Биокаталитическое получение акрилата аммония тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Полтавская, Светлана Викторовна

• Полтавская, Светлана Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Полтавская, Светлана Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Акриловая кислота. Ее свойства и области применения. Способы получения акриловой кислоты.

1.2. Микробная утилизация нитрилов: механизмы реакций микробной утилизации нитрилов. Характерисика ферментных систем. Промышленные аспекты применения нитрилутилизирующих микроорганизмов.

1.3. Микробиологическая трансформация акрилонитрила в акрилат аммония: характеристика штаммов, условий культивирования, параметров процесса биотрансформации.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Исследуемые объекты и штаммы микроорганизмов.

2.2. Среды.

2.3. Исследуемые соединения.

2.4. Методы выделения микроорганизмов, способных трансформировать акрилонитрил в акрилат аммония.

2.5. Идентификация культур.

2.6. Определение концентрации микробных клеток.

2.7. Изучение нитрилазной активности выделенных штаммов микроорганизмов.

2.7.1. Определение нитрилазной активности интактных клеток штаммов-продуцентов нитрилазы.

2.7.2. Изучение возможности использования нитрилов для роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.7.3. Изучение индуцирующей способности нитрилов.

2.7.4. Исследование влияния состава питательной среды на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.8. Исследование условий культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.8.1. Изучение физиологических параметров роста штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.8.2. Изучение процесса роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в ферментере с периодическим режимом культивирования.

2.9. Изучение процесса трансформации акрилонитрила в акрилат аммония с использованием штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

2.9.1. Оптимизация условий реакции гидролиза акрилонитрила.

2.9.2. Исследование основных технологических параметров процесса получения акрилата аммония с использованием штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АКРИЛОНИТРИЛ В АКРИЛАТ АММОНИЯ.

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА НИТРИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА С-32.

ГЛАВА 5. ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА СРЕДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА ALCALIGENES DENITRIFICANS С-32 - ПРОДУЦЕНТА ФЕРМЕНТА НИТРИЛАЗЫ.

5.1. Изучение параметров роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 на питательной среде, содержащей перевар Хоттингера.

5.2. Изучение параметров роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 на среде, содержащей ацетонитрил в качестве единственного источника углерода, азота и энергии.

5.3. Влияние различных питательных основ на параметры роста культуры Alcaligenes denitrificans С-32.

5.4. Влияние концентрации ацетата аммония на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

5.5. Влияние неорганических солей на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

5.6. Влияние нитрилов на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes den itrificans C-32.

5.7. Изучение влияния температуры и кислотности среды на скорость роста и нитрилазную активность штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

5.8. Исследование роста коллекционных штаммов, обладающих нитрилазной активностью, на среде, содержащей ацетат аммония.

ГЛАВА 6. ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ШТАММА ALCALIGENES DENITRIFICANS С-32 В РЕАКТОРАХ С ПЕРИОДИЧЕСКИМ РЕЖИМОМ ВЫРАЩИВАНИЯ.

ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛАТА АММОНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШТАММА ALCALIGENES DENITRIFICANS C-32 - ПРОДУЦЕНТА

ФЕРМЕНТА НИТРИЛАЗЫ.

7.1. Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония клетками штамма Alcaligenes denitrificans C-32.

7.2. Разработка процесса получения акрилата аммония.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биокаталитическое получение акрилата аммония»

Методы промышленного получения органических соединений с использованием микроорганизмов условно можно разделить на две группы: биосинтетические и биокаталитические [69]. Методы биосинтеза представляют собой образование новых веществ, осуществляемое клетками в процессе роста на основе питательных компонентов среды. В результате синтезируются природные соединения, в низкой концентрации и трудно выделяемые. Сегодня в промышленном масштабе этим методом получают многие аминокислоты, некоторые антибиотики, лимонную, глюконовую, молочную, уксусную и другие кислоты.

Методы биокатализа предполагают использование клеток микроорганизмов как источник ферментов, катализирующих специфические реакции трансформации субстрата, и предполагает проводить получение веществ in vitro. Общей чертой всех трансформаций является изменение молекулярной структуры трансформируемого вещества, а не синтез новой молекулы. С помощью данного подхода производят амиды (например, акриламид, метакриламид, никотинамид), органические кислоты (например, аспарагиновую и итаконовую), пептиды, витамины, коферменты; осуществляют трансформацию стероидов, алкалоидов, Сахаров и липидов, модифицируют природные антибиотики. Микробиологическая трансформация позволяет получать чистые вещества в мягких условиях, с высоким выходом, на основе неприродных субстратов.

Производство химических веществ биокаталитическими методами имеет целый ряд преимуществ: специфичность, работа при невысоких температурах, простота конструктивного оформления процесса, поэтому они начинают составлять серьезную конкуренцию традиционным химическим синтезам [15].

В последние десятилетия появились сообщения о возможностях использования бактерий, способных трансформировать алифатические и ароматические нитрилы органических кислот в практически важные продукты - амиды и кислоты [45]. Синтез акриламида с использованием микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной активностью, реализован в Японии и России в промышленных масштабах [15, 52, 75]. Биотехнология получения акриловой кислоты находилась на лабораторном уровне.

Сополимеры акриламида, акриловой кислоты или ее солей широко используются как флокулянты, суперабсорбенты и диспергаторы. Полимеры акриловой кислоты находят применение в экологосберегающих технологиях: укрепления поверхности горных отвалов, предотвращения выветривания, пылеобразования и водной эрозии почв, обезвоживания активного ила очистных сооружений. Акриловая кислота и ее производные необходимы в производстве лаков, красок, стройматериалов, товаров бытовой химии [3].

Примерно 55% производимой в мире акриловой кислоты используется для выработки акриловых эфиров. В последние годы мировые мощности по производству акриловой кислоты увеличивались в среднем на 400 тыс. т в год и к концу 2004 г., по оценке компании Technon Orbi-Chem, они достигли 3.4 млн. т в год. По прогнозу ведущих производителей спрос на акриловую кислоту в ближайшие годы будет увеличиваться на 3.5 - 5 % в год и к 2009 г. мировые потребности составят 4 млн. т.

В России потребление продуктов на основе акриловой кислоты и ее производных в последние годы стремительно растет. Единственный завод по химическому производству акриловых мономеров начал работу в четвертом квартале 2004 года в г. Дзержинске Нижегородской области. Технология получения акриловой кислоты основана на использовании пропилена, продукта глубокой переработки нефти, с последующим его окислением. Проектная мощность завода составила 25 тыс. тонн сырой акриловой кислоты (эфирного сорта) в год, из которых будет производиться около 2.5 тыс. тонн ледяной акриловой кислоты (полимерного сорта) и до 40 тыс. тонн эфиров. Но даже пуск этого химического производства не решает в полном объеме проблему получения акриловой кислоты полимерного сорта, необходимой в производстве высокомолекулярных полимеров. Именно они используются в нефтедобывающей отрасли, при производстве товаров бытового назначения (суперабсорбенты), в калийной промышленности.

