Лечение острых и резистентных форм аутоиммунной гемолитической анемии и мониторинг активности гемолиза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат медицинских наук Никулина, Ольга Федоровна

• Никулина, Ольга Федоровна
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Никулина, Ольга Федоровна

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы исследования.

Цель.

Задачи.

Научная новизна.

Практическая значимость.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. История развития учения об аутоиммунной гемолитической анемии.

1.2. Классификация аутоиммунной гемолитической анемии.

1.3. Патогенетические особенности АИГА.

1.4. Иммунологическая характеристика антител при АИГА.

1.5. Биофизические свойства эритроцитов - деформируемость и плотность.

1.6. Значение креатина эритроцитов при аутоиммунной гемолитической анемии.

1.7. Клиническая картина АИГА.

1.7.1. АИГА с неполными тепловыми агглютининами.

1.7.2. АИГА с тепловыми гемолизинами.

1.7.3. АИГА с полными Холодовыми агглютининами.

1.7.4. Пароксизмальная холодовая гемоглобинурия (ПХГ).

1.7.5. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ).

1.8. Диагностика АИГА.

1.9. Лечение аутоиммунной гемолитической анемии.

1.9.1. Кортикостероидная терапия.

1.9.2. Спленэктомия.

1.9.3. Применение иммунодепрессантов при лечении АИГА.

1.9.4. Лечение больных АИГА вызванными Холодовыми агглютининами.

1.9.5. Применение ритуксимаба (Мабтеры) в лечении АИГА.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общая характеристика больных.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Оценка фильтруемости и деформируемости эритроцитов.

2.2.2. Фталатный метод исследования распределения эритроцитов по плотности

2.3. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изменение фильтрусмости при различных формах анемий.

3.2. Измерение плотности эритроцитов в группе здоровых доноров и больных контрольной группы (ЖДА, МСЦ, ПНГ) и АИГА.

3.3. Оценка эффективности лечения АИГА «стандартными» дозами преднизолона.

3.4. Анализ эффективности пульс-терапии метилпреднизолоном больных с АИГА.

3.5. Сравнительный анализ результатов пульс-терапии метилпреднизолоном и «стандартной» терапии преднизолоном.

3.6. Оценка эффективности спленэктомии при АИГА.

3.7. Проведение спленэктомии больным МСЦ.

3.8. Лечение больных резистентной формой АИГА ритуксимабом.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Лечение острых и резистентных форм аутоиммунной гемолитической анемии и мониторинг активности гемолиза»

Актуальность темы исследования

Аутоиммунные гемолитические анемии (ЛИГА) - группа заболеваний, обусловленных выработкой аутоантител против антигенов эритроцитов. В результате происходит ускоренное разрушение эритроцитов, аутосенсибилизированных иммуноглобулинами различных классов и комплементом.

Стандарты диагностики и терапии АИГА остаются неизменными уже много лет. Однако при проведении первой линии терапии преднизолоном ремиссии составляют всего 7,3-22% (А.И. Воробьев, 2005, Dacie J. 1962, Packman С., Leddy J. 1995). Актуальность поиска новых возможностей лечения АИГА определяется необходимостью длительного приема кортикостероидных препаратов, приводящих к тяжелым осложнениям, развитием повторных гемолитических кризов при попытке их отмены, укорочением продолжительности ответа при повторном применении и противоречивыми результатами использования других видов' иммуносупрессивной терапии. Первостепенной задачей лечения острых АИГА является выбор пути наиболее быстрого прерывания гемолиза. В этих случаях пульс-терапия метил преднизолоном может стать альтернативой «стандартным» дозам преднизолона, поскольку она давно и успешно используется при тяжелых формах других аутоагрессивных заболеваний* (Liebling M.R, 1981, Caldwell D. 1991, Hari P, 1998, Pasricha J.S, 2003). В литературе нет достаточных сведений об эффективности пульс-терапии при АИГА (Ozsoylu S. 1990, 2000, Meyer О. et al. 1997) как и нет ответа, может ли она уменьшить число инвалидизирующих последствий общепринятого длительного режима кортикостероидной терапии (Stanbury R., Grham Е. 1998, Bialas М, Routledge P. 1998, Lester . R. et al. 1998).

В 1998 году в клинической практике применен препарат ритуксимаб, который представляет собой химерное моноклональное антитело к антигену

CD20, экспрессируемому на поверхности зрелых В-лимфоцитов (Coiffer B.et al. 1998, Leget G., et al. 1998). В зарубежных исследованиях была показана высокая эффективность ритуксимаба при разных аутоиммунных процессах, в том числе, у небольшого числа больных с резистентными АИГА (Stasi R. Et al. 2001, Lee E. Et al. 2000, Kakaiya R. 2003, Szodoray P., Alex P, 2004). Новая терапия на первом этапе позволила получить ремиссии в 50-80% случаев (Zecca М, 2003, Erdozain J.G., Irastorza R., 2004, Petz L., Garatty G. 2004). Однако необходим дальнейший научно-практический анализ значимости ритуксимаба, поскольку стабильность полученных результатов, оптимальная дозировка, спектр и частота побочных эффектов, а также возможность повторного введения при рецидиве заболевания и отдаленные последствия остаются мало изученными.

Основные симптомы и лабораторные признаки гемолиза (гемоглобин, ретикулоциты, билирубин, ЛДГ) позволяют констатировать уже состоявшийся гемолитический криз. Поэтому очень важен поиск других, доступных показателей гемолитической активности, мониторинг которых, дает возможность подтвердить стабильность достигнутой ремиссии, контролировать угрозу и ранние проявления рецидива и обосновать либо прекращение поддерживающей терапии, либо проведение превентивного, противорецидивного курса. Было показано, что при АИГА в разные периоды течения болезни такие биофизические свойства эритроцитов, как плотность и деформируемость существенно изменяются, что позволяет использовать их в контролировании ответа на лечение (Шурхина Е.С, Лисовская И.Л, 2004). Кроме того, исследование плотности и деформируемости эритроцитов, расширяет информацию о свойствах эритроцитов при различных патологиях и может быть использовано в дифференциальной диагностике некоторых анемии, а в дальнейшем для коррекции терапии. Биохимическое определение среднего содержания креатина в эритроцитах может стать еще одним рациональным методом измерения активности гемолиза на разных этапах АИГА. Колебания уровня креатина эритроцитов, как и количество ретикулоцитов в крови, являются интегральным показателем активности эритропоэза (Griffiths W., Fitzpztrick М., 1967). Однако, поскольку высокое содержание креатина свойственно только молодым эритроцитам и по мере их старения оно постепенно снижается, этот показатель более полно отражает изменение доли всех молодых эритроцитов, а не только ретикулоцитов (Griffiths W., Fitzpztrick М. 1967, Дмитриева М.Г. 1998). Иными словами креатин эритроцитов остается высоким даже тогда, когда уже нет ретикулоцитоза, так как молодые эритроциты продолжают циркулировать еще 2-3 недели.

Важно, что все три метода просты в исполнении, не требуют дорогостоящих реактивов и оборудования и могут найти применение в широкой клинической практике в качестве методов оценки активности гемолиза, а также диагностики некоторых форм анемий и контроля терапии.

Цель

Разработать оптимальные режимы лечения острых и резистентных форм АИГА и новый алгоритм мониторинга активности гемолиза с использованием оценки деформируемости, плотности и количества креатина эритроцитов.

Задачи

1. Проанализировать эффективность пульс-терапии при острых формах АИГА и выработать оптимальную тактику ведения данной группы больных.

2. Оценить эффективность и проанализировать особенности лечения ритуксимабом резистентных форм АИГА.

