //Журнал «Молекулярная биология» N 3 (1994). Том 28. С.496-505.

12. Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Стрельцова М.А. и др. Сравнительное изучение некоторых иммунологических показателей при введенииинактивированного вируса Марбург морским свинкам. //Журнал «Вопросы вирусологии» N2 (1991). Том 36, с.421-423.

13. Казачинская Е.И., Терновой В.А., Рудзевич Т.Н., Нетесов С.В., Чепурнов A.A., Разумов И.А. Исследование антигенной структуры белка VP35 вируса Эбола. //Журнал «Вопросы вирусологии» N5 (2001), с.25-31.

14. Казачинская Е.И., A.B. Перебоев, A.A. Чепурнов, Е.Ф, Беланов, И.А. Разумов. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеристика и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург.//Вопр. Вирусологии 2000 г.,-т.45, N3.- С.40-44.

15. Локтев В.Б. Диссертация доктора биол. наук. Кольцово. ГНЦВБ «Вектор»(1993).

16. Леннет Э., Н.Шмидт. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний. //Москва, "Медицина" 1974, с. 44, 95.

17. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. КМК Scientific Press Ltd., Москва.-1998.-386с.

18. Маркин В.А., Михайлов В.В., Краснянский Б.П., и др. //Разработка принципов экстренной профилактики и лечения лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. -1997.-Т.42. N1. - С. 31-34.

19. Машко C.B. Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. Москва, Наука (1990), с. 220-239.

20. Мертвецов Н.П., Беклемишев А.Б., Савич И.М. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин. Москва. Наука, 1987.

21. Михайлов JI.M., A.M. Титенко. Получение и характеристика моноклональных антител к антигенам Brucella abortus 19 В А. // Журнал «Биотехнология» N1 (2001). С.38-43.

22. Муравлев А.И., Агафонов А.П., Решетников С.С., Лавриненко И.А., Чешенко И.О., Беклемишев А.Б. 1995. Протективная активность белков оболочки вируса осповакцины, выделенных с использованием неионных детергентов. //Вопр. Вирусол. 40(4), 154-158.

23. Никифоров В.В., Туровский Ю.И., Калинин П.П. и др. Случай лабораторного заражения лихорадкой Марбург. //Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. -1994. - № 3. -С. 104-106.

24. Зб.Покровский А.Г., Беланов Е.Ф. Волков Г.Н. и др. Ингибирование репродукции вируса Марбург глицирризиновой кислотой и ее производными. //Доклад РАН N5 (1995). Том 344, с.709-711.

25. Стрельцова М.А. Иммунобиологическая характеристика живого и инактивированного вируса Марбург. Автореферат диссертации канд.биол.наук. Кольцово (1998).

26. Чепурнов A.A., Чернухин И.В;, Терновой В.А., Кудоярова Н.М., Махова Н.М. Азаев М.Ш. Смолина М.П. Попытка получения вакцины против лихорадки Эбола. // Журнал «Вопросы вирусологии» N 6 (1995), с. 257260.

27. Чепурнов А.А., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И. и др. Получение очищенного вируса Эбола. // Журнал «Вопросы вирусологии N 6 (1994). Т.39, с.254-257.

28. Шевченко JI.A., O.K. Бичуль, Б.Н. Мишанькин. сАМР-связывающий белок возбудителя чумы: изучение свойств с помощью полученных к нему моноклональных антител. // Журнал «Биотехнология» N4 (1996), с.42-46.

29. Adams-SC,-Broom-АК, Sammels LM, Hartnett-AG,-Howard MJ, Coelen RJ, Mackenzie JS, Hall RA. Glycosylation and antigenic variation among Kunjin vims isolates. //Virology. 1995 - Jan 10; -vol.206(l):- p.49-56.

30. Babiuk, L. A., Wardley, R.C., and Rouse, В. T. // Defense mechanisms against bovine herpesvirus: Relationship of virus-host cell events to susceptibility to antibody-complement lysis. -// Infect. Immun. 1975. - Vol. 12 - P. 958-963.

31. Baize S, Leroy EM, Mavoungou E, Fisher-Hoch SP. Apoptosis in fatal Ebola infection. Does the virus toll the bell for immune system? // Apoptosis 2000 Feb;5(l):5-7.

32. Baker O.R., Bray M., Huggins J.W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. //Antiviral. Res. -2003.-- vol.53, -p.13-23.

33. Bakonyi T, Hubalek Z, Rudolf I, Nowotny N. Novel flavivirus or new lineage of West Nile virus, central Europe. //Emerg Infect Dis. 2005 Feb;l l(2):225-31.

34. Bakonyi T, Ivanics E, Erdelyi K, Ursu K, Ferenczi E, Weissenbock H, Nowotny N. Lineage 1 and 2 strains of encephalitic West Nile virus, central Europe. //Emerg Infect Dis. -2006 Apr; - vol. 12(4): p.618-23.

35. Bazin H., Malache I.M., Nisol F., Delaunay T. 1990. Rat hybridomas and rat monoclonal antibodies. In: H.Bazin (Ed.) CRC Press, Florida, 165-201 p.

36. Beasley, D.W.C., A.D.T. Barrett. Identification of Neutralizing Epitopes within Structural Domain III of the West Nile Virus Envelope Protein. // J. Virol. -2002.-vol.76: 13097-13100.

37. Becker S, Feldmann H, Will C, Slenczka W. Evidence for occurrence of filovirus antibodies in humans and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur worldwide? // J Med Microbiol Immunol -(1992)-vol.l81:-p.43-55.

38. Becker Y. Retrovirus and filovirus «immunosuppressive motif» and the evolution of virus pathogenicity in HIV-1, HTV-2, and Ebola viruses. // Virus Genes (1995);- vol.1 l(2-3):p. 191-195.

39. Becker S, Huppertz S, Klenk HD, Feldmann H. The nucleoprotein of Marburg virus is posphorylated. // J Gen Virol 1994- vol.75:p.809-818.

