Комплексное исследование вакцин и галеновых препаратов физико-химическими и хемометрическими методами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Галкина Дарья Александровна

• Галкина Дарья Александровна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Галкина Дарья Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Органно-тканевая проницаемость наночастиц, содержащих биологически-активные компоненты

1.1.2. Природа и роль наночастиц

1.1.3. Методы контроля качества наноматериалов медицинского назначения

1.1.4. Контроль коллоидного состояния частиц дисперсной фазы с использованием оборудования Malvern Zetasizer Nano

1.2. Современные вакцины для иммунизации

1.2.1. Вакцины против SARS-CoV-2 и ротавируса А человека

1.2.2. Общая характеристика вируса SARS-CoV-2

1.2.3. Общая характеристика ротавируса А человека

1.2.4. VLP-частицы и механизм их иммунизации

1.2.5. Современные методы в контроле качества VLP

1.2.6. Фармакопейные подходы к контролю качества вакцин

1.3. Галеновые лекарственные препараты противовоспалительного и.

антибактериального действия

1.3.1. Химический состав и биологическая активность компонентов Calendula officinalis L

1.3.2. Комбинированная фармакологическая активность галеновых препаратов календулы

1.3.3. Макро- и микроэлементный состав календулы

1.3.4. Токсичность ЛП на основе календулы

1.4. Общая характеристика эвкалипта прутовидного (Eucalypti viminalis

folia)

1.4.1. Терпеновый профиль эвкалиптового масла и его биологическая активность

1.4.2. Противовирусная активность галеновых препаратов эвкалипта

1.4.3. Макро- и микроэлементный состав эвкалипта

1.4.4. Токсичность ЛРП на основе эвкалипта

1.5. Хемометрические подходы в оценке подлинности ЛРП и биологической

активности компонентов лекарственных растений

1.5.1. Метод главных компонент

1.5.2. Метод компьютерного моделирования количественная корреляция структура активность (ККСА/ QSAR)

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.1. Образцы компонентов экспериментальной вакцины

2.1.2. Настойки

2.1.3. Растворители

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. Метод динамического рассеяния света

2.2.2. Малоугловое светорассеяния (LALLS - Low-angle laser light scattering)

2.2.3. Поляриметрия

2.2.4. Потенциометрия

2.2.5. Кондуктометрия

2.2.6. Газовая хроматография с селективным с масс-селективным детектирование

2.2.7. Инфракрасная спектроскопия нарушенного полного внутреннего отражения (ИК-НПВО)

2.2.8. УФ - ВИД-спектрометрия

2.2.9. Рентгенофлуоресцентная спектрометрия

2.2.10. Метод компьютерного QSAR-моделирования

2.2.11. Метод Spirotox-тест

2.2.12. Обработка экспериментальных данных

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Дисперсные характеристики экспериментальных VLP, содержащих белки SARS-CoV-2 и ротавируса А в процессе их производства и вакцин на их основе

3.1.1. Дисперсные характеристики экспериментальных VLP, имитирующие

белки SARS-CoV-2

3.1.2. Дисперсные характеристики экспериментальных VLP, имитирующие

белки ротавируса А

3.1.3. Дисперсные характеристики адъюванта

3.1.4. Дисперсные характеристики вакцин на основе VLP

3.1.5. Мониторинг стабильности VLP-вакцин против SARS-CoV-2 с адъювантом

3.1.6. Валидационные характеристики методики контроля VLP-вакцин с адъювантом по показателю «размер частиц» методом лазерной дифракции света

3.2. Физико-химические методы в определении подлинности лекарственных растительных препаратов

3.2.1. Поляриметрическое исследование настоек

3.2.2. Электрохимические методы анализа в оценке доброкачественности настоек

3.2.3. Скрининговые исследования методом ГХ-МС

3.3. Тандемный подход в определении подлинности ЛРП с антибактериальными и противовоспалительными свойствами

3.3.1. Хемометрическая обработка ИК-спектров ЛРС в области «фингерпринт»

3.3.2. Тандем РФА+МГК в определения подлинности растительного сырья без СО

3.3.3. УФ-спектрофотометрия настоек эвкалипта и календулы в определении

подлинности

3.4. Прогноз биологической активности ЛРП разных ботанических родов в сравнении с НПВС т silico - метод ККСА

3.5. Контроль дисперсности настоек для последующей оценки их биологической активности методом Spirotox тест

3.5.1. Контроль дисперсности настоек при рН, имитирующие pH разных

биологических сред организма

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексное исследование вакцин и галеновых препаратов физико-химическими и хемометрическими методами»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Несмотря на длительную историю вакцинации от Л. Пастера до М.П. Чумакова, лишь недавний всплеск заболеваний коронавирусом (Canoui E. et al., 2019) стимулировал разработку новых типов вакцин. На мировом фармацевтическом рынке набирают популярность вакцины нового поколения на основе самособирающихся вирусоподобных частиц (VLP -Virus Like Particals), которые имитирует морфологические особенности (размер, форма, природа белков) настоящих вирусов. Российскими учёными разработаны вакцины на основе VLP распространенных штаммов вируса SARS-CoV-2 (Гребенникова Т.В. и др, Роспатент № 2021139796, 2021), а также ротавируса А (Черепушкин С.А. и др., 2021). Достоинством этой группы вакцин является отсутствие в их составе фрагмента матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК), что обеспечивает невозможность репликации вируса в организме человека (Prates-Syed W.A. et al., 2021). По результатам I и II фазы клинических испытаний вакцин на основе VLP они являются безопасными, что подтверждается отсутствием нежелательных побочных реакций (Grebennikova T.V. et al., 2023). Разработка VLP-вакцин потребовала использования дополнительных методик контроля качества, в частности проведения испытаний дисперсности. До настоящего времени, несмотря на активное внедрение в фармацевтическую практику метода динамического светорассеяния (DLS - Dinamical Light Scattering), контроль дисперсности вакцин осуществляли преимущественно методом трансмиссионной электронной микроскопии (De Sa Magalhaes et al., 2022).

Наночастицы, присутствующие в лекарственных средствах (ЛС), попадая в организм, могут быть источником механического стимулирования биологических сигналов, известного как механотрансдукция (Abdel Fattah A.R. et al., 2020; Weaver V. M., 2017). Например, их присутствие в отдельных компартментах организма может приводить к высвобождению химических трансмиттеров и возникновению нейронных импульсов (Elblova P. et al., 2024; Metze F.K. et al., 2019). Как оказалось, биомеханические воздействия не менее важны, чем традиционные биохимические

(pH, окислительно-восстановительные потенциалы, кинетический изотопный эффект, хиральные превращения, катализ). Процессы биомеханической стимуляции частицами дисперсной фазы лекарств исследуются всё с большей активностью, что подтверждается формированием новых направлений -наномедицины и нанофармации (Cai P. et al., 2018; Zhang Y. et al 2016). Особое значение приобретает изучение физико-химических механизмов возможных механотрансдукционных процессов, сопровождающееся контролем дисперсности ЛС (Syroeshkin A. V. et al., 2024; Petrov G. V. et al., 2024).

Для профилактики и лечения вирусных инфекций хорошо зарекомендовали себя ЛС на основе растительных компонентов — настойки календулы и эвкалипта (Mieres-Castro D. et al., 2021), в которых присутствуют частицы дисперсной фазы. Контроль качества настоек затруднен из-за их многокомпонентного состава (Shahane K. et al., 2021; Baser K.H.C. et al., 2023).В настоящее время нормативные требования ограничены определением массы сухого остатка настойки, содержания этанола, а также примесей метанола и тяжелых металлов («Настойки», ОФС.1.4.1.0019 ГФ РФ XV, «Liquid extraction preparations», Ph. Eur.11.5). Расширение спектра показателей качества лекарственных растительных препаратов (ЛРП) должно быть направлено на разработку методик определения подлинности и дисперсности.