3. Выявить характерные различия деформируемости и плотности эритроцитов при некоторых формах анемий и АИГА. Оценить клиническое значение мониторинга изменений деформируемости, плотности и количества креатина эритроцитов на разных этапах течения ЛИГА для контроля активности гемолиза.

4. Создать оптимальный алгоритм лечения и контроля за его эффективностью при острых и резистентных форм АИГА с неполными тепловыми агглютининами.

Научная новизна

Выявлены преимущества пульс-терапии метилпреднизолоном острых форм АИГА перед «стандартным» режимом лечения преднизолоном: а) отсутствие серьезных побочных эффектов, свойственных длительному лечению преднизолоном; в) быстрота первичного ответа не только без потери в отдаленных результатах, но и с большей частотой полной, ремиссии. Доказана высокая эффективность лечения ритуксимабом резистентных форм АИГА. Выработан новый подход к контролю эффективности лечения АИГА с помощью мониторинга деформируемости, плотности и креатина эритроцитов, определяющего степень стабильности ремиссии и ранние признаки рецидива гемолиза. Выявлены характерные различия деформируемости, плотности и количества креатина при некоторых формах анемий, которые улучшающие их дифференциальную диагностику и контроль ответа на терапию.

Практическая значимость

Оптимизирована тактика лечения острых и резистентных форм АИГА с использованием пульс-терапии метилпреднизолоном и ритуксимаба. Разработан новый алгоритм контроля активности гемолиза в процессе лечения АИГА, включающий измерение деформируемости, плотности и креатина эритроцитов, который позволяет констатировать полную ремиссию и раннее проявление рецидива. Показано, что измерение в динамике фильтрационно-осмотических свойств и креатина эритроцитов информативный и простой в исполнении комплекс тестов, повышающий достоверность дифференциальной диагностики анемий и улучшающий возможности контроля лечения не только АИГА, но ряда других анемий.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Никулина, Ольга Федоровна

выводы

1. Разработана оптимальные тактика лечения аутоиммунной гемолитической анемии (АИГА) с неполными тепловыми агглютининами; при остром течении — пульс-терапия метилпреднизолоном, при резистентных формах гемолиза - введение итуксимаба, включающая новый алгоритм мониторинга интенсивности гемолиза, с использованием показателей деформируемости, плотности эритроцитов и концентрации в них креатина.

2. Пульс-терапия метилпреднизолоном острых форм аутоиммунной гемолитической анемии по сравнению со «стандартным» режимом лечения преднизолоном позволила уменьшить количество осложнений, присущих кортикостероидам и увеличить частоту клинических ремиссии с 6,7 до 29%, а также ускорить прерывание гемолитического криза и в минимальные сроки оценить перспективу эффективного лечения больного (продолжение пульс-терапии, спленэктомия, иммуносупрессивная терапия).

3. Мониторинг биофизических параметров эритроцитов и содержания в них креатина, увеличивает информативность общепринятых параметров активности гемолиза и имеет прогностическое значение, так как позволяет оценить полноту и стабильность ремиссии и аргументировать отмену или продление поддерживающего лечения, а также уловить минимальные признаки активации гемолиза необходимые для своевременной коррекции терапии.

4. У всех восьми больных с резистентной аутоиммунной гемолитической анемией, пролеченных ритуксимабом был прерван гемолиз, причем у половины больных (50%) достигнута полная ремиссия длительностью от 4 до 30 мес, не требующая поддерживающей терапии.

5. Выделены особенности ответа на лечение ритуксимабом были:

1) отсроченный эффект с медианой развития ремиссии 48 дней;

2) возможность получения ответа при повторном введении препарата;

3) хорошая его переносимость; 4) возможность обоснованной редукции курсовой дозы за счет сокращения кратности введения.

Ритуксимаб не угнетал гуморальный иммунитет и не повышал частоту бактериальных инфекций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Причиной аутоиммунных гемолитических анемий (АИГА) является разрушение эритроцитов, аутосенсибилизированных иммуноглобулинами (Ig) и/или компонентами комплемента. В результате гиперпродукция эритроидных клеток в костном мозге уже не успевает компенсировать ускоренное разрушение циркулирующих эритроцитов, что приводит к развитию анемии, иногда молниеносной, угрожающей жизни больного.

Известно, что в подавляющем большинстве случаев, АИГА бывает вызвана неполными тепловыми, агглютининами и основные общепринятые сведения о диагностике, традициях лечения и обобщения его результатов касаются именно этой формы [4, 19, 25]. Естественно, что данная закономерность нашла отражение и в- нашем исследовании:* у 74% из 50 обследованных больных был именно этот тип АИГА, а холодовые агглютинины были выявлены только у 6 пациентов.

При острой форме АИГА тактика лечения, направленная на сокращение: сроков купирования гемолиза приобретает особое значение. Преднизолон в «стандартной» дозе 1-2 мг/кг, во всем мире применяется в качестве первой линией терапии гемолитического криза АИГА, однако ее итог — всего 7,3 -22% ремиссий [4, 7, 8, 10]. Возобновление гемолиза при снижении дозы преднизолона, укорочение продолжительности ответа при повторном его применении и неизбежные осложнения (остеопороз, сахарный диабет, бактериальные инфекции, тромбозы), превращающиеся в самостоятельную терапевтическую проблему, ухудшают прогноз и делают актуальным поиск новых режимов терапии АИГА. Отдельные публикации об успешном использовании пульс-терапии метилпреднизолоном при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре и других аутоагрессивных заболеваниях [93, 130] являются поводом для анализа его эффективности при АИГА.

При рецидивах гемолиза применяют различные виды альтернативной терапии - спленэктомию, вызывающую наибольшее число ремиссий (более чем в 60% случаев), а также иммунодепрессанты. Однако, в 20 -30% случаев АИГА оказывается резистентной или требует непрерывной поддерживающей терапии. Новым перспективным направлением борьбы с такими тяжелыми формами АИГА представляется терапия моноклональным химерным антителом к кластерам дифференцировки CD20 В-лимфоцитов (ритуксимаб). В зарубежных исследованиях его первоначально применяли у отдельных пациентов с вторичными АИГА, сопряженными с хроническими В-клеточными лимфатическими опухолями [110, 134]. В последующем оказалось, что после введения ритуксимаба в универсальной дозе, при самых разных резистентных аутоагрессивных заболеваниях, включая идиопатические АИГА и «холодовую гемагглютининовую болезнь», частота ремиссий достигала 50-80% случаев [16, 138, 140]. При АИГА преимущества и недостатки, продолжительность этого вида терапии и частота проведения курсов еще недостаточно известны [55, 97].

Совершенствование эффективности лечения предполагает также, поиск наиболее оптимальных способов контроля его результативности. Такие тесты дополнят общепринятые (гемоглобин, ретикулоциты, билирубин, ЛДГ), возможностью мониторировать минимальные признаки активности гемолиза, что необходимо для выработки единых показаний к отмене, изменению и моменту возобновления той или иной терапии АИГА.

Все это определило цель и задачи данной работы.

