Микробиологический синтез никотинамидадениндинуклеотида и 2-С-метил-D-эритритол-2,4-циклодифосфата коринеподобными бактериями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Санданов, Александр Андреевич

• Санданов, Александр Андреевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Санданов, Александр Андреевич

Актуальность темы.

Цель работы:.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Структура и физико-химические свойства и применение НАД.

1.2 Роль НАД в биохимических реакциях в клетке и его применение.

1.3 Пути биосинтеза и распада НАД у микроорганизмов.

1.3.1. De novo синтез НАД.

1.3.2. Salvage синтез НАД.

1.4 Физиологическое и прикладное значения salvage синтеза НАД.

1.5 Методы получения НАД. а) Метод получения никотинамидных коферментов выделением их из животных тканей.

1.5.1. Микробиологические методы получения НАД.

1.5.2. Условия проведения ферментационного процесса получения НАД при использовании штамма-продуцента СогупеЬаіїегіит ammoniagenes АТС С 6872.

1.5.3. Коринеподобные бактерии. Штаммы-продуценты НАД и других нуклеотидов.

1.5.4. Методы выделения и очистки НАД.

1.5.5. Достоинства Salvage синтеза.

1.6 Микробиологический синтез 2-С-метил-0-эрнтритол-2,4-циклодифосфата (МЭЦ).

1.6.1. Химическая структура и функции МЭЦ.

1.6.2. 2-С-метилэритрофосфатный путь (МЭФ-путъ) биосинтеза изопреноидов. Прикладные аспекты.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Микробиологический синтез никотинамидадениндинуклеотида и 2-С-метил-D-эритритол-2,4-циклодифосфата коринеподобными бактериями»

Актуальность темы. В настоящее время в России модернизация промышленности и науки является актуальной проблемой, в решении которой первостепенное значение отводится биотехнологии.

Одной из важнейших задач модернизации является совершенствование технологии получения биологически активных веществ.

Никотинамидадениннуклеотид (НАД), метилэритритолциклопирофосфат (МЭЦ), являются ценнейшими лекарственными препаратами, субстанциями-для фармакологической промышленности, и реактивами для химических производств и научных исследований.

НАД является одним из основных метаболитов клетки, применяется в медицине как лекарство-иммуномодулятор, при лечении и профилактике болезней, как реактив и компонент диагностикумов. МЭЦ может быть использован в качестве предшественника при получении новых антибиотиков, лечения различных заболеваний. МЭЦ также может использоваться для оживления дормантных клеток в случае их применения в качестве продуцента в биотехнологии.

В настоящее время производство НАД и МЭЦ в> России отсутствует. Применяемые за рубежом методы получения НАД' и МЭЦ (методы экстракции из биомассы) имеют низкий выход целевого продукта, высокую стоимость, например стоимость МЭЦ составляет 400$ за 1 мг. Наиболее перспективным методом их получения является микробиологический синтез. Небходимо отметить, что практическое исполнение микробиологического синтеза НАД и МЭЦ имеет очевидные трудности, связанные, главным образом, с недостатком и несовершенством предложенных штаммов-проуцентов НАД и> методов его получения.

Цель работы: Поиск биологических объектов для микробиологического синтеза НАД и МЭЦ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать в качестве биологических объектов для микробиологического синтеза НАД и МЭЦ различные штаммы коринеподобных бактерий и отобрать наиболее приемлемые для биотехнологии организмы.

2. Оптимизировать для микробиологического синтеза НАД состав питательной среды.

3. Осуществить химическую очистку и выделение НАД из культуральной жидкости коринеподобных бактерий.

4. Выделить МЭЦ из клеток штамма-продуцента и исследовать способность МЭЦ к реактивации дормантных форм бактерий.

Научная новизна: Нроведен поиск штаммов продуцентов из группы коринеподных бактерий, способных к синтезу НАД и МЭЦ. Установлены наиболее перспективные штаммы-продуценты С; ашшопаіа§епез ВСТИ 404, С. Пауит ВСТИ 301. Исследованы закономерности «оживления» дормантных клеток, обнаружено участие МЭЦ в переходе дормантных клеток из состояния «некультивируемости» в состояние активного роста, что говорит о новой функции МЭЦ.

Изучен химический состав супернатанта культуральной жидкости С. аттоша§епез ВСТИ 404, разработан метод химической очистки и выделения НАД.

