Молекулярные механизмы взаимодействия митохондриальных фосфолипидов с цитохромом c тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Степанов, Герман Олегович

• Степанов, Герман Олегович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Степанов, Герман Олегович

1 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2 ВВЕДЕНИЕ.

3 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1 Апоптоз. Основные понятия.

3.2 Значение апоптоза для организма.

3.3 Структурные и ферментативные процессы в апоптозе.

3.4 Внешний и внутренний механизмы развития апоптоза.

3.5 Роль цитохрома с в развитии апоптоза.

3.6 Общие представления о механизмах регуляции апоптоза.

3.6.1 Пероксидазная активность цитохрома

3.6.2 Пространственная структура активного центра гемопротеинов.

3.6.3 Определение пероксидазной активности.

3.7 Пространственнаяруктура цитохрома

3.7.1 Структура и функции цитохрома

3.7.2 Особенности устройства цитохрома

3.8 Изменения структуры цитохрома с в присутствии липидов.

3.8.1 Какие изменения цитохрома с возможны?.

3.8.2 Влияние анионных липидов на изменениеруктуры цитохрома

3.9 Механизмы регуляции пероксидазной активности цитохрома

3.10 Превращения фосфолипидов под действием фосфолипазы Б.

3.10.1 Преобразование фосфатидилхолина до фосфатидной кислоты под действием фосфолипазы Б.

3.10.2 Фосфолипаза Б в митохондриях.

Цель исследования.

Задачи исследования.

4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1 Реактивы.

4.2 Приготовление многослойных и однослойных липосом.

4.3 Приготовление насыщенного раствора оксида азота.

4.4 Люминол-зависимая хемилгоминесценция.

4.5 Спектрофотометр ия.

4.6 ЭПР-Спектроскопия.

4.7 Поверхностный плазмонный резонанс.

4.8 Измерение флуоресценции триптофана-59 цитохрома

4.9 Измерение активности фосфолипазы Б.

4.9.1 Взаимодействие фосфолипазы Б с симметричными и асимметричными фосфатидилхолинами.

4.9.2 Взаимодействие фосфолипазы Б с фосфолипидами митохондриальных мембран:.

4.9.3 Взаимодействие фосфолипазы Б с мембранами митохондрий.

4.10 Статистическая обработка.

5 РЕЗУЛЬТАТЫ.

5.1 Глава 1. Изучение изменений пространственнойруктуры и ферментативной активности цитохрома

5.1.1 Структура нативного цитохрома с и ее изменение при действии фосфолипидов.

5.1.2 Изменение пероксидазной активности цитохрома с при действии детергентов и фосфолипидов.

5.2 Глава 2. Влияние оксида азота и лазерного излучения на пероксидазную активность цитохрома

5.2.1 Изменение пероксидазной активности цитохрома с в присутствии оксида азота.

5.2.2 Влияние лазерного излучения на нитрозильные комплексы цитохрома

5.3 Глава 3. Регуляция пероксидазной активности цитохрома с под действием фосфолипидов, а также оксида азота и лазерного излучения.

5.3.1 Влияние насыщенных и ненасыщенных фосфолипидов на пероксидазную активность цитохрома

5.3.2 Изучение структурных изменений активного центра цитохрома с в присутствии ряда насыщенных и ненасыщенных фосфолипидов по измерению Флуоресценция Тгр59.

5.4 Глава 4. Влияние ионнойлы и температуры на пространственнуюруктуру активного центра и активность цитохрома

5.5 Глава 5. Влияние оксида азота и лазерного излучения на ферментативную активность цитохрома с в присутствии монослойных липосом разного липидного состава.

5.6 Глава 6. Измерение констант связывания фосфолипидов с цитохромом с методом поверхностного плазмонного резонанса.

5.6.1 Подбор оптимального контрольного образца для исследованийодства фосфолипидов к цитохрому

5.6.2 Измерение констант ассоциации цитохрома с с фосфолипидами.

5.7 Глава 7. Активация пероксидазной активности цитохрома с фосфатидилхолином в присутствии фосфолипазы D.

5.7.1 Влияние фосфолипазы D на фосфатидилхолин.

5.7.2 Активация перокисдазной активности цитохрома с симметричным и асимметричными фосфолипидами подвергшихся действию фосфолипазы D.

5.8 Глава 8. Влияние фосфолипазы D на мембраны митохондрий.

5.8.1 Митохондриальные фосфолипиды как активаторы пероксидазной активности цитохрома с после действия фосфолипазы D.

5.8.2 Исследование активации пероксидазной активности цитохрома с озвученными митохондриями, проинкубированными с PLD.

5.8.3 Действие оксида азота и лазерного излучения на пероксидазную активность цитохрома с, стимулированную митохондриальными фосфолипидами, в присутствии фосфолипазы D.

6 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Роль цитохрома с в апоптозе

6.1.1 Пероксидазная активность цитохрома с может способствовать его выходу в цитоплазму.

6.1.2 Анионные фосфолипиды более выражено влияют на цитохром

6.2 Регуляция пероксидазной активности цитохрома с и ее роль в апоптозе

6.2.1 Воздействие N0 на цитохром с в сравнении с другими гем-содержащими белками.

6.2.2 Воздействие лазера на NO-комплексы цитохрома

6.3 Прочность связывания цитохрома с с мембранными фосфолипидами.

6.4 Влияние фосфолипазы D активацию пероксидазной активности цитохрома

6.4.1 Предполагаемая роль в апоптозе.

7 ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные механизмы взаимодействия митохондриальных фосфолипидов с цитохромом c»

Апоптоз - один из механизмов клеточной гибели наряду с некрозом, но в отличие от последнего, апоптоз является генетически запрограммированным механизмом, который способствует регуляции размеров жизнедеятельности организма на всех стадиях его жизни, начиная от эмбрионального развития и заканчивая глубокой старостью [31]. Нарушения в механизмах апоптоза могут приводить к возникновению онкологических заболеваний, патологий сердечно-сосудистой системы, развития и многих других патологических процессов [20, 43].

После открытия явления апоптоза сразу возник вопрос о том, каков же его механизм? На сегодняшний день общепринятыми являются как минимум два молекулярных механизма развития апоптотического процесса: это внешний (extrinsic, рецептор-опосредованный) и внутренний (intrinsic-митохондриаяльный) [62, 87]. При этом внешний механизм развивается при воздействии различных лигандов на мембранные рецепторы клетки, например CD95 (Fas) или рецепторы фактора некроза опухоли (TNF). Внутренний или митохондриальный механизм развития апоптотического процесса, активируется при действии таких стимулов как ионизирующее излучение, ультрафиолет, некоторые лекарственные препараты и токсины [62, 87].

Следует заметить, что важнейшим событием в развитии апоптоза по внутреннему (митохондриальному) механизму, является выход цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму, что в конечном итоге приводит к активации цитоплазматических сериновых протеаз (каспаз) приводящих клетку к гибели [34].

Хорошо известно, что цитохром с это переносчик электронов между III и IV митохондриальными комплексами Грина. Но как выяснилось, лишь небольшая часть общего количества цитохрома с работает в дыхательной цепи, основная же его часть находится в межмембранном пространстве, ограниченном с помощью ОРА1 белков, и именно эта часть цитохрома с является ниболее важной в развитии апоптотических реакций [26, 72]. На сегодняшний день известно, что выходу цитохрома с в цитоплазму предшествует появление у него высокой пероксидазной активности после взаимодействия с кардиолипином, анионным фосфолипидом внутренней мембраны митохондрий [34]. Таким образом, возникло предположение, о том, что регулируя пероксидазную активность цитохрома с можно регулировать и апоптоз.

Настоящим этапом изучения механизмов апоптоза стал вопрос о возможности повышения и регуляции пероксидазной активности цитохрома с после его взаимодействия с различными биологическими, физическими и химическими агентами (такими как: мембранные фосфолипиды, оксид азота, лазерное излучение, изменение ионной силы, а также температуры). А также, если заранее предположить, что влияние различных фосфолипидов на цитохром с неодинаково, то выяснить константы ассоциации цитохрома с мембранными фосфолипидами, влияющими на изменение его пероксидазной активности [69].

Недавно было показано, что наравне с перекисью водорода, реакция с которой проявляет пероксидазную активность комплекса цитохрома с с фосфолипидами (кардиолипином и др.), он может реагировать с оксидом азота [4, 79]. При этом, взаимодействие цитохрома с с молекулой N0 и, как результат, образование нитрозильных комплексов резко подавляет пероксидазную активность цитохрома с [4]. Одновременно, целью настоящего исследования было выяснить устойчивость нитрозильных комплексов к действию видимого света. В ходе экспериментов выяснилось, что нитрозильные комплексы цитохрома с чувствительны к действию лазерного излучения (синего и зеленого лазерного излучения, 441 и 532 нм, соответственно), под действием которого распадаются на молекулы оксида азота и исходный комплекс цитохрома с с фосфолипидом (кардиолипином и др.), который вновь может проявлять пероксидазную активность [4].

Также выявилась четкая зависимость интенсивности пероксидазной реакции цитохрома с от ионной силы и температуры изучаемой системы. Из проведенных исследований следует, что при повышении ионной силы - интенсивность пероксидазной реакции падает, что объясняется наличием центров электростатического взаимодействия между цитохромом с и фосфолипидами (кардиолипином и др.) [34]. При этом, повышение температуры от 25С до 37С увеличивает пероксидазную активность цитохрома с приблизительно в три раза после предварительного взаимодействия с любым исследованным в данной работе фосфолипидом (кардиолипином, фосфатидной кислотой, фосфатидилсерином и фосфатидилхолином, причем каждый из них представлен, как в насыщенном, так и ненасыщенном варианте).

Как видно, большая часть данной работы посвящена влиянию различных факторов, таких как, оксид азота, лазерное излучение и модельные фосфолипиды на пероксидазную активность цитохрома с. Однако не так много внимания было уделено собственно фосфолипидам. При анализе результатов исследований было замечено, что одним из самых активных фосфолипидов, в отношении активации пероксидазной активности цитохрома с, является фосфатидная кислота, в то же время самым неактивным будет фосфатидилхолин (но он же один из самых распространенных фосфолипидов биологических мембран). Как известно, прямым способом преобразования фосфатидилхолина в фосфатидную кислоту является действие фосфолипазы Б. В качестве продуктов реакции фосфатидилхолина в присутствии фосфолипазы будут образовываться холин и фосфатидная кислота [63]. Именно фосфатидная кислота, взаимодействует с цитохромом с, и увеличивает его пероксидазную активность. Эта закономерность продемонстрирована, как на модельных синтетических фосфолипидах, так и на митохондриальных системах. В подтверждение вышеупомянутых исследований, оказалась возможной модуляция пероксидазной активности цитохрома с при помощи оксида азота (подавление пероксидазной активности цитохрома с) и лазерного излучения (фотолиз нитрозильных комплексов, а следовательно восстановление, подавленной ранее пероксидазной активности цитохрома с). При этом важным моментом данной реакции было, то, что предварительное усиление ферментативной активности цитохрома с, достигалось при действии фосфолипидов митохондриальных мембран обработанных фосфолипазой Б.

В качестве заключительного этапа данной работы, были исследованы константы связывания упомянутых фосфолипидов с цитохромом с методом поверхностного плазмонного резонанса [75]. В физическую основу данного метода положен принцип полного внутреннего отражения (в нашем случае от измеряемого биосенсорного чипа), причем ассоциация цитохрома с на иммобилизированные на поверхности биосенсорного чипа фосфолипиды приводила к изменению его диэлектрической проницаемости, а следовательно, и коэффициента преломления. Таким образом, измеряя угол полного внутреннего отражения, возможно оценить относительное количество цитохрома с ассоциированного на фосфолипиды (на поверхности биосенсорного чипа), а следовательно, и константы взаимодействия. В результате данного исследования выяснилось, что связывание фосфолипида очень сильно зависит от характеристической группы и почти не зависит от состояния насыщенности жирнокислотных остатков [69].

