Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вируса Батаи и создание тест-систем для диагностики этой инфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат медицинских наук Терехин, Сергей Анатольевич

• Терехин, Сергей Анатольевич
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Терехин, Сергей Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.~.б

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость работы.

Основные положения, выносимые на защиту.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Состав рода Orthobunya virus. Антигенная классификация. Таксономическое положение вируса Батаи в пределах супергруппы Буньямвера.

1.2. Морфология и морфогенез ортобуньявирусов.

1.3. молеьсулярно-биологическая характеристика вирусов

Orthobunya virus.

1.4. Эпидемиология лихорадки Батаи. Экология вируса-возбудителя.

1.4.1. История выделения вируса. Распространение.

1.4.2. Переносчики и позвоночные хозяева.

1.5. Взаимоотношение вируса Батаи с другими представителями рода Orthobunya virus.

1.6. Патогенность вируса для лабораторных животных.

1.7. Роль вируса Батаи в патологии человека.

1.8. Специфическая диагностика лихорадки Батаи.

1.8.1. Вирусологическая диагностика.

1.8.2. Серологическая диагностика.

1.8.3. Молекулярная диагностика.

1.9. Лечение и профилактика.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вируса Батаи и создание тест-систем для диагностики этой инфекции»

Арбовирусы - это экологическая группа вирусов, передающихся восприимчивым позвоночным через укусы кровососущих членистоногих: комаров, клещей, москитов, мошек и мокрецов. К этой группе тесно примыкают зоонозные вирусы, циркулирующие среди позвоночных животных, без участия кровососущих членистоногих. К ним относятся, в частности, возбудители ряда геморрагических лихорадок (Jlacca, Марбург, Эбола, аргентинская, боливийская, венесуэльская, бразильская, ККГЛ, с почечным и лёгочным синдромом). Общее число вирусов, относящихся к этим категориям, составляет примерно 550. Ио крайней мере для 100 из них выявлена способность вызывать заболевания людей

ЪЛП

Такие арбовирусные инфекции, как лихорадка денге, геморрагическая лихорадка денге, жёлтая, лихорадка, восточный, западный, венесуэльский энцефаломиелиты лошадей, энцефалиты - японский, клещевой, Сент-Луис, долины Муррея, Росио, Западного Нила, калифорнийский, лихорадки долины Рифт, москитные лихорадки, карельская лихорадка и-другие — далеко не полный перечень опасных для человека арбовирусных инфекций, представляющих огромное значение для здравоохранения в эндемичных регионах мира.

Борьба, а часто и этиологическая расшифровка вспышек арбовирусных инфекций затрудняются огромным антигенным разнообразием возбудителей, массивностью эпидемических вспышек с охватом в короткий срок значительных групп населения, необходимостью лабораторного подтверждения диагноза, отсутствием специфических средств лечения, а нередко и профилактики.

На территории бывшего СССР выявлено 58 арбовирусов, относящихся к семействам Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Iridaviridae, Picornaviridae, Orthomyxoviridae. Многие из них известны как возбудители заболеваний человека. Для других - патогенность для человека пока не выявлена, что отнюдь не означает отсутствия их потенциальной опасности.

Значительная часть из известных арбовирусных инфекций (включая лихорадку Батаи) относится к категории малоизученных.

Вирус Батаи принадлежит к семейству Випуачт<1ае, роду ОнкоЪипусыгтх (который насчитывает более 140 вирусов) и антигенному комплексу Буньямвера, включающего не менее 20 представителей. Ареал вируса Батаи охватывает южные, юго-восточные и восточные регионы Азии, Западную, Центральную и Восточную Европу, Африку (Судан, Уганда) [2]. Установлена циркуляция этого вируса в разных ландшафтных зонах Европейской и Азиатской территорий России [2,12].

Актуальность настоящих исследований определяется: широким географическим распространением и высокой активностью циркуляции вируса Батаи на эндемичных территориях; выраженной патогенностью для человека; ограниченностью данных о его роли в патологии человека и животных; отсутствием диагностических тест-систем, доступных для использования в практических лабораториях и этиотропных средств лечения лихорадки Батаи; отсутствием достаточной информации по молекулярно-генетической и антигенной идентификации штаммов вируса Батаи и близкородственных вирусов, которая имеет прямое отношение к пониманию процессов эволюции рода ОнЬоЪипуамЬ-т.

Цели и задачи исследования

Цели настоящего исследования: молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика и генотипирование малоизученных штаммов вируса Батаи, создание комплексной системы специфической диагностики лихорадки Батаи, определение активности ряда коммерческих и экспериментальных химических соединений в отношении этого патогенного агента.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: • определение частичных нуклеотидных последовательностей генов вп (М-сегмент) и РНК-полимеразы (Ь-сегмент) штаммов вируса Батаи, циркулирующих в Юго-Восточной Азии (Малайзия), Чешской Республике, на Украине и в России;

• проведение филогенетического анализа штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов Orthobimyavirus;

• определение аминокислотных замен в антигенных эпитопах гликопротеина Gn и L-полимеразы у штаммов вируса Батаи различного происхождения;

• создание и характеристика оригинальных ОТ-ПЦР и ИФА тест-систем для диагностики лихорадки Батаи;

• определение чувствительности и специфичности ИФА-IgM и ИФА-IgG тест-систем при обследовании сывороток крови больных людей, доноров и домашних животных; использование этих систем для серодиагностики лихорадки Батаи и проведения сероэпидемиологических исследований;

• изучение действия рибавирина, его производных (dRsata, Rsata) и ряда экспериментальных химических соединений (467, 452, Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A) на репродукцию вируса Батаи в опытах in vitro.

Научная новизна работы

1. Впервые определена нуклеотидная последовательность фрагментов сегмента M (513 н.о.) и сегмента L (501 н.о.) малоизученных штаммов вируса Батаи, выделенных в разные годы в России (Волгоградская область), на Западной Украине, в Чехословакии и Малайзии. На основании данных филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка сегмента M установлено, что исследованные штаммы группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры.