Дальнейшее совершенствование контроля качества вакцин и ЛРП как дисперсных систем методом DLS позволяет определять размер частиц в нанодиапазоне и характеризовать их стабильность по величине электрокинетического потенциала. Вариации дисперсности исходного лекарственного растительного сырья (ЛРС) открывают возможности определения подлинности путем сочетания спектральных характеристик с хемометрическими подходами, включая Метод Главных Компонент/ Principal Component Analysis (МГК/ PCA) и методы Количественной Корреляции «Структура - Активность»/ Quantitative Structure-Activity Relationship (ККСА/ QSAR). Контроль дисперсности галеновых препаратов позволяет усовершенствовать диаграмму корреляционных зависимостей между кажущейся энергией активации лиганд-рецепторных

взаимодействий (obsEa, Spirotox-тест) и токсичностью активных фармацевтических ингредиентов АФИ (LD50, per os).

Степень разработанности темы исследования. Вакцины нового поколения на основе VLP-частиц требуют совершенствования подходов к контролю их качества. В существующих нормативных документах («Вакцины анатоксины», ОФС.1.7.1.0004.15 ГФ РФ XV) отсутствует показатель «размер частиц». Разработанная методика определения дисперсности VLP позволила контролировать многостадийный процесс их выделения и очистки. Спектры динамического светорассеяния растворов VLP-вакцин с адъювантом характеризуют оптимальный размерный диапазон частиц в готовой лекарственной форме (ГЛФ). Стабильность готовых VLP-вакцин с адъювантом исследовали в течение 12 месяцев, что позволило установить их срок годности. Полученные результаты явились основой для формирования Стандарта Предприятия «Метод контроля стабильности VLP-вакцин» (СТП 01897357-002-2023, Контракт № 8а-04/23-051 от 02.05.2023 г.).

Отсутствие стандартных образцов (СО), необходимых для определения подлинности ЛРП, явилось основанием для разработки комбинированных аналитических подходов. Исследования коллектива кафедры фармацевтической и токсикологической химии Медицинского института РУДН в области идентификации ЛРС и галеновых препаратов с применением хемометрической обработки спектральных данных в широком интервале длин волн (Pleteneva T.V., Ogotoeva, D. D. et al., 2024) позволили расширить круг фармакогностических объектов, включив в рассмотрение ЛРП антибактериального и противовоспалительного действия. ККСА-прогнозирование субстанций с использованием разработанных на кафедре оригинальных компьютерных программ (Попов П.И., Роспатент № 2003612305, 2003; Попов П.И., Роспатент № 2005612770, 2005) позволило провести сравнение биологической активности природных компонентов ЛРП с синтетическими ЛС аналогичного терапевтического действия и оценить перспективность их применения.

Объекты и предмет исследования. Объекты диссертационного исследования: иммунобиологические препараты - экспериментальные образцы, содержащие вирусоподобные частицы 8ЛЯ8-СоУ-2 и ротавируса А; ГЛФ вакцин нового поколения на основе УЬР без адъюванта и с адъювантом, разработанные ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ; ЛРП: настойки и ЛРС противовоспалительного и антибактериального действия, реализуемые через аптечную сеть, а также лабораторные настойки, изготовленные из диспергированного гомогенизированного ЛРС.

Предмет исследования. Предмет диссертационного исследования -разработка методик контроля качества УЬР-вакцин и ЛРП путём оценки их дисперсности, ККСА-прогнозирования липофильности отдельных компонентов галеновых препаратов, хемометрической обработки результатов их спектрального анализа и прогнозирования комбинированной активности на основе аррениусовской кинетики.

Цель исследования: совершенствовать подходы к контролю качества некоторых противовирусных и антибактериальных лекарственных средств на основе комплекса физико-химических, хемометрических и биологических методов.

Задачи исследования:

1. Исследовать стабильность УЬР-вакцин нового поколения методом динамического светорассеяния (ЭЬБ) для последующей стандартизации.

2. Исследовать возможности физико-химических методов (поляриметрия, кондуктометрия, потенциометрия, ГХ-МС) в определении подлинности и оценке качества настоек календулы и эвкалипта.

3. Разработать методики определения подлинности ЛРП без использования СО путем хемометрической обработки (МГК) спектральных результатов (ИКФС НПВО, РФА, УФ).

4. Разработать ККСА-диаграммы для сравнительной характеристики липофильности компонентов растений и синтетических ЛС, обладающих противовоспалительным действием.

5. Разработать методику оценки комбинированной биологической активности галеновых препаратов выбранного фармакологического класса на основе аррениусовской кинетики (^ргто1ох-тест) для оптимизации токсикометрической оценки.

Научная новизна. Впервые разработана методика контроля стабильности вакцин нового поколения на основе УЬР, включенная в Стандарт предприятия (СТП) 01897357-002-2023 «Метод контроля стабильности УЬР-вакцин». Впервые галеновые препараты противовоспалительного и антибактериального действия исследованы физико-химическими методами (поляриметрии, кондуктометрии, потенциометрии, газовой хроматографии с селективным масс-детектированием -ГХ-МС), что открывает новые возможности в определении их подлинности и оценки качества. В связи с отсутствием СО впервые разработаны методики определения подлинности ЛРП разных ботанических родов (календулы цветки, эвкалипта листья, кора дуба, чабреца трава) на основе тандемного подхода: спектрометрия в сочетании с МГК. Впервые методом ККСА доказана более высокая липофильность каннабиноидов по сравнению с группой нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), что объясняет эффективность и безопасность зарубежных ЛС на основе каннабиса в качестве обезболивающих и противовоспалительных препаратов. Впервые для оценки биологической активности определены значения кажущихся энергий активации (оЬ8Ба) лиганд-рецепторных взаимодействий настоек календулы и эвкалипта, позволившие оптимизировать токсикометрические измерения.

Теоретическая и практическая значимость работы. Для контроля качества вакцин нового поколения на основе вирусоподобных частиц разработана методика, позволяющая охарактеризовать распределение размера частиц по интенсивности и объёму рассеяния света в зависимости от их размера в нанометровом диапазоне (метод DLS). Для оценки стабильности вакцин осуществлены фармакокинетические исследования, основанные на измерении указанных параметров в течение 12 месяцев. Стабильность вакцин нового поколения охарактеризована величиной электрокинетического потенциала (£-

потенциала). Проведенные исследования обобщены и представлены в виде «Стандарта предприятия» (см. Приложение А).

Разработан новый подход для определения подлинности ЛРП антибактериального и противовоспалительного действия, сочетающий спектрометрические исследования (ИКФС НПВО, РФА, УФ) и хемометрическую обработку спектральных результатов. Методика позволяет определять подлинность ЛРП в отсутствие СО и в перспективе может быть использована для разработки общей фармакопейной статьи (ОФС) «Определение подлинности ботанического рода лекарственных растительных препаратов». Осуществлён комплексный подход к экспресс-оценке качества галеновых препаратов, сочетающий измерения их оптической активности (метод поляриметрии) и, электрохимических показателей (рН, удельная электропроводность). Проведенные скрининговые исследования ГХ-МС позволили обнаружить в настойках календулы и эвкалипта специфические соединения - биомаркеры, которые могут быть рекомендованы для дальнейшего внедрения в фармацевтический анализ в качестве СО.

Методология и методы исследования. Диссертационные исследования базировались на общенаучной методологии - сравнение, сопоставление, анализ. Обобщены результаты исследований зарубежных и отечественных научных изданий (более 260 источников), а также патентов и нормативной документации, в том числе государственной фармакопеи (ГФ РФ) и зарубежных фармакопей. Исследования выполнены с использование современных физико-химических методов анализа: динамического светорассеяния (DLS), поляриметрии, потенциометрии, кондуктометрии, ИК-спектрометрии, РФА, и УФ-спектрофотомерии. Комбинированную биологическую активность компонентов настоек определяли методом Spirotox-тест на основе аррениусовской кинетики. Статистическую и хемометрическую обработку электронных и колебательных спектров, ККСА-моделирование и графическое представление результатов осуществляли в программах OriginPro 2021 (OriginLab Corporation, США) с

использованием оригинальных программ, разработанных на кафедре фармацевтической и токсикологической химии Медицинского института РУДН.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты применения метода динамического светорассеяния (ЭЬБ) для контроля качества вакцин нового поколения на основе УЬР.