40. Bukreyev A. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. // Naturwissenschaften (1999) 86, 8-17.

41. Besselaar, T.G., N.K. Blackburn. 1988. Antigenic analysis of West Nile virus strains using monoclonal antibodies. // Arch. Virol. 99:75-88.

42. Betakova T, Wolffe EJ, Moss B. //Membrane topology of the vaccinia virus A17L envelope protein. //Virology. 1999 Sep 1;261 (2):347-56.

43. Blasco R, Sisler JR, Moss B. Dissociation of progeny vaccinia virus from the cell membrane is regulated by a viral envelope glycoprotein: effect of a point mutation in the lectin homology domain of the A34R gene. // J Virol. 1993 Jun;67(6):3319-25.

44. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. -1976. -vol.72, 248-254.

45. Brinton MA, Kurane I, Mathew A, Zeng L, Shi PY// Clin Diagn Virol. -1998 -Jul 15; vol. 10(2-3):-p. 129-39. Review.

46. Buchsbaum DJ, Forero-Torres A, Lobuglio AF. TRAIL-receptor antibodies as a potential cancer treatment. // Future Oncol. 2007 Aug;3(4):405-409.

47. Bukreyev AA, Volchkov VE, Blinov VM, Dryga SA, Netesov SV. The complete nucleotide sequence of the Popp (1967) strain of Marburg virus: a comparison with the Musoke (1980) strain. // Arch Virol (1995) 140:15891600.

48. Bukreyev A, Volchkov VE, Blinov VM, Netesov SV. The VP35 and VP40 proteins of filoviruses. Homology between Mar burg and Ebola viruses. // FEBS Lett 1993-vol.322:-p.41-46.

49. Bukreyev A, Volchkov VE, Blinov VM, Netesov SV. The GP-protein of Marburg virus contains the region similar to the immunosuppressive domain of oncogenic retrovirus P15 E proteins. // FEBS Lett (1993) 323:183-187.

50. Bukreev AA, Belanov EF, Blinov VM, Netesov SV. Complete nucleotide sequences of Marburg virus genes 5 and 6 encoding VP30 and VP24 proteins. // Biochem Mol Biol Int (1995) 35:605-613.

51. Brüggemann M, Winter G, Waldmann H, Neuberger MS. The immunogenicity of chimeric antibodies. // J Exp Med. 1989 Dec l;170(6):2153-7.

52. Campbell GL, Marfin AA, Lanciotti RS, Gubler DJ. West Nile virus. // Lancet Infect Dis. 2002 Sep;2(9):519-29. Review.

53. Chan SY, Ma MC, Goldmith MA. Differential induction of cellular detachment by envelope glycoproteins of Marburg and Ebola (Zaire) viruses. // J Gen Virol (2000) Sep;81:2155-2159.

54. Chan SY, Speck RF, Ma MC, Goldsmith MA. Distinct mechanisms of entry by envelope glycoprotein of Marburg and Ebola (Zaire) viruses. // J Virology (2000) May;74(10):4933-4937

55. Chambers TJ, Hahn CS, Galler R, Rice CM. Flavivirus genome organization, expression, and replication. // Annu Rev Microbiol. 1990;44:649-88. Review.

56. Chen N., Danila M.I., Feng Z., Buller R.M.,Wang C., Han X., Lefcovitz E.J., Upton C. The genomic sequence of ectromelia virus, the causative agent of mousepox. //Virology. 2003.- vol.317,- p. 168-186

57. Cheung SC, Dietzschold B, Koprowski H, Notkins AL, Rando RF. A recombinant human Fab expressed in Escherichia coli neutralizes rabies virus. //J Virol. 1992 Nov;66(l l):6714-20.

58. Clegg J., Barber G., et al. Expression of Lassa virus nucleocapsid gene- fragments in bacteria. // Med Microbiol Immunol (1986)475(2-3):93-95.---

59. Cianciolo GJ, Copeland TJ, Oroszlan S, Snyderman R. Inhibition of lymphocyte proliferation by a synthetic peptide homologous to retroviral envelope protein. // Science (1985) 230:453-455.

60. Colcher D, Bird R, Roselli M, Hardman KD, Johnson S, Pope S, Dodd SW, Pantoliano MW, Milenic DE, Schlom J. In vivo tumor targeting of a recombinant single-chain antigen-binding protein. //J Natl Cancer Inst. 1990 Jul 18;82(14):1191-7.

61. Colcher D, Pavlinkova G, Beresford G, Booth BJ, Choudhury A, Batra SK. Pharmacokinetics and biodistribution of genetically-engineered antibodies. //Q JNucl Med. 1998 Dec; vol.42(4):p.225-231.

62. Czerny C.P., Johann S., Holzle L., Meyer H. 1994. Epitope detection in the envelope of intracellular naked orthopox viruses and identification of encoding genes. //Virology 200, 764-777.

63. Dauphin G, Zientara S, Zeller H, Murgue B. West Nile: worldwide current situation in animals and humans. //Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2004 Sep; 27(5):343-55. Erratum in: Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2005 May; 28(3):249-50.

64. Demkowicz WE, Maa JS, Esteban M. Identification and characterization of vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans. //J Virol. 1992 Jan;66(l):386-98.

65. Demkowicz WE, Maa JS, Esteban M. //Identification and characterization of vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans. J Virol. 1992 Jan;66(l):386-98.

66. Derrien M, Punjabi A, Khanna M, Grubisha O, Traktman P. Tyrosine phosphorylation of A17 during vaccinia virus infection: involvement of the HI phosphatase and the F10 kinase. //J Virol. -1999- Sep;-vol.73(9):7287-96.

67. Dessen A, Volchkov V, Dolnik 0,Klenk HD, Weissenhorn W. Crystal structure of the matrix protein VP40 from Ebola virus. // J EMBO (2000) Aug 15;19(16):4228-4236.

68. Elliott LH, McCormick JB, Johnson KM. Inactivation of Lassa, Marburg, and Ebola viruses by gamma irradiation. // J Clin Microbiol (1982) 16:704-708.