Практическая значимость: Предложены принципиальные технологические схемы микробиологического синтеза НАД с использованием С. аттопіа§епез ВСТИ 404, МЭЦ - С. йауит ВСТИ 301, и оптимизированных ферментационных сред. Впервые предложена технологическая схема сочетающая в себе биосинтезы НАД и МЭЦ в одном цикле производства.

Результаты полученные в ходе работе над диссертацией будут использоваться при преподавании биотехнологии и микробиологии.

Методом математического планирования экспериментов установлены оптимальные параметры синтеза НАД с помощью С. агштюпіа§епез ВСТИ 404: ферментационная среда следующего состава: глюкоза - 8,8%, мочевина -0,5%, К2НР04 - 0,71%, КН2Р04 - 0,71%, дрожжевой экстракт - 1,2%, MgS04-7H20 -1,4%,, биотин - 30 мкг/л, пептон - 0,2%, Са-пантетонат - 10 мг/л, и рН 7.0; время внесения предшественников и цетилпиридинийхлорида составляет 24 часа от начала ферментации, продолжительность процесса ферментации 39 часов.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на: пятом международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2009, 2011 г); международных конференциях «Системная биология» (Филиала института биоорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина., г. Пугцино, май 2009 г), "Качество как условие повышения конкурентоспособности и путь к устойчивому развитию" (ВСГТУ, июль 2009 г.), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология в целях экономики и экологии Сибири и Дальнего Востока» (Сентябрь 2010).

Публикации: 13 наименований, в том числе 4 в реферируемых изданиях из списка ВАК, 2 зарубежных.

Структура и объем работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методик проведения экспериментов и анализов, экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы (144 наименований, в том числе 126 на иностранных языках) и приложений. Работа изложена на 127 стр. машинописного текста и содержит 16 таблиц, и 32 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Санданов, Александр Андреевич

1.9.8. Выводы.

1. Для осуществления ' микробиологического синтеза никотинамидадениндинукпеотида (НАД) методом ферментации отобран штамм продуцент Corynebacterium ammoniagenes ВСТИ 404, для микробиологического синтеза 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклодифосфата (МЭЦ) - штамм Corynebacterium flavum ВСТИ 301.

2. Методом математического планирования экспериментов установлены оптимальные параметры синтеза НАД с помощью С. ammoniagenes ВСТИ 404: ферментационная среда следующего состава: глюкоза - 8,8%, мочевина -0,5%, К2НР04 - 0,71%, КН2Р04 - 0,71%, дрожжевой экстракт - 1,2%, Мё804-7Н20 -1,4%,, биотин — 30 мкг/л, пептон - 0,2%, Са-пантетонат - 10 мг/л, и рН 7.0; время внесения предшественников и цетилпиридинийхлорида составляет 24 часа от начала ферментации, продолжительность процесса ферментации 39 часов.

3. Изучен химический состав супернатанта культуральной жидкости С. ammoniagenes ВСТИ 404, разработан метод химической очистки и выделения НАД.

4. Предложены технологические схемы синтеза НАД и МЭЦ с помощью С. ammoniagenes ВСТИ 404 и С. Ааушп ВСТИ 301, а также технологическая схема синтеза этих соединений с помощью С. ammoшagenes ВСТИ 404 в одном цикле производства.

5. Установлена новая функция МЭЦ, заключающаяся в способности переводить «некультивируемые» (дормантные) клетки в состояние активного роста. Данное свойство МЭЦ может быть использовано для активизации культур микроорганизмов для решения задач биотехнологии и экологии.

Выражаю искреннюю признательность и благодарность главному научному сотруднику Института биохимии им. А.Н. Баха доктору биологических наук, профессору Островскому Дмитрию Николаевичу за большую помощ в освоении методов современной аналитической биохимии и обсуждении результатов исследования.

Александр Санданов.

1.9.7. Заключение

Низкомолекулярные метаболиты микробной клетки являются важнейшими целевыми продуктами современной биотехнологии. К их числу относятся НАД и МЭЦ, которые имеют большие перспективы в качестве лекарств, компонентов диагностикумов и реактивов.

Для получения НАД и МЭЦ предложено несколько методов - химических, бйологических, среди которых наиболее перспективным является метод микробиологического синтеза.

В данной работе для получения НАД использовали микробиологический синтез в котором в качестве основного биологического объекта для проведения этого биосинтеза избраны коринеподобные бактерии, которые являются наиболее универсальными организмами и способны образовывать самые различные нуклеотиды, нуклеотидные коферменты (в том числе НАД), но что особенно важно - синтезируют МЭЦ, ключевой метаболит недавно обнаруженного пути синтеза изопреноидов.

