Роль митохондрий в развитии окислительного стресса при экспериментальном рабдомиолизе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Чупыркина, Анастасия Андреевна

• Чупыркина, Анастасия Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чупыркина, Анастасия Андреевна

Оглавление

1. Введение

2. Обзор литературы

1. Причины рабдомиолиза

2. Клинические проявления рабдомиолиза

3. Причины, приводящие к развитию острой почечной недостаточности при рабдомиолизе

3.1. Роль ионов железа в развитии окислительного стресса при рабдомиолизе

3.2. Участие гемовой группы миоглобина в развитии окислительного стресса

в почке при рабдомиолизе

3.3. Развитие гипоксии в почке при рабдомиолизе

3.4. Развитие ацидоза при рабдомиолизе

3.5. Участие опиоидных пептидов в патогенезе почки при рабдомиолизе

4. Дисфункция почки при рабдомиолизе связана с развитием в ней окислительного стресса

4.1. Роль N0 и активных форм азота

4.2. Клубочковые изменения

4.3. Канальцевые повреждения

4.4. Изменения эндотелия при окислительном стрессе

4.5. Участие клеточных факторов ЫР-кВ и ТОР - р в патогенезе почки

5. Участие антиоксидантов в предотвращении почечных болезней

5.1. Митохондриально-адрессованные антиоксиданты

6. Участие митохондрий в развитии внутриклеточного окислительного стресса

при миоглобинурии

7. Возможное развитие нитрозильного стресса при рабдомиолизе

8. Центральная роль митохондрий в регуляции апоптоза

3. Методы

1. Индукция рабдомиолиза

2. Определение концентрации белка

3. Определение малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови, гомогенате почек и в митохондриях крыс

4. Определение нитрита в сыворотке крови и супернатанте митохондрий

5. Определение общей антиоксидантной активности (ОАА) сыворотки крови

6. Выделение митохондрий из почек крыс

7. Полярографический метод регистрации скорости дыхания митохондрий

8. Инкубация митохондрий с миоглобином (БСА, гемоглобином, протеолизированным миоглобином) in vitro

9. Определение миоглобина и цитохрома с в сыворотке крови, гомогенатах и митохондриях методом иммуноблоттинга

10. Протеолиз миоглобина пепсином in vitro

11. Получение культуры клеток почки

12. Инкубация канальцев и культуры клеток почки с миоглобином/ протеолизированным миоглобином

13. Оценка продукции АФК

14. Иммуноцитохимия

15. Гистология

16. Лечение крыс митохондриально-адресованными соединениями

17. Определение содержания гема в цитозоле и митохондриях почек крыс после индукции рабдомиолиз

18. Определение ионов свободного железа

Статистика

4. Результаты

1. Развитие острой почечной недостаточности при экспериментальном рабдомиолизе

2. Развитие окислительного стресса при моделировании рабдомиолиза

3. Повреждение митохондрий клеток почки при рабдомиолизе

4. Влияние миоглобина на функционирование митохондрий in vitro

5. Миоглобин приводит к увеличению продукции оксида азота

6. Влияние митохондриально - адресованных соединений на развитие почечной недостаточности

7. Влияние иротеолитической деградации миоглобина на его нефротоксичность

и взаимодействие с митохондриями

8. Появление продуктов деградации миоглобина в ткани почки при рабдомиолизе

5. Выводы

6. Благодарности

7. Список литературы

Список сокращений

AJ1T - аланинаминотрансфераза

ACT - аспартатаминотрансфераза

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГТФ - гуанозин трифосфат

ДНФ - 2,4 - динитрофенол

КДК - коэффициент дыхательного контроля

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛНП - липопротеины низкой плотности

ME - международная единица

МБА - метиленбисакриламид

МДА - малоновый диальдегид

НО - гем-оксигеназа

НАД(Ф)Н - никотинамиддинуклеотид (фосфат)

ОАА - общая антиоксидантная активность

ОПН - острая почечная недостаточность

СОД - супероксиддисмутаза

ПААГ - полиакриламидный гель

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ФСБТ - фосфатно - солевой буфер с твином -

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

IsoP - изопростаны

HIF - гипоксия-индуцибельный фактор NOS - синтаза оксида азота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль митохондрий в развитии окислительного стресса при экспериментальном рабдомиолизе»

1. Введение

В медицинской практике довольно распространенной патологией, ведущей к развитию острой почечной недостаточности (ОПН), является острый некроз мышц (рабдомиолиз) и следующая за ним миоглобинурия (Vanholder, Sever et al. 2000). Основной причиной рабдомиолиза являются травмы, сопровождающиеся раздавливанием тканей (при техногенных и природных катастрофах, военных действиях). Тем не менее, существует достаточно большое количество и других факторов, способствующих гибели мышечных клеток. К ним относятся чрезмерные физические нагрузки, эпилептические припадки, высоковольтные электротравмы, инфекции, гипертермия, нарушения электролитного баланса, ряд лекарственных препаратов (Bosch, Poch et al. 2009).

Наиболее опасной для жизни является развивающаяся примерно в 30% случаев (13-50%, по разным оценкам) острая почечная недостаточность. Основными клиническими методами лечения таких пациентов в настоящее время являются введение в кровь растворов бикарбоната натрия (повышает pH мочи и способствует растворению миоглобина, см. ниже) и/или маннитола (диуретик с антиоксидантными свойствами) (Ron, Taitelman et al. 1984). Однако применение этих методов ограничено, и кроме того, многими исследователями они считаются неэффективными (Brown, Rhee et al. 2004). При этом смертность среди таких пациентов довольно высока, от 7% до 80%>, в зависимости от возраста, пола, общего состояния здоровья и причины рабдомиолиза (Brivet, Kleinknecht et al. 1996).

Таким образом, эта проблема представляется чрезвычайно актуальной из-за высокой клинической распространенности и тяжести течения болезни.

Развитие острой почечной недостаточности при рабдомиолизе связано с высвобождением содержимого разрушенных мышечных клеток в систему циркуляции. Особое значение имеет выход в кровь большого количества миоглобина, который активно фильтруется в почке и попадает в первичную мочу (миоглобинурия). Откладываясь в просвете почечных канальцев, миоглобин ухудшает ток первичной мочи и реабсорбцию. Одновременно, миоглобин подвергается окислению и становится сильным прооксидантом, разрушая клетки нефрона (Zager 1996; Moore, Holt et al. 1998). В результате действия этих и ряда

других, пока неидентифицированных факторов, происходит гибель значительной части клеток почечной ткани.

Фундаментальные механизмы, лежащие в основе повреждения почечных структур при рабдомиолизе, изучены пока достаточно слабо. Особенно мало известно об участии митохондрий, а также оксида азота (N0) в развитии дисфункции клеток почки при миоглобинурии, поэтому данная работа была направлена, в том числе, и на исследование их роли при этой патологии. Также ничего неизвестно о судьбе самого миоглобина в почечном канальце.

Таким образом, расширение представлений о механизмах воздействия миоглобина на почечные клетки при рабдомиолизе и о потенциальных защитных механизмах является очень актуальным. В данной работе было изучено функционирование митохондрий, развитие в них окислительного стресса и продукция N0 на моделях экспериментального рабдомиолиза in vivo и in vitro. Полученный материал может быть использован для разработки фармакологических препаратов, способных уменьшать или предотвращать патологические изменения при острой почечной недостаточности, спровоцированной различными факторами.

Целью работы являлось исследование участия митохондрий в гибели клеток почки под действием миоглобина, а также поиск стратегий защиты. Задачи работы :

1. Исследование функционирования митохондрий клеток почки при

экспериментальном рабдомиолизе.

2. Оценка изменения продукции N0 при рабдомиолизе

3. Исследование влияния митохондриально-адресованных соединений на

развитие почечной недостаточности при рабдомиолизе.

4. Исследование влияния протеолитического расщепления миоглобина на

развитие окислительного стресса в клетках почки.

Научная новизна работы.

Получены новые данные о механизмах развития окислительного стресса в клетках почки при рабдомиолизе. Была показана центральная роль митохондрий клеток почки в развитии острой почечной недостаточности при рабдомиолизе. На основании этого была исследована возможность использования митохондриально-адресованных антиоксидантов для предотвращения дисфункции почки. Также была показано влияние протеолитического расщепления миоглобина клетками канальцев на развитие в них окислительного стресса и повреждение митохондрий.

Научно-практическое значение работы.

Данные, полученные в настоящем исследовании, расширяют представление механизмах развития миоглобин-индуцированной острой почечной недостаточности, а также о возможных перспективных методах ее лечения. Полученные данные о защитном действии митохондриально-адресованных соединений и ингибиторов протеолиза могут быть использованы для разработки фармакологических препаратов, способных уменьшать или предотвращать проявления острой почечной недостаточности, спровоцированной миоглобином.

2. Обзор литературы

Рабдомиолиз - острый некроз мышц, приводящий к появлению потенциально токсичного содержимого мускульных клеток в системе циркуляции. Синдром рабдомиолиза известен уже многие столетия, однако впервые связь между деструкцией мышц и нарушением функционирования почек была достоверно установлена после бомбардировок Лондона во время второй мировой войны. Примерно в 30% случаев рабдомиолиз приводит к развитию острой почечной недостаточности (Zager 1996, Boutaud and Roberts 2011). Лечение таких пациентов в настоящее время недостаточно эффективно, и смертность среди них довольно высока, от 7% до 80%, в зависимости от возраста, пола, общего состояния здоровья и причины рабдомиолиза (Brivet, Kleinknecht et al. 1996) 1. Причины рабдомиолиза.

К основным факторам, приводящим к рабдомиолизу, относятся травмы (непосредственно нарушающие целостность мышечных клеток), ишемия-реперфузия мышц, и происходящее по разным причинам значительное снижение уровня АТФ в миоцитах, приводящее к резкому повышению внутриклеточной концентрации кальция (Zager 1996, Bosch, Poch et al. 2009).

Повреждение мышц вследствие ишемии-реперфузии часто случается при травматическом сжатии конечностей с последующим их освобождением (например, при техногенных катастрофах). Реперфузия приводит к значительному росту уровня свободных радикалов и гибели миоцитов (Odeh 1991). Также ишемия в мышце может развиваться вследствие закупорки кровеносных сосудов, например, тромбом (Adiseshiah, Round et al. 1992). Длительное обездвиживание (кома, анестезия, алкогольное опьянение) также приводит к ишемии и гибели клеток (Szewczyk, Ovadiaet al. 1998).

В основе многих случае рабдомиолиза лежит значительное снижение уровня АТФ в клетке. В норме низкая клеточная концентрация ионов натрия поддерживается Na/K-АТФ-зависимым насосом. Его рабочий цикл заключается в переносе трех ионов натрия из клетки во внеклеточное пространство, а двух ионов калия - в обратном направлении. Таким образом, поддерживается отрицательный заряд на внутренней стороне сарколеммы относительно внешней. Пул ионов натрия в клетке участвует в поддержании внутриклеточной концентрации ионов кальция. Низкая концентрация ионов кальция в клетке также поддерживается АТФ-зависимым кальциевым насосом, который транспортирует кальций в

саркоплазматический ретикулум и митохондрии. Значительное падение уровня АТФ в клетке (которое может происходить по различным причинам), приводит к нарушению работы этих ионных обменников, результатом чего является увеличение клеточной проницаемости для ионов натрия. Увеличение концентрации ионов натрия приводит к высвобождению в цитозоль ионов кальция, которые активируют многие внутриклеточные протеолитические ферменты, нейтральные протеазы (кальпаин) и фосфолипазы (в т.ч. фосфолипазу А2, содержащуюся во внутренней мембране митохондрий) (Chatzizisis, Misirli et al. 2008). Гидролиз фософлипидов фосфолипазой приводит к серьезным повреждениям митохондриальных мембран. Кроме того, образующиеся в результате действия липаз жирные кислоты и лизофосфолипиды нарушают мембранный ионный транспорт. Как следствие, митохондрии теряют способность поддерживать электрохимический потенциал и синтезировать АТФ. В результате в митохондрии начинают поступать различные ионы, в первую очередь ионы калия, движимые электрическим полем, и фосфат, движимый разностью рН (Wrogemann and Pena 1976). Увеличение осмотического давления вследствие накопления в матриксе катионов и фосфата приводит к входу воды внутрь митохондрий и их набуханию. Поврежденные митохондрии могут генерировать большое количество супероксида, приводя к развитию окислительного стресса, который также оказывает деструктивное влияние на мускульную клетку.