69. Elliot LH, Killey MP, McCormick JB. Descriptive analyses of Ebola virus proteins. // J Virology (1985); 147:169-176.

70. Engelstad M, Smith GL. The vaccinia virus 42-kDa envelope protein is required for the envelopment and egress of extracellular virus and for virus virulence. Virology. 1993 Jun; 194(2): 627-3 7.

71. Essani K, Dales S. Biogenesis of vaccinia: evidence for more than 100 polypeptides in the virion. Virology. 1979 Jun;95(2):385-94.

72. Feldmann H, Volchkov VE, Volchkova VA, Klenk HD. The glycoproteins of Marburg and Ebola virus and their potential roles in pathogenesis. // Arch Virol Suppl (1999);15:159-169.

73. Feldmann H, Nichol ST, Klenk HD, Peters CJ, Sanchez A. Characterization of filoviruses based on differences in structure and antigenicity of the virion glycoprotein. // Virology (1994) Mar; 199:469-473.

74. Feldmann H, Will C, Schikore M, Slenczka W, Klenk HD. Glycosylation and oligomerization of the spike protein of Marburg virus. // Virology (1991) 182:353-356.

75. Feldmann H,' Klenk H-D, Sanchez A. Molecular biology and evolution of filoviruses. // Arch Virol (1993) 7 (suppl):81-100.

76. Feldmann H, Slenczka W, Klenk HD. Emerging and reemerging of filoviruses. // Arch Virol Supp (1996) 11:77-100.

77. Feldmann H, Muhlberger E, Randolf A, Randolf A, Will C, Kiley NP, Sanchez A, Klenk HD. Marburg virus, a filovirus: Messenger RNAs, gene order, and regulatory elements of the replication cycle. // Virus Res (1992) 24:1-19.

78. Fisher L.E. Localization of antigenic sites in the primary sequence of the Sendai virus NP protein. // Intervirology (1990) Vol 31, p. 116-121.

79. Franke CA, Wilson EM, Hruby DE. //Use of a cell-free system to identify the vaccinia virus L1R gene product as the major late myristylated virion protein M25. J Virol. 1990 Dec;64(12):5988-96.

80. Franke CA, Reynolds PL, Hruby DE. Fatty acid acylation of vaccinia virus proteins. //J Virol. 1989 Oct;63 (10):4285-91.

81. Galmiche MC, Goenaga J, Wittek R, Rindisbacher L. Neutralizing and protective antibodies directed against vaccinia virus envelope antigens. Virology. 1999 Feb l;254(l):71-80.

82. Galmiche M.C., Goenaga J., Wittek R., Rindisbacher L. 1999. Neutralizing and protective antibodies directed against vaccinia virus envelope antigens. Virology 254, 71-80.

83. Gaunt MW, Sail AA, de Lamballerie X, Falconar AK, Dzhivanian TI, Gould EA. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and biogeography. J Gen Virol. 2001 Aug;82(Pt 8): 1867-76.

84. Gefler ML, Margulies DH, Scharff MD. A simple method for potyethylene glucol promoted hybridization of mouse myeloma cells. // Somat Cell Genet (1977); 3:231-236.

85. Gefter, M.L., Margulies D.H., Scharft M. D. 1977. A simple method for polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells. Somat. Cell. Genet. 3,231-236.

86. Gonzalez JP, Nakoune E, Slenczka W, Vidal P, Morvan JM. Ebola and Marburg virus antibody prevalence in selected populations of the Central African Republic. // J Microbes Infect (2000) Jan; 2(l):39-44.

87. Gordon J., Mohandas A., Wilton S., Dales S. 1991. A prominent antigenic surface polypeptide involved in the biogenesis and function of the vaccinia virus envelope. Virology 181, 671-686.

88. Hall RA, Burgess GW, Kay BH, Clancy P. Monoclonal antibodies to Kunjin and Kokobera viruses. Immunol Cell Biol. 1991 Feb;69 (Pt l):47-9.

89. Hartlieb B, Weissenhorn W. Filovirus assembly and budding. Virology. 2006 Jan 5;344(l):64-70. Review.

90. Harris DT, Cianciolo GJ, Snyderman R, Argov S, Koren HR. Ingibition of human natural killer cell activity by a synthetic peptide homologous to a conserved region in the retroviral protein, pl5E. // J Immunol (1987) 138:889894.

91. Heinz FX, Mandl CW, Holzmann H, Kunz C, Hams BA, Rey F, Harrison SC. The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization. J Virol. 1991 C)ct;65(10):5579-83.

92. Hevey M, Negley D, Geisbert J, Jahrling P and Schmaljohn A. Antigenicity and vaccine potential of Marburg virus glycoprotein. // Virology (1997) 239,206-216.

93. Hevey M, Negley D, Pushko P, Smith J and Schmaljohn A. Marburg virus vaccines based upon alphavirus replicons protect guinea pigs and nonhuman primates. // Virology (1998) 251,28-37.

94. Hevey M, Negley D, VanderZanden L at al. Marburg virus vaccines: comparing classical and new appoaches. // J Vaccine (2001), Nov 12;20(3-4):586-93.

95. Hevey Michael, Negley Diane, Geisberg Joan, Jahrling Peter and Schmaljohn Alan. //Antigenicity and vaccine potential of Marburg virus glycoprotein expressed by baculovirus recombinant. Virology. - 1997.- Vol. 239.-P. 206-216.

96. Hsiao J.C., Chung C.S., Chang W. 1999. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the adsorption of intracellular mature virions to cells. J. Virol. 73, 8750-8761.

97. Hoenen T, Volchkov V, Kolesnikova L, Mittler E, Timmins J, Ottmann M, Reynard O, Becker S, Weissenhorn W.VP40 octamers are essential for Ebola virus replication.// J Virol. 2005 Feb;79(3): 1898-905.

98. Hooper J.W., Custer D.M., Schmaljohn C.S., Schmaljohn A.L. 2000. DNA vaccination with vaccinia virus L1R and A33R genes protects mice against a lethal poxvirus challenge. Virology 266, 329-339.