Возрастающая потребность в акриловых полимерах и существенные энергетические, экономические и экологические проблемы, связанные с химическим синтезом акриловой кислоты, делают весьма актуальной задачу разработки биокаталитического способа получения акриловой кислоты, в частности, акрилата аммония на основе использования оригинальных штаммов микроорганизмов, обладающих высокой нитрилазной активностью. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось создание высокоактивного биокатализатора, способного трансформировать акрилонитрил в аммонийную соль акриловой кислоты, и разработка на его основе процесса получения водных растворов акрилата аммония.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи:

1. Создание коллекции микроорганизмов, трансформирующих нитрилы в соответствующие кислоты, селекция штамма с максимальной активностью.

2. Оптимизация условий культивирования штамма, обладающего максимальной активностью фермента нитрилазы.

3. Разработка ферментационного процесса промышленного получения биомассы штамма - продуцента нитрилазы.

4. Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония.

5. Разработка технологии получения водных растворов акрилата аммония с использованием созданного биокатализатора.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Создана коллекция микроорганизмов, отнесенных к родам Pseudomonas и Alcaligenes, способных трансформировать алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие кислоты.

Выделенные штаммы обладают высокой нитрилазной активностью и способны трансформировать нитрилы в широком диапазоне рН и температуры. Штамм Alcaligenes denitrificans С-32, проявляющий максимальную нитрилазную активность, и условия его культивирования защищены патентом РФ № 2177034, приоритет от 03.04.2001.

Разработаны среда и условия культивирования для штамма Alcaligenes denitrificans С-32, не использующего углеводы и многоатомные спирты в качестве ростового субстрата.

Разработан биокаталитический способ получения водных растворов акрилата аммония с использованием биокатализатора на основе штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Разработаны подходы к конструированию сред для культивирования микроорганизмов, проявляющих нитрилазную активность и не использующих углеводы и многоатомные спирты в качестве источника углерода.

Реализованы в промышленном масштабе процессы получения биомассы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 и биокатализатора С-32 на ее основе.

Разработана промышленная технология получения 20 % растворов акрилата аммония полимерного сорта с использованием биокатализатора С-32. С января 2005 г осуществляется плановый выпуск акрилата аммония в объеме нескольких десятков тонн в месяц.

Работа является частью комплексных исследований проводимых в ЗАО

Биоамид", направленных на создание биокаталитического способа получения акрилата аммония.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Создана коллекция микроорганизмов, относящихся к родам Pseudomonas и Alcaligenes, обладающих нитрилазной активностью.

2. Селектированный штамм Alcaligenes denitrificans С-32, обладающий конститутивной нитрилазой, метаболизирует алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие органические кислоты без промежуточного образования амидов.

3. Высокая нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 достигается при росте на оптимизированной среде, не содержащей дорогостоящих компонентов и дополнительных индукторов.

4. Разработаны условия культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в аппаратах с периодическим режимом выращивания, позволяющие получать 9.3 г/л биомассы с удельной нитрилазной активностью до 5.7 ед/г.

5. Разработана и внедрена на ОАО "Биосинтез", г. Пенза, технология промышленного получения биомассы штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

6. Разработана технология получения водных растворов акрилата аммония с использованием созданного биокатализатора. Оптимизированные параметры процесса позволяют получать в лабораторных условиях растворы акрилата аммония концентрацией до 50%.

7. С использованием созданного биокатализатора разработана и внедрена на российско-германском предприятии "MSP", г. Пермь, промышленная технология получения 18 - 20% водных растворов акрилата аммония.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на Российских и Международных семинарах-презентациях, конференциях "Новые направления в биотехнологии", Пущино, 2000, 2001 и 2003 гг.; "Экологизация подготовки специалистов в ВУЗах. Утилизация и переработка отходов", Саратов, 2001 г.; на Первом и Третьем Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2002, 2005 гг.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 1 патент и 2 статьи.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 123 работы отечественных и зарубежных авторов, изложена на 135 страницах машинописного текста, включающего 7 рисунков и 19 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Полтавская, Светлана Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция микроорганизмов, обладающих нитрилазной активностью. Бактерии относятся к родам Pseudomonas и Alcaligenes.

2. Выделен и идентифицирован штамм бактерий Alcaligenes denitrificans С-32 - продуцент нитрилазы (патент № 2177034 РФ), обладающий высокой активностью фермента, на базе которого создан биокатализатор С-32 для промышленного получения акрилата аммония. Изучены индукция и субстратная специфичность нитрилазы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32, путь трансформации нитрилов.

3. Оптимизирована среда культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32. Основное преимущество среды - отсутствие токсичных и летучих нитрилов. Ростовыми и питательными субстратами является стандартное, широко используемое в микробиологической промышленности сырье - ацетат аммония и кукурузный экстракт.

4. Оптимизированы условия процесса культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в аппаратах с периодическим режимом выращивания: рН, температура, аэрация, схема подачи ростового субстрата. Данные условия позволили увеличить урожай биомассы до 9.3 г/л, удельную нитрилазную активность до 5.7 ед/г.

5. Разработана и внедрена на ОАО "Биосинтез", г. Пенза, технология промышленного получения биомассы штамма Alcaligenes denitrificans

• С-32, которая используется компанией "Биоамид" для производства биокатализатора С-32.

6. Оптимизированы условия трансформации акрилонитрила клетками штамма Alcaligenes denitrificans С-32, позволяющие получать в лабораторных условиях растворы акрилата аммония концентрацией до 50%.

С использованием созданного биокатализатора разработана и внедрена на российско-германском предприятии "MSP", г. Пермь, промышленная технология получения 18-20% водных растворов акрилата аммония.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Акриловая кислота и ее соли служат сырьем для получения широкого спектра полимерных продуктов. Материалы на основе полимеров и сополимеров акриловой кислоты используются в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства. Они находят применение в экологосберегающих технологиях: очистка сточных вод, укрепление поверхности горных отвалов, предотвращение выветривания, пылеобразования и водной эрозии почв, обезвоживание активного ила очистных сооружений. Анионные полимеры, представляющие собой сополимеры акриламида и акриловой кислоты, широко используются как флокулянты, суперабсорбенты и диспергаторы.

Современным промышленным способам получения акриловой кислоты присущи многие особенности, характерные для химических синтезов: высокая температура, многостадииность процесса, отравление катализатора, полимеризация продуктов реакции и наличие побочных продуктов, создающих проблему их утилизации. В связи с этим актуальна разработка биокаталитического способа производства, в частности, - с применением микроорганизмов, продуцирующих фермент нитрилазу.