Интенсивные мышечные нагрузки (такие как марафон) могут приводить к рабдомиолизу вследствие значительного и длительного снижения уровня АТФ. Факторы, увеличивающие риск повреждения мышц при серьезных нагрузках -гипокалемия, серповидно-клеточная анемия, экстремальные температура и влажность (Sharma, Winpenny et al. 1999).

Частой причиной рабдомиолиза являются лекарства и токсины. Рабдомиолиз может вызываться широким спектром химических веществ, таких как этанол, метанол, этиленгликоль, героин, метадон, барбитураты, кокаин, кофеин, амфетамин, диэтиламид лизергиновой кислоты, бензодиазепам и толуол (Khan 2009, Vanholder, Sever et al. 2000).

Алкоголь может приводить к рабдомиолизу благодаря комбинированному механизму действия, включающему обездвиживание, прямую миотоксичность и нарушение электролитного баланса (гипокалемию и гипофосфатемию) (Vanholder, Sever et al. 2000). Действие кокаина также опосредовано множественными

механизмами, включающими спазм сосудов, приводящий к ишемии мышц, судороги, повышение температуры тела, кому и непосредственное повреждение миофибрилл.

К другим веществам, способным индуцировать рабдомиолиз, относятся монооксид углерода СО (Sungur and Guven 2001), болиголов, укусы ядовитых змей и пауков, а также пчел (Betten, Richardson et al. 2006). CO приводит к ишемии мышц и рабдомиолизу, прочно связываясь крови с гемоглобином с образованием карбоксигемоглобина, нарушая тем самым связывание кислорода.

Регулярно причиной рабдомиолиза становится злоупотребление лекарственными средствами, такими как салицилаты (Montgomery, Porter et al. 1994), нейролептики (Khan, Syed et al. 2006), обезболивающие (Pedrozzi, Ramelli et al. 1996), хинин (Lim AK, (Lim, Ho et al. 2006)), кортикостероиды (Gayan-Ramirez and Decramer 1998), статины (Sylvain-Moore and Worden 1991), теофиллин (Tevveleit, Hippius et al. 2001), циклические антидепрессанты (селективные ингибиторы выброса серотонина (Richards, Umbreit et al. 2003), аминокапроновая кислота (Seymour and Rubinger 1997), фенилпропаноламин (Blewitt and Siegel 1983) и пропофол (Casserly, O'Mahony et al. 2004).

Удар электрическим током или молнией может привести к рабдомиолизу вследствие образования пор в сарколемме, нарушению ее барьерных функций и массивному выходу кальция в цитозоль (Brumback, Feeback et al. 1995).

Также к мышечной деструкции могут приводить высокие температуры. Температурный максимум для человека - приблизительно 42°С в течение 8 часов. Причиной гипертермии могут быть такие заболевания, как нейролептический злокачественный синдром, который характеризуется сильным жаром у пациентов, леченных фенотиазидами или галоперидолом (Eiser, Neff et al. 1982). Другая типичная причина гипертермии - наследственное состояние, которое характеризуется быстрым ростом температуры тела (1°С/мн) после анестезии галогенированным гидрокарбонатом или сукцинилхолином (Ben Abraham, Cahana et al. 1997).

Встречаются случаи рабдомиолиза, вызванные инфекцией. Повреждение ткани происходит вследствие гипоксии (сепсис), прямой бактериальной инвазии в клетку, низкой активности гликолитических ферментов, активации лизосомальных протеаз и цитотоксичного действия эндотоксинов (Blanco, Zabalza et al. 2002). К инфекционным агентам, способным вызвать повреждение мышечной ткани, относятся различные бактерии, вирусы, грибы и простейшие, такие как вирусы

гриппа группы А и Б, ВИЧ, цитомегаловирус, герпес; Legionella sp, Streptococcus sp, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Mycoplasma sp (Khan 2009).

Рабдомиолиз также может быть следствием нарушением ионного гомеостаза: гипонатремия, гипернатремия, гипокалемия и гипофосфатемия приводят к нарушению работы Na/K-АТФазы (Khan 2009).

Генетические болезни, нарушающие анаэробный гликолиз, приводят к дефициту АТФ в работающей мышце, и как следствие, ее некрозу. К таким болезням относятся дефицит миофосфорилазы, киназы фосфорилазы, фосфофруктокиназы, фосфоглицератмутазы, лактатдегидрогеназы, нарушения в метаболизме карнитина, а также такие синдромы, как дистрофия Дюшенна и злокачественная гипертермия (Brumback, Feeback et al. 1992).

Повреждение мышц усугубляется тем, что большая часть поперечнополосатой мускулатуры состоит из замкнутых компартментов, формирующих фасции. Если мышечная клетка повреждается и набухает, то в результате возрастает давление внутри всего компартмента. Это давление приводит к дополнительным повреждениям и некрозу (Odeh 1991). Также патологическая роль в гибели миоцитов принадлежит нейтрофилам, активация которых усиливают повреждение, высвобождая протеазы и свободные радикалы (Belkin, LaMorte et al. 1989). 2. Клинические проявления рабдомиолиза.

При разрушении значительной части мышечных клеток в систему циркуляции попадает большое количество органических и неорганических веществ, некоторые из которых очень токсичны (Vanholder, Sever et al. 2000).

При рабдомиолизе в крови значительно изменяются концентрации калия, фосфатов и кальция. Гиперкалимия - один из характерных симптомов рабдомиолиза, особенно у больных с ацидозом или олигоурией. Может приводить к аритмии и остановке сердца. Особенно серьезные нарушения в работе сердца она вызывает совместно с гипокальцемией, также характерной для рабдомиолиза. В этом случае кальций-фосфатные комплексы откладываются в некротизированной ткани. Одновременно они ингибируют активность 1 а-гидроксилазы, фермента, ответственного за продукцию активного витамина D (Khan 2009, Vanholder, Sever et al. 2000).

В большом количестве из клеток в кровь высвобождаются серосодержащие белки, которые могут приводить к серьезному ацидозу (см. ниже). Другие причины

ацидоза при рабдомиолизе - высвобождение в кровь молочной кислоты и уремия. (Gabow, Kaehny et al. 1982).

Оказавшиеся в крови нуклеозиды (в основном адениновые) попадают в печень и превращаются там в пурины, такие как ксантин, гипоксантин и мочевая кислота. Последняя, фильтруясь в почке, способствует обструкции почечных канальцев (Vanholder, Sever et al. 2000). В большом количестве из нежизнеспособных клеток выделяется креатин и трансформируется в креатинин. Уровень креатинина в плазме при рабдомиолизе очень высок (Vanholder, Sever et al. 2000, Bagley, Yang et al. 2007, Zager 1996).

При разрушении ткани в кровь попадают клеточные ферменты, такие как ЛДГ, ACT, AJIT, креатинкиназа (Vanholder, Sever et al. 2000). Активность креатинкиназы в крови - наиболее чувствительный маркер повреждения мышц. Увеличение ее активности более чем в 5 раз многими авторами считается симптомом рабдомиолиза (Sauret, Marinides et al. 2002).

Также у больных рабдомиолизом в крови примерно в 1,5 - 2 раза увеличивается концентрация скелетного тропонина I (Sorichter, Mair et al. 1997, Simpson, Labugger et al. 2002).

Наконец, самым опасным признаком рабдомиолиза является появление в моче миоглобина. В норме миоглобин связывается глобулинами плазмы и его концентрация в сыворотке очень низка (0-0,03 мг/дл). При некрозе миоцитов концентрация миоглобина значительно превышает концентрацию глобулинов и достигает 100 мг/дл (Gabow, Kaehny et al. 1982). Он фильтруется канальцами и в конечном счете попадает в мочу, придавая ей характерный красно-коричневый цвет. Концентрация миоглобина в сыворотке изменяется гораздо быстрее, чем активность креатинкиназы, обычно за первые 6 часов после индукции рабдомиолиза (Minnema, Neligan et al. 2008). Тем не менее, рабдомиолиз не всегда приводит к видимой миоглобинурии, а диагностика миоглобина в моче ортолуидиновым тестом представляет некоторые сложности, так как этим методом определяются также глобиновые фрагменты гемоглобина (Khan 2009).

3. Причины, приводящие к развитию острой почечной недостаточности при рабдомиолизе

Выше уже отмечалось, что примерно в 30-45% случаев рабдомиолиз приводит к развитию острой почечной недостаточности (ОПН). ОПН чаще

встречается среди пациентов,. пострадавших при использовании лекарств, злоупотреблении алкоголем, а также вследствие травмы_(МеШ, Chaudhry et al. 2005). В настоящее время полагают, что причинами дисфункции почки являются развивающиеся при некрозе мышц гиповолемия, вазоконстрикция и гипоксия, ацидоз, обструкция канальцев и прооксидантное действие миоглобина вне восстанавливающего клеточного окружения (Zager 1996).

Главным нефротоксичным фактором при рабдомиолизе в данный момент считается миоглобин, приводящий к развитию сильного окислительного стресса.

Миоглобин - небольшой гем-содержащий белок, с молекулярным весом 17600. Миоглобин относится к группе порфиринов и состоит из четырех пиррольных колец, соединенных метановыми группами (Wittenberg and Wittenberg 2003). Молекула порфирина имеет систему сопряженных двойных связей, определяющих характерные свойства этого соединения. Все производные порфиринов имеют один общий максимум поглощения при длине волны 400 нм. Хелатный комплекс протопорфирина с Fe2+ называется протогемом (или гемом), подобный комплекс с Fe3+ называется гемином или гематином. Основной функцией миоглобина считается перенос 2 атомов кислорода от сарколеммы к митохондриям в мышечных клетках и кардимиоцитах. В состав миоглобина входит 3-5 % всего железа организма. Концентрация миоглобина в сердечной мышце достигает примерно 200-300 мкМ, а его концентрация в скелетной мышце - порядка 400-500 мкМ (Wittenberg and Wittenberg 2003).

3.1. Роль ионов железа в развитии окислительного стресса при рабдомиолизе

Один из механизмов развития острой почечной недостаточности при рабдомиолизе предполагает высвобождение из гема свободного иона железа (Fe2+), который индуцирует образование гидроксильных радикалов в реакции Фентона и таким образом приводит к окислению липидов (Moore, Holt et al. 1998, Reeder, Sharpe et al. 2002).

В организме взрослого мужчины в среднем содержится 35-45 мг железа/кг (Emerit, Beaumont et al. 2001). Около 80% этого железа входит в состав гемоглобина, еще 15% - в состав миоглобина, остальное входит в состав других внутриклеточных белков (цитохромов и ферментов). Транспорт железа в плазме осуществляется

посредством специального 80 кДа железо-связывающего белка трансферрина. Поступление железа в клетку происходит благодаря связыванию трансферрина со своим рецептором. В клетке в норме железо связано другим белком, ферритином (Harrison and Arosio 1996). Ферритин может связывать до 4500 атомов железа. Он представляет собой белок массой 445 кДа, состоящий 24 субъединиц двух различных типов: тяжелого типа H (21 кДа) и легкого L (19 кДа). Тяжелые субъединицы обладают ферроксидазной активностью и могут восстанавливать железо. Соотношение между H и L субъединицами может определять скорость высвобождения свободного железа. В свою очередь, свободное железо может контролировать экспрессию индуцибельной NO-синтазы (Lipinski and Drapier 1997). Увеличение уровня железа в клетке снижает транскрипцию iNOS, в то время как его снижение оказывает противоположный эффект. С другой стороны, N0 способен влиять на внутриклеточный гомеостаз ионов железа, воздействуя на специфическую последовательность мРНК, называемую iron responsive element, IRE (Weiss, Wächter et al. 1995). Контроль уровня железа в клетке осуществляется посттранскрипционно, путем взаимодействия специального белка (iron regulatory protein, IRP) с петлевой структурой в составе IRE. Сродство IRP к IRE выше в отсутствие свободного цитозольного железа, и в этом случае трансляция ферритина на IRE ингибирована. Когда концентрация железа в клетке повышается, сродство IRP к IRE уменьшается и синтез ферритина ингибируется. Недавно также было показано, что в макрофагах оксид азота N0 также способен активировать IRE-связывающую активность IRP (Drapier, Hirling et al. 1993).

