Биотехнология бактериальной целлюлозы с использованием штамма - продуцента Gluconacetobacter hansenii GH - 1/2008 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Фан Ми Хань

• Фан Ми Хань
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фан Ми Хань

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ: ПРОДУЦЕНТЫ, БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

1.1 Характеристика бактериальной целлюлозы

1.2 Продуценты бактериальной целлюлозы

1.3 Механизм синтеза бактериальной целлюлозы

1.4 Культивирование продуцентов бактериальной целлюлозы

1.5 Применение бактериальной целлюлозы

1.6 Целлюлоза и её производные как пищевые добавки

2 ОБЪЕКТЫ, СХЕМЫ ПОСТАНОВКИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Характеристика объектов исследования

2.2 Методы выделения продуцента бактериальной целлюлозы

2.3 Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств продуцента бактериальной целлюлозы

2.4 Идентификация штамма до вида с помощью анализа 16э рРНК

2.5 Оценка влияния рН на продуктивность бактериальной целлюлозы штамма при поверхностном культивировании

2.6 Подбор питательных сред для оценки продуктивности штамма ОЫсопасеЮЪа^ег катепи

2.7 Оптимизация условий биосинтеза бактериальной целлюлозы в стационарных и глубинных условиях культивирования штамма

2.8 Статистическая обработка полученных результатов

2.9 Оценка влияния растворенного кислорода на продуктивность бактериальной целлюлозы

2.10 Исследование наноструктуры бактериальной целлюлозы

2.11 Исследование химической структуры бактериальной целлюлозы

2.12 Исследование физико-химических свойства варенной колбасы, содержащей бактериальную целлюлозу

3 ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

3.1 Скрининг продуцента бактериальной целлюлозы

3.2 Изучение культурально-морфологических признаков и идентификация продуцента полимера

3.3 Культивирование штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008

3.4 Влияние растворенного кислорода и состава питательной среды на продуктивность бактериальной целлюлозы

4 ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСТРУКТУРЫ, ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЛЕНОК БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

5 ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

5.1 Разработка способов сушки и получения порошка бактериальной целлюлозы

5.2 Использование бактериальной целлюлозы в технологии мясных продуктов на примере вареных колбас

5.3 Исследование адсорбционных свойств пленок бактериальной

целлюлозы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А (обязательное)

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (дополнительное)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнология бактериальной целлюлозы с использованием штамма - продуцента Gluconacetobacter hansenii GH - 1/2008»

ВВЕДЕНИЕ

Целлюлоза - природный полимер - синтезируется не только растениями, но и грибами, водорослями и бактериями. В структурах клеток бактерий она очень редко встречается, а является основным компонентом клеточных стенок растений и содержится в древесине, оболочках семян. Макромолекулы целлюлозы построены из элементарных звеньев D-глюкозы, соединённых 1,4-р-гликозидными связями в линейные неразветвлённые цепи. Полимерные цепи клетчатки соединены в более крупные структуры -микрофибриллы. Длина полимерных цепей у целлюлозы различается и зависит от природы продуцентов. Особого внимания заслуживает бактериальная целлюлоза, отличающаяся рядом уникальных свойств, благодаря которым она уже используется в различных отраслях народного хозяйства в мировой практике.

В пищевой промышленности бактериальная целлюлоза уже широко используется в виде порошка как общепринятая безопасная добавка (GRAS -Generally Regarded As Safe) - пищевой ингредиент. Добавление небольшого количества бактериальной целлюлозы в продукты придает хорошую стабильность дисперсии и суспензии, а также при употреблении продукта, благодаря хорошему сохранению формы, короткое ощущение наполненности во рту [1]. Однако возможности использования свойств бактериальной целлюлозы еще не исчерпаны.

В последние годы были выделены продуценты внеклеточной бактериальной целлюлозы, большинство из которых относятся к семейству Acetobacteriaceae. Бактерии этого семейства синтезируют внеклеточную целлюлозу, что позволяет легко её отделять от клеток и использовать в различных направлениях. В семействе Acetobacteraceae особого внимания заслуживают продуценты рода Gluconacetobacter: Gluconacetobacter xylinus, Gluconacetobacter hansenii, Gluconacetobacter kombuchae, Gluconacetobacter intermedius и др.

Многие авторы рекомендуют для промышленного получения бактериальной целлюлозы штаммы вида аисопасеЮЬаМег хуИпт [2, 41]. Характеристика морфолого-культуральных свойств, биохимия и генетики, условий культивирования продуцентов этого вида достаточно хорошо изучены. Разработан состав питательных сред для их культивирования. Однако сведений по исследованию и использованию штаммов других видов рода аисопасе^ЬаЫег, как продуцентов бактериальной целлюлозы, в мировой литературе мало, а в России такие данные отсутствуют. Кроме этого, в мировой литературе мало информации о виде С1исопасе(оЬа&ег катепи, штаммы которого синтезируют не только бактериальную целлюлозу, но и олигомер глюкуроновой кислоты.

С развитием науки, такие штаммы будут играть очень важную роль в развитии различных современных отраслей, в получении новых полимеров для применения в том числе и в нанотехнологии и для создания новых материалов.

Бактериальная целлюлоза, синтезируемая штаммами вида & катепи, не изучена по химическому составу, структуре связей и типу целлюлозы, физико-химическим свойствам. Свойства бактериальной целлюлозы, синтезируемой представителями различных видов, могут отличаться, поэтому их исследование у продуцентов необходимы для оценки возможности их использования в практике.

Цель работы: выделение продуцента бактериальной целлюлозы 01исопасе1оЪас1ег Иатепи и исследование закономерностей его роста при культивировании; исследование свойств бактериальной целлюлозы и оценка возможности её использования.

В задачи исследований диссертационной работы входило: выделение нового штамма С1исопасеюЬас(ег ярр.: ^ изучение его микро и макроморфологических, физиологических, культуральных свойств, проведение молекулярно-генетической идентификации;

^ изучение продуктивности бактериальной целлюлозы у штамма аисопасе^Ьа^ег катепи в поверхностных и глубинных условиях культивир ования;

разработка оптимальных условий для роста и биосинтеза полимера бактериальной целлюлозы штамма С1исопасе1оЪас1ег катепп ОН-1/2008 в поверхностных и глубинных условиях культивирования; ^ изучение влияния концентрации растворенного кислорода и этанола на биосинтез бактериальной целлюлозы в условиях поверхностного культивирования продуцента аисопасе^Ьа^ег катету, ^ исследование наноструктуры, биохимического состава и физико-химических свойств пленок бактериальной целлюлозы, полученных при культивировании штамма в поверхностных условиях; ^ разработка способа получения порошка бактериальной целлюлозы. ^ оценка возможности использования бактериальной целлюлозы как

пищевой добавки в технологии вареных колбас; ^ исследование способности пленок бактериальной целлюлозы адсорбировать антимикробные соединения - антибиотики и нано серебро, и оценка их антимикробных свойств.

Научная новизна работы.

Методом многоступенчатого скрининга выделен новый продуцент бактериальной целлюлозы ОН-1/2008. На основании исследований микроморфологических, культуральных, физиологических свойств и молекулярно-генетического анализа установлена его принадлежность к виду Ыисопасе1оЬас1ег катепи.

При исследовании твёрдотельных спектров методом ядерного магнитного резонанса КП ВМУ 13С впервые показано, что полимер, синтезируемой продуцентом 01исопасе1оЪас1ег катепи, содержит в основном целлюлозу 1а и значительно меньше 10. В основной цепи молекулы мономер в полимере имеет (3-1,4 связь. Нативный полимер содержит 97 %

влаги, 2,85 % целлюлозы, белка, липидов и нуклеиновых кислот - 0,15 %.

6

Методом атомно-силовой микроскопии показано, что бактериальная целлюлоза, синтезируемая штаммом С1исопасе^Ьас1ег казепи, имеет сеть микробрилл с диаметром от 15-20 нм и макрофибрилл с диаметром 50 - 100 нм, и длиной от 1 - 9 цм, высокую степень кристалличности, которая обеспечивает её влагоудерживающую способность, эластичность и прочность.

Показано, что при поверхностном культивировании в оптимальных условиях (рН и состав среды) продуктивность бактериальной целлюлозы штамма вН-1/2008 составляет 28,8 г/л, что превышает этот показатель у других штаммов С1исопасе1оЬа^ег Иатепп, синтезирующих целлюлозу.

Установлено, что количество растворенного кислорода в питательной среде от 1,5 до 3,0 мг/л является оптимальным для роста и инициации биосинтеза бактериальной целлюлозы штаммом & катепп ОН-1/2008.

Практическая значимость работы.

Выделенный штамм 01исопасе1оЪас1ег катепп вН-1/2008 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов с коллекционным номером ВКПМ В-10547 как продуцент для получения бактериальной целлюлозы в промышленных масштабах.