Таким образом, в данной работе были изучены свойства цитохрома с при различных условиях, а именно при действии таких факторов, как: температура, лазерное излучение, оксид азота, действие мембранных фосфолипидов и др. Можно заключить, что молекула цитохрома с специфически ассоциируется с большинством мембранных фосфолипидов. При этом, взаимодействие с ненасыщенными фосфолипидами (ненасыщенные аналоги кардиолипина, фосфатидной кислоты, фосфатидилсерина) приводит к существенной активации пероксидазной активности цитохрома с. Одновременно, интенсивность данного взаимодействия, и как следствие проявление перокисдазной активности цитохрома с резко уменьшается при увеличении ионной силы системы.

Открыта возможность преобразования синтетических фосфатидилхолинов, а также фосфолипидов мембран митохондрий с помощью фосфолипазы Э. Причем продукты данной реакции приводят к значительному увеличению пероксидазной активности цитохрома с. И во всех случаях, оксид азота, как объект способный формировать не пероксидирующие нитрозильные комплексы, так и лазерное излучение ведущие к фотолизу нитрозильных комплексов цитохрома с, а значит восстановлению его способности к взаимодействию с перекисью водорода, могут служить рычагами при помощи которых, мы можем регулировать пероксидазную активность цитохрома с, и возможно апоптоз. и

3 Обзор литературы

3.1 Апоптоз. Основные понятия.

Впервые апоптоз был упомянут Керром в 1972 году [40]. Но выраженный рост интереса к этому процессу замечен лишь с 1990 года. При этом, 7 октября 2002 г. Нобелевский комитет объявил о присуждении премии по физиологии и медицине С. Бреннеру, Х.Р. Хорвицу и Дж. Салстону «.за открытие в области генетической регуляции развития органов и запрограммированной смерти клетки» [21]. Апоптоз представляет собой процесс запрограммированной клеточной гибели (наравне с некрозом) [31]. Результатом апоптоза является выбраковка клеток посредством действия их внутренней, генетической программы. Он характеризуется четкими морфологическими изменениями ядра и цитоплазмы, фрагментаций хроматина и равномерным внутриядерным делением ДНК. Этот тип клеточной смерти, наравне с митозом, регулирует размер живых тканей, и немаловажен в процессе роста опухолей [36, 49, 55, 59] (1993).

Сравнение апоптоза с некрозом. В отличие от некроза, при котором чаще поражается большое количество клеток, что сопровождается мембранным набуханием и общими воспалительными проявлениями, апоптоз характеризуется единичной или избирательной клеточной гибелью, причем воспалительных изменений при апоптозе не наблюдается (Рисунок 1) [30]. Кроме того, некроз характеризуется сначала набуханием клеточной мембраны, а потом потерей ее целостности, изменениями в органеллах, набуханием ядра и конденсацией хроматина, что приводит к полному клеточному разрушению и расползанию клеточных остатков в межклеточном пространстве [64, 89].

Необходимо отметить, что при некрозе разрушение ДНК является одним из последних событий (Рисунок 1). В то время как, апоптоз начинается с конденсации хроматина и фрагментации ядра. Вслед за ядром похожим образом фрагментируется клеточная мембрана с образованием «апоптотических телец», которые содержат, за исключением митохондрий, морфологически неизмененные органеллы. После чего апоптотические клетки подвергаются фагоцитозу (автофагии) [23, 27, 28, 65, 66].

Рисунок 1 Схема отражающая основные отличия некроза от апоптоза (1>ес1а, 2000)

Для апоптоза характерно: Изменение клеточной формы с образованием апоптотических телец, окруженных бислойной мембраной и содержащих в основном нормальные клеточные органеллы. Данные апоптотические тельца впоследствии будут фагоцитированы.

Apoptotic body —

Phagocyte

NECROSIS APOPTOSIS

Для некроза характерно: Набухание и потеря целостности клеточной мембраны, конденсация хроматина. Данный процесс завершается полным клеточным разрушением [77],

3.2 Значение апоптоза для организма.

Апоптоз - это процесс необходимый, как в процессе эмбрионального развития, так и в процессе жизни любого взрослого организма. Но еще более значимо то, что апоптоз, является регулятором клеточного роста и действует как механизм подавляющий развитие онкологических заболеваний [36, 49, 59]. Другими словами «поломка» этого процесса ведет к безудержному клеточному росту, а следовательно, к возникновению всевозможных новообразований.

• В качестве примеров нужно представить что, апоптоз необходим уже на стадии деления бластомеров, в частности для элиминации клеток с поврежденным генетическим материалом т.к. они могут препятствовать правильному развитию эмбриона. В тоже время известно, что недостаточность некоторых ростовых факторов, таких как трансформирующий фактор роста а (TGF-а), или инсулиноподобный ростовой фактор, может способствовать апоптозу эмбриональных клеток [30].

• Одновременно, апоптоз является необходимым механизмом для жизни уже взрослого организма. Так известно, что развитие протоков молочной железы начинается с формирования заполненных клетками протоков, полость в которых появляется после селективной апоптотической гибели клеток, не соприкасающихся со стенками этого канала [5]. Так же процесс запрограммированной клеточной гибели необходим для правильной селекции Т-лимфоцитов. Известно, что при взаимодействии с комплексом антиген/МНС более 90% Т-лимфоцитов погибают по механизму апоптоза при формировании в тимусе, если не проходят двойной позитивный отбор [58]. • И также очень важной является роль апоптоза в формировании различных новообразований. Известно, что помимо бессмертия, отсутствия ответа на митогены и возможности метастазирования, раковые клетки обладают способностью «ускользать» от апоптоза [81]. Учитывая этот факт, ведутся поиски способов индукции апоптоза в раковых клетках. В настоящее время, известен способ терапии рака простаты препаратами способствующими генерации супероксидных радикалов (селентип), применение которых приводит к апоптотической гибели клеток [88].

3.3 Структурные и ферментативные процессы в апоптозе

Апоптоз это процесс запрограммированной клеточной гибели, основная цель которого — элиминация клеточного балласта из тканей живого организма, по пути наиболее безопасному для окружающих (здоровых) клеток, путем фагоцитоза. При этом в клетке происходит ряд последовательных превращений.Среди таких превращений необходимо отметить:

• Морфологические: -Равномерная ДНК фрагментация. -Конденсация хроматина и цитоплазмы.

-Изменение клеточной формы и образование «пузырьков» из клеточной цитоплазмы -апоптотических телец [22].

• Биохимические: могут протекать по внутреннему и внешнему механизмам (о которых будет рассказано позже), но главная мысль в активации цитоплазматических сериновых протеаз (каспаз), взаимодействие которых между собой и с другими цитополазматическими белками впоследствии приведет к клеточной гибели.

3.4 Внешний и внутренний механизмы развития апоптоза.

Развитие апоптоза может проходить по внешнему (или рецептор-опосредованному) механизму, суть которого в активации на различных клеточных рецепторах, каспазы-8, которая в свою очередь приведет к действию каспазы-3 (Правая часть Рисунок 2). С другой стороны, кроме внешнего, существует еще внутренний (или митохондриальный) путь. Одним из главных событий данного пути, является выход цитохрома с, который через ряд посредников, приводит к активации каспазы-9. И подобно каспазе-8, каспаза-9 активирует каспазу-3 (Левая часть Рисунка 2). И именно каспаза-3 запускает цепь ферментативных клеточных реакций приводящих к апоптозу [7, 12, 62, 87]. Как было указано выше, результатом апоптотического процесса является образование апоптотических телец с целой мембраной, которые впоследствии фагоцитируются.

Возник вопрос: А почему фагоциты реагируют на апоптотическте тельца, т.е. на целую клеточную мембрану?

Выяснилось что в нормальных условиях на внешнем листке клеточной мембраны никогда не экспрессируется фосфатидилсерин, т.к. его наличие постоянно контролируется мембранным ферментом скрамблазой [44]. Но если в клетке начались процессы апоптоза, то на внешней мембране появляется окисленные молекулы фосфатидилсерина, и именно он является сигналом («eat me signal») для активации рецепторов фагоцитов [33, 90].

При исследовании внешнего пути апоптоза, чуть более четко, нельзя не заметить всей его сложности и многообразия (Рисунок 3). Видно, что активация множества рецепторов возможна для запуска апоптотических процессов, и более того, каждый из них может действовать даже не по одному механизму.

В отличие от внешнего пути развития апоптоза, внутренний характеризуется лишь внутриклеточным (митохондриальным) развитием (Рисунок 4). После действия любого апоптотического стимула (кроме рецептор-опосредованных), происходит ряд изменений приводящих к выбросу цитохрома с из межмембранного митохондриального пространства (ограниченного белком ОРА1) в цитоплазму [26, 72]. В цитоплазме цитохром с соединяется вместе с белком (Apaf-1) и dATP для образования апоптосомы. Апоптосома способствует активации каспазы-9, которая похожим образом активирует каспазу-3, и именно каспаза-3 запускает каскад ферментативных реакций приводящих к клеточной гибели. Хотелось бы отметить, что изменение структуры активного центра цитохрома с, может приводить к его выходу из митохондрий в клеточную цитоплазму, и, как результат, развитию апоптоза - является предметом данной работы.

3.5 Роль цитохрома с в развитии апоптоза

Как уже упоминалось выше, цитохром с играет ключевую роль в развитии апоптоза по внутреннему (митохондриальному) пути. На данном рисунке (Рисунок 6) представлен ряд белков обеспечивающих развитие апоптоза по внутреннему механизму. Видно, что при взаимодействии с кардиолипином, цитохром с проявляет пероксидазную активность, которая способствует окислению мембран митохондрий и высвобождению мембраносвязанного цитохрома с. Причем высвыбождение цитохрома происходит сначала в межмембранном митохондриальном пространстве, а за тем в цитоплазму, что способствует развитию апоптоза. Причем как отмечает Eral Gottlieb et al. в межмембранном пространстве митохондрий цитохром с удерживается при помощи ОРА1 белков (Рисунок 5) [26]. В связи с представленным выше фактом, а также знаниями о функции цитохрома с в дыхательной цепи, необходимо сказать о его распределении внутри митохондрий. Как было показано в работе Luka Scorrano et al. лишь малая часть цитохрома с находится в межмембранном пространстве митохондрий, при этом большее его количество, а именно около 85% хранится внутри крист митохондрий [67]. И именно этот цитохром впоследствии будет принимать участие в развитии апоптоза. is»c у /

MtOCtHHldfUl MIFH

CMiL TRAIL

UtedicmllKin

Cytocttatnacl a 1 ** tf

DISC с ompte* Proc« spese- В

АрорЮыъ

Рисунок 2 Схематическое изображение внутреннего и внешнего путей развития апоптоза (MaeFarlane, 2004).

На данном рисунке представлены внешний и внутренний пути активации каспаз при апоптозе. Внешним (extrinsic), называется путь активации через сигналы от клеточных рецепторов. С другой стороны, воздействие различных рецептор-неопостредованных агентов способствует развитию апоптоза по внутреннему пути (intrinsic). Внешний путь апоптоза развивается при действии на рецепторы из суперсемейства ФНО, такие как ФИО-рецепторы, CD95 и др., которые через активацию FADD (Fas-associated death domain) приводят к димеризации (активации) каспазы-8 (caspase-8). Внутренный путь апоптоза начинается с выхода из межмембранного пространства митохондрий цитохрома с, который регулируется антиапоптотическими белками семейства Bel (в частности Bcl-2) и проапоптотическими белками, в частности t-Bid. Но как только цитохром с выходит в цитоплазму, он мгновенно связывается с апототическим фактором активации протеаз (Apaf-1), что приводит к образованию апоптосомы. Которая способствует активации каспазы-9 (caspase-9). И в итоге, активированные каспазы 8 и 9 из внешнего и внутреннего пути, соответственно, способствует активации каспазы-3, приводящей к апоптотическим изменениям в клетке [45].