2. Установлены различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов гликопротеина Gn и протеина L у изученных штаммов.

3. Проведён сравнительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей сегментов М и L РНК штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов антигенного комплекса Буньямвера.

4. Впервые в России создана и охарактеризована специфическая тест-система ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи.

5. Разработаны и охарактеризованы экспериментальные ИФА тест-системы для выявления специфических антител классов IgM и IgG в сыворотках крови людей, Ig G в сыворотках крови овец, а также антигенов вируса Батаи.

6. В опытах in vitro на модели вируса Батаи впервые проведено изучение противовирусной активности рибавирина, его производных и других препаратов, синтезированных в Институте биоорганической химии РАН. Установлено, что рибавирин обладает высокой противовирусной активностью.

Практическая значимость работы

1. Созданная и охарактеризованная в процессе исследования специфическая тест-система ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи обладает достаточно высокой чувствительностью, что позволяющей выявлять 12 БОЕ/мл. Она может быть рекомендована для использования в практических диагностических лабораториях.

2. Разработаны и охарактеризованы экспериментальные ИФА тест-систем для выявления специфических антител класса IgM и IgG в сыворотках крови людей, Ig G в сыворотках крови овец, а также антигенов вируса Батаи. Техническая документация на данные тест-системы утверждена

Учёным Советом НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН 11 мая 2009 г.

3. ИФА-IgM и ИФА-IgG системы были успешно использованы для специфической диагностики лихорадки Батаи при совместной работе с вирусологической лабораторией Центра гигиены и эпидемиологии в Астраханской области, где в 2007 г. серологически было верифицировано 5 случаев этой малоизученной инфекции;

4. Установлена выраженная противовирусная активность рибавирина в отношении вируса Батаи в опытах in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основании изучения нуклеотидной последовательности участка гена Gn (сегмента М РЕК) штаммов вируса Батаи, выделенных в России, на Западной Украине, в Чехии и Малайзии и сравнения полученных результатов с информацией GenBank, установлено, что штаммы вируса Батаи группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры. Сходная картина наблюдается при филогенетическом анализе данных по сегменту L. Однако в этом случае в пределах гомогенной европейской генетической группы у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) выявлялось определённое отличие от другого украинского штамма (499), российского штамма 42 (из Волгоградской области) и чешского штамма Чалово.

2. Филогенетический анализ участка гена Gn различных штаммов вируса Батаи и других представителей рода Orthobunyavirus (серокомплекс Буньямвера) выявляет наиболее близкими к вирусу Батаи североамериканские штаммы Northway и Tensaw (гомология 77% и 79% соответственно). Другие представители рода Ortobunyavirus (серокомплекс Буньямвера) филогенетически достаточно удалены от вируса Батаи (гомологичность нуклеотидной последовательности составляет 25-56%).

3. Установлены различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов гликопротеина Gn и протеина L у изученных штаммов. Гомогенная европейская генетическая группа имеет существенные замены в аминокислотных последовательностях эпитопов I и IV в участке гена гликопротеина Gn.

4. Разработка чувствительной и специфической тест-системы ОТ-ПЦР для выявления РЕК вируса Батаи. Чувствительность диагностикума составила 12 БОЕ/мл.

5. Разработка и характеристика тест-систем ИФА для выявления антигена вируса Батаи и специфических антител классов М и G к вирусу Батаи в сыворотках крови людей и класса G у овец. Чувствительность тест-системы для определения антигена вируса Батаи составила 100 БОЕ/мл.

6. В результате использования разработанных ИФА-IgM и ИФА-IgG систем проведено обследование сывороток крови больных лихорадочными заболеваниями и здоровых жителей Южного региона России и сывороток овец на антитела к вирусу Батаи. Серологически верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи в Астраханской области. Специфические антитела у овец обнаружены в Астраханской области (12,5%) и Ставропольском крае (5,2%).

7. Исследование противовирусной активности швейцарского препарата «рибавирин». Данный препарат эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса Батаи в культуре клеток Vero Ев. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 2,0 lg ЦПД50 при концентрации 500 мкг/мл. Производные рибавирина (dRsata, Rsata) и ряд экспериментальных химических соединений (467, 452, С1-Ага-А, dR-SK-452, Det-Ara-A, ОН-Ara-A, Оше-Ага-А) не обладают противовирусной активностью в отношении вируса Батаи.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Терехин, Сергей Анатольевич

выводы

1. На основании филогенетического анализа участка гена Gn сегмента М РНК штаммов вируса Батаи, выделенных в России, на Западной Украине, в Чехии и Малайзии установлено, что штаммы вируса Батаи группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры.

2. При филогенетическом анализе данных по сегменту L в пределах гомогенной европейской генетической группы штаммы вируса Батаи у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) обнаружено определённое отличие от другого украинского штамма (штамм 499), российского (42) и чешского (Чалово) штаммов.

3. Обнаружены аминокислотные замены в участках генов Gn и L-полимеразы у исследованных штаммов вируса Батаи. Участок гена РНК-полимеразы оказался достаточно консервативным; ген Gn является вариабельным.

4. С использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров создана высокоспецифичная тест-система на основе ОТ-ПЦР для детекции РНК вируса Батаи. Её специфическая чувствительность составляет 12 БОЕ/мл.

5. Разработаны и охарактеризованы специфичные и чувствительные тест-системы ИФА для обнаружения антигенов вируса Батаи, антител класса М и G в сыворотках людей и антител класса G в сыворотках овец. Чувствительность ИФА тест-системы для обнаружения антигенов вируса Батаи составила 100 БОЕ/мл.

