Комплексы физиологически активных веществ с ионами меди активных центров церулоплазмина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, кандидат химических наук Волков, Александр Александрович

• Волков, Александр Александрович
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Волков, Александр Александрович

Введение.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.И

1.1. Свойства церулоплазмина.

1.1.1. Фармакологические свойства церулоплазмина.

1.1.2. Структура молекулы церулоплазмина и его основные биохимические свойства.

1.1.3. Физиологическая роль церулоплазмина в организме.

1.1.4. Регуляция обмена меди в организме.

1.1.5. Антиоксидантные свойства церулоплазмина.

1.2. Способы выделения церулоплазмина.

1.3. Термодинамические и кинетические особенности взаимодействия белковых макромолекул с лигандами.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Получение и свойства церулоплазмина.

2.1.1. Количественное определение белка в препарате Церулоплазмин.

2.1.2. Определение степени очистки.

2.1.3. Электрофорез на плёнках из ацетата целлюлозы.

2.1.4. Иммуноэлектрофорез по методу Grabar

Grabar,Williams, 1953)[97].

2.1.5. Гель-проникающая хроматография низкого давления.

2.1.6. Определение ферментативной активности.

2.1.7. Количественное определение содержания ЦП.

2.2. Физиологически активные вещества.

2.2.1. Доксорубицин.

2.2.2. Дигидрокверцетин.

2.2.3. Лецитин.

2.3. Очистка растворителей.

2.4. Спектрофотометрические измерения.

2.5. Исследования методом ЭПР.

2.6. Измерения рН растворов.

2.7. Измерение поверхностного натяжения.

2.8. Исследования на модельных системах.

2.8.1. Модифицированная поверхность полипиромеллитимида.

2.8.2. Изучение адсорбции.

2.8.3. Модельные системы на основе монослоев Ленгмюра.

2.8.4. Получение дисперсии везикул.

2.9. Измерение краевого угла смачивания.

2.10. Атомно-силовая микроскопия.

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Комплексообразование ДР с ионами меди каталитического центра ЦП.

3.1.1. Характеристика реакционной смеси ДР и

ЦП в воде.

3.1.2. Изучение свойств комплексов Си2+-ДР на моделях биомембран.

3.2. Ассоциация полифенольного флавоноида - ДКВ с ЦП.

3.2.1. Обоснование выбора дигидрокверцетина как протекторного лиганда.

3.2.2. Исследование комплексообразования ДКВ с ионами меди (II) каталитического центра ЦП.Л

3.2.3. Кинетические особенности взаимодействия

ДКВ и Си2+610'ЦП.

3.2.4. Комплексное воздействие физиологичеки активных веществ на ЦП.

3.3. Защита активных центров ЦП при химиотерапии

ДР комплексами лецитин-ВМС.

3.3.1. Исследование свойств тонких пленок смеси лецитина и ВМС.

3.3.2. Адсорбция ДР на поверхности тонкой пленки сополимера Ст-ИВПД.

3.3.3. Адсорбция ДР на поверхности модифицированных полиамидокислот.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексы физиологически активных веществ с ионами меди активных центров церулоплазмина»

Актуальность темы

Медьсодержащие ферменты участвуют в различных биологических процессах и необходимы для роста организма, нормального функционирования иммунной системы, метаболизма углеводов и липидов. Одним из важных ферментов плазмы крови человека является медьсодержащий белок - церулоплазмин, относящийся к классу «голубых» оксидаз. Церулоплазмин регулирует обмен меди в организме, обеспечивает эффективный транспорт меди к тканям и выведения её из организма. Кроме того, он проявляет антиоксидантные свойства и является своего рода «функциональным депо» для безопасного хранения меди. В случае острых и хронических заболеваний отмечается высвобождение больших количеств меди, тогда как потребность организма в медьсодержащих факторах возрастает.

Недостаток ионов меди в организме может быть вызван нежелательным хелатированием ионов меди физиологически активными веществами, используемыми в терапии. Особенно этот эффект проявляется при использовании токсических противоопухолевых препаратов. В связи с этим, возникает проблема защиты медьсодержащих каталитических центров церулоплазмина и сохранения его антиоксидантных свойств.

Одним из путей защиты медьсодержащих активных центров фермента является ассоциация ионов меди с физиологически активными веществами, не проявляющими токсического действия. Требования к выбору защитных физиологически активных веществ определяются:

• термодинамикой конкурентного комплексообразования токсического противоопухолевого лекарственного вещества и выбранного защитного вещества (константы ассоциации или устойчивости комплексов),

• кинетическими особенностями ассоциации нетоксичного физиологически активного вещества с ионами меди активного центра церулоплазмина,

• взаимодействием физиологически активных веществ и их медьсодержащих комплексов с липофильными и гидрофильными фрагментами биомембран.

К ' лекарственным веществам, способным защищать медьсодержащие каталитические центры ферментов, относятся полифенольные флавоноиды.

Защитное действие флавоноидов связывают с их высокими антиоксидантными свойствами и способностью полифенолов образовывать хелатные комплексы с ионами металлов. Из полифенольных флавоноидов в медицинской практике наиболее широко применяется природный антиоксидант - дигидрокверцетин, не проявляющий токсического действия в терапевтических дозах.