Подобрана оптимальная питательная среда для культивирования штамма 01исопасе1оЬас1ег катепп вН-1/2008 следующего состава, %: сахарозы - 7, густого кокосового молока - 0,1, дрожжевого экстракта - 0,5, №2НР04 - 0,27, К2НР04 - 0,2, (МН4)2804 - 0,3, моногидрата лимонной кислоты - 0,115, спирта - 0,5, рН = 4,0.

Экспресс-метод оценки количества растворенного кислорода может быть использован для разработки состава питательной среды для биосинтеза бактериальной целлюлозы штаммами аисопасе^Ьааег каьепи.

Разработан способ получения порошка бактериальной целлюлозы с хорошими технологическими и функциональными свойствами. Наработаны партии препарата бактериальной целлюлозы и проведены испытания её в технологии продукта вареной колбасы, которые показали преимущество

7

использования бактериальной целлюлозы в сравнении с растительной целлюлозой.

Доказано, что пленки бактериальной целлюлозы & катепп ОН-1/2008 с абсорбированными антибиотиками и наносеребром обладают антимикробными свойствами и могут быть рекомендованы для разработки покровных материалов для лечения раневых инфекций.

Апробация работы.

Основные положения работы и результаты исследований представлены на конкурсах и конференциях: 10-ой юбилейной Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ (Москва, 2010); V фестивале науки (Москва, 2010); конкурсе молодых ученых VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); X Международной научно-практической конференции с международным участием «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012); IX международной научно -практической конференции «Технологии и продукты здорового питания, Москва, 2012, II Международной научно-практической Интернет -конференции "Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы". Казань, 2013.

Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов: АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)»; проектов № 4209 и № 9353 «Коллекция культур бактерий, бактериофагов, дрожжевых и мицелиальных грибов как база образовательного процесса, сохранения биоразнообразия и создания новых биотехнологий»; госконтракта П175 в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг; гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ; тема № 16.120.11.3245.-НШ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ: ПРОДУЦЕНТЫ, БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

1.1 Характеристика бактериальной целлюлозы

Бактериальная целлюлоза - уникальный полимер, редко встречающийся у прокариотов. В структурах клеток бактерий целлюлоза не синтезируется, так как основными компонентами клеточных стенок у бактерий являются пептидогликан (у грамположительных) и липополисахариды (у грамотрицательных). Целлюлоза является основным компонентом клеточных стенок растений и содержится в древесине, оболочках семян, в морских водорослях. Макромолекулы целлюлозы построены из элементарных звеньев Б-глюкозы, соединённых 1,4-Р-гликозидными связями в линейные неразветвленные цепи [3].

Структура бактериальной целлюлозы очень похожа на структуру целлюлозы растений, но различна по числу глюкозных остатков, а, следовательно, степенью полимеризации мономеров. Так, для целлюлозы волосков хлопчатника степень полимеризации первичной клеточной стенки равна 2-6 тыс., вторичной - 13-14 тыс., для целлюлозы С1исопасе^Ьас1ег хуНпия -2-6 тыс.; для древесины - 8 - 10 тыс. остатков [3].

С помощью рентгеноструктурного анализа установлено, что молекулы бактериальной целлюлозы имеют нитевидную форму. Эти нитевидные молекулы объединяются в мицеллы и формируют микрофибриллы с диаметром 1,5 - 2нм и длиной микрофибрилл около 50-100 цм. Макрофибриллы бактериальной целлюлозы меньше по размеру в сравнении с таковыми молекулами растений. Длина макромолекулы бактериальной целлюлозы от 1 |ам до 9 цм (рисунок 1).

Рисунок 1 - Схематическая модель микрофибрилл бактериальной целлюлозы в сравнении с микрофибриллами растительной целлюлозы: а - растительная целлюлоза; б - бактериальная целлюлоза [4]

Водоудерживающая способность бактериальной целлюлозы высокая и достигает 96 - 98,2 %. Плёнка, образуемая в процессе культивирования в перемешиваемой культуре, формируется в виде нерегулярных гранул, волокнистых нитей, которые хорошо диспергируются в культуральной жидкости. Макрофибриллы пленки целлюлозы в виде целлюлозы 1а и 1(3, аналогичны присутствующим в клеточных оболочках растений и водорослей. Плёнки, культивированные в статической культуральной среде, содержат более целлюлоз 1а, чем культивируемых в перемешиваемой среде [4] (рисунок 2). Отмечено, что целлюлоза 1а обладает более прочной структурой, чем целлюлоза 1р. В бактериальной целлюлозе содержание типа 1а составляет приблизительно 60 %, в то время как эта форма в растительной целлюлозе хлопка и рамаха составляет только 30 %. У растений целлюлоза ф

типа является главным компонентом [5]. Кристалличность, как полагают, является ключевым детерминантом свойств целлюлозы.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Фан Ми Хань

выводы

1. В результате многоступенчатого скрининга выделен новый штамм GH-1/2008, способный к синтезу полимера на различных источниках углерода. На основании исследований микро-морфологических, культуральных, физиологических свойств и молекулярно-генетического анализа установлена принадлежность штамма к виду Gluconacetobacter hansenii.

2. Методом CP/MAS 13С ЯМР установлено, что полимер, синтезируемый продуцентом Gluconacetobacter hansenii, содержит в большем количестве целлюлозу типа 1а, чем целлюлозу 1(3. В основной цепи молекулы мономер -глюкоза - в полимере имеет [3-1,4 связь. Пленки бактериальной целлюлозы, синтезируемые штаммом Gluconacetobacter hasenii, имеют прочную сеть микро- и макрофибрилл с диаметром поперечного сечения в пределах 15-20 нм и 50-100 нм, длиной макрофибрилл около 1-9 цм. Показатели прочности пленки бактериальной целлюлозы сопоставимы гидроцеллюлозной пленкой.

Пленки бактериальной целлюлозы имеют хорошую влагоудерживающую способность, которая при влагосодержании до 30% повышает её эластичность (удлинение), что имеет значение при использовании её в качестве покрытия пищевых продуктов и создании медицинских перевязочных и других материалов.

3. Проведена оптимизация условий поверхностного и глубинного культивирования штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008, при которых продуктивность бактериальной целлюлозы превышает показатель в сравнении с другими штаммами Gluconacetobacter hansenii. Максимальный выход целевого продукта бактериальной целлюлозы 28,78 г/л достигается в условиях поверхностного культивирования при температуре 30 °С на оптимизированной среде. В глубинных условиях культивировании продуцента продуктивность полимера ниже, чем в поверхностных и составляет не более 8,83 г/л.

4. Пленки бактериальной целлюлозы, полученные в условиях поверхностного культивирования штамма & казепи ОН-1/2008 содержат 97 % влаги, 2,85 % целлюлозы, белка, липидов и нуклеиновых кислот не более 0.15%.

5. Инициация биосинтеза бактериальной целлюлозы штаммом & кавепи вН-1/2008 зависит от количества растворенного кислорода в питательной среде, источника углерода и этанола. Концентрация растворенного кислорода в среде менее 0,5 мг/л, ингибирует рост штамма, а в количестве от 1,5 до 3 мг/л инициирует синтез полимера.

6. При поверхностном культивировании штамм синтезирует пленки двух типов: прозрачные или непрозрачные, что определяется составом питательной среды.

7. Для получения порошка бактериальной целлюлозы необходимо измельчение до однородной массы, удаление иммобилизованных клеток, прессование до состояния тонкого листа, сушка и дальнейшее измельчение до размеров порошка. Использование бактериальной целлюлозы в количестве 1,0 % улучшает органолептические свойства и структуру мясопродукта вареной колбасы.

8. Пленки бактериальной целлюлозы хорошо абсорбируют антибиотики, наносеребро и пчелиный воск, при этом они обладают необходимыми свойствами для создания антимикробных покрытий в медицине, в том числе искусственной кожи.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время бактериальная целлюлоза все больше привлекает внимание специалистов различных областей как уникальный природный материал. Благодаря сверх упорядоченной сетевой структуре с зонами кристалличности (высоко ориентированными участками), включающими отдельные аморфные (неориентированные) участки, бактериальная целлюлоза имеет большую механическую прочность. Диаметр фибрилл бактериальной целлюлозы составляет 72-175 нм (Bohn и др., 2000) или 70130 нм (Jonas и Farah, 1998; Yamanaka и др., 2000). Поскольку бактериальная целлюлоза состоит из нано размерных волокон, и структура нановолокон определяет её свойства, поэтому её описывают как наноцеллюлозу (Klemm и др., 2006).

По своим свойствам бактериальная целлюлоза отличается от растительной, так как в своем составе не содержит лигнина, гемицеллюлзы, пектина и восков. Степень полимеризации бактериальной целлюлозы составляет 2000-6000, тогда как растительной - 13000-14000 остатков глюкозы. Бактериальная целлюлоза имеет высокую способность к абсорбции воды, химическую стабильность, высокую механическую прочность (когда полимер влажный), сохраняет превосходную форму. Кроме этого, бактериальная целлюлоза нетоксичная, является биоразлагаемым полимером, инертным для метаболизма человека (Bielecki, 2005).

