Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вирусов москитных лихорадок и создание тест-систем для диагностики этих инфекций тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат медицинских наук Клименко, Ирина Сергеевна

• Клименко, Ирина Сергеевна
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Клименко, Ирина Сергеевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Часть 1. Обзор литературы.

1.1. Классификация и таксономия вирусов группы москитных лихорадок.

1.2. Морфология, молекулярная организация и репликация флебовирусов.

1.3.Молекулярные аспекты эволюции флебовирусов.

1.4. Биологические свойства флебовирусов.

1.4.1. Цитопатогенная активность.

1.4.2. Эксперименты на лабораторных животных.

1.5. Эпидемиология москитных лихорадок. Экология вирусов-возбудителей

1.5.1. История.

1.5.2. Распространение, заболеваемость, сезонность.

1.5.3. Экология вирусов MJI.

1.6. Клиника и патогенез MJT.

1.7. Лечение.

1.8. Профилактика.

1.9. Специфическая диагностика москитных лихорадок.

1.9.1. Вирусологическая диагностика москитных лихорадок.

1.9.2. Серологическая диагностика москитных лихорадок.

1.9.3. Молекулярная диагностика.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вирусов москитных лихорадок и создание тест-систем для диагностики этих инфекций»

Группа вирусов москитных лихорадок (МЛ) (род Phlebovirus семейство Bunyaviridae) в настоящее время насчитывает 52 вируса, 27 из которых объединены в 9 антигенных комплексов: Bujaru, Candiru, Chilibre, Frijoles, неаполитанской москитной лихорадки, Punta Того, лихорадки долины Рифт, Salehabad и сицилийской москитной лихорадки. Имеющиеся данные по антигенной классификации остальных 25 флебовирусов недостаточно полно характеризуют их таксономическое положение в пределах группы. Сведения по генотипированию многих флебовирусов также весьма ограничены.

Прототипные штаммы флебовирусов были выделены в разные годы в Бразилии, Панаме, Колумбии, США, Италии, Греции, Иране, Кении, Судане, и Центрально-Африканской республике. Информация об истории выделения пяти вирусов (Armero, Durania, Ixacanal, Mariquita, Odrinisrou), включая данные об источниках выделения, в доступной литературе отсутствует. Источниками выделения оригинальных штаммов других флебовирусов были москиты, больные острыми лихорадочными заболеваниями, грызуны, другие млекопитающие и комары [45,59,65,73].

Значение флебовирусов в патологии человека установлено для 14 из 52 представителей этой группы: 8 из них распространены в Бразилии, 2 — в Панаме, 3 — в странах Средиземноморья, Средней Азии и, возможно, в Закавказье, на юге Европейской части России, на Украине и Молдавии [2,16,36,42]. В 1986 и 1987гг. сотрудниками НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН из крови больных советских военнослужащих, дислоцированных в Афганистане, были выделены три штамма вируса неаполитанской москитной лихорадки (НМЛ) и два штамма вируса сицилийской москитной лихорадки (СМЛ) [3]. Наибольшее медицинское значение имеют неаполитанская МЛ, сицилийская МЛ, лихорадка Тоскана, а также южно-американские МЛ - Аленквер, Кандиру, Пунта Торо, Чагрес и другие, встречающиеся в Бразилии и Панаме [29,41,42,61,75].

Ареал СМЛ и НМЛ охватывает регион Средиземноморья (европейские и африканские страны), республики Средней Азии, Иран и Афганистан [104].

Заболевания лихорадкой Тоскана регистрируются в Италии, Испании, Португалии, на юге Франции, Словении, Греции, на Кипре и в Турции [64,74,85].

В публикациях отечественных и зарубежных авторов при описании географического распространения вспышек и эпидемий МЛ на территории бывшего СССР упоминаются республики Закавказья, Средней Азии (Туркмения, Таджикистан, юг Киргизии), Украина (Крым) и Молдавия [2,13,16]. Между тем, проведенный нами анализ более ранней информации позволил восстановить и прояснить ситуацию с заболеваемостью москитными лихорадками в южном регионе Европейской части бывшего СССР в первой половине XX века. В 1923 г. крупная эпидемическая вспышка МЛ наблюдалась в Севастополе и Бахчисарае, в 1928 и 1929 г.г. случаи заболевания регистрировались в Армавире, в 1933г. - в Феодосии. В 1934 г. большая вспышка имела место в Новороссийске. В 1935 г. в г. Георгиевске и близлежащих населенных пунктах было зарегистрировано 1375 больных. В 1935 г. в районе г. Новороссийска эпидемия МЛ охватила более 5000 человек. Помимо приведенной информации, имеются сведения об эпидемических вспышках «лихорадки паппатачи» в послевоенные годы в Дагестане и других административных территориях Северного Кавказа. В настоящее время какие-либо данные об этих инфекциях в южном регионе отсутствуют, что объясняется, возможно, резким снижением активности природных очагов, а также недоступностью тест-систем для специфической диагностики МЛ в практических региональных лабораториях.

Актуальность настоящих исследований определяется широким географическим распространением и высокой активностью циркуляции вирусов москитных лихорадок на эндемичных территориях, выраженной патогенностью для человека; отсутствием диагностических тест-систем, доступных для использования в практических лабораториях и этиотропных средств лечения москитных лихорадок; отсутствием достаточной информации по молекулярно-генетической идентификации "афганских" штаммов вирусов МЛ и близкородственных вирусов, которая имеет прямое отношение к пониманию процессов эволюции рода Phlebovirus.

Цель и задачи исследования

Цель исследования:

Проведение филогенетического анализа малоизученных штаммов вирусов МЛ, выделенных на территории Афганистана, и создание лабораторного варианта оригинальных ОТ-ПЦР и иммуноферментных тест-систем для мониторинга циркуляции вирусов MJI и диагностики вызываемых ими инфекций.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи: ^ разработать лабораторный вариант ОТ-ПЦР для избирательного выявления геномной РНК вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана, отработать условия проведения реакции, определить чувствительность и специфичность метода; S секвенировать фрагменты генома афганских штаммов вирусов МЛ и провести филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей; ^ создать и охарактеризовать компоненты ИФА-тест-систем, предназначенных для выявления антител класса М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также их антигенов; ^ провести обследование сывороток здоровых жителей южных областей России и больных острыми лихорадочными заболеваниями неясной этиологии с целью апробации ИФА-тест-систем для определения антител класса М и Q выявления циркуляции вирусов MJI в этих регионах и изучения их возможной роли в краевой патологии; S исследовать противовирусную активность коммерческого препарата рибавирин" и ряда экспериментальных химических соединений (452, 467, dRSata, R sata, Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ага-А, ОН-Ага-А, Ome-Ara-A) на модели вируса Тоскана в опытах in vitro.

