Направленный биосинтез лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.18, доктор технических наук Авчиева, Пенкер Бабаевна

• Авчиева, Пенкер Бабаевна
• доктор технических наук
• 1997

Оглавление диссертации доктор технических наук Авчиева, Пенкер Бабаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.Щ-бЗ

1.1. Микробиологический синтез лимонной кислоты. Сырье и продуценты. Селекция высокопродуктивных штаммов гриба А.

§ег. Требования, предъявляемые к ним.

1.2. Механизм и основы направленного микробиологического синтеза лимонной кислоты. $0~3В

1.3. Динамика биосинтеза лимонной кислоты грибом А.

§ег и ассимиляция источника углерода и компонентов минерального питания.

1.4. Основные технологические этапы получения лимонной кислоты. ¿/¿"-^

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Ь'Ч

2.1. Продуценты лимонной кислоты и методы их культивирования. 6 У - Л

2.2. Селекция гриба А.

§ег.5? - 5 $

2.3. Получение конидий для поверхностной ферментации. 62 "

2.4. Методы контроля роста и биосинтеза лимонной кислоты, определения компонентов минерального у питания в среде. ^ " о /

Глава 3. СЕЛЕКЦИЯ ГРИБА А.МСЕИ И ОТБОР

АКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ.

3.1. Получение мутантов А.г^ег и селекция активных продуцентов лимонной кислоты. 6*3 ~

3.2. Изучение способности биосинтеза лимонной кислоты грибом A.niger F-718 при поверхностном и глубинном способах ферментации. Ёб^б^

3.3. Влияние наполнителей конидий на физиологическую активность посевного материала.&&'

Глава 4. ПОДГОТОВКА МЕЛАССЫ К

ФЕРМЕНТАЦИИ.& " Н

4.1. Влияние способа подготовки мелассы к ферментации на биосинтез лимонной кислоты.99 -//

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ НАПРАВЛЕННОГО БИОСИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ГРИБОМ A.NIGER." í6á

5.1. Влияние состава и физико-химических факторов среды на биосинтез лимонной кислоты при периодической ^^ ферментации гриба."

5.1.1. Влияние компонентов минерального питания./105.1.2. Влияние начальной величины рН среды на биосинтез лимонной кислоты и морфологию гриба. ^

5.2. Физико-биохимические закономерности биосинтеза и экскреции лимонной кислоты. i1/в

5.2.1. Электронно-микроскопические исследования структуры клеток гриба в процессе ферментации.

5.2.2. Влияние ПАВ на биохимическую активность гриба и экскрецию лимонной кислоты. /SS

Глава 6. ПОЛУЧЕНИЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ПРИ

НЕПРЕРЫВНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ ГРИБА у „

А • Т- TIO /б?"

A.niger F-718.'

6.1. Зависимость роста гриба и биосинтеза лимонной кислоты от скорости разбавления среды. 1У

6.2. Биосинтез лимонной кислоты при двухстадийной непрерывной ферментации гриба.

6.3. Морфологическая характеристика культуры гриба в процессе непрерывной ферментации.

Глава 7. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ И ЗАДАЧИ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОИЗВОДСТВА. ^

7.1. Обсуждение свойств и критерии выбора потребителей биомассы мицелия гриба A.niger.^ ~ ^^

7.2. Оценка мицелия как корма для сельскохозяйственных животных.- &

7.3. Амилолитичесая активность мицелия. Использование мицелия для ферментативного гидролиза крахмалсодержащего сырья. 6 "

1 А. Биосинтез лимонной кислоты на гидролизованных средах зерновых продуктов. Zs/sf

7.5. Получение водных растворов лимонной кислоты.

Испытания в производстве консервных продуктов. ¿¿^ ~ ^

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.Ш

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Направленный биосинтез лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger»

Актуальность проблемы. Одной из основных задач биотехнологии на современном этапе является разработка технологий, призванных ликвидировать нехватку пищевых продуктов, кормовых ресурсов, улучшить охрану окружающей среды, с одной стороны, а с другой - предстоит решение задачи безотходных технологических процессов, то есть без сброса промышленных сточных вод в водоемы. Решение этих вопросов требует досконального изучения путей и методов регуляции метаболизма микробной клетки, обеспечивающих направленный биосинтез ценных для народного хозяйства метаболитов.

Научные разработки, излагаемые в данной диссертационной работе, содержат новые принципиальные решения и подходы к организации непрерывного процесса производства лимонной кислоты и мицелиальной биомассы гриба А.г%ег.

Среди метаболитов, продуцируемых микроорганизмами, широкое применение в народном хозяйстве находят пищевые кислоты, в частности лимонная кислота. Благодаря своим вкусовым и физико-химическим свойствам она широко применяется в пищевой, медицинской, фармацевч/ и Тч тическои, косметической промышленности. В пищевои промышленности лимонная кислота в основном применяется в процессе производства кондитерских изделий, в производстве алкогольных и безалкогольных напитков, ею обрабатывают мясо, рыбу, фрукты для стабилизации аромата и цвета. Введение этой кислоты с продуктами питания в организм стимулирует секреторные функции поджелудочной железы, усиливая выделение поджелудочного сока и повышая усвояемость пищи. Для человека приемлема суточная доза лимонной кислоты 50-120 мг/кг.

- f

Продукты, содержащие лимонную кислоту, человек использует в питании с древнейших времен. Целенаправленное получение и использование данной кислоты для придания продуктам кислого вкуса началось в XYIII веке после открытия шведским химиком В.К.Шееле лимонной кислоты в плодах цитрусовых.

Интерес ученых к лимонной кислоте, как к продукту микробного метаболизма, возник после того, как в 1905 г. немецкий ботаник К.Вемер открыл способность двух видов грибов - Citromyces pfefferianis и Citromy-ces glaber образовывать лимонную кислоту как результат аэробного брожения. Позднее было установлено, что лимонную кислоту на сахарных средах могут образовывать также грибы Strigmatocystis nigra и Aspergillus niger. Дальнейшими исследованиями было показано, что продуктивность образования лимонной кислоты у A.niger выше, чем у остальных исследованных грибов.

С тех пор исследованиям по образованию лимонной кислоты указанным грибом в зависимости от условий культивирования, от источника углерода, минерального состава питательной среды и т.д. посвящены научные труды ученых многих стран мира.

После изучения и освоения микробиологического способа производства этой кислоты объемы промышленного производства данным способом неуклонно возрастают. На сегодняшний день самым крупным производителем лимонной кислоты являются США, в частности фирмы «Ch.$dZ^\«Miles Laboratories, 1пс», которые вырабатывают ее как внутри страны, так и на своих предприятиях во многих других странах.

В России в настоящее время лимонную кислоту вырабатывают в основном на Белгородском заводе лимонной кислоты. Большую роль в развитии и совершенствовании отечественного производства сыграли научные и практические разработки сотрудников Санкт-Петербургского ВНИИ пищевых ароматизаторов, кислот и красителей.

В последствии в ИБФМ под руководством Т.В.Финогеновой были начаты и продолжаются по настоящее время исследования по подбору других продуцентов лимонной кислоты и источников сырья.

В ГосНИИсинтезбелок под руководством проф. Винарова А.Ю. разработаны и реализуются методы оптимального технологического проектирования модульных установок по получению лимонной кислоты из различных субстратов.