6. В результате проведения серодиагностических и сероэпидемиологических исследований с использованием ИФА-IgM и ИФА-IgG тест-систем верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи у жителей Астраханской области. Специфические IgG антитела обнаружены у овец в Астраханской области (2,9%) и Ставропольском крае (5,2%)

7. В опытах in vitro на модели вируса Батаи установлена выраженная противовирусная активность швейцарского препарата «рибавирин» и отечественного рибавирина. Индексы противовирусной активности варьируют от 0,8 1§ДПД50 (при концентрациях препарата 250-125 мкг/мл) до 3,0 ВДПДзо (при концентрации 500 мкг/мл). Другие тестированные экспериментальные химиопрепараты (467, 452) не обладают противовирусной активностью в отношении вируса Батаи даже при максимальной концентрации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Вирус Батаи широко распространён в странах Азии и Европы, встречается на африканском континенте.

Он является патогенным для человека и вызывает острые лихорадочные заболевания человека, иногда с явлениями менингоэнцефалита, и вызывает заболевания сельскохозяйственных животных. Серологические данные показали связь вируса Батаи с гриппоподобным заболеванием, сопровождаемым лихорадкой, миалгией и анорексией. Чехословацкие исследователи доказали роль вируса Батаи в этиологии лихорадочных заболеваний и бронхопневмоний, наблюдающихся в период активности кровососущих переносчиков [24].

В связи с этим, разработка и совершенствование методов специфической диагностики и средств лечения лихорадки Батаи представляются актуальными направлениями для науки и практики, учитывая отсутствия отечественных диагностических и лечебных препаратов. Цели данного исследования заключались:

• в проведении филогенетического анализа штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов Orthobunyavirns;

• в создании и характеристике оригинальных ОТ-ПЦР и ИФА тест-систем для диагностики лихорадки Батаи; в изучении действия ряда коммерческих и экспериментальных химиопрепаратов на репродукцию вируса Батаи в опытах in vitro.

Проведение филогенетического анализа штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов Orthobunyavirus, а также определение аминокислотных различий в последовательностях антигенных детерминант поверхностного гликопротеина Gn у европейских изолятов вируса Батаи (штаммы Батаи 42, Олыка 499, Олыка 1548, Чалово) являлось одной из задач данного исследования.

По данным филогенетических исследований частичных нуклеотидных последовательностей исследованные штаммы вируса Батаи чётко разделились на 3 группы по географическому признаку.

Первую группу составили азиатские штаммы, ММ 2222, ОМ 1Е/94, ОЫ 7В/01, СЬйоог, выделенные в Юго-Восточной Азии (Малайзия, Япония, Индия). Во вторую группу вошли африканские штаммы UgMP6830 и ^ап (из Уганды и Судана), в третью - штаммы Олыка 1548, Олыка 499, ВЛГ 42, и Чалово, выделенные на Западной Украине, в Волгоградской области и Чешской Республике.

Вирус Илеша (Нигерия) при анализе сегмента М оказался генетически родственным вирусу Батаи, но самостоятельным вирусом. Суданский штамм КУ-141 вируса Нгари, выделенный от больного человека, является реассортантом между вирусами Буньямвера (по Б и Ь сегментам) и вирусом Батаи (по М сегменту). Гомология между вирусом Нгари и штаммами вируса Батаи из Уганды, Японии и Малайзии по М сегменту достигает 95%. Эти данные совпадают с данными зарубежной литературы [61, 89,120].

В сравнении с другими представителями рода ОгАгоЪипуауггш (рис. 5), штаммы вируса Батаи формируют отдельную группу. Гомологичность нуклеотидной последовательности различных географических вариантов вируса Батаи составляет 85-98%, а аминокислотной — 92-95%.

Достаточно близкими к вирусу Батаи оказались северо-американские вирусы Тетсгм и ИоМкмау. Процент гомологии по М-сегменту прототипного штамма вируса Батаи с вирусом Тешем составил 79%, а с вирусом №оП1гмау - 77%. Эти данные согласуются с данными зарубежной литературы [69].

Результаты множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей М-сегмента исследованных нами штаммов вируса Батаи показали высокую степень гомологии (98%) российского штамма 42, украинских штаммов 1548, 499 и чешского штамма Чалово. По нашим данным, эти штаммы, формируют отдельную европейскую генетическую группу, которая по нуклеотидной последовательности М сегмента существенно отличается от таковой у других штаммов вируса Батаи.

Сходная картина наблюдается при филогенетическом анализе данных по Ь сегменту. Однако в этом случае в пределах гомогенной европейской генетической группы у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) выявлялось определённое отличие от другого украинского штамма, российского (из Волгоградской области) и чешского (Чалово) штаммов. Возможно это связано с тем, что штамм 1548 вируса Батаи является реассортантом по Ь-сегменту или с наличием мутаций в геноме данного вируса.

В результате настоящего исследования были обнаружены различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов поверхностного гликопротеина вп у близких штаммов Батаи, а также различия в аминокислотных последовательностях Ь-протеина.

У штамма Чалово в эпитопе I в положении 114 пролин заменён на серин. У российского штамма Батаи 42 в эпитопе I в положении 121 вместо аспарагина находится аспарагиновая кислота, а в положении 137 тирозин вместо гистидина. Некоторое отличие имеет штамм Олыка 499, у которого в положении 140 лейцин заменён на гистидин. Данные замены являются существенными, так как замещающие аминокислоты обладают разными зарядами и имеют разные по полярности радикалы. Это может изменять конформацию эпитопов и влиять на свойства штамма.

Несмотря на некоторое различие в нуклеотидной последовательности европейской группы штаммов вируса Батаи, аминокислотная последовательность секвенированного нами участка Ь сегмента штаммов вируса Батаи оказалась очень консервативной. Это объясняется вырожденностью генетического кода, а также функциональной значимостью Ь-протеина. Как известно, чем меньше функциональная важность отдельных участков генов, тем больше они имеют тенденцию к эволюционной изменчивости.

