Молекулярно-генетические основы предрасположенности к болезни Паркинсона тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Пчелина, Софья Николаевна

• Пчелина, Софья Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пчелина, Софья Николаевна

Оглавление.

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. БИОХИМИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БП.

1.1.1. Клиническая характеристика БП.

1.1.2. Патогенез БП.

1.1.3. Дисфункции митохондрий при БП.

1.1.4. Роль окислительного стресса в патогенезе БП.

1.1.5. Связь апоптоза с процессами нейродегенерации.

1.2. СРЕДОВЫЕ ФАКТОРЫ РИСКА БП.

1.2.1. 1 - метил-4-фенил-1,2,3,6 -теграгидропирид и н (МФТП) -индуцированный паркинсонизм.

1.2.2. Гипотеза экзогенных нейротоксинов.

1.2.3 Другие средовые факторы риска БП.

1.3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ МОНОГЕННЫХ ФОРМ БП.

1.3.1. Генетические локусы ассоциированные с БП.

1.3.2. Аутосомно-доминантная форма БП, ассоциированная с дефектами в гене а-синуклеина.

1.3.3. Аутосомно-рецессивный ювенильный паркинсонизм.

1.3.4. Аутосомно-доминантная форма БП, ассоциированная с дефектами в гене убикитин С-концевой гидролазы L1.

1.4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РИСКА МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫХ ФОРМ БП.

1.4.1. Поиск генов, ассоциированных с риском развития БП.

1.4.2. Вклад полиморфных аллелей гена дебризоквин 4-гидроксилазы в развитие БП.

1.4.3. Роль гена параоксоназы в процессах детоксикации.

1.4.4. Влияние гена метилентетрагидрофолат редуктазы на формирование окислительного стресса.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы.

2.2. Характеристика обследованных групп.

2.3. Выделение ДНК из периферической крови человека.

2.4. Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ.

2.4.1. Идентификация мутации 29А в гене CYP2D6.

2.4.2. Идентификация мутации 29В в гене CYP2D6.

2.4.3. Идентификация полиморфных аллелей А и В в гене PON 1 (Q191R).

2.4.4. Идентификация полиморфных аллелей L и М в гене PON1 (L54Met).

2.4.5. Идентификация мутации С677Т в гене MTHFR.

2.4.6. Амплификация 3 и 4 экзонов гена SNCA.

2.5. Анализ полиморфизма конформации однонитевых фрагментов ДНК (SSCP).

2.6. Статистический анализ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ частоты мутаций 29А и 29В гена CYP2D6 в популяции Санкт-Петербурга.

3.2. Исследование вклада мутации 29В reHaCYP2D6, полиморфных аллелей Q191R и L54M гена PONI и мутации С677Т гена MTHFR в развитие различных форм БП. а) мутации 29В в гене CYP2D6.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БП - болезнь Паркинсона

ЦНС - центральная нервная система

ЧС - черная субстанция

МФТП -1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин

МФП+ - 1-метил-4-фенил-пиридин ион

РМ - Poor metabolizer (слабый метаболизатор)

НАДН - никлтинамидадениндинуклеотид (восстановленный)

НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид

АТФ - аденозинтрифосфат

АДФ - аденозиндифосфат

NMDA-рецепторы - И-метил-О-аспартат рецепторы

Л - ДОФА - диоксифенилаланин

ЛПВП - липопротеиды высокой плотности

ЛГТНП - липопротеиды низкой плотности

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПААГ - полиакриламидный гель

SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism (полиморфизм конформации одноцепочечных фрагментов)

RR - relative risk (относительный риск)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетические основы предрасположенности к болезни Паркинсона»

Достижения молекулярной генетики последних десятилетий привели к идентификации десятков тысяч индивидуальных генов человека. Это позволяет уже в настоящее время проводить молекулярную диагностику, а значит и профилактику многих сотен моногенных заболеваний и определять генетические факторы риска наиболее распространенных болезней человека. Появился новый раздел медицины, получивший название молекулярной медицины, основанный на точном знании молекулярной природы первичных дефектов. Определенные успехи достигнуты в изучении патофизиологических механизмов, так называемых мультифакториальных заболеваний, в этиологии которых наряду со средовыми факторами значительный вклад вносят генетические составляющие. При поиске генетических факторов риска развития мультифакториальных заболеваниях использует различные подходы. В ряде случаев перспективным оказывается изучение генов, продукты которых участвуют в системе детоксикации вредных соединений, поступающих в организм человека из окружающей среды. Активно используется информация о биохимических и физиологических основах патологических процессов.