В связи с вышеизложенным, образование комплексов физиологически активных веществ с ионами меди, способных защищать или ингибировать активные центры ЦП, является актуальной проблемой.

Целью настоящей работы является исследование защитного действия полифенольным флавоноидом - дигидрокверцетином (ДКВ), активных центров церулоплазмина (ЦП) при противоопухолевой терапии доксорубицином (ДР), а также выявление путей снижения токсического действия ДР.

В задачи исследования входило:

• исследование термодинамики комплексообразования и ассоциации ДР и ДКВ'с ионами меди каталитического центра ЦП в водном растворе, а также кинетических особенностей взаимодействия ДКВ с ЦП;

• оценка специфической активности ЦП в присутствии ДР и ДКВ;

• разработка методики анализа комплексов ДР и ДКВ с ионами меди каталитического центра ЦП;

• изучение характера межмолекулярного взаимодействия ДР и Си2+ -ионов водных растворов солей и ЦП на моделях липидных и гидрофильных фрагментов биомембран;

• разработка полимерсодержащей липосомальной формы препаратов ДР, ослабляющей унос ионов меди ЦП.

Научная новизна

Впервые доказано образование комплексных соединений ДР и ДКВ с ионами меди каталитического центра ЦП. Предложен методологический подход с привлечением теории Скечарда и использованием безразмерной величины Я - ответа системы, позволяющий в первом приближении количественно оценить термодинамическую константу ассоциации ДКВ Ка с ионами меди активного центра ЦП.

Разработана методика анализа комплексов ДР с ионами меди, рассчитана термодинамическая константа устойчивости Кр комплексов ДР с ионами меди каталитического центра при стехиометрии 1:1. Показано, что величина Кр значительно превышает (в«1000раз) величину Ка.

Впервые на основе изучения межфазного и поверхностного натяжения реакционных смесей ЦП и физиологически активных веществ оценено гидрофильно-липофильное соотношение ЦП до и после его взаимодействия с ДР и ДКВ, а также дан анализ характера межмолекулярного взаимодействия ДР и Си на простейших моделях биомембран.

Показано, что при комплексном взаимодействии ДР, ДКВ и ЦП в реакционной смеси концентрация наиболее токсических комплексов ДР с ионами меди минимальна. Клиническими испытаниями установлено, что сочетанная химиотерпия ДР, ЦП, ДКВ обуславливает снижение токсических явлений и улучшение показателей по гемоглобину, количеству эритроцитов и специфической активности ЦП.

Предложена липосомальная форма препаратов, снижающая токсическое действие ДР.

Практическая значимость.

Показана возможность использования ДКВ в качестве протектора Си2+ каталитического центра ЦП при терапии онкологических заболеваний ДР. Разработанные методики изучения комплексного действия лекарственных веществ позволяют прогнозировать свойства препаратов, в том числе фармацевтическую несовместимость, иммобилизацию комплексов лекарственных веществ с ионами Си2+ в липофильный и гидрофильный фрагменты мембраны. Разработана липосомальная форма доксорубицина, стабилизированная статистическими сополимерами стирола.

Результаты работы используются в испытаниях препарата церулоплазмина по фармацевтической несовместимости с доксорубицином. Экспериментальные результаты по комплексообразованию ДР и ДКВ с ионами меди использованы в учебном процессе НГМА в дисциплине фармацевтическая химия.

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены на II Международном симпозиуме «Molecular design and synthesis of supramolecular architectures» (Казань, 2002г), на VII сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2002г), VI Всероссийской конференции молодых ученых (Саратов, 2003 г), V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа «Химия и медицина» (Уфа, 2005г), International conference «From molecules towards materials» (H. Новгород, 2005r).

По результатам исследований опубликовано 4 статьи и 6 тезисов научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава работы содержит обзор литературы по свойствам медьсодержащего фермента ЦП и методам изучения свойств коллоидных ферментных систем. Вторая глава работы посвящена методу получения ЦП, его фармацевтическому анализу, анализу специфической активности церулоплазмина, экспериментальным методикам изучения свойств церулоплазмина, доксорубицина и его комплексов с ионами меди (II),

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Волков, Александр Александрович

Выводы

1. Доказана способность ионов меди (II) каталитического центра церулоплазмина образовывать устойчивые комплексы с доксорубицином и дигидрокверцетином.

2. Разработана спектрофотоколориметрическая методика количественного определения доксорубицина, вовлеченного в комплекс с ионами меди фермента, используя уравнение калибровочной прямой D58o = а + ЬС-103, где а = 0,021+0,001; b = 5,752±0,002. Методом изомолярных серий установлен состав образующихся комплексов доксорубицина (1:1) и рассчитаны константа устойчивости Кр= (4,5±0,1)-106 и е580 = (5,29±0,05)-103 л/моль-см.

3. Взаимодействие доксорубицина и его Си комплексов с монослоями арахиновой кислоты и лецитина - моделей гидрофильного и липофильного фрагментов биомембраны - существенно изменяет свойства монослоев: молекулярная площадь So арахиновой кислоты в монослое увеличивается на 7-10%, S0 лецитина на 40-60%. Высказано предположение, что иммобилизация в монослои комплексных соединений сопровождается меньшим разрыхлением мембраны, чем при иммобилизации доксорубицина.