Death Receptor Signaling ™F-a

APO-2L/ TRAIL

ASK1

ASK1

ON A 1 rag men tali on Chromatin condensation

Рисунок 3 Внешний путь развития апоптоза.

Видно, что действие рецептора Fas/CD95 помимо активации каспазы-8, может так же воздействовать на митохондрии по некаспазовому пути. Некаспазовый путь осуществляется при участии ASK-1, МКК-7 и JNK и др. клеточных белков способствующих выходу цитохрома с (Cylo с) из митохондрий и как следствие запуску апоптоза. Одновременно, все рецепторы (Fas/CD95, TNFR-1, TNFR-2, DR3(Death receptor 3), DR4/5) за исключением рецептора для фактора некроза опухоли второго типа (TNFR-2), способствуют активации каспазы -8 через FADD(Fas-associated protein with death domain) или TRA DDfTNF receptor-1 -associated death domain protein), которая активирует каспазу-3, что также приводит к запуску апоптоза (Каспазовый путь). Но в любом случае, действие клеточных рецепторов могут приводить к активации каспазы-3, роль которой в запуске каскада ферментативных реакций приводящих к апоптозу [14].

Mitochondrial Control of Apoptosis

Death Stimuli: Survival Factor Withdrawal

Survival Factors: Growth Factors, Cytokines, etc.

XT*

Bad cytoeolic sequestration

DNA damage > Genotoxic Stress

Рисунок 4 Митохопдриальныи путь развития апоптоза.

Известно, что выход цитохрома с (Cyto С) является одним из ключевых моментов развития апоптоза по митохондриальному (внутреннему) пути. Но данное событие регулируется целым рядом про- и антиапоптотических белков, из которых Bad, Box, Bäk способствуют развитию апоптоза, причем некоторые из низ активируются при действии t-Bid. Основу их действия составляет подавление активности антиапоптотических белков (Bcl-xL, Bcl-2). При этом, выход цитохрома с, и взаимодействие его с Apaf-1 приводит к активации цитоплазматической сериновой протеазы (Caspase-9), которая активирует Caspase-3. Активация Caspase-3 способствует апоптозу [13].

Outer membrane perforation

Cytochrome с • release •

Pro-Caspase-9

Apaf-1 О n ^

Pro-Caspase-3 \

APOPTOSIS

Cristae unraveling membrane Inner membrane

Рисунок 5 OPA1 поддерживает кристы сжатыми предотвращая выход цитохрома с

Выходу цитохрома с из митохондрий предшествует перестройка крист (cristae remodeling) необходимая в дальнейшем для быстрого и полного выхода цитохрома с в цитоплазму. Видно, что ОРА1 существует в двух формах одна интегрирована во внутренную мембрану, вторая находится в межмембранном пространстве. Вместе они обеспечивают достаточно плотный контакт для предотвращения выхода цитохрома с из крист митохондрий. PARL при этом обеспечивает контроль за ОРА1. Таким образом, при нарушении функции белка ОРА1 цитохром с выходит сначала из крист в межмембранное пространство, а за тем и в цитоплазму, что приводит к активации касапз и развитию апоптотическгого процесса [26].

3.6 Общие представления о механизмах регуляции апоптоза

Как представлено на Рисунках 3 и 4 (внешний и внутренний механизмы развития апоптоза), существует множество природных факторов способствующих или препятствующих развитию апоптоза. Одной из задач представленной работы было найти механизмы регуляции этого процесса. Как было показано, выходу цитохрома с из митохондрий, а значит и запуску апоптоза, предшествует появление у цитохрома с пероксидазной активности [34]. Авторами данной работы, было предположено, что регулируя пероксидазную активность цитохрома с, возможно можно регулировать и апоптоз.

3.6.1 Пероксидазная активность цитохрома с . Известно, что цитохром с в нативном состоянии не обладает пероксидазной активностью. Для рассмотрения вопроса о ее появлении, мы попытались сравнить пространственную структуру цитохрома с с другими гем-содержащими молекулами, которые в норме являются пероксидазами или проявляют пероксидазную активность. На рисунке 7 приведены структуры активного центра таких молекул как гемоглобин, миоглобин, пероксидаза хрена и миелопероксидаза. Видно, что каждый из этих белков имеет пятикоординационную структуру гема (железо гема образует четыре координационные связи с тетрапирольным кольцом и пятую связь с атомом азота гистидина (на рисунке выделен зеленым цветом). Наличие связи железа с гистидином подтверждается при построении Ван дер Вальсовых радиусов этих атомов, полученных на основе рентгеноструктурного анализа. Шестая координационная связь железа может быть использована в пероксидазной реакции (она может образоваться с молекулой перекиси водорода, оксида азота и другими небольшими молекулами.) (Рисунок 7).

Cytochrome с

Smac/Dlablo

Рисунок 6 Высвобождение цитохрома с при апоптозе (Orrenius, 2005).

Цитохром с «заякорен» на внутренней мембране митохондрий при помощи электростатических и гидрофобных взаимодействий с кардиолипином. На начальных стадиях продукция АФК при действии комплекса цитохром с - кардиолипин, способствует окислению кардиолипина. При этом гемопротеин отщепляется от внутренней мембраны и может выходить в цитоплазму через пору во внешней мембране. А также кардиолипин, воздействуя на белки Bel и Bid, способствует образованию пор в наружной мембране митохондрий [57].

3.6.2 Пространственная структура активного центра гемопротеинов

4* 6

Рисунок 7А. Пространственная структура активного центра гемоглобина (Шетга!)2002)

Пространственная структура активного центра гемоглобина представляет собой железо (Те-2238-белый) образующее четыре координационные связи с окружающим тетрапирольным кольцом (красный), а также еще одну координационную связь с атомом азота гистидина (йи-92- зеленый). Таким образом, активный центр гемоглобина является пятикоординационньш. Желтым цветом представлено несколько молекул со стороны железа противоположной гистидину, но не образующие связи с атомом железа

1Я

Рисунок 7Б. Пространственная структура активного центра миоглобина (Watson, 1969)

Пространственная структура активного центра миоглобина представляет собой железо (Fe-I219-белый) образующее четыре координационные связи с окружающим тетрапирольным кольцом (красный), а также еще одну координационную связь с атомом азота гистидина (His-93- зеленый). Таким образом, активный центр миоглобина является пятикоординационным. Желтым цветом представлено несколько молекул со стороны железа противоположной гистидину, но не образующие связи с атомом железа [82].

Рисунок 7В. Пространственная структура активного центра пероксидазы хрена (Вегй1ип(1,2002)

Пространственная структура активного центра пероксидазы хрена представляет собой железо (Ге-2483-белый) образующее четыре координационные связи с окружающим тетрапирольным кольцом (красный), а также еще одну координационную связь с атомом азота гистидина (НЬ>-170- зеленый). Таким образом, активный центр пероксидазы хрена является пятикоординационным.

Желтым цветом представлено несколько молекул со стороны железа противоположной гистидину, но не образующие связи с атомом железа [8].

Рисунок 7Г. Пространственная структура активного центра миелопероксидазы (Г|ес11ег>2002)

Пространственная структура активного центра миелопероксидазы представляет собой железо (Ре-9431-белый) образующее четыре координационные связи с окружающим тетрапирольным кольцом (красный), а также еще одну координационную связь с атомом азота гистидина (Ню-336- зеленый). Таким образом, активный центр миелопероксидазы является пятикоординационным.

Желтым цветом представлено несколько молекул со стороны железа противоположной гистидину, но не образующие связи с атомом железа [24].

3.6.3 Определение пероксидазной активности н и

О^ ROOI1 FI.О

OR

FeI

Iiis J

Faxt О

Fell is

ROH

Fust О

Ii

Fe-Tyr"

Iiis I О

JU

Fef

IIb

II

Рисунок 8 Изменения в активном центре гем-содержащих пероксидаз при прохождении пероксидазной реакции (Tsai, 1997).

Активный центр любой гем-содержащей пероксидазы имеет следующую структуру: ото железо связанное четырьмя координационными связями с окружающим его тетрапиролъным кольцом (на схеме не указанном). При этом пятую координационную связь - это связь с атомом азота молекулы гистидина, а на место шестой координационной связи может подходить молекула перекиси водорода. При взаимодействии гема с перекисью водорода следует образование Соединения I (Compound I) в состоянии Fe+4 и Тугт, и затем преобразуется в Соединение II (Compound II) с железом в состоянии +4 [76].

На рисунке 8 представлена последовательность событий в активном центре гем-содержащих пероксидаз (или белков обладающих пероксидазной активностью) во время ферментативного акта [74, 76]. Для протекания пероксидазной реакции железо должно иметь не более пяти координационных связей, иначе не будет возможности даже малым лигандам, таким как перекись водорода, взаимодействовать с гемовым железом.

3.7 Пространственная структура цитохрома с

3.7.1 Структура и функции цитохрома с Цитохром с лошади представляет собой белок из 105 аминокислотных остатков, который кодируется геном CYCS находящимся в коротком плече 7-ой хромосомы (7р15.2). Он выполняет, по меньшей мере, две необходимые для жизни организма функции, которые необратимо связаны с его структурой: цитохром с является белком-переносчиком электронов между III (цитохром с редуктаза) и IV комплексом (цитохром с оксидаза) в дыхательной цепи митохондрий. Но что не менее значимо, выход цитохрома с из митохондрий с образованием апоптосомы, для последующей активации каспаз, является моментом необратимости апоптотического процесса. При этом, и в том и в другом случае, активным центром цитохрома с является гемм [68].

3.7.2 Особенности устройства цитохрома с Как показано на Рисунках 9 и 10 в обычных условиях, железо в активном центре цитохрома с, в отличие от других гем-содержащих белков, активный центр которых имеет пять координационных связей (Рисунок 7), образует 6 координационных связей. Причем наличие шестой координационной связи подтверждается существованием полосы поглощения при 695 нм на спектре поглощения цитохрома с (как указано на Рисунке 12).

Шестикоординационная структура активного центра позволяет цитохрому с свободно переносить электроны между III и IV дыхательными комплексами Грина, восстанавливая железо из состояния Fe+3 в Fe+2 на III дыхательном комплексе и отдавать электрон IV комплексу (при этом железо вновь окисляется и приобретает состояние Fe+3). Подобное расположение связей не позволяет цитохрому с проявлять пероксидазную активность, как минимум до момента взаимодействия с фосфолипидами, либо сурфактантами (додецилсульфат натрия) [4, 56].

3.8 Изменения структуры цитохрома с в присутствии липидов

3.8.1 Какие изменения цитохрома с возможны? Интересно понять, почему при развитии апоптоза, несмотря на свою шестикоординационную структуру, цитохром с может проявлять пероксидазную активность (т.к. наличие 6 координационных связей препятствует взаимодействию с железом активного центра малых лигандов, и в частности перекиси водорода). Было выяснено, что различные анионные липиды (кардиолипин, фосфатидилсерин и др.) или анионные детергенты (додецилсульфат натрия), могут влиять на структуру цитохрома с таким образом, что шестая координационная связь (связь Fe-Met-80) разрывается, или, по крайней мере, деформируется. Таким образом, потеря шестой координационной связи приводит к тому, что железо активного центра цитохрома с может взаимодействовать с малыми лигандами, в частности с перекисью водорода, а следовательно, проявлять пероксидазную активность [34, 54].

3.8.2 Влияние анионных липидов на изменение структуры цитохрома с Для понимания этого вопроса исследовалось влияние некоторых липидов (дицетилфосфат-содержащие и кардиолипин-содержащие липосомы), или детергентов додецилсулъфат натрия) на взаимодействие с цитохромом с, а также способность облегчать взаимодействие цитохрома с с перекисью водорода (Рисунки 11, 12) [4, 34, 56].