Таким образом на сегодняшний день накоплен достаточно большой опыт в области получения и производства лимонной кислоты. Однако в промышленных условиях ее в основном производят путем периодической глубинной ферментации гриба Aspergillus niger на сахаро- и крахмалосо-держащих средах.

В Италии и Японии производят небольшое количество лимонной кислоты путем периодической ферментации дрожжей на средах, содержащих в качестве источника углерода н-парафины.

Несмотря на то, что ежегодный объем мирового производства лимонной кислоты на основе указанных выше источников углерода достигает 450 тыс. тонн в год, потребность в ней удовлетворяется далеко не полностью. Доля лимонной кислоты на душу населения в нашей стране в настоящее время в 2,8 раза ниже, чем в ведущих капиталистических странах. В связи с чем особую актуальность в настоящее время приобрели разработки, направленные на интенсификацию и повышение производительности данного производства. К проблемам данного производства относятся также высокие затраты сырья, энергии, топлива и воды, что приводит к увеличению себестоимости продукта. Снижение удельного расхода этих показателей может быть достигнуто путем использования высокопродуктивных штаммов - продуцентов лимонной кислоты, применения стимуляторов кислотообразования, совершенствования технологии и аппаратурного оформления технологического процесса.

Основной энергоемкой и наиболее трудоемкой стадией производства лимонной кислоты является стадия ферментации. Продолжительность этой стадии при периодическом способе производства составляет 79 суток, а концентрация лимонной кислоты в среде достигает 10-14%.

Основным критерием оценки эффективности стадии ферментации является производительность процесса, что определяется продолжительностью ферментации и концентрацией конечного продукта в среде. Поэтому проблемы интенсификации производства лимонной кислоты, увеличения и снижения себестоимости продукции относятся к первоочередным задачам данного производства.

Исследованиями последних лет показано, что оптимизация стадии ферментации, в том числе и сокращение ее продолжительности, позволяет значительно повысить эффективность всего процесса производства лимонной кислоты. Одним из перспективных направлений, обеспечивающих оптимизацию этой стадии, является разработка технологии непрерывного процесса производства лимонной кислоты. Реализация этих задач и максимальное использование всех возможностей производства в целом требует значительно более глубокого изучения физиолого-биохимических закономерностей и особенностей, связанных как с ростом культуры, так и с биосинтезом лимонной кислоты.

Изучению указанных закономерностей при периодическом и непрерывном способах ферментации гриба Aspergillus niger на средах, содержащих различные источники углерода, и разработке непрерывной ферментации продуцента лимонной кислоты и посвящено настоящее исследование.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей биосинтеза лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger, а также оптимизация условий биосинтеза биомассы и лимонной кислоты.

В связи с этим в число основных задач настоящей диссертационной работы входило:

- подбор высокоактивных штаммов гриба A.niger - продуцентов лимонной кислоты;

- изучение влияния способа очистки мелассных питательных сред на биосинтез лимонной кислоты;

- изучение условий получения посевного материала, обеспечивающих максимальное кислотообразование продуцентом;

- изучение биохимических закономерностей биосинтеза и экскреции лимонной кислоты в зависимости от физиологического и морфологического состояния культуры;

- подбор и оптимизация условий, обеспечивающих направленный биосинтез лимонной кислоты при непрерывном способе ферментации продуцента;

- разработка технологического режима производства лимонной кислоты при непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger.

Научная новизна работы. Детально изучены биохимические закономерности биосинтеза и экскреции лимонной кислоты грибом A.niger при периодической и непрерывной ферментации в зависимости от физиологического и морфологического состояния культуры.

Впервые исследована ультраструктура мицелия гриба в фазе роста и биосинтеза лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба. Показано, что биосинтез и экскреция лимонной кислоты зависят от фазы роста культуры и проницаемости клеточной мембраны.

- а

Максимальное накопление лимонной кислоты в среде имеет место в стационарной фазе; морфологические исследования клеток в этот период показывают нарушение целостности их структуры.

Показано, что условия получения и активность посевного материала существенно влияют на активность биосинтеза лимонной кислоты грибом. Наибольшая активность образования лимонной кислоты отмечается при использовании посевного материала, полученного путем подращивания мицелия гриба на среде, содержащей 2% редуцирующих веществ и оптимальные концентрации цинка, кобальта и молибдена.

Впервые показана возможность удаления избытка минеральных элементов из мелассных сред, особенно железа, путем сорбционной очистки с применением клиноптилолита. Очистка мелассы с помощью кли-ноптилолита исключает наличие в среде свободного ферроцианида и облегчает процесс подготовки мелассы к ферментации, так как при этом отсутствуют стадия обработки мелассы гексацианоферроатом калия и стадия нейтрализации свободных цианидов, что обеспечивает экологическую чистоту этого процесса.

Впервые установлена взаимосвязь между начальной величиной рН среды, размером мицелиального клубка и активностью биосинтеза лимонной кислоты грибом. Показано, что чем ниже начальная величина рН, тем мельче и плотнее мицелий и тем выше активность синтеза лимонной кислоты.

Показана возможность организации производства лимонной кислоты путем ферментации гриба в непрерывном двухстадийном режиме. При этом первая стадия характеризуется как стадия роста культуры, а вторая -стадия биосинтеза лимонной кислоты. Показана возможность индукции экскреции лимонной кислоты на второй стадии с применением пермеаби-лизирующих реагентов, (твин-40 и твин-80).

Практическая ценность работы заключается в том, что разработаны технологические способы интенсификации по основным стадиям производства лимонной кислоты, в частности, по стадиям подготовки мелассы к ферментации, получения посевного материала, ферментации, в том числе при одно- и двухстадийной непрерывной ферментации. Данные разработки позволили интенсифицировать процесс биосинтеза лимонной кислоты, а также обеспечить экологически безопасную и экономически эффективную технологию получения лимонной кислоты.

Селекционирован и испытан в промышленных условиях высокопродуктивный штамм гриба A.niger Р-718. В результате промышленных испытаний показано, что штамм по морфологическим, биохимическим и технологическим особенностям удовлетворяет требованиям, предъявляемым к продуцентам лимонной кислоты в промышленных условиях. Штамм накапливает в промышленном ферментере объемо/ч 100 м3 до 14,4% лимонной кислоты.

На основании промышленных испытаний выданы рекомендации по подготовке питательных сред к ферментации и по технологии получения посевного материала.

На основе результатов работы разработаны исходные данные для организации промышленного производства лимонной кислоты непрерывным способом. Промышленная реализация технологии осуществляется в условиях Белгородского завода лимонной кислоты и начата на Краснодарском гидролизном заводе. Разработаны, утверждены и реализованы в промышленных условиях технические условия на водные растворы (10%-ный и 50%-ный) лимонной кислоты, предназначенные для использования в пищевой промышленности.

Публикации. По материалам диссертации автором опубликованы 32 работы, в том числе 3 обзора, 11 авторских свидетельств и патентов (в том числе и Европейских).

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на 4-й международной конференции молодых специалистов в Болгарии (1990 г.), на конференции «Концепция создания экологически чистых регионов» в Волгограде (1991 г.), на международной конференции Interbiotech-92 в Болгарии. Материалы диссертации докладывались на международной школе в Тарту (1993 г.), на конференции-выставке "Достижения Российской биотехнологии" в Берлине (1997 г.), на международной выставке-конференции в Ганновере (1997 г.) и на симпозиуме "Биотехнология-97" в Манане (1997 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения.