К числу подобных мультифакториальных заболеваний относится болезнь Паркинсона (БП). Это одно из наиболее распространенных нейродегенеративных расстройств. Данное заболевание характерно для пожилых людей и является хроническим заболеванием центральной нервной системы (ЦНС) с преимущественным поражением восходящего дофаминэргического нигростриарного пучка. Частота встречаемости БП среди лиц старше 60 лет составляет 1-2%. Лечение больных носит симптоматический характер. Терапия с использованием препарата Л-ДОФА или его аналогов хотя и дает выраженный клинический эффект, но не предотвращает, а, возможно, даже усугубляет процесс нейродегенерации ( Голубев и др., 1999).

Патоморфологические исследования мозга больных БП позволили обнаружить гибель дофаминэргических нейронов черной субстанции (ЧС). Это приводит к резкому снижению уровня дофамина в полосатом теле мозга. В цитоплазме нейронов ЧС были обнаружены характерные эозинофильные включения, так называемые тельца Леви. Считается, что присутствие телец Леви одновременно с гибелью нейронов ЧС является невропатологической характеристикой, отличающей БП от других подобных заболеваний (Каменецкий В.К., 1995).

Этиология БП неизвестна. В настоящее время обсуждается несколько гипотез, касающихся причин гибели дофаминэргических нейронов ЧС мозга человека, включая гипотезу оксидативного стресса, действия экзогенных нейротоксинов и генетической предрасположенности.

С генетической точки зрения БП представляет собой гетерогенную группу заболеваний. Семейные формы БП составляют от 20 до 30%. Многократно подтвержден факт повышенного риска развития БП среди родственников первой степени родства. Однако, роль генетических факторов в этиологии БП оставалась долгое время спорной из-за низкого значения конкордантности по близнецовым парам. В последнем, широкомасштабном исследовании на близнецовых парах, проведенном в США было показано, что генетические факторы вероятнее всего играют значительную роль в случаях ранней манифестации заболевания (Tanner et al., 1999).

В настоящее время расшифрована молекулярная природа некоторых моногенных форм БП. Описаны семьи с двумя аутосомно-доминантными формами БП, одна из которых ассоциирована с мутациями в гене белка, локализованного в пресинаптической терминали - а-синуклеина (SNCA). У больных с этой формой заболевания мутации обнаружены в 3 и 4 экзонах гена SNCA. Другая аутосомно-доминантная форма БП ассоциирована с мутациями в гене убикитин С-концевой гидролазы (UCHL1). Редкая форма аутосомно-рецессивного ювенильного паркинсонизма связана с мутациями в гене убикитин-подобного белка паркин (PARK2) (Dunnet & Bjorklund, 1999).

Однако, моногенные формы БП крайне редки. В большинстве случаев БП носит мультифакториальный характер. Определенные ассоциации с БП были получены при анализе генов, продукты которых участвуют в метаболизме экзогенных токсинов. Так была показана роль полиморфных аллелей одного из генов цитохрома микросомального окисления - дебризоквин 4-гидроксилазы (CYP2D6), N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2), дофаминового транспортера (DAT1) и глутатион трансферазы PI (GSTP1) в формировании предрасположенности к БП (Menegon et al., 1998).

Длительный контакт с фосфорорганическими соединениями, широко применяемыми в настоящее время в качестве гербицидов, пестицидов и исектицидов, является общепризнанным фактором риска БП. В печени человека фосфорорганические соединения активируются системой микросомального окисления до высоко токсичных соединений, оксонов. Оксоны, не претерпевшие ферментативный процесс детоксикации в печени, выбрасываются в кровь, где могут быть гидролизованы ферментом параоксоназой (PON1). Известные полиморфизмы гена PON1 (Q191R и L54M) участвуют в формировании индивидуальной чувствительности к действию некоторых фосфорорганических соединений (Mackness et al., 1998). ). Можно предположить, что носители аллелей параоксоназы, ассоциированных с пониженной активностью фермента, будут более чувствительны к токсическому воздействию фосфорорганических соединений и потому могут иметь повышенный риск развития БП.

Окислительный стресс играет существенную роль в патогенезе БП. Многие факторы способствуют образованию супероксидных радикалов. Считается, что повышенный уровень гомоцистеина - продукта метаболизма метионина - также способствует производству повышенного уровня супероксидных радикалов. Гомоцистеин оказывает токсическое воздействие на нейрональные клеточные линии in vitro и его повышенный уровень был обнаружен в плазме крови больных БП (Parsons et al., 1998; Kuhn et al., 1998). В большинстве тканей при реметилировании гомоцистеина участвует фермент метилентетрагидрофолат редуктаза (MTHFR), осуществляющий перенос метальной группы. Мутация С677Т в гене MTHFR приводит к 50% снижению активности фермента и, тем самым, может способствовать увеличению уровня гомоцистеина (Cattaneo et al., 1997).

Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования:

Целью исследования является оценка вклада некоторых генетических факторов риска в развитие БП.

Задачи исследования:

1. Определение частоты мутаций 29А и 29В в гене CYP2D6 в популяции Санкт-Петербурга.