Все эти положительные свойства бактериальной целлюлозы позволили получить уже широкое её применение в ряде отраслей народного хозяйства в мировой практике. Чаше всего бактериальная целлюлоза используется как альтернатива растительной целлюлозе, однако новые области применения её ещё не исчерпаны.

Согласно сведений о штаммах-продуцентах, бактериальную целлюлозу способно синтезировать небольшое число прокариот как внеклеточный полимер, выполняющий для них в основном функцию иммобилизации клеток в его матриксе. Это представители родов Acetobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Sarcina, Pseudomonas, Achromobacter, Alcaligenes, Aerobacter, Azotobacter, Zooglea (Kunihiko Watanabe, 2004), Gluconacetobacter. kombuchae, G. intermedius, G. swingsii, G. rhaeticus, G. nataicola (Debasree Dutta, 2007), G. oboediens, G. europaeus, G. hansenii, G. entanii (Franco Dellaglio, 2005) и цианобактерии (Brown, 2008).

До настоящего времени наибольшее внимание для практического использования привлекает к себе вид А. xylinum, который в 1998 г. был реклассифицирован как вид Gluconacetobacter xylinus. Анализ результатов, полученных рядом авторов, показал, что вид G. hansenii, синтезирующий бактериальную целлюлозу, способен синтезировать еще и другой олигомер глюкуроновой кислоты, на что указали авторы Joong Kon Part и Taous Khan, (2006). Однако, сведения об использовании этого вида малочисленны. В России имеются немногочисленные исследования, посвященные получению бактериальной целлюлозы с использованием штаммов А. xylinum (Хрипунов, Ткаченко, 1999). Кроме того, в России до сих пор не налажено производство бактериальной целлюлозы, а в коллекциях отсутствуют штаммы-продуценты бля получения бактериальной целлюлозы в промышленных масштабах.

Это обстоятельство послужило основанием для предпринятого исследования, в задачи которого входило выделение и идентификация продуцента, оценка его продуктивности, проведение оптимизации условий для получения полимера, исследование биохимического состава и свойств бактериальной целлюлозы и разработка технологической схемы её получения в поверхностных и глубинных условиях культивирования.

В период с 2006 по 2008 гг. методом многоступенчатого скрининга из культуры «чайного кваса» был выделен штамм GH-1/2008, который синтезировал внеклеточный полимер на полужидких и жидких селективных для уксуснокислых бактерий питательных средах. Исследования микроморфологических и культуральных свойств показали высокое сходство

122 штамма с представителями рода Gluconacetobacter. Для подтверждения видовой принадлежности штамм был исследован молекулярно-генетическими методами, показавшими его сходство с видом G. hansenii на 99 %. Таким образом, этот штамм был использован как объект для дальнейших исследований его в качестве продуцента бактериальной целлюлозы.

На наш взгляд, важным аспектом является исследование у штамма культуральных особенности в различных условиях культивирования. Оценка продуктивности штамма позволяет дать объективную оценку возможности их использования в биотехнологии как продуцента бактериальной целлюлозы. С этой целью была изучена продуктивность бактериальной целлюлозы при культивировании в условиях поверхностного культиврования штамма на рекомендованных авторами S. Hestrin и М. Schramm (1985) и разработанных нами 12 питательных средах.

Согласно полученным данным, было установлено, что штамм растет на различных источниках углерода, при этом продуктивность целлюлозы была наибольшей на разработанной нами среде Н5-2. Продуктивность биосинтеза полимера штамма GH-1/2008 сравнивали с таковой у типового штамма G. hansenii (ВКПМ В-11239), которая была ниже на всех средах в 2-5 раз.

Для дальнейших исследований для культивирования продуцента бактериальной целлюлозы целесообразно было использовать среду Н5-2.

Следующий этап исследований был посвящен оптимизации состава питательной среды и условий поверхностного и глубинного культивирования штамма. При оптимизации по показателю продуктивности бактериальной целлюлозы штамма в поверхностных условиях культивирования в качестве факторов варьирования использовали: концентрацию кокосового молока, концентрацию спирта, рН среды, концентрацию сахарозы и температуру. Для оптимизации показателя продуктивности штамма в глубинных условиях культивирования в качестве факторов варьирования использовали: концентрацию кокосового молока, концентрацию спирта, рН среды, концентрацию сахарозы и число оборотов в минуту.

В результате оптимизации показано, что в условиях поверхностного культивирования продуктивность биомассы полимера выше (13,5 г/л), чем в условиях глубинного (8,83 г/л, рисунок 5), в связи с чем, для получения максимальной массы полимера штамм целесообразно культивировать в поверхностных условиях. На следующем этапе оптимизации, проведенном по плану Уилсона-Бокса, продуктивность штамма G. hansenii GH-1/2008 на 7 сут в условиях поверхностного культивирования была увеличена до 28,78 г/л на среде, содержащей, %: сахароза - 7, кокосовое молоко - 0,1, дрожжевой экстракт - 0,5, Na2HP04 - 0,27, К2НР04 - 0,2, (NH4)2S04 - 0,3, моногидрат лимонной кислоты - 0,115, спирта - 0,5, рН = 4,0.

Учитывая, что продуцент бактериальной целлюлозы G. hansenii GH-1/2008 является облигатным аэробом, то концентрация растворенного кислорода в питательной среде является очень важным фактором, влияющим на биосинтез целлюлозы. Основываясь на концепции авторов R.E. Cannon (1989), J.W. Cosieron (1999) и W.S. Wiliams (1989), что в культурах продуцентов бактериальной целлюлозы одновременно существуют две популяции клеток: целлюлозоположительные (Се11+) и целлюлозоотрицательные (Cell-), подбирали среды с различным начальным количеством растворенного кислорода, для того, чтобы индуцировать биосинтез полимера у целлюлозоположительных клеток и элиминировать целлюлозонегативные клетки на начальных этапах культивирования.

Для такой цели штамм G. hansenii GH-1/2008 культивировали на шести питательных средах, в которых была различная начальная растворимость кислорода. В результате проведенных исследований было показано, что при концентрации растворенного кислорода ниже критической для данной культуры, рост тормозится, т.е. кислород становится лимитирующим фактором. Это означает, что в системе с критической концентрацией растворенного кислорода, но с более подходящим для метаболизма

124 источником углерода происходит индукция синтеза целлюлозы тогда, когда рост активно начинается в первые часы. Количество растворенного кислорода для С. Натепи ОН-1/2008 является фактором, инициирующим биосинтез полимера, при этом критическое количество растворенного кислорода в среде должно составлять не менее 2,5 и не более 3,0 мг/л. Контроль концентрации растворенного кислорода в среде может быть использован для оценки продуктивности бактериальной целлюлозы штаммами на различных питательных средах и в различных условиях культивирования.

В результате исследований было показано, что добавление этанола в среду увеличивает продуктивность бактериальной целлюлозы штаммом, оказывая ингибирующее действие на рост целлюлозонегативных клеток, которые не синтезируют целлюлозу, но потребляют субстрат и кислород. Использование этанола в среде в количестве не более 0,5 % также целесообразно для элиминации целлюлозонегативных клеток в культуре.

В результате исследований было показано, что при культивировании штамма в поверхностных условиях бактериальная целлюлоза синтезируется в виде пленок различной прозрачности, а в глубинных условиях - в виде глобул. Продуктивность бактериальной целлюлозы зависит от состава питательной среды и количества растворенного кислорода. При этом ведущими факторами являются концентрация сахарозы и кислорода.

Исследован биохимический состав пленок, тип связи, наноструктура и прочность пленок. Полученные результаты позволяют утверждать, что бактериальная целлюлоза, синтезируемая продуцентом (г. капяепи ОН-1/2008 идентична синтезируемой штаммом А. хуИпит, описанной в работе автора Ннгоуикл Копо и др. (2002; 2003), является в основном целлюлозой 1а-типа, а [3-тип целлюлозы составляет не более 30-35 %.