4. На основе анализа изотерм поверхностного натяжения растворов церулоплазмина, дигидрокверцетина и их смесей показано снижение поверхностной активности церулоплазмина и, соответственно, изменение гидрофильно-липофильного соотношения в его макромолекуле.

5. Предложен методологический подход к оценке взаимодействия церулоплазмина с дигидрокверцетином, в соответствии с теорией Скечарда. Количественной мерой активности церулоплазмина является безразмерная величина R (ответ системы), определяемая как относительное изменение оптической плотности полосы с А,тах = 610 нм, характерной для «голубых» оксидазных ионов меди (II).

Рассчитанная константа ассоциации дигидрокверцерина с «голубыми» ионами меди церулоплазмина, равна Ка=(5,4±0,2)-103.

6. Кинетические кривые насыщения «голубых» оксидазных ионов меди в каталитическом центре церулоплазмина Лею = Дт) удовлетворительно описываются уравнение вида Яш=а + Ь^т. Установлено, что при повышении температуры на 10 градусов, Та> уменьшается в 30 раз.

7. Выявлено ингибирование комплексообразования доксорубицина с ионами меди каталитического центра в присутствии дигидрокверцетина, что является основой комплексной химиотерапии онкологических заболеваний дигидрокверцетином, церулоплазмином и доксорубицином.

8. Предложено использовать комплексы на основе сополимеров стирола с К-винилпироллидоном, 4-винилпиридином и лецитином как компонентов лекарственных форм препарата доксорубицина, защищающих активные центры церулоплазмина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Волков, Александр Александрович, 2006 год

1. Holmberg C.G., Laurell C.B. Investigation in serum copper. Isolation of the copper-containing protein and a description of some of its properties. // Acta Chem. Scand. 1948. - v.2. - p.550-556.

2. Osaki S., Jonson D.A., Frieden E. The possible significance of the ferrous oxidase activity in normal human serum.// J.Biol.Chem.- 1966.-v.241. p.2746- 2757.

3. Takahashi N., Ortel T.L., Putnam F.W. Single-chain structure of human ce- ruloplasmin: the complete amino acid sequence of the whole molecule. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - v.81. -p.390-394.

4. Koschinsky M.L., Funk W.D., VanOost B.A. MacGillivray R.T. Complete cDNA sequence of human preceruloplasmin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986.-v.83.-p.5086-5090.

5. Yang F., Naylor S.L., Lum J.B., Cutshaw S., McCombs J.L., et al. Characterization, mapping and expression of the human ceruloplasmin gene.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - v.83. -p.3257-3261.

6. Lee G.R., Nacht S., Lukens J.N., Cartwright G.E. Iron metabolism in copper-deficient swine. // J. Clin. Invest. 1968. - v.47 . - p .2058 -2069.

7. Arimori S. Treatment on aplastic anemia, with special reference to ceruloplasmin // Jap.J. Clin. Exper. Med. 1966.- v.43.- p. 1897.

8. Katsunuma H., et all. Clinical experience with ceruloplasmin on aplastic anemia // Jap. J. Clin. Med.- 1961.- v. 19.- p.424.

9. Shimizu M. Clinical results on the use of human ceruloplasmin in aplastic anemia // Transfusion.- 1979.- v. 19.- p.742-748.

10. Morita H., Ikeda S., Yamamoto K, Morita S., Yoshida K., et al. Hereditary ceruloplasmin deficiency with hemosiderosis: a clinicopathological study of a Japanese family // Ann. Neurol.- 1995.-v.37.- p.646-56.

11. Harris Z.L., Takahashi Y., Miyajima H., Serizawa M., MacGillivray R.T. Aceruloplasminemia: molecular characterization of this disorder of iron metabolism // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.- v.92.- p.2539-43.

12. Segelmark M., Persson B., Hellmark T., Wieslander J. Binding and inhibition of myeloperoxidase (MPO): a major function of ceruloplasmin?// Clin. Exp. Immunol- 1997. v.l08.-p.l67-174.

13. Bianchini A., Musci G., Calabrese L. Inhibition of endothelial nitric-oxide synthase by ceruloplasmin// J. Biol. Chem. 1999. - v. 274. -p.20265-20270.

14. Mateescu M.A., Chahine R., Roger S., Atanasiu R., Yamaguchi N., Lalumiere G., Nadeau R. Protection of myocardial tissue against deleterious effects of oxygen free radicals by ceruloplasmin. // Arzneimittelforschung. 1995. - v.45. - lp.476-480.

15. Dumoulin M.J., Chahine R., Atanasiu R., Nadeau R., Mateescu M.A. Comparative antioxidant and cardioprotective effects of ceruloplasmin, superoxide dismutase and albumin.// Arzneimittelforschung. 1996. - v.46. -p.855-861.

16. De Silva D., Davis-Kaplan S., Fergestad J. and Kaplan J. Purification and characterization of Fet3 protein, a yeast homologue of ceruloplasmin// J. Biol. Chem.- 1997.- v.272.- p.14208-14213.

17. Malmstrom B.G. Early and more recent history in the research of multi- copper oxidases. In: Multi-Copper Oxidases (Ed. Messerschmidt A.), pp. 1-22. World Scientific, Singapore, 1997.

18. Malkin R., Malmstrom B.G. The state and function of copper in biological systems// Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.- 1970.- v.33. -p. 177-244.