Научная новизна работы

Впервые определено систематическое положение внутри рода трех афганских штаммов (Аф-1008, Аф-83 и Аф-1028) вирусов москитных лихорадок на основе анализа нуклеотидной последовательности участков двух сегментов (S и М) вирусного генома.

Впервые за последние 20 лет проведено серологическое обследование жителей южного региона России. Всего исследовано 1140 сывороток практически здоровых доноров и больных неясными лихорадочными заболеваниями. Согласно полученным результатам, на территории Астраханской области и Краснодарского края установлена циркуляция вирусов НМЛ и СМЛ. В Астраханской области выявлен серологически подтвержденный случай заболевания сицилийской москитной лихорадкой.

В опытах in vitro было впервые проведено изучение противовирусной активности препарата «рибавирин» на модели вируса Тоскана. Показано, что исследуемый препарат оказывает выраженное противовирусное действие в отношении этого вируса.

Практическая ценность работы

Создан лабораторный вариант группоспецифичной ОТ-ПЦР тест-системы для выявления РНК малого сегмента S генома вирусов МЛ. Чувствительность тест-системы составила 0,4 БОЕ/мл.

Созданы и охарактеризованы специфичные компоненты ИФА-тест-систем для выявления специфических антител М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также их антигенов. Техническая документация на эти системы утверждена Учёным Советом НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 11 мая 2009г.

Исследована противовирусная активность зарубежного (производство

Швейцария) и отечественного препарата «рибавирин» на модели вируса Тоскана. Показано, что исследуемый препарат подавляет цитопатическое действие этого вируса в культуре клеток Vero Е6. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 2,75 lgljn^o при концентрации препарата (500 мкг/мл). В то же время испытанные производные рибавирина и другие экспериментальные химические соединения (452, 467, dRSata, R sata) в отношении вируса Тоскана подобным действием не обладали.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Сравнительный анализ первичных нуклеотидных последовательностей участков генов, кодирующих белки N и Gn показал, что штамм Аф-1008 принадлежит к серокомплексу ИМЯ. Наиболее близким к нему является индийский штамм вируса НМЛ Р-7101795.

2. Выделенные в Афганистане штаммы Аф-1028 и Аф-83 являются представителями серокомплекса СМЛ. Наиболее близким им оказался штамм вируса СМЛ Р-701735, выделенный в Индии.

3. Создан и охарактеризован лабораторный вариант ОТ-ПЦР-тест-системы для детекции РНК вирусов МЛ.

4. Созданы и охарактеризованы ИФА тест-системы для обнаружения антител класса М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также антигенов этих вирусов.

5. Данные обследования сывороток крови здоровых доноров и лихорадящих больных южного региона России на антитела IgM и IgG к вирусам москитных лихорадок указывают на низкий уровень активности очагов этих инфекций на юге Краснодарского края и Астраханской области. Однако обнаружение положительных находок позволяет констатировать факт циркуляции вирусов НМЛ и СМЛ на данных территориях, что определяет целесообразность проведения дальнейших исследований.

6. Установлена выраженная противовирусная активность препарата «рибавирин» с демонстрацией эффективного подавления цитопатогенной активности вируса Тоскана в культуре клеток Vero Е6. Новые отечественные производные рибавирина и другие экспериментальные соединения не обладают противовирусной активностью в отношении вируса Тоскана.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Клименко, Ирина Сергеевна

Выводы

1. Разработан лабораторный вариант тест-системы на основе ОТ-ПЦР для детекции РНК вирусов MJI в экспериментальных материалах. Чувствительность системы составляет 0,4 БОЕ/мл.

2. Филогенетический анализ участков генов, кодирующих белки N и Gn штамма Аф-1008 и других представителей рода Phlebovirus выявил, что штамм Аф-1008 принадлежит к серокомплексу НМЛ, а наиболее близким ему как по М (94%), так и по S (93%) сегментам является индийский штамм вируса НМЛ Р-7101795.

3. Афганские штаммы Аф-1028 и Аф-83 являются представителями серокомплекса СМЛ, наиболее близкими к штамму Р-701735 из Индии. Гомологичность нуклеотидной последовательности фрагмента сегмента S между штаммами Аф-1028 и Р-701735 составила 87,5%, а между штаммами Аф-83 и Р-701735 — 95,5%. Нуклеотидные последовательности сегмента М штаммов Аф-1028 и Р-701735 гомологичны на 94%.

4. Обнаружены значимые различия в аминокислотных последовательностях участка гликопротеина Gn афганских штаммов вирусов МЛ и близкородственных им штаммов.

5. Созданы и охарактеризованы ИФА тест-системы для обнаружения специфических антител класса М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана в сыворотках крови людей, а также антигенов этих вирусов.

6. На юге Краснодарского края и в Астраханской области по данным серологических исследований установлена низкая активность вирусов неаполитанской (в Краснодарском крае) и сицилийской (в Астраханской области) москитных лихорадок. Случай СМЛ диагностирован в Астраханской области впервые. У здорового жителя Краснодарского края обнаружены IgG антитела к вирусу НМЛ.

7. Показано, что рибавирин эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса Тоскана в культуре клеток Vero Е6. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 2,75 lg ЦПД50 при максимальной концентрации препарата 500 мкг/мл. Испытанные серии производных рибавирина (dRsata, Rsata) и других химических соединений не обладали противовирусной активностью в отношении вируса Тоскана.

Заключение

Настоящая работа посвящена вопросам генотнпирования и филогенетики малоизученных штаммов вирусов МЛ, выделенных в мае — августе 1986 — 1987 гг. в Афганистане, а также разработке и совершенствованию методов специфической диагностики и средств лечения инфекций, вызываемых этими вирусами, что представляется актуальным для науки и практики, учитывая факт отсутствия отечественных диагностических и лечебных препаратов. В исследовании использовали прототипные штаммы вирусов неаполитанской, сицилийской москитных лихорадок, вируса Тоскана, а также афганские штаммы (Аф-1008, Аф-83, Аф-1028), выделенные сотрудниками НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского (С.Я.Гайдамович и соавт.) из крови советских военнослужащих.

Как известно, геном вирусов МЛ представлен тремя кольцевыми молекулами РНК (сегменты S, М и L), каждая из которых содержит уникальную генетическую информацию и играет различную роль в вирусном патогенезе. Объектом филогенетического исследования изучаемых нами штаммов были малый S и средний М сегменты.