В настоящее время известны бактерии, способные гидролизовать алифатические и ароматические нитрилы органических кислот, что делает их перспективными для получения важных продуктов - амидов и кислот. В 90-х годах XX столетия реализованы крупномасштабные * биокаталитические процессы получения амидов, наиболее ценными среди которых являются акриламид, метакриламид и никотинамид. Однако биотехнология получения органических кислот, в частности акриловой, по причине тех или иных недостатков находилась на лабораторном уровне.

Поэтому целью настоящей работы явилось выделение и микробиологическая характеристика штамма, обладающего нитрилазной активностью, создание на его основе высокоактивного биокатализатора, способного трансформировать акрилонитрил в аммонийную соль акриловой кислоты, и разработка основанного на его применении процесса получения водных растворов акрилата аммония.

На первом этапе работы нами изучались культуры из лабораторной коллекции, способные трансформировать акрилонитрил в акриловую кислоту без образования акриламида в качестве промежуточного продукта. Однако низкий уровень активности коллекционных образцов и необходимость внесения казаминовых кислот в среду культивирования для достижения высокой активности даже наиболее активного из коллекционных штаммов Alcaligenes sp. ВКПМ В-6706 заставили отказаться от их использования.

Для создания эффективного биокатализатора нами проведен скрининг бактерий с высокой нитрилазной активностью, выделенных из мест непосредственного контакта природной микрофлоры с токсичными соединениями данного класса. Были использованы традиционные методы прямого высева, накопительной культуры и ступенчатой адаптации. Выделение штаммов вели из объектов окружающей среды, расположенных в районах производств, выпускающих или потребляющих акрилонитрил и акриловую кислоту.

Метод накопительной культуры с использованием акрилонитрила в концентрации 3.0 г/л в качестве селектирующего агента позволил выделить из почвы, сточной воды и активного ила таких производств 38 изолятов. В результате селекции при применении метода ступенчатой адаптации из тех же проб почвы, сточной воды и активного ила с использованием акрилонитрила в возрастающей концентрации (за месяц культивирования концентрация была увеличена с 0.01 до 3.0 г/л) нами изолированы 117 штаммов, устойчивых к акрилонитрилу в концентрации 3.0 г/л.

Скрининг микроорганизмов, выделенных с помощью метода накопительной культуры, показал, что лишь 13 из них трансформировали акрилонитрил, причем у 11 в реакционном растворе выявлен как акриламид, так и акриловая кислота. И только два штамма, с лабораторным шифром Р1 и Р2, позднее отнесенных к роду Pseudomonas, трансформировали акрилонитрил в акрилат аммония без образования акриламида в качестве интермедиата.

Детальное исследование 117 микроорганизмов, выделенных методом ступенчатой адаптации, показало, что 64 изолята не деградируют акрилонитрил, хотя растут в его присутствии, используя дополнительные источники питания. Гидролиз акрилонитрила 49 культурами сопровождался образованием акриламида в качестве промежуточного продукта. И только четыре штамма, РЗ, Р4, С-23 и С-32, трансформировали акрилонитрил в акрилат аммония, под действием фермента нитрилазы. Акриламид, как интермедиат трансформации, выявлен не был. Штаммы РЗ и Р4 были отнесены к роду Pseudomonas, а штаммы С-23 и С-32 - к роду Alcaligenes.

Таким образом, при исследовании 26 проб почвы, 56 проб сточных вод и 5 проб активного ила было выделено 155 культур, устойчивых к акрилонитрилу в концентрации 0.01-3 г/л. Среди них 6 штаммов обладали нитрилазной активностью.

Выделенные микроорганизмы, обладающие ферментом нитрилаза, были исследованы на способность трансформировать акрилонитрил.

Было показано, что штаммы, принадлежащие к родам Pseudomonas и Alcaligenes, существенно различались по биокаталитической активности. Средняя нитрилазная активность представителей рода Alcaligenes более чем в 8 раз превышала таковую у псевдомонад. Наибольшей активностью обладал штамм Alcaligenes sp. с лабораторным шифром С-32. Его удельная нитрилазная активность составляла 2.23 ед/г. Поэтому именно этот штамм, Alcaligenes sp. С-32, послужил объектом наших дальнейших исследований.

С целью видовой идентификации штамма С-32 были подробно изучены его биологические характеристики. Штамм с лабораторным номером С-32 был идентифицирован как Alcaligenes denitrificans.

Штамм Alcaligenes denitrificans С-32 - продуцент нитрилазы депонирован в соответствии с условиями Будапештского соглашения во Всероссийской коллекции микроорганизмов (VKM) под номером В-2243 D.

Проведенные работы по идентификации штамма показали, что он не использует в качестве питательного субстрата углеводы и многоатомные спирты, а это значительно затрудняло работу по оптимизации среды для получения высокого урожая клеток. Поэтому, используя в качестве питательной среды бульон на переваре Хоттингера, мы исследовали некоторые доступные вещества на их способность служить дополнительным ростовым субстратом. Было показано, что хорошими дополнительными субстратами для роста клеток являются этиловый и пропиловый спирты, а также уксусная и пропионовая кислоты.

Анализ состава среды культивирования при использовании этилового спирта в качестве единственного источника углерода показал, что он под воздействием ферментной системы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 постепенно превращается в уксусную кислоту, которая и усваивается микроорганизмами.

Продуктом трансформации ацетонитрила при росте культуры является аммонийная соль уксусной кислоты, выступающая в роли ростового субстрата. Известно, что ацетат аммония является промышленным сырьем, которое широко используется в микробиологической промышленности для культивирования многих штаммов-продуцентов. Это позволило нам использовать в качестве единственного источника углерода и азота аммонийную соль уксусной кислоты.

Хотя штамм Alcaligenes denitrificans С-32 способен расти на синтетической минеральной среде, содержащей лишь ацетат аммония в качестве единственного источника углерода, азота и энергии, прирост биомассы в этих условиях культивирования невелик. Максимальные показатели роста и достаточно высокой специфической активности клеток получены при использовании в качестве питательной основы дрожжевого и кукурузного экстрактов. Кукурузный экстракт является доступным недорогим промышленным сырьем, что позволило нам использовать его в качестве питательной основы для культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в дальнейшей работе.

Проведенные эксперименты показали, что концентрация ацетата аммония 10 г/л создает в среде оптимальное количество как ацетат-ионов, так и ионов аммония, что позволяет обеспечить максимальную скорость роста клеток и их нитрилазную активность.