В качестве биологических объектов для разрабатываемой биотехнологии мы использовали наиболее известные штаммы-продуценты нуклеотидов С. ammoniagenes АТСС 6872, и наряду с ним, ранее выделенный из природных источников штаммы — продуценты С. ammoniagenes ВСТИ 403, С. йауит ВСТИ 301, а также отдельные штаммы типовых культур из группы коринеподобных бактерий.

Осуществлены конкурсные испытания этих культур для установления перспективной культуры в качестве штамм-продуцента, обеспечивающего наиболее высокий и стабильный выход НАД и МЭЦ.

Для оптимизации питательной среды, как наиболее важного фактора для увеличения выхода целевого продукта при микробиологическом синтезе различных

БАВ, в том числе нуклеотидов и нуклеотидных коферментов, применили метод математического планирования эксперимента.

Для дальнейших работ нами были отобраны штаммы С. Аттоша§епез ВСТИ 403. Данный организм, как ранее было показано [Цыренов, 1990]. представляет собой марганец не чувствительный штамм-продуцент нуклеозидфосфатов, способный осуществлять биосинтез в водопроводной и дистиллированной воде, без дополнительной ее обработки. Этим свойством он выгодно отличается от С. аттог^^епея АТСС 6872, который осуществляет высокоэффективный биосинтез нуклеотидов и нуклеозидов (в частности инозиновой кислоты) при очень низких концентрациях ионов марганца. Другим преимуществом С. ammoniagenes ВСТИ 403 является более выраженная и стабильная биосинтетическая активность, что было установлено в работах по оптимизации питательных сред.

При оптимизации питательной среды в качестве источников основных питательных веществ и факторов роста испытаны дрожжевой экстракт, гидролизат рыбной муки, гидролизат БВК. Наиболее хорошие результаты в микробиологическом синтезе НАД получены при добавлении дрожжевого экстракта. В состав питательной среды также вносили цетилпиридиний хлорид, который изменяет проницаемость мембран клеток и способствует экскреции метаболитов, и в конечном счете усиливает эффективность биосинтеза. Методом математической оптимизации достигали выхода НАД в культуральной жидкости С. аттог^епез ВСТИ 403 4,8-5,1 мг/мл.

В настоящее время особую актуальность для фармацевтической биотехнологии имеет исследование вопросов, касающихся микробиологического синтеза МЭЦ — ключевого метаболита недавно открытого немевалонатного пути анаболизма изопреноидов и вещества, перспективного для создания антибиотиков нового поколения.

Впервые нами проведен скрининг на продуцирование МЭЦ различными штаммами коринеподобных бактерий. Установлен наиболее перспективный штаммпродуцент - С. flavum ВСТИ 301. Из клеток этого штамма удалось получить препарат МЭЦ в небольших количествах и использовать его в научных работах по поиску новых функций этого соединения. Мы предположили, что МЭЦ участвует в реактивации (оживлении) некультивируемых (дормантных) клеток, что имеет большое значение в микробиологических синтезах для регуляции биологической активности штаммов-продуцентов. В качестве модели мы использовали культуру дормантных клеток Mycobacterium smegmatis . Показано впервые, что добавка в среду для реактивации чистого МЭЦ приводила к восстановлению способности у упомянутого выше организма к росту.

Предложена приниципиальная схема микробиологического синтеза НАД и МЭЦ на основе применения в качестве биообъектов экспериментально отобранных штаммов-продуцентов из группы коринеподобных бактерий. Так же предложена схема биосинтеза НАД и МЭЦ в одном цикле производства, что призвано будет существенно улучшить экономичность процесса микробиологического синтеза, выделения и химической очистки и безотходность производства препаратов указанных метаболитов. (что будет способствовать снижению себестоимосиъ продуктов и образованию меньшего количества отходов и сточных вод в процессе производства)

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Санданов, Александр Андреевич, 2011 год

1. Амагаева A.A. Разработка технологических методов получения нуклеозидных и нуклеотидных коферментов: Канд. дисс. М.: 1976.

2. Ангаев С.Б., Соктоев СЛ., Дульянинова Н.Г., Цыренов В.Ж. Потребление глюкозы и синтез нуклеотидных соединений штаммом-продуцентом Corynebacterium amnonlagenes ВСГИ 404 // Известия СО РАН, Сибирский биологический журнал. 1992. - вып. 5. - с. 19-23.