У штамма Олыка 1548 в положении 105 глутаминовая кислота заменена на лизин. Позиция 123 у данных штаммов является достаточно гетерогенной: у двух штаммов (Батаи 42 и Олыка 499) в этой позиции находится глутаминовая кислота; у штамма Чалово в позиции 123 находится аланин, а у штамма Олыка 1548 — лизин.

Особая роль в настоящем исследовании была отведена разработке тест-системы на основе ОТ-ПЦР для детекции РНК вируса Батаи. Преимуществом метода ПНР является высокая скорость проведения анализа, отсутствие необходимости использования клеточных культур и дорогостоящих лабораторных животных. Данный метод обладает высокими чувствительностью и специфичностью.

Описанная в работе тест-система характеризуется использованием оригинальных праймеров, которые комплементарны участку гена поверхностного гликопротеина вп.

При подборе праймеров был проведён анализ последовательностей геномов нескольких штаммов вируса Батаи (ММ 2222, 0>1-7/В/01, ОМ-1/Е/94, ЩМР 6830, СЫйог Ю 20217). Праймеры были комплементарны последовательности гена гликопротеина вп вируса Батаи и амплифицировали фрагмент ДНК длиной 513 пар нуклеотидов (п.н.). Особое внимание уделялось тому, чтобы 3' концы праймеров не были комплементарны вариабельным областям генома.

Разработанная нами тест-система ОТ-ПЦР позволяет выявить 12 БОЕ/мл. Чувствительность метода зависит от многих факторов: чистоты и источника матрицы для ПЦР, метода экстракции нуклеиновых кислот, температурного режима реакции. Нами было проведено сравнение двух методов выделения нуклеиновых кислот: экстракция с помощью реагента «Тризол» и сорбирования на неорганическом носителе. Метод экстракции тризолом позволяет выделять РНК/ДНК с более высокой степенью частоты. Несмотря на высокую чувствительность разработанной тест-системы, выделение РНК вируса сорбированием на неорганическом носителе не дало положительных результатов. Это можно объяснить наличием в составе мозговой суспензии балластных веществ (липиды, белки), которые экранируют и закрывают частицы неорганического сорбента, не давая РНК связываться с ним.

Подобранная пара праймеров обеспечивает синтез фрагмента в-гена (513 п.н.) всех изучаемых нами штаммов вируса Батаи. Специфичность выбранных праймеров была проверена при использовании в ОТ-ПЦР гетерологичных вирусов: Синдбис, Гета, Западного Нила, жёлтой лихорадки, Денге П, Тягиня, Тоскана, Сицилийской и Неаполитанской лихорадок, Бужару, Исфаган, Кемерово.

Все пробы, содержащие гетерологичные вирусы, а также отрицательный контроль (мозговая суспензия незараженной мыши) оказались отрицательными. Наряду с этим, при обследовании пробы мозга мышей, инфицированных вирусом Батаи, был получен положительный сигнал. Эти данные указывают на выраженную специфичность разработанной тест-системы.

В лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского нами разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления специфических вирусных антигенов, и антител к вирусу Батаи в сыворотке крови людей, а также обнаружения специфических антител ^О в сыворотке крови овец, что позволяет впервые в нашей стране проводить специфическую диагностику лихорадки Батаи у больных с острыми сезонными лихорадочными заболеваниями неясной этиологии и проводить сероэпидемиологические исследования. Техническая документация на эти тест-системы утверждена Ученым советом института 11 мая 2009 г.

Разработка ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи, а также тест-систем ИФА для обнаружения антигена вируса Батаи, а также антител класса М и О в сыворотке крови людей, и антител класса О в сыворотке крови овец была обусловлена необходимостью диагностики лихорадки Батаи и проведения сероэпидемиологических исследований.

Чувствительность метода ИФА для определения антигенов вируса Батаи, определенная по сравнительным результатам реакции бляшкообразования, составила 100 БОЕ/мл. Сравнив этот показатель с чувствительностью молекулярно-биологических методов, можно сделать вывод, что он оказался в 10 раз ниже чувствительности ОТ-ПЦР. Такой результат является закономерным, учитывая то, что в процессе амплификации первоначальное количество молекул нуклеиновой кислоты увеличивается в тысячи раз.

Специфичность ИФА оказалась высокой: было показано отсутствие перекрестной реактивности для родственных Буньявирусов.

Реагенты, приготовленные в процессе разработки ИФА тест-системы для индикации антигена вируса Батаи (специфические иммуноглобулин, антигены, пероксидазный конъюгат, нормальный глобулин и антиген), явились достаточной основой для конструирования ИФА-диагностикумов, предназначенных для выявления IgM и IgG антител в сыворотках крови людей и животных. Наличие положительных контролей, высокие специфичность и чувствительность данного метода позволяет рекомендовать данную тест-систему к использованию в диагностических лабораториях эндемичных областей.

Лихорадка Батаи относится к малоизученным и довольно редким заболеваниям. В зарубежной литературе имеются малочисленный сведения о выявлении больных лихорадкой Батаи. В частности, в 1988 г. в Судане (Африка) среди 195 серологически обследованных больных острыми лихорадочными заболеваниями неясной этиологии, у 13 человек (7%) были обнаружены антитела класса М к вирусу Батаи, и у 59 человек из 96 -антитела класса G (61%) [89]. Чехословацкие исследователи доказали роль вируса Батаи в этиологии лихорадочных заболеваний и бронхопневмоний, наблюдающихся в период активности кровососущих переносчиков [24].

В отечественной литературе также имеется описания нескольких случаев лихорадки Батаи. Три случая лихорадки Батаи имели место в сентябре и октябре 1991 г., два случая - в апреле и мае 1993 г. в Краснодарском крае (г. Сочи) [20]. В 2001 г. на территории Астраханской области был зарегистрирован один случай заболевания лихорадкой Батаи [1].