2. Анализ распределения мутации 29В в гене CYP2D6, полиморфных аллелей Q191R и L54M в гене PON1, мутации С677Т в гене MTHFR среди больных БП и в контрольной возрастной группе.

3. Выявление вклада исследуемых мутаций в формирование наследственной предрасположенности к БП.

4. Поиск мутационных повреждений в 3 и 4 экзонах гена SNCA среди лиц с семейной формой БП.

10

Научная новизна:

Впервые в популяции Санкт Петербурга охарактеризовано распределение двух мутаций 29А и 29В в гене CYP2D6.

Впервые в Санкт-Петербурге проведена оценка частот мутации 29В в гене CYP2D6, полиморфных аллелей Q191R и L54M в гене PON1 и мутации С677Т в гене MTHFR среди больных БП и в контрольной возрастной группе.

Впервые в мире показано, что присутствие полиморфного аллеля М54 в гене PON1 значительно увеличивает риск развития семейных и ранних форм БП. Показано, что другие изученные ДНК-полиморфизмы не влияют на предрасположенность к БП.

Впервые проведен анализ мутационных повреждений 3 и 4 экзонов гена SNCA у больных Санкт Петербурга с семейной формой БП. Показано, что мутации в 3 и 4 экзонах гена SNCA не являются причиной развития заболевания в исследуемых семьях.

Практическая значимость работы:

1. Наличие полиморфного аллеля М54 в гене PON1 является генетическим фактором риска по развитию БП. Лица с LM и ММ генотипом должны избегать контакта с фосфорорганическими удобрениями, гербицидами и инсектицидами.

2. Разработанные автором методы идентификации полиморфных аллелей 29А в гене CYP2D6, а также Q191R и L54M в гене PON1 могут быть рекомендованы для использования в лабораторной и клинической практике.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Распределение генотипов по полиморфным аллелям M54L гена PON1 достоверно отличается в общей выборке больных БП, а также в подгруппах с ранней и семейной формами БП по сравнению с группой возрастного контроля. Носительство аллеля М гена PON1 увеличивает риск развития заболевания.

2. Все остальные исследованные в работе полиморфные аллели не являются факторами риска развития БП в популяции Санкт Петербурга.

3. Мутации в 3 и 4 экзонах гена SNCA не являются причиной заболевания у больных Санкт-Петербурга с семейными формами БП.

Апробация работы

Предложенные к защите результаты были доложены на заседании общества неврологов, Санкт Петербург (1995); XXVIII Европейской конференции по генетике человека (Лондон, 1996); на конференции молодых ученых, Санкт Петербург, ПИЯФ

РАН (2000). По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов.

12

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы (133 наименования). Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 16 рисунками и фотографиями.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Пчелина, Софья Николаевна

ВЫВОДЫ:

1. Частоты мутаций 29А и 29В гена CYP2D6 у жителей Санкт Петербурга достоверно ниже, чем в Европе и составляют 0.01 и 0.17, соответственно.

2. Мутация 29В в гене CYP2D6, полиморфные аллели Q191R в гене PON1 и мутация С677Т в гене MTHFR не являются генетическими факторами риска развития БП в популяции Санкт Петербурга.

3. Носительство М аллеля в положении 54 гена PON1 является генетическим фактором риска развития БП. Относительный риск развития ранних и семейных форм БП для носителей М аллеля увеличен в 5 и в 7 раз, соответственно. При позднем развитии заболевания подобной ассоциации не найдено.

4. У больных Санкт Петербурга с семейной формой БП мутаций в 3 и 4 экзонах гена SNCA не обнаружено.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пчелина, Софья Николаевна, 2000 год

1. Голубев В.Л., Левин Я.И., Вейн А.М. Болезнь Паркинсона и синдром паркинсонизма. Москва, Медпресс, 1999

2. Иллариошкин СН, Сломинский ПА, Иванова-Смоленская ИА, и др. Мутационный анализ генов некоторых наследственных нейродегенеративных заболеваний. Второй Российский съезд медицинских генетиков, Курск, 2000, с.51

3. Каменецкий В.К. Паркинсонизм. Санкт Петербург, 1995

4. Самойлов М.О. Мозг и адаптация. Санкт-Петербург, Институт физиологии им. И.П.Павлова, 1999

5. Allard Р, Marcusson JO, and Ross SB. 3H.GBR-12935 binding to cytochrome P450 in the human brain. J.Neurochemistry 1994; 62:342-348

6. Armstrong M, Daly AK, Cholerton S, Bateman DN, and Idle JR. Mutant debrisoquine hydroxylation genes in Parkinson's disease. Lancet 1992; 339:1017-1018

7. Bandmann O, Vaughan J, Holmans P, Marsden CD, Wood NW. Association of slow acetylator genotype for N-acetyltransferase 2 with familial Parkinson's disease. Lancet, 1997,350:1136-39