99. HubalekZ. European experience with the West Nile virus ecology and epidemiology: could it be relevant for the New World? Viral Immunol. 2000; 13(4):415-26. Review.

100. Ichihashi Y., Oie M. 1988 Epitope mosaic on the surface proteins of orthopoxviruses. Virology 163, 133-144.

101. Ichihashi Y, Oie M. Epitope mosaic on the surface proteins of orthopoxviruses.//Virology. 1988 Mar;163(l):133-44.

102. Ichihashi Y, Oie M. Neutralizing epitope on penetration protein of vaccinia virus.//Virology. 1996 Jun 15;220(2):491-4.

103. Ichihashi Y. Extracellular enveloped vaccinia virus escapes neutralization.//Virology. 1996 Mar 15;217(2):478-85.

104. Ichihashi Y, Matsumoto S, Dales S. //Biogenesis of poxviruses: role of A-type inclusions and host cell membranes in virus dissemination. Virology. 1971 Dec;46(3):507-32. No abstract available.

105. Ichihashi Y, Oie M. //Adsorption and penetration of the trypsinized vaccinia virion.//Virology. 1980 Feb;101(l):50-60. No abstract available.

106. Ichihashi Y, Tsuruhara T, Oie M. The effect of proteolytic enzymes on the infectivity of vaccinia virus. //Virology. 1982 Oct 30;122(2):279-89.

107. Ichihashi Y, Oie M, Tsuruhara T. //Location of DNA-binding proteins and disulfide-linked proteins in vaccinia virus structural elements. J Virol. 1984 Jun;50(3):929-38.

108. Ichihashi Y, Oie M, Tsuruhara T. Location of DNA-binding proteins and disulfide-linked proteins in vaccinia virus structural elements. //J Virol. 1984 Jun;50(3):929-38.

109. Ichihashi Y, Takahashi T, Oie M. Identification of a vaccinia virus penetration protein.//Virology. 1994 Aug l;202(2):834-43.

110. Ignat"ev GM, Agafonov AP, Strelsova MA, Kashentseva EA. Inactivated Marburg virus elicits a nonprotective immune response in Rhesus monkeys. // J Biotechnology (1996),44:111-118.

111. Ito H, Watanabe S, Takada A, Kawaoka Y. Ebola virus glycoprotein: proteolytic processing, acylation, cell tropism, and detection of neutralizing antibodiesr// TVirol (2001) Feb;75(3)T1576=1580:

112. Jasenosky LD, Neumann G, Lukashevich I, Kawaoka Y. Ebola virus VP40-induced particle formation and association with the lipid bilayer. // J.Virol (2001) Jun;75(l 1):5205-5214.

113. Sanchez A, Kiley MP. Identification and analysis of Ebola virus messenger RNA.//Virology (1987) 157:414-420.

114. Jensen ON, Houthaeve T, Shevchenko A, Cudmore S, Ashford T, Mann M, Griffiths G, Krijnse Locker J. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis. //J Virol. 1996 Nov;70(l l):7485-97.

115. Johnson KM, Lange JV, Webb PA, Murphy FA Isolation and partial characterisation of a new virus causing acute haemorrhagic fever in Zaire. // Lancet (1977) -vol. I - P. 569-571.

116. Johnson ED, Johnson BK, Silverstein D. et al. Characterization of new Marburg virus isolated from a 1987 fatal case in Kenya. // Arch Virol Suppl (1996) 11:101-114.

117. Joklik W.K. The purification of four strains of poxvirus.//Virology — 1962-vol 18, p9-18.

118. Katz E, Moss B. //Vaccinia virus structural polypeptide derived from ahigh-molecular-weight precursor: formation -and -integration- into virusparticles. J Virol. 1970 Dec;6(6):717-26.

119. Kiley MP, Regnery RL, Johnson KM. Ebola virus: identification of virion structural proteins. // J Gen Virol (1980) 49:333-341.

120. Kiley MP, Cox NJ, Elliot LH, Sanchez A, Defries R, Buchmeier MJ, Richman DD, McCormick JB. Physicochemical properties of Marburg virus: evidence for three virus strains and their relationship to Ebola virus. // J Gen Virol (1988) 69:1557-1567.

121. Kimura-Kuroda, J., K. Yasui. Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies. //J. Gen. Virol. 1986.- 67(Pt 12):2663-2672.

122. Koch J, Liang M, Queitsch I, Kraus AA, Bautz EK. Human recombinant neutralizing antibodies against hantaan virus G2 protein. //Virology. 2003 Mar 30;308(l):64-73.

123. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature (1975), 256, 495.

124. Ksiazek T.G., Murphy F.A. Immunization against virus disease. In Fields Virology, 3-d Edition. Ed-s: B.N.Fields, D.M.Knipe, P.M.Howley, et al. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, P. 467-498.

125. Kuno G, Chang GJ, Tsuchiya KR, Karabatsos N, Cropp CB.

126. Phylogeny of the genus Flavivirus.// J Virol. 1998 Jan;72(l):73-83.

127. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature (London). 227, 680-685.

128. LeGuenno B, Formentry P, Wyers M, Gounon P, Walker F, Boesch C. Isolation and partial characterisation of new strain of Ebola virus. // Lancet (1995) 345:1271-1273.

129. Lewis AD, Chen R, Montefiori DC, Johnson PR, Clark KR. Generation of neutralizing activity against human immunodeficiency virus type 1 in serum by antibody gene transfer. J Virol. 2002 Sep;76(17):8769-75.

130. Lin T-H, Chia C-M., Hsiao J-C., Chang W., Ku C-C., Hung S-C., Tzou D-L. M. 2002. Structural Analysis of the Extracellular Domain of Vaccinia Virus Envelope Protein, A27L, by NMR and CD Spectroscopy. J. Biol. Chem. 277, 20949-20959.

131. Lindenbach, B.D., C.M. Rice, 2001. Flaviviridae: The viruses and their replication: 589-641. In: Knippe DM, Howley PM. Editors. Fundamental Virology. Philadelphia: Lippincott Williams &Wilkins.