РНК малого сегмента проявляет двойную кодирующую стратегию и содержит две открытые рамки считывания. Одна из них кодирует нуклеокапсидный белок N, а другая - неструктурный белок NSs. Согласно большинству недавних исследований, малый сегмент S флебовирусов наиболее консервативен по сравнению с сегментом М генома [84,96,119]. Генетическая стабильность нуклеотидной последовательности малого сегмента объясняется функциональной значимостью нуклекапсидного белка N. Ранее афганские штаммы вирусов MJT (Аф-1008, Аф-83 и Аф-1028 и еще два) были типированы с использованием серологических методов исследования [1,3]. По результатам идентификации в реакциях непрямой иммунофлюоресценции, связывания комплемента и нейтрализации методом редукции числа бляшек на клетках Vero Е6 и СПЭВ штамм Аф-1008 был отнесен к серокомплексу вируса НМЛ, а штаммы Аф-83 и Аф-1028 — к серокомплексу вируса СМЛ [3]. Известно, что нуклеокапсидный белок N проявляет комплементсвязывающую активность. На основании результатов изучения антигенных связей в РСК, полученных Э.Б.Белан [1], в составе серокомплекса НМЛ были выделены три антигенные группы: 1 - вирусы НМЛ (штамм Sabin), Тоскана и Тегеран, 2 - афганские штаммы Аф-130, Аф-1038, Аф-1008. Вирус Каримабад, по данным этого теста, оказался удаленным от других представителей серокомплекса и вошел в третью группу. Афганские штаммы Аф-83 и Аф-1028, по данным РСК, оказались идентичными друг другу и прототипному штамму СМЛ. В то же время, они не вступали в перекрестные реакции с вирусами серокомплекса НМЛ.

С целью изучения филогенетических взаимоотношений штаммов, выделенных в Афганистане, и дальнейшего сравнения полученных данных с существующей антигенной классификацией была поставлена задача секвенировать участки малого S и среднего М сегментов генома этих вирусов. Анализ существующей литературы показал, что для молекулярно-генетического анализа и детекции РНК вирусов МЛ используют такие методы как ПЦР, ОТ-ПЦР, "гнездовая" ОТ-ПЦР [86,107]. В зависимости от конечной цели исследования специфические олигонуклеотиды подбирают к тому или иному сегменту генома вирусов МЛ. Филогенетическое исследование проводят как по полным последовательностям какого-либо сегмента вирусного генома (большого L, среднего М, малого S), так и по участкам последовательностей вирусных структурных (N, Gn, Gc, L) и неструктурных (NSs, NSm) белков [33,51,85]. Тест-системы, используемые для детекции РНК вирусов МЛ в клинических образцах и пулах насекомых, амплифицируют фрагмент гена РНК-зависимой РНК-полимеразы, кодируемой сегментом L, или гена нуклеокапсидного белка N флебовирусов [40,85,107,109]. В представленной работе на первом этапе была создана ОТ-ПЦР тест-система для выявления и амплификации участка S-сегмента генома вирусов МЛ

НМЛ, СМЛ, Тоскана и близкородственных им штаммов). Их последовательности опубликованы в базе данных GeneBank. Мишенью для специфических олигонуклеотидов была последовательность нуклеокапсидного белка N, поскольку неструктурный белок NSs малого сегмента генома характеризуется большей вариабельностью [84,96]. Места посадки выбранных праймеров соответствовали наиболее консервативным участкам "консенсусной" последовательности сегмента S. В ходе оптимизации условий проведения ПЦР проводили подбор следующих параметров реакции: температуры отжига праймеров и количества циклов амплификации. Созданная ОТ-ПЦР тест-система оказалась группоспецифичной, способной выявлять РНК нуклеокапсидного белка N родственных вирусов москитных лихорадок, по чувствительности эквивалентна 0,4 БОЕ/мл вируса Тоскана.

С использованием созданной лабораторной ОТ-ПЦР тест-системы были амплифицированы участки малого сегмента генома штаммов Аф-1008, Аф-83 и Аф-1028. Далее была определена нуклеотидная последовательность ПЦР-фрагментов. Распределение изучаемых штаммов вирусов МЛ на филогенетической дендрограмме четко соответствовало их антигенной классификации, основанной на данных перекрестных опытов РСК и других серологических реакций. Группу I составили вирусы неаполитанского серокомплекса, который разделился на две ветки: вирус НМЛ (штамм Sabin) и другие НМЛ-подобные штаммы, вирус Тоскана и Тоскана-подобные штаммы. В группу П вошли прототипный штамм Sabin вируса СМЛ и близкие ему штаммы. Вирус Каримабад оказался обособленным от вышеперечисленных групп, что соответствует литературным данным по таксономии этого вируса [1]. Сходные результаты были получены Xu F. и соавт. [119] в результате анализа нуклеотидных последовательностей гена белка N. Согласно данным, полученным Xu F. вирусы серокомплекса НМЛ разделяются на две ветви: вирус Тоскана (ISS Phi 3) и близкородственный ему штамм Тоскана(ЕЬВ), прототипный штамм вируса НМЛ (Sabin) и штаммы POONA 7101795, NAMRU 840055, R-3, YU 8-76,Р-7101795. Прототипный штамм вируса СМЛ (Sabin) и близкородственные ему штаммы 1-701735, 910451, 91025В объединились в серокомплекс вируса СМЛ. Следует отметить, что по данным Xu F. объединение вирусов, участвующих в филогенетическом исследовании, в кластеры по местоположению изоляции не было выявлено. Однако, анализ дендрограммы, построенной на основе участка нуклеокапсидного белка N, настоящего исследования позволяет сделать противоположные выводы. Вирусы, изолированные на соседних территориях, характеризуются большим процентом гомологии нуклеотидной последовательности участка белка N. Согласно данным настоящей работы, афганский штамм Аф-1008 вошел в состав неаполитанского серокомплекса, наиболее близким ему оказался штамм вируса НМЛ индийского происхождения (Р-7101795), изолированный в 1970 г.(92,9 % гомологии). Афганские штаммы Аф-83 и Аф-1028 относятся к сицилийскому серокомплексу. Они наиболее близки индийскому штамму I-701735 вируса СМЛ, выделенному в 1970 -1971 гг. (95,5 и 87,5 процентов гомологии, соответственно).

О достоверности полученных данных свидетельствует 100% совпадение нуклеотидной последовательности участка S сегмента прототипного штамма НМЛ, секвенированного нами, с таковой, опубликованной в базе данных GeneBank. То же можно сказать и про прототипные штаммы вирусов СМЛ и Тоскана (100%).

Известно, что у флебовирусов, как и у многих других буньявирусов, сегмент М, кодирующий экспрессию поверхностного гликопротеина Gn, является наиболее вариабельным, с ним связана нейтрализующая активность гомологичных антител. Поэтому он является важным объектом для филогенетического анализа, представляет значительный интерес для проведения молекулярно-эпидемиологических исследований вирусов МЛ и изучения эволюции возбудителя [65,110].

В связи с генетической вариабельностью первичной последовательности гена Gn нам не удалось выбрать универсальную пару праймеров, амплифицирующую все штаммы (прототипные штаммы вирусов НМЛ, СМЛ, Тоскана и близкородственные им штаммы). Поэтому для каждого серокомплекса были сконструированы индивидуальные специфические олигонуклеотиды. Место посадки праймеров на нуклеотидной последовательности штаммов неаполитанского и сицилийского серокомплексов было одинаковым, что в дальнейшем позволило провести более точный сравнительный анализ.