2. Результаты применения физико-химических методов (поляриметрии, кондуктометрии, потенциометрии, ГХ-МС), необходимых для контроля качества и стандартизации галеновых препаратов выбранного фармакологического класса.

3. Результаты сочетания спектральных методов анализа и МГК для идентификации ботанического рода без использования СО.

4. Результаты ККСА-моделирования компонентов ЛРС и компонентов настоек противовоспалительного и антибактериального действия в сравнении их липофильности с ЛС класса НПВС.

5. Результаты прогнозирования биологической активности настоек календулы и эвкалипта, позволяющие оптимизировать получение сравнительных токсикометрических данных.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 3.4.2. Фармацевтическая химия, фармакогнозия (фармацевтические науки) по следующим областям исследования:

1. Исследование и получение биологически активных веществ на основе направленного изменения структуры синтетического и природного происхождения и выявление связей и закономерностей между строением и свойствами веществ.

3. Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления.

6. Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе.

Степень достоверности полученных результатов. Работа выполнена на высокотехнологичном оборудовании с использованием оригинального программного обеспечения (ПО), что гарантирует высокую воспроизводимость и достоверность полученных результатов. Разработанные методики определения размера частиц VLP-вакцин и подлинности ЛРП статистически обработаны с помощь пакета «Origin Pro» (OriginLab Corporation, США) и валидированы в соответствии с ГФ РФ («Валидация аналитических методик», ОФС.1.1.0012, ГФ РФ XV).

Апробация результатов исследования диссертационной работы

проведена на заседании кафедры фармацевтической и токсикологической химии Медицинского института РУДН (протокол № 0300-35-04/13от 30.09.2024).

Основные результаты диссертационной работы представлены в 8 публикациях, среди которых 6 статей в журналах, индексируемых в международных базах цитирования (Scopus), 2 статьи в изданиях перечня РУДН, а также в тезисах и устных докладах: XII и XIII Всероссийская научная конференция студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация -потенциал будущего» (Санкт-Петербург, Россия, 2023, 2024); XIII межвузовская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых с международным участием «Научная весна 2023» (Самара, Москва, Саратов, Санкт-Петербург, Россия, 2023); XVII Международная Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (Москва, Россия, 2022).

Личный вклад автора. Работа выполнена при непосредственном участии автора: экспериментальная часть, обработка и интерпретация результатов, подготовка и публикации научных статей в соавторстве с научными коллективами кафедры фармацевтической и токсикологической химии Медицинского института РУДН и лаборатории молекулярной диагностики ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 250 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, выводы, библиографический список содержит 254 источника и приложения. Основная часть диссертации включает 21 таблицу и 51 рисунок.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

Международные базы цитирования:

1. Pleteneva, T. V. The new approaches to identification of tinctures and medicinal plants / T. V. Pleteneva, D. D. Ogotoeva, O. V. Levitskaya, D. A. Galkina, E. V. Uspenskaya, A. V. Syroeshkin // International Journal of Applied Pharmaceutics. -2024. - V. 16. - N. 2. - P. 306-312. DOI: 10.22159/ijap.2024v16i2.49780.

2. Petrov, G.V. Controlling the Quality of Nanodrugs According to Their New Property—Radiothermal Emission / G. V. Petrov, D. A. Galkina, A. M. Koldina, T. V. Grebennikova, O. V. Eliseeva, Y. Y. Chernoryzh, V. V. Lebedeva, A. V. Syroeshkin // Pharmaceutics. - 2024. - V. 16. - N. 2. - P.180. DOI:10.3390/pharmaceutics16020180.

3. Pleteneva, T. V. Arrhenius kinetics in the evaluation of the biological activity of pharmaceutical tinctures / T. V. Pleteneva, D. A. Galkina, O. A. Fatkulina, D. D. Ogotoeva, O. V. Levitskaya, E. V. Uspenskaya, A. V. Syroeshkin // International Journal of Applied Pharmaceutics. - 2023. - V. 15. - N 4. - P. 277-281. DOI: 10.22159/ijap.2023v15i4.48058.

4. Syroeshkin, A. V. Radiothermal Emission of Nanoparticles with a Complex Shape as a Tool for the Quality Control of Pharmaceuticals Containing Biologically Active Nanoparticles / A. V. Syroeshkin, G.V. Petrov, V. V. Taranov, T. V. Pleteneva, A. M. Koldina, I. A. Gaydashev, E. S. Kolyabina, D. A. Galkina, E. V. Sorokina, E. V. Uspenskaya, I. V. Kazimova, M. A. Morozova, V.V. Lebedeva, S. A. Cherepushkin, I. V. Tarabrina, S. A. Syroeshkin, A. V. Tertyshnikov, T.V. Grebennikova // Pharmaceutics. - 2023. - V. 15. - N. 3. - P.966. DOI:10.3390/pharmaceutics15030966

5. Syroeshkin, A. V. Comparison of biopharmaceutical parameters of cannabinoids and non-steroidal anti-inflammatory drugs by QSAR method / A. V. Syroeshkin, D. A. Galkina, D. D. Ogotoeva, O. V. Levitskaya, M. A. Morozova, T. V. Pleteneva // International Journal of Applied Pharmaceutics. - 2023. - V. 15. - N. 1. - P. 269-273. DOI: 10.22159/ijap.2023v15i1.45990

6. Syroeshkin, A.V. Polarimetry and dynamic light scattering in quality control of cardiotonic and hypotensive tinctures / A. V. Syroeshkin, D. D. Ogotoeva, D. A. Galkina, E. V. Uspenskaya, T. V. Pleteneva // International Journal of Applied Pharmaceutics. -2022. - V. 14. - N 6. - P. 114-119. DOI: 10.22159/ijap.2022v14i6.45907.

Перечень RSCI:

7. Сыроешкин, А.В. Поляриметрия и динамическое светорассеяние в контроле качества настоек / А. В. Сыроешкин, Д. Д. Оготоева, Д. А. Галкина, М. А. Джавахян, Т. Е. Елизарова, Е. В. Успенская, Т. В. Плетенева // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2022. - T. 25. - N 9. -C. 3-9. DOI: 10.29296/25877313-2022-09-01.

8. Сыроешкин, А. В. Сравнительное QSAR-моделирование каннабиноидов-анальгетиков и нестероидных противовоспалительных препаратов / А. В. Сыроешкин, Д. А. Галкина, Т. В. Плетенева, М. А. Морозова, О. В. Левицкая // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2021. - Т.24. - N 12. С. 18-23. DOI: 10.29296/25877313-2021-12-03.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Органно-тканевая проницаемость наночастиц, содержащих биологически-активные компоненты

Одним из ключевых параметров, необходимых для выявления эффективных препаратов, является способность проникать через липофильные мембраны, поскольку лекарственные средства (ЛС), предназначенные для внутриклеточной мишени с плохой проницаемостью, имеют низкую биодоступность [1].

Биодоступность, определяет эффективность препарата, а также его побочные эффекты. Факторы, влияющие на определение биодоступности, например, проницаемость через различные биологические мембраны является критическим, поскольку невозможность достижения намеченной цели часто приводит к плохой эффективности in vivo и может потребовать более высокие минимальные эффективные дозы (ED50), что вызывает высокие риски побочных эффектов при различных способах введения ЛС в организм [2].

Пероральное введение наиболее распространенная лекарственная форма (ЛФ) при различных заболеваниях из-за ее высокой безопасности, удобства, низкой стоимости и высокой приверженности пациентов [3]. Тем не менее, многие препараты плохо проникают через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и кишечного эпителия, плохо всасываются при пероральном приеме и обладают ограниченным терапевтическим эффектом.