19. Olsson M.H., Ryde U. The influence of axial ligands on the reduction potential of blue copper proteins// J. Biol. Inorg. Chem.- 1999. v.4.-p.654-663.

20. Qian Z.M., Tsoi Y.K. Ceruloplasmin promotes iron uptake rather than release in cultured brain astrocytes.// Exp. Brain Res. 2001.- v. 140.-№3.-p.369-74.

21. Calabrese L., Mateescu M.A., Carbonaro M., Mondovi B.

22. Reexamination of spectroscopic properties of ceruloplasmin freshly isolated with a novel very rapid single-step procedure // Biochem. Int. -1988. v.16(2). - p. 199-208.

23. Holm R.H., Kennepohl P., Solomon E.I. Structural and functional aspect of metal sites in biology // Chem. Rev. 1996. - v.6.- p.2239-2314.

24. Calabrese L., Musci G. Molecular properties of ceruloplasmin from different species. In: Multi-Copper Oxidases (Ed. Messerschmidt A), pp. 307-354. World Scientific, Singapore, 1997.

25. Zaitseva I., Zaitsev V., Card G., Moshkov K., Bax B., Ralph A., Lindley P. The X-ray structure of human serum ceruloplasmin at 3.1 A: Nature of the copper centers // J. Biol. Inorg.Chem. 1996.- v.l.- p. 15-23.

26. Musci G.; Bonaccorsi di Patti M.C.; Fagiolo U.; Calabrese L. Age-related changes in human ceruloplasmin. Evidence for oxidative modifications.//J. Biol. Chem.- 1993.- v.268. -p.3388-13395.

27. Machonkin T.E., Zhang H.H., Hedman B., Hodgson K.O., Solomon E.I. Spectroscopic and magnetic studies of human ceruloplasmin: Identification of a redox-inactive reduced Type 1 copper site // Biochemistry. 1998. - v.37. - p.9570-9578.

28. Musci G., Bellenchi G.C., Calabrese L. The multifunctional oxidase activity of ceruloplasmin as revealed by anion binding studies.// Eur. J. Biochem. 1999. - v.265.-p.589-597.

29. Matsuda I., Pearson T., Holtzman N.A. Determination of apoceruloplasmin by radioimmunoassay in nutritional copper deficiency, Menkes' kinky hair syndrome, Wilson's disease, and umbilical cord blood. // Pediatr. Res. 1974. - v.8. - p.821-824.

30. Laurell C.B., Kullander S., Thorell J. Effect of administration of a combined estrogen-progestin contraceptive on the level of individual plasma proteins. // Scand.J. Clin. Lab. Invest. 1968. - v.21. -p.337-343.

31. Ryden L. Evideiice for proteolytic fragments in commercial samplesof human ceruloplasmin.//FEBS Lett- 1971.- v. 18. -p.321-325.

32. Васильев В.Б., Качурин A.M., Рокко Р.П., Бельтрамини М. и др. Спектральные исследования активного центра церулоплазмина при удалении и восстановлении в него ионов меди // Биохимия.- 1996.-Т.61.- №2.- с.296-307.

33. De Filippis V.,' Vassiliev V.B., Beltramini M., Fontana A. et all. Evidence for the molten globule state of human apo-ceruloplasmin // Biochim. Biophys. Acta.- 1996.- v.1297.- №2.- p.l 19-123.

34. Moshkov K.A., Lakatos S., Hajdu J., Zavodsky P., Neifakh S.A. Proteolysis of human ceruloplasmin. Some peptide bonds are particularly susceptible to proteolytic attack.// Eur.J. Biochem.- 1979. -v.94(1). p. 127134.

35. Kingston I.В., Kingston B.L., Putman F.M. Primary structure of a his- tidine-rich proteolytic fragment of human ceruloplasmin. I. Amino acid sequence of the cyanogen bromide peptides// J.Biol.Chem.- 1980.-v.255.- p.2886-2896.

36. Manolis A., Cox D.W. Purification of rat ceruloplasmin. characterization and comparison with human ceruloplasmin // Prep.Biochem.- 1980. v.10.- p.121-132.

37. Calabrese L., Malatesta F., Barra D. Purification and properties of bovine caeruloplasmin// Biochem. J.- 1981.- v.199.- p.667-673.

38. Neel J.V. Rare variants, private polymorphisms, and locus heterozygosity in Amerindian populations.// Am. J. Hum. Genet. 1978. -v.30. - p.465-490.

39. Sato M.; Schilsky M.L.; Stockert R.J.; Morell A.G.; Sternlieb I. Detection of multiple forms of human ceruloplasmin // J.Biol.Chem.-1990.- V. 265. -№5.- p.2533-2537.

40. Mohrenweiser H.W., Decker R.S. Identification of several electrophoretic variants of human ceruloplasmin including CpMichigan, a new polymorphism.// Hum. Hered. 1982. - v.32.- p.369-373.

41. Endo M., Suzuki K., Schmid K., Fournet В., Karamanos Y. et al. The structures and microheterogeneity of the carbohydrate chains of human plasma ceruloplasmin. A study employing 500-MHz 1H-NMR spectroscopy.//J. Biol. Chem. 1982.-v. 257.-p.8755-8760.