На филогенетической дендрограмме, построенной на основе нуклеотидной последовательности гена белка Gn, вирусы вновь разделились на два кластера: I - вирусы неаполитанского серокомплекса, II — сицилийского серокомплекса. Изучаемые нами афганские изоляты распределились так же, как и на дендрограмме, построенной на основе малого S сегмента. Афганский изолят Аф-1008 оказался наиболее близок штамму POONA-7101795 вируса НМЛ индийского происхождения (гомология 78,1%), а первичная последовательность участка М сегмента штамма Аф-1028 на 98% соответствовала таковой штамма 1-701735 СМЛ.

Сравнение аминокислотных последовательностей участка малого сегмента S афганских штаммов и близкородственных им штаммов выявило незначительные изменения. Замена аланина в позиции 46 на треонин у штамма Аф-1008 обнаружена и у индийского штамма вируса НМЛ POONA-7101795. Анализ последовательности аминокислот малого S сегмента вирусов серокомплекса СМЛ выявил сходные мутации у штаммов Аф-83, Аф-1028 и I-701735. Замена лизина на аргинин в позициях 24 и 67 аминокислотной последовательности характерна только для штамма Аф-83. Выявленные замены не оказывают влияния на пространственную организацию нуклеокапсидного белка, поскольку не изменяют общего заряда полипротеина. Сравнение аминокислотной последовательности среднего М сегмента штамма Аф-1008 выявило наличие характерных только для него аминокислот пролина (в позиции 49), фенилаланина (50) и тирозина (60) и отсутствие серина (54) и лизина (55). Минимальное число отличий аминокислотного состава участка гена Gn у штамма Аф-1028 от такового у индийского штамма 1-701735 (серен 30 -аспарагин, глютаминовая кислота 99 - лизин) указывает, возможно, на недавнее расхождение этих штаммов в процессе эволюции.

Таким образом, нами были впервые секвенированы малоизученные афганские штаммы вирусов неаполитанской и сицилийской москитных лихорадок. Полученные данные о систематическом положении этих изолятов внутри антигенных групп подтверждают результаты предыдущих серологических исследований. На основании этих наших данных можно сказать, что по малому S и среднему М сегментам исследуемые штаммы не являются реассортантами, поскольку наибольшая гомология их со штаммами, выделенными на территории Индии, прослеживается по обоим сегментам. Кроме того, можно предположить, что изоляты из Афганистана произошли от индийских штаммов, либо они имеют общего прародителя. Высокая чувствительность и универсальность разработанного лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для выявления РНК малого сегмента генома S флебовирусов позволяют использовать его и в диагностических целях. Целесообразность создания диагностических ПЦР тест-систем для быстрой детекции РНК вирусов МЛ в клинических образцах продиктована острым началом инфекции, отсутствием специфических IgM и IgG в первые дни заболевания и наличием вирусемии в конце продромального периода и в течении первых двух - трех дней болезни, а также отсутствием подобных диагностикумов отечественного производства.

Не менее востребованными для диагностики и проведения сероэпидемиологических исследований являются и серологические методы, в первую очередь ИФА-IgM (MAC-ELISA) и ИФА-IgG (ELISA). Они особенно актуальны для диагностики заболевания после окончания короткого периода вирусемии у больных МЛ, когда выявление специфической вирусной РНК с помощью ОТ-ПЦР тест-системы уже не представляется возможным. Однако, начиная с пятого дня заболевания, концентрация специфических IgM достигает определяемых уровней [23]. Поэтому одной из задач нашего исследования было создание ИФА-тест-систем для выявления IgM и IgG антител к вирусам MJI, а также специфических антигенов.

Приготовленные компоненты (антигены, глобулины и конъюгаты) оказались высоко активными. Проверка специфичности диагностикумов показала отсутствие перекрестных реакций (с использованием гомологичных и гетерологичных антител и антигенов), между всеми тестированными родственными флебовирусами, за исключением вирусов НМЛ и Тоскана, что объясняется их близким антигенным родством [1]. Чувствительность созданных ИФА-систем для детекции антигенов вирусов MJI была достаточно высокой, позволяющей выявлять специфические антигены в культуральной жидкости инфицированных клеток Vero Е6 и в мозговой ткани зараженных н.б.м. в титрах, соответственно 1:400 и 1:512000. С помощью тест-системы ИФА-IgG были выявлены антитела к вирусу НМЛ (в титре 1:12800) у здорового жителя Краснодарского края, а специфические IgM антитела к вирусу СМЛ (в титре 1:800) в сыворотке крови больного из Астраханской области. Созданные нами ИФА тест-системы расширяют спектр имеющихся в России препаратов, предназначенных для диагностики эндемичных арбовирусных инфекций.

Из литературных источников известно, что на территории южного региона Европейской части бывшего СССР (Крым, Ставропольский, Краснодарский край, Дагестан, Северный Кавказ) в первой половине XX века наблюдалась активная циркуляция вирусов MJI. Эпидемические вспышки заболевания насчитывали тысячи больных. Борьба с москитами-переносчиками позволила радикально сократить массовое инфицирование населения в Севастополе. Какие-либо данные о случаях заболевания MJI на юге России в настоящее время отсутствуют. Подобный факт можно объяснить снижением активности природных очагов вирусов МЛ в этом регионе или отсутствием специфической диагностики.

Для выяснения существующей ситуации было проведено обследование сывороток крови больных лихорадками неясной этиологии и здоровых доноров, проживающих на территории Ростовской и Астраханской областей, а также Краснодарского края на IgM и IgG антитела к вирусам москитных лихорадок с использованием созданных нами ИФА-тест-систем.

Антитела к вирусам НМЛ и СМЛ у жителей Ростовской области не были обнаружены, что объясняется отсутствием москитов Ph.papatasi на этой территории. Как известно, северная граница ареала Ph.papatasi на юге России находится на уровне 45° с.ш. (широта г.г. Армавира и Буденновска) [17].

Среди обследованных сывороток, собранных на территории Астраханской области в 2007 году, у одного пациента (К.М.Н.) — жителя с. Новая Рыча Володарского района (госпитализированного в сентябре 2007 г. в Областную клиническую инфекционную больницу с неподтвержденным диагнозом «лихорадка Ку») на 13 день болезни были обнаружены IgM антитела к вирусу СМЛ в титре 1:800. Володарский район граничит с Атыраусской областью Казахстана (ранее - Гурьевская), где Ю.А.Дубровским [18] на широте примерно 46° с.ш. были обнаружены москиты вида Ph.mongolensis Sint.

Кроме того, нам удалось выявить IgG антитела к вирусу НМЛ в титре 1:12800 у здорового жителя (донора) из Новороссийского района Краснодарского края. Эта же сыворотка за счет перекрестных антигенных связей реагировала в титре 1:6400 с антигеном вируса Тоскана. По данным О.М.Пиликовой (личное сообщение), при обследовании 92 доноров-жителей г. Новороссийска в 2004 г. было выявлено две положительные пробы: одна содержала IgG к вирусу НМЛ, другая - IgG к вирусу СМЛ.