Рисунок 9 Пространственная структура цитохрома с (ВияЬпеП, 1990)

На данном рисунке представлена пространственная структура цитохрома с, в котором атом железа (белый) образующий шесть координационных связей, четыре из которых это связи с тетрапирольным кольцом (красный) и еще две: с Шз-18 и Ме1-80 окружаюгцего белка (зеленый) [10].

Рисунок 10 Пространственная структура активного центра цитохрома с (Вш1ше1[, 1990)

Пространственная структура активного центра цитохрома с представляет собой железо (Ре-828-белый) образующие четыре координационные связи с окружающим тетрапирольным кольцом (красный), а также еще две координационные связи с атомом азота гистидина (НЬ-18 (снизу)) и с атомом серы (Ме(-80 (сверху)). Таким образом, активный центр цитохрома с является шестикоординационным (в отличие от других, представленных на Рисунке 7 гем-содержащих белков) [10].

Magnetic Field (mT) Magnetic Field (mT)

Рисунок 11 Серия ЭПР-спектров цитохрома с в комплексе с кардиолипин-содержащими (А) или дицетилфосфат-содержащими (Б) липосомами в различных соотношениях (Nantes, 2001).

А) Видно, что когда соотношение кардиопипин/гщтохром с равно 0, цитохром с находится в низкоспиновом состоянии. Но при увеличении этого соотногиения от 12 до 60 определяется две формы высокоспинового состояния

1- с ромбической симметрией (~150тТ)

2- с аксиальной симметрией (~110тТ)

Тонкая линия (~330тТ) свидетельствует о появлении липидного радикала.

Б) Данный эксперимент проведет при таких otee липид/белковых соотношениях, что и Рис 11 А. Но во всех случаях цитохром с остается только в низкоспиновом состоянии.

ЭПР-спектры были получены при температуре 11К[54].

0,08

0.0«

-I 0.04 о

W X}

0.02 Н

Cyl с~ C-OFC/TOCL Ш г~~

690

1 "Г —

7-10

Рисунок 12 Действие кардиолипни содержащих липосом на шестую координационную связь цитохрома с (К^ап, 2005).

Запись полосы поглощения цитохрома с (695нм) в отсутствии (верхний) и в присутствии кардиолипин-содержащих липосом (нижний). Полоса 695 нм свидетельствует о наличии связи ¥е-Б(Ме1-80) [34].

Wavelength (ntn)

В дополнение к представленным выше данным необходимо познакомиться с результатами работы Oellerich et al., которые выяснили, что влияние додецилсульфата натрия, также приводит к конформационным изменениям в активном центре молекулы цитохрома с, так что теряется связь атома железа с остатком Met-80, и это изменение может способствовать развитию апоптоза, в частности взаимодействию с Apaf-1 [56].

При этом, Nantes et al., продолжая исследования взаимодействия цитохрома с с липидами подтвердили, что взаимодействие цитохрома с с кардиолипин-содержащимц липосомами приводит к потере цитохромом с его шестикоординационной структуры, и при этом резко возрастает пероксидазная активность цитохрома с (Рисунк 11) [54]. также, потеря шестой координационной связи регистрировалась по исчезновению полосы при 695 нм на спектрах поглощения цитохрома с, и изменению спинового состояния ЭГТР-спектров цитохрома с, что более подробно отражено в работах Kagan et al. (Рисунок 12) [34].

3.9 Механизмы регуляции пероксидазной активности цитохрома с

Следующим шагом был поиск возможности регуляции данной активности (Рисунок 11А-Б). Известцо, что оксид азота может взаимодействовать с железом в ферро-состоянии и образовывать нитрозильные комплексы [41, 50, 78, 86].

Fe(II) + NO —» Fe(II) - NO

Также, хорошо известно, что, оксид азота быстро взаимодействует с металлопротеинами, например с гемом [41, 51]. При этом ферментативная активность гемовых белков почти всегда подавляется (за исключением гуанилат циклазы). Но самым важным фактом, в преломлении для данной работы, было подтверждение возможности взаимодействия цитохрома с с оксидом азота, но, как оказалось тогда, эта реакция давала очень низкий выход [1]. Это объясняется тем, что железо гема цитохрома с образует шесть координационных связей и даже малым лигандам таким как перекись водорода или оксид азота, очень трудно получить доступ к активному центру. Но совсем недавно было показано, что присутствие кардиолипина облегчает это взаимодействие (Рисунок 13) [4, 79]. Данные Рисунка 13 говорят о том, что наличие тетраолеоилкардиолпина резко облегчает взаимодействие цитохрома с с оксидом азота, т.е. образование нитрозильного комплекса [79]. Но не менее важно, что действие оксида азота подавляет пероксидазную активность комплекса цитохром с — тетраолеоил кардиолипин, как представлено в следующем эксперименте (Рисунок 14) [79].

2.068 1.986

Рисунок 13 Исследование влияния кардиолипина на нитрозилирование цитохрома с при помощи ЭПР-спектроскопии (У1азоуа, 2006).

На данном рисунке представлены ЭПР спектры нитрозилирования комплекса цитохром с — тетраолеоил кардиолипин. В качестве источника оксида азота использовался N0 донор (ОЕАИОа1е). Концентрация тетраолеоилкардиолипина состовляла: а- ОмМ б-1,5 мМ в- 4 мМ

Реакция была остановлена охлаждением образцов в жидком азоте. Все спектры были записаны при температуре 77К [79].

5 тгп

1 тт

0 -[--1-1-1-!

О 50 100 150 200 0ЕАЫ0а1е, мМ

Рисунок 14 Эффект доноров N0 на пероксидазную активность комплекса цитохром с- тетраолеоил кардиолипинн (\'|;кчоуи, 2006).

Рисунок а - представляет собой ЭПР-спектр этапозидного феноксильного радикала (Е(-О ) образующегося в результате пероксидазной реакции комплекса цитохром с -тетраолео илкардиол ипин.

Рисунок б - четырехминутная кинетика образования этапозидного радикала (Е1-0•) при добавлении к комплексу цитохром с - тетраолеоил кардиолипии перекиси водорода.

Рисунок в - зависимость этапозидного (Е(-О ) сигнала (на пятой минуте реакции) от концентрации донора NО (ОЕАМОа1е) [79].

Данный рисунок показывает проявление пероксидазной активности комплекса цитохром с - тетраолеил кардиолипин, а также подавление пероксидазной активности этого комплекса при действии оксида азота за счет образования нитроз ильных комплексов цитохрома с. Другими словами N0 может действовать как регулятор пероксидазной активности цитохрома с [79].

В 2004 году Ю.А. Владимиров с соавторами показал, что нитрозильные комплексы гемопротеинов таких как гемоглобин и цитохром с подвержены фотолизу при действии лазерного излучения, при этом они распадаются на исходный белок (гемоглобин или цитохром с) и оксид азота. Важно заметить, что после распада нитрозильного комплекса, входящий в его состав белок восстанавливал свою функцию [2].

Иу + с—N0 су 1с Л- N0*.

Авторам было интересно, узнать каково влияние лазерного излучения на нитрозильные комплексы цитохрома с, образованные в присутствии фосфолипидов, и додецилсульфата натрия. А также исследовать изменение пероксидазной активности данных нитрозильных комплексов.

3.10 Превращения фосфолипидов под действием фосфолипазы О

3.10.1 Преобразование фосфатидилхолина до фосфатидной кислоты под действием фосфолипазы И.

Главным образом, уже упомянутые выше, исследования свидетельствуют о возможности активации пероксидазной активности цитохрома с при действии фосфолипидов, но слишком мало внимания было уделено качественному составу мембранных фосфолипидов и главное возможности их преобразования.

На данный момент известно, что в присутствии фосфатидной кислоты, пероксидазная активность цитохрома с резко возрастает. Одновременно, фосфатидилхолин оказывает минимальное воздействие на указанную активацию [37]. При этом, как указано ниже, известно, что фосфолипаза Б способна преобразовывать фосфатидилхолин в соответствующую фосфатидную кислоту [25, 63]. Интересно, было выяснить: Возможна ли активация пероксидазной активности цитохрома с фосфатидилхолином в присутствии фосфолипазы 1)1 Фосфолипаза Б (ЕС 3.1.4.4.) -фосфатидилхолин специфический фермент (хотя существуют данные о его действии и в отношении других фосфолипидов) преобразующий фосфатидилхолин до соответствующей фосфатидной кислоты и холина (Рисунок 15) [25, 35, 63, 70, 71]. prostaglandins thromboxanes, leukolrienas

Inflammation

Ca2+ mobilize ion adenylyl cyclase inhibition. PLC acwaiion

Рисунок 15 Реакции катализируемые фосфолипазами A1,A2,C,D [63].

На данном рисунке представлена схема работы разных классов фосфолипаз (PL). Видно, что действие фосфолипаз А1 (PLAi) и А2 (PLA2) направлены на отщепление дальних или ближних (соответственно) от характеристической группы остатков жирных кислот. Фосфолипдаза С (PLC) приводит к отщеплению характеристической группы вместе с «фосфатом». И главное, Фософолипаза D (PLD) преобразует фосфолипид (например фосфатидилхолин) на соответствующую фосфатидную кислоту и характеристическую группу (в случае фосфатидилхолина -это холин).

Однако, как показали исследования Roberts M.F et al, а также Sugano М et al. в нативном состоянии фосфолипаза D демонстрирует не высокую активность, как результат - огромное количество работ посвящены различным способам активации данного фермента. Среди активаторов и кофакторов фосфолипазы D, главным образом, фигурируют кальций, фосфатидная кислота, стауроспорин (один из самых известных активаторов апоптоза) и пероксид водорода [11, 17, 25, 29, 35, 42, 52, 53, 60, 70, 73]. Причем, в некоторых работах уже представлены результаты в пользу использования фосфолипазы D в составе тест систем на кальций в сыворотке крови [53, 73]. Таким образом, нашли свое отражение наиболее оптимальные способы активации фосфолипазы D, обычно это большое количество кальция (до 5 мМ) и фосфатидной кислоты (до 10% ненасыщенной фосфатидной кислоты липосомы) (Рисунок 16) [25, 70]. в составе фосфатидилхолин содержащей А

Саг* $ = РОРС fl - POPA

Рисунок 16 Модель активации фосфолипазы D при помощи фосфатидной кислоты в фосфатидилхолиновых мембранах. у.

А. В отсутствие Са молекула фосфолипазы D взаимодействует при помощи электростатических взаимодействий с фосфолипидной мембраной содержащей отрицательно зараженные молекулы фосфатидной кислоты (на схеме обозначены у. черным цветом). Но присутствие Са , таким образом модифицирует структуру фосфолипазы, что ее активные центры блиэ1се приближаются к мембране, где происходит преобразование фосфатидилхолина, при этом сильно повышается эффективность данной реакции.

При этом, почти нулевая эффективность фосфолипазной реакции, в отсутствие и Са и фосфатидной кислоты схематично выражено на рисунке В. РОРС— пальмитоилолеоил фосфотидилхолин POPA— пальмитоилолеоил фосфатидная кислота PLD — фосфолипаза D

Для подтверждения указанных выше фактов в работах Mary F. Roberts et al. был проведен ряд исследований, результаты которых представлены ниже. ошег 1саЯе1 тпег сЬсНпе

3.22 3.16 3.10 3.04 ррш Рисунок 17 500МГц *Н ЯМР спектры (3.27-2.80ррт) малых однослойных липосом содержащих 10 мМ РОРС (в 5мМ Са2+, 50мМ имидазол, рН 7.2, ЗОС) как функция времени инкубации с РЮ (1.2мкг) из 5. скгото/шст [25]

На данном рисунке (Рисунок 17) представлены спектры ЯМР фосфатидилхолин-содержащих липосом в присутствии фосфолипазы Э. Видно, что после инкубации фосфатидилхолин-содержащего образца с фосфолипазой Э, как разультат ферментативной реакции, происходит увеличение количества холина [25]. Также на основании 'Н ЯМР исследований была экспериментально подтверждена необходимость присутствия Са в данной системе (Таблица 1)

Таблица 1 Зависимость ферментативной активности фосфолипазы D от количества добавлнного в систему Са2+ и фосфатидной кислоты [25].