Для более полной характеристики дополнительных показателей активности гемолиза - деформируемости, плотности и количества креатина эритроцитов, которые мы выбрали для мониторинга, помимо основного контингента больных АИГА с тепловыми неполными агглютининами, были обследованы пациенты контрольной группы. В нее включили здоровых доноров (п=21), больных с самыми распространенными видами анемии — железодефицитной (ЖДА п=20) и В12 дефицитной (п=5), а также с такими гемолитическими анемиями, как наследственная микросфероцитарная (п=30) и ПНГ (п=8), которые наиболее часто вовлечены в дифференциальный диагноз с АИГА. Мониторинг дополнительных параметров гемолиза (от 4 до 20 анализов) провели 38 больным АИГА. Было показано, что при разных анемиях биофизические свойства эритроцитов существенно различаются (рис 10,11,12). Наиболее значимыми различиями следует считать 1. при МСЦ преобладание в общей популяции эритроцитов патологической, тяжелой фракциии состоящей из микросфероцитов, при умеренном увеличении доли легкой фракции эритроцитов (ретикулоциты и молодые эритроциты); 2. для ЖДА - легкой фракции эритроцитов, сдвигающей кривую РЭПП влево (рис 10); 3. ПНГ с внутрисосудистым гемолизом, приводящим к гипохромии, как и при ЖДА - легкая фракция эритроцитов преобладала (до 20 норм), тогда как эритроциты тяжелой фракции (дегидратированные эритроциты и микросфероциты) практически отсутствовали. Кривая- РЭПП.при ПНГ имеет два пика, за счет присутствия эритроцитов нормальной плотности, помимо измененной фракции ^ (рис 12). Таким образом, определение плотности и деформируемости эритроцитов, при различных формах анемий, имеет дифференциально-диагностическое значение, что используется в . нашей' практической работе.

В отличие от всех предыдущих вариантов, диаграммы РЭПП при АИГА, в период активного гемолиза, выявляли значительное увеличение обеих патологических фракций, как легкой, так и тяжелой. В процессе лечения и развития ремиссии показатели РЭПП постепенно приближались к параметрам здоровых доноров (рис. 10).

Общепринятые показатели гемолиза (гемоглобин, ретикулоциты; непрямой билирубин), сопоставили с предложенными нами «дополнительными» тестами, характеризующими активность гемолиза -изменением плотности эритроцитов (распределение эритроцитов по плотности - РЭПП), способность деформироваться и количеством креатина эритроцитов в различные фазы заболевания.

У больных АИГА, в период активного гемолиза, параллельно с изменениями гемограммы, выявили грубые нарушения биофизических свойств эритроцитов в виде увеличения легкой, тяжелой фракции эритроцитов в 12-25 раз (dJie, 12±8,0% ,<1тяж 25,6±9%),за счет уменьшения эритроцитов с нормальной плотностью, нарушение фильтруемости (Ucr 229±42мОсм) и увеличение количества креатина эритроцитов (метилгуанидиноуксусной кислоты) в среднем в 5 раз. По сравнению с подсчетом ретикулоцитов средний уровень креатина не позволяет пропустить факт активации эритропоэза, так как высокий уровень креатина сохраняется в молодых эритроцитах более 20 дней, а продолжительность циркуляции ретикулоцитов около двух дней [81, 124]. Вот почему сочли необходимым включить креатин в стандартные методы диагностики в Японии [102]. Использование его в качестве мониторингового теста помогает выявить эпизод гемолиза или скрытый гемолиз.

Стремление уменьшить осложнения, свойственные кортикостероидной терапии, а также ускорить купирование- гемолиза, стало основанием проведения пульс-терапии метилпреднизолоном 17 больным с острой формой течения АИГА в виде гемолитического криза (10 с впервые выявленной АИГА и 7 с рецидивом гемолитического криза), в возрасте 18-66 лет (11 мужчин и 6 женщин).

Через месяц от начала пульс-терапии характеристика всех основных параметров интенсивности гемолиза имела преимущества перед «стандартной» терапией. Средние показатели уровня гемоглобина были выше, а количество ретикулоцитов и билирубина ниже в группе терапии метилпреднизолоном (рис.28).

Ни у одного больного при «стандартной» терапии не удавалось проследить такого же быстрого повышения гемоглобина, как это наблюдалось при пульс-терапии: в среднем на 3 г/л уже через сутки от начала терапии и дальнейший рост до 80 г/л на четвертые сутки. В то время как при первом варианте «стандартной» терапии аналогичный уровень гемоглобина (80 г/л) был зарегистрирован только через 15-20 дней от ее начала (рис.27). Данная тенденция сохранялась на всем протяжении лечения. После проведения (4-5 курсов) пульс-терапии метилпреднизолоном — гемоглобин был выше, а ретикулоцитоз ниже, как минимум на 10 г/л и 13%о, чем после N приема преднизолона. Анализ деформируемости, фильтруемости эритроцитов и содержание в них креатина показала, что патологические фракции - легкая и тяжелая фракции эритроцитов оказалась меньше в группе получившей пульс-терапию. Ежемесячный мониторинг показателей гемограммы и биофизических свойств эритроцитов после пульс-терапии показал их постепенное улучшение - снижение уровня креатина, легкой и тяжелой фракции эритроцитов в 3 раза и 1,5 раза соответственно (рис.20, рис.21). Данные показатели нормализовывались быстрее на пульс-терапии метилпреднизолоном. В ремиссии достигнутой пульс-терапией нормализовывались» не только гемоглобин, ретикулоциты, билирубин, но и биофизические свойства, и количество креатина эритроцитов, что ни разу не удалось достичь на «стандартной» терапии преднизолоном.

Как показал мониторинг на всех стадиях купирования, гемолиза и при достижении ремиссии биофизические и» биохимические свойства эритроцитов (РЭПП, фильтруемость, креатин эритроцитов) менялись параллельно с основными изменениями показателей гемограммы (Hb, Rt, непрямой билирубин), но нормализация основных показателей наступала быстрее, чем дополнительных тестов, что имеет важное значение для режима терапии. Полноту ремиссии определяли по нормализации основных показателей, однако возврат к норме «дополнительных» тестов более убедительно подтверждал ремиссию и позволял переводить больных на поддерживающую терапию. Таким образом, в ходе многолетнего наблюдения была подтверждена перспективность определения минимальной активности гемолиза, с помощью анализа плотности, фильтруемости и креатина эритроцитов.

Корреляционный анализ в группе больных, получивших пульс-терапию, выявил обратную взаимосвязь между снижением ретикулоцитов и повышением уровня гемоглобина и эритроцитов (г=-0,69 и г=-0,76, р<0,05, п=17), прямую корреляцию между ретикулоцитозом, увеличением креатина эритроцитов (г = 0,7, р<0,05, п=17) и легкой фракцией эритроцитов (г=0,66, р<0,05, п=17), а также легкой фракцией эритроцитов и количеством молекул иммуноглобулинов (А, М) на эритроцитах (п=17, г=64, 52 и г=66, р<0,05). Все эти данные показывают клиническую информативность, как совокупности, так и отдельно взятых тестов активности гемолиза.