42. Mackiewicz A., Ganapathi M.K., Schultz D., Kushner I. Monokines regulate glycosylation of acute-phase proteins. // J. Exp. Med. 1987. -v.166.-p.253-258.

43. Sato M., Gitlin J.D. Mechanisms of copper incorporation during the ^ biosynthesis of human ceruloplasmin. // J. Biol. Chem. 1991. - v.266.p.5128-5134.

44. Daimon M., Yamatani K., Igarashi M., Fukase N., Kawanami T., et al. Fine structure of the human ceruloplasmin gene.// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1995.-v.208.-p.l028-1035.

45. Gitlin J.D. Transcriptional regulation of ceruloplasmin gene expression during inflammation.//J. Biol. Chem.- 1988. v.263. -p.6281-6287.

46. Aldred A. R., Grimes A., Schreiber G., Mercer J.F. Rat ceruloplasmin. Molecular cloning and gene expression in liver, choroid plexus, yolk sac, placenta, and testis.// J. Biol. Chem.- 1987. v.262. -p.2875-2878.

47. Fleming R.E., Gitlin J.D. Primary structure of rat ceruloplasmin and analysis of tissue-specific gene expression during development.// J. Biol. Chem. 1990. -v.265.-p.7701 -7707.

48. Klomp L.W., Gitlin J.D. Expression of the ceruloplasmin gene in the ^ human retina and brain: implications for a pathogenic model in 9 aceruloplasmine- mia//Hum. Mol. Genet. 1996.-V.5. -№12.-p. 1989-1996.

49. Klomp L.W.J., Gitlin J.D. Expression of the ceruloplasmin gene in the human retina and brain: implications for a pathogenic model in aceruloplasminemia // Hum. Mol. Genet- 1996.- v.5.- p. 1989-96.

50. Patel B.N., David S. A novel glycosylphosphatidylinositol anchored form of ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes. //J. Biol. Chem. - 1997. - v.272.-p.20185-20190.

51. Fortna R.R., Watson H.A, Nyquist S.E. Glycosyl ^ phosphatidylinositol- anchored ceruloplasmin is expressed by rat Sertolicells and is concentrated in detergent-insoluble membrane fractions.// Biol. Reprod. 1990. - v.61. - p. 1042- 1049.

52. Gitlin D., Janeway C.A. Turnover of the copper and protein moieties of ceruloplasmin.// Nature. 1960. - v. 185. -p.693.

53. Sternlieb I., Morell A.G., Tucker W.D., Greene M.W., Scheinberg I.H. The incorporation of copper into ceruloplasmin in vivo: studies with copper64 and copper67,//J. Clin. Invest. 1961. -v.40. -p. 1834-1840.

54. Gitlin J.D., Schroeder J.J., Lee-Ambrose L.M., Cousins RJ. Mechanisms of ceruloplasmin biosynthesis in normal and copper deficient• rats.// Biochem. J. 1992.-v.282.-p.835-839.

55. Holtzman N. A., Gaumnitz B.M. Identification of an apoceruloplasmin-like substance in the plasma of copper-deficient rats. // J. Biol. Chem. 1970. - v.245. -p.2350-2353.

56. Osaki S., Johnson D.A. Mobilization of liver iron by ferroxidase (ceruloplasmin).// J. Biol. Chem. 1969. - v.244. - v.5757-5758.

57. Evans G.W. Ceruloplasmin and maternal iron mobilization.// J. Nutr. 197 l.-v.101.-p.567-568.

58. Frieden E. Ceruloplasmin: The serum copper transport protein with oxidase activity. In: Copper in the Environment, Part II (Ed. Nriagu JO),t pp. 241 -284. John Wiley, New York, 1979.

59. Inoue K., Akaike T., Miyamoto Y., Okamoto T., Sawa T., Otagiri M., Suzuki S., Yoshimura T., Maeda H. Nitrosothiol formation catalyzed by ceruloplasmin. Implication for cyto-protective mechanism in vivo.// J. Biol. Chem. 1999. - v.274.-p.27069-27075.

60. Arnaud P., Gianazza E., Miribel L. Ceruloplasmin.// Methods Enzymol. 1988.-v.163.-p.441-452.v.

61. Bingley J.B., Dick A.T. The pH optimum for ceruloplasmin oxidase• activity in the plasma of several species of animal.// Clin. Chim. Acta. 1969. v.25. -p.480-482.

62. Musci G., Bonaccorsi di Patti M.C., Calabrese L. Modulation of the redox state of the copper sites of human ceraloplasmin by chloride.// J. Protein. Chem.- 1995.-v.14.-p.611-619.

63. Stoj C, Kosman D.J. Cuprous oxidase activity of yeast Fet3p and human ceruloplasmin: implication for function. // FEBS Lett. 2003. -v.554. - p.422-426.

64. Cappelli-Bigazzi M., Ambrosio G., Musci G., Battaglia C, Bonaccorsi di Patti M.C., Golino P. Ragni M. Chiariello M., Calabrese L. Ceruloplasmin impairs endothelium-dependent relaxation of rabbit aorta.// Am. J. Physiol. 1997. - v.273.-p.H2843-H2849.

65. Furchgott R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine.// Nature. 1980. - v.288. - p.373-376.

66. Dormandy T.L. Ceruloplasmin: Acute-phase antioxidant.// Agents Actions Suppl. 1981.- v.8. -p.185-197.

67. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. The antioxidants of human extracellular fluids.//Arch. Biochem. Biophys. 1990. -v.280. - p. 1-8.