Относительный показатель активности фосфолипазы

Са2^ РОРС РОРС/РОРА (9:1) РОРС/РОРА (8:2) РОРС/РОРА (7:3) ты

0.5 1.0 0.49

1 1.25 2.63

2 1.50 5.76

3 3.51 16.7

5 3.50 17.8 31.3 29.1

По результатам данной таблицы видно, что увеличение количества Са2+ приводит к резкому и многократному (особенно при условии добавления в состав липосом хотя бы 10% фосфатидной кислоты) увеличению активности фосфолипазы Б. Результаты данного исследования наглядно подтверждают упомянутый выше факт существенного влияния фосфатидной кислоты на увеличение активности фосфолипазы Б (Рисунок 18) [25].

Рисунок 18 Специфическая активность S.c/tromofuscus фосфолипазы D в условии возрастающего количества фосфатидилхолина, а также в отсутствии и присутствии фосфатидной кислоты.

Образцы содержали: в 5мМ Са2+, 50мМ имидазол, рН 7.2, ЗОС, PLD (1.2мкг) из S.chromofuscus (нижняя кривая), а также в присутствии 10% фосфатидной кислоты (POPA)(верхняя кривая) [25]. При этом по оси абсцисс отлоэюены концентрации фосфатидилхолина в изучаемой экспериментальной модели, а по оси ординат специфическая активность S.chromofuscus фосфолипазы D [25].

3.10.2 Фосфолипаза D в митохондриях Упомянутые выше исследования были проведены на модельных системах. Однако остался невыясненным факт - Существуют ли процессы в нашем организме, где прослеживается связь между фосфолипазой D и апоптозом.

В связи с этим, необходимо отметить, что в последние несколько лет активно развивается концепция о постоянном разделении и слиянии митохондрий (mitochondrial fission and fusion) во время жизни клетки и целого организма. Вопреки предыдущим данным, оказалось, что митохондрии - много более динамичная структура. В некоторых типах клеток, митохондрии, так активно делятся и сливаются, что даже могут образовывать некоторую непрерывную сеть [15]. При этом, необходимо сказать, что в процессе деления и слияния митохондрий принимают участие огромное количество белков регуляторов, повреждение которых приводит к дисрегуляции процессов разделения и слияния. В качестве примера, на указанный процесс могут влиять даже вирусные инфекции [51, 83]. Ярким примером является цитомегаловирусная инфекция, присутствие которой приводит к нарушению процесса деления митохондрий, и как следствие подавлению процесса апопотза [6, 38, 61]. Говоря о фосфолипазе D (PLD), Choi и др. в своей работе показали взаимосвязь между действием PLD и процессом митохондриального деления [16]. В данных экспериментах снижалась экспрессия фосфолипазы D, либо при нормальной экспрессии производилась мутация каталитического домена, что в обоих случаях приводило к недостаточному слиянию митохондрий [16]. А как уже упоминалось ранее, нарушение митохондриальной целостности может приводить к програмируемой клеточной гибели.

В результате анализа данных литературы можно поставить цель и сформулировать следующие задачи исследования:

Цель исследования

Исследование структурных и ферментативных изменений цитохрома с при взаимодействии с биологическими мембранами, а также регуляция его ферментативной активности при помощи оксида азота и лазерного излучения.

Задачи исследования

1. Выявление структурных и ферментативных изменений цитохрома с при его взаимодействии с рядом мембранных фосфолипидов.

2. Регуляция ферментативной активности цитохрома с при действии окисда азота и лазерного излучения

3. Влияние температуры и ионной силы среды взаимодействия цитохрома с с фосфолипидами на эффективность протекания пероксидазной реакции.

4. Измерение сродства комплексов фосфолипид/цитохром с методом поверхностного плазмонного резонанса.

5. Преобразование фосфатидилхолина (мембран митохондрий и собственно митохондриальных частиц) с помощью фосфолипазы Б, а также последущая активация пероксидазной активности цитохрома с продуктами фосфолипазной реакции (фосфатидной кислотой).

6. Усиление пероксидазной активности цитохрома с митохондриальными фософлипидами после действия фосфолипазы Б. И регуляция указанной активности при помощи оксида азота и лазерного излучения.

4 Материалы и методы

4.1 Реактивы

В работе использовали цитохром с из сердца лошади (Sigma,США); тетраолеоил кардиолипин (TOCL); тетрамеристоил кардиолипин (TMCL); диолеоил фосфатидная кислота (DOPA); дистеароил фосфатидная кислота (DSPA); диолеоил фосфатидилсерин (DOPS); дистеароил фосфатидилсерин (DSPS); пальмитоил-стеароил фосфатидилхолин (PSPC); диолеоил фосфатидилхолин (DOPC) и дистеароил фосфатидилхолин (DOPC) -все от (Avanti Polar Lipids, США); додецилсульфат натрия (Sigma,США), фосфолипаза D из Streptomyces chromofuscus (ЕС 3.1.4.4), а также насыщенный раствор оксида азота в фосфатном буфере, полученный продуванием газообразного N0 через фосфатный буфер (pH 7,4).

Большинство исследований проведено с использованием воды - 18,2 МОм*см

4.2 Приготовление многослойных и однослойных липосом

Для приготовления многослойных липосом - один из представленных в разделе реактивы фосфолипидов (например, TOCL) смешивался с насыщенным фосфатидилхолином (PSPC) в эквимолярных количествах, при этом сначала навеска каждого липида отдельно растворялась в хлороформе (либо смеси Фолча — хлороформ:метанол:вода в объемном соотношении 64:36:8, соответственно) и лишь после этого они смешивались между собой, после чего растворитель удаляли, продувая смесь липидов аргоном. Затем добавляли фосфатный буфер (pH 7,4) от ЮмМ до 150мМ (в зависимости от условий эксперимента), и интенсивно перемешивали на шейкере до полного образования грубой суспензии (с целью получения многослойных липосом), после чего, при необходимости получения однослойных липосом суспензию озвучивали в ультразвуковой ванне (35кГц, 10мин,37С) до образования полупрозрачного опалесцирующего раствора липосом. Суммарная концентрация липидов варировала в зависимости от условий эксперимента.

В некоторых исследованиях, полученные однослойные липосомы могли быть калиброваны по размеру 0,1мкМ с помощью шприца-экструдера (Cat# 610000, Avanti Polar Lipids, США).

4.3 Приготовление насыщенного раствора оксида азота

Для приготовления насыщенного раствора оксида азота 10 мл воды либо 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,4) интенсивно продували аргоном в течение 5 мин, а далее оксидом азота, также в течение 15 мин до получения насыщенного раствора. При этом в момент продувания и на протяжении всего исследования пробирка с раствором оксида азота должна находиться на льду. Концентрация насыщенного раствора N0 в буфере составляла примерно 2-3 мМ.

4.4 Люминол—зависимая хемилюминесценция

Для измерения свечения, возникающего в пероксидазной реакции с участием цитохрома с, использовали хемилюмипометры LKB 1251 (Швеция) и XJIM-3 (Бикап, Россия). В качестве активаторов пероксидазной активности цитохрома с использовались одно- и многослойные липосомы (в том числе калиброванные по 0,1мкм мембране) содержащие (TOCL, TMCL, DOPA, DSPA, DOPS, DSPS, DOPC, DSPS, PSPC). При этом, соотношение фосфолипид/цитохром с составляло от 0 до 20. В качестве субстрата и индикатора пероксидазной реакции использовали от 0,02 до 0,1 мМ перекиси водорода и от 0,25 до 0,5 мМ раствора люминола. Все эксперименты проводили при непрерывном перемешивании образца и постоянной температуре 22 либо 37°С.

4.5 Спектрофотометрия

Для измерения спектра поглощения цитохрома с, а также его ответа на добавление аскорбата использовался спстрофотометр SPECORD 200 (Analytic Jena, Германия), либо BECKMAN 65 (Beckman, США). Измерения проводились в стеклянной кювете с длинной оптического пути - 1см, при температуре 22 °С, диапазон длин волн не выходил за пределы видимой области.

4.6 ЭПР-Спектроскопия

Для регистрации пероксидазной реакции использовался ЭПР-спектрометр (Varían 4, США). В качестве индикатора действия Соединения I (Compound I) цитохрома с использовался раствор этопозида (Et-OH), который в результате пероксидазной активности цитохрома с образует этопозидный фепоксильный радикал (Et-O) (Рисунок 19). Измерения проводились при температуре 22 °С.

Рисунок 19 Этопозид, как индикатор интенсивности пероксидазной реакции.

Рисунок А — представляет собой химическую формулу этопозида, который превращается в этопозидный феноксильный радикал (Б), что происходит при действии пероксидаз, в частности циторома с, если он предварительно взаимодействовал с анионными липидами (кардиолипин, фосфатидилсерии) и анионными детергентами (додецилсулъфат натрия).

1.1 Поверхностный плазмонный резонанс

Измерение констант ассоциации цитохрома с к ряду указанных выше фосфолипидов производилось при помощи прибора Biacore 3000 (Biacore, Швеция). Все исследования были проведены и использованием липидного биосенсорного чипа LI (Biacore, Швеция).

Биосенсорный чип представляет из себя тонкую золотую пластинку с иммобилизированными на поверхности декстрановыми соединениями (Рисунок 20). Причем, характерной особенностью биосенсорного чипа L1 является то, что на упомянутых декстрановых «ниточках» ассоциированы липофильные группы, на которые происходит иммобилизация фосфолипидов. Необходимо отметить, что конструкция измерительной камеры сконфигурирована таким образом, что образует четыре экспериментальных канала (при помощи специальной накладки, Рисунок 20), впоследствии действующих параллельно, но одновременно существует техническая возможность коммутировать их практически в любой последовательности. При этом, перед началом иммобилизации фосфолипидов необходимо проведение предварительной подготовки биосенсорного чипа, для этого: через его каналы пропускается 20мМ CHAPS со скоростью Юмкл/мин в течение 5 минут, после чего производится его отмывка пропусканием 30% этанола (5мкл/мин, 3 минуты). В наших исследованиях канал №4 всегда содержал PSPC и

-С

Каналообразующая накладка с указанием направления тока аналита (буферного раствора)

Золотой биосенсорный чип И (с липофильными группами) \ р-поляризованный поворот на 9(Т

Образец

- 6 • „ * . • ' о л * * * V.

Измерение угла отражения

Биосенсорный чип I-1 Каналообразующая с липофильными группами) накладка

Рисунок 20 Схематическое изображение измерительной ячейки в приборе В1АСОМС 3000.

Рисунок А. Схема биосенсерного чипа Ы с указанием направления тока аналита через измерительные каналы.

Рисунок Б Схема измерения угла отражения (в) при котором достигается эффект полного внутреннего отражения, а именно угла при котором интенсивность отраженного света минимальна.