Полученные нами предварительные данные указывают на отсутствие циркуляции вирусов НМЛ и СМЛ в Ростовской области и очень низкий уровень активности очагов этих инфекций на юге Краснодарского края и Астраханской области. Однако обнаружение положительных находок IgM и IgG антител позволяет констатировать факт циркуляции вирусов НМЛ и СМЛ на данных территориях, что определяет целесообразность проведения дальнейших исследований.

При экспериментальном испытании химиопрепаратов в отношении многих вирусных инфекций особое внимание уделяется рибавирину. Его выраженное противовирусное действие, наряду с вирусами разных семейств и родов, было показано в опытах in vitro и in vivo на моделях флебовирусов Пунто Торо [94]. В нашем исследовании была поставлена задача оценить эффективность этого препарата in vitro на модели вируса Тоскана. Препарат использовался в дозах 500, 250, 125 и 62,5 мкг/мл. Выбор данных концентраций препарата обусловлен результатами предшествующих исследований, в которых было показано, что в этих концентрациях рибавирин не токсичен для клеток и активно снижает репликацию ряда вирусов [95]. Наши исследования показали, что рибавирин заметно снижает цитопатогенную активность вируса Тоскана после добавления в поддерживающую среду спустя час после заражения монослоя (индекс противовирусной активности составил 2,75 lg ЦПД5о/0,1 мл), а также через 2, 4 и 6 часов, снижая титр вируса на 3 lg ЦПД50/0,1. Внесение препарата за 1 час до заражения клеточного монослоя и после 18 часов существенно не предотвращало развитие ЦПД вируса.

Действие рибавирина швейцарского производства и аналогичного отечественного препарата оказалось в одинаковой степени эффективным.

Помимо рибавирина были протестированы несколько новых экспериментальных химических соединений (467, 452, dRsata, Rsata, Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A), синтезированных в НИИ биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Их действие оценивали также в четырех концентрациях, параллельно контролируя возможную токсичность для клеток. Было установлено, что соединения 467, 452, dRsata, Rsata в выбранных концентрациях не оказывали противовирусного действия. Другие перечисленные препараты оказались цитотоксическим и для культуры клеток Vero Е6, поэтому оценить их эффективность не оказалось возможным.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Клименко, Ирина Сергеевна, 2009 год

1. Белан Э.Б. Биологические и антигенные свойства штаммов вирусов Сицилийской и Неаполитанской москитных лихорадок, выделенных в Афганистане в 1986 — 87 гг.//Диссер.канд.мед.наук. Москва. - 1994.

2. Воинов И.И., Семикоз Ф.Ф., Чеботаревич Н.Д. Лихорадка паппатачи на Северном Кавказе//Мед.паразитол. и паразит, бол. 1936. - T.V., вып. 6. - С. 852 - 862.

3. Гайдамович СЛ., Хуторецкая Н.В., Азямов Ю.В. и др. Вирусологическое изучение случаев москитных лихорадок в Афганистане//Вопр. вир. 1990. -N.1.-C. 45-47.

4. Демиховская Е.В. Биологические свойства флебовирусов и разработка иммунохимических методов диагностики москитных лихорадок//Дисс. канд.мед.наук. -М., 1989.

5. Каверин Н.В. Стратегия генома и репродукция вирусов. В кн.: Медицинская вирусология (Под ред.Д.К.Львова). Москва, МИА. - 2008. -С.66.

6. Курахмедова Ш.А. Гемагглютинирующие свойства вирусов группы москитных лихорадок//Дисс.докт.мед.наук. М., 1973.

7. Лаврова Н.А., Краснобаева З.Н. Опыт получения иммунопероксидазных диагностикумов для индикации арбовирусов//Арбовирусы/Под ред. С.Я.Гайдамович, Л.С.Приймяги-Таллин, 1984. С. 144 - 146.

8. Лаврова Н.А., Наволокин О.В. Твердофазный иммуноферментный метод (ТИФМ) для выявления арбовирусов и антител к ним//АрбовирусыЛ1од ред С.Я.Гайдамович. М., 1986. - С. 146 - 153.

9. Лурия С., Дарнелл Дж. Общая вирусология. Под ред. Ю.З.Гендона Перевод Л.Б.Меклера. "Мир", Москва. - 1970. - С. 36 - 41.

10. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции//Москва "Медицина". 1989 г. - С. 168.

11. Львов Д.К., Щелканов М.Ю. Буньявирусы. В кн.: Медицинскаявирусология (под ред. Львова Д.К.). М., 2008. - С. 138 — 164, 546.

12. Мельникова Е.Э. Иммунные сыворотки и асцитные жидкости к арбовирусам//Арбовирусы/Под ред. С.Я.Гайдамович. М., 1986. - С. 104 -106.

13. Москитная лихорадка (болезнь Папатачи). Ананян С.А.//Автореф. дис. д.м.н. Москва. — 1954.

14. Организация эколого-эпидемиологического мониторинга территории Российской Федерации с целью противоэпидемической защиты населения и войск (Методические рекомендации). Под ред. академика РАМН Д.К.Львова. -Москва, 1995.-С. 56-61,83-86.

15. Павловский Е.Н. Лихорадка паппатачи и ее переносчик. Медгиз. - 1947. — С. 7 -13.

16. Пашкин М.Ф., Никитин A.M., Демина С.Н. Материалы по изучению природного очага москитной лихорадки в Севастополе за 1945 1988 гг.//Мед.паразитол. -1990. -N.6. - С.38 - 40.

17. Сергиев П.Г. К вопросу о лихорадке паппатчи на Северном Кавказе//Мед.паразитол. и параз. бол. 1936. - T.V., вып. 6. - С. 863 — 868.

18. Сорокин В.В., Амплеева Э.А., Иванов B.C. О природной очаговости кожного лейщманиоза в низовьях реки Эмбы//Мед.паразитол. 1979. - N.3. -С. 44 - 46.

19. Сошникова М.Н. Изучение вируса москитной лихорадки на мышах-сосунках//ЖМЭИ. — 1954. -N.7. С. 53 — 55.

20. Часовников. Клинические особенности течения лихорадки паппатачи и опыт специфической серотерапии.//Мед.паразитол. и паразит бол. 1936. -T.V., вып. 6. - С. 871 - 878.

21. Accardi L., Gro М.С., Di Bonito P. et al. Toscana virus genomic L segment: molecular cloning, coding strategy and amino acid sequence in comparison with other negative strand RNA viruses//Virus.Res. 1993. - V.27, N. 2. - P. 119 - 131.