68. Miyajima H., Nishimura Y., Mizoguchi K., Sakanoto M., Shimizu T., et al. Familial apoceruloplasmin deficiency associated with blepharospasm and retinal degeneration//Neurology.- 1987.-v.37.-p.761-67.

69. Olivares M.; Uauy R. Copper as an essential nutrient // Am. J. Clin. Nutr.- 1996.- V.63.- №5.- p.791S-796S.

70. Wildman R.E.; Hopkins R.; Failla M.L.; Medeiros D.M. Marginal copper- restricted diets produce altered cardiac ultrastructure in the rat // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1995,- V.210. -№1.- p.43-49.

71. Foster M.A., Pocklington T., Dawson A.A. //Metal Ions in Biological Systems.- Basel.-1979. v.10.- p.129-166.

72. Turnlund J.R., Keyes W.R., Anderson H.L., Acord L.L. Copper absorption and retention in young men at three levels of dietary copper using the stable isotope, 65 Qm.II Am. J. Clin. Nutr. 1989. - v.49. -p.870-878.

73. Nakamura K., Endo F., Ueno T., Awata H., Tanoue A., Matsuda I.

74. Excess copper and ceruloplasmin biosynthesis in long-term cultured hepatocytes from Long-Evans cinnamon (LEC) rat, a model of Wilson disease. // J. Biol. Chem. 1995. - v.270. -.p.7656-7660.

75. Gitlin J.D., Schroeder I.J., Lee Ambrose L.M., Cousins RJ.// Mechanisms of ceruloplasmin biosynthesis in normal and copper-deficient rats.// Biochem. J. 1992. - v.282(3). - p.835-839.

76. Bull P.C., Thomas G.R., Rommens J.M., Forbes J.R., Cox D.W. The Wilson disease gene' is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene.//Nat. Genet. 1993. - v.5. -p.327-337.

77. Dunn M.A., Green M.H., Leach R.MJr. Kinetics of copper metabolism in rats: a compartmental model.// Am. J. Physiol. 1991. -v.261. - p.927-937.

78. Ярополов A.H. Механизмы антиоксидантного действия церулоплазмина // Доклады академии наук СССР.- 1986.- т.291.- №1.-с.237-241.

79. Gutteridge J.M. Antioxidant properties of caeruloplasmin towards iron- and copper-dependent oxygen radical formation // FEBS Lett.- 1983.-v.157. p.37-40.

80. Halliwell B, Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine,. 2nd edn. Oxford: Clarendon Press, 1989.

81. Richter C, Schweizer M. Oxidative stress in mitochondria. In: Scandalios JG, ed. Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1997. - p. 169-200.

82. Gutteridge J.M. Inhibition of the Fenton reaction by the protein caeruloplasmin and other copper complexes. Assessment of ferroxidase and radical scavenging activities.// Chem. Biol. Interact- 1985.- v.56. p. 113120.

83. Берлинских H.K., Исмайлова И.М., Юдин B.M. Иммуномодулирующая активность экзогенного церулоплазмина при экспериментальном опухолевом росте // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.-1992.-т.113.-№5.-с.520-522.

84. Steinbuch М., Quentin М. Preparation ceruloplasmin// Nature.-1961 .-v.190.-№4781 .-р.Н21.

85. Morell AG, Van den Hamer CJ, Scheinberg IH. Physical and chemical studies on ceruloplasmin. VI. Preparation of human ceruloplasmin crystals.//J. Biol. Chem. 1969. - v.244(13). - v.3494-3496.

86. Broman L.,Kjellin K. A rapid semi-cotinuous method for purification ofceruloplasmin from human serum // Bioch et bioph Acta.-1963.-v.82.-p.101-109.

87. Curzon G. The inhibition of caeruloplasmin by azide //Biochem J. -1966.-v.2.-p.295-302.

88. Deutsch H.F.The preparation of crystalline ceruloplasmin from human plasma.// Arch'. Biochem. Biophys. 1960. - v.89. - p.225-229.

89. Zgirski A, Witwicki J, Hilewicz-Grabska M, Witas H A simple and rapid procedure for isolation of ceruloplasmin from porcine and bovine blood serum.// Acta Biochim. Pol. 1978. - v.25(4). - p.361-368.

90. Oosthuizen M.M., Nel L., Myburgh J.A., Crookes R.L. Purification of undegraded ceruloplasmin from outdated human plasma.// Anal. Biochem. 1985. - v.l46(l).-p.l-6.

91. Исрафилов А.Г., Еникеева С.А., Лютов А.Г., Гайтанова Е.И., Хакимова Ф.З. Способ получения церулоплазмина.// Патент RU 2087150, опубл. 20.08.97.

92. Мецлер Д.Е. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. -М.: Изд. "Мир" 1980 г. -408 с.

93. Комов В.Н., Шведова В.Н. Биохимия: Учеб. для вузов. . М.: Изд. "Дрофа" - 2004 г. -640 с.

94. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия: Учеб. Для хим., биол. и мед. спец. вузов М.: Высшая школа - 2003 г. -479с.