3. Баздырева Н.М., Подлепа Е.М., Тулошноеа Л.В. Синтез никотинамида из экзогенных предшественников. Свойства и регуляция ферментов // Прикл. Биохим. Микробиол. 1994. - 30, 6. - 741-58.

4. Баздырева Н.М, Kyifeea JJ.C. Влияние поверхностно-активного вещества — N-цетилпиридиний-хлорида на биосинтетическую способность Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872, продуцента НАД // Прикл. Биохим. и Микробиол. 1984. - 20,3. - С. 334 - 339.

5. Барышникова И.М., Санданов Ч.М., Монахова Е.В., Головлев Е.А. Дифференциация родов коринеподобных бактерий, синтезирующих аминокислоты и нуклеотиды // Микробиология. 1982. - т. 51, Вып. I. - с. 125129:

6. Безбородое A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза Для вузов по спец. "Технология микробиол. пр-в". М.: Лег. и пищ. пром-сть, 1984.-304 с.

7. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию Рига: Звайгоне, 1978.

8. Бутуханов В.Д., Бобык М.А., Цыренов В.Ж., Кулаев PI. С. Изучение возможной роли высокомолекулярных полифосфатов в синтезе АТР из экзогенного аденина культурой Corynebacterium species, штамм ВСТИ 301 // Биохимия. -1979. Т. 44, вып. 7. - С. 1321 - 1328.

9. Бельков В.В. Порожденные генной инженерией // Природа. 1994. - 10, - С. 17-24.

10. Венкстерн Т.В., Баев A.A. Спекры поглощения минорных компонентов и некоторых олигонуклеотидов рибонуклеиновых кислот -М.: Наука, 1967,

11. Демина Г.Р., Плешакова О.В., Сибельдина Л.А., Харатьян Е.Ф., Щипанова И.Н., Островский Д.Н. Стабильность нового продукта окислительного стресса в клетках бактерий. // Биохимия. 1995. - 60,4. - с. 661-668.

12. Дульянинова Н.Г., Подлепа Е.М., Радина В.П., Цыренов В.Ж., Быховский В.Я. Регуляция никотинат-фосфорибозилтрансферазы из Brevibacteriumammoniagtnes АТСС 6872 // Прикл. биохимия и микробиол. 1997. - 33, 1. - С. 18-23.

13. Ершов Ю.В. 2-С-метилэритрофосфатный путь биосинтеза изопреноидов как мишень при поиске новых антибиотиков, гербицидов и иммуномодуляторов //Прикл. Биохим. и Микробиол. 2007. - том 43, № 2. - с. 133-157.

14. Зелтянухин A.A. Малый практикум по биохимии Учеб. пособие для биол. спец. вузов. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1985. - 128 с.

15. Инегиина Е.Г., Цыреиов В.Ж. Исследование физиолого-биохимических особенностей кулыуры рода Arthrobacter продуцента гуаниновых нуклеотидов // Микробиологическая промышленность. - 1979. - № 1, - С. 45.

16. Лысак Е.И., Огрель О.Д., Харатьян Е. Ф.~, Щипанова И.Н., Островский Д.И. Связь синтеза нового компонента стрессорной реакции с метаболизмом бактериальной клетки. //Микробиология. 1995. - т. 64, - с. 437 - 441.

17. Мейбаум В.В. Определение пентоз в нуклеотидах и нуклео-зидах посредством реакции Биаля. //Биохимия. 1945. - 10,4. - С. 353-359.

18. Мукалюлова Г.В., Янг М., Келл Д.Б., Капрелъянц A.C. Бактериальные феромоны и клеточное деление. // Успехи биол. химии. 1999. - Т. 39., - С. 225-254.

19. Островский Д.Н, Лысак ЕЖ, Демина Г.Р., Бинюков ВЖ. Взаимодействие бактерий с ртутными соединениями // Микробиология. 2000. - т.69, № 5. - с. 620-628.

20. Островский Д.Н. Новые участники окислительного стресса у бактерий // Усп. биол. химии. -1997. т. 37, - с. 147 - 169.

21. Островский Д.Н., Щгтанова H.H., Сибелъдина Л.А., Степанов С.Н., Харатъян Е.Ф., Шумаев КБ. II Докл. Акад. Наук СССР. 1991. - 320, - 477480.

22. Островский Д.Н., Лысак Е.И., Сибелъдина Л.А., Харатъян Е. Ф., Щипанова H.H. Новым участником теплового шока некоторых бактерий является 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфат. // Доклады РАН. 1994. - Т. 337, -С. 687-689.