22. Amaro F., Ciufolini M.G, Venturi G et al. Phleboviruses laboratory diagnosis

23. Toscana virus)//Acta.Med.Port. 2007. - V.20, N.4. - P. 341 - 346.

24. Bartellioni P.J., Tesh R.B. Clinical and serologic responses of volunteers infected with phlebotomus fever virus (Sicilian type)//Am.J.Trop.Med.Hyg. -1976.- V.25. P. 456 - 462.

25. Billecocq A., Spiegel M., Vialat P. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription//J.Virol. 2004. - V.78, N.18.-P. 9798-9806.

26. Bishop D.H.L. Ambisense RNA genomes of arenaviruses//Adv.Virus.Res. -1986.-V.31.-P. 1-51.

27. Braito A., Corbisiero R., Corradini S. et al. Toscana virus infections of the central nervous system in children: a report of 14 cases//J.Pediatr. 1998. - V.132, N.l.-P. 144-148.

28. Brandt W.E., Buescher E.L., Hetrick F.M. Production and characterization of arbovirus in mouse ascetic fluid//Am.J.Trop.Med.Hyg. — 1967. V.16, N.3. -P.339 - 347.

29. Calisher C.H., Petzman C.I. et al. Serodiagnosis of La Cross Virus infections in humans by detections of immunoglobulin M class antibodies//J.Clin.Microbiol. -1986.-V.23.-P. 667-671.

30. Charrel R.N., Gallian P., Navarro-Mari J.M. et al. Emergence of Toscana virus in Europe./ZEmerg Infect Dis. 2005. - V.ll, N.ll. - P. 1657 - 1665.

31. Charrel RN., Izri A., Temmam S. et al. Cocirculation of 2 genotypes of Toscana virus, southeastern France//Emerg.Infect.Dis. 2007. - V.13, N.3. - P. 465 - 468.

32. Chenais F., Virella G, Patrick C.C. et al. Isolation of immune complex by affinity chromatography using staphylococcal protein-A-Sepharose as substrate//J.Immunol.Method. 1977. - V.l8. - P. 183 - 193.

33. Clarke D.H., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutonation-inhibition with arthropod-born virusis//Am .J.Trop.Med.Hyg- 1958. V.7. - P. 561 -573.

34. Collao X., Palacios G, Sanbonmatsu-Gamez S. et al. Genetic diversity of

35. Toscana virus//Emerg.Infect.Dis. 2009. - V.15, N.4. - P. 574 - 577.

36. Crance J.M., Gratier D., Guimet J., Jouan A. Inhibition of sandfly fever Sicilian virus (Phlebovirus) replication in vitro by antiviral compounds//Res.Virol. 1997. -V.148, N.5. - P. 353 — 365.

37. Cusi M.G, Savellini GG, Terrosi C. et al. Development of a mouse model for the study of Toscana virus pathogenesis//Virology. 2005. - V. 333. - P. 66 - 73.

38. Darwish M.A., Hoogstraal H., Roberts T.J.et al. A sero-epidemiological survey for Bunyaviridae and certain other arboviruses in Pakistan//Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg. 1983. - V.77, N.4. - P. 446 - 450.

39. Di Bonito P., Bosco S., Mochi S. et al. Human antibody response to Toscana virus glycoproteins expressed by recombinant baculovirus//J.Med.Virol. 2002. -N.68. - P.615 -619.

40. Di Bonito P., Mochi S., Gro M.C. et al. Organization of the M genomic segment of Toscana phlebovirus//J.Gen. Virol. 1997. - V.78. - P. 77 - 81.

41. Di Bonito P., Nicoletti L., Mochi S. et al. Immunological characterization of Toscana virus proteins//Arch.Virol. 1999. - V.144, N.10. - P. 1947 - 1960.

42. Di Nicuolo G, Pagliano P., Battisti S. et al. Toscana virus central nervous system infections in southern Italy//J.Clin.Microbiol. 2005. - V.43, N.12. - P. 6186-6188.

43. Dionisio D., Esperti F., Vivarelli A., Valassina M. Epidemiological, clinical and laboratory aspects of sandfly fever//Curr.Opin.Infect.Dis. 2003. - V.16, N.5. - P. 383-388.

44. Duran N., Gowen B.B., Costa F.T. et al. A biotechnological product and its potential as a new immunomodulator for treatment of animal phlebovirus infection: Punto Того virus//Antiviral.Res. 2009. - V.83, N.2. - P. 143 - 147.

45. Echevarria J.M., de Oiy F., Guisasola M.E. et al. Acute meningitis due to Toscana virus infection among patients from the Spanish Mediterranean region and the region of Madrid//J.Clin.Virol. 2003. - N.26. - P. 79 - 84.

46. Ehrnst A., Peters C.J., Niklasson B. et al. Neurovirulent Toscana virus (asandfly fever virus) in Swedish man after visit to Portugal/ZLancet. 1985. - V.25, N.l.-P. 1212-1213.

47. Eight report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses// C.M.Fauquet, M.A.Mayo, J.Maniloff,U.Desselberger and L.A.Ball. 2005.

48. Eitrem R., Niklasson В., Weiland O. Sandfly fever among Swedish tourists//Scand.J.Infect.Dis. 1991. - V.23. - P.451 - 457.

49. Elliott R.M., Dunn E., Simons J.F. et al. Nucleotide sequence and coding strategy of the Uukuniemi virus L RNA segmentZ/J.Gen.Vir. 1992. - V.73. - P. 1745-1752.

50. Ellis S.B., Appenzeller G, Lee H. et al. Outbreak of sandfly fever in central Iraq, September 2007//Mil.Med. 2008 - V.173, N.10. - P. 949 - 53.

51. Espy J.R., Uhl L.M., Sloan L.M. et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing//Clin.Microbiol.Rev. 2006. - V.19. -P. 165-256.

52. George J.E. Isolation of Phlebotomus fever virus from Phlebotomus papatasi and determination of the host ranges of sandflies (Diptera:Psychodidae) in West Pakistan.//J.Med.Entomol. 1970. - N.7. - P. 670 - 676.

53. Giorgi C., Accardi L., Nicoletti L. et al. Sequences and coding strategies of the S RNAs of Toscana and Rift Valley fever compared to those of Punta Того, Sicilian Sandfly fever, and Uukuniemi viruses//Virology. 1991. - V.180. - P. 738 - 753.

54. Gori Savellini G, Di Genova G, Terrosi C. et al. Immunization with Toscana virus N-Gc proteins protects mice against virus challenge//Virology. 2008. -V.375, N.2. — P.521 — 528.

55. Goswami B.B., Borek E., Sharma O.K. et al. The broad-spectrum antiviral agent ribavirin inhibits capping of messenger RNA//Biochem.Biophys.Res.Commun. 1979. - V.89. - P. 830 - 836.

56. Grassi M., Wandele A.I., Peterhaus E. Enzyme-linked immunosorbent assay for determination of antibodies to the envelope glycoprotein in rabies virus//J.Clin.Microbiol. 1989. - V.27. - P. 899 - 902.