95. Grabar P., Williams С.A. Methode permettant letude cojuguee desproprietes electrophoretiques dun melange de proteins.// Application au serum sanguine, Biochim.Biophys.Acta.- 1953,- v,10.-p,193-194.

96. Ravin H.A. An improved colorimetric enzymatic assay of ceruloplasmin.// J. Lab. Clin. Med. 1961. v.58. -p.161-168.

97. Mancini G., Carbonari A.O., Yeremaus J.// Immunochemistry. 1965.-v.2.-№3.-p.235-254.

98. Plenum, 1975. Vol. 4. P. 209.

99. Зайцев С.Ю., Зубов В.П. Полимерные монослои и липосомы на основелипидоподобных мономеров // Биологические мембраны. Т.5. -№3. -1988. С.252-257.

100. Чупин В.В., Аникин А.В., Серебренникова Г.А. Полимерные липидныемембраны: получение, свойства и использование // Биологическиемембраны,-1993 .-т. 10;№3 .-с.229-251.

101. Щ 104. Практикум по коллоидной химии: Учеб. пособие для хим.-техн. спец.

102. Вузов / Баранова В.И., Бибик Е.Е., Кожевникова Н.М. и др.; под ред. Лаврова И.С.-М.: Высш. шк., 1983.- 216 с.

103. Кемертелидзе Э.П., Георгиевский В.П. Физико-химические методы анализа некоторых биологически активных веществ растительного происхождения.-Тбилиси.: Мецниерева, 1976. -222 с.

104. Мельникова Н.Б., Кочнева Е.Г., Кузьмин А.В., Карташов В.Р. Свойства поверхности полипиромеллитимида, модифицированного для химической металлизации//ЖПХ. 1991. №7. С. 1512-1518.

105. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М.: Химия.-1976.-541с.ф 108. Юрьев Ю.К. Практические работы по органической химии, Выпуск

106. II.-M.: Изд-во Московского ун-та, 1961.- 419 с.

107. Розин Ю.А., Татьяненко JI.B., Бурындина Е.И., Барыбин А.С., Попова В.Г. Производные ализарина как ингибиторы транспорта кальция.//химико-фармацевтический. 1996г, № 8, с.28-29

108. Kwok J.C., Richardson D.R. Examination of the mechanism's involved in doxorubicin mediated iron accumulation in ferritin: studies using metaboliticч inhibitors, protein synthesis inhibitors, and lysosomotropic agents// Mol.

109. Pharmacol, v.65., 2004, p. 181 -195

110. Qian Z.M, Ke Y. Rethinking the role of ceruloplasmin in brain iron metabolism. // Brain Res Brain Res Rev.-2001.-v.35.-№3.- p.287-294

111. Ryden L. In "Copper protein and copper enzymes".- Lontie P. Ed.- CRC Press, Boca Raton, Florida.- 1984.- p.37-108

112. Vachette P., Dainese E., Vasyliev V.B., Di Muro P., Beltramini M., Svergun D.I., De Filippis V., Salvato B. A key structural role for active site type 3 copper ions in human ceruloplasmin.// J. Biol. Chem.- 2002. -v.277(43): p.40823- 40831.

113. Calabrese L., Carbonaro M and Musci G., Chicken ceruloplasmin. Evidence in support of a trinuclear cluster involving type 2 and 3 centers. Journal of biological chemistry, v.263, 1988, p.6480-6483

114. Васильев В.Б., Кононова C.B.// Биохимия, т.52., с.387-395, 1987

115. Адамсон А. Физическая химия поверхностей .-М.: Мир, 1979.586 с.

116. Charych D., Cheng Q., Reichert A., Kuziemko G., Stroh M., Nagy J.O., Spevak W., Stevens R.C. A "litmus test" for molecular recognition using artificial membranes // Chem. Biol. 1996. Vol. 3. №2. P. 113-120.

117. Генис P. Биомембраны: Молекулярная структура и функции: Пер. с англ.-М.: Мир, 1997.-624 с.

118. Georgallas A., Hunter D.L., bookman Т., Zuckermann M.J., Pink D.A. Interactions between two sheets of bilayer membrane and its internal lateral pressure // Eur. Boiphys J. 1984. Vol. 11. P. 79-86.

119. MacDonald R.C., Simon S.A. Lipid monolayer states and their relationships to bilayers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. Vol. 84. P. 40894093.

120. McConell H.M., Tamm L.K., Weis R.M. Periodic structures in lipid monolayer phase transitions. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 3249-3253.

121. Petres R., Beck K. Translation diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. Vol. 80. P. 7183-7187.

122. Флавоновые гликозиды. Методы выделения, очистки, разделения и анализа: Методическая разработка / ЛХФИ (Сост. Минина С.А., Шимолина Л.Л.).- Л.: Изд-во ЛХФИ, 1991. -28 с.

123. Георгиевский В.П., Рыбаченко А.И., Казаков А.Л. Физико-химические и аналитические характеристики флавоноидных соединений // Ростов-на-Дону: Изд-во Ростовского университета, 1988.- 144 с.

124. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. -М.: Высш. школа, 1974. -213 с.

125. Общая органическая химия в 12-ти т..- М.: Химия, 1985. Т.9: Кислородсодержащие и серусодержащие и другие гетероциклы. -798 с.

126. Макашева И.Е., Головкина М.Т. Взаимодействие кверцетина с ионами меди (II) в водно-спиртовых растворах // ЖОХ. 1973. Т. XLIII. Вып. 7. С. 1640-1645.