132. Lin CL, Chung CS, Heine HG, Chang W. //Vaccinia virus envelope H3L protein binds to cell surface heparan sulfate and is important for intracellular mature virion morphogenesis and virus infection in vitro and in vivo. J Virol. 2000 Apr;74(7):3353-65.

133. Lucht A., C. Otterbein, P. Moller, H. Feldmann, S. Becker, and R. Grunow. Prodution of monoclonal antibodies to Ebola-Zaire virus. // Symposium on Marburg and Ebola viruses. Germany, Marburg (2000), October 1-4. P. 5.

134. Maa JS, Esteban M. //Structural and functional studies of a 39,000-Mr immunodominant protein of vaccinia virus. J Virol. 1987 Dec;61(12):3910-9.

135. Mandl CW, Guirakhoo F, Holzmann H, Heinz FX, Kunz C. Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tickborne encephalitis virus as a model. J Virol. 1989 Feb;63(2):564-71.

136. Martin KH, Grosenbach DW, Franke CA, Hruby DE. //Identification and analysis of three myristylated vaccinia virus late proteins. J Virol. 1997 Jul;71(7):5218-26.

137. Martin KH, Franke CA, Hruby DE. // Novel acylation of poxvirus Atype inclusion proteins. Virus Res. 1999 Apr;60(2): 147-57.

138. Maruyama T, Rodriguez LL, Jahrling PB, Sanchez A, Khan AS, Nihol ST, Peters CJ, Parren PW and Burton D. Ebola virus can be effectively neutralized by antibody produced in natural human infection. // Jurnal of Virology (1999) July, p.6024-6030.

139. Mathiot, C.C., A.J. Georges, V. Deubel. 1990. Comparative analysis of

140. West Nile-virus strains -isolated from human and animal-hosts—using"monoclonal antibodies and cDNA restriction digest profiles. Res. Virol. 141:533-543.

141. McKelvey TA, Andrews SC, Miller SE, Ray CA, Pickup DJ // Identification of the orthopoxvirus p4c gene, which encodes a structural protein that directs intracellular mature virus particles into A-type inclusions. J Virol. 2002 Nov;76 (22):11216-25.

142. McKinney M.M., Parkinson A//A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. 1987 - J. Immunol. Meth. - vol.96 - P.271-278.

143. Medzon EL, Bauer H. Structural features of vaccinia virus revealed by negative staining, sectioning, and freeze-etching. Virology. 1970 Apr;40(4):860-7.

144. Meloen R.H., et al. Antigenicity and immunogenicity of synthetic peptides of foot-and-mouth disease virus. // J Gen'Virol (1987) Vol 115, p.305-314.

145. Mercer J, Traktman P. //Investigation of structural and functional motifs within the vaccinia virus A14 phosphoprotein, an essential component of the virion membrane. J Virol. 2003 Aug;77(16):8857-71.

146. Meyer H., Osterrieder N., Czerny C.P. 1994. Identification of binding sites for neutralizing monoclonal antibodies on the 14-kDa fusion protein of orthopox viruses. Virology 200, 778-783.

147. Milenic DE, Yokota T, Filpula DR, Finkelman MA, Dodd SW, Wood

148. JFf-'Whitlow M, - Snoy P, Schlom —J. Construction, binding- properties,metabolism, and tumor targeting of a single-chain Fv derived from the pancarcinoma monoclonal antibody CC49. //Cancer Res. 1991 Dec 1 ;51(23 Pt 1):6363-71.

149. Mitchel SW, McCormick JB. Physicochemical inactivation of Lassa, Ebola, and Marburg viruses and effect on clinical labratory analyses.// J Clin.Microbiol.- 1984.- Vol.20, N3.-P.486-489.

150. Mitchell SW, McCormick JB. Physicochemical inactivation of Lassa, Ebola, and Marburg viruses and effect on clinical laboratory analyses. // J Clin Microbiol (1984) 20:486-489.

151. Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains. Proc Natl Acad Sci USA. 1984 Nov; 81(21):6851-5.

152. Morvan, J., T. Besselaar, D. Fontenille, P. Coulanges. 1990. Antigenic variations in West Nile virus strains isolated in Madagascar since 1978. Res. Virol. 141:667-676.

153. Moss B. 2000. Poxviridae: The viruses and their repluication. In Fields Virology, 4-d Edition. Ed -s: B.N.Fields, D.M.Knipe, P.M.Howley, et al. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 2849-2880p.

154. Moss B. 1991. Vaccinia virus: a tool for research and vaccine development. Science. 252(5013), 1662-1667.

155. Muhlberger E, Weik M, Volchkov VE, Klenk HD, Becker S. Comparison of the transcription and replication strategies of Marburg virus and Ebola Virus by using artificial replication systems. // J Virol (1999) Mar;73(3):2333-2342.

156. Muehlberger E, Sanchez A, Randolf A, Will C, Kiley MP, Klenk HD, Feldmann H. The nucleotide sequence of the L gene of Marburg virus, a filovirus: homologies with paramyxoviruses and rhabdoviruses. // Virology (1992) 187:534-547.

157. Murphy FA, van der Groen G, Whitfield SG, Lange JV. Ebola and Marburg virus morphology and taxonomy. In: Pattyn SR (ed) Ebola virus haemorrhagic fever. // Elsevier North-Holland (1978), Amsterdam. P.61-8.

158. Niedrig M, Klockmann U, Lang W, Roeder J, Burk S, Modrow S, Pauli G. Monoclonal antibodies directed against tick-borne encephalitis virus with neutralizing activity in vivo. Acta Virol. 1994 Jun;38(3): 141-9.

159. Niikura M., Ikegami T., Saijo M., Kurane I., Miranda M.E., Morikawa S. Detection of Ebola viral antigen by enzyme-linked immunosorbent assay using a novel monoclonal antibody to nucleoprotein. // J Clinical Microbiol (2001)39:3267-3271.

160. Niles EG, Seto J. //Vaccinia virus gene D8 encodes a virion transmembrane protein. J Virol. 1988 Oct; 62(10):3772-8.

