Молекулярные механизмы взаимодействия оксида азота(II) и низкоинтенсивного лазерного и светодиодного излучения с митохондриями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Буравлев, Евгений Александрович

• Буравлев, Евгений Александрович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Буравлев, Евгений Александрович

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Химические свойства и биологическая роль оксида азота(П).

2.1.1. Физико-химические свойства оксида азота(П).

2.1.2. Взаимодействие негемовых белков с оксидом азота(П).

2.1.3. Взаимодействие гем-содержащих белков с оксидом азота(Н).

2.1.4. Участие N0 в физиологических и патофизиологических процессах.

2.2. Механизмы действия лазерного излучения.

2.2.1. Фотолиз нитрозильных комплексов.

Нитрозильные комплексы гемоглобина.

Нитрозильные комплексы цитохрома

Нитрозильные комплексы цитохром с оксидазы.

2.2.2. Фотодинамическая теория действие низкоинтенсивного лазерного излучения.

Действие низкоинтенсивного лазерного излучения (632,8 нм) на заживление ран.

Влияние фотосенсибилизаторов на активацию лейкоцитов при действии лазерного излучения.

Использование лазерного и УФ излучения при экземе и реинфузии облученной крови.

2.3. Модель эндотоксического шока и действие лазерного излучения.

2.3.1. Молекулярный механизм действия бактериальных липополисахаридов.

2.3.2. Низкоинтенсивное лазерное излучение при эндотоксическом шоке

3. Материалы и методы.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследования.

Определение общего содержания белка.

Облучение образцов митохондрий печени.

Калибровка датчиков кислорода.

Электрохимические измерения коэффициента дыхательного контроля митохондрий.

Измерение ЭПР спектров митохондрий.

Оценка мембранного потенциала.

Определение концентрации N0.

Процедура экстракции липидов из эритроцитов крови крыс.

Процедура облучения животных гелий-неоновым лазером.

Измерение люминол-зависимой хемилюминесценции лейкоцитов крови

Определение супероксиддисмутазной активности плазмы крови.

Регистрация флуоресценции г/г/с-паринариевой кислоты для измерения окисления липидов мембран.

Измерение флуоресценции эндогенных порфиринов в плазме крови крыс.

Поиск научной литературы.

Статистическая обработка.

4. Результаты.

4.1. Оценка сродства оксида азота(П) к гемоглобину и митохондриальным комплексам переноса электронов.

4.1.1. Исследование распределения оксида азота(П) между митохондриями и гемоглобином.

4.1.2. Влияние гемоглобина на параметры дыхания митохондрий в присутствии N0.

4.2. Влияние оксида азота(П) и лазерного излучения на митохондрии в условиях гипоксии.

4.2.1. Исследование влияния степени восстановления митохондрияальных переносчиков на образование нитрозильных комплексов.

4.2.2. Влияние лазерного излучения на нитрозильные комплексы митохондрии.

4.3. Влияние лазерного излучения и оксида азота(П) на скорость дыхания и мембранный потенциал митохондрий.

4.3.1. Влияние лазерного излучения на дыхание митохондрий в норме и в присутствии N0.

Влияние лазерного излучения на интактные митохондрии.

Влияние N0 на потребление кислорода митохондриями.

Действие лазерного излучения на митохондрии в присутствии оксида азота(П).

4.3.2. Влияние ионов Са на дыхание митохондрий.

При воздействии лазерного излучения.

В присутствии оксида азота(П).

Перекисное окисление липидов мембран митохондрий.

4.4. Влияние лазерного излучения на функционирование митохондрий при экспериментальном эндотоксическом шоке.

4.4.1. Влияние лазерного излучения на дыхания митохондрий животных, подвергавшихся действию ЛПС.

4.4.2. Влияние лазерного облучения на мембранный потенциал митохондрии животных, подвергавшихся действию ЛПС.

4.4.3. Исследование образования нитрозильных комплексов митохондрии у животных, подвергавшихся действию ЛПС, методом ЭПР

4.5. Воздействие лазерного излучения красного диапазона (632,8 нм) на свободно-радикальные процессы в крови крыс.

4.5.1. Подбор условий для регистрации эндогенных порфиринов в плазме крови.

4.5.2. Количественное определение содержания эндогенных порфиринов в плазме.

4.5.3. Определение супероксиддисмутазной активности плазмы крови крыс

4.5.4. Измерение хемилюминесцентного ответа лейкоцитов крови крыс.

4.5.5. Измерение перекисного окисления в липидах мембран эритроцитов.

5. Обсуждение результатов.