Заключение диссертации по теме «Технология биологически активных веществ», Авчиева, Пенкер Бабаевна

выводы

1. В результате многократного отбора и обработки мицелия гриба химическими мутагенами получен мутантный штамм гриба А.п^ег Р-718, отличающийся от исходного штамма высокой активностью образования лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации.

По сравнению с исходным штаммом полученный штамм синтезирует в среднем на 17% больше лимонной кислоты.

Испытание штамма в промышленных условиях показали, что штамм не утрачивает стабильности свойств и накапливает в промышленных ферментерах до 14,5% лимонной кислоты против 10,2 и 11,2%, накапливаемых внедренными на заводе штаммами.

Подобран и оптимизирован состав биологически активного наполнителя конидий, способствующего повышению биохимической активности посевного материала.

Испытания наполнителя конидий в промышленных условиях обеспечило сокращение цикла прорастания и увеличение съема лимонной кислоты (по сравнению с контрольным наполнителем) на 8,3%.

2. Показана высокая эффективность сорбционной очистки мелассы от нежелательных примесей с помощью клиноптилолита. Применение данного способа очистки способствует более полному удалению избытка железа из среды и сокращению числа технологических операций на стадии приготовления сырья.

3. Обнаружено существенное влияние начальной величины рН среды на активность биосинтеза лимонной кислоты при периодической ферментации гриба.

Установлено, что оптимальные для биосинтеза лимонной кислоты значения рН зависят от состава и качества сырья. При ферментации гриба на синтетической питательной среде оптимальная для биосинтеза лимонной кислоты начальная величина рН составляет 2,4"; на мелассной питательной среде - оптимальные для синтеза лимонной кислоты рН лежат в пределах 4,5-5,5.

4. Установлена взаимосвязь начальной величины рН среды, размером мицелиального клубка и активностью биосинтеза лимонной кислоты. Показано, что чем ниже начальная величина рН, тем мельче и плотнее мицелий и тем выше активность синтеза лимонной кислоты грибом.

5. Исследования ультраструктуры мицелия на разных стадиях развития гриба позволили выявить ряд общих закономерностей, характеризующих особенности культуры в фазах роста и продуцирования лимонной кислоты.

Установлено, что переход культуры на продуцирование лимонной кислоты сопровождается разрыхлением цитоплазмы и частичным лизисом клеточной стенки на начальном этапе (через 72 часа от начала ферментации) и существенным нарушением целостности структуры, а также увеличением проницаемости клеток в период интенсивного накопления лимонной кислоты (120 часов). Снижение и прекращение накопления лимонной кислоты грибом (144-168 часов) сопровождается появлением в среде более 50% полупустых и пустых нефункционирующих клеток.

6. Показана возможность управления процессом экскреции лимонной кислоты и сокращения продолжительности ферментации путем добавления в питательную среду соединений, влияющих на проницаемость клеток микроорганизмов, в частности твина-40.

Электронно-микроскопические исследования морфологии и структуры гриба в присутствии твина в среде показали, что ультраструк

- ¿¿//тура мицелиальных клеток 5-суточной культуры, выращиваемой при добавлении оптимальных концентрация твина, аналогична ультраструктуре 7-суточной культуры без добавления твина.

7. Установлено, что, несмотря на взаимосвязь условий культивирования и образования лимонной кислоты, оптимальные условия для роста гриба и биосинтеза лимонной кислоты не совпадают. Максимальная эффективность по данным показателям достигается при установлении стабильного режима для каждой стадии отдельно, что легче всего достигается при двухстадийном непрерывном ведении процесса.

Разделение стадий роста и биосинтеза лимонной кислоты позволяет управлять параметрами процесса на каждой стадии в зависимости от его назначения. Оптимизация параметров на каждой из стадий позволяет ведение процесса в непрерывном режиме с продуктивностью 2,4 г/л-час против 0,51 г/л-час при периодической и 1,35 г/л-час при непрерывной одностадийной ферментации.

Проведенные исследования легли в основу создания исходных данных для организации производства лимонной кислоты и ее водных растворов в России и за рубежом.

- мл

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Решение проблемы создания экономически эффективной технологии производства лимонной кислоты путем микробиологического синтеза возможно лишь при комплексном решении всех взаимосвязанных технологических этапов данного процесса, начиная от получения и хранения культуры и завершая утилизацией отходов.

Проведенные нами исследования были начаты с получения активного продуцента лимонной кислоты; устойчивого к изменяющимся факторам среды в промышленных условиях. В результате всестороннего изучения физиологических и морфологических факторов роста и биосинтеза лимонной кислоты полученным штаммом и оптимизации «заученных факторов разработана технология получения лимонной кислоты при двухстадийной непрерывной ферментации гриба.

При этом предварительно оптимизированы взаимосвязанные с ферментацией стадии получения посевного материала и подготовки сырья к ферментации. Предложенный способ очистки мелассы от нежелательных примесей позволяет беспрепятственно использовать побочный продукт производства лимонной кислоты - мицелий гриба А.ш§ег, поскольку исключается наличие в продукте свободных или связанных цианидов.

С учетом современного состояния экономики и необходимостью перехода предприятий на расширение ассортимента выпускаемой продукции предусмотрен также вариант производства концентрированных водных растворов в общей технологической цепочке получения кристаллической лимонной кислоты.

По предварительным расчетам, производство лимонной кислоты при двухстадийной непрерывной ферментации гриба, одновременное производство ее водных растворов и производство кормового мицелия позволит в два раза увеличить экономическую эффективность предприятий производства лимонной кислоты.

Список литературы диссертационного исследования доктор технических наук Авчиева, Пенкер Бабаевна, 1997 год

1. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Биосинтез лимонной кислоты из н-парафинов мутантным штаммом С.Нро1уПса 917-1.- Биотехнология, 1992, №3, с.65-68.

2. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Получение мутантов дрожжей С. 1ро1уйса активных продуцентов лимонной кислоты.- Микробиология, 1993, т.62, в.2, .243-248.

3. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю., Биосинтез лимонной кислоты при непрерывной ферментации. Экскреция лимонной кислоты.- Биотехнология. 1992, №1, с.46-49.

4. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Питательная среда для получения лимонной кислоты. Патент РФ. № 2007459, 1995г.

5. Авчиева П.Б. Технология применения нового физиологически активного наполнителя при производстве лимонной кислоты. МГЦНТИ, 1997, №1-97, с. 1-3.

6. Авчиева П.Б. Подготовка питательной среды к ферментации в производстве лимонной кислоты. МГЦНТИ, 1996, №2-96, с. 2-3.

7. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Способ получения посевного материала в производстве лимонной кислоты. Заявка на патент № 94017790, 1994. Решение о выдаче 1995г.

8. Авчиева П.Б. Штамм гриба A.niger Р- 718 продуцент лимонной кислоты. Заявка на патент № 116989, 1995. Решение о выдаче 1996г.

9. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Биосинтез лимонной кислоты при непрерывной ферментации гриба A.niger. Прикладная биохимия и микробиология. 1992, в.4, т.29, с. 567-575.

10. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Побочные продукты производства лимонной кислоты компоненты комбикормов.- Комбикормовая промышленность, 1994, № 1, с. 33-34.

11. Авчиева П.Б., Винаров А.Ю. Углеводно-минеральный концентрат. Комбикормовая промышленность, 1994, № 1, с. 30-32.

12. Авторское свидетельство СССР № 488850, кл. С 12 d 13/10, С 12 К 3/00, 1976г.

13. Алиханяи С.И. Селекция промышленных микроорганизмов. Москва, "Наука", 1968, с. 151.

14. Буткевич B.C., Тимофеева А.Г. Влияние отдельных минеральных элементов питательной среды на образование кислот грибом A.niger. В кн.: Буткевич B.C. Избранные труды, т. 1, "Изд. АН СССР", 1957, с. 373.

15. Бережной Ю.Д., Новикова Л.А. и др. Способ получения лимонной кислоты. АС СССР, № 51050 9, 1996г.

16. Бабаев И.С. и др. Применение природного цеолита -клиноптилолита в биотехнологических процессах очистки воды.: Обзор информации. Баку: АзНИНТИ, 1981, 22с.

17. Бутковский В.А., Мельников Е.М. Технология мукомольного, крупяного и комбикормового производства. Москва, В.О."Агропромиздат", 1989, с. 252-310.

18. Винаров А.Ю., Сидоренко Т.Е. Стехиомические характеристики синтеза лимонной кислоты на смеси углерод-содержащих субстратов. Прикладная биохимия и микробиология, 1997, 33, 1, с.57-60.

19. Василев Н., Василева М. Биосинтез на органични киселини с имобилизирани клетки. Спис. Бълг. АН. -1988, т.34, №3,с. 30-35.

20. Голубцова В.М. Селекция и культивирование A.nigerв производстве лимонной кислоты. Автореферат канд. Диссертации. М., 1979г.

21. Гаврилова H.H., Пятаева Н.И. Подбор питательной среды для биосинтеза пектолитических ферментов грибом A.niger. -Биотехнология 1985, №1, с.615-623.

22. Глущенко H.A., Карпов П.Ф., Глущенко Л.Ф. Физиологическая активность продуцента лимонной кислоты. Изв. Вузов СССР. Пищевая технология, 1982, №2, с. 102-104.-¿(/У

23. Грачева И.М., Гаврилина H.H., Иванова JI.A. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М. Пищевая промышленность, 1980, с. 63-83.

24. Голубцова В.М., Щербакова Е.Я. и др. Способ получения посевного материала для производства лимонной кислоты поверхностной ферментацией. A.C. СССР № 1409658, МКИ, С 12 N 1/14, 1988г.

25. Голубцова В.М., Потехина В.А. Действие pH на синтез лимонной кислоты. Хлебопекарная и кондитерская промышленность, 1981, №10, с.43-44.

26. Емельянова И.З. Химико-технический контроль гидролизных производств. Москва,Лесная промышленность, 1969, с.367.

27. Жаболовская H.A., Агеев А.Н., Петрова А.Ф. Методы определения органических кислот. Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1968, т.5, с.22-25.

28. Журавский Г.И., Терентьева О.Ф. и др. Способ получения лимонной кислоты. АС СССР, № 432181, 1974.

29. Журавский Г.И., Аглиш И.В. Рост и кислотообразование у A.niger. Сообщ.У. Микология и фитопатология, 1974, вып.1, с. 15-22.

30. Имщенецкий A.A., Щербакова Е.Я. О корреляции, существующей между морфологическими и физиологическими изменениями у мутантов A.niger. -Микробиология, 1964, т. 33, в. 1, с. 252-260.

31. Карклинын Р.Я., Пробок А.К. Биосинтез органических кислот. Изд. "Зинатне", Рига, 1972, с. 80-95.

32. Костычев С.П. Избранные труды по физиологии и биохимии микроорганизмов. Москва, АН СССР, 1956, т.2, 508с.

33. Камзолова C.B., Шишкакова Н.В. и др. Биосинтез лимонной и изолимонной кислот дрожжами Y. lipolyticaNl в зависимости от концентрации кислорода и железа в среде. -Прикладная биохимия и микробиология, 1997, т.ЗЗ,4, с.403-407.

34. Камзолова C.B., Шишкакова Н.В. и др. Влияние ионов железа на биосинтез лимонной и изолимонной кислот мутантом Y.lipolytica N1 в условиях непрерывного куль-тивированияю Прикладная биохимия и микробиология, 1996, т.32, №1, с.39-42.

35. Караджян а.М., Чиркинян А.Г. Применение природных цеолитов в животноводстве и растениеводстве. Тбилиси: Мецниереба, 1984, с. 25-27.

36. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В. Микробиологический синтез органических кислот из углеводородов нефти. -Журнал Всес. хим. Общества им. Менделеева, 1972, т.17, №5, с. 526-532.

37. Львова Е.Б., Выборгова Т.В., Бережной Ю.Д. и др. Способ получения лимонной кислоты. A.C. СССР №1419152 25.06.86.

38. Мандева Р.Д., Ермакова И.Т. и др. Условия и динамика экскреции цитрата, изоцитрата и полиолов при росте дрожжей на глюкозе. Микробиология, 1981, т.50, в.4, с. 636-644.

39. Минц Е.С., Иванова Л.Ф. и др. Способ подготовки мелассы к сбраживанию при производстве лимонной кислоты.

40. АС СССР № 526659, С 12 Д 1/04, 1976г.

41. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И., Рыбалченко О.В. Влияние конденсанта формальдегида на продуцент лимонной кислоты A.niger. Биотехнология, 1997, № 5, с. 28-32.

42. Минц Е.С., Иванова Л.Ф. и др. Способ подготовки мелассы к ферментации при производстве лимонной кислоты. A.C. СССР №454992 15.11.73.

43. Михайлова Р.В., Пробанок А.Г., А.П., Захаренко И.Н. Специфические эстеразы грибов рода A.niger и Fusarium.- Прикладная биохимия и микробиология, 1977, т.ЗЗ, № 5, с. 492-496.

44. Маслова Т.И., Смирнов В.А. Оптимизация параметров лимоннокислого брожения. НТРС, 1979, сер.З, в. 1, с. 6-9.

45. Меткин В.П., Аглиш И.В., Львова Е.Б. и др. Способ получения лимонной кислоты.-А.С. СССР №813968, 1978г.

46. Никифорова Т.А., Щербакова Е.Я. Продуценты пищевой лимонной кислоты для культивирования в глубинных условиях. Обз.информация, сер. 22, АгроНИИТЭИПП, 1995, №2, с. 1-19.

47. Нагиб Мохамед, Кирова Е., Денчев Д. Биосинтеза на лимонена кисилена при дъябочинно культивиране на плесеннии гъби от A.niger. Научн. тр. Высш. инст. хранит, и вкус, пром-ть. Пловдив, 1991, -38, №2, р.153-161.

48. Никифорова Н.Г., Сухаревич В.И. Повышение эффективности биосинтеза лимонной кислоты при культивировании продуцента A.niger в глубинных условиях. Биотехнология, 1985, №1, с. 68-70.