127. Brown J.E., Khodr Н., Hider R.C., Rice-Evans С.A. Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties // Biochem. J. 1998. Vol. 330. P. 1173-1178.

128. Balogh-Hergovich E., Kaizer J., Speier G. Kinetics and mechanism of the Си (I) and Си (II) flavonolate-catalyzed oxygenation of flavonol. Functional quercetin 2,3-dioxygenase models // J. Molecular Catalysis A: Chemical. 2000. Vol. 159. P. 215-224.

129. Devi M.A., Das N.P. In vitro effects of natural plant polyphenols on the proliferation of normal and abnormal human lymphocytes and their secretions of interleukin-2// Cancer Lett 1993. Vol.69. №3. P. 191-196.

130. Ильюченок Т.Ю., Хоменко А.И., Фригидова J1.M. и др. Фармакологические и радиозащитные свойства некоторых производных у-пирона (флаваноны и флаванолы) // Фармакология и токсикология. 1975. Т.38. №5. С. 607-611.

131. Biziagos Е., Crance J.M., Passagot J., Deloince R. Effect of antiviral substances on hepatitis A virus replication in vitro // J. Med. Virol. 1987. Vol. 22. №1. p. 57-66.

132. Bakay M., Mucsi I., Beladi I., Gabor M. Effect of flavonoids and related substances. II. Antiviral effect of quercetin, dihydroquercetin and dihydrofisetin // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1968. Vol. 15. №3. P. 223-227.

133. Оганесян Э.Т., Гущин И.С., Першков C.P., Сараф А.С. Исследование связи структура активность производных флавона, обладающих антиаллергической активностью // Хим.-фарм. журн. 1989. №10. С. 12381241.

134. Теселкин Ю.О., Жамбалова Б.А, Бабенкова И.В. и др. Антиоксидантные свойства дигидрокверцитина // Биофизика. 1996. Т. 41. №3. С. 620.

135. Metodiewa D., Jaiswal А.К., Cenas N., Dickancaite E., Segura-Aguilar J. Quercetin may act as a cytotoxic prooxidant after its metabolic activation to semiquinone and quinoidal product // Free Radic. Biol. Med. 1999. Vol. 26. P.107-116.

136. Yamasaki Н., Sakihama Y., Ikehara N. Flavonoid-peroxidase reaction as a detoxification mechanism of plant cells against H202 // Plant Physiol. 1997. Vol. 115. P. 1405-1412.

137. Arora A., Byrem T.M., Nair M.G., Strasburg G.M. Modulation of liposomal membrane fluidity by flavonoids and isoflavonoids // Arch. Biochem. Biophys. 2000. Vol. 373. №1. P. 102-109.

138. Sugihara N., Arakawa Т., Ohnishi M., Furuno K. Anti-and pro-oxidative effects of flavonoids on metal induced lipid hydroperoxide-dependent lipid peroxidation in cultured hepatocytes loaded with a-linolenic acid // Free Radic.

139. Biol. Med. Vol. 27.-11/12. P. 1323-1999.

140. Иваненко Е.Ф. Биохимия витаминов,- Киев: Вища школа, 1970.- 210 с.1. Список печатных трудов

141. Мельникова Н.Б., Волков A.A., Кононова C.B., Крайнова Т.А., Ефремова J1.M., Анастасиев В.В. Комплексы доксорубицина с ионами меди каталитического центра церулоплазмина. // Химико-фармацевтический журнал. 2006, № 1

142. Волков A.A., Гусихина М.С. Взаимодействие противоопухолевого антибиотика антрахинонового типа с ионами меди в системах, моделирующих биологические среды. // Тезисы доклада 7-ой Нижегородской сессии молодых ученых «Голубая Ока», 25-30 апреля 2002 г.

143. Волкс>в A.A., Кононова C.B., Мельникова Н.Б. Комплексы физиологически активных веществ с ионами меди каталитического центра церулоплазмина. // V Всероссийский научный семинар и молодежная научная школа «Химия и медицина». Уфа, 5-8 сентября 2005 г.

144. Цель испытаний снижение токсических явлений при химиотерапии препаратом доксорубицина гидрохлорид

145. В качестве препаратов снижающих токсичность использовались дигидрокверцетин и церулоплазмин.1. Результаты испытаний:1. Химиотерапия др ЦП (5мг/кг, через день, 10 инфузий) ДР, ЦП, ДКВнь Уменьшение на Увеличение на Увеличение на10.30% 15-20% 15-30%

146. Количество Уменьшение на Увеличение на Увеличение наэритроцитов 10-15% 8-10% 10-15%

147. СпА ЦП, ед/мкг 0,08±0,002 0,12±0,002 0,12±0,002

148. Ассистент кафедры «УЭФ и фармацевтической технологии»

149. Зав. кафедрой «Фармацетической химии», д.х.н., проф.

150. Генеральный директор компании «ИнтелФарм»1. Волков А.А.1. Мельникова Н.Б.1. Раснецов Л.Д.

151. Автор искренне и от всего сердца благодарит своего учителя и наставника, научного руководителя, профессора, доктора химических наук

152. Мельникову Нину Борисовну. За неоценимую помощь в выполнении и написании диссертационной работы.