Добавление в среду культивирования различных нитрилов не оказывает индуцирующего влияния на нитрилазную активность штамма С-32. Более того, а-замещенные нитрилы, такие как лактонитрил и хлорацетонитрил, существенно ингибируют как рост культуры, так и нитрилазную активность клеток. Сильный индуктор для многих нитрилазных штаммов, е-капролактам, в наших экспериментах не только не увеличивал нитрилазной активности штамма С-32, но даже подавлял его рост. Тем самым, мы подтвердили наше предположение о том, что синтез фермента нитрилазы у штамма Alcaligenes denitrificans С-32 конститутивен.

В результате проведенных работ по оптимизации солевого состава среды для выращивания клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 нами предложен следующий состав среды культивирования (г): Na2HP04 • 12Н20 -6.0, КН2Р04 - 2.0, MgSC>4 • 7Н20 - 0.7, кукурузный экстракт - 5.0, ацетат аммония -10.0, дистиллированная вода - 1000.

Эта питательная среда, оптимизированная на основе стандартного, широко используемого в микробиологической промышленности сырья, и не содержащая дорогостоящих компонентов и индукторов, послужила основой

Ill для разработки условий промышленного культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

Сбалансировав состав среды, мы перешли к изучению зависимости роста клеток и их ферментативной активности от таких важнейших параметров, как температура и уровень кислотности. Эти параметры не только влияют на скорость роста и выход биомассы, но могут изменять метаболизм и химический состав бактерий.

Оптимальный температурный режим для получения максимального урожая клеток с высокой нитрилазной активностью составляет 30-32 °С. Во время культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 на среде, содержащей ацетат аммония, происходит изменение рН среды с 7.4±0.2 до 9.0±0.2. Эти изменения связаны с неравномерным потреблением отдельных компонентов среды, а именно, ацетат-иона и иона аммония. Тем не менее, оптимальное начальное значение кислотности среды, позволяет достичь максимальной скорости роста. Максимальная скорость роста наблюдается в интервале значений рН 7.6 - 8.2. При этих значениях показателя концентрации водородных ионов уже за 24 часа культивирования достигается максимальный съем биомассы с высокой нитрилазной активностью.

Оптимизация состава питательной среды, рН и температурных режимов культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в условиях периодического культивирования в колбах позволила нам перейти к следующему этапу исследования - отработке процесса выращивания клеток штамма-продуцента нитрилазы в лабораторных, а в последствии, и промышленных ферментерах.

Использование для культивирования полусинтетических сред, содержащих ацетат аммония, не давало возможности получать высокий урожай клеток в колбах из-за быстрого сдвига значений рН в щелочную сторону в результате неравномерного потребления из среды ионов аммония и ацетат-ионов. Чтобы избежать отрицательного воздействия изменений показателя водородного потенциала на скорость роста и образование специфического фермента во время культивирования, в дальнейших экспериментах, проводимых в ферментере, контролировалось значение рН. Для сохранения максимальной скорости роста и достижения высокой нитрилазной активности клеток культивирование проводили при автоматическом поддержании значений рН на уровне 8.2±0.2. Для этого в ферментационную среду вводили раствор уксусной кислоты по принципу обратной связи. Уксусная кислота также являлась дополнительным ростовым субстратом.

В результате за 72 часа роста получен урожай клеток, составляющий 4.93 г/л (по сухому весу) с нитрилазной активностью клеток 3.7 ед/г. Анализируя изменение параметров культивирования, мы пришли к выводу, что именно падение концентрации ацетат-иона практически до нуля является причиной остановки роста культуры. Поэтому, в последующих экспериментах в среду после 18-20 часов культивирования дополнительно вводили ацетат аммония в количестве 7.5 г/л.

В ходе исследований было изучено влияние аэрации на выход биомассы и ее ферментативную активность. Показано, что интенсивное насыщение среды культивирования кислородом позволяет добиться высокой нитрилазной активности при максимальном выходе биомассы.

Оптимизация вышеуказанных параметров ферментации позволила за 72 часа культивирования увеличить урожай клеток штамма Alcaligenes

• denitrificans С-32 до 9.3 г/л, а нитрилазная активность достигла 5.7 ед/г. Штаммов с подобной нитрилазной активностью ранее в литературе описано не было.

Масштабирование процесса ферментации осуществляли на базе центральной лаборатории ОАО "Биосинтез", г. Пенза, в ферментере объемом 2 м . Посевной материал вносили в 300 литровый ферментер, заполненный оптимизированной средой. Культивирование проводили в течение 24 часов. Затем выросшую культуру использовали как инокулят для засева промышленного ферментера объемом 2 м3, содержащего 1500 литров среды. Уксусную кислоту вносили дробно, по мере сдвига значений рН выше 8.5. По окончании культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости сепарированием.

За 36 часов культивирования урожай клеток составил 7.6 г/л, а их удельная нитрилазная активность 3.5 ед/г. Эти показатели несколько ниже полученных ранее на лабораторной установке, что, возможно, связано с более интенсивным массообменом в промышленном ферментере, приводящим к выдуванию аммиака из культуральной среды.

Таким образом, в результате проведенного исследования была разработана среда и оптимизированы условия культивирования, позволившие начать промышленный выпуск биокатализатора на основе * штамма Alcaligenes denitrificans С-32 с января 2005 года.

Исследование основных параметров процесса биотрансформации показало, что штамм Alcaligenes denitrificans С-32 обладает высокой термостабильностью фермента, а наибольшая нитрилазная активность клеток отмечается при температуре 65°С. Быстрая инактивация фермента происходит при 70°С. Нами установлено, что высокая термостабильность нитрилазы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 позволяет получать концентрированные растворы акрилата аммония при температурах 30-40°С.

Оптимальной областью значений рН, в которой клетки штамма т Alcaligenes denitrificans С-32 проявляют наибольшую нитрилазную активность, является интервал рН 7.8 - 11. Однако было показано, что начальный уровень кислотности среды при получении концентрированных растворов акрилата аммония не должен превышать значений 9.0.

Биосинтез акрилата аммония с использованием штамма Alcaligenes denitrificans С-32 можно проводить в дистиллированной воде, предварительно скорректировав значение рН. Такая технология дает возможность получения более чистых растворов акрилата аммония, содержащих минимальное количество примесей неорганических солей, способных в дальнейшем ухудшить качество конечного продукта -полимера.

Удельная нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 практически не зависит от начальной концентрации нитрила акриловой кислоты в реакционной смеси вплоть до предела растворимости субстрата. Выявленная характеристика нитрилазы штамма Alcaligenes denitrificans С-32 является, на наш взгляд, весьма важной, так как позволяет вести процесс синтеза акрилата аммония, как при высоких, так и низких концентрациях акрилонитрила. Более того, при низких концентрациях акрилонитрила -1.3 г/л, скорость гидролиза с использованием клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 не падает ниже 90 % от максимально * возможной. Это позволяет заканчивать процесс получения концентрированных растворов акрилата аммония с содержанием акрилонитрила ниже предела обнаружения.