Таким образом, после проведения терапии метилпреднизолоном (МТП) восстановление до нормы гемоглобина, ретикулоцитов, непрямого билирубина, характеризующих прекращение гемолиза, отмечались после 5 — 6 курсов. Тогда как, в группе больных, получавших «стандартную» терапию (п=28) преднизолоном, через 2-3 месяца от начала терапии, при снижении дозы препарата, как правило, постепенно снижался уровень гемоглобина и повышалось число ретикулоцитов, что говорило о раннем рецидиве гемолиза (НЬ 85,2+12,8 г/л, Rt 84,5±40,4%0), который можно было прогнозировать, опираясь на дополнительные тесты, свидельствующие о «скрытой» активности гемолиза т.е по сути о реальном отсутствии ремиссии, возникающей при попытке более быстрой отмены преднизолона из-за возникших осложнений. Это заставляло вновь возвращаться к высокой дозе преднизолона и только через 3-5 рецидивов или 1,5-2 года вставал вопрос о спленэктомии. Длительное лечение преднизолоном больных приводило к комбинированным тяжелым осложнениям, свойственным стероидной терапии. Тогда как еще Ю.И. Лорие, добившийся наибольшего процента ремиссий (22%), при длительной до 3-х лет поддерживающей терапии преднизолоном в дозах 40-20 мг и отменой препарата лишь при отрицательной прямой пробе Кумбса, систематически отмечал такие тяжелые осложнения, как развитие асцита, вследствие тромбоза вен портальной системы, бактериальные сепсисы, остеопорозы с деструкцией костей, декомпенсированный сахарный диабет [19]. Ошибки раннего прерывания лечения преднизолоном типично для практической гематологии. Это обьясняется желанием избежать осложнений. Такая принципиальная возможность существует при пульс-терапии. Характерно, что при пульс-терапии удалось избежать осложнений не только у тех, кто получал кортикостероиды впервые, но и у пациентов, уже имеющих побочные эффекты от предшествующей «стандартной» терапии, что находит подтверждение литературным данным - отсутствие осложнений при проведении пульс-терапии больным с ревматоидным полиартритом и другими аутоиммунными заблеваниями (Pasricha J.S, 2003). Единственной нашей проблемой при пульс-терапии был синдром отмены (у 18%), купированный назначением 10-15 мг преднизолона с последнего третьего дня курса с последующей быстрой отменой-в течение 5 дней. Решить продолжать пульс-терапию или провести спленэктомию можно было уже после второго курса метилпреднизолона (2-3 недели). Таким образом, первые два курса лечения были определяющими.

После проведения «стандартной» терапии ремиссия достигнута у двух больных (6,7% случаев). Продолжительность ремиссии 17, 30" месяцев. Небольшой процент успеха может быть объяснен наиболее тяжелым контингентом больных, направленных для обследования и лечения в ГНЦ, а также жесткими критериями определения полной клинической ремиссии.

В результате пульс-терапии метилпреднизолоном ремиссия была достигнута у 5 больных (29% случаев), продолжающаяся от 8 до 55 мес. Ремиссии при пульс-терапии отмечены при различных вариантах АИГА - с неполными тепловыми агглютининами, смешанной формой антител, при синдроме Фишера-Эванса, тогда как при «стандартной» терапии, аналогичный результат достигнут только у больных АИГА с неполными тепловыми агглютининами.

Сравнительный анализ безрецидивного течения АИГА при двух видах кортикостероидной терапии, несмотря на неоднородность состава больных, показал, что проведение пульс-терапии приводит к более быстрому ее достижению у более тяжелого контингента больных, что наглядно представлено на рисунке 28.

Таким образом, анализ наших клинических наблюдений привел к заключению, что проведение пульс-терапии является альтернативой «стандартной» терапии при острых формах АИГА и тяжелых гемолитических кризах, не только благодаря уменьшению осложнений, но и большему проценту ремиссий. Мониторинг не только основных, но и дополнительных тестов, характеризующих активность гемолиза, у больных АИГА помогает подтвердить стабильность достигнутой ремиссии и решить вопрос о необходимости дальнейшего проведения терапии или ее отмены.

При отсутствии ремиссии, в результате пульс-терапии следующим этапом стала спленэктомия. Важным моментом при уточнении показаний к спленэктомии явилось определение места секвестрации эритроцитов с Сг51 или Тс"-теоксим [25, 26]. Последний метод имеет преимущества при острых формах АИГА из-за сокращения сроков диагностики до 1-2 дней. У больных, с повышенной секвестрацией эритроцитов в> селезенке, по аналогии с контрольной группой больных МСЦ (п=10) после проведения спленэктомии, высока вероятность клинической ремиссии АИГА (96%). Тогда как у пациентов, не достигших клинических ремиссий АИГА до и после спленэктомии, была выявлена также првышенная секвестрация в печени.

Таким образом, выделенные тесты, предложенные нами для дополнительного мониторинга активности гемолиза (распределение эритроцитов по плотности, фильтруемость эритроцитов, количество креатина в эритроцитах) приобретают, во-первых, вследствие различий в механизме гемолиза дифференциально-диагностическое значение, во-вторых, позволяют более четко стадировать АИГА. Но самое главное, что они позволяют определить полноту ремиссии для решения вопроса о необходимости продления терапии или ее отмены без риска развития рецидива, а также помогают распознать возврат минимальной активности, даже в отсутствии клинических проявлений заболевания и своевременно начать новый курс лечения, не дожидаясь развития очередного гемолитического криза.

Внедрение этих 3-х тестов в широкую клиническую практику позволит уменьшить процент диагностических ошибок и изменить тактику введения больных в целях предупреждения развития рецидива гемолиза.

Следующей важнейшей задачей данной части работы было лечение резистентных форм АИГА, составляющих 20-30% случаев (4,10). Применение хорошо известных и новых иммунодепрессивных препаратов (циклоспоринА, даназол, циклофосфамид), а также введение иммуноглобулина дает небольшой процент клинических ремиссий [68, 88, 116]. В ряде случаев ремиссии достигаются только при комбинации вышеуказанных препаратов с преднизолоном (как это отмечено при лечении даназолом) (37). В последние 5 лет появился ряд сообщений об успешном использовании антител к кластерам дифференцировки зрелых В-лимфоцитов (aHTH-CD-20 — рнитуксимаб), первоначально при вторичных, осложнивших лимфопролиферативные заболевания, а затем и первичных АИГА [109,' 110, 114]. Начиная с единичных описаний больных с АИГА с Холодовыми антителами, спектр и количество больных увеличивались с каждым годом и в настоящее время описано более ста наблюдений с различными формами-АИГА [97, 100, 108]. Согласно данным зарубежной литературы после проведения терапии ритуксимабом больным резистентной формой АИГА ремиссии получены в 54-80 % [100, 55, 140, 142, 141].

При разработке программы лечения АИГА ритуксимабом (РТМ) важен был выбор курсовой дозы препарата. Курс лечения РТМ — четыре введения в дозе 375 мг/м" в течение месяца был принят у больных с лимфопролиферативными заболеваниями, имеющих увеличенную массу лимфоцитов — мишеней. В литературе имеются сообщения о двух-, трех-, и шестикратном введении препарата [95, 108]. Тогда как у больных с АИГА абсолютное число В-лимфоцитов не превышает норму и даже после предшествующей кортикостероидной терапии, бывает снижена. Можно предположить, что доза ритуксимаба может быть уменьшена без ущерба для желаемого эффекта. Учитывая это, в исследовании мы ограничились двумя введениями ритуксимаба с интервалом в одну неделю. Обоснованность выбора такого режима введения дозы t препарата, была уточнена путем еженедельного мониторинга численности В-лимфоцитов (CD 19+, CD20+, CD22+) периферической крови после введения препарата. Выявлено быстрое снижение их численности до 0, уже перед вторым введением препарата. В том случае, когда количество В-лимфоцитов перед вторым введением был более 1%, курс лечения состоял из 4-х введений ритуксимаба.

Ритуксимаб вводили восьми больным резистентной формой АИГА, с тепловыми агглютининами. Двум из восьми больным, до введения препарата спленэктомия не проводилась, поскольку имело место повышение не только селезеночной, но и печеночной секвестрации эритроцитов, что в дальнейшем не привело бы к полной ремиссии заболевания. Учитывая увеличение селезенки, а также сохраняющийся после двух введений ритуксимаба уровень CD20+ лимфоцитов - 2% у одной' из больных проведено четырехкратное- введения препарата, после- чего достигнута частичная ремиссия. Тогда как у другой больной клиническая ремиссия была достигнута после двухкратного введения, поскольку численность В-лимфоцитов с маркерами CD20+ снизилась до 0% уже после первого введения.