57. Hacker D., Rochat S., Kolakofsky D. Anti-mRNA in La Crosse Bunyavirus-infected cells//J.Virology 1990. - V.64, N.10. - P. 5051 - 5057.

58. Hemmersbach-Miller M., Parola P., Charrel RJM. et al. Sandfly fever due to TOSV: an emerging infection in southern France//Eur.J.lntern.Med. 2004. — N.15. - P. 316-317.

59. Hukic M., Salimovic-Besic I. Sandfly Pappataci fever in Bosnia and Herzegovina: the new-old disease/ZBosn.J.Basic.Med.Sci. — 2009. - V.9, N.l. - P. 39 - 43.

60. Ikegami Т., Won S., Peters C.J., Makino S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene//J. Virol. 2006. - V.80. - P. 2933 - 2940.

61. Intern. Catalogue of Arboviruses, 1985, Amer.Soc.Trop.Med.Hyd. (N.Karabatsos, ed.), San Antonio, Texas,USA.

62. Izri A, Depaquit J, Parola P. Phlebotomine sandflies and transmission of disease agents around the Mediterranean basin//Med.Trop. 2006. - V.66, N.5. -P. 429-35.

63. Izri A., Temmam S., Moureau G et al. Sandfly fever Sicilian virus, Algeria//Emer.Inf.Dis. 2008. - V.14, N.5. - P. 795 - 797.

64. Jenkins GM., Rambaut A., Pybus O.G, Holmes E.C. Rates of molecular evolution in RNA viruses: a quantitative phylogenetic analysis//J.Mol.Evol. -2002.-V.54.-P. 156-165.

65. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences//J.Mol.Evol. -1980. —N.16. P. 111-120.

66. Konstantinou GN., Papa A., Antoniadis A. Sandfly fever outbreak in Cyprus: are phlebiviruses still a health problem?//Travel.Med.Infect.Dis. 2007. - V.5, N.4. -P. 239-242.

67. Kumar S., Gadagkar S.R. Efficiency of the neighbor-joining method in reconstructing deep and shallow evolutionary relationships in largephylogenies//J.Moi.Evol. 2000. - V.51, N.6. - P. 544 - 553.

68. Liu D.-Y., Tesh R.B., Travassos Da Rosa A.P.A. et al. Phylogenetic relationships among members of the genus Phlebovirus (Bunyaviridae) based on partial M segment sequence analyses//J.Gen.Virol. V.84. - P. 465 - 473.

69. Magurano F., Nicoletti L. Humoral response in Toscana virus acute neurologic disease investigated by viral-protein-specific immunoassays//Clin.Diagn.Lab.Immunol. — 1999. — V.6, N.l. P. 55 - 60.

70. Marriot A.C., Ward V.K., Nuttall P.A. The S RNA segment of Sandfly Fever Sicilian virus: evidence for an ambisense genome/Aerology. 1989. - V.169, N.2. -P. 341-345.

71. Mendenhall M., Wong M.H., Skirpstunas R. et al. Punta Того virus (Bunyaviridae, Phlebovirus) infection in mice: strain differences in pathogenesis and host interferon response//Virology. 2009. - V.395, N.1. - P. 143 - 151.

72. Morshed M.G, Lee M.K., Jorgensen D., Isaac-Renton J.L. Molecular method used in clinical laboratory: prospects and pitfalls//FEMS Immunol.Med.Microbiol. 2007. - V.49, N.2. — P. 184-191.

73. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation//J.Histochemistry and Cytochemistry. 1974. - V.22, N.l2 - P. 1084 -1091.

74. Overview of Arbovirology in Brazil and neighbouring countries. Belem, Instituto Evandro Chagas (A.P.A.Travassos da Posa, P.F.C.Vasconcelos, J.F.S.Travassos da Rosa, eds.) 1998. - P. 25 - 26, 101 - 105.

75. Papa A., Konstantinou G, Pavlidou V., Antoniadis A. Sandfly fever virus outbreak in Cyprus//Clin.Microbiol.Infect. 2006. - V.12, N.2. - P. 192-194.

76. Peralta P.H., Shevlokov A., Brody J.A. Chagres virus: a new human isolate from Panama//Am.J.Trop.Med.Hyg. 1965. - V.14, N.l. - P. 146 - 151.

77. Perez-Ruiz M., Collao X., Navarro-Mari J.M., Tenorio A. Reverse transcription, real-time PCR assay for detection of Toscana virus//J.Clin.Virol. -2007. V.39, N.4. - P. 276 - 281.

78. Peyrefitte CN., Devetakov I., Pastorino B. et al. Toscana virus and acute meningitis, France//Emerg.Infect.Dis. 2005. - V.ll, N.5. - P. 778 - 779.

79. Pifet D.Y., Osterling M.C., Smith J.F. Antigenic analysis of Punta Того virus and identification of protective determinants with monoclonal antibodies/Aerology. 1988. - N.l67. - P. 442 - 450.

80. Raju R., Kolakofsky D. The ends of La Cross virus genome and antigenome RNAs within nucleocapsids are base paired//J.Virol. 1989. - V.63. - P. 122 -128.

81. Robeson G, Said L.H., Brandt W. et al. Biochemical studies on the Phlebotomus fever group viruses (Bunyaviridae family)//J.Virol. 1979. - V.30, N.l.-P. 339-350.

82. Rossi C., Ksiazek Т.Е. Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA). In: Manual of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome//H.W.Lee, Ch.Calisher, C.Schaljohn (eds). P. 87-91.

83. Sabin A.B. Experimental studies on Phlebotomus (pappataci, sadfly) fever during World War II//Arch.Gesamte Virusforsch. 1951. - V.4, N.4. - P. 367 -410.

84. Sail A.A., Zanotto A., Zeller H.G et al. Variability of the NS(S) protein among Rift Valley fever virus isolates//J.Gen.Virol. 1997. - V.78. - P. 2853 - 2858.

85. Sanbonmatsu-Gamez S., Perez-Ruiz M., Collao X. et al. Toscana virus in

86. Spain//Emer.Inf.Dis. 2005. - V.ll,N.ll. - P. 1701 - 1707.

87. Sanchez-Seco M.P., Echevarria J.M., Hernandez L. et al. Detection and identification of Toscana and other phleboviruses by RT-nested-PCR assays with degenerated primers//J.Med.Yirol. 2003. - V.71, N.l. - P. 140 - 149.

88. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase//J.Mol.Biol. — 1975. — V. 94. — P. 444448.

89. Sanger F., Niclein S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1977. — T. 74. — C. 5463-5467.

90. Schmidt J.R. et al. Phlebotomus fever in Egypt//Am.J.Trop.Med.Hyg. 1971. -N.20. - P. 483 — 490.

91. Schwartz T.F., Gilch S., Pauli C. et al. Immunoblot detection of antibodies to Toscana virus//J.Med.Virol. 1996. - V.49, N.2. - P. 83 - 86.