На основании результатов оценки прочности и адсорбционных свойств целесообразно рекомендовать получение полимера в виде пленок при культивировании штамма в поверхностных условиях. Биотехнология

125 Б

Рисунок 40 - Технологическая схема биотехнологии бактериальной целлюлозы в условиях поверхностного (А) и глубинного (Б) культивирования

Очищенный воздух А

1- исходная культура продуцента (х ИатепИ ОН-1/2008 в пробирках; 2- культура в колбе; 3 - культура в банке Протодьяконова; 4- емкость для подогрева воды; 5 - стерилизатор; 6- емкость для хранения сухих питательных сред; 7 - дозатор; 8- бикс с питательной средой; 9 -автоклав; 10 - бикс со стерильной средой; 11 - стеганная ватно-марлевая салфетка; 12 - крышка для кюветы; 13 - кювета на загрузке; 14 -стол; 15 - загруженная кювета; 16-камера; 17-стеллажи; 18-сброс воздуха из калорифера в атмосферу; 19 - фильтры для воздуха; 20-вентилятор; 21 - калорифер; 22 - отбойники; 23 - ручной манипулятор для разгрузки кювет; 24 - сырая пленка бактериальной целлюлозы; 25 - стерильный флакон или пакет; 26 - грязная кювета; 27 - ванны для мойки кювет; 28 - подсушка кювет; 29 - шкаф для стерилизации кювет; 30 - стерильная кювета; 31 - холодная комната; 32 - емкость для стерилизация и охлаждения воды; 33 - емкость для вещества, используемые для нейтрализации; 34 - дозатор; 35 - емкость для промывания и стерилизации; 36 - насос; Б

1,2- дозатор; 3,4- емкости для приготовления питательной среды; 5 - стерилизатор; 6 - исходная культура продуцента бактериальной целлюлозы; 7-теплообменник; 8-инкубатор; 9-ферментер; 10 - компрессорная установка с фильтрами; 11, 13 - сепараторы ; 12-емкости для нейтрализации; 14 - сборник ЖК и избыток воды; 15 - распылительная сушилка.

Рисунок 41 - Принципиальная технологическая схема поверхностного культивирования А (по И.М. Грачевой, 2000) и глубинного культивирования Б.

Описание технологической схемы получения препарата на основе штамма аисопасеЮЪаМег катепи ОН-1/2008 при поверхностном культивировании.

Исходную культуру продуцента О. Натепи ОН-1/2008 на жидкой питательной среде, содержащей, %: сахарозы - 7, кокосового молока - 0,1, дрожжевого экстракта - 0,5, Ка2НР04 - 0,27, К2НР04 - 0,2, (Ш4)2804 - 0,3, моногидрата лимонной кислоты - 0,115, спирта - 0,5, рН = 4,0 пересевают для обновления в пробирки, затем в колбы вместимостью 0,75 - 1л, содержащие 0,25 - 0,5л питательной среды. Пробирки и колбы помещают в термостат и продуцент культивируют при 28 ± 2°С до появления на поверхности пленок с толщиной 2-3см. Подготовленный в колбах в достаточном количестве посевной материал используют для засева питательной среды, которую предварительно стерилизуют в биксах при 119 °С в течение 30 мин. Спирт и уксусную кислоту для регулирования рН добавляют после стерилизации.

Засеянная среда в соотношении 1:10 наливается в стерильные прямоугольные кюветы, которые выполняются из оцинкованного неперфорированного железа и снабжены крышками, имеющими два отверстия, закрывающиеся ватно-марлевыми салфетками. В каждую кювету наливают 1л засеянной среды. Закрытые кюветы со средой помещают в специальные растильные камеры для культивирования на стеллажи или этажерки. В камере поддерживают определенную влажность (80%) и температурный режим (28 ± 2 °С) оптимальные для роста штамма и синтеза бактериальной целлюлозы. Воздухообмен в такой камере осуществляют в о о диапазоне 1-2,5 м / (м .ч).

Полученные пленки снимают с кювет после 7 - 10 суток культивирования при помощи ручного манипулятора и во влажном состоянии помещают в стерильные пакеты, которые помещают на хранение в камере с температурой не выше 4 °С до окончания его микробиологической и биохимической проверки. Длительность хранения пленок не должна

130 превышать 5-6 суток. Пленки не должны содержать посторонней микрофлоры.

Если пленки удовлетворяют всем требованиям, их хранят в холодном помещении в отделение обработки. Плёнки нейтрализуют 0.5Н ИаОН и отмывают холодной водой в специальной ёмкости, затем стерилизуют при 137 °С в течение 4 с и упаковывают. Срок хранения препаратов пленок не более 12 месяцев.

Описание технологической схемы получения препарата поверхностным культивированием

Технологическая схема получения мицелия методом глубинного культивирвования в ферментере с аэрацией среды стерильным воздухом показана на рисунке 416 .

Сухие питательные вещества приготовленной среды, содержащей %: сахарозы - 7, густого кокосового молока - 0,2, дрожжевого экстракта - 0,5, Ыа2НР04 - 0,27, К2НР04 - 0,2, (МН4)2804 - 0,3, моногидрата лимонной кислоты - 0,115 поступают в емкости 3 и 4 для приготовления среды, затем полученная среда поступает на стерилизацию паром в стерилизатор 5. После охлаждения на теплообменниках 7 подается в инкубатор 8. Спирт (0,5%) и уксусную кислоту добавяют в инкубатор вместе с посевным материалом. Температура среды в инкубаторе не должна превышать (28±1) °С.

Посевной материал доставляется из лаборатории 6. Активация и масштабирование посевного материала ведется в инокуляторе 8 в течении 14 суток. После масштабирования инокулят поступает в ферментер 9, куда подается среда и стерильный воздух для аэрации с компрессорной установки 10 (концентрация растворенного кислорода контролируется в диапазоне 1,5 -3,0 мг/л). Контроль доступного воздуха в ферментер проводят путем измерения концентрации растворенного кислорода а питательной среде. Воздух поступает в ферментер, когда концентрация растворенного кислорода в питательной среде снижается до 1,5 мг/л и контролируется до достижения растворенного кислорода в среде не более 3 мг/л.

131

Ферментер снабжен рубашкой для обогрева, поддерживающей постоянную температуру ферментации. Процесс культивирования идет в течении 7-10 суток. После достижения стационарной фазы роста культуры, культуральная жидкость выводится из нижней части ферментера и поступает в сепаратор для удаления культуралной жидкости. Суспензия концентрируется до содержания батериальной целлюлозы 9-10 г/л, из нижней части сепаратора выходит отработанная культуральная жидкость и поступает в бак для ее сбора 14.

Из сепаратора концентрированная суспензия поступает в емкость 12 для нейтрализации и отмывки клеток. Полученная жидкость с бактериальной целлюлозы поступают на 2-ой сепаратор ступени 13, после центрифуги, полученная суспензия бактериальной целлюлозы подается на распылительную сушку 15. При распылительной сушке происходит испарение воды из высушиваемой бактериальной целлюлозы, в результате получают сухой порошкообразный или гранулированный продукт. Сушку проводят воздухом, нагретым до температуры не более (85±5) °С. Аппарат так же имеет систему отвода воздуха и выгрузки готового продукта.

Затем полученный препарат поступает на упаковку и хранение. Упакованный препарат хранится в сухом виде, без прямого попадания солнечных лучей помещении при комнатной температуре. Срок хранения препарата не более 6 месяцев.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фан Ми Хань, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Филлипс Г.О. и др. Справочник по гидроколлоидам. Перевод с английского

- М.: Гиорд, 2006-536 с.

2 Хрипунов А.К. Исследование нанокомпозитов на основе гидратированных фосфатов кальция и целлюлозы Acetobacter xylinum/ A.K. Хрипунов, Ю.Г. Баклагина, В.А. Синяев и др. // Физ. хим. стекла. 2008. Т. 34. С. 248-258.

3 Неверова O.A. Пищевая биотехнология продуктов из сырья растительного происхождения: Учебное пособие./ O.A. Неверова, Гореликова Г.А, Позняковский В.М. - Новосибрск: Сиб. Унив. Изд-ство, 2007. - 16с.

4 Steinbüchel А. Biopolymers for Medical and Pharmaceutical Applications: Humic Substances, Polyisoprenoids, Polyesters, and Polysaccharides/ A. Steinbüchel, Robert H. Marchessault// Wiley, 2005.-p.31-84.

5 Sugiyama J. Electron diffraction study on the two crystalline phases occurring in native cellulose from an algal cell wall/ J. Sugiyama, R. Vuong, H. Chanzy // Macromolecules, 1991, 24.- p. 4168 - 4175.

6 M. Iguchi. Bacterial cellulose -A masterpiece of nature's arts/ M. Iguchi, S. Yamanaka, A. Budhiono //J. Mater. Sei., 2000, 35,- p.261-270.

7 Дудкин M.C. Гемицеллюлозы/ M.C. Дудкин, B.C. Громов, Ведерников H.A. и др. - Рига: Зинатне, 1991 - с. 7-10.

8 Klemm D. Bacterial syhnthesized cellulose-artificial blood vessel for microsurgery/ D. Klemm // Progress in Polymer Science, 2001. 26(9).-p. 15611603.

9 Klemm D. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material/ D. Klemm, В. Heublein, H-P. Fink, A. Bohn// Angew Chem Int Ed, 2005, 44,- p.3358

- 3393.

10 Eichhorn S. J. Review: current international research into cellulose nanofibres and nanocomposites / S. J. Eichhorn, A. Dufresne, M. Aranguren at all. // Journal of Material Science, 2010, 45,- p. 1-33.