Оптимизация условий проведения гидролиза акрилонитрила клетками штамма Alcaligenes denitrificans С-32 позволила разработать промышленную технологию получения акрилата аммония.

Для проведения процесса получения акрилата аммония клетки биокатализатора при перемешивании суспендировали в фосфатном буфере или дистиллированной воде в количестве от 0.025 до 3% в интервале » рН 7.0-11.0 и температуре от 0 до 65°С. Суспензия вносилась в стеклянный или стальной реактор, представлявший собой термостатируемую емкость, снабженную механической мешалкой. Затем, при перемешивании, подавали акрилонитрил. Внесение нитрила акриловой кислоты в реакционную смесь осуществляли различными способами: разовым добавлением, дробным или плавным, так, чтобы его начальная и текущая концентрация не превышала

0.1%. В результате трансформации можно получать 10-50% растворы акрилата аммония. Время процесса зависит от концентрации клеток штамма, температуры реакционной среды и концентрации акрилата аммония, получаемой в реакции трансформации. После окончания синтеза клетки отделяли от раствора фильтрованием или центрифугированием.

Высокая активность и термостабильность нитрилазы клеток штамма

Alcaligenes denitrificans С-32 позволяет вести процесс получения акрилата аммония при низких микробных нагрузках, используя для повышения скорости биоконверсии повышение температуры реакции вплоть до 40°С. Это можно сделать без дополнительных энергозатрат, так как процесс трансформации экзотермичен.

Условия проведения процесса в промышленных условиях характеризуются упрощенной схемой подачи акрилонитрила в реактор, заполненный суспензией клеток в деионизированной воде. Используется минимальная микробная нагрузка (2 г/л). Температура проведения процесса 36±1°С. В результате за 6-8 часов синтеза можно получить 18-20% растворы акрилата аммония.

Этот процесс был масштабирован на действующей промышленной установке объемом 5.3 м3 компании "MSP", г. Пермь. Опытные работы по получению 10-20 % растворов акрилата аммония в промышленных условиях с использованием биокатализатора С-32 оказались успешными и полностью воспроизводили результаты, полученные в лабораторных экспериментах. В настоящее время в компании "MSP", г. Пермь, работает промышленная * установка объемом выпуска 500 т в год в пересчете на 100 % акриловую кислоту.

Водные растворы акрилата аммония, полученные с использованием клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 эквивалентны акрилату аммония полимерного сорта, приготовленному традиционными химическими способами. Акрилат аммония может быть переведен в иную химическую форму, например, в свободную кислоту или соль щелочного металла. Чистота и качество мономеров позволяют синтезировать полимеры с заданными свойствами.

Таким образом, селекция штамма Alcaligenes denitrificans С-32 -продуцента фермента нитрилазы, оптимизация условий его культивирования, позволили создать высокоактивный биокатализатор С-32 и разработать промышленную технологию его получения.

С использованием этого биокатализатора разработан и внедрен в промышленность процесс синтеза растворов акрилата аммония с концентрацией основного вещества 18-20 %.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Полтавская, Светлана Викторовна, 2005 год

1. Акриловые олигомеры и материалы на их основе / Берлин А.А., Королев Г.В., Кефели Т.Я., Сиверчик Ю.М. // М: Химия. 1983. - 356 с.

2. Астаурова О.В., Погорелова Т.Е., Фомина О.Р. Регуляция биосинтеза ферментов биодеградации нитрилов у Rhodococcus rhodocrous МО / Биотехнология. 1991. -№ 5. - С. 10-14.

3. Беленький П.Г. Применение высокомолекулярных композиционных материалов для интенсификации технологических процессов и охраны окружающей среды / Научно-технический процесс в производственном объединении "Аппатит'7/ М.: Наука, 1989. 93 с.

4. Биотехнология. Принципы и применение; Пер. с англ. / Под ред. И. Хиггенса, Д. Беста, Дж. Джонса. М.: Мир, 1988. - 480 с.

5. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология: Кинетические основымикробиологических процессов: Учеб.пособие для биол. и хим. спец.вузов. М.: Высш.шк., 1990. - 296 с.

6. Забазная Е.В., Козулин С.В., Воронин С.П. Отбор штаммов, трансформирующих акрилонитрил и акриламид в акриловую кислоту // Прикладная биохимия и микробиология.- 1998.- Т. 34, № 4.- С. 377-381.

7. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука, 1982. - 179 с.

8. Келети Т. Основы ферментативной кинетики: Пер.с англ. М.: Мир, 1990. -350 с.

9. Марч Дж. Органическая химия: Пер. с англ. В 4-х т. М.: Мир, 1987.1. С. 356-358.

10. Ю.Методы общей бактериологии. В 3-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Ф.

11. Герхарда и др. М.: Мир, 1984. - Т.З. - 264 с. 11.Обзоры по отдельным производствам химической промышленности: Вып. 20. - М.: НИИТЭХим, 1978. - 67 с.

12. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса.- М.: Мир, 1997. -432 с.

13. Пат. 2081169 С 1 RU, МКИ6 С12 N 9/78, С12 Р7/40, 13/02, С12 R 1:05. Штамм бактерий Alcaligenes species продуцент нитрилазы / Забазная Е.В., Козулин С.В., Куликова JI.K., Воронин С.П. - 10 с.

14. Полиакриламид / Абрамова Л.И., Байбурдов Т.А., Григорян Э.П. // Под ред. Куренкова В.Ф. М.: Химия, 1992. - 192 с.

15. Темкин О.Н. Промышленный катализ и экологически безопасные технологии. М.: Химия, 1996.

16. Химическая энциклопедия / Под ред. Кнунянца И.Л. М.: Советская энциклопедия, 1988. - С. 117-118.

17. Химический энциклопедический словарь / Под ред. Кнунянца И.Л. М.: Советская энциклопедия, 1983. - С. 454.

18. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. М.: Мир, 1987. - 567 с.

19. Almatawah Q., Cramp R., Cowan D. Characterization of an inducible nitrilase from a thermophilic bacillus // Extremophiles. 1999. - N 3. - P. 283-291.

20. Amarant Т., Vered Y., Bohak Z. Substrates and inhibitors of nitrile hydratase and amidase of Corynebacterium nitrilophilus // Biotechnol. Appl. Biochem. -1989.-Vol. 11, N 1. P. 49-51.

21. Application 91/11527 WO. IPC 5 C12 P756, 7/62. Production of esters of lactic acid, esters of acrylic acid, lactic acid and acrylic acid / Walkup P.C., Rohrmann

22. Ch.F., Hallen R.T., Eakin D.T. 53 p.

23. Application 1-132392 Л5, Int.Cl4 C12 P 7/40, C12 Rl:05. Microbiological production of monocarboxylic acid / Kawakami K., Tanabe Т., Inoue Sh.-16 p.