8. Beal MF. Excitoxicity and nitric oxide in Parkinson's disease pathogenesis. Ann.Neurol. 1998; 44(suppl 1):S110-S114

9. Benecke R, Strumper P, and Weiss H. Electron transfer complexes I and IV of platelets are abnormal in Parkinson's disease but normal in Parkinson-plus syndromes. Brain 1993; 116:1451-1463

10. Ben-Shlomo Y. How far are we in understanding the cause of Parkinson's disease? J.Neurol. Neurosur. Psych. 1996; 61:4-16

11. Bezard E, Gross CE, Foumier MC; Dovero S, Bloch B, and Jaber M. Absence of MPTP-induced neuronal death in mice lacking the dopamine tramsporter. Exp.Neurol. 1999; 155(2):268-273

12. Blatter Garin MC, James RW, Dussoix P, Blanche H, Passa P, Froguel P, and Ruiz J. Paraoxonase polymorphism Met-Leu 54 is associated with modified serum concentrations of the enzyme. J. Clin. Invest. 1997; 99:62-66

13. Broly F, Gaedigk A, Heim M, Eichelbaum M, Morike K, and Meyer UA. Debrisoquine/spartein hydroxylation genetype and phenotype: analysis of common mutations and allels of CYP2D6 in a European population. DNA and Cell Biology 1991; 10:545-558

14. Brooks Al, Chadwick CA, Gelbard HA, Cory-Slechta DA, and Federoff HJ. Paraquat elicited neurobehavioral syndrome caused by dopaminergic neuron loss. Brain Research 1999; 823:1-10

15. Brooks DJ. The early diagnosis of Parkinson's disease. Ann.Neurol. 1998; 44(suppl):S10-S18

16. Burke RE, and Kholodilov NG. Programmed cell death: does it play a role in Parkinson's disease? Ann. Neurology 1998;44(Supl 1):S126-S133

17. Cattaneo M. Hyperhomocysteinemia: a risk factor for arterial and venous thrombotic disease. Int. J. Clin. Lab. Res. 1997; 27: 139-144

18. Chan P, Tanner CM, Jiang X, and Langston W. Failure to find the a-synuclein gene missense mutation (G209A) in 100 patients with younger onset Parkinson's disease. Neurology 1998; 50:513-514

19. Christensen PM, Gotzcshe PC, Brosen K. The sparteine/debrisoquine (CYP2D6) oxidation polymorphism and the risk of Parkinson's disease: a meta-analysis. Parmacogenetics 1998; 8:473-479

20. Conway KA, Harper JD and Lansbury PT. Accelerated in vitro fibril formation by a mutant a-synuclein linked to early-onset Parkinson disaese. Nature medicine 1998; 4:1318-1320

21. Costa LG, Li WF, Richter RJ, Shih DM, Lusis A, Furlong Ce. The role of paraoxonase (PON1) in the detoxication of organophosphates and its human polymorphism. Chem. Biol, Interact. 1999; 14:119-120:429-38

22. Cotton R.G.H. Current methods of mutation detection. MutatRes 1993; 285:125-44

23. Cumming JL. Understanding Parkinson disease. JAMA 1999; 281:376-378

24. Dahl M, Johansson I, Palmertz MP, Ingelman-Sundberg M, and Sjoqvist F. Analysis of the CYP2D6 gene in relation to debrisoquin and desipramine hydroxylation in a Swedisn population. Clin.Pharmacol. Ther 1992; 51:12-17

25. Daly AK, Armstrong M, Monkman SC, Idle ME, and Idle JR. Genetic and metabolic criteria for the assignment of debrisoquine 4-hydroxylase (cytochrome P4502D6) phenotypes. Parmacogenetics 1991; 1:33-41

26. Davidson WS, Jonas A, Clayton DF, George JM. Stabilization of alpha-synuclein secondary structure upon binging to sythetic membranes. J.Biol. Chem. 1998; 273(16): 9443-9449

27. Davis H, Richter RJ, Keifer M, Broomfield CA, Sowalla J, and Furlong CE. The effect of the human serum paraoxonase polymorphism is reversed with diazoxon, soman and sarin. Nat. Genet. 1996; 14:334-336

28. Duinen SG, Lammers GJ, Maat-Schieman ML, Roos RA. Numerous and widespresd alpha-synuclein-negative Lewy bodies in an asymptomatic patient. Acta neuropathol 1999; 97(5):533-539

29. Dunnet SB and Bjorklund A. Prospects for new restorative and neuroprotective treatments in Parkinson's disease. Nature 1999; 399(Suppl):A32-A39