Система доставки ЛС с помощью наночастиц (NDDS - novel drug delivery system) является уникальной, так как имеет ряд преимуществ: включает защиту лекарств от преждевременной деградации и взаимодействие с физиологической средой, способствует увеличению проникновения внутрь клеток и усиливает абсорбции лекарств. Однако, изменение физико-химических свойств коллоидных наночастиц (размер, свойства поверхности и форма) оказывает существенное влияние на лиганд-рецепторное взаимодействие, что влияет на биодоступность лекарств per os [4].

Частицы меньшего размера легко движутся в слизи, что позволяет быстрее и эффективнее достигать мишени. Например, твердые липидные наночастицы с ретиноевой кислотой существенно увеличивают пероральную биодоступность ретиноевой кислоты при уменьшении размера частиц от 328,8 нм до 89,3 нм [5], что доказывает, решающую роль размера частиц в пероральной доставке лекарств [6].

Биодоступность АФИ посредством пиноцитоза (греч. pino — пью, впитываю и kytos — вместилище) зависит от размера наночастиц, содержащихся в ЛФ. Например, наноструктурированные липидные носители с размером частиц 100 нм эффективно используются для лечения рака толстой кишки и демонстрируют более высокую эффективность поглощения в раковых клетках Caco-2 (Cancer coli, «рак толстой кишки»), а также имели более высокую проникающую способность по сравнению с липидными наночастицами большего размера 200 нм и 300 нм Фармакокинетические исследования показали, что наночастицы размером 100 нм демонстрирует самые высокие фармакокинетические показатели: максимальная концентрация (Cmax) и площадь под кривой «концентрация-время» (AUC - Area Under Curve) по сравнению с наночастицами большего размера [7].

Содержание наночастиц меньшего размера вызывает более высокий иммунобиологический ответ организма в отличии от традиционных вакцин из-за их плохого распознавания и интернализации иммунными клетками. Например, значительно более высокий титр антиникотиновых антител был достигнут с помощью нановакцины с размером частиц 100 нм по сравнению с нановакциной 500 нм и показала лучшую фармакокинетику, чем 500-нм нановакцина в присутствии квасцового адъюванта.

1.1.2. Природа и роль наночастиц

Дисперсный (греч. dispergeo - измельчать, дробить) - наименование объекта, которой содержит в себе мелкие частицы [8]. Дисперсной системой называют раствор, состоящий из двух или более фаз, одна из которых состоит из твердых частиц. Одни из таких частиц являются наночастицы, которые образуют коллоидные (греч. kola - клей), в частности, дисперсные системы. Многие ЛФ являются коллоидными системами, например, эмульсии, порошки, мази, суспензии и другие [9-12].

В зависимости от размера частиц твердой фазы дисперсные системы классифицируются на грубодисперсные, микро- или нанодисперсные и растворы (Таблица1).

Таблица 1. Классификация дисперсных систем, в зависимости от размера частиц

Диаметр частицы, Классификация

нм системы

d > 1000 грубодисперсные

1 < d < 1000 микро- или

нанодисперсные

d <1 растворы

Дисперсность - характеризует степень раздробленность вещества [8] и обратно пропорциональна размеру частиц:

Д = £ (м-1) (1)

Где

Д - дисперсность, (м-1); сС диаметр частицы, м.

Для микро- и нанодисперсных коллоидных систем характерны пределы дисперсности 109 м-1 > Д > 106 м-1.

Таким образом, лекарства, содержащие наночастицы являются нанодисперсными системами и обладают высокой раздробленностью.

Лиофобность дисперсной системы (греч. «1уо» - растворяю, «ркоЪо8» -страх) характеризуется очень слабым взаимодействием частиц дисперсной фазы (ДФ) и дисперсионной среды (ДС). Энергия Гиббса для таких систем имеет высокие значения (АО >0), следовательно такие системы не могут образовываться самопроизвольно. Например, к таким системам относятся масляные эмульсии в воде или золи металлов. Из ЛС к таким системам можно отнести, например, вакцины, в которых в качестве адъюванта использованы аллюминий или сквален.

Лиофильные системы (греч. «1уо» - растворяю, «рЫ1вЖ> - люблю) характеризуются сильными молекулярными взаимодействиями ДФ и ДС. Энергия Гиббса для таких систем имеет значения меньше нуля (АО < 0) Согласно второму закону термодинамики, такие системы образуются самопроизвольно. Примером ЛС с лиофильной системой могут быть лекарственные настойки, разбавленные водой.

ДФ и ДС имеют заряд вследствие чего может возникать двойной электрический слой (ДЭС), включающий в себя потенциалопределяющие ионы и слой противоионов (Рисунок 1).

5 \ I

Рисунок 1. Строение двойного электрического слоя: 5, X - толщины плотного и диффузионного слоев двойного электрического слоя; ф5, фХ - потенциалы на межфазных границах и плотного слоя; А - граница слоя скольжения; ^-потенциал.

Адсорбционный слой (слой Гельмгольца) плотно прилегает к границе раздела фаз с определенной толщиной (5), которая соответствует радиусу потенциалопределяющих ионов. Толщина (X) диффузного слоя (слой Гуи) зависит от свойств коллоидной системы и в некоторых случаях может достигать больших значений.

Дзетта-потенциал (0 - потенциал диффузного слоя (ф5) и возникает на плоскости скольжения (А), образующаяся в результате движения частиц в подвижной фазе. При этом наиболее удаленная часть диффузионного слоя Гуи практически остаётся неподвижной, что приводит к нескомпенсированности поверхностного заряда.

Дзетта-потенциал представляет собой разность потенциалов ДС и неподвижного слоя жидкости, окружающий частицу:

С = фд - фх (2)

Где

фд - потенциал ДС, образующийся на границе адсорбционного и диффузного слоев, мВ;

фх - потенциал, характеризующий толщину диффузного (плотного) слоя, мВ.

Дзета-потенциал является характеристикой стабильности коллоидной системы. Чем выше величина потенциала по модулю, тем лучше стабильнее коллоидная система (Таблица 2).

Таблица 2. Устойчивость коллоидных систем при различных значениях дзетта-потенциала [13]

Значение £ -потенциала, мВ Устойчивость коллоидной системы

0 до ± 30 Низкая устойчивость

30 На границе

< ± 30 Высокая устойчивость

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Галкина Дарья Александровна, 2024 год

Си - - -

Е 2085 3091 705

Как и следовало ожидать, в настойке с наименьшей электропроводностью суммарное содержание элементов оказалось в 3-4 раза меньше по сравнению с другими образцами. Следует подчеркнуть, что основное фармакопейное требование к качеству настоек по массе сухого остатка является необходимым, но не достаточным, так как может приводить к ошибке в оценке доброкачественности галеновых препаратов.

Выявленная корреляция между суммарным количеством элементов и удельной электропроводностью позволяет использовать кондуктометрию для оценки доброкачественности настоек.

Диаграммы Пурбэ позволяют прогнозировать форму элементов по установленным значениям рН настоек (5,21 - 6,2) преобладающих в водно-

этанольной смеси. При полученных pH медь существует в трех малорастворимых формах: Cu, Cu2O и Cu(OH)2, что подтверждается результатами РФА (см. Таблица 20). Цинк, марганец и железо, наоборот, преобладают в катионной форме Zn2+, Мп2+и Fe2+, которые могут образовывать хелатные комплексы, обеспечивает

возможность поступления их в организм. (Рисунок 26).

в г

Рисунок 26. Диаграммы Пурбэ для микроэлементов: а - цинка, б - марганца,

в - железа, г - меди.

Таким образом, настойки являются источником эссенциальных элементов Мп и Бе, которые способны образовывать высокобиодоступные хелатные соединения или аквакомплексы.