49. Никифорова Т.А., Фишкова Э.С., Львова Е.Б., Лыкова Л.А. Влияние ПАВ на биосинтез лимонной кислоты глубинной культурой A.niger. Межвузовский сборник научных трудов "Получение и применение регуляторов роста". Санкт-Петербург, 1986г., с.94-100.

50. Орлов И.Н., Федосеев В.Ф. и др. Способ получения лимонной кислоты. A.C. СССР № 229413,1986г,

51. Озолс А.Я., Вальдман А.Р., Карклиньш Р.Я. "Биостим С" новый премекс для обогащения корма откармливаемых свиней. В.кн.: Клрмовые концентраты лизина. Рига: Зинатне, 1977, 178 с.

52. Осе И.К. Влияние твинов на изменение активностинакопления а-кетоглутаровой кислоты культурой Pseudomonas nonliquetaciens . // Биосинтетические и физиологические свойства микроорганизмов. Рига . 1975.-с.41-45.

53. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. Мир, 1978, с.27-28. .

54. Практические работы по физической химии. Под ред. Мищенко К.П., Равделя A.A., Пономаревой A.M. Л.: Химия, 1982, - 398 с.

55. Патент Австралии № 392799, МКИ, С 121 Р 7/48.

56. Пелумане И.Ж., Корде Г.В., Кестре Б.Я. Влияние ПАВ на биосинтез изолимонной кислоты парафиноассимилиру-ющими дрожжами // Биосинтез оксикислот и кетокислот микроорганизмами. Рига, 1984. - с.32-34.

57. Патент РФ № 248377. "Полунепрерывный способ получения лимонной кислоты". МКИ С 12 Р 7/48, 1989г.

58. Патент Австрии №293313 кл. G F 16. 1971г.

59. Проблемы пушного звероводства. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, 1997, Родники, 115с.

60. Соколов Д.М., Содовникова Н.Ю. и др. Роль фосфокиназы в регуляции синтеза лимонной кислотыYarrowia lipolytica.- Прикладная биохимия и микробиология, 1996, т. 32, №3. с. 315-319.

61. Смирнов В.А. Пищевые кислоты. Москва. Легкая и пищевая промышленность, 1983, с. 97-119.

62. Способ получения лимонной кислоты из н-парафина и/или олефина. Заявка Японии №3-2517 16.01.91. № 1-63.-¿vt

63. Способ ферментационного получения лимонной кислоты из углеводов. Заявка Германии №40 28726. 02.05.91.

64. Терентьева О.Ф. О роли ферроцианида калия в процессах роста и кислотообразования у A.niger. Тр. ЛНИИПП, 1971, т. 1, с. 52-63.

65. Терентьева О.Ф. Азотное и минеральное питание A.niger в зависимости от методов культивирования его в производстве лимонной кислоты. Автореф. канд. диссертации,. Л: 1971г.

66. Технологическая инструкция по производству лимонной кислоты. Санкт-Петербург 1981, -130с., с.7.

67. Типовой технологический регламент производства хлебопекарских дрожжей. М. "Легкая и пищевая промышленность" 1983, с.276.

68. Тарасевич Ю.И. Природные сорбенты в процессах очистки воды. Киев. : Наукова думка, 1981, 208с.

69. Финогенова Т.В. Биосинтез органических кислот и его регуляция. Автореферат докт. дисс. Пущино, 1982.

70. Фаусек Е.А., Шишканова Н.В. и др. Активность ферментов цитратного и глиоксилатного циклов при росте C.lipolytica на среде с этанолом и синтезе изолимонной кислоты.- Микробиология, 1991, т.60, в.1, с. 17-21.

71. Финогенова Т.В. Метаболизм апканов и синтез продуктов микроорганизмами. Пущино ОНТИНЦБИ, 1991, с.96-114.

72. Финогенова Т.В., Илларионова В.И., Лозинов А.Б. Образование лимонной кислоты дрожжами C.lipolytica при росте на н-парафинах. Микробиология, 1973, t.XL11, в.5, с. 790-794.

73. Финогенова Т.В., Камзолова C.B. и др. Влияние удельной скорости роста и ионов цинка на синтез лимонной и изолимонной кислот, состав биомассы дрожжей Y.lipolytica 1.- Прикладная биохимия и микробиология, 1996, т. 32, № 1, с. 34-38. л

74. Фаусек E.A., Шишканова H.B. и др. Активность ферментов нитратного и глиоксилатного циклов при росте C.lipolytica на среде с этанолом и синтезе изолимонной кислоты. -Микробиология, 1991, т.60, в.1, с. 17-22.

75. Фостер Д. Химическая деятельность грибов. М. Изд. Иностранная литература, 1950, с. 112.

76. Федосеев В.Ф., Смирнов В.А. и др. Способ производства лимонной кислоты. A.C. СССР 554282 11.08.75.

77. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии, 1975, М.Просвещение, с.318.

78. Фертман Г.И., Шойхет М.И. Технологический контроль бродильных производств. Изд. Пищевая промышленность. Москва, 1969, с. 68-72.

79. Федосеев В.Ф., Бережной Ю.Д., Бименская И.С. Способ производства лимонной кислоты из мелассы. A.C. СССР №1201303, 13.12.83.

80. Хавезов И., Зецалев Д. Атомно-адсорбционный анализ. -Л.Химия, 1983.

81. Цицинешвили Г.В., Андроникошвили Т.Г. и др. Природ-ние цеолиты. М.: Химия, 1985, 224 с.

82. Чемицев Н.Ф., Беренштейн Б.Г., Володин В.Ф. Цеолиты -новый тип минерального сырья. М.: Недра, 1987, 176 с.

83. Шишканова Н.В. Получение мутантов дрожжей C.lipolytica 704. Прикладная биохимия и микробиология, 1979, т. 15,с. 555-558.

84. Щербакова Е.Я. Изменчивость A.niger продуцента лимонной кислоты под влиянием ультрафиолетовых лучей. - Автореферат канд. Диссертации. М.1966г.

85. Щербакова Е.Я. Изменчивость и селекция A.niger продуцента лимонной кислоты под влиянием химических мутагенов. - Тр. ЛНИИПП, 1971, т.1, с. 3-5.

86. Aiba S., and Matsuoka M. Citrate productione from n-alkane by Candida lipolytika in referense to carbone fluxes in vivo. Eur. J. Of Applied Microbiology and Biotechnology, 1978, 5, p.247-261.

87. Ashy M.A. and Abow-Zeid A.A. Production of citric acid. -Zbl.Mikrobiol., 1982, 137,p.395-405.

88. Briffaud J., Engasser M. Citric Acid Production from Glucose.II. Growth and Excretion Kinetics in a Trickle-Frow Fermentor. -Biotechnology and Bioengineering, 1979, v.XXI, p.2093-2111.

89. Berry D.R., Chimel A. and Al Obaidy Z. Genetics and Physiology of the A.niger, edited by Smith J.E. and Pateman J. A. (Academic Press, London, New York, San Francisco). 1997, p.405-426.

90. Bruchmann E.E. Citronenqauer fermentation, Wasserstoffperoxid and Chevermetalle. Chemiker Zeitung. 1980, jg. 104, N10, p.291-293.

91. Bhat H.K., Oazi G.N., Choppa C.L. Effect of 5-hydrozymethylfurftiral on production of citric acid by A.niger. Indian J. Exper. Biol. 1984, 22 (1), p.37-38.