5.1. Влияние лазерного облучения и гемоглобина на митохондрии в присутствии оксида азота(П).

5.2. Действие оксида азота(П) на дыхательные комплексы митохондрии печени крыс.

5.3. Действие оксида азота(П) на митохондрии печени крыс, подвергавшихся воздействию ЛПС.

5.4. Влияние степени восстановления митохондриальных переносчиков на образование нитрозильных комплексов негемового железа в митохондриях.

5.5. Взаимосвязь эндогенных порфиринов плазмы крови крыс и свободно-радикальных процессов в крови крыс.

6. Выводы.

7. Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные механизмы взаимодействия оксида азота(II) и низкоинтенсивного лазерного и светодиодного излучения с митохондриями»

Среди многочисленных реакций оксида азота(П) наиболее важными являются реакции с кислородом, ЭН-группами и металлами переменной валентности, которые входят в состав гемовых и негемовых белков. На молекулярном уровне физиологические эффекты оксида азота(П) реализуются, обычно, через взаимодействие с гемовыми и негемовыми белками. Например, известно, что когда оксид азота (II) образует нитрозильный комплекс с гемом гуанилат-циклазы, то наблюдается увеличение каталитической активности фермента. В результате происходит расслабление гладкой мускулатуры сосудов и увеличивается кровоснабжение ткани. Не менее важной реакцией оксида азота(П) в клетке/организме является реакция с белками электрон-транспортной цепи митохондрий, среди которых важно упомянуть цитохром с, цитохром с оксидазу и негемовые железо-серные белки. Оксид азота(П) ингибирует их каталитическую активность, снижает дыхание митохондрий и синтез АТФ.

Согласно теории о механизмах действия низкоинтенсивного лазерного излучения видимого диапазона, предложенной Ю.А. Владимировым, известно, что оно вызывает разрушение нитрозильных комплексов [3]. В ряде патофизиологических процессов, протекающих с участием оксида азота(П), нитрозильные комплексы белков могут играть важную роль. Это касается состояний, связанных с нарушениями кровообращения - ишемия, гипертензия, шок. При наличии в организме большого количества бактериальных липополисахаридов проявляется состояние известное как эндотоксический шок. В этом состоянии в организме образуется значительное количество оксида азота(П), который оказывает заметное воздействие на функции белков и ферментов. Например, низкие (наномолярные) концентрации оксида азота(П) способны ингибировать цитохром с оксидазу. Высокие концентрации N0 ингибируют дыхательную цепь митохондрий из-за нитрозилирования тиолов и блокирования железосерных центров в митохондриальных дыхательных комплексах. Так же в результате взаимодействия с кислорода в процессе дыхания митохондрий оксид азота(П) способен образовывать пероксинитрит. Пероксинитрит вызывает необратимое повреждение, как белковых комплексов дыхательной цепи, так и мембран митохондрий. Поэтому, изучение роли оксида азота(П) в регуляции дыхания митохондрий имеет важное значение для понимания механизмов протекания этого патологического состояния, и оказать влияние на разработку методов его диагностики и лечения. Важным свойством нитрозильных комплексов является их фоточувствительность. В работах, проведенных в нашей лаборатории, было показано, что гемоглобин и цитохром с могут распадаться при действии лазерного излучения с длиной волны 442 нм [47,88].

Таким образом, основной целью нашей работы является исследование влияния лазерного и светодиодного излучения и оксида азота(П) на функционирование митохондрий. Для достижения этой цели были поставлены следующие актуальные задачи:

1. Изучить воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения (442 нм) и гемоглобина на нитрозильные комплексы негемового железа митохондрий.

2. Изучить влияние лазерного и светодиодного излучения на функционирование митохондрий в норме и при воздействии экзогенного N0.

3. Изучить влияние лазерного и светодиодного излучения на функционирование митохондрий в норме и при воздействии эндогенного N0, образующегося в организме на модели эндотоксического шока.

4. Изучить влияние степени восстановления митохондриальных переносчиков в норме и при воздействии эндогенного N0, образующегося в организме на модели эндотоксического шока.

5. Исследование роли эндогенных порфиринов в механизме действия низкоинтенсивного лазерного излучения видимого диапазона (632,8 нм) на свободно-радикальные процессы в крови крыс при действии на организм липополисахаридов.

2. Обзор литературы

В литературном обзоре основное внимание уделено: физико-химическим и биологическим свойствам оксида азота(П) (1); механизмам действия лазерного излучения (2), в первую очередь фотодинамическому действию и фотолизу нитрозильных комплексов; действию низкоинтенсивного лазерного излучения при экспериментальном эндотоксическом шоке (3).