3.2.3. Скрининговые исследования методом ГХ-МС

Скрининговые исследования методом ГХ-МС летучих компонентов двух ботанических родов позволили выделить индивидуальные биомаркеры, рекомендуемые для идентификации настоек. Были выбраны компоненты, которые присутствовали в производственных и лабораторных настойках одного ботанического рода с наиболее высокими площадями хроматографического сигнала(АиС) и идентифицированные с помощью сравнения полученных масс-спектров с данными электронных баз включенных в программное обеспечение программы АМОТБ (приложение Е) (Рисунок 27, Рисунок 28).

Рисунок 27. Летучие компоненты настойки календулы, отсутствующие в настойках эвкалипта

О

3 <

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

хУ /

п|1

ол

ж

|лабораторная 1 заводская

¿о /

Рисунок 28. Летучие компоненты настойки эвкалипта, отсутствующие в настойках календулы

Известно, что идентифицированный 1,8-цинеол (эвкалиптол) используют в качестве СО для определения подлинности листьев эвкалипта и эфирного масла эвкалипта, что подтверждает достоверность полученных нами данных [174, 232]

Сравнительный анализ компонентов специфических соединений в настойках календулы: 7-ацетил-2-гидрокси-2-метил-5-изопропилбицикло[4,3,0]нонан и эпизонарен (1,6-диметил-4-пропан-2-ил- 1,2,3,7,8,8а-гексагидронафталин) и эвкалипта: эвкалиптол (1,8-цинеол) позволил рекомендовать их для дальнейшего внедрения в фармацевтический анализ после проведения их межлабораторной интеркалибрации и государственного утверждения в качестве СО.

3.3. Тандемный подход в определении подлинности ЛРП с антибактериальными и противовоспалительными свойствами

Попытки использовать спектральные методы анализа в определении подлинности галеновых препаратов и ЛРС безуспешны из-за многообразия химического состава. Так, например, спектры анализируемых объектов не отражают специфичность разных ботанических видов из-за присутствия в них химических компонентов одних и тех же химических классов.

3.3.1. Хемометрическая обработка ИК-спектров ЛРС в области

«фингерпринт»

ИК-спектры проб неизмельченного ЛРС, взятых из аптечной упаковки, представляли собой сплошное поглощение, не позволяющее выделить отдельные спектральные полосы (Рисунок 29).

106

ч? 104 ф'

X

г

га

* 102 о >s

с О

а

с 100

98

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

Волновое число, см"1

Рисунок 29. ИК-спектр аптечного сырья до диспергирования для Eucalypti viminalis folia.

i_._i_i_i_i_i_._i

Оценка дисперсности полученного гомогенизированного растительного сырья подтверждали методом малоуглового светорассеяния (ЬЛЬЬБ) (Рисунок 30).

а б

Рисунок 30. Размерные спектры малоуглового лазерного светорассеяние (LALLS) гомогенизированной ЛРС: а - календулы; б - эвкалипта.

Диспергирование и гомогенизация позволили получить ИК-спектры, но спектры образцов ЛРС разных ботанических родов в средней ИК-области не имеют существенных различий, т. е. практически не отличаются по положению и интенсивности пропускания (Рисунок 31). В связи с этим, в отличие от индивидуальных органических соединений, невозможно создать библиотеку ИК-спектров ЛРС, которая могла бы использоваться для их идентификации. Известно, что область 1500-650 см-1 (область «отпечатков пальцев», или «фингерпринт») является ключевым диапазоном в анализе субстанций органической природы. Но для растительных объектов большинства ботанических родов также не были обнаружены различия в этой области спектров [233].

а б

Рисунок 31. ИК-спектры ЛРС в области 4000-650 см-1 (а) и в области «фингерпринт» (б). Лекарственные травы: 1-4 календулы; 5-7 - эвкалипта листья, 8-10 - кора дуба; 11-14 - чабреца трава.

Как было показано ранее [234], использование МГК в определении подлинности ЛРС трёх ботанических видов возможно на основе ИК-спектров, полученных во всем интервале волновых чисел. Но, как оказалось, в некоторых случаях, добавление в спектральную библиотеку данных других фармакологических классов нарушает ожидаемый результат дискриминантного анализа. Например, расстояние Махаланобиса для ЛРС эвкалипта и пустырника не отвечает требуемому пограничному расстоянию в >3 БЭ. В связи с этим в настоящем исследовании выбранная область волновых чисел была ограничена наиболее информативным интервалом 1500-650 см-1 [235].

Накопленные спектральные результаты ЛРС разных ботанических родов, производителей и серий в области волновых чисел от 1500 см-1 до 650 см-1 были собраны в специальную библиотеку. Многомерный анализ 14 различных образцов с выбранным шагом значений волновых чисел (N1 = 913) позволил оперировать с первичной матрицей Х, включающей более 10 тыс значений: ^Х)= 14 х 913 = 12 782. Выбор необходимого числа ГК проводили по положению излома на графике

собственных значений ГК, который находился между второй и третьей компонентой (Рисунок 32).

Рисунок 32. Зависимость собственных значений от номера ГК

Это позволило использовать как двумерную, так и трехмерную модель визуализации результатов (Рисунок 33).

о>

см

о о.

-2

ЯегруШ кегЬа юл <. икп^нЬи' /к 3®

® 13® и ¡л (>иегсиа саг1е.х Еыси1урп /о/шт «® »

-2

РС 1 (80.55%)

а

б

Рисунок 33. Результаты хемометрической обработки (МГК) ИК-спектров в области «фингерпринт»: б - 2Б-моделирование, в - 3Б-моделирование. ЛРС: 1-4 -календулы цветки; 5-7 - эвкалипта листья; 8-11 - чабреца трава; 12-14 - кора дуба.

Две компоненты в сумме (ГК1+ ГК2) составили 95,54% (80,55%+14,19%) от общей дисперсии спектральных результатов. Общая дисперсия трехмерной модели характеризовалась суммой 98,27% (80,55%+14,19%+2,73%). Анализ методом ГК позволил разделить ботанические роды на отдельные кластеры.

График нагрузок («карта переменных») для двумерной модели (Рисунок 34) позволил оценить вклад отдельных функциональных групп в результат дискриминационного анализа. Наиболее информативными явились полосы с максимумами при следующих волновых числах, см-1: 1400, 1253, 931, 763. Счеты/баллы ГК («карта образцов») заметно отличались для всех четырёх родов сырья. Так, например, для цветков календулы (1-4) обе ГК1 и ГК2 были положительные, а для листьев эвкалипта (5-7) ГК1 - положительная, ГК2 -отрицательная. Для листьев чабреца (8-11), наоборот, первая ГК1 имела отрицательные значения, а вторая - положительные. Для ЛРС коры дуба обе ГК приобрели отрицательные значения.

i I 'С2 (14,19%)!

I I 'С1 160 55 j|

1 2 3 4 5 в 7 в 9 10 11 12 13 14 ЛРС I Medicinal plant materials

а б

Рисунок 34. Нагрузки (а) и счеты/баллы (б) для двумерной модели анализа ЛРС методом ГК/ в области (1500-650 см-1) «фингерпринт»: 1-4 - календулы цветки; 5-7 - эвкалипта листья; 8-11 - чабреца трава; 12-14 - кора дуба.

Аналогичный анализ трехмерной модели (Рисунок 35) позволил дополнительно выделить вклад отдельных функциональных групп. Третья

компонента ГК3 в первую очередь демонстрирует роль колебательных процессов при волновых числах, см-1: 1317 и 777. Счеты/баллы ГК отличались для всех четырёх видов сырья, так, например, для цветков календулы (1-4) все три компоненты характеризуются положительными значения, листьев эвкалипта (5-7), напротив, практически все ГК - отрицательные значения. Для листьев чабреца (811), лишь ГК2 имела положительные значения, а вторая ГК1 и ГК3 -отрицательные. Для ЛРС коры дуба (12-14) ГК3 - положительная.

Таким образом, картирование образцов легло в основу кластерного разделения ботанических родов (см. Рисунок 34).