Было показано, что инъекции глицерина уже через 2 часа приводят к заметному повышению концентрации железа в моче и сыворотке крови (Zager 1992). При этом еще в 1988 г. было показано, что хелатор железа (дефероксамин, DF0) в некоторой степени уменьшает симптомы почечной недостаточности у крыс с глицерин-индуцированным рабдомиолизом (Palier 1988). Так, скорость клубочковой фильтрации у крыс, леченных дефероксамином, повышалась с 0,133 до 0,374 мл/ мин (в контроле - 1,2 мл/мин), а уровень МДА-продуктов снижался с 0,842 нмоль/мг до 0,562 нмоль/мг (в контроле - 0, 336 нмоль/мг). Лечение дефероксамином также приводит к практически полному устранению железа из мочи (Zager 1992). Было предположено, что эффект DFO может быть связан с хелатированием ионов железа, высвободившихся из гема, и таким образом с предотвращением его участия в реакции Фентона и образования гидроксильных радикалов (Shah and Walker 1988).

Однако Zager (1992) отмечает, что цитотоксичность железа может быть Н2О2-

зависимой, но не ОН'-зависимой (Zager and Foerder 1992). Было показано, что

уровень МДА-продуктов снижался при инкубации изолированных канальцев с ионами Fe2+/FeJ+ в присутствии глутатиона и каталазы, но не в присутствии ловушек гидроксильного радикала DMTU и бензоата. Значительное увеличение продукции перекиси почками в глицериновой модели рабдомиолиза у крыс было показано Guidet В et al в 1989 (Guidet and Shah 1989). Имеются данные, что перекись может мобилизовать железо из белков и внутриклеточного пула (Halliwell and Gutteridge 1990).

С другой стороны, в настоящее время есть данные, показывающие, что источниками ионов железа при рабдомиолизе могут быть другие белки, например, цитохром Р-450 (Baliga, Zhang et al. 1996). Было показано, что при рабдомиолизе в почке заметно возрастает уровень железа, коррелирующий с уменьшением содержания в почке цитохрома Р-450. В то же время, ингибиторы цитохрома Р-450 приводили к улучшению функциональных и гистологических показателей почки при индуцированной рабдомиолизом острой почечной недостаточности.

Источником ионов железа при определенных условиях может быть ферритин (Reif 1992). При нормальных условиях ферритин - инертный внутриклеточный белок, способный связывать до 4500 ионов железа. Однако уже в 1974 г была показана способность супероксида мобилизовать железо из ферритина (Williams, Lee et al. 1974). В 1990 г была показана способность N0 высвобождать железо из ферритина, которая ингибировалась в присутсвии гемоглобина и супероксида (Reif and Simmons 1990).

Цитотоксичное действие железа может усиливаться при его транспорте внутрь клетки канальца с помощью трансмембранных белков - переносчиков, активность которых контролируется железо-чувствительными белками, ферритиновым комплексом и гем-оксигеназой-1 (Aydogdu, Atmaca et al. 2006). Недавно был открыт новый белок, нейтрофил желатиназо-ассоциированный липокалин (Ngal), который формирует комплекс с железо-связывающим белком сидерофором и железом. Комплекс способен транспортировать железо внутрь клетки и хелатировать ион Fe (Aydogdu, Atmaca et al. 2006).

3.2. Участие гемовой группы миоглобина в развитии окислительного стресса в почке при рабдомиолизе.

Альтернативный механизм может включать участие в окислительно-

восстановительных реакциях всей гемовой группы миоглобина (Moore, Holt et al. 1998, Reeder, Sharpe et al. 2002). Известно, что в восстановительном окружении клеток железо в миоглобине всегда двухвалентно. Однако, попадая в кровь, а затем в почку, миоглобин подвергается окислению и железо в нем становится трехвалентным (образуется метмиоглобин), который приводит к значительному повышению уровня АФК.

В первую очередь, в почечных канальцах восстановленный миоглобин (Fe2+) подвергается автоокислению с образованием метмиоглобина (FeJ+), обладающего сильной окислительной способностью. Каталитический редокс-цикл происходит между двумя окисленными состояниями миоглобина: метмиоглобином (FeJ+) и феррил-миоглобином ([Fe=0]2+), последнее из которых может прямо инициировать липидное окисление (рис. 1).

Mb(II) + Н202 -► Mb (IV)=02_ +Н20

Mb (II) + Mb (IV)-O2" +H+ -► 2 Mb (III) + OH"

Mb (III) + H202 -► Mb (IV)=02~ + H20

(Wilson and Reeder 2008)

Рис. 1. Развитие острой почечной недостаточности при рабдомиолизе. Пояснения в тексте. (Reeder В et al, 2002, (Reeder, Svistunenko et al. 2004).

В одной из работ было показано, что в почке при рабдомиолизе действительно происходит накопление метмиоглобина: экстракт почечной ткани имеет такой же спектр, как и очищенный коммерческий метмиоглобин, с характерным пиком при 406 нм и минорными пиками при 502 и 630 нм (рис. 2). Этот спектр четко отличается от спектра восстановленного миоглобина (Fe 2+), с пиками при 430 и 550 нм (Moore, Holt et al. 1998).

380 430 480 530 580 630 680

Wavelength (nm)

Рис. 2. Оптический спектр экстракта миоглобина из рабдомиолизной почки до (А) и после восстановления и деоксигенации дитионитом натрия (В) (Moore К et al, 1998). На врезке увеличена область от 450 до 700 нм. Спектр А содержит пики, характерные для метмиоглобина, при 406, 502 и 630 нм. Спектр В типичен для восстановленного миоглобина, с пиками при 430 и 550 нм.

С другой стороны, взаимодействие миоглобина с перекисью водорода в кислой среде приводит к ковалентному связыванию гемовой простетической группы с белком с образованием продукта - Mb-H (Vuletich, Osawa et al. 2000, Osawa and Williams 1996, Reeder, Svistunenko et al. 2002). Образование поперечных сшивок происходит автокаталитически при участии тирозинового остатка 103, и трансформируют миоглобин в кислородсодержащий белок с высокой прооксидантной активностью. Такой модифицированный миоглобин обнаруживается в моче пациентов, страдающих ОПН, индуцированной рабдомиолизом. Было показано, что окисление фосфатидилхолина Mb-Н было примерно в 5 раз интенсивнее, чем нативным миоглобином. При этом такой модифицированный миоглобин способен самостоятельно окислять липиды, без добавления экзогенной перекиси (Vuletich, Osawa et al. 2000).

Сейчас появились данные, что протективный эффект дефероксамина (и других хелаторов железа) может быть связан с его способностью восстанавливать феррил-миоглобин ([Fe=0]2+) и препятствовать образованию обладающего сильной цитотоксичностью производного миоглобина- Mb-H (Reeder, Hider et al. 2008).

Гибель клеток почки может быть обусловлена также непосредственной гемовой цитотоксичностью. Grunwald Е. et al на мутантных формах миоглобина показали, что миоглобин с низким сродством к гему (в 25 раз меньше, чем у нативного) обладает более сильными окислительными свойствами, чем миоглобин с высокой скоростью автоокисления гема (дикий тип) (Grunwald and Richards 2006). С другой стороны, известно, что в проксимальных канальцах почки имеются рецепторы эндоцитоза (мегалин и кубилин), обладающие сродством к миоглобину (Gburek, Birn et al. 2003). Мегалин - 600 кДа трансмембранный гликопротеин, а кубилин - 460 кДа гликопротеин, у которого отсутствует классический трансмембранный домен. Константа диссоциации комплексов миоглобина с мегалином и кубилином - 2 и 3 мкМ, соответственно. Было показано, что при рабдомиолизе происходит накопление миоглобина внутри лизосом, при этом накопление резко снижалось у мегалин-дефицитных мышей. Одновременно, есть данные, показывающие, что инъекции крысам низкомолекулярных белков (миоглобина и лизоцима) увеличивают активность катепсинов В и L в проксимальных канальцах (Olbricht, Gutjahr et al. 1990).

Важная роль интактного гема в развитии окислительного стресса при рабдомиолизе была показана при изучении активности гем-оксигеназы.

Гем-оксигеназа - митохондриальный фермент, используя кислород и NADPH, катализирует конверсию гема в биливердин, в процессе реакции высвобождается железо и генерируется СО. Биливердин метаболизируется в билирубин (метаболит с антиоксидантными свойствами) биливердин-редуктазой. (Tracz, Alam et al. 2007, Nath, Haggard et al. 2000).

Существует две изоформы гем-оксигеназы (НО). НО-1 - индуцибельный фермент, в норме его экспрессия в почечных канальцах невелика, но значительно активируется в ответ на различные стрессорные стимулы, включая гипоксию, ишемию, гипероксию, окислительный стресс, воспаление и тяжелые металлы. НО-2 - конститутивный фермент, экспрессируется в основном в прегломулярной сосудистой сеточке и дистальных нефронах (Nath, Haggard et al. 2000).

В гомеостатических условиях ген гем-оксигеназы -1 (hniox-1) находится под контролем репрессирующего транскрипционного регулятора Bach-1. Транскрипционный фактор представляет собой гетеродимер с маленьким белком Maf, связанным с элементом StRE в области энхансера. Интересной особенностью Bach-1 является его способность связывать гем с большим сродством. Связывание с гемом изменяет его ДНК-связывющие свойства, уменьшая сродство к StRE. В результате этих наблюдений была предложена простая модель индукции экспрессии НО-1: инактивация гена hmox-1 комплексом Bach-1 устраняется при внутриклеточном повышении уровня гема. (Tracz, Alam et al. 2007).

На глицериновой модели рабдомиолиза было показано, что уже через три часа после индукции рабдомиолиза синтез гем-оксигеназы в почке увеличивается (Nath, Baila et al. 1992). При этом экспрессия гем-оксигеназы коррелировала с синтезом внутриклеточного железо-связывающего белка ферритина. Цепь Н ферритина проявляет ферроксидазную активность, ингибирующую редокс-цикл железа (Baila, Jacob et al. 1992). Таким образом, белок уменьшает риск окислительного стресса, связанного с окислением железа и способствует цитопротективному эффекту гем-оксигеназы-1 (Tracz, Alam et al. 2007, Zager, Burkhart et al. 1995).

Мыши, дефицитные по гену НО-1, демонстрировали повышенную чувствительность к гемовым белкам - у крыс в глицериновой модели наблюдались значительно более высокие уровни креатинина и лактатдегидрогеназы в крови и увеличение смертности; ингибирование активности НО вызывало гем-индуцированный апоптоз (Nath, Haggard et al. 2000). Протективный эффект гем-оксигеназы связан не только с устранением гема, обладающего сильной токсичностью, но и образованием в результате его деградации продуктов, обладающих цитопротекторным действием. Так, СО может способствовать вазодилатации, активируя cGMP и кальций-зависимый калиевый канал (Kim, Ryter et al. 2006), также он может приводить к противовоспалительному эффекту, стимулируя р38 МАР-киназу и ингибируя образование эндотелина-1 и PDGF (Morita and Kourembanas 1995). Железо может индуцировать синтез железо-связывающих и железо-экспортирующих белков, гем-оксигеназы-1, белка р21 и белков, отвечающих за клеточный рост. Билирубин обладает антиоксидантной активностью, а также снижает активность NADPH-оксидазы (Reeder and Wilson 2005).

В некоторых работах было показано, что другие транскрипционные факторы также могут регулировать экспрессию hmox-1, например, NF-кВ (Lavrovsky, Schwartzman et al. 1994).

3.2.1. Цитотоксичность гема.

В организме присутствует огромное количество гемовых белков: кроме миоглобина и гемоглобина к ним относятся митохондриальные цитохромы дыхательной цепи, цитохром Р450, NO-синтаза, гуанилатциклаза, простагландинсинтаза, фосфодиестеразы, каталаза и пероксидаза, NADPH-оксидаза, некоторые регуляторы транскрипции и трансляции (Tracz, Alam et al. 2007). Кроме участия в окислительно-восстановительных реакциях важным свойством гема является его способность связывать кислород, оксид азота и оксид углерода. Синтез гема, как и его деградация, происходит в митохондриях. В норме уровень свободного гема приблизительно 100 нМ, однако некоторые патологические процессы, например, ишемия или нефротоксические агенты, могут приводить к значительному увеличению его уровня. Во многих работах показано, что более высокие концентрации гема могут быть опасны для клетки. В частности, в микромолярных концентрациях и в отсутствие сыворотки гем индуцирует экспрессию каспазы 3 и апоптоз. В присутствии сыворотки (которая сама по себе обеспечивает выживаемость) такие концентрации гема не индуцируют апоптоз, но вызывают блок клеточного цикла (через индукцию синтеза белка р21), ингибируя клеточный рост и пролиферацию (Gonzalez-Michaca, Farrugia et al. 2004). При еще больших концентрациях гем может окислять липиды мембран, денатурировать белки, воздействовать на цитоскелет. Он также может изменять активность цитозольных ферментов, включая некоторые гликолитические ферменты, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, глутатион-редуктазу, может активировать каспазы и катепсины. (Tracz, Alam et al. 2007). В митохондриях, инкубированных с патологическими концентрациями гема (10-75 мкМ), наблюдалось ухудшение дыхания вследствие значительного снижения скорости утилизации кислорода дыхательной цепью (Nath, Grande et al. 1998). Провоспалительные эффекты гема также могут приводить к повреждению клеток. К примеру, в клетках канальцев он индуцирует хемокины, такие как МСР-1, через активацию редокс-чувствительного транскрипционного фактора NF-кВ (Nath, Vercellotti et al. 2001).