Рисунок В. Схема тока аналита с измеряемым образцом (в нашем случае Цитохром с - обозначен как белый круг) через каналы биосенсорого чипа Ы на которые предварительно иммобилизирован второй исследуемый компонент (в нашем случае: фосфолипиды - обозначены на схеме, как триугольники, квадраты и т.п.), с разними константами ассоциации, и как следствие с разным количеством исследуемого вещества (цитохрома с) иммобилизирован кого на фосфолипиды. использовался как канал сравнения. Каналы №2 и №3 использовались как экспериментальные (в них иммобилизировались насыщенные и не насыщенные: кардиолипин, фосфатидная кислота и фосфатидилсерин). Все липиды иммобилизировались путем инжекции фосфолипидных липосом (Юмкл/мин, ЗОминут). После завершения иммобилизации фосфолипидов, через каналы пропускается ЮмМ ИаОН для отмывки плохоиммобилизированных компонентов и стабилизации базовой линии. После фосфолипидной иммобилизации в аналит(буфер), протекающий по каналам измерительной камеры, добавлялся бычий сывороточный альбумин (БСА) - 1мг/мл (Юмкл/мин, 20минут), с целью закрыть незанятые сайты связывания на поверхности биосенсорного чипа и предупредить неспецифическое взаимодействие экспериментальных образцов. Одновременно, БСА ассоциируется на поверхности свободного канала №1, и также как и РБРС (Канал №4) является каналом сравнения. После обработки с помощью БСА - система дважды промывалась ЮмМ ЫаОН с целью стабилизации базовой линии (дважды по Юмкл/мин, 1 минуту). Необходимо отметить, что иммобилизация анионных фосфолипидов к отрицательно заряженному биосенсорному чипу происходит с низкой эффективностью в условиях невысокой ионной силы. Для решения этой проблемы в раствор фосфолипидных липосом добавлялся 0,5мМ ИаС1, с целью временного повышения ионной силы системы.

В завершение, после фосфолипидной иммобилизации производилось титрование всех каналов системы цитохромом с. Инжекции цитохрома с производились при скорости 5мкл/мин в течение 6 минут каждая. После завершения очередной добавки цитохрома с, чтобы удалить его остатки, все каналы оптического чипа промывались ЮмМ №ОН (Юмкл/мин, 2 минуты). В результате указанных выше исследований строиться ряд кривых, пример которых представлен па рисунке 52.

Анализ результатов производился с помощью программного обеспечения В1Ае\'а1иа1лоп \'4.1 (В1асоге). Константа ассоциации рассчитывалась из полученной при исследовании кривой насыщения (Ленгмюра) (Рисунок 21): где по оси абсцисс отложена концентрация цитохрома с (С), которой производилось титрование, а по оси ординат амплитуды резонансных сигналов соответствующих добавленным концентрациям цитохрома с (11^) ■

Расчет производился согласно уравнению 1: уравнение 1) где Ка - константа ассоциации, Rmax - максимальное (асимптотическое) на полученной кривой насыщения (Ленгмюра). При этом необходимо отметить, что экспериментальны точки на кривой насыщения обязательно апроксимировались (fitting) согласно уравнению н

Концентрация цитохрома с, М

Рисунок 21. Кривая насыщения (Ленгмюра) фосфолипидных мембран на поверхности биосенсорного чина L1 при титровании возрастающими концентрациями цитохрома с

В данном исследовании, цитохром с возрастающих концентраций (от Ю-бООмкМ) ассоциировался к фосфолипидной мембране на поверхности биосенсорного чипа L1 содержащий TOCL в экспериментальном канале. И PSPC в референсном. В качестве буфера для приготовления растворов соединений и аналита использовался PBS, рН 7,4.

Подбор оптимального контрольного образца для исследований сродства фосфолипидов к цитохрому с методом поверхностного плазмонного резонанса

В качестве такого вещества фирма производитель прибора рекомендует бычий сывороточный альбумин, но во всех наших предыдущих исследований в качестве «ноль»-контроля (отрицательного контрольного образца) выступал РБРС (пальмитоил-стеароил фосфатидилхолин) демонстрирующий минимальный эффект на увеличение пероксидазной активности цитохрома с. С целью сравнения эффективности действия этих двух контрольных элементов была проведена серия исследований, в которых, при подготовке биосенсорного чипа Ы к измерениям: в один канал ассоциировался БСА, во второй РБРС (и это будут два контрольных канала). После чего, в третий канал ассоциировался ТОСЬ. Далее с целью выявления наиболее адекватного контрольного образца Через все три канала, параллельно, пропускался раствор цитохрома с возрастающих концентраций (от ЮмкМ до ЮОмкМ), и строились кривые: канал 3(с ТОСЬ) минус канал 1 (с БСА) (Пунктирные кривые, Рисунок 22), а также канал 3(с ТОСЬ) минус канал 2 (с РБРС) (Непрерывные кривые, Рисунок 22) На этом рисунке видно, что амплитуда сигналов при титровании ТОСЬ содержащего канала (по отношению к контрольным образцам с БСА и с РБРС) на поверхности биосенсорного чипа 1Л возрастающими концентрациями цитохрома с (10- ЮОмкМ) имеет практически одинаковую амплитуду, что говорит о почти полной схожести параметров ассоциации примененных контрольных образцов. Таким образом, во всех последующих исследованиях в качестве контрольного образца выступает РБРС (пальмитоил-стеароил фосфатидилхолин).

Время, с

Рисунок 22. Использование БСА и PSPC в качестве контролей при определении констант связывания между цнтохромом с и TOCL

Кривые указанные на данном рисунке соответствуют амплитуде резонансного сигнала прибора при титровании TOCL содержащей мембраны на поверхности биосенсорного чипа LI возрастающими концентрациями цитохрома с (Ю-100мкМ). Непрерывные кривые - измерения, где в качестве контроля выступал PSPC; Пунктирные кривые - измерения, где в качестве контроля выступал БСА. В качестве аналита и буферного раствора при приготовлении всех компонентов использовался PBS pH 7,4 (Копия рисунка 51)

4.8 Измерение флуоресценции триптофана-59 цитохрома с.

Флуоресценция триптофана-59 измеряли при помощи спектрофлуориметра Hitachi 4000 (Hitachi, Япония). В данных исследованиях использовался тот же ряд фосфолипидов, который применялся и для исследования люминол-зависимой хемилюминесценции (а именно: TOCL, TMCL, DOPA, DSPA, DOPS, DSPS, PSPC). Флуресценция триптофана-59 выполнялась при - 279нм (что соответствует максимуму кривой возбуждения - данные не представлены), спектр испускания записывался от 300 до 400нм. Все растворы приготавливались с использованием фосфатного буфера 10мМ, pH 7,4.

4.9 Измерение активности фосфолипазы Б

4.9.1 Взаимодействие фосфолипазы £) с симметричными и асимметричными фосфатидилхолинами.

В соответствии с указанным выше пунктом, производилось приготовление липосом, содержащих ассиметричеые (ЭОРС или ОБРС), либо симметричный БОРС фосфатидилхолны в количестве 0,9мкмоль. Необходимо отметить, что в состав буферного раствора входил СаСЬ (ЗшМ) . Полученный раствор фосфолипидов озвучивался в ультразвуковой ванне (35кГц, Юмин, 37С) до получения однослойных липосом (Материалы и методы: Приготовление многослойных (мультиламелярных), либо однослойных липосом). Далее к полученным липосомам добавляли 0,9 либо 1,8ед. фосфолипазы Э и инкубировали при постоянном перемешивании и температуре 37С от 0 до 60 минут (в зависимости от условий эксперимента).

После инкубации, с целью удаления кальция, к реакционной смеси добавляли ЕОТА (5тМ) и повторно инкубировали па шейкере 1800 об./мин при комнатной температуре, 10 минут. Следующим шагом, с целью выделения липидной части, следовало разделение реакционной смеси на гидрофобную и гидрофильную части в градиенте хлороформ/метанол: на ~500мкл реакционной смеси добавляли 200мкл метанола и интенсивно встряхивали (вручную, 1мин), за тем следовала добавка ЗООмкл хлороформа и снова встряхивание (вручную, 1мин). Разделение на гидрофобную и гидрофильную фракции ускорялось центрифугированием (7000g, 20 секунд). Далее гидрофобная фракция (содержащая фосфолипиды) перемещалась в отдельную пробирку и продувалась аргоном до полного удаления растворителя. Полученные, в результате, фосфолипидные пленки растворялись в 10 мМ фосфатном буфере и озвучивались на УЗ-ванне (35кГц, Юмин, 37С). Полученные после озвучивания липосомы использовались, как активаторы пероксидазной активности цитохрома с, которая изучалась при помощи люминол-зависимой хемилюминесценции.

4.9.2 Взаимодействие фосфолипазы D с фосфолипидами митохондриалъных мембран:

Приготовление митохондриальных фосфолипидов:

В результате выделения митохондрий из печени крысы по стандартной методике Sigma (Cat # MITOISOl), получилось 78 мг/мл митохондрий по белку (согласно методике Sigma Т1449-биуретовый метод). Для выделения митохондриальных липидов было взято 1000 мкл выделенных (но предварительно хранившихся в морозильной камере) митохондрий. Далее полученные митохондрии разделялись на две пробирки по 500 мкл, для разделения на гидрофобную и гидрофильную фракции в градиенте хлороформ/метанол. Сначала, в каждую пробирку добавлялись 500 мкл метанола и интенсивно встряхивались (вручную, 1 минута). Далее в каждую пробирку добавляли 300 мкл хлороформа и также интенсивно встряхивали (вручную, 2 минуты), после чего обе пробирки центрифугировались при 7000g, 20 секунд. Далее гидрофильная часть отбрасывалась, а в оставшуюся гидрофобную часть, содержащую большое количество митохондиальных и клеточных остатков (в виде нерастворенной взвеси), добавлялось еще ЗООмкл хлороформа (в обе пробирки). После чего, вновь производилось интенсивное встряхивание (вручную, 2 минуты) и центрифугирование (7000g, 20 секунд). Далее прозрачная (слабо опалесцирующая) гидрофобная часть из обеих пробирок переносилась в отдельную, предварительно взвешенную пробирку. Как и в предыдущем пункте, растворитель полностью удалялся при продувании данной пробирки аргоном. И при помощи повторного взвешивания рассчитывался вес сухого гидрофобного остатка, он составлял от 8 до 10мг. Далее рассчитывалась приблизительное количество фосфолипида в данном остатке, при этом, условно, его молекулярная масса принималась равной 750. Таким образом, общее количество фосфолипида — менее чем 7мкмоль. Данный сухой остаток заливался ЮООмкл буферного раствора содержащего СаС1г(ЗтМ). И озвучивался в ультразвуковой ванне (35кГц, 5 мин, 37С) до получения однослойных липосом. Все последующие действия по инкубации липосом с фосфолипазой D, и выделением гидрофобной части, соответствует п.1 данного раздела (Взаимодеймствие фосфолипазы D с симметричными и асимметричными фосфатидилхолинами). Отличием является лишь то, что ЮООмкл полученных липосом разделялись на 4 равные части, и к каждой добавлялось по 3,2 ед. фосфолипазы D. После чего, следовала добавка фосфатного буфера (по ЗООмкл) в каждую из 4-ех пробирок. А также озвучивание в УЗ-ванне (35кГц, 5 мин, 37С) до получения однослойных липосом. Полученные после озвучивания липосомы использовались, как активаторы пероксидазной активности цитохрома с, которая изучалась при помощи люминол-зависимой хемилюминесценции.

4.9.3 Взаимодействие фосфолипазы И с мембранами митохондрий Для проведения данного исследования, в выделенных аналогично п.2 данного раздела (Взаимодействие фосфолипазы Б с фосфолипидами митохондриальных мембран) митохондриях сначала производилось разбиение митохондрий на митохондриальные частицы при помощи озвучивания в УЗ-ванне (35кГц, 5 мин, 37С). Далее с целью ингибирования сторонних ферментов производилась добавка Азида натрия (ЮмМ), либо БТЫВ (дитионитробензойная кислота) (ЮмМ) приблизительно на 46мг митохондрий (измеренных по белку - биуретовым методом). И производилась инкубация на шейкере 1800об./мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее с целью отмыть митохондриальные частицы от добавленных ингибиторов ферментов, производилась двойная отмывка в 100 кратном объеме буферного раствора при 11000§, 10 минут и 4С (на центрифуге НеШсЬ 11о1лпа 3811, Германия). После отмывки, полученый осадок (в каждой из двух пробирок) ресуспендировался в буферном растворе содержащим СаС1г(ЗшМ). Полученные объемы, а именно 800мкл митохондриальных частиц инкубированных и Азидом нтария и 800мкл митохондриальных частиц инкубированных и ОТИВ разливались на 4 пробирки (по 200мкл). К каждой добавлялось еще по 800мкл Тбуферного раствора содержащего СаС12(ЗтМ) и фосфолипаза Э (варьирующее количество в зависимости от условий эксперимента от 1 до Юед.). Производилась инкубация во временном интервале от 0 до 60 минут (в зависимости от условий эксперимента). Далее производилась отмывка центрифугированием при 11000§, 10 минут и АС. После чего, полученный осадок заливался фосфатным буфером ЮмМ, рН 7.4 в количестве ЮООмкл на каждую пробирку (всего пробирок: 4 после инкубации с азидом натрия и 4 после ОТЫВ). Полученные после инкубации с азидом натиря или ОТЫВ, и в обоих случаях с фосфолипазой Б, митохондриальные частицы использовались, как активаторы пероксидазной активности цитохрома с, которая изучалась при помощи люминол-зависимой хемилюминесценции.