30. Evans WE, Relling MV, Rahman A, McLeod H, Scott EP, and Lin J. Genetic Basis for a lower prevalence of deficient CYP2D6 oxidative drug metabolism phenotypes in Black Americans. J.Clin.Invest. 1993;91:2150-2154

31. Fairer M. Low frequency of a-synuclein mutation in familial Parkinson's disease. Ann. Neurol. 1998; 43:394-397

32. Feany MB and Bender WW. A drosophila model of Parkinson's disease. Nature 2000; 404:394-398

33. Fleming L, Mann JB, Bean J, Briggle T, Sanchez-Ramos JR. Parkinson's disease and braim levels of organochlorine pesticides. AmvNeurology 1994; 36(1):100-103

34. Forloni G, Bertani I, Calella AM, Thaler F, and Invernizzi R. a-synuclein and Parkinson's disease: selective neurodegenerative effect of a-synuclein fragment on dopaminergic neurons in vitro and in vivo. Ann. Neurology 2000; 47(5):632-640

35. Forno LS, DeLanney LE, Irwin I. Similarities and differences between MPTP-induced parkinsonism and Parkinson's disease. Adv.Neurol. 1993;60:600-608

36. Foster NL, Wilhelmsen K, Sima AAF1. Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17: a consensus. Ann.Neurol. 1997;42:85-94

37. Gasser T, Muller-Myhsok B, Wszolek ZK, Oehlmann R, Calne DB, Bonifati V, Bereznai B, Fabrizio E, Vieregge and Horstmann RD. A susceptibility locus for Parkinson's disease maps to chromosome 2pl3. Nature Genetics 1998; 18:262-265

38. Gasser T. Genetics of Parkinson's disease. Ann. Neurol. 1998; 44:S53-S57

39. Gilham DE, Cairns W, Paine MJl. Metabolism of MPTP by chytochrome P4502D6 and the demonstration of 2D6 mRNA in human foetal and adult brain be in situ hybridization. Xenobiotica 1997; 27:111-125

40. GoedertM. The awakening of a-synuclein. Nature 1997; 388:232-233

41. Gough AC, Smith CAD, Howell SM, Wolf CR, Bryant SP, and Spurr NK. Localization of the CYP2D gene locus ti the human chromosome 22ql3.1 by polymerase chain reaction, in situ hybridization, and linkage analysis. Genomics 1993; 15:430-432

42. Gwinn-Hardy KA, Crook R, Adler С H, Caviness JN, Hardy J, and Farrer M. A kindred with Parkinson's dosease not showing genetic linkage to established loci. Neurology, 2000,54:504-507)

43. Haass С and Kahle PJ. Parkinson's pathology in a fly. Nature 2000; 404:341-42

44. Harmon D, Ramsbottom D, Whitehead A, Ben-Shlomo Y, and Davey-Smith G. The termolabile variant of 5,10-methylentetrahydrofolate reductase is not associated with Parkinson's disease. J.Neurology, Neurosurgery, Psychiatry 1997; 62:671

45. Hashimoto M, Hsu LJ, Xia Y, Takeda A, Sisk A, Sundsmo M, and Masliah E. Oxidative stress induces amyloid-like agregate formation of NACP/alpha-synuclein in vitro. Neuroreport 1999; 10(4):717-721

46. Hasset С, Richter RJ, Humbert R, Chapline C, Crabb W, Omiecinski, and Furlong CE. Characterization of cDNA Clones Encoding Rabbit and Human Serum Paraoxonase: The mature protein retains its signal sequence. Biochemistry 1991; 30:10141-10149

47. Hattori N, Matsumine H, Asakawe S, etal Point mutations (Thr240Arg and Ala31 IStop) in the Parkin gene. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 249:754-758).

48. Hegele RA, Brunt H, and Connelly P. A polymorphism of the paraoxonase gene associated with variation in plasma lipoproteins in a genetic isolate. Ateroscl. Throm. And Vascular Biology, 1995,15:89-95

49. Heim M, and Meyer UA. Genotyping of poor metabolisers of debrisoquine by allele-specific PCR amplification. Lancet 1990; 336:529-532

50. Heim MH, and Meyer UA. Evolution of a highly polymorphic cytochrome P450 gene cluster: CYP2D6. Genomics 1992; 14:49-58

51. Hoehn MM, Yahr MD. Parkinsonism, onset, progression and mortality. Neurology 1967; 17:427-442

52. Humbert R, Adler DA, Disteche CM, Hasset C, Omiecinski C, and Furlong C. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity polymorphism. Nature Genetics 1993; 3:73-76

53. Humble JP, Cao T, Hassanein RES, Neuberger JS, and Koller WC. Risk factors for Parkinson's disease. Neurology 1993; 43:1693-1697

54. Jenner P. Oxidative damage in neurodegenerative disease. Lancet 1994; 344:796-798

55. Jensen РН, Nielsen MS, Jakes R, Dotti CG, Goedert M. Binding of alpa-synuclein to brain vesicles is abolished by familial Parkinson's disease mutation. J.Biol. Chem. 1998; 273(41): 26292-4