При нашем участии в 2007 г. в Астраханской области в вирусологической лаборатории ЦГиЭ серологически было верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи. Один случай закончился летально. У больных наблюдались слабость, недомогание, головокружение, тошнота, кашель, боль в мышцах, лихорадка до 38-39° С. У одного пациента отмечалось однократное обильное носовое кровотечение, у другого - ригидность мышц затылка. Возраст больных составил от 18 до 60 лет. Трое из пяти больных проживали в городе Астрахани, двое являлись сельскими жителями. В сыворотке крови, полученной от одной из больных на 10 сутки после начала заболевания, были обнаружены антитела класса М к вирусу Батаи в титре 1:32000.

При серологическом обследовании овец в Астраханской области и Ставропольском крае методом ИФА были выявлены положительные сыворотки, в среднем в 2,9 и 12,5% случаев соответственно.

Эти данные подтверждают результаты предшествующих исследований ряда авторов, свидетельствующие о циркуляции вируса Батаи в южном регионе России, что определяет целесообразность проведения дальнейших исследований.

Одна из задач настоящего исследования заключалась в изучении эффективности рибавирина на модели вируса Батаи в опытах in vitro. Кроме того, были протестированы также новые производные рибавирина и другие химические соединения, синтезированные в Институте биоорганической химии, РАН.

Результаты исследований показали, что рибавирин (как отечественного, так и швейцарского производства) эффективно предотвращает развитие цитопатического действия (ЦПД) вируса Батаи в клетках Vero Е6. Эффективность препарата возрастает пропорционально его концентрации, и он не обладает цитотоксическим действием.

Результаты опыта показали, что тестированные производные рибавирина и другие новые химические соединения, синтезированные в Институте биоорганической химии РАН, не проявляют противовирусной активности в отношении вируса Батаи даже при максимальной концентрации. Пять из девяти химических соединений оказались токсичными для культуры Vero Еб, вызывая неспецифическую деструкцию клеток, поэтому оценить их противовирусное действие не представилось возможным.

Нами выявлено, что рибавирин, внесённый в поддерживающую среду за час до контакта клеток с вирусом и через 18 часов после заражения монослоя не оказывает защитного действия. В тоже время, заметный противовирусный эффект наблюдается при добавлении рибавирина спустя 2, 4 и 6 часов после инфицирования клеток Vero Е6.

Таким образом, использованная модель in vitro позволила впервые продемонстрировать выраженное противовирусное действия рибавирина в отношении вируса Батаи.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Терехин, Сергей Анатольевич, 2009 год

1. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. Д.К.Львов, С.М.Клименко, С.Я.Гайдамович и др. -М.: Медицина, 1989.

2. Арбовирусные инфекции. (Методическое письмо). / Под ред. Т.П.Пак // Душанбе, 1974. 16 с.

3. Букринская А.Г. Вирусология. М.: Медицина, 1986. - 336 с.

4. Гребенникова Т.В. Метод ПЦР в диагностике и мониторировании лечения инфекционных заболеваний // Методические указания для студентов медицинского факультета РУДН. М., 2005. - С.21-23.

5. Жданов В.М. Эволюция вирусов. М.: Медицина, 1990. - 374 с.

6. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т.Нго, Г.Ленхофф. М., 1988. -с. 172-242.

7. Константинова И.Д., Есипов P.C., Муравьева Т.И., Таран С.А., Веревкина К.Н., Гуревич А.И., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Способ получения 1-Р-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (Рибавирина). // Патент РФ № 2230118 от 21.08.2002.

8. Ю.Константинова И.Д., Леонтьева H.A., Галегов Г.А., Рыжова О.И., Чувиковский Д.В., Антонов К.В., Есипов P.C., Таран С.А., Веревкина

9. К.Н., Феофанов С.А., Мнрошннков А.И. Биотехнологический способ получения рибавирина. Действие рибавирина и некоторых его комбинаций на репродукцию вируса осповакцины (Vaccinia Virus) // Биоорганическая химия. — 2004. — Т.ЗО, № 6. — С.613-620.

10. П.Львов Д.К., Лебедев А.Д. Экология арбовирусов. М.: Медицина, 1974 -210 с.

11. Львов Д.К., Дерябин П.Г., Аристова В.А. и др. Атлас распространения возбудителей природно очаговых вирусных инфекций на территории Российской Федерации. М.: Изд-во НПЦ ТМГ МЗ РФ. - 2001.

12. Медицинская вирусология: Руководство / Под ред. Д.К.Львова. М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008.

13. М.Мельникова Е.Э. Реакция связывания комплемента в диагностике арбовирусных инфекций. // В сб.: Арбовирусы М - 1986 - с.140-146.

14. Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я. Краткий курс практической вирусологии. / Медгиз 1954 - Москва.

15. Рис Э., Стернберг М. Введение в молекулярную биологию. М.: Мир, 2002.-с. 19-24.

16. Ройзман Б. Размножение вирусов: общие представления. В кн.: Вирусология / Под ред. Б. Филдс, Д. Найп. М.: Мир, 1989. - с. 124137.

17. Рубахова Ю.В. Распространение арбовирусов в субтропической зоне Краснодарского края и их роль в патологии человека // Дисс. канд. мед. наук., Москва 1994 - 114 с.

18. Яскович Г.А., Яковлева Е.П. Микробиологический синтез виразола иммобилизованными клетками // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35, №27, С.146-149.

19. Akashi Н., Gay М., Ihara Т., Bishop D.H.L. Localised conserved regions of the S RNA gene products of bunyaviruses are revealed by sequence analyses of the Simbu serogroup Aino virus. // Virus research, 1984. Vol. 1. - p. 51-63.

20. Beaty В J., Sundin D.R., Chandler L.J. et al. Evolution of Bunyaviruses by genome reassortment in dually infected mosquitoes // Science. 1985 - Vol. 230.-p. 548-550.