Комплексный мониторинг основных и дополнительных гематологических показателей определил, что результативность лечения становится очевидной в течение одного месяца (гемоглобин > 100 г/л, нормализация непрямого билирубина и снижение ретикулоцитоза и легкой фракции эритроцитов более чем в два раза). Нормализация билирубина отмечена ко второму месяцу у всех больных. Дальнейшее восстановление гемоглобина происходило постепенно к пятому месяцу после введения препарата у 7 из 8 больных. Параллельно с нормализацией гемограммы к пятому месяцу постепенно снижалось содержание креатина в эритроцитах и улучшились, их биофизические свойства — снизилась до нормы доля легкой фракции эритроцитов, тогда как тяжелая фракция эритроцитов у четырех больных еще сохранялась выше нормы. Постепенный характер изменений удалось показать благодаря мониторингу всех перечисленных показателей в течение 5-6 месяцев. Кроме того, такая степень улучшения мониторируемых показателей у всех восьми больных была отмечена впервые за многолетний период предыдущей терапии.

Проведенный корреляционный анализ подтверждает взаимосвязь основных и дополнительных тестов, характеризующих активность гемолиза, и свидетельствует об информативности, как каждого из них, так и их в совокупности (табл. 12).

В связи с важностью контроля за количеством В-клеток проводили мониторинг численности В-лимфоцитов периферической крови. В течение недели после первого введения препарата у всех больных выявлено исчезновение из циркуляции В-лимфоцитов (CD20+, CD 19+, CD22+) практически до нуля; с последующим постепенным, подъемом через 3-5 месяцев (до 3L5 %) с достижением исходного количества к пятому месяцу (в среднем до 11%). Динамика изменения В-клеток после введенияфитуксимаба является закономерной, что подтверждают сведения из ряда публикаций [103, 108]. Данная динамика В-лимфоцитов в дальнейшем- может быть использована в разработке программы лечения больных с АИГА.

Представляет интерес успешное повторное введение препарата двум больным через 2 и 8 месяцев от начала терапии. Полная и частичная ремиссии продолжаются, 18 и 6 месяцев. Данный пример показывает, что благодаря мониторингу дополнительных тестов, выявляющих минимальную активность гемолиза еще до клинических изменений, возможна «превентивная» терапия, предотвращающая гемолитические кризы и улучшающая качество жизни, и социальную реабилитацию больных. Наш клинический опыт при резистентных АИГА в совокупности с немногочисленными литературными сведениями [55] позволяет сделать вывод о сохраняющейся эффективности ритуксимаба при повторных введениях с продолжительностью ремиссии близкой к той, которая была при первом введении препарата.

Поскольку ритуксимаб приводит к истощению популяции CD20+ В-лимфоцитов, большой интерес представляла оценка гуморального иммунитета у этой категории больных. Тщательный длительный еженедельный мониторинг иммуноглобулинов крови (G, А, М) не выявил эпизодов их снижения по сравнению с исходными показателями, что указывает на сохранность гуморального иммунитета у данной категории больных. Аналогичные данные мы нашли в литературе [142]. В то же время имеют место сообщения о снижении Ig G у детей, но при этом не было отмечено тяжелых инфекционных осложнений [133, 142]. В некоторых случаях в детской гематологии профилактически вводили препараты иммуноглобулина, однако необходимость такой профилактики инфекции четко не определена и требует дальнейшего изучения. [142]. Возможно, не все секретирующие клоны В-клеток подвергаются воздействию ритуксимаба. Наши наблюдения свидетельствовали о том, что у пациентов после введения РТМ сопутствующие хронические воспалительные заболевания не прогрессировали, более того их проявления уменьшились после прекращения гемолиза. А у больных с тромбозами на фоне активного гемолиза, вследствие аспленического тромбоцитоза, после введения ритуксимаба рецидивов тромбозов не отмечено.

Таким образом, после введения ритуксимаба, впервые ответ на терапию получен у всех восьми больных (100%), резистентных к другим видам лечения. Отмечен высокий процент ремиссий (50%), близкий к результатам метанализа по зарубежным публикациям [69, 109].

Полная ремиссия достигнута у 4-х из 8-ми больных (50%), которые были резистентными к предыдущей терапии, причем отмечена нормализация, как показателей гемограммы, так и дополнительных тестов, характеризующих активность гемолиза. В настоящее время продолжительность ремиссии составляет 30, 17, 16 и 14 месяцев. Частичная ремиссия достигнута у 4-х других больных. Продолжительность частичной ремиссии на сегодня у одного больного 15 месяцев, у двух — более 13 месяцев и у одной — шесть. В общей сложности после введения ритуксимаба медиана сроков достижения полной ремиссии составила 48 дней. Минимальный срок достижения ремиссии - один месяц, максимальный — 4 месяца (рис.39).

Анализ результатов наших клинических наблюдений позволил выработать следующий алгоритм ведения больных АИГА, охватывающих, как острые формы, гемолитические кризы, так и резистентные формы АИГА, которая может стать основой для создания протокола лечения АИГА. Результаты нашей работы позволили выработать алгоритм ведения больных с острыми и резистентными формами АИГА, схема которого представлена на рис. 44. рис. 44 Схема терапии больных острой формой и гемолитическим кризом АИГА

При диагностике острой формы или гемолитического криза АИГА рекомендовано проведение двух курсов пульс-терапии метилпреднизолоном в дозе 500 мг в/в капельно в течение 3-х дней. При ответе на терапию, проведение еще 3-4 аналогичных курсов. Ответ на терапию оценивался благодаря постоянному мониторингу основных и дополнительных тестов, контролирующих активность гемолиза. При отсутствии ответа на терапию подготовка больного к спленэктомии, с учетом прогноза эффективности удаления селезенки (или проведение иммуносупрессивной терапии). Если достигнута ремиссия после проведения пульс-терапии, спленэктомии или иммуносупрессивной терапии, проведение поддерживающей терапии длительное время до подтверждения ремиссии дополнительными методами контроля гемолиза (прием плаквенила 2-3 т в сутки не менее 6 месяцев). При резистентности к проводимой терапии рекомендовано введение ритуксимаба в дозе 375 мг /м~, два введения (первый и восьмой день) под контролем численности В-лимфоцитов в периферической крови (критерии режима курса ритуксимаба - два или четыре введения) и мониторинга тестов, контролирующих активность гемолиза. При сохраняющемся числе В-лимфоцитов более 1% после двух введений проведение курса терапии ритуксимабом осуществлено в полном объеме - 4 еженедельных введений. При возникновении рецидива АИГА — повторное введение ритуксимаба.

Таким образом, были разработаны новые режимы терапии, как острых гемолитических кризов, так и резистентных форм АИГА, с учетом постоянного мониторинга биофизических свойств эритроцитов, которые дают основание для изменения стандартов лечения АИГА, подтверждают стабильность достижения ремиссии и позволяют решать дифференциально-диагностические задачи.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Никулина, Ольга Федоровна, 2008 год

1. Балалыкин А.С. Эндоскопическая абдоминальная хирургия. ИМА-пресс. Москва, 1996.

2. Борзова Л.В. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, 1976, стр. 11-12.

3. Воробьев А.И. Проблемы гематологии и переливания крови N5, 1978, стр. 18-23.

4. Воробьев А.И. Руководство по гематологии. Т. 2,1985.

5. Гржимоловский А.В. Автореферат диссертации. Москва, 2004.

6. Дыгин В.П. Аутоиммунные заболевания системы крови. Медицина, 1964.