56. Jimenez-Jimenez FJ, Mateo D, and Gimenez-Roldan S. Exposure to well water and pesticides in Parkinson's'disease: a case-control study in the Madrid aria. Mov.Disord. 1992; 7:149-52

57. Jonas H, Ellenberg E., et. al, Etiology of PD, 1995, New York.

58. Kagimoto M, Heim M, Kagimoto K, Zeugin T< and Meyer UA. Multiple Mutations of the human cytochrome P450IDD6 gene (CYP2D6) in poor metabolizers of debrisoquine. J.Biol.Chem. 1990; 265:17209-17214

59. Kimura S, Umeno M, Skoda RC, Meyer UA, and Gonzalez FJ. The human debrisoquin 4-hydroxylase (CYP2D) locus: sequence and identification of the polymorphic CYP2D6 gene, a related gene, and a preudogene. Am.J.Hum.Genet. 1989; 45:889-904

60. Kitada T, Asakawa S, Hattori N, Matsumine H, Yamamura Y, Minoshima S, Yokochi M, Mizuno Y, and Shimizu N. Mutation in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature 1998; 392:605-608

61. Kondo I, and Kanazawa I. Debrisoquine hydroxolase and Parkinson's disease. Advances in Neurology 1993; 60:338-342

62. Kondo 1, and Yamamoto M. Genetic polymorphism of paraoxonase 1 (PON1) and susceptibility to Parkinson's disease. Brain Research 1998; 806:271-273

63. Kowall NW, Hantrave P, Brouillet E, Beal MF, McKee AC, Ferrante RJ. MPTP induced alpha-synuclein aggregation in the substantia nigra of baboons. Neuroreport 2000, ll(l):211-3)

64. Kruger R, Kuhn W, Muller T, Woitalla D, Graeberg M, Kosel S, Przuntek H, Epplen J, Schols L, and Riess O. Ala30Pro mutation in the gene encoding a-synuclein in Parkinson's disease. Nature genetics 1998; 18:106-108

65. Kuhn W, Roebroek R, Blom H. Elevated plasma levels of homocysteine in Parkinson's disease. Eur Neurol 1998;40:225-27

66. Lahiri D.K., Bye S., Nurnberger J.I Jr. J.Biol.Chem andBiophys. Methods. 1992, 25:193205

67. Le Couteur DG, Leighton PW, McCann SJ, Pond SM. Association of a polymorphism in the dopamine-transporter gene with Parkinson's disease. Mov. Disord. 1997,12:760-63

68. Leviev I, and James RW. Promoter polymorphisms of human paraoxonase PON I gene and serum paraoxonase activities and concentrations. Ateroscler. Thromb. Vase. Biol. 2000; 20(2):516-521

69. Liou HH, Tsai MC, Chen CJ, Jeng JS, Chang YC, Chen SY, Chen RC. Environmental risk factors and Parkinson's disease. Neurology 1997; 48.1583-1588

70. Logroscino G, Marder K, Cote L, Tang M, Shea S, and Mayeux R. Dietary lipids and antioxidants in Parkinson's disease: a population-based, case-control study. Ann. Neurol. 1996; 39:89-94

71. Mackness B, Durrington P and Mackness M. Human serum paraoxonase. Gen. Pharmac. 1998; 31(3): 329-336

72. Mackness B, Mackness M, Arrol S, Turkie W, and Durrington PN. Effect of the molecular polymorphisms of human paraoxonase (PON1) on the rate of hydrolysis of paraoxon. British J. Pharmacol. 1997; 122:265-268

73. Mackness MI, Arrol S, Mackness B, and Durrington PN. The alloenzymes of paraoxonase determine the effectiveness of high-density lipoprotein in protecting low density lipoprotein against lipid-peroxidation. Lancet 1997; 349:851-852

74. Mann VM, Cooper JM, and Schapira AHV. Quantitation of mitochondrial DNA deletion in Parkinson's disease. FEBS 1992;299:218-222

75. Maraganore DM, Farrer MJ, Hardy J A, Lincoln SJ, McDonnell SK, and Rocca WA. Case-control study of the ubiquitin carboxy-terminal hydrolase LI gene in Parkinson's disease. Neurology 1999; 53(8): 1858-1860

76. Marder K, Tang MX, Mejia H, Alfaro B, Cote L, Louis E, Groves J, and Mayeux R. Risk of Parkinson's disease among first-degree relatives: a community-based study. Neurology 1996; 47:155-160

77. Markoff A., Savov A., Vladimirov V., Bogdanovf N., Kremensky I., Ganev V. Optimization of single-strand conformation polymorphism analysis in the presence of polyetilene glycol. Clinical Chemistiy 1997; 43(l):30-33

78. Markopoulou К and Langston JW. Candidate genes and Parkinson's disease. Neurology 1999; 53:1382-1383

79. Markopoulou K, Wszolek ZK, Pfeiffer RF, and Chase BA. Reduced expression of the G209A a-synuclein allele in familial Parkinsonism. Ann Neurology 1999; 46:374-381

80. Menegon A, Board PG Blackburn AC, Mellick GD, Le Couteur DG. Parkinson's disease, pesticides, and glutathione transferase polymorphisms. Lancet 1998; 352:1344-1346.