3.3. Развитие гипоксии в почке при рабдомиолизе.

Также при миоглобинурии помимо непосредственного развития окислительного стресса в почке под действием миоглобина наблюдается уменьшение кровотока, приводящее к ишемии. Было показано, что через три часа после индукции рабдомиолиза почечный кровоток уменьшался с 4,92 мл/мин/100г до 1,99 мл/мин/100г (Kurtz, Maletz et al. 1976). Также было отмечено, что в этой модели уменьшение кровотока в почке не связано с канальцевой обструкцией (4,12 мл/мин/100г у крыс с билатеральной уретеральной обструкцией и 4, 41 мл/мин/100 г у контрольных крыс) и, вероятно, связано с вазоконстрикцией (Venkatachalam, Rennke et al. 1976).

В настоящее время полагают, что уменьшение кровотока в почке при рабдомиолизе вызывают специфические вазоконстрикторные молекулы, изопростаны, образующиеся при неферментативном свободнорадикальном окислении арахидоновой кислоты миоглобином (Moore, Holt et al. 1998; Reeder, Sharpe et al. 2002). Два изопростана, 15-F2t-IsoP и 15-E2t-IsoP, образуются в наибольшем количестве и являются сильнейшими почечными вазоконстрикторами, действуя через уникальные рецепторы (Badr and Abi-Antoun 2005; Khasawneh, Huang et al. 2008). Показано также, что 15-F2t-IsoP индуцируют секрецию эндотелина-1, который также является сильным почечным вазоконстриктором (Yura, Fukunaga et al. 1999). У крыс при рабдомиолизе концентрация изопростанов в моче увеличивается более чем в 7 раз (Moore, Holt et al. 1998).

Другим фактором, способствующим вазоконстрикции и последующей гипоксии при рабдомиолизе, является способность гемовой группы миоглобина связывать оксид азота NO (Flogel, Merx et al. 2001). Оксид азота синтезируется тремя различными NO-синтазами: эндотелиальной eNOS, нейрональной nNOS и индуцибельной iNOS (Chander and Chopra 2005, Brown and Borutaite 2007, Vinas, Sola et al. 2006). Эндотелиальная NO-синтаза имеет наибольшее значение в регуляции почечной гемодинамики и выделительных функций. Вазодилататорное действие NO опосредуется через активацию гуанилатциклазы: повышение концентрации cGMP приводит к понижению концентрации кальция в цитоплазме и таким образом ведет к расслаблению гладких мышечных клеток (Chander and Chopra 2005). Было показано, что через 24 часа происходит значительное снижение уровня NO в ткани почки (с 12,18 мкМ/мг до 2,01 мкМ/мг) и моче (с 25,45 мкМ/мг до 6,98 мкМ/мг) (Chander and Chopra 2005). При этом лечение крыс донорами оксида азота (молсидомином и L-

аргинином) приводило к значительному уменьшению уровня МДА-продуктов, а также к практически полному восстановлению уровней глутатиона, каталазы и супероксиддисмутазы.

Адаптация к гипоксии в первую очередь связана с так называемыми гипоксия-индуцибельным транскрипционными факторами (HIFs) (Rosenberger, Goldfarb et al. 2008). HIF представляют собой гетеродимер, составленный из конститутивной ß-субъединицы, и одной-двух чувствительных к кислороду а-субъединиц. Регуляция активности фактора происходит путем кислород-зависимого протеолиза а-субъединицы. Ключевой фермент деградации гипоксия-индуцибельных факторов -HIF-пролилгидроксилаза (PHD). В качестве субстратов ей необходимы кислород, а-кетоглутарат и как кофактор - негемовое железо. При этом ее константа Км [Ог] лежит в области клеточных концентраций кислорода (около 250 мкМ). Таким образом, эту сигнальную систему можно сравнить с клеточным кислородным сенсором. HIF мгновенно активируется при гипоксии и быстро деградирует при нормоксии убиквитин-протеасомной системой.

При гипоксии деградация HIF-a ингибирована, и он может быть детектирован иммуногистохимически в тканях. На глицериновой модели рабдомиолиза было показано, что уже через три часа после индукции рабдомиолиза в почках крыс обнаруживается две изоформы - HIF-la и HIF-2a (Rosenberger, Goldfarb et al. 2008). HIF-la была обнаружена в главным образом в канальцах, а HIF-2a - в эндотелиальных клетках. Однако, что уже через 6 часов окрашивание на HIF-a было негативным для всех типов почечных клеток.

Оказалось также, что HIF-a участвует в регуляции экспрессии гена гем-оксигеназы-1, причем максимальная экспрессия hmox-1 наблюдалась через 6 часов после индукции рабдомиолиза, когда HIF уже не определялся (Rosenberger, Goldfarb et al. 2008).

3.4. Развитие ацидоза при рабдомиолизе.

Важным фактором, способствующим усилению прооксидантых свойств миоглобина, является ацидоз. Первичный ацидоз при рабдомиолизе связан с высвобождением в кровь из некротизированной мышцы серосодержащих белков, фосфорной кислоты, креатинина, вывод которых почками затруднен вследствие уменьшения скорости клубочковой фильтрации (McCarron, Elliott et al. 1979). В дальнейшем ацидозу способствует сужение кровеносных сосудов и падение рОг в ткани почки вследствие вазоконстрикции. Это приводит к увеличению роли

анаэробного гликолиза в энергетическом метаболизме, накоплению молочной кислоты, и, как следствие, падению тканевого pH. Кислый pH способствует образованию феррил-миоглобина Mb (IV)=02", сильного прооксиданта. (Reeder, Sharpe et al. 2002, Cooper, Vollaard et al. 2002). Протонированная форма Mb (IV)=0 " крайне реакционноспособна, так как химически представляет собой эквивалент Mb (III) и радикала ОН'. Таким образом, повышение pH (например, подщелачивание крови и мочи инъекциями бикарбоната натрия) снижает эффективность редокс-цикла и уменьшает прооксидантую активность миоглобина (Reeder, Sharpe et al. 2002, Wilson and Reeder 2008, Cooper, Vollaard et al. 2002).

Низкий pH также способствует образованию изопростанов, что усугубляет повреждение за счет развития вазоконстрикции и вторичной ишемии (см. выше), в то же время их количество уменьшается в 2 раза при pH 8 по сравнению с pH 5,5 (Moore, Holt et al. 1998).

Кроме того, известно, что при кислом pH значительно снижается растворимость миоголобина, вследствие чего он выпадает в осадок в просвете канальца, вместе с некротизированными участками канальцев образуя так называемые цилиндры, которые могут нарушать нормальный отток мочи. При pH 5 только 32% миоглобина, попавшего в почку, выводится с мочой (Zager 1996).

3.5. Участие опиоидных пептидов в патогенезе почки при рабдомиолизе.

В последнее время появились новые данные (Sauriyal D. et al), демонстрирующие, что в повреждении почки при рабдомиолизе могут участвовать опиоидные пептиды. Было показано, что некоторые опиатные блокаторы (налтрексон, миноксидил, глибенкламид) заметно уменьшали симптомы рабдомиолиза в дозо-зависимой манере. Исследователи предположили, что при рабдомиолизе может происходить образование опиоидных пептидов, модулирующих активность К(АТР) канала, таким образом способствуя патогенезу острой почечной недостаточности. С другой стороны, было показано (Fruitier I, Garreau I et al, 1999) что при лизосомальном протеолизе гемоглобина (родственного миоглобину белка) образуются геморфины - биоактивные пептиды с опиоидной активностью, относительно стабильные в первые часы гидролиза. Авторы предполагают, что такой ткане-специфический пептидный пул может быть конститутивным и участвовать в пептидэргической регуляции. При этом опиоидные пептиды могут проявлять не

только опиатное действие, например, в мозге они могут связываться также с NMDA-рецепторами (Wollemann М et al, 2004).

4. Дисфункция почки при рабдомиолизе связана с развитием в ней окислительного стресса.

Основная функция почек состоит в стабилизации внутренней среды организма путем сохранения постоянного объема, осмоляльности, рН и концентрации солей во внеклеточной жидкости. Это достигается фильтрацией плазмы (внеклеточной жидкости) в почечных клубочках (glomerulus), реабсорбцией нужных веществ в канальцах и выделением ненужных продуктов метаболизма в мочу.

Обилие ненасыщенных жирных кислот в мембранах клеток почки делает их особенно уязвимыми при атаке АФК, поэтому развивающийся окислительный стресс является основной причиной их дисфункции при ряде патологий. Он участвует в развитии таких серьезных заболеваний, как острая и хроническая почечная недостаточность, гломерулонефрит, гиперлипедемия, рабдомиолиз. Участие АФК в этих процессах подтверждается как обнаружением продуктов окислительного повреждения в ткани почки или моче, так и эффективностью различных антиоксидантов при лечении (Singh, Kaur et al. 2006).

Активные формы кислорода (АФК) и азота (АФА) являются нормальными метаболитами клетки, образующимися в результате различных окислительно-восстановительных реакций. АФК и АФА представляют собой свободные радикалы: супероксид анион радикал (Ог"), гидроксильный радикал (ЮН), гидроперокси-радикал (НОО-)? алкоксил-радикал (LO-), липопероксирадикал (LOO-), NO-радикал (NO-), а также нерадикальные молекулы: пероксид водорода (Н2О2), синглетный кислород (02'), гипохлорит-анион (ОСГ), пероксинитрит (ONOO"). Активные формы кислорода и азота обладают высокой химической активностью и представляют существенную угрозу для редокс-чувствительных компонентов клетки, прежде всего белков, липидов и нуклеиновых кислот, могут вызвать каскад реакций, приводящий к митохондриальной дисфункции, активации каспаз и к активации различных сигнальных путей. В норме АФК и АФА действуют как специфические сигнальные молекулы, участвующие в регуляции многих физиологических процессов (Turpaev 2002; Turrens 2003). Окислительным стрессом называется такое состояние ткани, которое характеризуется избыточным уровнем продукции АФК и АФА. При этом наблюдается значительное увеличение клеточного редокс-потенциала и существенное снижение восстановительной способности клеточных редокс-пар,

таких как окисленный/восстанов ленный глутатион. В нормальных условиях основная часть молекулярного кислорода (более 95%) потребляется митохондриями клетки, где фермент цитохромоксидаза присоединяет к молекуле О2 четыре электрона, катализируя образования двух молекул воды. Но в ряде случаев может происходить одноэлектронное восстановление кислорода при его взаимодействии с убихиноном, который является промежуточным компонентом дыхательной цепи. В результате этой реакции образуется супероксид-анион кислорода О2 — радикал, содержащий один неспаренный электрон. Такое может происходить, например, при ишемии/реперфузии, когда перевосстановление компонентов дыхательной цепи при реоксигенации приводит к одноэлектронному восстановлению кислорода (Turrens 2003). Также этот радикал может образоваться путем взаимодействия кислорода с ионами металлов переменной валентности или в ходе спонтанного окисления некоторых соединений, например дофамина. В большинстве случаев именно супероксид является первым продуктом активации кислорода, давая начало всем остальным АФК. Суперкооксид-анион кислорода является высокореакционным соединением, время жизни которого составляет 10-бс. В водных растворах он быстро дисмутирует с образованием перекиси водорода Н2О2, причем скорость дисмутации сильно зависит от кислотности среды (Fridovich 1995). Пероксид водорода способен взаимодействовать с железом Fe2+, образуя гидроксильный радикал ЮН в реакции Фентон (Fenton):

Fe2+ + Н2О2 Fe3+ + -ОН + "ОН

Fe3++02"-+ Fe2++02

Реакция идет с высокой скоростью, константа реакции в обоих направлениях составляет 104 M-1/c-l при нейтральном pH. Кроме этого, гидроксил-радикал может образовываться в катализируемой металлами реакции Хабера-Вайса (Haber-Weiss): О2" + Н2О2 О2 + -ОН + "ОН

Однако, эта реакция идет очень медленно и не является важным источником гидроксил-радикала.