92. Behrens U., Thiersch A., et al. Particularities in the Kinetics of Growth and Citric acid accumulation by Sach. .lipolytica. -Acta Biotechnol. 1987, 7, N2, p.179-183.

93. Briffaut J. Cinetique comparée de la production d'acide citrique en fermenteurs homogene et heterogene. Influence de la limitation diffiisionnelle de l'oxygene. Doctoral thesis, University of Nancy, France, 1978.

94. Currie J.N. The citric acid fermentation of A.niger. J. Biol. Chem. 1917,32, p.15.

95. Charely R.C. Production of citric acid fermentation system. PhD Thesis, University of Strathclyde, 1981,p. 1 -243.

96. Cameselle Claudio, Bis. Bernard, et al. Mejora en la producion de acido citrico hor efecto de la inmovilizacion de A.niger. -Afmidad- 1996, 53, N463, p.181-188.

97. Chen Hung-Chang. Optimizing the concentration of carbon, nitrogen and phosphorus in a citric acid fermentation with responge Surface method. Food Biotechnol. 1996, v. 10, N1p. 13-27.

98. Clark D., Ito K., Horitsu H. Effect of manganese and other heavy metals on submerged citric acid fermentation of molasses. -Biotechnology and bioengineering, 1996, N4, p.465-471.

99. Charles L. Meyer and Eleftherios T. Papoutsakis. Increased level of ATF and NADH are associated with increased solvent production in continuous cultures of Clostridium acetobutylicum. Dep. Of Chemical Engineering Rice University P.O. Box, 1982, Texas.

100. Dagiey S. (1974). Citrate UV spectrophotometric determination. -Methods of Enzymatic Analysis,vol.3,p. 1562-1565. Edited by Bergmeeyer H.U. New York and London: Academic Press.

101. Ding-Bang X., Christian P. Kubicek, and Max Rohr. A comparison of factors influencing citric acid production by A.niger grown in submerged culture and on filter paper. Appl. Microbiol. Biotehnol, 1989, 30, p. 444-449.

102. Dukis Dragutin, Markovin Goran, Jlastic Milomirka. Tehnoloski aspekt biosinteze limunske kiselin pri dubinskoj fermentacii A.niger. Nauka u praksi -1991,21,p. 149-158

103. Dawson M.W., Maddox J.S., Brooks J.D. Evidence for nitrogen catabolite repression during citric acid production by A.niger under phosphate limited growth conditions. Biotechnol. and Bioeng. 1989, 33, 11, p.1500-1504.

104. Denchev D., Gerginova M., Kaimattchev A. Citric acid production on ethanol by yeast. ^oKji.Eojir.AH. 1995, 48, N5, p.63-66.

105. Dawson M.W. and Maddox I.S. Application of Fed-Batch Culture to citric acid production by A.niger: The effect of Dilution Rate and Dissolved Oxygen Tension. - Biotechnology and Bioengineering,1988, v.32, p.220-226.

106. Hamissa F.A., Gad Anbar S. Treatment of beet molasses for citric acid production by a potent strain of A.niger. Van Tieghem. Bioresour Technol. 1992, 39, 2, p.191-197.- a z

107. Esuoso Kayede O., Oderinde Rotimia, Okogun Josephy.

108. Citric acid production from imuemu Cyperus esculentus and maize Zeamays. J.Ferm. andBioeng. 1991, 71,3, p.200-202.

109. Furukawa T. and Ogino T. Citric Acid Production from n-Parafflns by Use of a Semicontinuous Cell-Recycle System. - J.Ferment. Nechno., 1982, Vol.60, No.4, p.377-380.

110. Furukawa T., Ogino T. and Matsuyoshi T. Fermentative production of citric acid from n-paraffins by Saccharomycopsis lipolytica. -J.Ferment. Technol., 1982, v.60, №4,p.281-286.

111. Folsh J., Lees M., Seogne Stanley G.H. A simple method for the isolation and participation of total lipids from animal tissues. -J.Biol.Chem., 1957, 226, p.497-501.

112. Greenshields R.N. Economic mirobiology, 1978, v.l. Primary products of metabolism. Academic Press, London.

113. Garg K. Bioconversion of sugarcane molasses to citric acid. PhD Thesis, University of Roorkee, Roorke, India, 1990.

114. Gradisnik-Grapulin Majda, Jegisa Matic. Comparison of specific metabolic characteristics playing a role in citric acid excretion between some strains of the genus Aspergillus. J.Biotechnol., 1996, 45, N3, p.265-270.

115. Hattori K., Yokoo S., and Imada O. Effect of ammonium ion on the ratio of citric acid to d-isocitric acid formed from n-paraffin.- Journal of Fermentation Technology, 52, p. 542-550.

116. Hamissa F.A., Abow-Zeid and Radwan A.A. Influence of Micronutrients on citric acid production by C.lipolytica

117. Y 1095. -Zbl.Bakt.,1980,105,p.332-338.

118. Hattori K., Yokoo S. and Imada O. Effect of Ammonium ion on the Ratio of citric acid to d-isocitric acid formed from n-paraffins.

119. J. Ferment. Technol., 1974,v.52,№8,p.542-550.- JLÏ3~

120. Habison A., Kubicek C.P., Rohr M. Phosphofructokinase as a regulatory enzyme in citric acid producing A.niger. FEMS -microbiol. Lett., 1979, N1, p.39-42.

121. Kahlon S.S., Kalra K.L., et al. Citric acid production by A.niger. J.Res. Punjab Agr. Univ. 1991, 28, N4, p.521-528.

122. Kubicek C.P., Rohr M. (1977) Influence of manganess on enzyme synthesis and citric acid accoumulation by Aspergillus niger. -European J.Appl.Microbiol. 4, p. 167-173.

123. Kibicek C.P., Rohr M. (1986) Citric acid fermentation. CRC Crit Rev Biotechnol 3, p.331-373.

124. Kantova H., Rymoweiz W. et al. The utilization of beet molasses in citric acid production with yeast. Sei. Alim. 1992, 12, 3, p.383-391.

125. Kirimura K., Nakajima J. et al. Improvement in citric acid production of A.n. diploid strains. J.Ferm.Tech.1988, v.66, №4, p.375-382.

126. Kirimura K., Nakajima I., Lee S.P., Kawabe S., Usami S. (1988). Citric acid production bu the diploid strains of Aspergillus niger obtained by protoplast fusion. Appl.Microbiol.Biotechnol 27:p.504-506.

127. Kirimura K., Lee S.P., Nakajima J., et al. Improvement in citric acid production by Haploidization of A.niger Diploid strains. -J.Ferm.Tech. 66, 4, p.375-382.

128. Kubicek C.P., Rohr M. Novel trends in physiology of citric acid production. Overproduction of Microbial Products. 1982. Academic Press, London-New York, p.253"

129. Khan A.H. and Grose T.K. Kinetics of citric acid production by A.niger. Journal of Fermentation Technology, 51,(1973),p. 734-741.

130. Kamal K.S.S. and Gupta B.K. Some cultural conditions (hydrogen ion concentration, incubation period and temperature) affecting citric acid production by A.niger strain. Life Science Advancer, 1, (IB), (1982), p.89-93.