1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 12Э4567&9 10 11 12 13 14

Волновое число, см1 / Wav en umber, cm' flPC I Medicinal plant materials

а б

Рисунок 35. Нагрузки (а) и счеты/баллы (б) для двумерной модели анализа ЛРС методом ГК/ в области (1500-650 см-1) «фингерпринт»: 1-4 - календулы цветки; 5-7 - эвкалипта листья; 8-11 - чабреца трава; 12-14 - кора дуба

Согласно требованиям ГФ РФ и международным нормативным документам для валидации методики по показателю «подлинность» единственной необходимой характеристикой является «специфичность» [227].

Для характеристики специфичности метода оценки подлинности ЛРС в библиотеку спектральных данных были включены образцы растительных препаратов неизвестного происхождения («слепые образцы» D1, D2). Кроме того, полученная библиотека данных была дополнена образцами ЛРС, используемого для получения галеновых препаратов другого фармакологического класса -

кардиотонического, седативного, гипотензивного действия: валерианы лекарственной корневища с корнями (К = 5), пустырника трава (К = 5), боярышника плоды (К = 5). При этом общая база данных для включения в первичную матрицу превысило 20 тыс. значений: N = 31 х 913 = 28 303. Анализ методом ГК показал, что неизвестное сырьё заняло область, соответствующую коре дуба, что позволило безошибочно определить природу ЛРС, предоставленное заказчиком (Рисунок 36). Три образца ЛРС выбранной дополнительной фармакологической группы образовали отдельные не перекрывающиеся кластеры.

Рисунок 36. Результаты хемометрической обработки (МГК) ИК-спектров трехмерной модели в области «фингерпринт». ЛРС: 1-4 - календулы цветки; 5-7 -эвкалипта листья; 8-11 - чабреца трава; 12-14 - кора дуба; 15-19 - корневища с корнями валерианы; 20-24 - трава пустырника; 25-29 - плоды боярышника; 01-02 - «слепые образцы».

Методика определения подлинности ботанических родов ЛРС без использования стандартных образов предполагает анализ диспергированного и гомогенизированного растительного сырья методом ИК-Фурье с НПВО в области фингерпринт, накопления большого массива данных (библиотека спектров) и последующую хемометрическую обработку результатов методом главных компонент. Разработанная методика определения подлинности ЛРС разных ботанических родов, сочетающая ИК-спектрометрию НПВО в области 1500-650 см-1 и хемометрическую обработку с использованием МГК анализа позволяет идентифицировать лекарственные растения без применения СО.

3.3.2. Тандем РФА+МГК в определения подлинности растительного сырья

без СО

Элементный профиль ЛРС. Предварительные испытания показали, что для определения элементного профиля лекарственных растений календулы и эвкалипта методом РФА требуется специальная пробоподготовка, которая заключается в высушивании, измельчении и гомогенизации растительного сырья (Рисунок 37).

Рисунок 37. Спектральные характеристики РФА для ЛРС: а - календулы; б -эвкалипта.

После обработки сырья календулы наблюдается увеличение сигнала рентгеновской флуоресценции о для кальция (в 1,8 раза), стронция (в 4,4) и железа (в 4,1 раза). Эвкалипт по сравнении с другими растениями является источником эссенциального микроэлемента - марганца, сигнал которого после пробоподготовки увеличился в 1,3 раза. Как и в случае с календулой, эвкалипт продемонстрировал также увеличение открываемости кальция, стронция и железа.

Тандемный подход, использующий метод РФА и МГК позволил различить лекарственное сырье разных производителей, каждое из которых заняло отдельную область в двумерном и трехмерном пространстве в соответствии с ботаническим родом и рекомендуемыми расстояниями Махалонобиса (>3БВ) [207] (Рисунок 38).

Ш О

со 0

см

О 0_

-1

-2

_ о//1С1паИ\/1о га 9< ЕисЫурй \чттаНя /оИа

гО э 1 1

-1 0 1

РС 1 (71.48%)

Рисунок 38. Результаты хемометрической обработки (МГК) РФА двумерной модели. ЛРС: 1-3 - календулы цветки, 4-6 - эвкалипта листья.

Расширение библиотеки полученными ранее результатами по элементному профилю ЛРС и сухих остатков настоек другой фармакологической группы

продемонстрировал специфичность методики в определении подлинности (Рисунок 38).

Рисунок 39. Результаты хемометрической обработки лекарственное сырья (МГК) РФА двумерной (а) трехмерной (б) модели. ЛРС: 1-3 - календулы цветки, 46 - эвкалипта листья,7-15 - валерианы корневища с корнями, 16-24 - пустырника трава, 25-29 - боярышника плоды.

Таким образом, тандемный подход, включающий данные, полученные методом РФА и их обработку МГК, позволяет отличить ЛРС календулы и эвкалипта. Разработанная методика характеризуется специфичностью и позволяет определить подлинность ЛРП антибактериального и противовоспалительного действия без использования СО.

3.3.3. УФ-спектрофотометрия настоек эвкалипта и календулы в определении

подлинности

Спектры настоек календулы и эвкалипта в ультрафиолетовой области, не могут быть использованы для определения подлинности в связи с присутствием соединений одних и тех же химических классов. Стоит отметить, что лабораторная настойка эвкалипта в отличии от производственных имеет высокую оптическую плотность в при (Х=270 нм), что характеризует высокую степень экстракции активных компонентов (фенольальдегидов) [236] из диспергированного гомогенизированного сырья в (70 %) водно-этанольную смесь (Рисунок 40).

200 250 300 350 400 450 50

Рисунок 40. Электронные спектры настоек календулы (а): заводские - 1-9, лабораторная - L1 и эвкалипта (б): заводские - 1-7, лабораторная -L2.

Хемометрическая обработка спектральных результатов зависимости оптической плотности (A) от длины волны (X) позволила различить природу настоек календулы и эвкалипта. Многомерный анализ 15 различных образцов с выбранным шагом значений волновых чисел (N = 913) позволил оперировать с первичной матрицей, включающей более 9 тысяч значений: N = 15x601 = 9 015. Для характеристики специфичности метода оценки подлинности настоек календулы и эвкалипта были использованы лабораторные настойки календулы и эвкалипта (L1, L2). Анализ методом ГК показал, что лабораторные настойки заняли

области, соответствующие аптечным настойкам календулы и эвкалипта, что позволило их безошибочно определить (Рисунок 41).

«

о

О О.

Л13 Ьисаир ПпсПт а и" 9": II 9а ^ о 9?

15 92 39 5 - Э* Сикп(1Шие /ЬгсГнги

а!

со

2 о

и

и а.

,0а 5 ЕтсчИ Л ^ Ч 11ПСГШ 91 411 9 ® 9» а?

91-2 9? 9м >5 'а 99 * 1мс1иги

-10 11

1012 РСЦвЗ.11%)

РС 1 (85.85% I

Рисунок 41. Результат хемометрической обработки (МГК) настоек при 2Э моделировании: а - при моделировании: 1-9 - календулы; 10-15 - эвкалипта, Ь1-Ь2 - лабораторные настойки календулы и эвкалипта.

Таким образом, разработанная методика определения подлинности галеновых препаратов в УФ-области без использования СО с последующей хемометрической обработкой МГК позволила с высокой вероятностью идентифицировать настойки календулы и эвкалипта. Разработанная методика валидирована по показателю «специфичность».

Прогноз биологической активности ЛРП разных ботанических родов в сравнении с НПВС ш бШсо - метод ККСА

Оценке биологической активности дисперсных систем in vivo предшествовали ККСА исследования компонентов ЛРС разных ботанических родов, обладающих антибактериальным противовоспалительным действием. Это позволило провести последующую интерпретацию результатов с использованием Sp. ambiguum.

Липофильность (logP) - наиболее важное свойство ЛС, определяющее как фармакокинетические, так и токсикокинетические процессы [237]. Липофильность экспериментально оценивают по величине константы распределения между неполярным (октанол) и полярным (вода) растворителем [238]:

logP = 1одСоктаноЛ) (20)

5 3 С (Н2 О)

Увеличение липофильности способствует проникновению АФИ через неполярные слои клеточной мембраны и доступности нативных рецепторов.