11 Bielecki S. Bacterial cellulose, in: Polysaccharides and polyamide in the food industry: Properties, production and patents/ S. Bielecki, A. Krystinowicz, M. B. C., Turkiewcz, and H. Kalinowska // Wiley VCH, Weinhein, 2005,- p.31-84

12 Chanliaud E. Mechanical properties of primary plant cell wall analogues/ E. Chanliaud, K. M. Burrows, G. Jeronimidis and M. J. Gidley// Planta, 2002, 215.-p. 989-996.

13 Klemm D. Nanocellulose innovative polymers in research and application / D. Klemm, D. Schumann, F. Kramer, N. Hebler, M. Hornung, H. P. Schmauder and S. Marrsch // Advance of Polymer Science, 2006, 205,- p. 49-96.

14 Brown A.J. On an acetic ferment which forms cellulose / A.J. Brown // J. Chem. Soc. Trans., 1886, 49.- p. 432-439.

15 Patent US6818434 - Cellulose-producing bacteria // Kunihiko Watanabe, -2004.

16 Debasree Dutta. Nitrogen-fixing and cellulose-producing Gluconacetobacter kombuchae sp. nov., isolated from Kombucha tea/ Debasree Dutta, Ratan Gachhui.//International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57.- p.353-357.

17 Dellaglio F. h AP- Description of Gluconacetobacter swingsii sp. nov. and Gluconacetobacter rhaeticus sp. nov., isolated from Italian apple fruit/ F. Dellaglio et all.// Int J Syst Evol Microbiol, 2005, 55,- p. 2365-2370.

18 Patent US2008085520-A1; US7803601-B2. New cyanobacterium comprising exogenous bacterial cellulose operon, useful for producing extracellular glucose or for fixing carbon into a photobiomass/ D R. Nobles., R. M. Brown (2008. 13p).

19 Colvin J. R. Formation of cellulose microfibrils in a homogenate of Acetobacter xylinum/ J. R. Colvin // Arch Biochem Biophys, 1957, 70,- p. 294 - 295.

20 http://www.botany.utexas.edu/facstaff/facpages/mbrown/algae/default.htm

21 Martin Dworkin h ap. The Prokaryotes - A Handbook on the Biology of Bacteria: Proteobacteria: Alpha and Beta Subclasses.// Springer, 2006, 3rd -Volume 5,-p. 163-201.

22 Yamada Y. The phylogeny of acetic acid bacteria based on the partial sequences of 16S ribosomal RNA: the elevation of the subgenus Gluconoacetobacter to generic level/ K. Hoshino and T. Ishikawa// Biosci.Biotechnol. Biochem, 1997, 61.-p. 1244-1251.

23 Don J. Brenner. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology - second edition - volume 2 - part C- The Alpha -, Beta-, Delta-, and Epsilonproteobacteria/ Noel R.Krieg, James T.Staley// Spinger, 2005,- p.41- 96.

24 Cannon R. E. Biogenesis of BC/ R. E. Cannon, S. M. Anderson. Critical Reviews in Microbiology, 1991, 17 (6).- p. 435-447.

25 Hestrin S. Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum: 2. Preparation of Freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose/ S. Hestrin, M. Schramann // Biochemical Journal, 1952, 58.- p.345-352.

26 Schramm M. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum/ M. Schramm, S. Hestrin// Journal of General and Microbiology, 1954, 11,-p.123-129.

27 Costeron J.W. The role of bacterial cellulose exopolysaccharides in nature and disease/ J.W. Costeron // J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 1999, 22,- p.551-563.

28 Williams W.S. Alternative environmental roles of cellulose produced by Acetobacter xylinum! W.S. Williams, R.E. Cannon// Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55.- p.2448-2452.

29 Jonas R. Production and application microbial cellulose/ R. Jonas, L.F. Farad// Polymer. Degrad. Stabil., 1998, 59.- p.101-106.

30 Okamoto T. Cloning of the Acetobacter xylinum cellulase gene and its expression in E. coli and Zymomonas mobilis.! T. Okamoto, S. Yamano, H. Ikeaga and K. Nakamura// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42,- p. 563 - 568.

31 Koo H.M. Evidence that a Beta-l,4-endoglucanase secreted by Acetobacter xylinum plays an essential role for the formation of cellulose fiber/ H.M., Koo S.H. Sony, Y.R. Pyun and Y.S. Kim// Biosci. Biotech. Bioeng., 1991, 62.- p.2257 -2259.

32 Ross P. Cellulose biosynthesis and faction in bacteria/ P. Ross, R. Mayer and M. Benziman// Microbiol. Rev., 1991, 55,- p.35-58.

33 http://livescience.ru/content/view/863/272/

34 http://2010.igem.org/Team:Tokyo_Metropolitan/Project/Fiber

35 Delmer D.P. Cellulose biosynthesis/ D.P. Delmer, Y. Amoy// Plant cell, 1995, 7,- p.987.

36 Tonouchi N. A host-vector system for a cellulose-producing Acetobacter strain/ N. Tonouchi, T. Tsuchida, F. Yoshinaga, S. Horinouchi , T. Beppu // Biosci Biotechnol Biochem, 1994, 58(10).- p.1899-901.

37 De Wulf P. Improved cellulose formation by Acetobacter xylinum mutant limited in (keto) gluconate synthesis/ P.De Wulf, K. Joris and E.J. Vandamme// J. Chem. Tech. Biotechnol., 1996, 67,-p.376-380.

38 Park J. K. Structural studies of the glucuronic acid oligomers produced by Gluconacetobacter hansenii strain/ J. K. Park, T. Khan and J. Y. Jung// Carbohydr. Polym., 2006, 63,- p.482-486.

39 Khan T. The structure and physical properties of glucuronic acid oligomers produced by a Gluconacetobacter hansenii strain using the waste from beer fermentation broth/ T. Khan, J. Kon Park// Carbohydrate Polymers, 2008, 73.-p.438-445.

40 http://biotech.upesh.edu.pk/files/Presentations/Dav%2003/Session%2002/ Dr.Taous.ppt

41 Chawla P.R. et al. Fermentative Production of Microbial Cellulose / P.R. Chawla et al.// Food Technol. Biotechnol, 2009, 47 (2).- p. 107-124.

42 Saxena I.M. Characterization of genes in the cellulose-synthesizing operon (acs operon) of Acetobacter xylinum: implications for cellulose crystallization/ I.M. Saxena, K . Kudlicka, K. Okuda, R.M. Brown// Jr. J Bacteriol., 1994, 176(18).-p.5735-52.

43 Wong H.C. Genetic organization of the cellulose synthase operon in Acetobacter xylinum / H.C. Wong, A.L. Fear, R.D. Calhoon, G.H. Eichinger, R.

Mayer, D. Amikam, M. Benziman, D.H. Gelfand, J.H. Meade, A.W. Emerick, R. Bruner, A. Ben-Bassat, R. Tal// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87,- p. 81308134.

44 Kawano S. Effects of endogenous endo-b-l,4-glucanase on cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum ATCC23769/ S. Kawano, K. Tajima, H. Kono, T. Erata, M. Munekata, M.Takai// J.Biosci. Bioeng., 2002, 94,- p.275-281.

45 Standal R. A new gene required for cellulose production and a gene encoding cellulolytic activity in Acetobacter xylinum are colocalized with the bes operon/ R. Standal, T.G. Iversen, D.H. Coucheron, E. Fjaervik, J.M. Blatny, S. Valla// J. Bacterid., 1994, 176,- p.665-672.

46 S.-Q. Hu. Structure of bacterial celluose synthase subunit D octamer with four inner passageways/ S.-Q. Hu, Y.-G. Gao, K. Tajima, N. Sunagawa, Y. Zhou, S. Kawano, T. Fujiwara, T. Yoda, D. Shimura, Y. Satoh, M. Munekata, I. Tanaka and M. Yao// Proc. Natl. Acad. Sci, 2010, 107(42).- p. 17957-61.

47 Endler A. Cellulose squeezes through Glycobiology/ A. Endler, C. Sánchez-Rodríguez, S. Persson// Nat Chem Biol., 2010, 6(12).- p.883-4.

48 Steel R. Studies on the Antibacterial Activity of Certain Strains of Acetobacter/ R.Steel, T.K. Walker// J. gen. Microbiol., 1958, 18,- p.369-376.

49 Romling U. Molecular biology of cellulose production in bacteria/ U. Romling // Res Microbiol., 2002, 153(4).- p.205-12.

50 Tal R. Three cdg operons control cellular turnover of cyclic di-GMP in Acetobacter xylinum: Genetic organization and occurrence of conserved domains in isoenzymes/ R. Tal, H.C. Wong, R. Calhoon, D. Gelfand, A.L. Fear, G. Volman, R. Mayer, P. Ross, D. Amikam, H. Weinhouse, A. Cohen, S. Sapir, P. Ohana, M. Benziman//J. Bacteriol., 1998, 180,- p.4416-4425.