Гидроксильный радикал обладает наибольшей разрушительной силой по отношению к биологическим структурам и способен, благодаря высокой реакционной способности (Ross, Dey et al. 1998) окислять практически все клеточные компоненты. Из-за своих окислительных свойств ОН* не обладает избирательностью действия, имеет время жизни около нескольких наносекунд и не может

диффундировать далеко от места образования (лишь на нескольких нанометров) (Roots and Okada 1975).

Ненасыщенные жирные кислоты (олеиновая, линолевая, линоленовая, арахидоновая) взаимодействуют со свободными радикалами, в результате чего происходит разрыв ослабленной сопряженной двойной тс-связи с образованием свободных радикалов жирных кислот, вступающих в реакцию цепного автоокисления. Избыточная активность алкоксил-радикала и липопероксирадикала тормозится насыщенными жирными кислотами, холестерином, а также а-токоферолом. Перекисное окисление липидов приводит к нарушению нормальной упаковки мембранного бислоя и общей целостности клеточной мембраны.

Процесс образования АФК в клетке при ишемии можно разделить на ферментативный и неферментативный. К ферментативным источникам АФК относятся, прежде всего, ксантиноксидаза, циклооксигеназа, а также цитохром Р450-зависимые оксигеназы, NADPH-оксидазы плазматической мембраны макрофагов и эндотелиальных клеток (Coon, Ding et al. 1992). Например, в норме при распаде АТФ накапливается гипоксантин, который ферментом ксантиндегидрогеназой окисляется в ксантин с последующим превращением в мочевую кислоту с использованием NAD+ в качестве акцептора электронов. Однако, при ишемии и развитии окислительного стресса в результате атаки свободными радикалами SH-rpynna ксантиндегидрогеназы окисляется и фермент превращается в другую изоформу -ксантиноксидазу. Ксантиноксидаза катализирует ту же самую реакцию (окисления гипоксантина в ксантин), за исключением того, что акцептором электронов является кислород, что приводит к образованию супероксид-анион радикала (Beetsch, Park et al. 1998). Супероксид-анион интенсивно образуется также в результате ферметантивного окисления арахидоновой кислоты циклооксигеназой 2 (Kukreja, Kontos et al. 1986).

Полиморфноядерные лейкоциты (ПЯЛ) также могут играть важную роль в продукции свободных радикалов. ПЯЛ могут генерировать свободные радикалы с помощью двух ферментых систем, таких как NADPH-оксидаза и миелопероксидаза. NADPH-оксидазная система плазматической мембраны лейкоцитов, а также макрофагов и эндотелиальных клеток представляет собой мультикомпонентный комплекс ферментов, основу которого составляют флавоцитохром Ь558 и несколько белков цитоплазмы, собирающихся в комплекс при поступлении сигналов воспаления. Комплекс устроен таким образом, что, используя цитозольный NADPH2,

генерирует О2". с внешней стороны плазмалеммы для воздействия в области воспаления (Vignais 2002).

Миелопероксидаза находится в лизосомах лейкоцитов и относится к гем-содержащим белкам. Основным субстратом миелопероксидазы является перекись водорода, а катализируемым продуктом - гипохлорит-анион, который является сильным окислителем и способен галогенировать белки (Zhang, Brennan et al. 2002).

4.1. Роль NO и активных форм азота

Активные формы азота образуются с помощью фермента NO-синтазы

(NOS), которая катализирует превращение L-аргинина сначала в N-гидроксиларгинин, а затем в L-цитруллин и NO (Knowles and Moneada 1994, Alderton, Cooper et al. 2001). Донором двух электронов в этой реакции выступает NADPH:

L-аргинин +NADPH2 + 02 ^N0+ L-цитруллин.

NO-синтаза - это сложно устроенный фермент, представляющий собой гомодимер, к каждому из которых присоединено несколько кофакторов (флавинмононуклеотид, флавин динуклеотид, кальмодулин, гем и тетрагидробиоптерин), определяющих каталитические свойства фермента. NOS присутствуют в клетках практически всех типов тканей и по типу экспрессии их разделяют на конститутивно присутствующие в клетках cNOS и индуцибельные iNOS (Chander and Chopra 2005, Vinas, Sola et al. 2006). Группа cNOS обычно делится на нейрональную ncNOS (NOS1) и эндотелиальную ecNOS (NOS3) по месту их основной локализации, хотя они находятся и в других клетках. iNOS ассоциирована в основном с макрофагами и участвует в работе иммунной системы (Albina and Reichner 1998), накапливаясь в этих клетках после активации их цитокинами (IFN-y, IL-ip , TNF-a) и другими агентами (ЛПС).

Каталитическая активность ncNOS и ecNOS сильно зависит от концентрации

2+

Са , в то время как с iNOS кальмодулин связан столь прочно, что она не нуждается в добавлении Са2+. Недавно была открыта митохондриальная NOS (mtNOS), активация которой вместе с продукцией О2" приводит к образованию высокоактивного пероксинитрита ONOO.

NO играет дуалистическую роль в организме. С одной стороны, при низкой концентрации (порядка 10-150 нМ) он имеет физиологическую функцию в качестве внутри- и межклеточного мессенджера. С другой стороны, при концентрациях >300нМ он выступает как цитотоксическая молекула (Gross and Wolin 1995). Оксид азота легко проникает через клеточные мембраны и компоненты межклеточного

вещества, время его полужизни в среднем не более 5-30 секунд, а расстояние возможной диффузии в среднем 30 мкм. Также N0 обладает высокой реакционной способностью и взаимодействует со многими возможными субстратами, в основном с тиолами и переходными металлами

(Nedospasov 1998). Оксид азота, взаимодействуя с 02~, образует пероксинитрит (ONOO"), а также может являться источником очень токсичного гидроксил- радикала

ОН в реакции:

NO* + 02~ ONOO~ + Н+ -> ONOOH ONO* + * ОН

Источниками супероксида у животных могут быть эндотелий, гладкие мышечные клетки сосудов, фибробласты. Ангиотензин II может стимулировать продукцию супероксида эпителиальными и мезангиальными клетками через активацию NADPH -оксидазы (Jaimes, Galceran et al. 1998).

Пероксинитрит обладает сильной окислительной активностью, он интенсивно нитрозилирует белки, но в присутствии тиолов он образует NO (Albina and Reichner 1998, Estevez, Spear et al. 1999). Также известно, что пероксинитрит является важным модулятором циклооксигеназной активности, способствуя синтезу простагландинов (Landino, Crews et al. 1996).

Одним из важных регуляторных эффектов N0 является нитрование белков (Bosca and Hortelano 1999). Образование 3-нитротирозина может представлять собой пост-трансляционную модификацию, сходную с фосфорилированием и несущую сигнальные функции. Нитрозилирование белков по остаткам тирозина (Reiter, Teng et al. 2000), осуществляемое ONOO", может иметь серьезные функциональные последствия, так как оно подавляет фосфорилирование тирозина, то есть нарушает некоторые пути передачи сигнала в клетке. Недавно сообщалось (Cassina, Hodara et al. 2000), что пероксинитрит может нитрозилировать и цитохром с в митохондриях, что приводит к изменению его функций, в частности он становится неспособным поддерживать перенос электронов в дыхательной цепи и не восстанавливается аскорбатом. Оксид азота также является модулятором синтеза ренина и его секреции почками (Kurtz and Wagner 1998).

Еще одним источником NO может являться нитритредуктаза. Возможно, она является основным источником NO во время реперфузии, так как NOS для своей реакции требуют молекулярный кислород, концентрация которого в ткани во время ишемии незначительна. В ряде работ был показан NOS независимый синтез NO в

различных тканях при ишемии: в сердце (Zweier, Wang et al. 1995), скелетных мышцах (Lepore, Kozlov et al. 1999); в кишечнике (Kozlov, Sobhian et al. 2001).

Клинические и экспериментальные признаки почечных повреждений при окислительном стрессе могут быть сгруппированы в клубочковые, канальцевые и эндотелиальные изменения (Singh, Kaur et al. 2006).

4.2. Клубочковые изменения.

Клубочки - наиболее чувствительные к окислительному повреждению участки

нефрона.

Развитие окислительного стресса связано, в первую очередь, с накоплением в них липопротеинов низкой плотности (ЛНП) (Gwinner, Deters-Evers et al. 1998). Легко окисляясь при воспалении и инфильтрации лейкоцитов, они могут индуцировать продукцию АФК в клубочковых клетках, и таким образом приводить к активации в них апоптотического пути (Wheeler, Chana et al. 1994, Galle, Heermeier et al. 1999). Также они могут стимулировать генную экспрессию фибронектина через аутокринную секрецию трансформирующего фактора роста (3 (TGF Р) (Ding, van Goor et al. 1997). Нативные липопротеины также участвуют в повреждении клубочков, стимулируя секрецию фибронектина мезангиальными клетками. Таким образом, дислипопротеинемия приводит к развитию гломерулосклероза.

С другой стороны, окислительный стресс может развиваться под влиянием медиаторов воспаления, таких как цитокины и хемокины (Singh, Kaur et al. 2006). Эти молекулы образуются в различных типах почечных клеток (мезангиальными, эндотелиальными клетками, канальцевым эпителием, интерстициальными фибробластами) в ответ на разнообразные стимулы. В результате они активируют лейкоциты, которые и производят АФК. Активации фактора NF-кВ в мезангиальных клетках свободными радикалами приводит к усилению экспрессии провоспалительных генов (Massy, Guijarro et al. 1999). Позднее окисление липопротеинов, а также супероксид и NO могут активировать апоптоз в мезангиальных клетках (рис. 3).

АФК

Клубочковые клетки и инфильтрация лейкоцитов

. Активация NF-kB 1

Адгезивные молекулы

Цитокины и хемокины

провоспалительные

Клубочковые повреждения

Рис. 3. Механизм повреждения клубочков под действием АФК.

4.3. Канальцевые повреждения.

Поврежденные канальцы - типичная патология, развивающаяся при различных

заболеваниях почек (рис. 4). При уменьшении избирательной проницаемости клубочков в канальцы и мочу попадает много вредных веществ, таких как окисленные липопротеины, переходные металлы, нефротоксичные лекарства, гемоглобин и миоглобин (Singh, Kaur et al. 2006). Эти вещества обладают потенциальной окислительной способностью, а также могут активировать гем-оксигеназу, фермент, катализирующий деградацию гемовых групп (Nath, Baila et al. 1992, Nath, Haggard et al. 2000). В результате в просвете канальцев появляется свободное железо, которое приводит к появлению ОН - радикала и липидных перекисей (Singh, Kaur et al. 2006, Moore, Holt et al. 1998, Cooper, Vollaard et al. 2002, Reeder, Svistunenko et al. 2004). Кроме этого, миоглобин непосредственно может индуцировать перекисное окисление липидов (Moore, Holt et al. 1998, Reeder, Sharpe et al. 2002). Показано, что при миоглобинурии (экскреции миоглобина с мочой) в клетках канальцев наблюдается увеличение продукции перекиси водорода и падение уровня глутатиона (Polo-Romero, Fernandez-Funez et al. 2004). Появление АФК индуцирует экспрессию медиаторов воспаления (Singh, Kaur et al. 2006). Также непроходимость канальцев может быть связана с отложениями оксалата кальция при мочекаменной болезни. Кроме его патогенной роли в образовании камней, он также способен генерировать свободные радикалы, вызывая окисление липидов (Singh, Kaur et al. 2006).

Накопление макрофагов в интерстициальном пространстве почечного кортекса также играет важную роль в развитии канальцевых повреждений и интерстициального фиброза (Vielhauer, Anders et al. 2001). Было показано, что АФК могут индуцировать экспрессию цитокинов, хемокинов и других медиаторов воспаления, таким образом способствуя привлечению лейкоцитов (Singh, Kaur et al. 2006).

Уретральная обструкция, часто встречающаяся при различных дисфункциях почки, также связана с окислительным стрессом и приводит к повреждениям канальцев вследствие воспалительного и тубулоинтерстициального фиброза (Klahr 2001). Также после уменьшения обструкции происходит увеличение продукции АФК канальцами (Young, Young et al. 1996).