131. Katarina Jernejc, Aleksa Cimerman, et al. Lipids of a citric acid production in copper- and manganese-supplement media. -Applied microbiology and biotechnology. 1990, v.32, N6, p. 99-103.

132. Kristiansen B. and Sinclair C.G. Production of citric acid in continuous culture. Biotechnology and bioengineering, 1979, v.XXI, p. 297-315.

133. Kahion S.S., AroraM., Kaur J., J.Res. Optimization of parameters for production of citric acid by immobilized A.niger.

134. Punjab Agr. Univ. 1992, v.29, N3, p.359-366.

135. Jernege K., Cimerman A. and Perdih A. Citric acid production in chemically defined media by A.niger. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 14, (1982), p.29-33.

136. Hossain M., Brooks J.D., Maddox I.S. The effect of the suger source on citric acid production by A.niger. Appl.Microbiol.Biotechnol. 19, p.393-397.

137. Lockwood L.B. Production of organic acids by fermentation. In: Peppier H.J. and Perlman D. Microbial technology, 1979, v. 1, p.355-387. Academic Press, New York.

138. Lai D.N., Srivastava A.S. Effect of aminoacid by A.niger. -Zbl. Microbiol. 1982,137 (1), p.32-35.

139. Lima Vera Lucia Arroxelasc, Stamtord Tania Lucia M., Salgueiro Alexandra Amorim. Producao de acido citrico utilizando A.niger em. residio de abacaxi (Ananas comocus (L) Meriil) For fermentacao em Solido. Ard. biol. e technol. 1995, v.38, 3, p.773-783.

140. Lowry O.M., Rosebrough H. Y., et al. Protein measurement with the folin Phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951.

141. Marchel R., Chaude O., and Metche M. Production of citric acid from n- paraftns by Saccharomycopsis Lipolytica: Kinetics and balance of the fermentation. Eur. J. Of Applied Microbiology, 1977a, 4, p. 111-123.

142. Marchel R., Vandecasteele J.P., and Metche M. Regulation of the central metabolism in retion to citric acid production in S.lipolytica.- Archives of Microbiology, 1977, 113, p. 99-104.

143. Mustapha Yigitoglu, Brian McNeil and Bjorn Kristiansen. Effect of Initial Ammonium Concentration on Citric Acid Production in a Stirred Tank Reactor. Biotechnol.Group 2nd Annual Student's Meeting. Ferment.Biotechnol.London, 5 Dec., 1991.

144. Mustafha Yigitoglu, Brian McNeil and Bjorn Kristiansen. Effect of pH on citric acid Production in a Stirred Tank Reactor. -Chem.Technol. and Biotechnol. 1992, v.54, N3, p.304.

145. Moresi.M., Cimarelli D., et al. Cinetics of citric acid fermentation.- Jornal of Chemical Technology and Biotechnology, 1980, v,30, N5, p. 266- 277.

146. Maria Papagianni, Michael Mattey and Bjorn Kristiansen. Morphology and citric acid production of A.niger PM1. -Biotechnology letters, 1994, v. 16, N9, p.929-934.

147. Nakanishi T., Yamamoto M., et al. Fermentative production of citric acid from n-paraffin by yeast. J. Of Fermentation Technology, 1972, 50, p. 855-867.

148. Nakanishi T., Yamamoto M., Kimura R. and Tanaka K. Fermentative production of citric acid from n-paraffin by yeast. -J. Ferment. Technol. 1972,v.50,№12,p. 855-867.

149. Otsuka S., MiyajimaR. and Shiio I. Comparative studies on the mechanisms of microbiol glutamate formation: Effect of biotin. -Journal of General and Applied Microbiology, 1965, 11, p. 295-301.

150. Oderinde Rotimi A., Okogun Joseph I. Citric acid production from imumu Cyperus esculentus and maize Zea mays. J. Ferment, and Bioeng., 1991, 71, N3, p. 200-202.

151. Popov К., Kostova К. et al. Citric acid production in submerged A.niger culture. Докл. Болг. АН, 1997, 30, N1, c.l 17-119.

152. Rehm HJ., Eikmeier H. Production of citric acid with immobilized Aspergillus niger. Appl.Micr.Biol, 1984, 20(6), p.365-370.

153. Rane Kishore D., Sims Kevin A. Citric acid production by C.lipolytica y-1905 in cell recycle and fed-batch fermentation. Biotechnol. andBioeng., 1995, v.46, №>4,p.325-332.

154. Rohr M., Kubicek C.P. and Kominek J. 1983. Citric acid. In: Rehm H.J., Reed G. (eds) Biotechnology, v.3;verlag Chemie Weinheim, p.341-352.

155. Rugsaseel S., Morikawa S., Kirimura K., Ugami S. Stimulation of citric acid production in A.niger by addition of viscous substrances in shake culture. Appl.Microbial and Biotechnol., 1995, v.42, №6, p.839-853.

156. Ronkas T. Influence of impeller speed on citric acid production and selected enzyme activities of the TCA cycle. Ind.Microbiol. 1991, 7, N3, p.221-226.

157. Rohr M., Stadler P.J. et al. An improved method for characterization of citrate production by conidia of A.niger. Biotechnol.Lett. 1979, N1, p.281-286.

158. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy.- J.Cell.Biol. 1963,v. 17, p.208-212.

159. Ronkas T., Harvey L. The effect of pH on production of citric and glucomic acid from beet molasses using continuous culture. -Biotechnol.Lett. 1988, 10, N4, p.280-284.

160. Shich Aiba and Massayoshi Matsuoka. Citrate Production From n-alkane by Candida lipolytica in Reference to Carbon Fluxes in vivo. European JAppl.Microbiol.Biotechnol., 1978,5,p.247-261.

161. Shnichi Aiba and Masayoshi Matsuoka. Identification of Metabolic Model. Citrate Production from Glucose by C.Lipolytica.- Biotechnology and Bioengineering, 1979,v.21,p. 1373-1386.

162. Sanjay Gupta and Chandra B. Sharma. Citric acid Fermentation by the mutant strain of the A.niger Resistant to manganese ions inhibition. Biotechnology letters, 1995, v. 17, №3, p.269-274.

163. Szczodrak J. Biosynthesis of citric acid in relation to the activity selected enzymes of the Krebs Cycle in A.niger mycelium.- European J.Appl.Microbiol.biotechnol. 1981, 13, p. 107-112.

164. Smith john E. Concepts of development in Aspergillus niger. -Post Microbiol. 1976, v.5, № 13-14, p.28.

165. Sanchez-Marroquiva A., Carreno R., Ledezma M. Effect of trace elements on citric acid fermentation by A.niger.- Appl.Microbiol. 1971, 20, p.888-892.

166. Siebert D. and Schulz G. Citric acid production by fermentation.- Intern, Microbiol.Food Ind.Cangr. Paris 1979.

167. Treton B., Le Dali M.-T., Heslot H. Excretion of citric acid and isocitric acid by yeast S.lipolytica. European J.Appl.Microbiol. 1978, 6, p. 67-77.

168. Tzekova K., Vicheva A., Georgieva M., et al. Production of organic acids on corn hydrolysates. /ioKJi.EoJir.AH.1995, 48, №2, p.85-88.

169. Torre Nestor V. Modeling approach to control of corbohydrate metabolism during citric acid accumulation by A.niger. -Biotechnol. andBioeng., 1994,v.44,N1,pi 12-118.