24. Application Al-20030014193 US. Analysis of catalysed reactions by calorimentry // Ramsden, David Keith. 16.01.2003.

25. Asano Y., Ando S., Tani Y. Fungal degradation of triacrylonitrile // Agric. Biol. Chem. -1981. Vol. 45, N 1. - P. 57-62.

26. Asano Y., Tachibana M., Tani Y., Yamada H. Purification and characterization of amidase which participates in nitrile degradation // Agric. Biol. Chem. 1982. -Vol. 46, N 5. - P. 1175-1181.

27. Bandyopadhyay A.K., Nagasawa Т., Asano Y. Purification and characterization of benzonitrilases from Arthrobacter sp. strain J1 // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - Vol. 51, N 2. - P. 302-306.

28. Banerjee A., Sharma R., Banerjee U.C. The nitrile degrading enzymes: Current status and future prospects // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. -Vol. 60. - P. 33-44.

29. Bengis-Garber C., Gutman A. L. Bacteria in organic synthesis: selective conversion of 1,3-dicyanobenzene into 3-cyanobenzoic acid // Tetrahedron Lett. 1988. - V. 29. - P. 2589-2590.

30. Bengis-Garber C., Gutman A. L. Selective hydrolysis of dinitriles into cyano-carboxylic acids by Rhodococcus rhodochrous NCIB 11216 // Appl. Microbiol. Biotech. 1989. - Vol. 32. - P. 11-16.

31. Bhalla T.C., Miura A., Wakamoto A., Ohba Y., Furuhashi K. Asymmetric hydrolysis of a-aminonitriles to optically active amino acids by a nitrilase of Rhodococcus rhodochrous PA-34 // Appl. Microbiol. Biotech. 1992. -Vol. 37.-P. 184-190.

32. Brennan B.A., Alms G., Nelson M.G., Durney L.T., Scarrow R.C. Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1 contains a non-corrinoid cobalt with two sulfure ligands // J. Am. Chem. Soc. 1996. - Vol. 118. - P. 91949195.

33. Bunch A.W. Biotransformation of nitriles by rhodococci // Antonie van Leeuwenhoek. -1998. Vol. 74. - P. 89-97.

34. Cowan D., Cramp R., Pereira R., Graham D., Almatawah Q. Biochemestry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes // Extremophiles. 1998. - N 2. - P. 207-216.

35. Dadd M., Claridge Т., Pettman A., Knowles Ch. Biotransformation of benzonitrile to benzohydroxamic acid by Rhodococcus rhodochrous in the presence of hydroxylamine // Biotechnol. Lett. 2001. - Vol. 23. - P. 221-225.

36. Goldhust A., Bohac Z. Induction, purification and characterization of the nitrilase of Fusarium oxysporum f. sp. melonis // Biotechnol. Appl. Biochem. -Vol. 11.-P. 581-601.

37. Janet O.C., Strauss U., Kroutil W. Large-scale preparation of nitrile-hydrolysing biocatalyst: Rhodococcus R 312 (CBS 717.73) // J. of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1999. - N 6. - P.555-560.

38. Harper D.B. Microbial metabolism of aromatic nitriles. Enzymology of C-N cleavage by Nocardia sp. NCIB 11216 // Biochem. J. 1977. - Vol. 165. -P. 309-319.

39. Harper D.B. Fungal degradation of aromatic nitriles. Enzymology of C-N cleavage by Fusarium solani // Biochem. J. 1977. - Vol. 167. - P. 685-692.

40. Harper D.B. Purification and properties of an unusual nitrilase from Nocardia NCIB 11216 // Biochem. Soc. Trans. 1976. - Vol. 4. - P. 502-504.

41. Harper D.B. Characterization of a nitrilase from Nocardia sp. NCIB 11215, using p-hydroxybensonitrile as sole carbon source // Int. J. Biochem. 1985. -N17.-P. 677-683.

42. Hook R. H., Robinson W.G. Ricinine nitrilase. II. Purification and properties // J. Biol. Chem. 1964. - Vol. 239, N 12. - P. 4263-4267.

43. Hoyle A.J., Bunch A.W., Knowles Ch.J. The nitrilases of Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 // Enzyme and Microbiol. Technology. 1998. -Vol. 23.-P. 475-481.

44. Hughes J., Armitage Y.C., Symes K.C. Application of whole cell rhodococcal biocatalysts in acrilic polymer manufacture // Antonie van Leeuwenhoek. -1998.-Vol. 74.-P. 107-118.

45. Hynes M.J. Amidase utilization in Aspergillus nidulans: Evidence for a third amidase enzyme // J. Gen. Microbiol. 1975. - Vol. 91. - P. 99-109.

46. Kakeya H., Sakai Т., Ohta H. Microbial hydrolysis as a potent method for the preparation of optically active nitriles, amides and carboxylic acids // Tetrahedron Lett. 1991. - Vol. 32. - P. 1343-1346.

47. Kaoken M.P., Segrai J.I., Duran R. Purification and properties of the nitrile hydratase of a new strain of Rhodococcus sp.// Zbl. Microbiol. 1991. - Vol. 146,N2.-P. 89-98.

48. Kelly M., Kornberg H.L. Purification and properties of acyltransferases from Pseudomonas aeruginosa // Biochem. J. 1964. - Vol. 93. - P. 557-566.

49. Klempier N., Raadt A., Faber K., Griengl H. Selective transformation of nitriles into amides and carboxylic acids by an immobilyzed nitrilase II Tetrahedron Lett. 1991. - Vol. 32. - P. 341-344.

50. Kobayashi M., Nagasawa Т., Yamada H. Nitrilase of Rhodococcus rhodochrous Jl. Purification and characterization // Eur. J. Biochem. 1989. -Vol. 182.-P. 349-356.

51. Kobayashi M., Komeda H., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous Jl: sequencing and overexpression of the gene and identification of an essential cysteine residue // J. Biol. Chem. 1992. -Vol. 267.-P. 20746-20751.

52. Kobayashi M., Shimizu S. Versatile nitrilases: nitrile-hydrolysing enzymes // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - Vol. 120. - P. 217-224.

53. Kobayashi M., Nagasawa Т., Yamada H. Enzymatic synthesis of acrilamide: A success story not yet over // Trends Biotechnol. 1992. - N 10. - P. 402-408.

54. Kobayshi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Purification and characterization of a novel nitrilase of Rhodococcus rhodochrous К 22 that acts on aliphatic nitriles // J. Bacterid. 1990. - Vol. 172, N 9. - P. 4807-4815.

55. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Hyperinduction of an alifatic nitrilase by Rhodococcus rhodochrous К 22 // FEMS Microbiol. Lett. -1991.-Vol. 77, N 1. P. 121-124.

56. Kobayashi M., Nagasawa Т., Yanaka N., Yamada H. Nitrilase-catalyzed production of p-aminobenzoic acid from p-aminobenzonitrile with Rhodococcus rhodochrous J 1 // Biotechnol. Lett. 1989. - N 11. - P. 27-30.

57. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Nitrilase-catalyzed production of pyrazininoic acid, an antimicobacterial agent, from cyanopyrazine by resting cells of Rhodococcus rhodochrous J 1 // J. Antibiotics. 1990. -N43.-P. 1316-1320.

58. Kobayashi M., Nagasawa Т., Yamada H. Regiospecific hydrolysis of dinitrilecompouds by nitrilase from Rhodococcus rhodochrous J1 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. - Vol. 29. - P .231-233.

59. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Monohydrolysis of an aliphatic compound by nitrilase from Rhodococcus rhodochrous К 22 // Tetrahedron. 1990. - V. 46. - P. 5587-5590.

60. Komeda H., Kobayashi M., Shimizu S. A novel gene cluster including the R. rhodochrous J1 nhiBA genes encoding a new low molecular mass nitrile hydratase (L-NHase) induced by its reaction product // J. Biol. Chem. 1996. -Vol. 271.-P. 15796-15802.

61. Layh N., Hirrlinger В., Stolz A., Knackmuss H. Enrichment strategies for nitrilehydrolysing bacteria // Appl. Microbiol. Biotech. Vol. 47. - P. 668-674.

62. Legras J.L., Chuzel G., Arnuad A., Galzy P. Natural nitriles and their metabolism // World J. Microbiol. Biotech. 1990. - N 6. - P.83-108.

63. Li W., Zhang H., Yang H. The production of acrylamide microbial conversion of acrylonitrile // Acta Microbiol. Sin. 1990. - Vol. 30, N 1. - P. 29-35.

64. Linton E.A., Knowles C.J. Utilization of aliphatic amides and nitriles by Nocardia rhodochrous LL100-21 // J. Gen. Microbiol. 1986. - Vol. 132, N 6. -P. 1493-1501.

65. Mahadevan S., Thimann K.V. Nitrilase: II. Substrate specificity and possible mode of action//Arch. Biochem. Biophys. 1964. - Vol. 107. - P. 62-68.

66. Mathew C.D., Nagasawa Т., Kobayashi M., Yamada H. Nitrilase-catalyzed production of nicotinic acid from 3-cyanoyridine in Rhodococcus rhodochrous J1 //Appl. Environ. Microbiol. 1988. - Vol. 54. - P. 1030-1032.

67. Miller J.M., Gray D.O. The utilization of nitriles and amides by a Rhodococcus species // J. Gen. Microbiol. 1982. - Vol. 128, N 8. - P. 1803-1809.

68. Mimura A., Kawano Т., Yamada K. Application of microorganisms to Petrochemical industry. I. Assimilation of nitrile compouds by microorganisms // J. Ferment. Technol. 1969. - Vol. 49, N 10. - P. 631-638.

69. Nagasawa Т., Yamada H. Microbial transformations of nitriles // Trends Biotechnol. 1989. - Vol. 7, N 6. - P. 153-158.

70. Nagasawa Т., Yamada H. Interrelations of chemistry and biotechnology. 6. Microbial production of commodity chemicals // Pure Appl. Chem. 1988. -N67.-P. 1241-1256.

71. Nagasawa Т., Mauger J., Yamada H. A novel nitrilase, arylacetonitrilase, of Alcaligenes faecalis JM3. Purification and characterization // Eur. J. Biochem. -1990. Vol. 194, N 3. - P. 765-772.

72. Nagasawa Т., Nakamura Т., Yamada H. Production of acrylic acid using Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. -Vol. 34.-P. 322-324.

73. Nagasawa Т., Kobayashi M., Yamada H. Optimum culture conditions for production of benzonitrilase by Rhodococcus rhodochrous J1 // Arch. Microbiol. 1988.-Vol. 150.-P. 89-94.

74. Nagasawa Т., Nanda H., Ryuno К. Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororafis B23. Purification and characterization // Europ. J. Biochem. 1987. -Vol. 162,N6.-P. 691-698.

75. Nagasawa Т., Ryuno K., Yamada H. Nitrile hydratase of Brevibacterium R 312. Purification and characterization // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1986. Vol. 139, N 3. - P. 1305-1312.

76. Nagasawa Т., Shimizu H., Yamada H. The supereority of the third-generation catalyst Rhodococcus rhodochrous J 1 nitrile hydratase, for industrial production of acrylamide // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - Vol. 40. - P. 189-195.

77. Nagasawa Т., Takeuchi K., Yamada H. Occurrence of a cobalt-induced and cobalt-containing nitrile hydratase in Rhodococcus rhodochrous J 1 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. - Vol. 155, N 2. - P. 1008-1016.

78. Nagasawa Т., Yamada H. Ферментативное производство никотиновой кислоты и никотинамида. // Biosci. Ind. 1988. - Vol. 46, N 8. - P. 3516-3518.

79. Nagasawa Т., Nakamura Т., Yamada H. e-Caprolactam, a new powerful inducer for the formation of Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase // Arh. Microbiol. 1990. - Vol. 155. - P. 13-17.

80. Nagasawa Т., Yamada H. Nitrile hydratase is a quinoprotein. A possible new function of pyrroloquinolin quinone activation of H20 in an enzymatic hydration reaction // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. - Vol. 147, N 2. - P. 701709.

81. Nagasawa Т., Yamada H. Application of nitrile converting enzymes to the production of useful compounds// Pure Appl. Chem. 1990. - Vol. 62, N 7. - P. 1441-1444.

82. Nagasawa Т., Wieser M., Nakamura T. Nitrilase of Rhodococcus rhodochrous Jl. Conversion into active form by subunit association // Eur. J. Biochem. 2000. - Vol. 267, N 1. - P. 138-144.

83. Pace H.C., Brenner C. The nitrilase superfamily: classification, structure and function // Biochem. Struct. Biol. 2001. -Vol.2, N 1.

84. Pat. 5998180 US. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous for converting acrylonitrile directly to acrylic acid / Armitage Y.Ch., Hughes J., Webster N.A. -7.12.1999.

85. Pat. 9858072 WO. Flocculation of biological material from organic acid-containing systems / Weir S., Hughes J., Moran P. 23.12.1998.

86. Pat. 245585 DE // Procede de preparation a acids organiques par hydrolysebiociques / A. Commeyras, A. Arnaud, P. Galzy J.C. Jallageas.