23. Островский Д.Н. Окислительный стресс и органический пирофосфат у бактерий//Биохимия. 1995. - т.60, вып. 1.-е. 14-20.

24. IJapiotceea Р.А.-Х, Красноштанова A.A., Крылов PI.А. Количественные закономерности процесса экстракции никотинамидных коферментов из биомассы пекарских дрожжей. // Химическая технология. 2005. - №11. - С. 16-21.

25. Парилсева Р.А.-Х. Исследование процесса ионообменного выделения восстановленных никотинамидных коферментов из водно-щелочного экстракта пекарских дрожжей. // Успехи в химии и химической технологии. -2005. XIX, №5. - с. 67-70.

26. Насеитиченко В.А. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов М.: ВИНТИ, 1987.

27. Санданов Ч.М., Ероишна И.В., Цыренов В Ж. Изучение метаболическогомеханизма синтеза адениновых нукпеотидов из эк-зогенного аденинау коринеморфных бактерий //Микробиология. 1981. - т. 50, вып. 6. -с. 1053-1056.

28. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии 2 - Москва: Издательство Московского университета, 1989. - 509

29. Тулохонова Л.В., Ваздырева Н.М., Подлепа ЕМ., Цыренов В.Ж. Влияние НАД и НАДФ на фосфориллирование АМФ бесклеточными экстрактами Bravibacterium ammonagenes АТСС 6872 // Прикл. Биохим. и Микробиол. -1992. т.23, №4. - с. 591-597.

30. ХоултД.Г., Заварзин Г.А., Беркли Р. Определитель бактерий Берджи В 2 т. М.:Мир, 1997. 429,1. с.

31. Цыренов В.Ж., Ракгиаина М.Ц., Алюгаева A.A. Биосинтез нуклеотидов у штамма Bac.Subtilis // Тез. Докл. Всесоюзной конференции по регуляции биохимическиих процессов у микроорганизмов. Пущино-на-Оке. 1972. - - с. 175-178.

32. Цыренов В.Ж. Микробиологический синтез нуклеозидфосфатов М.: Наука, 1990. - 199 с.

33. Щипанова H.H., Харатъян H.H., Сибелъдина Л.А., Огрелъ О.Д., Островский Д.Н. О природе нового макроэрга, возникающего у бактерий в ответ на окислительный стресс // Биохимия. 1992. - №57, вып.6. - с.862-871.

34. Abbouni В., Elhariry HM., Aiding G. Overproduction of NAD+ and 5'-inosine monophosphate in the presence of 10 microM Mn2+ by a mutant of

35. Corynebacterium ammoniagenes with thermosensitive nucleotide reduction (nrd(ts)) after temperature shift//Arch Microbiol. 2004. - 182,2-3. - 119—05.

36. AbdelRaheim S.R., Cartwright J.L., Gasmi L., McLennan A.G. Th.es NADH diphosphatase encoded by the Saccharomyces cerevisiae NPY1 nudix hydrolase gene is located in peroxisomes // Arch Biochem Biophys. 2001. - 388, 1. — 18-24.

37. Agarwal R.P., Parks R.E., Jr. Purine nucleoside phosphorylase from human erythrocytes. IV. Crystallization and some properties // J Biol Chem. 1969. - 244, 4. - 644-7.

38. Atkinson M.R., Jackson J.E, Morton R.K. Nicotinamide mono nucleotide adenylyltransferase of pig-liver nuclei. The effects of nicotinamide mononucleotide concentration and pH on dinucleotide synthesis // Biochem J. 1961. - 80, — 318-23:

39. Aiding G., Follmann H. Manganese-Dependent Ribonucleotide Reduction and Overproduction of Nucleotides in Coiyneform Bacteria New York:: Dekker, 1994.

40. Barksdale L. Corynebacterium diphtheriae and its relatives // Bacteriol'Rsiv. 1970. -34,4.-378-422.

41. Belenky P., Bogan K.L., Brenner C. NAD+ metabolism in health and disease // Trends Biochem Sci. 2007. - 32,1. - 12-9.

42. BrinkrolfK., Brune l, Tauch A. The transcriptional regulatory network of the amino acid producer Corynebacterium glutamicum // J Biotechnol. 2007. - 129, 2. - 191211.

43. Burdett A.S., Stevens M.M., Macmillan D.L. Laboratory and field studies on the effect of molinate, clomazone, and thiobencarb on nontarget aquatic invertebrates // Environ Toxicol Chem. 2001. - 20, 10. - 2229-36.51