81. Mezey E, Dehejia A, Harta G, Papp MI, Olymeropoulos MH, and Brownstein MJ. Alpha-synuclein in neurodegenerative disorders: murderer or accomplice? Nature Medicine 1998;4:755-757

82. Mizuno Y, Ikebe S, Hattori N, Nakagawa-Hattori Y, Mochizuki H, Tanaka M, and Ozava T. Role of mitochondria in the etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. BiochemicaetBiophysica Acta 1995; 1271: 265-274

83. Morino H, Kawarai T, Izumi Y, Kazuta T, Oda M, Komure O, Udaka F, Kameyama M, Nakamura S, and Kawakami H. A single nucleotide polymorphism of dopamine tramsporter gene is associated with Parkinson's disease. Ann.NeuroI. 2000,47(4):528-531

84. Muller T, Werne B, Fowler B, and Kuhn W. Nigral endothelial dysfanction, homocysteine, and Parkinson's disease. Lancet 1999; 354:126-127

85. Orita M., Youchi S., Sekiya Т., Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics. 1989; 5:874-9

86. Palma G, Mozzoni P, Mutti A, Calzetti S, and Negrotti A. Case-control study of interactions between genetic and invironmental factors in Parkinson's disease. Lancet 1998; 352:1986-1987

87. Palma G, Mozzoni P, Mutti A, Calzetti S, and Negrotti A. Case-control study of interactions between genetic and environmental factors in Parkinson's disease. Lancet 1998;352:1986-1987

88. Papadimitriou A, Veletza V, Hadjigeorgiou GM, Patrikiou A, Hirano M, and Anastasopoulos I. Mutant a-synuclein gene in two Greek kindreds with familial PD: incomplete penetrance? Neurology 1999; 52:651-654

89. Parisian A, Racette B, Zhang ZH, Chakravarty S, Rundle M, Goate A, and Perlmutter JS. Mutation, sequence analysis, and association studies of a-synuclein in Parkinson's disease. Neurology 1998; 51:1757-1759

90. Parsons RB, Waring RH, Ramsden DB, Williams AC. In vitro effect of the cysteine metabolites homocysteic acid, homocysteine and cysteic acid upon human neuronal cell lines. Neurotoxicology 1998; 19(4-5):599-603.

91. Playter JR, Eze LC, Bullen MF, and Evans DAP. Genetic polymorphism and interethnic variability of plasma paraoxonase activity. J.Med. Genet. 1978; 13:337-342

92. Polymeropoulos MH, Higgins JJ, Golbe LI. Mapping of a gene for Parkinson's disease to chromosome 4q21-23. Science 1996; 274:1197-1199

93. Rostami-Hodjegan A, Lennard MS, Wood HF. Meta-analysis of studies of the CYP2D6 polimirphism in relation to lung cacer and Prkinson's disease. Pharmacogenetics 1998; 8:227-238

94. Saigoh K, Wang Y, Suh JG, Yamanish T, Sakai Y, Kiyosawa H, Harada T, Ichihara N, Wakana S, and Kikuchi T. Intragenic deletion in the gene encoding ubiquitin carboxy-terminal hydrolase in gad mice. Nature Genetics, 1999, 23:47-51

95. Salminen A, Liu PK, and Hsu CY. Activation of transcription factors binding activities in the ischemia rat brain. Biochem. Biophys. Res. 1995; 212: 939-944

96. Sambrook J.,Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular cloning:A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1992

97. Sandy MS, Armrsrong M, Tanner CM, Daly AK, Monte DA, Langston JW, and Idle JR. CYP2D6 allelic frequencies in young-onset Parkinson's disease. Neurology 1996; 47:225-230

98. Schapira AHV, Cooper JM, Dexter D, Clark JB, Jenner P, and Marsden CD. J.Neurochem. 1990; 54:823-827

99. Schapira AHV. Nuclear and mitochondrial genetics in Parkinson's disease. J.Med.Genet. 1995;32:411-414

100. Schmidt H, Schmidt R, NiederkornK. Paraoxonase PON1 polymorphism Leu-Met54 is associated with carotid atherosclerosis. Stroke 1998; 29:2043-2048

101. Seidler A, Hellendbrand W, Robra BP, Vieregge P, Nischan P, Joerg J, Oertel WH, Ulm G, Scheneider E. Possible environmental, occupational, and other etiological factors for Parkinson's disease. Neurology 1997; 46:1275-1284

102. Senanayake N and Sanmuganathan PS. Extrapyramidal manifestations complicating organophosphorus insecticide poisoning. Hum. Exp.Toxicol 1995, 14:600-04.