21. Bardos. V. On the ecology of arboviruses in Czechoslovakia. // Vydav. SAV Bratislava, 1965-p.l98.

22. Barr J.N., Rodgers J.W., Wertz G.W. The Bunyamwera virus mRNA transcription signal resides within both the 3' and the 5' terminal regions and allows ambisense transcription from a model RNA segment. // J. Virol., 2005. Vol. 79. - p. 12602-12607.

23. Barr J.N., Wertz G.W. Bunyamwera bunyavirus RNA synthesis requires cooperation of 3'- and 5' terminal sequences. // J. Virol., 2004. Vol. 78. -p. 1129-1138.

24. Barr J.N., Elliott R.M., Dunn E.F., Wertz G.W. Segment- specific terminal sequences of Bunyamwera bunyavirus regulate genome replication. // Virology., 2003., Vol. 311. - p. 326-328.

25. Bishop D.H.L. Bunyaviridae and their replication. I. Bunyaviridae. In: Virology, 2nd edn, pp. 1155-1173. 1990.

26. Bishop D.H.L., Shope R.E. Bunyaviridae // Comprehensive virology/ Ed.H.Fraenkel-Conrat, R.R. Wagner. New York; London: Plenum press, 1979.-Vol. 14, ch. l.-p. 1-156.

27. Bishop D.H.L., Calisher C.H., Casals J. et al. Bunyaviridae // Intervirology. -1980.-Vol. 14.-p. 125-143.

28. Blakqori G., Van Knippenberg I., Elliott R.M. Bunyamwera orthobunyavirus S-segment untranslated regions mediate poly(A) tail independent translation. // J.Virol., 2009. Vol. 83(8). - p. 3637-3646.

29. Bridgen A., Weber F., Fazakerley J.K., Elliott R.M. Bunyamwera bunyavirus nonstructural protein NSs is a nonessential gene product that contributes to viral pathogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2001. -Vol. 98.-p. 664-669.

30. Briese T., Bird B., Kapoor V. et al. Batai and Ngari viruses: M segment reassortment and association with severe febrile disease outbreaks in East Africa//J. Virol.-2006.-Vol. 80.-No. 11.- p. 5627-5630.

31. Brown F. The classification and nomenclature of viruses: summary of results of meetings of the international commetee on taxonomy of viruses in Sendai, September, 1984 // Intervirology. 1986. - Vol. 25. - p. 141-143.

32. Brummer-Korvenkontio M. Batai (Calovo) arbovirus neutralizing antibodies in Finland // Ann. Med. Exp. Biol. Fenn. 1973. - Vol. 51. - No. 4. -p. 158161.

33. Butenko A.M., Lvov D.K., Kolobukhina L. Arboviruses of the genus Bunyavirus (family Bunyaviridae) and caused illnesses in the former USSR. // Sov. Med. Rev. E.: Virology reviews, 1993. Vol. 5. - p. 77-135.

34. Calisher C.H. Bunyaviridae. // Archives of Virology, 1991. suppl. 2. - p. 273-283.

35. Calisher C.H., Francy, D.B., Smith G.C. et al. Distribution of Bunyamvera serogroup viruses in North America // Amer. J. Trop. Med. Hyg. — 1986. -Vol. 35.-p. 429-443.

36. Calisher C.H., Petzman C.I., Muyh D J., Parsons M.A. Serodiagnosis of La Cross virus infection in humans by detections of immunoglobulin M class antibodies. //J. Clin. Microbiol. 1986. - Vol.23. - p. 667-671.

37. Casals J., Whitman L. A new group of arthropod-borne viruses. The Bunyamwera group // Am.J.Trop.Med.Hyg. 1960. Vol. 9. - p. 73-77.

38. Casals J., Brown L.V. Hemagglutination with arthropod-borne viruses. // J. Exp. Med., 1954. Vol. 99. - p. 429-499.

39. Casals J. Viruses: The versatile parasites. I. The arthropod-borne group of animal viruses. // Trans. N.Y. Acad. Sci., 1957. Vol. 19. - p. 219-235.

40. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Analytical Biochemestry, 1987. Vol. 162. - p. 156-159.

41. Cherry W.B. Immunofluorescence techniques. In: Manual of clinical microbiology, 3rd ed. / E.H.Lennette, A.Balows. Washington, D.C.: Am. Soc. Microbiol. - 1980. - p. 501-508.

42. Clarke D.U., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination-inhibition with arthropod-borne viruses // Ann. J. Trop. Med. Hyg. 1958. - N.7. - P.562-573.

43. Dunn E.F., Pritlove D.C., Elliot R.M. The S RNA genome segments of Batai, Cache Valley, Guaroa, Kairi, Lumbo, Main Drain and Northway bunyaviruses: sequence determination and analysis // Journal of General Virology, 1994. Vol. 75. - p. 597-608.

44. Elliott R.M. The Bunyaviridae: concluding remarks and future prospects. In: The Bunyaviridae. N.Y.: Plenum Press, 1996. - p. 295-332.

45. Elliott R.M. Nucleotide sequence analysis of the S RNA segment of Bunyamwera virus, the prototype of the family Bunyaviridae. // J. Gen. Virol., 1989/- Vol. 70. p. 1281-1285.

46. Elliott R.M. Nucleotide sequence analysis of the large (L) genomic RNA segment of Bunyamwera virus, the prototype of the family Bunyaviridae. // Virology, 1989. Vol. 173. - p. 426-436.

47. Elliott R.M., Molecular biology of the Bunyaviridae. // J. Gen. Virol., 1990. -Vol. 71.-p. 501-522.

48. Elliot R.M., McGregor A. Nucleotide sequence and expression of the small (S) RNA segment of Maguari bunyavirus. // Virology, 1989. Vol. 171. - p. 516-524.

49. Elliot R.M., Lees J.F., Watret G.E., Clark W., Pringle C.R. Genetic diversity of bunyaviruses and mechanisms of genetic variation. In: Mechanisms of Viral Pathogenesis: from Gene to Pathogen, 1984. p. 61-76.