51 Ishikawa A. Increase in cellulose production by sulfaguanidine-resistant mutants derived from Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans/ A. Ishikawa,

M. Marsuoka, T. Tsuchida and F. Yoshinaga// Biosci. Biotechnol. Biochem., 1995, 59.- p.2259-2262.

52 Toyosaki H. Screening of bacterial cellulose - producing Acetobacter strains suitable for agitated culture/ H. Toyosaki, T. Naritomi, A. Seto, M. Matsuoka, T. Tsuchida and F. Yoshinaga// Biosci. Biotechnol. Biochem., 1995, 59,- p. 14981502.

53 Hutchens S.A. Statistical analysis of optimal culture conditions for Gluconacetobacter hansenii cellulose production/ S.A. Hutchens, R.V. Leon, H.M. O'Neill and B.R. Evans// Lett Appl Microbiol, 2007, 44(2).- p. 175-80.

54 Bielecki S. Bacterial cellulose in E. J. Vandamme, S. De Baets, A. Steinbuechel, eds, Biopolymers/ S. Bielecki, A. Krystynowicz, Turkiewicz M, Kalinowska H// Wiley-VCH, Weinheim, 2002 (5) - p. 37-90.

55 Embuscado M.E. Bacterial cellulose II. Optimization of cellulose production byy Acetobacter xylinum through response surface methodology/ M.E. Embuscado, J.N. Be Miller and J.S. Marks// Food Hydrocolloids, 1994, 8,- p. 419 -430.

56 Oikawa T. Production of cellulose from D-mannitol by Acetobacter xylinum KU-1/ T. Oikawa, T. Ohtori and Ameyama// Biosci. Biotech. Biochem, 1995, 59 (2).- p.331-332.

57 Patent W0/2005/003366. Bielecki S. A method for the production of bacterial cellulose, 2005.

58 Патент РФ № 2189394 - Состав питательной среды культивирования Acetobacter xylinum для получения бактериальной целлюлозы. Авторы Хрипунов А.К, Ткаченко А.А, 2002.

59 Masaoka S. Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum/ S. Masaoka, T. Ohe, N. Sakota//J. Ferment. Bioeng, 1993, 75,- p.18-22.

60 Park J.K. Cellulose production by Gluconacetobacter hansenii in a medium containing ethanol/ J.K. Park, J.Y. Jung, Y.H. ParkII Biotechnol. Lett, 2003, 25.-p.2055-2059.

61 Son H J. Increased production of bacterial cellulose by Acetobacter sp. V6 in synthetic media under shaking culture conditions/ H.J. Son, H.G. Kim, K.K. Kim, H.S. Kim, Y.G. Kim, S.J. Lee// Bioresour. Technol., 2003, 86,- p.215-219.

62 Hornung M. Optimizing the production of bacterial cellulose in surface culture: A novel aerosol bioreactor working on a fed batch principle/ M. Hornung, M. Ludwig, H.P. Schmauder// Eng. Life Sci., 2007, 7.- p. 35-41.

63 Ishihara M. Utilization of D-xylose as carbon source for production of bacterial cellulose/ M. Ishihara, M. Matsunaga, N. Hayashi, V. Tiler// Enzyme Microb. Technol., 2002, 31.- p.986-991.

64 Ramana K.Y. Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinuml K.V. Ramana, A. Tomar, L. Singh// World J. Microbiol. Biotechnol., 2000, 16.- p.245-248.

65 Son H.J. Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp. A9 in shaking cultures/ H.J. Son, M.S. Heo, Y.G. Kim, S.J. Lee// Biotechnol. Appl. Biochem., 2001, 33,- p. 1-5.

66 Keshk S. Influence of lignosulfonate on crystal structure and productivity of bacterial cellulose in a static culture/ S. Keshk, K. Sameshima// Enzyme Microb. Technol., 2006, 40,- p. 4-8.

67 Toda K. Cellulose production by acetic acid-resistant Acetobacter xylinuml K. Toda, T. Asakura, M. Fukaya, E. Entani, Y. Kawamura// J. Ferment. Bioeng., 1997, 84.- p.228-231.

68 Bae S. Statistical optimization of culture conditions for bacterial cellulose production using Box-Behnken design/S. Bae, M. Shoda// Biotechnol. Bioeng., 2005, 90 .- p.20-28.

69 Bae S. Bacterial cellulose production by fed-batch fermentation in molasses medium/ S.Bae, M. Shoda//Biotechnol. Progr., 2004, 20,- p. 1366-1371.

70 Keshk S. The utilization of sugar cane molasses with/without the presence of lignosulfonate for the production of bacterial cellulose/ S. Keshk, K. Sameshima// Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006,12.- p.291-296.

71 Premjet S. The effect of ingredients of sugar cane molasses on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum ATCC 10245/ S. Premjet, D. Premjet, Y. Ohtani// Sen-i Gakkaishi, 2007, 63,- p.193-199.

72 Kim S.Y. Production of bacterial cellulose by Gluconacetobacter sp. RKY5 isolated from persimmon vinegar/ S.Y. Kim, J.N. Kim, Y.J. Wee, D.H. Park, H.W. Ryu// Appl. Biochem. Biotechnol., 2006, 131.-p.705-715.

73 Hornung M. Optimizing the production of bacterial cellulose in surface culture: Evaluation of substrate mass transfer influences on the bioreaction (part 1)/ M. Hornung, M. Ludwig, A.M. Gerrard, H.P. Schmauder // Eng. Life Sei., 2006, 6.-p.537-545.

74 Hornung M. Optimizing the production of bacterial cellulose in surface culture: Evaluation of product movement influences on the bioreaction (Part 2)1 M. Hornung, M. Ludwig, A.M. Gerrard, H.P. Schmauder// Eng. Life Sei., 2006, 6.- p. 546-551.

75 Hornung M. Optimizing the production of bacterial cellulose in surface culture: A novel aerosol bioreactor working on a fed batch principle (Part 3)/ M. Hornung, M. Ludwig, H.P. Schmauder// Eng. Life Sei, 2007, 7,- p.35^11.

76 Son H.J. Increased production of bacterial cellulose by Acetobacter sp. V6 in synthetic media under shaking culture conditions/ H.J. Son, H.G. Kim, K.K. Kim, H.S. Kim, Y.G. Kim, S.J. Lee// Bioresour. Technol, 2003, 86,- p. 215-219.

77 Ramana K.V. Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum/ K.V. Ramana, A. Tomar, L. Singh// World J. Microbiol. Biotechnol, 2000, 16,- p.245-248.

78 Matsuoka M. A synthetic medium for bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans! M. Matsuoka, T. Tsuchida, K. Matsushita, O. Adachi, F. Yoshinaga// Biosci. Biotechnol. Biochem, 1996, 60.-p.575-579.

79 Yang Y.K. Cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 under agitated condition/ Y.K. Yang, S.H. Park, J.W. Hwang, Y.R. Pyun, Y.S. Kim// J. Ferment. Bioeng., 1998, 85,- p.312-317.

80 Chao Y. Effect of addition of water-soluble polysaccharides on bacterial cellulose production in a 50-L airlift reactor/ Y. Chao, M. Mitarai, Y. Sugano, M. Shoda// Biotechnol. Progr, 2001, 17.- p.781-785.

81 Bae S. Improvement of bacterial cellulose production by addition of agar in a jar fermentor/ S. Bae, Y. Sugano, M. Shoda // J. Biosci. Bioeng., 2004, 97. - p.33-38.

82 Zhou L.L. Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum/ L.L. Zhou, D.P. Sun, L.Y. Hu, Y.W. Li, J.Z. Yang// J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2007, 34,- p. 483-489.

83 Bae S.O. Features of bacterial cellulose synthesis in a mutant generated by disruption of the diguanylate cyclase 1 gene of Acetobacter xylinum BPR 2001/ S.O. Bae, Y. Sugano, K. Ohi, M. Shoda//Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 65.-p.315-322.

84 Benziman M. Cellulose biogenesis: Polymerization and crystallization are coupled processes in Acetobacter xylinum/ M. Benziman, C.H. Haigler, R.M. Brown Jr., A.R. White, K.M. Cooper// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77,- p. 6678-6682.

85 European patent 19870307513. Use of cellulase preparations in the cultivation and use of cellulose-producing microorganisms. M.R. Brown, 1993.

86 Nakamura T. Cellulose production by Acetobacter xylinum in the presence of cellulose/ T. Nakamura, K. Tajima, M. Fujiwara, M. Takai, J. Hayashi// Use of Minerals in Papermaking, 1998. - p.3-8.

87 Nguyen V.Y. Characterization of cellulose production by a Gluconacetobacter xylinus strain from kombucha/ V.Y. Nguyen, B. Flanagan, M.J. Gidley, G.A. Dykes// Curr. Microbiol., 2008, 51.- p. 449^153.