При канальцевой обструкции и вазоконстрикции происходит возбуждение расположенных в стенках артериол клеток юкстагломерулярного аппарата (ЮГА) (Singh, Kaur et al. 2006). Они начинают усиленно секретировать протеолитический фермент ренин, катализирующий начальный этап образования декапептида ангиотензина I. Далее под влиянием специальной пептидазы, обнаруженной в плазме крови и тканях, ангиотензин I - превращающего фермента (дипептидил-карбоксипептидаза I) из ангиотензина I образуется октапептид ангиотензин II. Главным местом этого превращения являются легкие. Ангиотензин II обладает высокой биологической активностью. Основной функцией ангиотензинов является регуляция уровня артериального давления и сопряженных процессов почечной фильтрации и водно-солевого обмена. Однако, у ангиотензина II есть еще ряд активностей, важных в контексте развития окислительного стресса (Klahr 1998). Ангиотензин II может приводить к активации мембранно-связанной NADPH-оксидазы, таким образом способствуя генерации супероксида, который, в свою очередь, приводит к гипертрофии почечных канальцев. Также он регулирует экспрессию цитокинов TGF-ß и TNF-a, способствующих воспалению и фиброзу канальцев (Hannken, Schroeder et al. 1998).

Канальцевая непроходимость

I

Аангиотензин 2 оксалат кальция

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Чупыркина, Анастасия Андреевна

5. Выводы

1. Показано нарушение функционирования митохондрий почки in vivo при экспериментальном рабдомиолизе и при действии миоглобина in vitro.

2. Дисфункция митохондрий вызвана развитием неспецифической проницаемости митохондрий и сопровождается окислительным стрессом и повышением продукции N0.

3. При рабдомиолизе в клетках почки повышается уровень продуктов деградации миоглобина - гема и ионов железа.

4. Митохондриально-адресованный антиоксидант SkQRl уменьшает дисфункцию почки при рабдомиолизе.

6. Благодарности

Хочу поблагодарить сотрудников кафедры биохимии за те ценные знания и практические навыки, которые я получила за время обучения.

Я очень признательна д.б.н. Зорову Дмитрию Борисовичу за предоставленную возможность выполнения диссертационной работы в лаборатории структуры и функции митохондрий, а также за ценные советы, полученные в ходе выполнения самой работы и при обсуждении результатов.

Особую благодарность хочу выразить своему научному руководителю, д.б.н. Плотникову Егору Юрьевичу, за постоянное внимание и значительную помощь в подготовке и проведении экспериментов, критическое обсуждение теоретических проблем и результатов, а также за те практические навыки, которые я получила, выполняя кандидатскую работу под его руководством.

Я благодарю также Ирину Певзнер, Дениса Силачева, Татьяну Хряпенкову, Марию Моросанову, Алену Васильеву за поддержку и помощь, полученные при выполнении работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чупыркина, Анастасия Андреевна, 2012 год

7. Список литературы

1. Adiseshiah, М., J. M. Round, et al. (1992). "Reperfusion injury in skeletal muscle: a prospective study in patients with acute limb ischaemia and claudicants treated by revascularization." The British journal of surgery 79(10): 1026-1029.

2. Agapova, L. S., В. V. Chernyak, et al. (2008). "Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 3. Inhibitory effect of SkQl on tumor development from p53-deficient cells." Biochemistry (Mosc) 73(12): 13001316.

3. Albina, J. E. and J. S. Reichner (1998). "Role of nitric oxide in mediation of macrophage cytotoxicity and apoptosis." Cancer Metastasis Rev 17(1): 39-53.

4. Alderton, W. К., С. E. Cooper, et al. (2001). "Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition." Biochem J 357(Pt 3): 593-615.

5. Antonenko, Y. N., V. A. Roginsky, et al. (2008). "Protective effects of mitochondria-targeted antioxidant SkQ in aqueous and lipid membrane environments." J Membr Biol 222(3): 141-149.

6. Avramovic, V., P. Vlahovic, et al. (1999). "Protective effect of a bioflavonoid proanthocyanidin-BPl in glycerol-induced acute renal failure in the rat: renal stereological study." Renal failure 21(6): 627-634.

7. Aydogdu, N., G. Atmaca, et al. (2006). "Protective effects of L-carnitine on myoglobinuric acute renal failure in rats." Clin Exp Pharmacol Physiol 33(1-2): 119-124.

8. Badr, K. F. and Т. E. Abi-Antoun (2005). "Isoprostanes and the kidney." Antioxid Redox Signal 7(1-2): 236-243.

9. Bagley, W. H„ H. Yang, et al. (2007). "Rhabdomyolysis." Intern Emerg Med 2(3): 210218.

10. Baliga, R., Z. Zhang, et al. (1996). "Evidence for cytochrome P-450 as a source of catalytic iron in myoglobinuric acute renal failure." Kidney international 49(2): 362-369.

11. Balla, G., H. S. Jacob, et al. (1992). "Ferritin: a cytoprotective antioxidant strategem of endothelium." The Journal of biological chemistry 267(25): 18148-18153.

12. Beetsch, J. W., T. S. Park, et al. (1998). "Xanthine oxidase-derived superoxide causes reoxygenation injury of ischemic cerebral endothelial cells." Brain Res 786(1-2): 89-95.

13. Belkin, M., W. L. LaMorte, et al. (1989). "The role of leukocytes in the pathophysiology of skeletal muscle ischemic injury." Journal of vascular surgery : official publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter 10(1): 14-18; discussion 18-19.

14. Ben Abraham, R., A. Cahana, et al. (1997). "Malignant hyperthermia susceptibility: anaesthetic implications and risk stratification." QJM 90(1): 13-18.

15. Berry, E. A. and B. L. Trumpower (1987). "Simultaneous determination of hemes a, b, and c from pyridine hemochrome spectra." Anal Biochem 161(1): 1-15.

16. Betten, D. P., W. H. Richardson, et al. (2006). "Massive honey bee envenomation-induced rhabdomyolysis in an adolescent." Pediatrics 117(1): 231-235.

17. Blanco, J. R., M. Zabalza, et al. (2002). "Rhabdomyolysis of infectious and noninfectious causes." South Med J 95(5): 542-544.

18. Blewitt, G. A. and E. B. Siegel (1983). "Renal failure, rhabdomyolysis, and phenylpropanolamine." JAMA 249(22): 3017-3018.

19. Bosca, L. and S. Hortelano (1999). "Mechanisms of nitric oxide-dependent apoptosis: involvement of mitochondrial mediators." Cell Signal 11(4): 239-244.

20. Bosch, X., E. Poch, et al. (2009). "Rhabdomyolysis and acute kidney injury." The New England journal of medicine 361(1): 62-72.

21. Boutaud, O., K. P. Moore, et al. (2010). "Acetaminophen inhibits hemoprotein-catalyzed lipid peroxidation and attenuates rhabdomyolysis-induced renal failure." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107(6): 2699-2704.

22. Boutaud, O. and L. J. Roberts, 2nd (2011). "Mechanism-based therapeutic approaches to rhabdomyolysis-induced renal failure." Free radical biology & medicine 51(5): 1062-1067.

23. Bowie, A. G. and L. A. O'Neill (2000). "Vitamin C inhibits NF-kappa B activation by TNF via the activation of p38 mitogen-activated protein kinase." Journal of immunology 165(12): 7180-7188.

24. Brdiczka, D., G. Beutner, et al. (1998). "The molecular structure of mitochondrial contact sites. Their role in regulation of energy metabolism and permeability transition." Biofactors 8(3-4): 235-242.

25. Brivet, F. G., D. J. Kleinknecht, et al. (1996). "Acute renal failure in intensive care units-causes. outcome, and prognostic factors of hospital mortality; a prospective, multicenter study. French Study Group on Acute Renal Failure." Crit Care Med 24(2): 192-198.

26. Brown, C. V., P. Rhee, et al. (2004). "Preventing renal failure in patients with rhabdomyolysis: do bicarbonate and mannitol make a difference?" The Journal of trauma 56(6): 1191-1196.

27. Brown, G. C. and V. Borutaite (2007). "Nitric oxide and mitochondrial respiration in the heart." Cardiovasc Res 75(2): 283-290.

28. Brumback, R. A., D. L. Feeback, et al. (1992). "Rhabdomyolysis in childhood. A primer on normal muscle function and selected metabolic myopathies characterized by disordered energy production." Pediatr Clin North Am 39(4): 821-858.

29. Brumback, R. A., D. L. Feeback, et al. (1995). "Rhabdomyolysis following electrical injury." Semin Neurol 15(4): 329-334.

30. Cascon, E., R. Roig, et al. (2001). "Nonalcoholic components in wine reduce low density lipoprotein cholesterol in normocholesterolemic rats." Lipids 36(4): 383-388.

31. Casserly, B., E. O'Mahony, et al. (2004). "Propofol infusion syndrome: an unusual cause of renal failure." American journal of kidney diseases : the official journal of the National Kidney Foundation 44(6): e98-101.

32. Cassina, A. M., R. Hodara, et al. (2000). "Cytochrome c nitration by peroxynitrite." The Journal of biological chemistry 275(28): 21409-21415.

33. Chander, V. and K. Chopra (2005). "Molsidomine, a nitric oxide donor and L-arginine protects against rhabdomyolysis-induced myoglobinuric acute renal failure." Biochimica et biophysica acta 1723(1-3): 208-214.

34. Chatzizisis, Y. S., G. Misirli, et al. (2008). "The syndrome of rhabdomyolysis: complications and treatment." Eur J Intern Med 19(8): 568-574.

35. Cocheme, H. M., G. F. Kelso, et al. (2007). "Mitochondrial targeting of quinones: therapeutic implications." Mitochondrion 7 Suppl: S94-102.

36. Coon, M. J., X. X. Ding, et al. (1992). "Cytochrome P450: progress and predictions." The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 6(2): 669-673.

37. Cooper, C. E., N. B. Vollaard, et al. (2002). "Exercise, free radicals and oxidative stress." Biochemical Society transactions 30(2): 280-285.

38. Ding, G., H. van Goor, et al. (1997). "Oxidized LDL stimulates the expression of TGF-beta and fibronectin in human glomerular epithelial cells." Kidney international 51(1): 147154.

39. Drapier, J. C., H. Hirling, et al. (1993). "Biosynthesis of nitric oxide activates iron regulatory factor in macrophages." EMBO J 12(9): 3643-3649.

40. Eiser, A. R., M. S. Neff, et al. (1982). "Acute myoglobinuric renal failure. A consequence of the neuroleptic malignant syndrome." Arch Intern Med 142(3): 601-603.

41. Emerit, J., C. Beaumont, et al. (2001). "Iron metabolism, free radicals, and oxidative injury." Biomed Pharmacother 55(6): 333-339.

42. Estevez, A. G., N. Spear, et al. (1999). "Examining apoptosis in cultured cells after exposure to nitric oxide and peroxynitrite." Methods Enzymol 301: 393-402.

43. Flogel, U., M. W. Merx, et al. (2001). "Myoglobin: A scavenger of bioactive NO." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98(2): 735-740.

44. Fridovich, I. (1995). "Superoxide radical and superoxide dismutases." Annu Rev Biochem 64: 97-112. FEBS Lett., 447(l):81-6.

45. Fruitier I, Garreau I, Lacroix A, Cupo A, Piot JM. (1999). Proteolytic degradation of hemoglobin by endogenous lysosomal proteases gives rise to bioactive peptides: hemorphins.

46. Fruitier, I., I. Garreau, et al. (1999). "Proteolytic degradation of hemoglobin by endogenous lysosomal proteases gives rise to bioactive peptides: hemorphins." FEBS Lett 447(1): 81-86.

47. Gabow, P. A., W. D. Kaehny, et al. (1982). "The spectrum of rhabdomyolysis." Medicine (Baltimore) 61(3): 141-152.

48. Galle, J., K. Heermeier, et al. (1999). "Atherogenic lipoproteins, oxidative stress, and cell death." Kidney Int Suppl 71: S62-65.

49. Garcic, A. (1979). "A highly sensitive, simple determination of serum iron using chromazurol B." Clin Chim Acta 94(2): 115-119.

50. Gayan-Ramirez, G. and M. Decramer (1998). "[The effect of corticotherapy on respiratory muscles]." Rev Mai Respir 15(1): 33-41.