50. Elliott R.M., Schmaljohn C.S., Collett M.S. Bunyaviridae genome structure and gene expression. // Current Topics in microbiology and immunology, 1991.-Vol. 169.- p. 91-141.

51. Fontana J., Lopez-Montero N., Elliott R.M., Fernandez J.J., Risco C. The unique architecture of Bunyamwera virus factories around the Golgi complex. // Cell Microbiol., 2008. Vol. 10. - p. 2012-2018.

52. Fu S.H., Sun X.H., Wang H.Y., Cao Y.X., Wang H.Q., Liu W.B., Tao S.J., Liang G.D. Molecular biological identification of Batai virus isolated in China. // Zhoghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi, 2005. -Vol. 19.-p. 331-334.

53. Gaidamovich S. Ya., Obukhova V.R., Vinograd A.I., Klisenko G.A., Melnikova E.E. Olyka an arbovirus of the Bunyamwera group in the USSR. // Acta. Virol., 1973. - Vol. 17. - p. 444.

54. Geevarghese G., Prasanna N.Y., Jacob P.G., Hanumaiah, Bhat H.R. Isolation of Batai virus from sentinel domestic pig Kolar district in Karnataka State, India. // Acta. Virol., 1994. Vol. 38. - p. 239-240.

55. Glukhov A.I., Trofimova M.E., Gordeev S.A. PCR amplification of phage lambda DNA sequences using thermostable DNA polymerase // Mol.Biol. -1991.-Vol. 25.-p. 1602-1610.

56. Hart T.J., Kohl M., Elliott R.M. Role of the NSs protein in the zoonotic capacity of Orthobunyaviruses. // Zoonoses Public Health, 2008.

57. Huang C., Slater B., Campbell W., Howard J., White D. Detection of arboviral RNA directly from mosquito homogenates by reverse-transcription-polymerase chain reaction. // J. Virol. Methods., 2001. Vol. 94.-p. 121-128.

58. Hubalek Z. Mosquito-borne viruses in Europe. // Parasitol Res., 2008. -Suppl. l.-p. 29-43.

59. Hubalek Z., Zeman P., Halouzka J., Juricova Z., Stovickova E., Balkova H., Sikutova S., Rudolf I. Mosquitoborne viruses, Czech Republic, 2002. // Emerg. Infect. Dis., 2005. Vol. 11. - p. 116-118.

60. Hunt A.R., Calisher Ch. Relationships of Bunyamwera group viruses by neutralisation // Am. J. Trop. Med. Hyg., 1979. Vol. 28. - p. 740-749.

61. Jin H., Elliott R.M. Characterization of Bunyamwera virus S RNA that is transcribed and replicated by the L protein expressed from recombinant vaccinia virus. // J. Virology, 1993. Vol. 67. - p. 1396-1404.

62. Juricova Z., Mitterpak J., Prokopic J., Hubalek Z. Circulation of mosquito-borne viruses in large-scale sheep farms in eastern Slovakia. // Folia Parasitol. (Praha)., 1986. Vol. 33. - p. 285-288.

63. Kaledin A.S., Slusarenko A.G., Gorodetskii S.I. Isolation and properties of DNA polymerase from extremely thermophilic bacterium Thermus rubber // Biokhimiya. 1981. - Vol. 47. - p. 1785-1791.

64. Karabatsos N. International Catalogue of arboviruses including certain other viruses of vertebrates. San Antonio: Amer. Soc. Trop. Med. Hyg., 1985. -1146 p.

65. Keegan K. and Collett M.S. Use of bacterial expression cloning to define the amino acid sequences of antigenic determinants on the G2 glycoprotein of Rift Valley fever virus // J. of Virology. 1986. - V.58, N2. - P.263-270.

66. Kemp DJ., Smith D.B., Foot S.J. Colorimetric detection of specific DNA segment amplified by polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - p. 2423-2427.

67. Kohl A., Hart T.J., Noonan C., Royall E., Roberts L.O., Elliott R.M. A Bunyamwera virus minireplicon system in mosquito cells. // J. Virol., 2004. -Vol. 78.,-p. 5679-5685.

68. Kohl A., Clayton R.F., Weber F., Bridgen A., Randall R.E., Elloitt R.M. Bunyamwera virus nonstructural protein NSs counteracts interferonregulatory factor 3-madiated induction of early cell death. // J. Virol., 2003., Vol. 77., - p. 7999-8008.

69. Lees J.F., Pringle C.R., Elliott R.M. Nucleotide sequence of the Bunyamwera virus M RNA segment: conservation of structural features in the bunyavirus glycoprotein gene product. // Virology, 1986. Vol. 148. - p. 1-14.

70. Leonard V.H., Kohl A., Hart T.J., Elliott R.M. Interaction of Bunyamwera Orthobunyavirus NSs protein with mediator protein MED8: a mechanism for inhibiting the interferon response. // J. Virol., 2006. — Vol. 80, № 19. — p. 9667-9675.

71. Leonard V.H., Kohl A., Osborne J.C., McLees A., Elliott R.M. Homotypic interaction of Bunyamwera virus nucleocapsid protein. // J. Virol., 2005. -Vol. 79.-p. 13166-13172.

72. Lowen A.C., Elliott R.M. Mutational analyses of the nonconserved sequences in the Bunyamwera Orthobunyavirus S segment untranslated regions // Virology. 2005. - Vol. 79. - No. 20. - p. 12861-12870.

73. Lundstrom J.O. Mosquito-borne viruses in Western Europe: a review. // J. Vector. EcoL, 1999. Vol. 24. - p. 1-39.

74. Maxam A.M., Gilbert W. A new method of sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Dei. USA. 1977. - Vol. 74. No. 2. - p. 560-564.

75. Mohl B.P., Barr J.N. Investigation the specificity and stoichiometry of RNA binding by the nucleocapsid protein of Bunyamwera virus. // RNA, 2009. -Vol. 15(3).-p. 391-399.