7. Идельсон Л.И., Дидковский Н.А., Ермильченко Г.В. Гемолитические анемии. Москва, Медицина, 1975.

8. Идельсон Л.И., Койзман М.М., Пивник А.В. Антитела, фиксированные на поверхности эритроцитов у больных ПККА. // Проблемы гематологии, 1976, № 6, стр. 3-9.

9. Идельсон Л.И., Мансурова Н.К., Ильин Г.П. Клиника, диагностика и лечение аутоиммунных гемолитических анемий с неполными тепловыми агглютининами. // Тер. Арх., 1982, 8: 90-95.

10. Исследование системы крови в клинической практике. Под ред Г.И.Козинца, В.А.Макарова. Москва, 1998.

11. Кассирский И.А., Алексеев Г.А. Клиническая гематология. Москва, 1962.

12. Клиническая иммунология и аллергология. Т. 2, под ред. Л.Иегера, Москва, Медицина, 1986.

13. Козинец Г.И., Зоделова М.М., Борзова JI.B., Кульман Р.А. Электрофорез клеток гемопоэтической ткани. Тбилиси, 1986, стр. 149.

14. Койфман М.М., Идельсон Л.И. Агрегат-гемагглютинационная проба в диагностике аутоиммунных гемолитических анемий с отрицательной пробой Кумбса.

15. Курильников А.Я. Мабтера 4 года в Россию. Москва, 2003.

16. Лисовская И.Л. Автореферат докторской диссертации. Москва, 2004.

17. Лисовская И.Л., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И. Фильтрационное исследование деформируемости эритроцитов. // Гематология и переливание крови, 2000, № 5.

18. Лорие Ю.И. Клиника гемолитических анемий. // Диссертация на соискание ученой степени доктора мед. наук, Москва, 1964

19. Мечников И.И. Sur les cytotoxines. Ann Inst Pasteur, 1900, 14; 6:369

20. Пивник A.B., Дмитриева М.Г. Прогностическая значимость определения' внутриэритроцитарной концентрации креатина для диагностики ускоренного гемолиза эритроцитов у больных анемиями. // Проблемы гематологии и трансфузиологии, 1998, № 4, стр. 37-42.

21. Подберезин М.М. Автореферат диссертации на соискание степени кандидата мед. наук. 1998.

22. Подберезин М.М. Современные методы диагностики аутоиммунных гемолитических анемий. // Гематология и трансфузиология, т.43, 1998, № 1, стр. 15-17.

23. Подберезин М.М., Левина А.А., Цибульская М.М., Пивник А.В. Иммуноферментный метод определения иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов: диагностическое и клиническое значение. // Проблемы гематологии, 1997, № 2, стр. 24-29.

24. Руководство по гематологии. Т.З. под редакцией А.И.Воробьева. Москва, 2005, стр. 262.

25. Сахибов Я.Д. АИГА: выживаемость и секвестрация эритроцитов. // Тер. Архив, 1978, №7.

26. Сизикова С.А., Лисуков И.А., Кулагин А.Д. // Тер. Архив. 2002, 7, стр. 22-26.

27. Турбина Н.С., Устинова Е.Н., Калинин Н.Н. Аутоиммунная гемолитическая анемия с Холодовыми эритроагглютининами. // Гематология и трансфузиология, 1988, № 6, стр. 29-31.

28. Устинова Е.Н., Турбина Н.С., Порешина Л.П. Клиническое значение класса иммуноглобулинов на эритроцитах при идиопатической аутоиммунной гемолитической анемии. // Гематология и трансфузиология, 1987, № 12, стр. 8-10.

29. Файнштейн Ф.Э., Зотиков Е.А., Турбина Н.С. Новые данные о патогенезе аутоиммунной гемолитической анемии и их клиническом значении. //Гематология и трансфузиология, 1983, № 6, стр. 9-12.

30. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. Москва, 1985, стр. 188.

31. Цветаева Н.В., Колодей С.В. Лечение "острых" форм аутоиммунных гемолитических анемий. // Врач, 2002

32. Цветаева Н.В., Колодей С.В., Заваденко М.А. Полибреновый тест в диагностике аутоиммунной гемолитической анемии. // Гематология и трансфузиология, стр. 40-41

33. Шпакова А.П., Турбина Н.С., Устинова Е.Н., Петрова В.И. Лечебный плазмолимфоцитаферез при аутоиммунной гемолитической анемии. // Гематология и трансфузиология, 1988, № 3, стр. 20-22.

34. Шурхина Е.С., Нестеренко В.М., Лисовская И.Л. Выявление этапов Аутоиммунной гемолитической анемии с помощью исследования деформируемости и плотности эритроцитов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, т. 138, № 9, стр. 316319.

35. Ahn Y.S. Efficacy of danazol in hemologic disorders. // Acta haematol, 1990, 84(3): 122-9.

36. Anderson D.R., Kelton J. Mechanisms of intravascular and extravascular cell destruction. // In: Nance SJ ed. Immune destruction of red blood cells. Arlington V.A.; American association of blood banks, 1989.

37. Anderson D.R., Kelton J.G. Hemolysis, thrombocytopeniaand the spleen. London: Ehapmon and hall medical, 1990, p. 287-318.

38. Anderson. C.L., Looney R.J. Human leucocyte IgG Fc receptors. // Immunol today, 1986, 7: 264.

39. Andrea L. Rose, Smith B.E., Meloney D.G. Glucocorticoids and rituximab in vitro: synergistic direct antoproliferative and apoptotic effects. // Blood 1, Sept 2002, Vol. 100, № 5, p. 1765-73.

40. Bardill В., Mengis C., Tschopp M. Severe IgA mediated auto-immune haemolytic anaemia in a 48 yr old woman. // Eur j haematol, 2003 Jan, 70 (1): 60-3.

41. Berentsen S., Ulvestad E., Gjertsen B. Ritiximab for chronic cold agglutinin disease: a prospective study of 37 courses of therapy 27 patient. // Blood, 2004 Apr 15, 103(8): 2925-8.

42. Blinder M.A., Hemolytic anemia. N.Y., 1995, p. 405-414.

43. Bowen M., Olsen A. The relationship of erytrocyte creatine levels to anemia. //Clin Res, 1980, 28: 823A.

44. Boye J., Elter Т., Engert A. An overview of the current clinical use of the anti CD20 monoclonal antibody rituximab. // Annals of Oncolog, 14: 520535, 2003.

45. Cancham P.B., Burton A.C. Distribution of size in population normal human red cells. // Circulation research, 1968, 22, 405-22.

46. Carnow F., Viallard J.F., Pellegrin J.L. Rituximab in cold agglutinin disease. // Rev Med Interne, 2003, Aug, 24(8): 501-4.

47. Cerny Т., Borisch В., Introna M., Johnson P. Mechanism of action of rituximab. // Anticancer drugs, 2002, Nov 13, Suppl 2: 3-10.

48. Chakrabarti S. The place of rituximab in the treatment algorithm for post-stem cell transplantant autoimmune hemolytic anemia. // Hematologica, 2002, 87: 105.

49. Chobak L., Dulicek P., Zak P. Treatment of PNH. // Vnetr Lek, 2001 Dec, 47(12): 880-6.

50. Chrobak L. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (membrane defect, pathogenesis, aplastic anemia, diagnosis). // Acta Medica, 2000, 43(l):3-8.

51. Cines D.B., Blanchette V.S., Chir B. Immune thrombocytopenic purpura. // N Engl J Med, Vol 346, № 13, March 28, 2002, 995-1007.

52. Coombs R.R., Mourant A.E., Race R.R. A new test for the detection of weak and incomplete Rh agglutination. // Brit J Exp Pathol, 1045, Vol 26, p. 255.