4.10 Статистическая обработка

В данной работе, запись измеряемых параметров производилась в виде (среднее значение ± стандартное отклонение), с количеством измерений 4-10. Расчет производился с помощью пакета анализа программы MS Excel.

• Примечание к экспериментальным данным посвященным влиянию ионной силы на эффективность взаимодействия цитохрома с с фосфолипидами Очень часто фигурирует понятие «ионная сила» — в данной работе она соответствует концентрации растворенных солей (и имеет размерность молярной концентрации), а не определяется формулой

1 = \ I¿(zi' сд> где

I - ионная сила раствора,

Z-заряд i-ого иона (например z(Na+)= +1), с, - молярная концентрация данного иона (моль/л)

• Поиск научной литературы в данной работе осуществлялся при использовании международного ресурса PubMed

При поиске научной литературы использовались поисковые предложения, основа которых указанна ниже:

1. ("Cytochrome-c Peroxidase "[Mesh] OR "Cytochromes c"[Mesh]) AND peroxidas*[ti]

2. ("Cytochrome-c Peroxidase "[Mesh] OR "Cytochromes c"[Mesh]) AND apopt*[ti]

3. ("Cytochrome-c Peroxidase"[Mesh] OR "Cytochromes c"[Mesh]) AND Kagan[au]

4. ("Surface Plasmon Resonance"[Mesh] OR SPR) AND "cytochrome c"[ti]

5. "Phospholipase D"[Mesh] AND chromofiiscus AND activation[ti] и др.

- в некоторых случаях были использованы возможности Web - ресурса (www.pubmed.gov) при поиске работ следующих авторов - (Anatoly N. Osipov; Yuri A. Vladimirov; Valerian E. Kagan; Anatoly F. Vanin; Dmitriy A. Svistunenko; Andrey V. Kozlov; Mary F. Roberts)

5 Результаты

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Степанов, Герман Олегович

7 Выводы

Изучение комплексов цитохрома с с фосфолипидными мембранами показало, что:

1. Взаимодействие цитохрома с с такими фосфолипидами, как TOCL, TMCL, DOPA, DSPA, DOPS, DSPS, DOPC, PSPC или додецилсульфатом натрия приводит к резкому усилению пероксидазной активности цитохрома с (примерно в 20 раз для TOCL; в 14 - для DOPA; 6,5 - для DOPS; 2-2,5 - для DSPA,TMCL,DSPS и почти не меняется в присутствии PSPC и DOPC).

Структурные изменения пространственной структуры активного центра цитохрома с оцениваемые по флуоресценции триптофана-59 в молекуле цитохрома с уменьшаются в ряду TOCL-»DOPA-»TMCL-»DOPS-»DSPA-»DSPS-*PSPC. Эти результаты наглядно демонстрируют параллелизм изменения структуры активного центра цитохрома с и его ферментативной активности.

2. Оксид азота подавляет пероксидазную активность комплексов цитохрома с с фосфолипидами (степень подавления напрямую зависит от структуры предварительно добавленного фосфолипида и концентрации оксида азота). Уменьшение пероксидазной активности в присутствии оксида азота наблюдается у всех исследованных комплексов цитохрома с с фосфолипидами (TOCL, DOPA, TMCL, DOPS, DSPA, DSPS, DOPC,PSPC) и составляет при концентрации оксида азота 0,1 мМ не более 40%. Воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения (532нм, 15мин , 50мВт) способствовует частичному восстановлению пероксидазной активности комплексов цитохрома с При этом, наибольшей эффективностью (восстановление на 120-124% ) обладают TOCL, DOPA, (DOPS -занимает пограничное положение).

3. Повышение ионной силы от 10 до 150 мМ резко снижает пероксидазную активность комплексов фосфолипидов с цитохромом с. Для DOPA (диолеоил фосфатидной кислоты) указанная эффективность падает более чем в 6 раз. Одновременно нагревание этой же системы от 25 С до 37 С приводит к увеличению пероксидазной активности цитохрома с приблизительно в 3 раза. Однако, если рассматривать отношения эффективности действия DOPA/DSPA при различных условиях, то это отношение тем больше, чем ниже температура и ниже ионная сила (например отношение активности действия DOPA/DSPA при 25С и ионной силе ЮмМ равна 13,1; в то время как при 37С и ионной силе 150мМ это значение равно всего 1,5). Представленные результаты, главным образом, свидетельствуют об ослаблении электростатических взаимодействий в системе фосфолипид/цитохром с при повышении ионной силы.

4. Методом поверхностного плазмонного резонанса измеряли сродство (в виде констант ассоциации) цитохрома с как к насыщенным, так и ненасыщенным фосфолипидам. Можно видеть, что константы ассоциации зависят только от характеристической группы фосфолипида, но не от присутствия насыщенных жирнокислоных остатков, эти величины имеют следующие значения:

Ка (СуЮ-Б8Р8) = (6,31 ± 1,51)Е-3 М"1; Ка (С^С-БОРБ) = (5,63 ± 1,35)Е-3 М'1; Ка (С^С-БЭРА) = (2,16 ± 0,60)Е-3 М"1; Ка (Су1С-БОРА) = (2,22 ±0,53)Е-3 М'1; Ка (СуЮ-ТМСЬ) = (2,15 ± 0,62)Е-4 М"1; Ка (СугС-ТОСЬ) = (9,78 ± 2,35)Е-3 М"1

Полученные данные подтверждают тот факт, что активация пероксидазной активности цитохрома с является сложным процессом, зависящим не только от гидрофобных и электростатических взаимодействий, а также от структуры фосфолипидов.

5. Было обнаружено, что взаимодействие цитохрома с с фосфатидилхолином в присутствии фосфолипазы Б, также приводит к многократной активации пероксидазной активности цитохрома с. Это явление можно объяснить таким образом, что фосфолипаза Б превращает фосфатидилхолин в соответствующую фосфатидную кислоту. Указанный факт наблюдался, как на синтетических фосфолипидах (активация в 21-90 раз в зависимости от фосфолипида), на липидах экстрагированных их митохондрий (активация в 18 раз), так и на целых митохондриальных частицах (активация в 3-3,5 раза).

Продукты, образующиеся в результате действия фосфолипазы Б на ассиметричные фосфатидилхолины (80РС и ОБРС) стимулировали пероксидазную активность цитохрома с в 2,5 - 3,5 раза хуже, чем с симметричным аналогом - БОРС (увеличение пероксидазной активности в 90).

6. Пероксидазная активность комплексов цитохрома с с фосфатидной кислотой, полученных в результате реакции фосфолипазы Б с митохондриальными фосфолипидами, подавлялась в присутствии оксида азота (примерно в 2 раза). При этом, действие лазерного излучения (532нм, 50мВт,15мин) также приводило к восстановлению пероксидазной активности на-45%.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Степанов, Герман Олегович, 2009 год

1. Борисенко Г. Г., Постнов, С. С., Казаринов, К. Д., Осипов, А. Н., Владимиров, Ю. А.: Нитрозильные комплексы цитохромов митохондриальной цепи-первиченые хромофоры в механизме фотоактивации дыхания // Биол мембраны 2002. № 19. С. 356.

2. Владимиров Ю. А., Клебанов Г. И., Борисенко Г. Г., Осипов А. Н.: Молекулярные и клеточные механизмы действия низкоинтенсивного лазерного излучения. // Биофизика. 2004. № 49. С. 339-350.

3. Владимиров Ю. А., Осипов А. Н., Клебанов Г. И.: Фотобиологические основы терапевтического применения лазерного излучения. // Биохимия. 2004. № 69. С. 103-113.

4. Осипов А. Н., Степанов Г. О., Владимиров Ю. А., Козлов А. В., Каган В. Е.: Регуляция пероксидазной активности цитохрома с с посощью оксида азота и лазерного излучения. // Биохимия. 2006. № 10. С. 1392-1398.

5. Abud Н. Е.: Shaping developing tissues by apoptosis. // Cell Death Differ. 2004. № 11. P. 797-799.

6. Arnoult D., Gaume В., Karbowski M., Sharpe J. C., Cecconi F., Youle R. J.:, Mitochondrial release of aif and endog requires caspase activation downstream of bax/bak-mediated permeabilization. // Embo J. 2003. № 22. P. 4385-4399.

7. Baliga В., Kumar S.: Apaf-1/cytochrome с apoptosome: An essential initiator of caspase activation or just a sideshow? // Cell Death Differ. 2003. № 10. P. 16-18.

8. Berglund G. I., Carlsson G. H., Smith А. Т., Szoke H., Henriksen A., Hajdu J.: The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution. // Nature. 2002. № 417. P. 463468.

9. Biswal В. K., Vijayan M.: Structures of human oxy- and deoxyhaemoglobin at different levels of humidity: Variability in the t state. // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2002. № 58. P. 1155-1161.

10. Bushnell G. W., Louie G. V., Brayer G. D.: High-resolution three-dimensional structure of horse heart cytochrome c. // J Mol Biol. 1990. № 214. P. 585-595.

11. Butikofer P., Yee M. C., Schott M. A., Lubin В. H., Kuypers F. A.: Generation of phosphatidic acid during calcium-loading of human erythrocytes. Evidence for a phosphatidylcholine-hydrolyzing phospholipase d. // Eur J Biochem. 1993. № 213. P. 367-375.

12. Cell Signaling Technology Inc. Электронный ресурс. URL: http://www.cellsignal.com/reference/pathway/pdfs/ApoptosisMitochondrial.pdf.дата обращения: 19.05.2009)

13. Cell Signaling Technology Inc. Электронный ресурс. URL: http://www.cellsignal.com/reference/pathway/pdfs /DeathReceptor. pdf (дата обращения: 19.05.2009)

14. Chen H., Detmer S. A., Ewald A. J., Griffin E. E., Fraser S. E., Chan D. C.: Mitofusins mfiil and mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. // J Cell Biol. 2003. № 160. P. 189-200.

15. Choi S. Y., Huang P., Jenkins G. M., Chan D. C., Schiller J., Frohman M. A,: A common lipid links mfn-mediated mitochondrial fusion and snare-regulated exocytosis. // Nat Cell Biol. 2006. № 8. P. 1255-1262.

16. Clark C. S., Maurelli А. Т.: Shigella flexneri inhibits staurosporine-induced apoptosis in epithelial cells. // Infect Immun. 2007. № 75. P. 2531-2539.

17. Crompton M.: Mitochondrial intermembrane junctional complexes and their role in cell death. // J Physiol. 2000. № 529 Pt 1. P. 11-21.

18. Crompton M.: The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. // Biochem J. 1999. № 341 ( Pt 2). P. 233-249.

19. Crow M. Т., Mani K., Nam Y. J., Kitsis R. N.: The mitochondrial death pathway and cardiac myocyte apoptosis. // Circ Res. 2004. № 95. P. 957-970.