76. Moreli M.L., Aquino V.H., Figueiredo L.T. Identification of Simbu, California and Bunyamvera serogroup bunyaviruses by nested RT-PCR. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 2001. Vol. 95. - p. 108-113.

77. Mullis K.B., Falloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro a polymerase-catalysed chain reaction // Meth. Ensymol. 1987. - Vol. 155. - p. 335-349.

78. Nashed N.W., Olson J.G., el-Tigani A. Isolation of Batai virus (Bunyaviridae: Bunyavirus) from the blood of suspected malaria patients in Sudan. // Am. J. Trop. Med. Hyg., 1993. Vol. 48. - p. 676-681.

79. Nichol S.T., Beaty B.J., Elliott R.M. et al. Family Bunyaviridae. In: Virus Taxonomy. Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / Elsevier Academic Press, 2005. - p. 695-716.

80. Novoa R.R., Calderita G., Cabezas P., Elliott R.M., Risco C. Key Golgi factors for structural and functional maturation of bunyamwera virus. // J. Virol., 2005.-p. 10852-10863.

81. Osborne J.C., Elliott R.M. RNA binding properties of bunyamwera virus nucleocapsid protein and selective binding to an element in the 5' terminus of the negative-sense S segment. // J. Virol., 2000. Vol. 74. - p. 99469952.

82. Pavri K.M., Singh K.R.P. Activity of Chitoor virus in India. // Arboviruses of the California Complex and the Bunyamwera Serogroup. Publ .House SAS, Bratislava 1969 - 191-197.

83. Peiris J.S., Amerashinghe P.H., Amerashingle F.P., Calisher C.H., Perera L.P., Arunagiri C.K., Munasingha N.B., Karunaratne S.H. Viruses isolated from mosquitoes collected in Sri Lanka. // Am. J. Trop. Med. Hyg., 1994. -Vol. 51.-p. 154-161.

84. Pringle S.R. The universal system of virus taxonomy of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), including new proposals ratified since publication on the sixth report in 1995 // Arch. Virol. 1998. -Vol. 143.-p. 203-210.

85. Rossi C., Ksiazek T.G. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In: Manual of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome / H.W.Lee, C.Calisher, C.Schaljohn. Seoul, 1998. -p. 87-91.

86. Saiki R.K., Glcand D.N., Staffer S. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase // Sciene. 1988. - Vol. 293. -p. 487-491.

87. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Dei. USA. 1977. - Vol. 74. No. 12.-p. 5463-5467.

88. Schmaljohn C.S., Patterson J.L. Bunyaviridae and their replication. II. Replication of Bunyaviridae. In: Virology, 2nd edn, 1990. p. 1175-1194.

89. Shi X., Kohl A., Li P., Elliott R.M. Role of the cytoplasmic tail domains of Bunyamwera orthobunyavirus glycoproteins Gn and Gc in virus assembly and morphogenesis. // J. Virol., 2007. Vol. 81, № 18., - p. 10151-10160.

90. Shi X., Kohl A., Leonard V.H., McLess A., Elliott R.M. Requirement of the N-terminal region of orthobunyavirus nonstructural protein NSm forvirus assembly and morphogenesis. I I J/ Virol., 2006. Vol. 80, № 16. - p. 8089-8099.

91. Shi X., Elliott R.M. Analysis of glycoproteins of viruses in the family Bunyaviridae. // Methods Mol. Biol., 2007. Vol. 379. - p. 137-148.

92. Shi X., Brauburger K., Elliott R.M. Role of N-linked glycans on Bunyamwera virus glycoproteins in intracellular trafficking, protein folding and virus infectivity. // J. Virol., 2005. Vol. 79. - p. 19725-13734.

93. Shi X., Lappin D.F., Elliott R.M. Mapping the Golgi targeting and retention signal of Bunyamwera virus glycoproteins. // J. Virol., 2004. -Vol. 78.-p. 10793-10802.

94. Shope R.E. Arboviral zoonoses in Western Europe. In: Handbook of zoonoses. Section B: Viral / G.W.Beran, J.H.Steel Boca Raton: CRC Press, 1994.-p. 227-235.

95. Thomas D., Blakgori G., Wagner V., Banholzer M., Kessler N., Elliott R.M., Haller O., Weber F. Inhibition of the RNA polymerase II phosphorylation by a viral interferon antagonist. // J. Biol. Chem., 2004., -Vol. 279.-p. 31471-31477.

96. Turkovic B., Brudnjak Z. Natural foci of some viral zoonoses in Croatia. //Acta. Med. Croatica., 1999. Vol. 53. - p. 195-198.

97. Villarreal L.P. Viruses and the evolution of life. Washington: ASM Press,2005.-p. 89-115.

98. Viljoen G.J., Nel L.H., Crowther J.R. Molecular diagnostic PCR handbook. -IAEA, 2005.

99. Virus Taxonomy. Eight Report of the International Commetee on Taxonomy of Viruses / C.M.Fauquet, M.A.Mayo Elsevier Academic Press, 2005. -1259 p.

100. Weber F., Bridgen A., Fazakerley J.K., Streiterfeld H., Kessler N., randall R.E., Elliott R.M. Bunyamwera bunyavirus nonstructural protein NSs counteracts the induction of alpha/beta interferon. // J.Virol., 2002. Vol. 76.-p. 7949-7955.

101. Yadav P.D., Mishra A.C., Mourya D.T. Molecular characterization of Umbre virus (Bunyaviridae) // Virology Journal, 2008. Vol. 5. - p. 115.

102. Yanase T., Kato T., Yamakawa, Takayoshi K., Nakamura K., Kokuba T., Tsuda T.M. Genetic characterization of Batai virus indicates a genomic reassortment between ortobunyaviruses in nature // Arch. Virol., 2006. -Vol. 151.-p. 2253-2260.