51. Gburek, J., H. Birn, et al. (2003). "Renal uptake of myoglobin is mediated by the endocytic receptors megalin and cubilin." Am J Physiol Renal Physiol 285(3): F451-458.

52. Giovannini, L., M. Migliori, et al. (2001). "Resveratrol, a polyphenol found in wine, reduces ischemia reperfusion injury in rat kidneys." J Cardiovasc Pharmacol 37(3): 262270.

53. Gonzalez-Michaca, L., G. Farrugia, et al. (2004). "Heme: a determinant of life and death in renal tubular epithelial cells." Am J Physiol Renal Physiol 286(2): F370-377.

54. Grivennikova, V. G. and A. D. Vinogradov (2006). "Generation of superoxide by the mitochondrial Complex I." Biochimica et biophysica acta 1757(5-6): 553-561.

55. Gross, S. S. and M. S. Wolin (1995). "Nitric oxide: pathophysiological mechanisms." Annu Rev Physiol 57: 737-769.

56. Grunwald, E. W. and M. P. Richards (2006). "Mechanisms of heme protein-mediated lipid oxidation using hemoglobin and myoglobin variants in raw and heated washed muscle." J Agric Food Chem 54(21): 8271-8280.

57. Guevara, I., J. Iwanejko, et al. (1998). "Determination of nitrite/nitrate in human biological material by the simple Griess reaction." Clin Chim Acta 274(2): 177-188.

58. Guidet, B. and S. V. Shah (1989). "Enhanced in vivo H202 generation by rat kidney in glycerol-induced renal failure." Am J Phvsiol 257(3 Pt 2): F440-445.

59. Gutierrez, J., S. W. Ballinger, et al. (2006). "Free radicals, mitochondria, and oxidized lipids: the emerging role in signal transduction in vascular cells." Circ Res 99(9): 924-932.

60. Guzy, R. D. and P. T. Schumacker (2006). "Oxygen sensing by mitochondria at complex III: the paradox of increased reactive oxygen species during hypoxia." Exp Physiol 91(5): 807-819.

61. Gwinner, W., U. Deters-Evers, et al. (1998). "Antioxidant-oxidant balance in the glomerulus and proximal tubule of the rat kidney." J Physiol 509 ( Pt 2): 599-606.

62. Hackenbrock, C. R. (1968). "Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 61(2): 598-605.

63. Halliwell, B. and J. M. Gutteridge (1990). "Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview." Methods Enzymol 186: 1-85.

64. Hannken, T., R. Schroeder, et al. (1998). "Angiotensin II-mediated expression of p27Kipl and induction of cellular hypertrophy in renal tubular cells depend on the generation of oxygen radicals." Kidney international 54(6): 1923-1933.

65. Harrison, P. M. and P. Arosio (1996). "The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation." Biochimica et biophysica acta 1275(3): 161-203.

66. He, L. and J. J. Lemasters (2002). "Regulated and unregulated mitochondrial permeability transition pores: a new paradigm of pore structure and function?" FEBS Lett 512(1-3): 1-7.

67. Ishikawa, Y. and M. Kitamura (2000). "Anti-apoptotic effect of quercetin: intervention in the JNK- and ERK-mediated apoptotic pathways." Kidney international 58(3): 1078-1087.

68. Jaimes, E. A., J. M. Galceran, et al. (1998). "Angiotensin II induces superoxide anion production by mesangial cells." Kidney international 54(3): 775-784.

69. Kaushal, G. P. (2003). "Role of caspases in renal tubular epithelial cell injury." Semin Nephrol 23(5): 425-431.

70. Kaushal, G. P., A. G. Basnakian, et al. (2004). "Apoptotic pathways in ischemic acute renal failure." Kidney international 66(2): 500-506.

71. Khan, F. Y. (2009). "Rhabdomyolysis: a review of the literature." The Netherlands journal of medicine 67(9): 272-283.

72. Khan, PI. M., N. A. Syed, et al. (2006). "Neuroleptic malignant syndrome: need for early diagnosis and therapy." Journal of Ayub Medical College. Abbottabad : JAMC 18(1): 1721.

73. Khasawneh, F. T., J. S. Huang, et al. (2008). "Characterization of isoprostane signaling: evidence for a unique coordination profile of 8-iso-PGF(2alpha) with the thromboxane A(2) receptor, and activation of a separate cAMP-dependent inhibitory pathway in human platelets." Biochemical pharmacology 75(12): 2301-2315.

74. Kim, H. P., S. W. Ryter, et al. (2006). "CO as a cellular signaling molecule." Annu Rev Pharmacol Toxicol 46: 411-449.

75. Klahr, S. (1998). "Obstructive nephropathy." Kidney international 54(1): 286-300.

76. Klahr, S. (2001). "Urinary tract obstruction." Semin Nephrol 21(2): 133-145.

77. Knowles, R. G. and S. Moncada (1994). "Nitric oxide synthases in mammals." Biochem J 298 (Pt 2): 249-258.

78. Kowaltowski, A. J., R. F. Castilho, et al. (2001). "Mitochondrial permeability transition and oxidative stress." FEBS Lett 495(1-2): 12-15.

79. Kozlov, A. V., B. Sobhian, et al. (2001). "Organ specific formation of nitrosyl complexes under intestinal ischemia/reperfusion in rats involves NOS-independent mechanism(s)." Shock 15(5): 366-371.

80. Kukreja, R. C., H. A. Kontos, et al. (1986). "PGH synthase and lipoxygenase generate superoxide in the presence ofNADH or NADPH." Circ Res 59(6): 612-619.

81. Kurtz, A. and C. Wagner (1998). "Role of nitric oxide in the control of renin secretion." Am J Physiol 275(6 Pt 2): F849-862.

82. Kurtz, T. W., R. M. Maletz, et al. (1976). "Renal cortical blood flow in glycerol-induced acute renal failure in the rat." Circ Res 38(1): 30-35.

83. Landino, L. M., B. C. Crews, et al. (1996). "Peroxynitrite, the coupling product of nitric oxide and superoxide, activates prostaglandin biosynthesis." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(26): 15069-15074.

84. Lavrovsky, Y., M. L. Schwartzman, et al. (1994). "Identification of binding sites for transcription factors NF-kappa B and AP-2 in the promoter region of the human heme oxygenase 1 gene." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91(13): 5987-5991.

85. Lemasters, J. J., T. Qian, et al. (2002). "Role of mitochondrial inner membrane permeabilization in necrotic cell death, apoptosis, and autophagy." Antioxid Redox Signal 4(5): 769-781.

86. Lepore, D. A., A. V. Kozlov, et al. (1999). "Nitric oxide synthase-independent generation of nitric oxide in rat skeletal muscle ischemia-reperfusion injury." Nitric Oxide 3(1): 75-84.

87. Lim, A. K., L. Ho, et al. (2006). "Quinine-induced renal failure as a result of rhabdomyolysis, haemolytic uraemic syndrome and disseminated intravascular coagulation." Intern Med J 36(7): 465-467.

88. Massy, Z. A., C. Guijarro, et al. (1999). "The central role of nuclear factor-kappa B in mesangial cell activation." Kidney Int Suppl 71: S76-79.

89. Massy, Z. A., T. Nguyen Khoa, et al. (1999). "Dyslipidaemia and the progression of renal disease in chronic renal failure patients." Nephrol Dial Transplant 14(10): 2392-2397.

90. Matsumoto, S., H. Friberg, et al. (1999). "Blockade of the mitochondrial permeability transition pore diminishes infarct size in the rat after transient middle cerebral artery occlusion." J Cereb Blood Flow Metab 19(7): 736-741.

91. McCarron, D. A., W. C. Elliott, et al. (1979). "Severe mixed metabolic acidosis secondary to rhabdomyolysis." Am J Med 67(5): 905-908.

92. Melli, G., V. Chaudhry, et al. (2005). "Rhabdomyolysis: an evaluation of 475 hospitalized patients." Medicine (Baltimore) 84(6): 377-385.

93. Mihara, M. and M. Uchiyama (1978). "Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test." Anal Biochem 86(1): 271-278.

94. Minnema, B. J., P. C. Neligan, et al. (2008). "A case of occult compartment syndrome and nonresolving rhabdomyolysis." J Gen Intern Med 23(6): 871-874.

95. Montgomery, H., J. C. Porter, et al. (1994). "Salicylate intoxication causing a severe systemic inflammatory response and rhabdomyolysis." Am J Emerg Med 12(5): 531-532.

96. Moore, K. P., S. G. Holt, et al. (1998). "A causative role for redox cycling of myoglobin and its inhibition by alkalinization in the pathogenesis and treatment of rhabdomyolysis-induced renal failure." The Journal of biological chemistry 273(48): 31731-31737.

97. Morita, T. and S. Kourembanas (1995). "Endothelial cell expression of vasoconstrictors and growth factors is regulated by smooth muscle cell-derived carbon monoxide." The Journal of clinical investigation 96(6): 2676-2682.

98. Nath, K. A., G. Balla, et al. (1992). "Induction of heme oxygenase is a rapid, protective response in rhabdomyolysis in the rat." The Journal of clinical investigation 90(1): 267270.

99. Nath, K. A., J. P. Grande, et al. (1998). "Intracellular targets in heme protein-induced renal injury." Kidney international 53(1): 100-111.

100. Nath, K. A., J. J. Haggard, et al. (2000). "The indispensability of heme oxygenase-1 in protecting against acute heme protein-induced toxicity in vivo." Am J Pathol 156(5): 15271535.

101. Nath, K. A., G. M. Vercellotti, et al. (2001). "Heme protein-induced chronic renal inflammation: suppressive effect of induced heme oxygenase-1." Kidney international 59(1): 106-117.

102. Nedospasov, A. A. (1998). "Competition involving biogenic NO." Biochemistry (Mosc) 63(7): 744-765.

103. Nickenig, G., K. Strehlow, et al. (2000). "Negative feedback regulation of reactive oxygen species on ATI receptor gene expression." Br J Pharmacol 131(4): 795-803.

104. Nihei, T., Y. Miura, et al. (2001). "Inhibitory effect of resveratrol on proteinuria, hypoalbuminemia and hyperlipidemia in nephritic rats." Life sciences 68(25): 2845-2852.

105. Odeh, M. (1991). "The role of reperfusion-induced injury in the pathogenesis of the crush syndrome." The New England journal of medicine 324(20): 1417-1422.

106. Olbricht, C. J., E. Gutjahr, et al. (1990). "Effect of low molecular weight proteins and dextran on renal cathepsin B and L activity." Kidney international 37(3): 918-926.

107. Osawa, Y. and M. S. Williams (1996). "Covalent crosslinking of the heme prosthetic group to myoglobin by H202: toxicological implications." Free radical biology & medicine 21(1): 35-41.

108. Paller, M. S. (1988). "Hemoglobin- and myoglobin-induced acute renal failure in rats: role of iron in nephrotoxicity." Am J Physiol 255(3 Pt 2): F539-544.

109. Park, M. S., B. S. Kim, et al. (2007). "Hypoxia/re-oxygenation injury induces apoptosis of LLC-PK1 cells by activation of caspase-2." Pediatr Nephrol 22(2): 202-208.

110. Pedrozzi, N. E., G. P. Ramelli, et al. (1996). "Rhabdomyolysis and anesthesia: a report of two cases and review of the literature." Pediatr Neurol 15(3): 254-257.

111. Plin, C., J. P. Tillement, et al. (2005). "Resveratrol protects against cold ischemia-warm reoxygenation-induced damages to mitochondria and cells in rat liver." Eur J Pharmacol 528(1-3): 162-168.

112. Plotnikov, E. Y., A. A. Chupyrkina, et al. (2011). "Mechanisms of nephroprotective effect of mitochondria-targeted antioxidants under rhabdomyolysis and ischemia/reperfusion." Biochimica et biophysica acta 1812(1): 77-86.

113. Plotnikov, E. Y., A. V. Kazachenko, et al. (2007). "The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney." Kidney international 72(12): 1493-1502.

114. Polo-Romero, F. J., A. Fernandez-Funez, et al. (2004). "Effect of N-acetylcysteine on antioxidant status in glycerol-induced acute renal failure in rats." Renal failure 26(6): 613618.

115. Reeder, B. J., R. C. Hider, et al. (2008). "Iron chelators can protect against oxidative stress through ferryl heme reduction." Free radical biology & medicine 44(3): 264-273.