20. Dijkstra C. D.: nobel prize for physiology or medicine 2002 is awarded for research into the genetic regulation of organ development and programmed cell death. // Ned Tijdschr Geneeskd. 2002. № 146. P. 2525-2527.

21. Erwig L. P., Henson P. M.: Clearance of apoptotic cells by phagocytes. // Cell Death Differ. 2008. № 15. P. 243-250.

22. Fiedler T. J., Davey C. A., Fenna R. E.: X-ray crystal structure and characterization of halide-binding sites of human myeloperoxidase at 1.8 a resolution. // J Biol Chem. 2000. № 275. P. 11964-11971.

23. Geng D., Chura J., Roberts M. F.: Activation of phospholipase d by phosphatide acid. Enhanced vesicle binding, phosphatidic acid-ca2+ interaction, or an allosteric effect? // J Biol Chem. 1998. №273. P. 12195-12202.

24. Gottlieb E.: Opal and pari keep a lid on apoptosis. // Cell. 2006. № 126. P. 27-29.

25. Gustafsson A. B., Gottlieb R. A.: Autophagy in ischemic heart disease. // Circ Res. 2009. № 104. P. 150-158.

26. Gustafsson A. B., Gottlieb R. A.: Recycle or die: The role of autophagy in cardioprotection. // J Mol Cell Cardiol. 2008. № 44. P. 654-661.

27. Halenda S. P., Rehm A. G.: Evidence for the calcium-dependent activation of phospholipase d in thrombin-stimulated human erythroleukaemia cells. // Biochem J. 1990. № 267. P. 479-483.

28. Hardy K.: Apoptosis in the human embryo. // Rev Reprod. 1999. № 4. P. 125-134.

29. Helewski K. J., Kowalczyk-Ziomek G. I., Konecki J.: apoptosis and necrosis—two different ways leading to the same target. // Wiad Lek. 2006. № 59. P. 679-684.

30. Kagan V. E., Fabisiak J. P., Shvedova A. A., Tyurina Y. Y., Tyurin V. A., Schor N. F., Kawai K.: Oxidative signaling pathway for externalization of plasma membrane phosphatidylserine during apoptosis. // FEBS Lett. 2000. № 477. P. 1-7.

31. Kang M. H., Reynolds C. P.: Bcl-2 inhibitors: Targeting mitochondrial apoptotic pathways in cancer therapy. // Clin Cancer Res. 2009. № 15. P. 1126-1132.

32. Karbowski M., Norris K. L., Cleland M. M., Jeong S. Y., Youle R. J.: Role of bax and bak in mitochondrial morphogenesis. //Nature. 2006. № 443. P. 658-662.

33. Kerr J. F., Wyllie A. H., Currie A. R.: Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. // Br J Cancer, 1972. № 26. P. 239-257.

34. Khrapova N. V., Malenkova I. V., Vanin A. F.: s-nitrosothiols and dinitrosothiol iron complexes as a source of nitric oxide in animals. // Biofizika. 1995. № 40. P. 117-121.

35. King M. A., Eddaoudi A., Davies D. C.: A comparison of three flow cytometry methods for evaluating mitochondrial damage during staurosporine-induced apoptosis in jurkat cells. // Cytometry A. 2007. № 71. P. 668-674.

36. Liu J., Dai Q., Chen J., Durrant D., Freeman A., Liu T., Grossman D., Lee R. M.: Phospholipid scramblase 3 controls mitochondrial structure, function, and apoptotic response. // Mol Cancer Res. 2003. № 1. P. 892-902.

37. MacFarlane M., Williams A. C.: Apoptosis and disease: A life or death decision. // EMBO Rep. 2004. № 5. P. 674-678.

38. Madesh M., Balasubramanian K. A.: Effect of antimalarial drugs on rat enterocyte mitochondrial phospholipase d activity. // Life Sei. 1998. № 62. P. 177-184.

39. Madesh M., Balasubramanian K. A.: Nitric oxide inhibits enterocyte mitochondrial phospholipase d. // FEBS Lett. 1997. № 413. P. 269-272.

40. Mayer B., Oberbauer R.: Mitochondrial regulation of apoptosis. // News Physiol Sei. 2003. № 18. P. 89-94.

41. Michaelis M., Doerr H. W., Cinatl J.: The story of human cytomegalovirus and cancer: Increasing evidence and open questions. // Neoplasia. 2009. № 11. P. 1-9.

42. Mittermayr R., Osipov A., Piskernik C., Haindl S., Dungel P., Weber C., Vladimirov Y. A., Redl H., Kozlov A. V.: Blue laser light increases perfusion of a skin flap via release of nitric oxide from hemoglobin. // Mol Med. 2007. № 13. P. 22-29.

43. Mookherjee P., Quintanilla R., Roh M. S., Zmijewska A. A., Jope R. S., Johnson G. V.: Mitochondrial-targeted active akt protects sh-sy5y neuroblastoma cells from staurosporine-induced apoptotic cell death. // J Cell Biochem. 2007. № 102. P. 196-210.

44. Morishita Y., Iinuma Y., Nakashima N., Kadota A., Miike A., Tadano Т.: Enzymatic assay of calcium in serum with phospholipase d. // Clin Chem. 1999. № 45. P. 2280-2283.

45. Nantes I. L., Zucchi M. R., Nascimento O. R., Faljoni-Alario A.: Effect of heme iron valence state on the conformation of cytochrome с and its association with membrane interfaces. A cd and epr investigation. // J Biol Chem. 2001. № 276. P. 153-158.

46. National Library of Medicine. Электронный ресурс. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mesh/68017209?ordinalpos=l&itool=:EntrezSystem2.PEntrez.Mes h.MeshResultsPanel.MeshRVDocSum. (дата обращения: 19.05.2009)

47. Oellerich S., Wackerbarth H., Hildebrandt P.: Conformational equilibria and dynamics of cytochrome с induced by binding of sodium dodecyl sulfate monomers and micelles. // Eur Biophys J. 2003. № 32. P. 599-613.

48. Orrenius, Zhivotovsky: Cardiolipin oxidation sets cytochrome с free. // NATURE CHEMICAL BIOLOGY. 2005. № 1. P. 188-189.

49. Owen J. J., Jenkinson E. J.: Apoptosis and t-cell repertoire selection in the thymus. // Ann NYAcadSci. 1992. № 663. P. 305-310.

50. Pandey R., Chander R., Sainis К. В.: Prodigiosins as anti cancer agents: Living upto their name. // Curr Pharm Des. 2009. № 15. P. 732-741.

51. Putcha G. Y., Harris C. A., Moulder K. L., Easton R. M., Thompson С. В., Johnson E. M., Jr.: Intrinsic and extrinsic pathway signaling during neuronal apoptosis: Lessons from the analysis of mutant mice. // J Cell Biol. 2002. № 157. P. 441-453.

52. Roberts M. F.: Phospholipases: Structural and functional motifs for working at an interface. // FASEB J. 1996. № Ю. P. 1159-1172.

53. Saraste A., Pulkki K.: Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. // Cardiovasc Res. 2000. № 45. P. 528-537.

54. Savill J.: Recognition and phagocytosis of cells undergoing apoptosis. // Br Med Bull. 1997. №53. P. 491-508.

55. Scarlatti F., Granata R., Meijer A. J., Codogno P.: Does autophagy have a license to kill mammalian cells? // Cell Death Differ. 2009. № 16. P. 12-20.

56. Scorrano L., Ashiya M., Buttle K., Weiler S., Oakes S. A., Mannella C. A., Korsmeyer S. J.: A distinct pathway remodels mitochondrial cristac and mobilizes cytochrome с during apoptosis. // Dev Cell. 2002. № 2. P. 55-67.

57. ExPASy Proteomics Server: Электронный ресурс. URL: http://cn.expasy.org/uniprot/P99999. (дата обращения: 15.06.2009)

58. Stepanov G., Gnedenko O., Mol'nar A., Ivanov A., Vladimirov Y., Osipov A.: Evaluation of cytochrome с affinity to anionic phospholipids by means of surface plasmon resonance. // FEBS Lett. 2009. № 583. P. 97-100.

59. Stieglitz K., Seaton В., Roberts M. F.: The role of interfacial binding in the activation of streptomyces chromofuscus phospholipase d by phosphatidic acid. // J Biol Chem. 1999. № 274. P. 35367-35374.

60. Stieglitz K. A., Seaton B. A., Roberts M. F.: Binding of proteolytically processed phospholipase d from streptomyces chromofuscus to phosphatidylcholine membranes facilitates vesicle aggregation and fusion. // Biochemistry. 2001. № 40. P. 13954-13963.

61. Suen D. F., Norris K. L., Youle R. J.: Mitochondrial dynamics and apoptosis. // Genes Dev. 2008. № 22. P. 1577-1590.

62. Sugano M., Yamauchi K., Sugano K., Kawasaki K., Tozuka M., Katsuyama Т., Soya H., Tanaka Т., Imamura S., Nomoto S.: New enzymatic assay using phospholipase d to measure total calcium in serum. // Clin Chem. 2005. № 51. P. 1021-1024.

63. Torreri P., Ceccarini M., Macioce P., Petrucci Т. C.: Biomolecular interactions by surface plasmon resonance technology. // Ann 1st Super Sanita. 2005. № 41. P. 437-441.

64. Tsai A., Wei C., Baek H. K., Kulmacz R. J., Van Wart H. E.: Comparison of peroxidase reaction mechanisms of prostaglandin h synthase-1 containing heme and mangano protoporphyrin ix. //J Biol Chem. 1997. № 272. P. 8885-8894.

65. Ueda N., Shah S. V.: Tubular cell damage in acute renal failure-apoptosis, necrosis, or both. //Nephrol Dial Transplant. 2000. № 15. P. 318-323.

66. Vanin A. F.: Dinitrosyl iron complexes with thiolate ligands: Physico-chemistry, biochemistry and physiology. //Nitric Oxide. 2009. № 21. P. 1-14.

67. Vuppugalla R., Mehvar R.: Short-term inhibitory effects of nitric oxide on cytochrome p450-mediated drug metabolism: Time dependency and reversibility profiles in isolated perfused rat livers. // Drug Metab Dispos. 2004. № 32. P. 1446-1454.

68. Watson A. J.: Apoptosis and colorectal cancer. // Gut. 2004. № 53. P. 1701-1709.

69. Watson H. C.: // ProgStereochem. 1969 №4 P. 299.

70. Westermann B.: Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. // J Biol Chem. 2008. № 283. P. 13501-13505.

71. Williams S. A., Tappia P. S., Yu C. H., Binaglia L., Panagia V., DhallaN. S.: Subcellular alterations in cardiac phospholipase d activity in chronic diabetes. // Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 1997. № 57. P. 95-99.

72. Wink D. A., Hanbauer I., Krishna M. C., DeGraff W., Gamson J., Mitchell J. B.: Nitric oxide protects against cellular damage and cytotoxicity from reactive oxygen species. // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. № 90. P. 9813-9817.

73. Wink D. A., Mitchell J. B.: Chemical biology of nitric oxide: Insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. // Free Radic Biol Med. 1998. № 25. P. 434-456.

74. Zhang N., Hartig H., Dzhagalov I., Draper D., He Y. W.: The role of apoptosis in the development and function of t lymphocytes. // Cell Res. 2005. № 15. P. 749-769.

75. Zhao R., Xiang N., Domann F. E., Zhong W.: Expression of p53 enhances selenite-induced superoxide production and apoptosis in human prostate cancer cells. // Cancer Res. 2006. № 66. P. 2296-2304.

76. Ziegler U., Groscurth P.: Morphological features of cell death. // News Physiol Sci. 2004. № 19. P. 124-128.

77. Zwaal R. F., Comfurius P., Bevers E. M.: Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. // Cell Mol Life Sci. 2005. № 62. P. 971-988.9 Благодарности

78. Исследования, приведенные в настоящей работе, проводились при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований, гранты № 06-04-49296 и 05-04-49765.