87. Pat. 0274856 EP // Microbial degradation of waste / C.J. Knowles, J.M. Wyatt.

88. Pat. 0188316 EP // Process for the preparation of amides using microorganisms /1. Watanabe, M. Okumura.

89. Pat. 61-43037 JP // Способ получения акриловой, (мет)акриловой кислоты. // Watanabe I. / 25.09.86. 6 p.

90. Pat. 5932454 US. Method of producing carboxylic acids / Matsuoka K., Matsuyama A. 3.08.1999.

91. Pat. 2182928 RU. Способ получения водного раствора (мет)акриловой кислоты или ее соли / Сайме К.Ч., Хьюс Д. 27.05.2002.

92. Pat. 6162624 US. Production of ammonium acrylate / Symes K.Ch., Hughes J.-19.12.2000.

93. Pat. 0444640 EP. Process for producing an elevated amount of nitrilase activity from a microbial strain of Rhodococcus / Yamada H., Nagasawa Т., Nakamura T.-04.09.1991.

94. Pat. 5135858 US. Process for biological production of organic acids / Yamada H., Nagasawa Т., Nakamura T. 04.08.1992.• 94. Pat. 6146861 US. Processes for the production of amidase / Armitage Y.,1. Hughes J. 14.11.2000.

95. Pat. 6251646 US. Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells // Ben-Bassat A., Dicosimo R., Fallon R. 26.06.2001.

96. Pat. 19848129 DE. New nucleic acid sequence encoding Alcaligenes faecalis nitrilase polypeptide useful for converting racemic nitriles to chiral carboxylicacids // Engels D., Mattes R., Hauer B. 20.04.2000.

97. Pat. 6066490 US. Nitrilase-producing acidovorax facilis // Gavagan J., Herces F., Di Cosimo R., Fallon R. 23.05.2000.

98. Pat. 1008655 EP. Process for producing malonic acid derivatives // Endo Т., Ozaki E., Enomoto K. 14.06.2000.

99. Pat. 11341979 JP. Production of bacterial cell body having high nitrilase productivity // Watabe Т., Ishikawa Т., Yokoyama M. 14.12.1999.

100. Pat. 9028382 JP. Microorganism constitutionally producing nitrilase, control factor related to constitution and gene therefor // Nakamura Т., Mizumura Yu., Kobayashi Y. 04.02.1997.

101. Pat. 0707061 EP. Method for preserving a suspension of cells or immobilized cells // Endo T, Hirata Y., Murao K. 17.04.1996.

102. Robinson W.G., Hook R.H. Ricinine nitrilase. I. Reaction product and substrate specificity // J. Biol. Chem. 1964. - Vol. 239, N 12. - P. 4257-4262.

103. Stalker D.M., Mc Bride K.E., Malyj L.D. Herbicide resistance in transgenic plants expressing a bacterial detoxification gene // Science. 1988. - Vol. 242. -P. 419-423.

104. Stalker D.M., Malyj L.D., Mc. Bride K.E. Purification and properties of a nitrilase specific for the herbicide bromoxynil and corresponding nucleotide sequence analysis of the bxn gene // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263, N 13. - P. 310-314.

105. Stevenson D.E., Feng R., Dumas F. at al. Mechanistic and structural studies on Rhodococcus ATCC 39484 nitrilase // Biotech. Appl. Biochem. 1992. -Vol. 15.-P. 283-302.

106. Stevenson D.E., Feng R., Storer A.C. Detection of covalent enzyme-substrate complexes of nitrilase by ion-spray mass spectroscopy // FEBS Lett. 1990. -Vol. 277.-P. 112-114.

107. Sugiura Y., Kuwahara J., Nagasawa Т., Yamada H. Nitrile hydratase: The first non-hemoiron enzyme with a typical low-spin Fe(III) active center // J. Am. Chem. Soc. - 1987. - Vol. 109, N 19. - P. 5848-5850.

108. Sugiura Y., Kuwahara J., Nagasawa Т., Yamada H. Significant interaction between low-spin iron (III) site and pyrroloquinolin quinone in active center of nitrile hydratase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. - Vol. 154, N 2.1. P. 522-528.

109. Tani Y. Производство продажных химических реактивов и микробиологические процессы. // Biosci. Ind. 1990. - Vol. 48, N 7. - P. 635640.

110. Thompson A., Knowles C.J., Linton E.A., Wiatt J.M. Microbial Biotransformations of nitriles // Chem. in Britain. 1988. - N 9. - P. 900-902, 912.

111. US 6162624// Production of ammonium acrylate / Symes K.CH., Hughes J. // 19.12.00.

112. Watanabe I., Satoh Y., Enomoto K. Screening, isolation and taxonomical properties of microorganisms having acrylonitrilehydrating activity // Agric. Biol. Chem. 1987. - Vol. 51, N 12. - P. 3193-3199.

113. Webster N.A., Ramsden D.K., Hughes J. Comparative characterisation of two

114. Rhodococcus species as potential biocatalysts for ammonium acrylate production // Biotechnol. Lett. 2001. - Vol. 23. - P. 95-101.

115. Yamada H. Recent development in microbial transformation // Nippon Nogei Kagaku Kaishi. 1988. - Vol. 62, N 4. - P. 765-767.

116. Yamada H., Kobayashi M. Nitrile hydratase and its application to industrial production of acrylamide // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996. - Vol. 60. - P. 1391-1400.

117. Yamada H., Asano Y., Nino Т., Tani Y. Microbial utilization of acrylonitrile // J. Ferment. Technol. 1979. - Vol. 57, N 1. - P. 8-14.

118. Yamada H., Nagasawa Т. Промышленное производство акриламида с использованием ферментов. // Biosci. Ind. 1988. - Vol. 46, N 4. - P. 30633065.

119. Yamamoto К., Ueno Y., Otsubo K., Kawakami K., Komatsu K. Production of S-(+)- Ibuprofen from a nitrile compound by Acinetobacter sp. AK 226// Appl. Environ. Microbiol. 1990. -N 56. -P. 3125-3129.

120. Yamamoto K., Komatsu K. Purification and characterization of nitrilase responsible for the enantioselective hydrolysis from Acinetobacter sp. AK 226 // Agric. Biol. Chem. 1991. - Vol. 55. - P.1459-1466.

121. Yamamoto K., Oishi K., Fujimatsu I., Komatsu K. Production of R-(-)-mandelic acid from mandelonitrile by Alcaligenes faecalis ATCC 8750 // Appl. Environ. Microbiol. 1991. -N 57. -P. 3028-3032.

122. Yamamoto K., Fujimatsu I., Komatsu K-I. Purification and characterization of the nitrilase of Alcaligenes faecalis ATCC 8750 responsible for enantioselectective hydrolysis of mandelonitrile // J. Ferm. Bioeng. 1992. -N73.-P. 425-430.