92. Schwarz T.F., Glich S., Jager G Travel-related Toscana virus infection/ZLancet. 1993. - V.25. - P. 803 - 804.

93. Schwarz TF., Gilch S., Jager G Aseptic meningitis caused by sandfly fever virus, serotype Toscana//Clin.Infect.Dis. 1995. - V.21., N.3. - P. 669 - 671.

94. Schwarz TF., Jager G, Gilch S., Nitschko H. Nested RT-PCR for detection of sandfly fever vims, serotype Toscana, in clinical specimens, with confirmation by nucleotide sequence analysis/ZRes.Virol. 1995. - V.146., N.5. - P. 355 — 362.

95. Sidwell R.W., Huffinan J.H., Barnard D.L. et al. Antiviral and immunomodulating inhibitors of experimentally-induced Punta Того virus infections//Antiviral.Res. 1994. - V.25., N.2. - P. 105 - 122.

96. Sidwell R.W., Huffman J.H., Barnett B.B., Pifat D.Y. In vitro and in vivo Phlebovirus inhibition by ribavirin//Antimicrob.Ag.Chem. 1988. - V.32., N.3. — P.331—336.

97. Simons J.F., Hellman U., Pettersson R.F. Uukuniemi virus S RNA segment: ambisense coding strategy, packaging of complementary strands into virions, and homology to members of the genus Phlebovirus//J. Virol. 1990. - V.64, N.l. - P.247.255.

98. Smith R.A., Sidwell R.W., Robins R.K. Antiviral mechanisms of action//Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 1980. - Vol.20. - P. 259 - 284.

99. Terrosi C., Olivieri R., Bianco C. et al. Age-dependent seroprevalence of Toscana virus in central Italy and correlation with the clinical profile//Clin.Vaccine Immunol.-2009. V.l 6, N.8.-P. 1251 - 1252.

100. Tesh R. et al. Studies on the epidemiology of sandfy fever in Iran. 1. Virus isolated obtained from Phlebotomus//Am.J.Trop.Med. Hyg. 1977. - V.26. - P. 282 -287.

101. Tesh R.B. The genus Phlebovirus and its vectors//Annu.Rev.Entomol. — V.33. -P. 169-181.

102. Tesh R.B., Boshell J., Young D.G et al. Biology of Arboledas virus, a new phlebotomus fever serogroup virus (Bunyaviridae: Phlebovirus) isolated from sandflies in Colombia//Am.J.Trop.Med.Hyg. 1986. - V.35, N.6. - P. 1310 -1316.

103. Tesh R.B., Duboise S.M. Viremia and immune response with sequential phlebovirus infections//Am.J.Trop. Med.Hyg. 1987. - V.36, N.3. - P. 662 - 668.

104. Tesh R.B., Peters C.J., Meegan J.M. Studies on the antigenic relationship among Phleboviruses//Am.J.Trop.Med.Hyg. 1982. - V.31, N.l. -P. 149 - 155.

105. Tesh R.B., Saidi S., Gajdamovich SJa. et al. Serological studies on the epidemiology of sandfly fever in the Old Wold//BULL.Wold Health Organ. 1976. - V.54. - P. 663 - 673.

106. Valassina M., Cuppone A.M., Bianchi S. et al. Evidence of Toscana virus variants circulating in Tuscany, Italy, during the summer of 1995 to 1997//J.Clin.Microbiol. 1998. - V.36, N.7. - P. 2103 - 2104.

107. Valassina M., Cusi M.G, Valensin P.E. A Mediterranean arbovirus: the Toscana virus//J.Neurovirol. 2003. - V.9, N.6. - P. 577 - 583.

108. Valassina M., Cusi M.G, Valensin P.E. Rapid identification of Toscana virus by nested PCR during an outbreak in the Siena area of Italy//J.Clin.Microbiol. 1996.- V.34., N.10. P. 2500 - 2502.

109. Valassina M.,Soldateschi D., Dal Maso GM. et al. Diagnostic potential of Toscana virus N protein expressed in Escherichia coli//J.Clin.Microbiol. 1998. -V.36., N.l 1. - P. 3170 - 3172.

110. Valassina, M., Meacci F., Valensin P.E., Cusi M. G Detection of neurotropic viruses circulating in Tuscany: the incisive role of Toscana virus//J.Med.Virol. -2000.-V.60.-P. 86-90.

111. Valentini M., Valassina M., Savellini GG, Gusi M.G Nucleotide variability of Toscana virus M segment in strains isolated from clinical cases//Virus Res. — 2008.- V.135,N.l. —P. 187-190.

112. Venturi G, Ciccozzi M., Montieri S. et al. Genetic variability of the M genome segment of clinical and environmental Toscana virus strains//J.Gen.Virol. 2007. -V.88. - P. 1288 - 1294.

113. Verani P., Nicoletti L., Ciufolini M.G, Balducci M. Viruses transmitted by sandflies in Italy//Parassitologia. 1991. - V.33. - P. 513 - 518.

114. Voller A., Bidwell D., Bartlett A. Microplate immunoassay for the immunodiagnosis of virus infection//Eds. N.R.Rose, H.H.Friedman. — 1976. -Washington. P. 506 - 512.

115. Watts D.M., MacDonald C., Bailey C.L. et al. Experimental infection of Phlebotomus Papatasi with sandfly fever Sicilian virus//Am.J.Trop.Med.Hyg. -1988. V.39, N.6. - P. 611 - 616.

116. Weidmann M., Sanchez-Seco M.P., Sail A.A. et al. Rapid detection of important human pathogenic Phleboviruses//J.Clin.Virol. 2008. - V. 41, N.2. - P. 138-142.

117. Won S., Ikegami Т., Peters C.J. NSm protein of Rift Valley fever virus suppresses virus-induced apoptosis//J.Virol. — 2007. — V.81, N.24. — P. 1333513345.

118. Won S., Ikegami Т., Peters C.J., Makino S. NSm and 78-kilodalton proteins of Rift Valley fever virus are nonessential for viral replication in cell culture//J.Virol.- 2006. V.80, N.16. — P. 8274 - 8278.

119. Worobey M., Holmes E.C. Evolutionary recombination in RNA viruses//J.Gen.Microbiol. 1999. - V.80. - P. 2535 - 2543.

120. Xu F., Chen H., Travassos da Rosa A.P.A. et al. Phylogenetic relationships among sandfly fever group viruses (Phlebovirus: Bunyaviridae) based on the small genome segment//J.Gen.Virol. 2007. -N.88. - P. 2312 - 2319.

121. Xu F., Liu D., Nunes M.R.T. et al. Antigenic and genetic relationships among Rift Valley fever virus and other selected members of the genus Phlebovirus (Bunyaviridae)//Am.J.Trop.Med.Hyg. 2007. - V.76, N.6. - P.l 194 - 1200.