53. Costa Maria Virginia, Martinez Lem, Pomoli SantiagoTreatment with Rituximab in acute severe idiopathic AIHA. // Blood, 2003, Nov 16, Vol 102,№ ll.

54. Cui W., Zhang Z. Expression of CD55 and CD 59 on lymphocytes in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients. // Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 2002 Feb, 23(2): 77-79.

55. Da Costa L., Mohandes N., Sorrette M. Temporal differences in membrane loss lead to distinct reticulocyte features in hereditary sherocytosis and immune hemolytic anemia. // Blood, 2001, 98, 2894-2899.

56. Dacie J.V. The hematolytic anemias. Congenital and acquered. // J and A Churchill v. 1-2 1962-66.

57. Dameshell W., Schwarz S.O. Hemolysins as a cause of clinical and experimental hemolytic anemias. // Am J Med Sci, 1938, Vol 196, p. 129.

58. Dausset J. Immuno-hematologic clinique et biologique. Paris, 1954.

59. I.Edward J. Lee. Rituxan in the treatment of cold agglutinin disease. // Blood, Vol 92, № 9, (Novl) 1998, p. 3490-91.

60. Engelhardt M., Jakob A., Ruter B. Severe cold hemagglutinin disease (CHD) successfully treated with rituximab. // Blood I, Sept 2002, Vol 100, №5, p. 1922-1923.

61. Erdozain J.G., G. Ruiz Irastorza, Egurbide M.V. Sustained response to rituximab of autoimmune hemolytic anemia associated with antiphospholipid syndrome. // Haematologica, 2004, 89 (9): ECR 34.

62. Fehr J., Knob M. Comparison'of red cell creatine level and reticulocyte count in appraising the severity of hemolytic process. // Blood, 1979, 53: 966-976.

63. Ferrant A., Leners N., Michaux J.L. The spleen and haemolysis evaluation of the intrasplenic transiet time. // Br J Hematol, 1987, 65, 31-34.

64. Ferreira J.A., Feliu E. Morphological and morphometric light and electron microscopic studies of the spleen in patients with hereditary spherocytosesand AIHA. // Brit J Hematol, 1989, 72, 246-253.

65. Flores G., Cunningham-Rundles C., Newland A.C., Bussel J.B. Efficacy of intravenous immunoglobulin in the treatment of AIHA. // Am J Hematol, 1993 Dec, 44(4); 237-42.

66. Galor A., O'Brien T. Rituximab treatment for relapsed autoimmune hemolytic anemia in Evans syndrom. // Int J Hematol, 2003, Nov, 78(4): 335-6.

67. Garratty G. Target antigens for red cell bound autoantibodies. // In: Nance: S.J. Ed Clinical and basic science aspects of immunohematology. Arlington: American Association of Blood Banks, 1991.

68. Genty I., Michel M., Hermine O. Characteristics of autoimmune hemolytic anemia in adults: retrospective analysis of 83 cases. // Rev Med Interne, 2002, Nov, 23 (11): 901-9.

69. Gibson G. Autoimmune hemolytic anemia current concepts. // Austr, NZJ Med, 1988, 18: 625-635.

70. Gordon G., Silberstein L., Moreau L. Trisomy3 in cold agglutinin disease. // Cancer Genet cytogenet, 1990, 46: 89-92.

71. Griffiths W., Fitzpztrick M. The effect of age on the creatine in red cells. // Brit J Hematol, 1967, 13: 175-180.

72. Gupta N., Kavuru D., Patel D. Rituximab-based chemotherapy for steroid-refractory autoimmune hemolytic anemia. // Leukemia, 2002, 16. 2092-95.

73. Halperin J.A., Brugnara C., Nicholson-Weller A. Ca2+ activated K+ efflux limits complement — mediated lysis of human erythrocytes. // J Clin Invest, 1989, 83; 1466-1471.

74. Halperin J.A., Brugnara C., Nicholson-Weller A. Ca 2+ activated K+ efflux limits complement mediated lysis of hum. erythrocytes.// J Clin Invest, 1989, Vol 83, p. 1466-71.

75. Hofer S., Hunziker S., Dimhofer S. Rituximab effective in a patient with refractory autoimmune haemolytic anaemia and CD20 negative multiple myeloma. // British J Hematol, 2003, Aug, Vol 122, iss4; p. 690.

76. Jiao Y., Okumiya Т., Saibara T. Erythrocyte creatine as marker of excessive erythrocyte destruction due hypersplenism in patient with liver cirrhosos. // Clin Biochem, 2001, Vol 34, № 5, p. 395-398.

77. John Meletis, Evangelos Terpos. Recent insight into pathophisiology of PNH. // Med Sci Monit, 2003, 9(7) 161-172.

78. Lalezari P., Jiang A.F. The manual polybrene test: a simple and rapid procedure for detection of red cell antibodyes. //Transfusion, 1980, Vol 20, 206-211.

79. Li Z., Chao Z., Xu Y., Shen L. Subclasses of warm autoantibody IgG in patient with AIHA and their clinical implication. // Chin Med J ( Engl), 1999, Sept; 112(9) 805-8.

80. Liu H., Shao Z.H., Cui Z.Z., Wu I.H. An analysis of relapse and risk factors of AIHA and Evans syndrom. // Zhongua Xue Ye Xue Za Zhi, 2003, Oct 24 (10): 534-7.

81. Liu H., Shao Z.H., Cui Z.Z., Wu I.H. The effectiveness of cyclosporin A in the treatment of AIHA and Evans syndrome. // Zhongua Xue Ye Xue Za Zhi, 2001, Nov; 22 (11): 581-3.

82. Logue L., Rosse W., Immunologic mechanisms in autoimmune hemolytic disease. // Semirs in hematology, 1976, Vol 13, № 4, 277-89.

83. Marchetti M.C., Marco B.D., Cifone G. Dexamethason-induced apoptosis of thymocytes: role of glucocorticoid receptor -associated Src kinase and caspase 8 activation. // Blood 15, 2003, Jan, Vol 101, N2, p 585-593.

84. Melaughlin P. Rituximab: perpective on single agent experience and future direction in combination trials. // Crit Rev Oncol Hematol, 2001; 40: 3-16.

85. Meletis J., Terpos E. Recent insight into the pathophisiology of PNH. // Med Sci Monit, 2003, 9 (7): 161-72.

86. Meyer O., Stahl D, Beckhove P. Pulsed high dose dexamethasone in chronic autoimmune hemolytic anemia of warm type. // Br J Haematol, 1997, Sept, 98 (4): 860-2.

87. Michael В. Jordan, N. von Rooijen, Izui S. Liposomal clodronat as a novel agent for treating AIHA in a mouse model. // Blood, 15 Jan 2003, Vol 101, № 2 p, 594-601.

88. Mohandas N., Chasis J.A., Shohet S.B. The influence of memrane skeleton on red cell deformability, membrane material properties and shape. // Semin Hematol, 1983, 20, 225-242.

89. Morsell M., Luppi M., Potenza L. Mixed warm and cold AIHA: complete recovery after 2 courses therapy Rituximab. // Blood, 2002 May, Vol 99, № 9 p. 3478-79.

90. Motto D.G., Williams J.A., Boxer L.A. Rituximab for refractory childhood AIHA. // Isr Med Assoc J, 2002, Nov, 4(11): 1006-8.

91. Moyo V.M., Smith D.,Brodsky I. High dose cyclophosphamide for refractory AIHA. // Blood, 15 Jul 2002, Vol 100, № 2 , p. 704-706.