88 Gromet-Elhanan Z. Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum. VI. Growth on citric acid-cycle intermediates/ Z. Gromet-Elhanan, S. Hestrin// J. Bacterid., 1963, 85.- p.284-292.

89 Kongruang S. Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum strains from agricultural waste products/ S. Kongruang // Appl. Biochem. Biotechnol., 2008, 148.- p.245-256.

90 Shirai A. Biosynthesis of a novel polysaccharide by Acetobacter xylinum/ A. Shirai, M. Takahashi, H. Kaneko, S. Nishimura, M. Ogawa, N. Nishi, S. Tokura// Int. J. Biol. Macromol., 1994, 16,- p. 297-300.

91 Ishida T. Role of water-soluble polysaccharides in bacterial cellulose production/ T. Ishida, M. Mitarai, Y. Sugano, M. Shoda// Biotechnol Bioeng, 2003, 83(4).- p.474-8.

92 Kouda T. Effects of oxygen and carbon dioxide pressures on bacterial cellulose production by Acetobacter in aerated and agitated culture/ T. Kouda, T. Naritomi, H. Yano, F. Yoshinaga// J. Ferment. Bioeng., 1997, 84,- p. 124-127.

93 Tantratian S. Effect of dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter sp./S. Tantratian P. Tammarate, W. Krusong, P. Bhattarakosol, A. Phunsri// J. Sci. Res. Chula Univ., 2005, 30,- p. 179-186.

94 Hwang J.W. Effects of pH and dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 in agitated culture/ J.W. Hwang, Y.K. Yang, J.K. Hwang, Y.R. Pyun, Y.S. Kim//J. Biosci. Bioeng., 1999, 88,- p. 183-188.

95 Y. Chao, Y. Sugano, M. Shoda, Bacterial cellulose production under oxygen-enriched air at different fructose concentrations in a 50-liter, internal-loop airlift reactor/ Y. Chao//Appl. Microbiol. Biotechnol. 55 (2001) 673-679.

96 http://www.registrarcorp.com/fda-food/fce-sidexamples/Nata%20De%20 Coco?lang=vn

97 http://en.wikipedia.org/wiki/Nata_de_coco

98 Bae S.O. Features of bacterial cellulose synthesis in a mutant generated by disruption of the diguanylate cyclase 1 gene of Acetobacter xylinum BPR 2001/

S.O. Bae, Y. Sugano, K. Ohi, M. Shoda// Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 65.-p.315-322.

99 http://en.wikipedia.org/wiki/Kombucha

100 Nguyen V.T. Potential of a nisin-containing bacterial cellulose film to inhibit Listeria monocytogenes on processed meats/ V.T. Nguyen, M.J. Gidley, G.A. Dykes// Food Microbiol., 2008, 25(3)., p.471-8.

101 Amar N. Neogi. United States Patent 4960763. Method of using bacterial cellulose as a dietary fiber component/Amar N. Neogi, 1990.

102 Liebner F. Aerogels from Unaltered Bacterial Cellulose: Application of sc C02 Drying for the Preparation of Shaped, Ultra-Lightweight Cellulosic Aerogels/ F. Liebner, E. Haimer, M. Wendland, M.-A. Neouze, K. Schlufter, P. Miethe, T. Heinze, A. Potthast, T. Rosenau// Macromolecular Bioscience, 2010, 10(4).- p. 349-352.

103 Zhang By Taiji. Biotemplated Synthesis of Gold Nanoparticle-Bacteria Cellulose Nanofiber Nanocomposites and Their Application in Biosensing/ By Taiji Zhang, Wei Wang, Dayong Zhang, Xinxiang Zhang, Yurong Ma, Yinglin Zhou, and Limin Qi// Adv. Funct. Mater. 2010, 20,- p.l 152-1160.

104 Czaja W.K. et al. The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications/W.K. Czaja et al // Miomacromolecules, 2007, 8(1).- p. 1 -12.

105 Rainer J. Production and application of microbial cellulose/ J. Rainer, F. Luiz Farah// Polymer Degradation and Stability, 1998, 59(1-3).- p. 101-106.

106 Rezaeel A. Microbial Cellulose As Support Material For The Immobilization Of Denitrifying Bacteria/ A. Rezaeel, H. Godini, H. Bakhtou// Environmental Engineering and Management Journal, 2008, 7(5).-p. 589-594.

107 Wu Sheng-Chi. Application of bacterial cellulose pellets in enzyme immobilization/ Wu Sheng-Chi, LIA Ying-Ke// Journal of molecular catalysis. B, Enzymatic, 2008, 54 (3-4).- p. 103-108.

108 Patent US 7968646.Method of in situ bioproduction and composition of bacterial cellulose nanocomposite. Marie-Pierre Laborie, Elvie Brown, 2011.

109 Патент 2415221. Способ получения электроизоляционной бумаги. Авторы Хрипунов А.К, Ткаченко А.А, 2010.

110 Masaya Nogi. Optically Transparent Nanofiber Paper/ Masaya Nogi, Shinichiro Iwamoto, Antonio Norio Nakagaito, Hiroyuki Yano// Advanced Materials, 2009, 21 (16), p. 1595 - 1598.

111 Trotter J. A. Colloquium on biotechnology of extracellular matrix/ J. A. Trotter, J. Tipper, G. Lyons-Levy, K. Chino, A.H. Heuer, Z. Liu, M. Mrksich, C. Hodneland, W.S. Dillmore, T.J. Koob, M.M. Koob Emunds, K. Kadler, D. Holmes // Portland Press, Leeds, 2000, p 357.

112 Saska S. Bacterial Cellulose-Hydroxyapatite Nanocomposites for Bone Regeneration/S. Saska, H. S. Barud, A. M. M. Gaspar, R. Marchetto, S. J. L. Ribeiro, and Y. Messaddeq// International Journal of Biomaterials, 2011 - 8p.

113 Gatenholm P. Bacterial nanocellulose as a renewable material for biomedical applications/ P. Gatenholm, D. Klemm// MRS Bulletin, 2010, 35,- p. 208.

114 Schumann D. A. Artificial vascular implants from bacterial cellulose: Preliminary results of small arterial substitutes/ D. A. Schumann, J. Wippermann, D. O. Klemm, F. Kramer, D. Koth, H. Kosmehl, T. Wahlers T, S. Salehi-Gelani// Cellulose, 2009, 16 (5).- p. 877-885.

115 http://www.pravda.ni/world/l 1-10-2002/809105-0/

116 Grande C.J. Nanocomposites of bacterial cellulose/hydroxyapatite for biomedical applications/ C.J. Grande, F.G. Torres, C.M. Gomez, M.C. Bano// Acta Biomater, 2009, 5(5).-p. 1605-15.

117 Jeong Ji-Suk. Water absorption and maintenance of nanofiber cellulose production by Gluconacetobacter rhaeticus TL-2C/ Ji-Suk Jeong, Jae-Yong Park// African Journal of Biotechnology, 1012, 11(40).- p. 9630-9632.

118 Hernane S. Barud. Antimicrobial Bacterial Cellulose-Silver Nanoparticles Composite Membranes/ S. Barud Hernane, Thais Regiani, Rodrigo F. C. Marques, Wilton R. Lustri, Younes Messaddeq, and Sidney J. L. Ribeiro// Journal of Nanomaterials, 2011, 8 p.

119 Vitta S. Multifunctional bacterial cellulose and nanoparticle-embedded composites/ S. Vitta V. Thiruvengadam// CURRENT SCIENCE, 2012, 102 (10).

120 Klemm D. Nanocelluloses: A new Family of Nature-Based Materials/ D. Klemm, F. Kramer, S. Moritz, T. Lindstrôm, M. Ankerfors, D. Gray, A. Dorris// Angew. Chem., Int. Ed., 2011, 50,- p.5438.

121 Nogi M. Optically Transparent Nanofiber Paper/ M. Nogi Sh. Iwamoto,

A. Norio Nakagaito, H. Yano//Advanced Materials, 2009, 21(6).- p.1595-1598.

122 Хрипунов A.K. Формирование композита на основе наночастиц Se, стабилизированных поливинилпиролидоном, и гель-пленок целлюлозы Acetobacter xylinum/ A.K. Хрипунов, А.А. Ткаченко, Ю.Г. Баклагина и др. // Ж. Прикл. химии. 2007. Т. 80. С. 1516-1524.

123 Klechkovskaya V.V. Model of Acetobacter xylinum Cellulose Intercalated by Drug Nanoparticles/ V.V. Klechkovskaya, V.V.Volkov, E.V. Shtykova at all.// NATO Science for Peace and Security Series - B: Physics and Biophysics. Nanomaterials for Application in Medicine and Biology. Ed. by M. Giersig, G. Khomutov, Springer, 2007,- P. 165-177.