161. Nybakken GE, Oliphant T, Johnson S, Burke S, Diamond MS, Fremont DH. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody. Nature. 2005 Sep 29;437(7059):764-9.

162. Payne LG. Characterization of vaccinia virus glycoproteins by.„monoclonal antibodyprecipitation. Virology.-1992 Mar; 187(1 ):251-60

163. Payne LG. //Identification of the vaccinia hemagglutinin polypeptide from a cell system yielding large amounts of extracellular enveloped virus. J Virol. 1979 Jul;31(l):147-55.

164. Payne LG. //Significance of extracellular enveloped virus in the in vitro and in vivo dissemination of vaccinia. J Gen Virol. 1980 Sep;50(l):89-100.

165. Payne LG. //Characterization of vaccinia virus glycoproteins by monoclonal antibody precipitation. Virology. 1992 Mar; 187(1):251-60.

166. Pedersen K, Snijder EJ, Schleich S, Roos N, Griffiths G, Locker JK. Characterization of vaccinia virus intracellular cores: implications for viral uncoating and core structure. //J Virol. 2000 Apr;74(8):3525-36.

167. Pedersen K, Snijder EJ, Schleich S, Roos N, Griffiths G, Locker JK. //Characterization of vaccinia virus intracellular cores: implications for viral uncoating and core structure. J Virol. 2000 Apr; 74(8):3525-36.

168. Pereboev A, Borisevich V, Tsuladze G, Shakhmatov M, Hudman D, Kazachinskaia E, Razumov I, Svyatchenko V, Loktev V, Yamshchikov V. //Genetically delivered antibody protects against West Nile virus. //Antiviral Res. - 2008,- Vol.7, N1 - P:6-13.

169. Peiris, J.S., J.S. Porterfield, J.T. Roehrig. 1982. Monoclonal antibodies against the flavivirus West Nile. J. Gen. Virol. 58(Pt 2): 283-289.

170. Peters CJ, Sanchez A, Rollin PE, Ksiazek TG, Murphy FA. Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. // Fields Virology (1996).Chapter 39, p.l 1611176.

171. Peters D, Mueller G, Slenczka W. Morphology, Development and classification of the Marburg virus. // (1971) In: Martini G, Siedelberg New York. P. 68-83.

172. Pringle Cr. The order Mononegavirales. // Arch Virol (1991) 117:137140.

173. Ramsey-Ewing A, Moss B. //Apoptosis induced by a postbinding step of vaccinia virus entry into Chinese hamster ovary cells. //Virology. 1998 Mar 1;242(1): 138-49.

174. Ramsey-Ewing A, Moss B. // Recombinant protein synthesis in Chinese hamster ovary cells using a vaccinia virus/bacteriophage T7 hybrid expression system. J Biol Chem. 1996 Jul 12;271(28): 16962-6.

175. Ravanello MP, Hruby DE. //Conditional lethal expression of the vaccinia virus L1R myristylated protein reveals a role in virion assembly .//J Virol. 1994 0ct;68(10):6401-10.

176. Ravanello MP, Hruby DE. //Characterization of the vaccinia virus L1R- myristylproteinas a-component-of the intracellular virion- envelope.//-J- Gen

177. Virol. 1994 Jun;75 (Pt 6):1479-83.

178. Reichert JM. Trends in the development and approval of monoclonal antibodies for viral infections. //BioDrugs. 2007;- 21(1): pl-7.

179. Reichert JM, Dewitz MC. Anti-infective monoclonal antibodies: perils and promise of development. //Nat Rev Drug Discov. 2006 Mar;5(3): 191-5.

180. Reichert JM, Valge-Archer VE. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. //Nat Rev Drug Discov. 2007 May;6(5):349-56. Review.

181. Reichert JM. Trends in US approvals: new biopharmaceuticals and vaccines. //Trends Biotechnol. 2006 Jul;24(7):293-8.

182. Rey FA, Heinz FX, Mandl C, Kunz C, Harrison SC. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. //Nature. 1995 May 25;375(6529):291-8.

183. Regnery RL, Johnson KM, Kiley MP. Virion nucleic acid of Ebola virus. //J Virol (1980)36:465-469.

184. Rodriguez D, Risco C, Rodriguez JR, Carrascosa JL, Esteban M. Inducible expression of the vaccinia virus A17L gene provides a synchronized system to monitor sorting of viral proteins during morphogenesis.//J Virol. 1996 Nov;70(l l):7641-53.

185. Rodriguez J.F., Paez E., Esteban M. 1987. A 14,000-Mr envelope protein of vaccinia virus is involved in cell fusion and forms covalently linked trimers. //J. Virol. 61, 395-404.

186. Rodriguez J.F., Janeczko R., Esteban M. 1985. Isolation and characterization of neutralizing monoclonal antibodies to vaccinia virus. //J. Virol. 56:482-488.------------------------------------------------------------------------------

187. Rodriguez J.F., Esteban M. 1987. Mapping and nucleotide sequence of the vaccinia virus gene that encodes a 14-kilodalton fusion protein. //J. Virol. 61,3550-3554.

188. Rodriguez D, Risco C, Rodriguez JR, Carrascosa JL, Esteban M. //Inducible expression of the vaccinia virus A17L gene provides a synchronized system to monitor sorting of viral proteins during morphogenesis. //J Virol. 1996 Nov;70(ll):7641-53.

189. Rodriguez JR, Risco C, Carrascosa JL, Esteban M, Rodriguez D. //Vaccinia virus 15-kilodalton (A14L) protein is essential for assembly and attachment of viral crescents to virosomes.//J Virol. 1998 Feb;72(2): 1287-96.

190. Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M. //The vaccinia virus 14-kilodalton fusion protein forms a stable complex with the processed protein encoded by the vaccinia virus A17L gene. J Virol. 1993 Jun;67(6):3435-40.

191. Roger H Kennett and Thomas J. McKearn. Hybridomas: A new dimension in biological analyses. // Plinum Press (1981). New York and London.