103. Smith CAD, Gough AC, Leigh PN, Summers В A, Harding AE, Maranganore DM, Sturman SG, Schapira AHV, Williams AC, Spurr NK, and Wolf CR. Debrisoquinehydroxilase gene polymorphism and susceptibility tp Parkinson's disease. Lancet 1993; 339:1375-1377

104. Snow В J, Vingerhoets FJG, Langston JW, Tetrud JW, Sossi V, and Calne D. Pattern of dopaminergic loss in the striatum of humans with MPTP induced parkinsonism. J.Neurol.Neurosurg. Psychiatry 2000; 68:313-316.

105. Sodeyama N, Yamada M, Itoh Y, Suemarsu N, Matsushita M, Otomo E, Mizusawa H. No association of paraoxonase gene polymorphism with atherosclerosis or Alzhaimer's disease. Neurology 1999; 53(5): 1146-48

106. Solano SM, Miller DW, Augood SJ, Young AB, and Penney JB. Expression of a-synuclein, parkin, and ubiquiti carboxy-terminal hydrolase LI mRNA in human brain: genes associated with Parkinson's disease. Ann.Neurol. 2000,47(2):201-210

107. Stone M. Jumbo gene offers clue to Parkinson's. Science 1998; 280:203

108. Suzuki T, Fujita S, Narimatsu S, Masubuchi Y, Tachibana M, Ohta S, and Hirobe M. Cytochrome P450 isoxymes catalyzing 4-hydroxilation of parkinsonism-related compound 1,2,3,4-tetrahydroisoquiniline in rat liver microsomes. FASEB 1992; 6:771776

109. Tatton WG, and Chalmers-Redman RME. Mitochondria in neurodegenerative apoptosis: an opportunity for therapy? Ann.Neurol. 1998; 44(suppl 1):S 134-S141

110. Tsuneoka Y, Matsuo Y, Iwahashi 1С, Takeuchi H, and Ichikawa Y. A novel cytochrome P-45011D6 mutant gene associated with Parkinson's disease. J.Biochem. 1993; 114:263-266

111. Tunner CM, Ottoman R, Goldman SM, Ellenberget J. Parkinson's disease in twins: An etiologic study. JAMA 1999; 281:341-346

112. Vila M, Vukosavic S, Jackson-Lewis V, Neystat M, Jakowec M, Przedboraki S. Alpha-synuclein up-regulation in substancia nigra dopaminergic neurons following administration of the parkinsonian toxin MPTP. J. Neurochem. 2000; 74(2):721-729

113. Wakabayashi K, Engelender S, Yoshimoto M, Ross CA, and Takahashi H. Synfilin-1 is present in Lewy bodies in Parkinson's disease. Ann.Neurology 2000; 47(4):521-523

114. Wang S, Huang J, Lai M, Liu B, and Lai M. Molecular basis of genetic variation in debrisoquin hydroxylation in Chinese subjects: polymorphism in RFLP and DNA sequence of CYP2D6. Clin. Pharmac. & Therap. 1993; 53(4):410-418

115. Whittemore ER, Loo DT, and Cotman CW. Exposure to hydrogen peroxide induces cell death via apoptosis in cultured rat cortical neurons. Neuroreport 1994; 5(12): 14851488

116. Wilhelmsen K, Mirel D, Marder Kl. Is there s genetic susceptibility locus for Parkinson's disease om chromosome 22ql3? Ann. Neurology 1997; 41:813-817

117. Wong GF, Gray CS, Hassanein RS, and Roller WC. Environmental risk factors in siblings with Parkinson's disease. Arch.Neurol 1991; 48:287-89

118. Wong SS, Li RHY, and Stadlin A. Oxidative stress induced by MPTP and MPP+: selective vulnerability of cultured mouse astrocytes. Brain Res. 1999; 836:237-244

119. Wood NW. Genetic risk factors in Parkinson's disease. Ann. Neurology 1998; 44(Suppl. 1 ):S58-S62

120. Yamasaki Y, Sahamoto K, Watada H, Kajimoto Y and Hori M. The Arg (192) isoform of paraoxonase with sarin-hydrolysing activity is dominant in the Japanese. Hum.Genet. 1997; 101:67-68109

121. Zareparsi S, Kay J, Camicioli R, Kramer P, Nutt J, Bird T, Litt M, and Payami H. Analysis of the a-synuclein G209A mutation in familial Parkinson's disease. Lancet 1998; 351:37-38