124 Cai Zhijiang. Bacterial cellulose/ collagen composite: Characterization and first evaluation of cytocompatibility/ Cai Zhihiang, Yang Guang// Journal of Applied Polymer Science, 2011, 120 (5). -p. 2938 - 2944.

125 http://www.novate.ru/blogs/130710/15105/

126 http://www.ecouterre.com/u-k-designer-grows-an-entire-wardrobe-from-tea-fermenting-bacteria/

127 http://www.mediamatic.net/131772/en/bacterial-cellulose-shoes-amp-amp-body-form

128 Amnuaikit Th. Effects of a cellulose mask synthesized by a bacterium on facial skin characteristics and user satisfaction/ Th. Amnuaikit T. Chusuit, P. Raknam, P. Boonme// Medical Devices: Evidence and Research, 2011,4.- p.77-81.

129 http://www.belmondobeauty.com/about/blog/Feel-the-healing-with-Bio-Cellulose-Masks-bd.html

130 Zhong Chunyan. W0/2011/153667. Bacterial cellulose ice-compressing bag and process for producing the same.

131 http://www.utexas.edu/news/2008/04/23/biofuel_microbe/

132 Patent US 2008/0085520. Production and Secretion of Glucose in Photosynthetic Prokaryotes/ David R. Nobles, R. Malcolm Brown. (Cyanobacteria), 2008.

133 Lina Fu. Bacterial Cellulose for Skin Repair Materials/ Fu Lina, Zhang Yue, Zhang Jin and Yang Guang // Biomedical Engineering - Frontiers and Challenges, Reza Fazel-Rezai (Ed.), 2009,- p. 249-274.

134 Донченко JI.B. Безопасность пищевой продукции/ Л.В. Донченко, В.А. Надыкта - М.: ДеЛи принт, 2005. - 539 с, 128 - 131 с.

135 Рогов И.А. Проектирование комбинированных продуктов питания./ И.А. Рогов, А.И. Жаринов, Ивашкин и др. - М.: МГУПБ, 2005 - 44с.

136 Методические рекомендации MP 2.3.1.2432 -08. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. - М.: Минздрав России, 2008. - 41с.

137 Нечаев А.П. Пищевые добавки/ А.П. Нечаев, А.А. Кочеткова, А.Н. Зайцев, 2002. - М.:Колос,- 256с.

138 Методические рекомендации MP 2.3.1.1915-04. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ - М.: Минздрав России, 2004. - 32с.

139 http://en.wikipedia.org/wiki/Kombucha

140 http://vi.wikipedia.org/wiki/N%E1%BA%A5m thu%El%BB%B7 s%C3 %A2m.

141 Thurman Dow. Patent US4655758 A. Microbial polysaccharide articles and methods of production, 1987.

142 Громовых Т.И. Основы научных исследований: полный факторный эксперимент/Т.И. Громовых, О.Н. Еременко, Т.В. Климанская, И.С. Почекутов. Методические указания. - Красноярск: Сиб-ГГУ, 2006. - 24 с.

143 Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках/ Н. С. Егоров. - М.: Издательство МГУ. - 1994. - 512 с.

144 Huang Nguyên Thùy. Ânh hircmg сйа nguôn ca chât và kiêu lên men dên nâng suât và chât luçmg cellulose vi khuân/ Nguyên Thùy Huong Tap chi Khoa hoc DHQGHN// Khoa hoc Tir nhiên và Công nghê, 2008, 24 .- p. 205-210.

145 Lisdiyanti P. Diversity of Acetic Acid Bacteria in Indonesia, Thailand, and the Philippines/P. Lisdiyanti, K. Katsura, W. Potacharoen, R. Richard Navarro, Y.Yamada, Tai Uchimura, and K. Komagata// Microbiol. Cult. Coll. Dec., 2003.-p. 91—99.

146 Гурьянова JI.C. Чайный гриб - целитель в банке/ Л.С. Гурьянова, М.: ACT. СПб.: Сова: Владимир: ВКТ, 2008,- 7 с.

147 Toda К. Cellulose production by acetic acid-resistant Acetobacter xylinum/ K. Toda, T. Asakura, M. Fukaya, E. Entani, Y. Kawamura // J. Ferment. Bioeng., 1997, 84,- p. 228-231.

148 Кантере В.M. Теоретические основы технологии микробиологических производств/ В.М. Кантере, М.: Агропромиздат, 1990. - 277с.

149 Бирюков В.В., Основы промышленной биотехнологии/В.В. Бирюков, Москва, «Химия» - «Колос», 2004 г. - 296 с.

150 Atalla R.H. Native cellulose: a composite of two distinct crystalline forms/ R.H. Atalla, D.L. Vanderhart// Science, 1984, 223(4633).- p.283-285.

151 Hiroyuki Kono. CP/MAS 13C NMR Study of Cellulose and Cellulose Derivatives. 1. Complete Assignment of the CP/MAS 13C NMR Spectrum of the Native Cellulose/ Hiroyuki Kono, Shunji Yunoki, Tamio Shikano, Masashi

152 Hiroyuki Kono. Determination of the Through-Bond Carbon-Carbon and Carbon-Proton Connectivities of the Native Celluloses in the Solid State/ Tomoki Erata and Mitsuo Takai// Macromolecules, 2003, 36 (14) .-p. 5131-5138.

153 http://www.pischevie-volokna.ru/

154 Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. -3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во "Элевар", 2000. - 512 с.91

ПРИЛОЖЕНИЕ А (обязательное)

й Рге<«сЛюп РгоШег

209.11 15> [8.51763, 10.

970237]

.2 0.390688

«I €>

О

5-

п'1 м I т ■■г

I III I I II 'I 'I '—I I I—I, I I—I 1 I 1 I 1 I 1 II-Г—Т—I-1-г

о о о ^ о м Ч <с о о о о^ о сэ о о о1

0.5 х1

25 х2

25 ХЗ

10 х4

5

х5

Рисунок 1 - Проверка значимости коэффициентов регрессии по критерию Стьюдента для поверхностного культивирования

20

.а н о о

со £ <

О. С

15 -

10 -

5 -

Продуктивность, г/л РгесИ^е Р< 0001 Р8д=0.91 РМЭЕ=1.592

Рисунок 2 - Проверка адекватности линейного уравнения регрессии для

поверхностного культивирования

о

X

ш

|

> 5

С о

5.03441 7 " ^ [4.77164, 5 -5.2972 з I

1 -

2 0.19035 и ш о

ю

N Ч

1Л

м Н

о

о

.......'

11111

------ ;:.■.-

СМ1Л

1Л

1—I—I—I—г

о см о см ^ со

!:; н

1 I 1 I 1 I 1

о о о о о Г- г- см со

0.5 X

2.5 X

2.5 X

10 X

Рисунок 3 - Оценка значимости коэффициентов регрессии по критерию Стьюдента для глубинного культивирования

юс *

N О

о о о о о

о

со

1 23456789

Продуктивность, г/л Ргес1ю1е Р<0001 1^=0.94 РМ8Е=0.658

Рисунок 4 - Оценка адекватности линейного уравнения регрессии для

глубинного культивирования

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (дополнительное)

тт 5 ш»*®«

Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов

ФГУП Го сНИИГе нетика

0 Роотя РЛосгаэ 113545 1-ыи Дерет®«« преем 1 ГосНИИГенвгшв ВКПМ Л.« *,_),» 1~„ <095)3161210 фле [phone] -кис 411Г18 БЕЫОМ 5и Зл лм-з лр-пдделейка п.

№ 10547

НАЦИОНАЛЬНОЕ ПАТЕНТНОЕ ДЕПОНИРОВАНИЕ

СПРАВКА О ДЕПОНИРОВАНИИ

Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ)

ФГУП ГосНИИгенетика приняла на национальное патентное депонирование

культуру:

С1исопасеюЬас1ег Ьапзепп ОН-1/2008 Дата депонирования: 15 марта 2010 Депозитор:

Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Продукт, продуцируемый штаммом (область применения штамма)-

Уксусная кислота, пноконовая кислота. Продуцирует пленку целлюлозы, обладаем апгагоиисшчсскими свойствами

РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР ВКПМ: В-10547

Директор ВКПМ Синеокий С.П.

НА ИЗОБРЕТЕНИЕ

№ 2464307

ШТАММ БАКТЕРИИ СШССЖАСЕТОВАСТЕЯ НА№ЕШ1 вН-1/2008 - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

Патентообладателе ли): Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образовании "Московский государственный университет пищевых производств" (Яи), Громовых Татьяна Ильинична (!Ш),Динильчук Татьяна Николаевна (Ш1)

Автор(ы): см. на обороте

Заявка №2011121841

Приоритет изобретения 31 мая 2011 Г.

Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 октябри 2012 г. Срок действия патента истекает 31 мая 2031 г.

1'уководителъ Федеральной службы по инте.гяектуалыиш собственности

В.Г1. Симонов