Растения разных ботанических родов чаще всего содержат незначительное число специфических, характерных для данного рода соединений. Например, в листьях эвкалипта находят специфические флаваноиды (эвкалиптин) [239] и терпены (1,8-цинеол, эвкалиптол) [240]. Для цветков календулы характерно преобладание каротиноидов [241, 242]. Специфическими компонентами каннабиса являются каннабиноиды, в том числе не проявляющие психоактивность [243], что подтверждает их успешное применение за рубежом в качестве эффективной альтернативы синтетическим НПВС [244]. Обычно в растениях присутствуют различные соединения одних и тех же химических классов - терпенов (терпинеол, а, Р-эудесмол), флавоноидов/гликозидов (кверцетин, кемпферол), кумаринов (кумарин, герниарин, скополетин, дафноретин), летучих эфиров. Обилие этих компонентов затрудняет определение биологической активности ЛРС и приготовленных из него галеновых препаратов.

Сформированная нами библиотека значений липофильности общих и специфических компонентов растений трёх ботанических родов, а именно эвкалипта, календулы и каннабиса, позволила обнаружить взаимно однозначные соответствия между 1о§Р и топологическим индексом Винера (Рисунок 42). В результате расчета индекса Винера для 39 соединений (приложение Ж) были получены пять кластеров, соответствующих пяти химическим классам.

Рисунок 42. Взаимно-однозначные соответствия индекса Винера и липофильности для компонентов ЛРС календулы, эвкалипта и класса

каннабиноидов.

Сравнивая значения липофильностей соединений рассматриваемых классов, можно прогнозировать более высокую проницаемость каротиноидов через клеточную мембрану и следовательно, более высокую биологическую активность в клетке в том числе на модели клеточного биосенсора 8р. ambiguum.

При анализе структур каротиноидов было обнаружено, что удлинение основной цепи, сопровождается увеличением липофильности. Присутствие в молекуле атомов кислорода напротив снижает липофильность (Рисунок 43)

Рисунок 43. Взаимно-однозначные соответствия индекса Винера (W) и липофильности (Log P) для каротиноидов.

Таким образом, содержание в календуле каротиноидов подразумевает более легкое проникновение галеновых препаратов на ее основе через липофильные клеточные мембраны в том числе гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что увеличивает биодоступность и позволяет использовать меньшую терапевтическую дозу по сравнению с другими анальгетиками.

Включение в группу каннабиноидов (тетрагидроканнабиварин, каннабигерол, каннабихромен, П-нор-9-карбокси-Д9-тетрагидроканнабинол, каннабидиварин) их синтетических аналогов (JWH-015, JWH-018, JWH-019, JWH-020, JWH- 022, JWH-122, JWH-210, AM-2201, MAM-2201) продемонстрировало их более высокую липофильность по сравнению с НПВС и опиоидными анальгетиками (Рисунок 44).

■ НПВС

• АНАЛЬГИН

* НАТУРАЛЬНЫЕ КАШАБИНОИДЫ » СИНТЕТИЧЕСКИ КАННАБИНОИДЫ

♦ ОПИОДЫ

_i_I_i_I_._I_>_I_i_I_i_

0 200 400 600 800 1000 1200

W

Рисунок 44. Ваимно-однозначные соответствия индекса Винера для каннабиноидов в сравнении с группой НПВС и опиоидными анальгетиками.

Более высокая биодоступность каннабиноидов по сравнению с группой НПВС позволяет использовать меньшую терапевтическую дозу по сравнению с синтетическими анальгетиками.

Таким образом, полученные корреляции позволяют прогнозировать липофильность любого впервые обнаруженного соединения схожей химической структуры после расчета его топологического индекса Винера без экспериментального исследования.

Контроль дисперсности настоек для последующей оценки их биологической активности методом 8р1то1ох-тест

Для определения кажущейся энергии активации (оЬ8Еа) лиганд-рецепторных взаимодействий методом аррениусовской кинетики с использованием $>р. ambiguum было необходимо оценить дисперсность водных разведений настоек в разных растворителях. Выбор растворителя для проведения поляриметрических измерений проводили по результатам динамического светорассеяния (ОЬБ).

Дисперсность и стабильность водно-спиртовых (70%) разведений настоек. Водно-спиртовые (70%) разведения настоек календулы и эвкалипта по интенсивности оставались прозрачными, но характеризовались полидисперсным распределением с полосами при максимумах (0,6; 4,85; 78,8; 5560) и (4,19; 4800) нм соответственно. При этом объемном распределении характеризовалась размером частиц: для настоек календулы ё < 4 нм, для настоек эвкалипта (4,19; 4800) нм (Рисунок 45).

10000

а б

Рисунок 45. Размерные спектры распределения по интенсивности настоек

(разведение (70%) водно-этанольной смесью 1:100 по объему Ущ^Уобщ): а -

календулы; б - эвкалипта. Вставка - объёмное распределение частиц дисперсной

фазы. (Ы = 3).

Дисперсность и стабильность спиртовых (99,9%) разведений настоек. Разведение настоек хроматографически чистым спиртом (99,9%) приводило к появлению хлопьевидного осадка с размерами частиц при максимумах 825 нм и 5,6 мкм для календулы и 531 нм и 5,6 мкм для эвкалипта (Рисунок 46).

а б

Рисунок 46. Размерные спектры распределения по интенсивности настоек

(разведение этанолом (99,9 %) 1:100 по объему Уал:УобЩ): а - календулы; б -эвкалипта. Вставка - объёмное распределение частиц дисперсной фазы. (К = 3).

Дисперсность и стабильность водных разведений настоек. Водные разведения настоек календулы и эвкалипта оставались прозрачными и характеризовались узкой единичной полосой с максимумом при 164 нм и 106 нм соответственно (Рисунок 47).

Рисунок 47. Размерные спектры распределения по интенсивности настоек (разведение высокоомной водой 1:100 по объему Уал:Уобщ): а - календулы; б -эвкалипта. Вставка - объёмное распределение частиц дисперсной фазы. (К = 3).

Несмотря на однотипность спектров распределения частиц дисперсной фазы, значения их электрокинетических потенциалов были различны. Так дзета-потенциал для водного разведения настойки календулы составлял (К = 5; (± ББ): -33,7±2,2 мВ. Это значение характеризовало настойку календулы в соответствующем разведении как устойчивую коллоидную систему [245, 246]. Дзета-потенциал водного разведения настойки эвкалипта оказался примерно вдвое меньше: (К = 5; ( ± ББ): -14,5±1,6 мВ.

Таким образом, монодисперсность, присутствие частиц с размерами в нанометровом диапазоне и достаточно высокие значения электрокинетических потенциалов позволяют характеризовать коллоидные системы как стабильные. Это позволило использовать их для оценки их биологической активности, используя аррениусовскую кинетику [247]. Наночастицы, обнаруженные в водных разведениях настоек, могут играть роль переносчиков биологически активных компонентов в клетку, например, путем эндоцитоза [248].

3.5.1. Контроль дисперсности настоек при рН, иммитирующие рН разных

биологических сред организма

Один из способов применения настойки календулы - пероральный. Особый интерес представляло, исследования дисперсности in vitro водного разведения настойки в разных буферных растворах при pH, имитирующих биологические среды организма. В модельном растворе - аналоге желудочному соку (pH = 1,2) наблюдается монодисперсная полоса распределения частиц по интенсивности со среднем максимумом при (N = 5; d ± SD, нм): 250 ± 7. Как видно, происходит укрупнение частиц дисперсной фазы по сравнению с водным раствором (см. Рисунок 47). В среде, имитирующей содержимое тонкого кишечника в отсутствие ферментов, т.е. в период между приемами пищи (pH = 6,8), размерный спектр дисперсной фазы по интенсивности практически не отличается от водного разведения, и его средний максимум приходится на 154 ± 7 нм (Рисунок 48).