92. Nakakuma H., Kawaguchi T. Pathogenesis of selective expansion of PNH clones. // Int J Hematol, 2003, Feb, 77(2): 121-4.

93. Ny P.C., Lee K.K., Li C.K., Fox T.F. Anti В cell target immunotherapy for treatment of Refractory autoimmune haemolytic anaemia in a young infant. // ADC, 2003, 337-339.

94. Ocubo S., Ishida Т., Xasunaga K. IgG subclass of warm red cell autoantibodies in autoimmune hemolytic anemia. Rinsho-Ketsueki, 1990, Set 31 (19); 1581-2.

95. Okumiya Т., Kageoka Т., Hashimoto E. Clinical usefulness of measurement of creatine contents in human erythrocytes as an index of erythropoiesis. // Rinsho Byori, 1992, Feb, 40(2): 165-71.

96. Perrota S., Locatelli F., Manna L.A. Anti-CD20 monoclonal antibody (Rituximab) for life threatening autoimmune haemolytic anemia in a patient with systemic lupus erythematosus. // Brit J Haematol, 2002 Feb; 116 (2): 465-7.

97. Petz L.D. Treatment of autoimmune hemolytic anemias. // Curr Opin Hematol, 2001, Nov; 8 (6): 411-6.

98. Pignon J.M., Poirson E., Rochant H. Danazol in autoimmune hemolytic anemia. // Br J Hematol, 1993, 83; 343-345.

99. Pirofsky B. Autoimmunization and autoimmune hemolytic anemias. Baltimore, 1969.

100. Pirofsky B. Hereditary aspects of autoimmune hemolytic anemia: a retrospective analysis. // Vox sang, 1968, 14: 334-347.

101. Raff M.E., Carner K., Chambers K. Depletion of В cells in vitro by chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. // Blood, 1994, Vol 83, №2, p. 435-445.

102. Ramanathan S., Koutts. J., Hertzberg M.S. Two cases of refractory warm autoimmune hemolytic anemia treated with rituximab. // Am J Hematol, 2005, Feb, 78(2): 123-6.

103. Rastetter W., Molina A., White C.A. Rituximab : expanding role in therapy for lymphom and autoimmune disease. // Annu Rev Med, 2004, 55: 477-503.

104. Ravetch J., Kinet J-P. Fc receptors. // Annu Rev Immunol; 1991; 9: 457-492.

105. Reinhart W.H., Chien S. Roles of cell geometry and cellular viscosity in red cell passage through narrow pores.// Am J Phisiol, 1985.Vol 248, p. 473-79.

106. Richards S.J., Morgan G.J., Hillmen P. Immunophenotypic analysis of В cells in PNH: insights into the generation of circulation naive and memory В cells. // Blood, 2000, Nov 15: 96 (10): 3522-8.

107. Rivera A., Jarolim P., Brugnara C. Modulation of Gardos channel activity by cytokines in side erythrocytes.// Blood, 2002, Vol 99, p. 357363.

108. Robak T. Monoclonal antibodies in the treatment of autoimmune cytopenias. // Eur J Hematol, 2004, Feb; 72 (2): 79-88.

109. Rochant H. Autoimmune hemolytic anemia. // Rev Prat, 2001, Sept 15; 51 (14): 1534-41.

110. Roelcke D. Cold agglutination. // Trans med Rev, 1989; 33: 140-166.

111. Rosse W.F., Nishimura J. Clinical manifestations of PNH: present state and future problems. // Int J Hematol, 2003, Feb; 77(2): 113-20.

112. Rotoli В., Bessler M., Alfinito F. Membrans proteins in PNH. // Blood Reviews, 1993, № 7, 75-86.

113. Schrier S.L. Redcell membrane biology. // Clin Haematol, 1985, 14, 1-12.

114. Shanafelt T.D., Madueme H. L., Wolf R.C. Rituximab for immune cytopenia in adults: 1TP, AIHA and Evans syndrom. // Mayo Clin Proc, 2003, Nov, 78 (11): 1340-6.

115. Shichishima Т., Noji H. A new aspect of molecular pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. // Hematology, 2002, Aug; 7(4): 21127.

116. Smith В., Butzner D., Wills M. Erytrocyte creatine in cord blood. // Clin Lab Sci, 1982, 13: 439-448.

117. Smith В., Daniel P., Mohlr N. Erytrocyte creatine levels in anemia Ann. // Clin Lab Sci, 1982, 13, 439-448.

118. Smith L.A. Autoimmune hemolytic anemias: characteristics and classification. // Clin Lab Sci, 1999, Mar-Apr, 12 (2): 110-4.

119. Smith L.J. Paroxysmal noctural hemoglobinuria. // Clin Lab Sci, 2004, 17(3): 172-7.

120. Sokol K.J., Booker D.J., Stamps K. Investigation of patient with AIHA and provision of blood for transfusion. // J Clin Pathol, 1995, 48: 60210.

121. Sokol K.J., Mewiff S., Booker D.J. Erythrocyte autoantibodies, subclass of IgG and autoimmune haemolysis. // Autoimmunity, 1990, 6 (12): 99-104.

122. Sokol K.J., Booker D.J., Stamps R. Cold haemagglutinin disease: clinical significans of serum haemolysins. // Clin Lab Haematol, 2000, Dec; 22(6): 337-44.

123. Stasi R., Brinetti M., Pagano A. Pulsed intravenous high-dose dexamethasone in adults with chronic idiopathic trombocytopenic purpura. // Blood Cells Mol Dis. 2000, Dec, 26(6): 582-6.

124. Szodoray P., Alex P., Dandapani V., Nakken B. Apoptotic effect of rituximab on peripheral blood В cells in rheumatoid arthritis. // Scand J Immunol, 2004, Jul-Aug 60 (1-2), 209-218.

125. Trape G., Fianchi L., Lei M., Laurenti L., Piscitelli R. Rituximab chimeric anti CD 20 monoclonal antibody treatment for refractory hemolytic anemia in patients with limphoproliferative disorders. // Haematologica, 2003, Feb, 222.

126. Treon S., Anderson K. The use of rituximab in the treatment of malignant and non malignant plasma cell disorders. // Semin Oncol, 2000, 27; 79-85.

127. Tyndall A. Hematopoietic Stem Cell Transplantation in the treatment of severe autoimmune disease. // Autoimmune disease, chapter 4.

128. Von Baeyer H. Plasmapheresis in immune hematology: review of clinical outcome data with respect to evidence-based medicine and clinical experience. // Ther Apher Dial, 2003, Feb, 7(1): 127-40.

129. Wakim M., Shah A., Armat P.A. Successful anti CD20 monoclonal antibody treatment of severe autoimmune hemolytic anemia due to warm reactive IgM auto antibody in a child with common variable immunodeficiency. // Amer J Hematol, 2004 Jun, 76(2): 152-5.

130. Wang Y., Wu Y., Zhang Z. Study of lymphocyte subset and its activated molecules in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. // Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 2002, Nov; 23(11): 571-3.

131. Webster D., Richie В., Mant M. Prompt response to rituximab of severe hemolytic anemia with both cold and warm autoantibodies. // Amer J Hematol, 2004, Apr, 75 (4): 258-9.

132. Williams W.J., Hematology, N.Y., 1990, 29-32.

133. Zecca M., Nobili В., Ramenghi U. Rituximab for treatment of refractory AIHA in children. // Blood, 2003, Jan 16.

134. Zecca M., P. De Stefano, Nobili B. Anti CD20 monoclonal antibody for the treatment of severe immune-mediated, pure red cell aplasia and hemolytic anemia. // Blood, 2001, Jun 15, Vol 97, № 12, 3995.