116. Reeder, B. J., M. A. Sharpe, et al. (2002). "Toxicity of myoglobin and haemoglobin: oxidative stress in patients with rhabdomyolysis and subarachnoid haemorrhage." Biochemical Society transactions 30(4): 745-748.

117. Reeder, B. J., D. A. Svistunenko, et al. (2004). "The radical and redox chemistry of myoglobin and hemoglobin: from in vitro studies to human pathology." Antioxid Redox Signal 6(6): 954-966.

118. Reeder, B. J., D. A. Svistunenko, et al. (2002). "Characteristics and mechanism of formation of peroxide-induced heme to protein cross-linking in myoglobin." Biochemistry 41(1): 367-375.

119. Reeder, B. J. and M. T. Wilson (2005). "Hemoglobin and myoglobin associated oxidative stress: from molecular mechanisms to disease States." Curr Med Chem 12(23): 2741-2751.

120. Reif, D. W. (1992). "Ferritin as a source of iron for oxidative damage." Free radical biology & medicine 12(5): 417-427.

121. Reif, D. W. and R. D. Simmons (1990). "Nitric oxide mediates iron release from ferritin." Archives of biochemistry and biophysics 283(2): 537-541.

122. Reiter, C. D., R. J. Teng, et al. (2000). "Superoxide reacts with nitric oxide to nitrate tyrosine at physiological pH via peroxynitrite." The Journal of biological chemistry 275(42): 32460-32466.

123. Richards, S., J. N. Umbreit, et al. (2003). "Selective serotonin reuptake inhibitor-induced rhabdomyolysis associated with irinotecan." South Med J 96(10): 1031-1033.

124. Rodrigo, R., C. Bosco, et al. (2004). "Amelioration of myoglobinuric renal damage in rats by chronic exposure to flavonol-rich red wine." Nephrol Dial Transplant 19(9): 22372244.

125. Ron, D., U. Taitelman, et al. (1984). "Prevention of acute renal failure in traumatic rhabdomyolysis." Arch Intern Med 144(2): 277-280.

126. Roots, R. and S. Okada (1975). "Estimation of life times and diffusion distances of radicals involved in x-ray-induced DNA strand breaks of killing of mammalian cells." Radiat Res 64(2): 306-320.

127. Rosenberger, C., M. Goldfarb, et al. (2008). "Evidence for sustained renal hypoxia and transient hypoxia adaptation in experimental rhabdomyolysis-induced acute kidney injury." Nephrol Dial Transplant 23(4): 1135-1143.

128. Ross, A. D., I. Dey, et al. (1998). "Effect of antithyroid drugs on hydroxyl radical formation and alpha-1-proteinase inhibitor inactivation by neutrophils: therapeutic

implications." The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 285(3): 12331238.

129. Sandau, K., J. Pfeilschifter, et al. (1997). "Nitric oxide and superoxide induced p53 and Bax accumulation during mesangial cell apoptosis." Kidney international 52(2): 378-386.

130. Sauret, J. M., G. Marinides, et al. (2002). "Rhabdomyolysis." Am Fam Physician 65(5): 907-912.

131. Sauriyal, D. S., A. S. Jaggi, et al. (2011). "Investigating the role of endogenous opioids and K(ATP) channels in glycerol-induced acute renal failure." Fundam Clin Pharmacol.

132. Seymour, B. D. and M. Rubinger (1997). "Rhabdomyolysis induced by epsilon-aminocaproic acid." Ann Pharmacother 31(1): 56-58.

133. Shah, S. V. and P. D. Walker (1988). "Evidence suggesting a role for hydroxyl radical in glycerol-induced acute renal failure." Am J Physiol 255(3 Pt 2): F438-443.

134. Sharma, N., H. Winpenny, et al. (1999). "Exercise-induced rhabdomyolysis: even the fit may suffer." Int J Clin Pract 53(6): 476-477.

135. Sharma, R., A. Khanna, et al. (2000). "Transforming growth factor-betal increases albumin permeability of isolated rat glomeruli via hydroxyl radicals." Kidney international 58(1): 131-136.

136. Simpson, J. A., R. Labugger, et al. (2002). "Differential detection of skeletal troponin I isoforms in serum of a patient with rhabdomyolysis: markers of muscle injury?" Clin Chem 48(7): 1112-1114.

137. Singh, D., V. Chander, et al. (2004). "Protective effect of naringin, a bioflavonoid on ferric nitrilotriacetate-induced oxidative renal damage in rat kidney." Toxicology 201(1-3): 1-8.

138. Singh, D., R. Kaur, et al. (2006). "Antioxidants in the prevention of renal disease." J Med Food 9(4): 443-450.

139. Skulachev, V. P. (2007). "A biochemical approach to the problem of aging: "megaproject" on membrane-penetrating ions. The first results and prospects," Biochemistry (Mosc) 72(12): 1385-1396.

140. Skulachev, V. P., V. N. Anisimov, et al. (2009). "An attempt to prevent senescence: a mitochondrial approach." Biochimica et biophysica acta 1787(5): 437-461.

141. Sorichter, S., J. Mair, et al. (1997). "Skeletal troponin I as a marker of exercise-induced muscle damage." J Appl Physiol 83(4): 1076-1082.

142. Sungur, M. and M. Guven (2001). "Rhabdomyolysis due to carbon monoxide poisoning." Clin Nephrol 55(4): 336-337.

143. Sylvain-Moore, H. and J. P. Worden, Jr. (1991). "Lovastatin-associated rhabdomyolysis." Heart Lung 20(5 Pt 1): 464-466.

144. Szewczyk, D., P. Ovadia, et al. (1998). "Pressure-induced rhabdomyolysis and acute renal failure." The Journal of trauma 44(2): 384-388.

145. Tak, P. P. and G. S. Firestein (2001). "NF-kappaB: a key role in inflammatory diseases." The Journal of clinical investigation 107(1): 7-11.

146. Tang, J., C. Faustman, et al. (2005). "Interactions between mitochondrial lipid oxidation and oxymyoglobin oxidation and the effects of vitamin E." J Agric Food Chem 53(15): 6073-6079.

147. Teweleit, S., M. Hippius, et al. (2001). "[Rhabdomyolysis as a rare complication of theophylline poisoning]." Med Klin (Munich) 96(1): 40-44.

148. Towbin, H., T. Staehelin, et al. (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76(9): 4350-4354.

149. Tracz, M. J., J. Alam, et al. (2007). "Physiology and pathophysiology of heme: implications for kidney disease." Journal of the American Society of Nephrology : JASN 18(2): 414-420.

150. Turpaev, K. T. (2002). "Reactive oxygen species and regulation of gene expression." Biochemistry (Mosc) 67(3): 281-292.

151. Turrens, J. F. (2003). "Mitochondrial formation of reactive oxygen species." J Physiol 552(Pt 2): 335-344.

152. Ustundag, S., S. Sen, et al. (2009). "L-Carnitine ameliorates glycerol-induced myoglobinuric acute renal failure in rats." Renal failure 31(2): 124-133.

153. Ustundag, S., O. Yalcin, et al. (2008). "Experimental myoglobinuric acute renal failure: the effect of vitamin C." Renal failure 30(7): 727-735.

154. Vanholder, R., M. S. Sever, et al. (2000). "Rhabdomyolysis." Journal of the American Society of Nephrology : JASN 11(8): 1553-1561.

155. Venkatachalam, M. A., H. G. Rennke, et al. (1976). "The vascular basis for acute renal failure in the rat. Preglomerular and postglomerular vasoconstriction." Circ Res 38(4): 267279.

156. Vielhauer, V., H. J. Anders, et al. (2001). "Obstructive nephropathy in the mouse: progressive fibrosis correlates with tubulointerstitial chemokine expression and accumulation of CC chemokine receptor 2- and 5-positive leukocytes." Journal of the American Society of Nephrology : JASN 12(6): 1173-1187.

157. Vignais, P. V. (2002). "The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism." Cell Mol Life Sei 59(9): 1428-1459.

158. Vinas, J. L., A. Sola, et al. (2006). "NO and NOS isoforms in the development of apoptosis in renal ischemia/reperfusion." Free radical biology & medicine 40(6): 992-1003.

159. Vinas, J. L., A. Sola, et al. (2006). "Mitochondrial NOS upregulation during renal I/R causes apoptosis in a peroxynitrite-dependent manner." Kidney international 69(8): 14031409.

160. Vuletich, J. L., Y. Osawa, et al. (2000). "Enhanced lipid oxidation by oxidatively modified myoglobin: role of protein-bound heme." Biochemical and biophysical research communications 269(3): 647-651.

161. Weiss, G., H. Wächter, et al. (1995). "Linkage of cell-mediated immunity to iron metabolism." Immunol Today 16(10): 495-500.

162. Wheeler, D. C., R. S. Chana, et al. (1994). "Oxidation of low density lipoprotein by mesangial cells may promote glomerular injury." Kidney international 45(6): 1628-1636.

163. Williams, D. M., G. R. Lee, et al. (1974). "The role of superoxide anion radical in the reduction of ferritin iron by xanthine oxidase." The Journal of clinical investigation 53(2): 665-667.

164. Wilson, M. T. and B. J. Reeder (2008). "Oxygen-binding haem proteins." Exp Physiol 93(1): 128-132.

165. Wittenberg, J. B. and B. A. Wittenberg (2003). "Myoglobin function reassessed." J Exp Biol 206(Pt 12): 2011-2020.

166. Wollemann M, Benyhe S (2004). "Non-opioid actions of opioid peptides". Life Sei. 2004 Jun 4;75(3):257-70.

167. Wrogemann, K. and S. D. Pena (1976). "Mitochondrial calcium overload: A general mechanism for cell-necrosis in muscle diseases." Lancet 1(7961): 672-674.

168. Wu, J. M., Z. R. Wang, et al. (2001). "Mechanism of cardioprotection by resveratrol, a phenolic antioxidant present in red wine (Review)." Int J Mol Med 8(1): 3-17.

169. Young, M. R., I. S. Young, et al. (1996). "Lipid peroxidation assessment of free radical production following release of obstructive uropathy." J Urol 156(5): 1828-1832.

170. Yura, T., M. Fukunaga, et al. (1999). "Free-radical-generated F2-isoprostane stimulates cell proliferation and endothelin-1 expression on endothelial cells." Kidney international 56(2): 471-478.

171. Zager, R. A. (1992). "Combined mannitol and deferoxamine therapy for myohemoglobinuric renal injury and oxidant tubular stress. Mechanistic and therapeutic implications." The Journal of clinical investigation 90(3): 711-719.

172. Zager, R. A. (1996). "Mitochondrial free radical production induces lipid peroxidation during myohemoglobinuria." Kidney international 49(3): 741-751.

173. Zager, R. A. (1996). "Rhabdomyolysis and myohemoglobinuric acute renal failure." Kidney international 49(2): 314-326.

174. Zager, R. A. and K. Burkhart (1997). "Myoglobin toxicity in proximal human kidney cells: roles of Fe, Ca2+, H202, and terminal mitochondrial electron transport." Kidney international 51(3): 728-738.

175. Zager, R. A., K. M. Burkhart, et al. (1995). "Iron, heme oxygenase, and glutathione: effects on myohemoglobinuric proximal tubular injury." Kidney international 48(5): 16241634.

176. Zager, R. A. and C. A. Foerder (1992). "Effects of inorganic iron and myoglobin on in vitro proximal tubular lipid peroxidation and cytotoxicity." The Journal of clinical investigation 89(3): 989-995.

177. Zager, R. A., A. C. Johnson, et al. (2004). "Proximal tubular cytochrome c efflux: determinant, and potential marker, of mitochondrial injury." Kidney international 65(6): 2123-2134.

178. Zenebe, W. J., R. R. Nazarewicz, et al. (2007). "Hypoxia/reoxygenation of isolated rat heart mitochondria causes cytochrome c release and oxidative stress; evidence for involvement of mitochondrial nitric oxide synthase." Journal of molecular and cellular cardiology 43(4): 411-419.

179. Zhang, R., M. L. Brennan, et al. (2002). "Myeloperoxidase functions as a major enzymatic catalyst for initiation of lipid peroxidation at sites of inflammation." The Journal of biological chemistry 277(48): 46116-46122.

180. Zurovsky, Y. (1993). "Models of glycerol-induced acute renal failure in rats." J Basic Clin Physiol Pharmacol 4(3): 213-228.

181. Zweier, J. L., P. Wang, et al. (1995). "Enzyme-independent formation of nitric oxide in biological tissues." Nat Med 1(8): 804-809.