170. Thomas D. Brock. Citric acid. Biotechnology: A text book of Industrial microbiology. Sanderland, 1984, p. 112 -120.

171. Vanags J., Priede H. et al. Effect of various mixing systems on citric acid production. Latv. Zinatne Akad. Vestis B. 1992, N6, p.60-64.

172. Wang J.L., Lin P. Comparison of citric acid production by A.niger immobilized in gels. J.Ind.Microbiol. 1996,16,N6,p.351-353.

173. Xu D.-B., Kubicek C.P. and Rohr M. A comparison of factors influencing citric acid production by A.niger grown in submerged culture and on filter paper. Applied Microbiology and Biotechnology, 30, 1989, p.444-449.

174. Yigitoglu M., McNeil B. and Kristiansen B. Ammonium supplementation in batch culture of A.niger. First UK Biotech. Congress Paper Gl 0, 1991.

175. Yigitoglu M., McNeil Brian. Ammonium and citric acid supplementation in batch culture of A.niger. Biotechnol.Leth., 1992, 14, N3, p.831-836.

176. Zahorsky B. US Patent 1065358, 1913.

177. Zima Vera Lucia Arroxelas G. De, Stamford Tania Lucia M.5 et al. Producao de acido citrico utilizando A.niger em residno de abacaxi for fermtntaca em estado solido. Org. Biol. And Technol, 1995, 38, N3, p.773- 783.

178. Zdzislan Jlcruk. Tendencje u badaniach i biotechnologu microbiologicz Nej syntezy Kwasn cytrynowego. Postery microbiologui. 1989, t.28, N1, p.63-76.

179. УТВЕРЖДАЮ инжея^р Белгородского иг/онной кислоты1. Наумов Е.Г.1995г.

180. АКТ ПРОМЫШЛЕННОЙ ПРОВЕРКИ ШТАММА ГРИБА

181. Промышленная проверка штамма проведена в условиях Белгородского .завода лимонной кислоты.

182. Промышленная проверка штамма проводилась в несколько этапов в период с августа 1994 года по май 1995года-. •

183. Первый этап:- изучение биосинтетической активности штамма в лабо-раторныхусловиях завода путем поверхностного и глубинного культивирования. В лабораторных условиях проведен^ более десяти экспериментов.

184. Второй этап:- микробиологические исследования морфологических иг би химических особенностей штамма и получение засевного материала в виде конидий для испытаний в производственных ферментерах.

185. Третий этап:- изучение биохимических и технологических особенносте штамма гриба А. 718 в производственных ферментерах объемом

186. На. основании полученных результатов штамм гриба су^^^'г^^-и^'^^г. 718 принят Белгородским заводом к внедрению.1. ЧЛЕНЫ КОМИССИИ:

187. Микробиолог-завода Ст.микробиолог Ст.биохимик Технолог цеха ферментации

188. Морозова Е.В. Мамина А.И. Богданова Л.С,сггСе.С-Сс-^- Михайлова Л.П.

189. ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ГосНИИсинтезбелок

190. Заведующая лаб. микробиологического синтеза органических и биологически активных веществ. П. Б. Авчиева-М0утвЕРадюинститута ГосНИИсинтезбелок А.П.Захарычев сентября 1994г.

191. РЕКОМЕНДАЦИИ-по получению посевного материала и ферментации А. мЛ^&ъ, в производстве лимонной кислоты в условиях Белгородского завода лимонной кислоты.

192. От/исполнителя Зав.сектором органических кислрз1. Б.Авчиева

193. От заказчика Главный инженер завода о&^с^^у . В.П.КозловввдаиЕ

194. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА I конидий) НА ШДКЙХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ ,

195. Приготовление питательных сред

196. Для получения спорового посевного материала используют жидкие или уплотненные (агаризированные) питательные среды на основе неохмеленного пивного сусла с содержанием '^аавг^л^вел?» не менее 15%.

197. Готовое сусло .разливают по кюветам слоем 1-1,5 см.»стерилизуют и используют'для получения посевного материала.

198. Для уплотнения среды и улучшения кислотообразующих свойств проду-' цента рекомендуется использование сухой мицелиальной массы в соотношенииот 1:1 до 0,5:1 к массе дробленного солода.

199. Наилучший эффект по осахариванию крахмала и кислотообразованию конидий достигантся при использовании измельченной мицелиальной массы. Использование мицелиальной массы не предусматривает увеличение количества воды (соотношение 1:4 сохраняется).

200. Получение посевного материала

201. Продление срока культивирования до 10 суток и ступенчатый режим проращивания способствуют увеличению кислотообразующей активности посевного материала.

202. После просмотра конидий собирают,засыпают в кюветы(закрытые ватно-марлевыми фильтрами.). и подсушивают в вентилируемом термостате при темпераяуре 30°С в течение 48 часов (остаточнаяя влажность 23-30%).

203. Увеличение температуры подсушивания выше 32°С сопрововдается снижением кислотообразующей активности конидий.Лучшие показатели по данному пара метру достигаются ,при температуре подсушивания 30°С.

204. Контроль "посевного материала

205. Посевной материал контролируют на чистоту,всхожесть,прорастание,однородность ^кислотообразующую активность.

206. Для контроля из казвдой партии отбирают пробу в размере 0,5-1%. Для анализа навеску спор высевают в чашку с СА и ЫПА.

207. Разведение спорового материала готовят так,чтобы на чашке выросло не бодш50 колоний.

208. Чашки с СА выдерживают при температуре 32°С 6 суток, чашки с МПА - 35°С' - 2 суток.г . .

209. Чашки просматривают на 2,4, и 6 -е сутки после посева. ■,

210. Кислотообразующие свойства посевного материала определяют в химических стаканах, по отработанной на заводе(цехе) методике.

211. На первом этапе подращивания мицелия (в колбах на качалке) целесооб-^ разней вести на 1%мелассной среде в течение 24 часов.

212. Кислотообразующая активность мицелия возрастает при культивировании | на среде с.- рй- 4 4,5, устанавливают рН с помощью Н^О^. Подросший мицелий использую^ля засева колб или ферментера.

213. БИОМАССА МИЦЕЛИЯ ГРИБА Технические условия •ТУ 9291-002-00479994-95

214. Срок действия с 01.10.95 г.1. СОГЛАСОВАНО Директор

215. АО Белгородский завод лимонной кислоты "Цитробел"письмо В.П.Козлов01/20 от ,/13. 01. 1995 г.

216. СОГЛАСОВАНО Зам.начальника Департаментаветеринарии Минсельхозпрода1. В.В.Селиверстов 1995г.

217. Зам.директора ГосНИИсинтезбелок1. А.В.Луканин£ Тб>//1995 г.

218. Зав.лабораторией органических кислот ГосНИИсинтезбелок1. П.Б.Авчиева£ .0/. 1995 г.

219. Завлабораторией качества и стандартизации ГосНИИсинтезбелоь

220. О.И.Валихова ¿г . ¿>/. /1995 г.1. Государепвгйещровс!\\i- n Г.оа Гр №1. ПОПвниисэнти.1 попито- стандартов1к. ■Л,2ГУи1'0€Ю.8в1. Ш'ЦШЗК Начальнивевагл.л