192. Ross N., et al. A novel immunogold cryoelectron microscopic approach to invectigate the structure of the intracellular and extracellular forms of vaccinia virus. //EMBOJournal.-1996.- V.15. 2343-2355.

193. Saijo M, Niikura M, Morikawa S, Ksiazek T.G., Meyer R.F., Peters C.J., Kurane I. Enzyme-linked immunosorbent asseys for detection of antibodies to Ebola and Marburg viruses using recombinant nucleoproteins. II J Clin Microbiol (2001) Jan; 39 (1): 1-7.

194. Sanchez A, Trappier SG, Many BW, Peters CJ, Nichol ST. The virion glycoproteins of Ebola viruses are encoded in two readieng frames and are expressed through transcriptional editing. // Proc Natl Acad Sci USA (1996); 93:3602-3607.

195. Sanchez A, Killey MP, Holloway BP, Auperin DD. Sequence analysis of the Ebola virus genom: organization, genetic elemets, and comparison with the genom of Marburg virus. // Virus Res (1993) 29:215-240.

196. Sanchez A, Kiley MP, Klenk HD, Feldmann H. Sequence analysis of the Marburg virus nucleoprotein gene: comparison to Ebola virus and other non-segmented negative-strand RNA viruses. // J Gen Virol (1992) 73:347-357.

197. Sanchez A, Khan AS, Zaki SR, Nabel GJ, Ksiazek, and Peters CJ. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. // J Filds Virology (2001) Charter 40. P.1279-1304.

198. Sanchez MD, Pierson TC, McAllister D, Hanna SL, Puffer BA, Valentine LE, Murtadha MM, Hoxie JA, Doms RW. Characterization of neutralizing antibodies to West Nile virus. Virology. 2005 May 25;336(1):70-82.

199. Sambrook J., Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2-d Fd. - Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

200. Sardelis MR, Turell MJ, Dohm DJ, O'Guinn ML. Vector competence of selected North American Culex and Coquillettidia mosquitoes for West Nile virus. //Emerg Infect Dis. 2001 Nov-Dec;7(6): 1018-22.

201. Sarov I, Joklik WK. Studies on the nature and location of the capsid polypeptides of vaccinia virions. Virology. 1972 Nov;50(2):579-92.

202. Sawyer LA. Antibodies for the prevention and treatment of viral diseases. Antiviral Res. 2000 Aug;47(2):57-77.

203. Scianimanico S, Schoehn G, Timmins J, Ruigrok RH, Klenk HD, Weissenhorn W. Membrane association induces a conformational change in the Ebola virus matrix protein. // J EMBO (2000) Dec 15; 19(24):6732-6741.

204. Shchelkunov S.N., 1995. Functional organization of variola major and vaccinia virus genomes. Virus Genes 10:53-71.

205. Schmaljohn A. L., Johnson E. D., Dalrymple J. M., Cole G.A. //Non neutralizing monoclonal antibodies can prevent lethal alphavirus encephalitis. -//Nature. 1982. - Vol.297. - P. 70-72.

206. Scherret JH, Poidinger M, Mackenzie JS, Broom AK, Deubel V, Lipkin WI, Briese T, Gould EA, Hall RA. The relationships between West Nile and Kunjin viruses. //Emerg Infect Dis. 2001 Jul-Aug;7(4):697-705.

207. Smith GL, Law M. The exit of vaccinia virus from infected cells.//Virus Res. 2004 Dec; 106(2): 189-97. Review.

208. Smithburn, K.C., T.P. Hughes, A.W. Burke, J.H. Paul. 1940. A neurotropic virus isolated from the blood of a native of Uganda. Am. J. Trop. Med. Hyg. 20:471-492.

209. Sullivan NJ, Sanchez A, Rollin PE, Yang ZY, Nabel GJ. Development of a preventive vaccine for Ebola virus infection in primates. // J Nature (2000) Nov 30; vol.408(6812):605-609.

210. Takahashi T, Oie M, Ichihashi Y. //N-terminal amino acid sequences of vaccinia virus structural proteins.//Virology. 1994 Aug l;202(2):844-52.

211. Takada A, Robison C, Goto H. et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. // Proc Natl Acad Sei USA (1997) Dec.23; 94(26): 14764-14769.

212. Takada Ayato, Shinji Watanabe, Hirohi Ito, and Yoshihiro Kawaoka. Infectivity-enhancing antibodies to Ebola virus glycoprotein. // Simposium on Marburg and Ebola viruses. Marburg, Germany (2000), abstract. P.53.

213. Takada A, Watanabe S, Ito H, Okazaki K, Kida H, Kawaoka Y. Downregulation of beta 1 integrins by Ebola virus glycoprotein: implication for virus entry. // Virology (2000) Dec 5;278(l):20-26.

214. Takada Ayato, Shinji Watanabe, Hirohi Ito, and Yoshihiro Kawaoka.

215. Ebola virus glycoproteins.-//-Simposium on Marburg and Ebola viruses.

216. Marburg, Germany (2000), abstract. P. 14.

217. Takada A, Watanabe S, Okazaki K, Kida H, Kawaoka Y. Infectivity-Enhancing Antibodies to Ebola virus glycoprotein. // Journal of Virology N5 (2001) March.75:2324-2330.

218. Tilson MD, Ozsvath KJ, Hirose H, Xia S, and Lanita R. A novel hypothesis to explain the hemorrhagic and connective tissue manifestations of Ebola virus infection. // J Clinical immunology and immunopathology (1996) Dec;81(3):303-306.

219. Timmins J, Scianimanico S, Schoehn G, Weissenborn W. Vesicular release of Ebola Virus matrix protein VP40. // Virology (2001) Apr 25;283(1) -p.1-6.

220. Tsekhanovskya MA, Matveev LE, Rubin SG, et all. Epitope analyses of TBE complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype). // Virus Res (1993), Vol.30, p. 1-16.

221. Towbin H, Staekelin T, Gordon J. Electrohporetic transfer of proteins from polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets: Procedure and some applications. // Proc Natl Acad Sci USA (1979); 76:4350-4354.

222. Ulaeto D, Grosenbach D, Hruby DE. The vaccinia virus 4c and A-type inclusion proteins are specific markers for the intracellular mature virus particle. //J Virol. 1996 Jun; 70(6):3372-7.

223. Van der Groen G, Elliot L, Lack of cross reactivity of rhabdovirus antibodies with Marburg and Ebola antigens in the inderect immunofluorescent antibody test. // Ibid (1982) Vol 62, p.67-68.

224. VanderZanden L, Custer D, Bray M, Huggins J, Schmaljohn C. Developments in nucleic acid vaccines for filoviruses.// In: American Society for Virology 16th Annual Meeting (1997). Bozeman, Montana, July. P. 19-23.

225. Va'zques M-A., Esteban M. Identification of Functional Domains in the 14-Kilodalton Envelope Protein (A27L) of Vaccinia Virus. //J. Virol. 1999. -Vol.73, -p.9098-9109.

226. Vigerust DJ, Shepherd VL.Virus glycosylation: role in virulence and immune interactions/Trends Microbiol. 2007 May;15(5):211-8. Epub 2007 Mar 29. Review

227. Volchkov VE, Chepurnov AA, Volchkova VA, Ternovoj VA, Klenk HD. Molecular characterization of guinea pig-adapted variants of Ebola virus.W Virology. 2000 Nov 10;277(l):147-55.

228. Volchkov VE, Volchkova VA, Chepurnov AA, Blinov VM, Dolnik O, Netesov SV, Feldmann H. Characterization of the L gene and 5' trailer region of Ebola virus. // J.Gen.Virol (1999) Feb;80 (Pt2):355-362.

229. Volchkov VE, Volchkova VA, Muhlberger E, Kolesnikova L, and Klenk H-D. Expression strategy of the Ebola virus GP gene: implication of the transcriptional RNA editing. // Marburg 2000. Symposium on Marburg and Ebola viruses, abstract. P. 4.

230. Volchkov- VE, Becker S, Volchkova VA, Ternovoj VA, Kotov AN, Netesov SV, Klenk HD. GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerases. // Virology (1995) 214:421-430.

231. Volchkov VE, Feldmann H, Volchkova VA, Klenk HD. Processing of the Ebola virus glycoprotein convertase furin. // Proc Natl Acad Sei USA (1998).95:5762-5767.

232. Volchkov VE, Volchkova VA, Slenczka W, Klenk Hd, Feldmann H. Release of viral glycoproteins during Ebola virus-infectionr// Virology (1998) — May 25;245(1):110-119.

233. Volchkov VE, Blinov VM, Netesov SV. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses. // FEBS Lett (1992) 305:181-184.

234. Volchkov VE, Volchkova VA, Muhlberger E, Kolesnikova LV, Weik M, Dolnik O, Klenk HD. Recovery of infectionus Ebola virus from complementary DNA: RNA editing of the GP gene and viral cytotoxicity. // J Science (2001) Mar 9;291 (5510):1965-1969.

235. Wallengren K., Risco C., Krijnse-Locker J., Esteban M., Rodriguez D. 2001. The A17L gene product of vaccinia virus is exposed on the surface of IMV. //Virology 290, 143-152.

236. Wallengren K, Risco C, Krijnse-Locker J, Esteban M, Rodriguez D. //The A17L gene product of vaccinia virus is exposed on the surface of IMV. Virology. 2001 Nov 10;290(1): 143-52.

237. Weber E.L., Buchmaier M.J. Fine mapping of a peptide sequence containing an antigenic site conserved among arenavirus. // Virology (1988) Vol 164, p.30-38.

238. Weissenhorn W, Carfi A, Lee KH, Skehel JJ, Wiley DC. Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit, GP2, from the envelope glycoprotein ectodomain. // Mol Cell (1998) Nov; 2(5):605-616.

239. Weissenhorn W, Dessen A, Calder LJ, Harrison SC, Skehel JJ, Wiley

240. DC. Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses. Mol Membr

241. Biol. 1999 Jan-Mar; 16(1 ):3-9. Review.

242. Wengler Gerd and Gisela Wengler. Cell-associated West Nile flavivirus is covered with E+pre-M protein heterodimers which are destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus release. //J. of Virology, -1989, Vol. 63, N 6, - p.2521-2526.

243. Will C, Muhlberger E, Linder D, Slenczka W, Klenk HD, Feldmann H. Marburg virus gene 4 encodes the virion membrane protein, a type I transmembrane glycoprotein. // J Virol (1993) 67:1203-1210.

244. Wilson JA, Hart MK. Protection from Ebola virus mediated by cytotoxic T lymphocytes specific for the viral nucleoprotein. // J Virol (2001) Mar; 75(6):2660-2664.

245. Wilson JA, Hevey M, Bakken R, Guest S, Bray M, Schmaljohn A.L, Hart MK. Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus. //J Science (2000) Mar 3;287 (5458):1664-1666.

246. Wilson JA, Bray M, Bakken R, Hart MK. Vaccine potential of Ebola virus VP24, VP30, VP35, and VP40 proteins. // J Virology (2001) Aug 1;286 (2):384-390.

247. Wolffe EJ, Weisberg AS, Moss B. //The vaccinia virus A33R protein provides a chaperone function for viral membrane localization and tyrosine phosphorylation of the A36R protein. J Virol. 2001 Jan;75(l):303-10.

248. Xu L, Sanchez A, Yang Z, Zaki SR, Nabel EG, Nichol ST, Nabel GJ. Immunization for Ebola virus infection. // Nat Med (1998) 4:37-42.

249. Yang Z, Delgado R, Xu L, Todd RF, Nabel EG, Sanchez A, Nabel GJ. Distinct cellular interactions of secreted and transmembrane Ebola virus glycoproteins. // Science (1998) 279:1034-1037.

250. Zinoviev VV, Tchikaev NA, Chertov OYu, Malygin EG. Identification of the gene encoding vaccinia virus immunodominant protein p35. //Gene. -1994 Sep 30; Vol. 147(2) : p.209-14.