Рисунок 48. Размерные спектры распределения по интенсивности водного разведения настойки календулы (1:100) (разведение буферными растворами 1:100 по объему Уал:Уобщ): а - pH = 1,2; б - pH = 6,8. Вставка - объёмное распределение частиц дисперсной фазы. (К = 5).

Таким образом, в средах, желудочного сока и тонкого кишечника, водные разведения настойки календулы сохраняют размер частиц в нанометровом диапазоне, что обеспечивает её высокую биодоступность биологически активных компонентов.

3.6. Оценка биологической активности настоек эвкалипта и календулы

in vitro

Ранее была рассмотрена возможность корреляции между полулетальными дозами фармацевтических субстанций (LD50) и наблюдаемой (кажущейся) энергией активации (obsEa) гибели одноклеточного организма [249]. Такой подход базируется на понятии лиганд-рецепторных взаимодействий между рецептором нативных структур и биологически активными соединениями, достигающих соответствующих активных центров. Представляло интерес выяснить, какое место в соответствующих корреляционных зависимостях «obsEa-LD50» займут компоненты настоек. Для дополненная диаграммы нами, во-первых, был осуществлен литературный поиск значений LD50 как самих настоек, так и их химических компонентов. Во-вторых, в рамках аррениусовской кинетики была исследована биологическая активность водных разведений обеих настоек.

Литературные данные по токсичности экстрактов листьев эвкалипта и цветков календулы оказались трудно сравнимыми, так как они относятся к разным лекарственным формам, разным животным и разным способам введения. Например, Европейское медицинское агентство приводит значения острой токсичности эвкалиптового масла LD50 (мыши, per os) = 4400 мг/кг [196]. Значение для водно-этанольного (30 %) экстракта календулы при подкожном введении на порядок ниже: LD50 (мыши, подкожно) = 450 мг/кг [250].

Присутствующие в настойках биологически активные соединения участвуют в лиганд-рецепторных взаимодействиях на клеточном уровне организма. Использование в качестве модели одноклеточного объекта -инфузории Sp.

ambiguum позволяет обобщить механизмы таких взаимодействий, представив их известной схемой:

быстро медленно

С (клетка)+пЬ —С • Ьп ^ БС (смерть клетки)

По результатам зависимости времени жизни Бр. ambiguum было выбрано водное разведение 1:7. Исследование было проведено в диапазоне температур от 22 до 30 °С по пять измерений, затем были рассчитаны средние значения и стандартные отклонения (Рисунок 49).

1,*С СС

а б

Рисунок 49. Температурная зависимость продолжительности жизни Бр. ambiguum в водном разведении (1:7) для настоек: а - календулы; б - эвкалипта. (К = 5).

Использование аррениусовских координат скорости гибели Бр. ambiguum от температуры («1пк-1/Т»), позволило рассчитать значения кажущиеся энергии активации гибели Бр. ambiguum как для экстрагента, так и для настоек календулы и эвкалипта (Рисунок 50).

■3,6

-3,6

¡^ -4.2

с -4.4

-4.6

-4,6

у * -12,3* + 36,9 И =

9

■3,0

-3,5

£ -4.5

-5.0

■6,5

-

*

4 I

У ~ | -19,1* +■ 59,1 0,Э6В • • ■

3,32

3,34

3.36

3,3В

1000ГГ, К"1

а

3,30 3.3? 3,34 э.з*

юсо/тгк1

6

Рисунок 50. Скорость гибели Бр. ambiguum от температуры (аррениусовские координаты) в настойках: а - календулы; б - эвкалипта (водные разведения 1:7). (К

= 5).

Как оказалось, более высокие значения оЬ8Ба (меньшая токсичность) характерна для 70% этанола в тех же объёмных разведениях, которые были выбраны для настоек (Таблица 21).

Таблица 21. Энергии активаций гибели Бр. ambiguum в настойках и этаноле при разведении водой (1:7), (К = 5).

Настойка/ экстрагент °Ь*Еа± 8Б, кДж/моль

Календулы 103±18

Эвкалипта 159±5

Водно-этанольная смесь, 70 % 258±8

Полученные значения кажущейся энергии активации гибели Бр. ambiguum свидетельствуют о большей биологической активности/токсичности настойки календулы по сравнению с настойкой эвкалипта. Проведенный литературный анализ свидетельствует о значительном содержании в цветках календулы каротиноидов [118-253]. Следует подчеркнуть, что в литературе отсутствуют

данные о присутствии каротиноидов в листьях эвкалипта. Как следует из проведенного ККСА-моделирования, каротиноиды обладают самой высокой липофильностью по сравнению с другими компонентами растений, включая каннабиноиды (см. Рисунок 41). Это в значительной мере определило их биодоступность, а значит и токсичность для выбранной клеточной модели -инфузории Sp. ambiguum.

Статистически различимые значения энергий активаций разведений обоих настоек и 70%-ого этанола позволяют расположить их в ряд роста токсичности: этанол < эвкалипт < календула.

Полученные результаты определения кажущейся энергии активации obsEa гибели Sp. ambiguum в аррениусовских координатах позволили дополнить имеющуюся диаграмму «obsEa-LD50» и осуществить прогнозирование токсичности (LD50, крысы, per os) (Рисунок 51).

Рисунок 51. Диаграммы взаимных соответствий между энергией активации гибели клеточного биосенсора оЬ!5Еа и LD50 (мг/кг) для лабораторных животных (крысы, per os) в полулогарифмических координатах: а - для настоек и органических соединений; б -для настоек.

Из диаграммы следует, что прогнозируемая комбинированная токсичность настойки календулы (199 мг/кг) превышает токсичность настойки эвкалипта (1000 мг/кг). Сравнение полученных результатов с настойками другой

фармакологической группы [254] , а именно с настойками пустырника, боярышника и валерианы в разных разведениях свидетельствуют, о еще большей комбинированной токсичности настойки пустырника по сравнению с настойкой календулы. Стоит отметить, что токсичность водных разведений настоек календулы (1:7) и пустырника (1:10) эквивалентны токсичности водного раствора фенола в низкой концентрации (3,55 ммоль/л) (оЬ*Еа = 108 кДж/ моль). Высокая токсичность обуславливается возможным присутствием в настойке календулы пирролизидиновых алкалоидов (интермедин №оксид, европин, европин-Ы-оксид, оксиматрин, ретросин, исатидин и др.), обладающие острой токсичностью [171].

В диссертации разработан комплексный подход к контролю качества противовирусных и антибактериальных ЛС на основе оптических, электрохимических, хемометрических и биокинетических методов. Результаты оценки дисперсности УЬР-вакцин были внедрены в практику предприятия-разработчика в виде стандарта «Метод контроля стабильности УЬР - вакцин», № 01897357-002-2023. Продемонстрировано применения оптических и электрохимических методов анализа для оценки доброкачественности галеновых препаратов. Разработанный подход определения подлинности ЛРП антибактериального и противовоспалительного действия, основанный на хемометрической (МГК) обработке спектральных данных (ИКФС НПВО, РФА, УФ) использован для определения подлинности ботанического рода ЛРП в отсутствие СО. Оценка методом ККСА липофильности компонентов ЛРП в сравнении с НПВС позволяет прогнозировать их биодостуность без экспериментальных исследований на животных. Разработанные методом $>ргто1ох-тест диаграммы «оЬ!5Еа - ЬЭ50» настоек календулы и эвкалипта важны для оценки, комбинированной токсичности их компонентов.

1. Разработан комплексный подход к контролю качества некоторых противовирусных и антибактериальных лекарственных средств на основе спектральных, электрохимических, хемометрических и биологических методов.

2. Разработана методика оценки стабильности УЬР-вакцин нового поколения на основе метода динамического светорассеяния (ЭЬБ). Установлено, что вакцины характеризуются монодисперсным распределением ( с1 ± БЭ), нм: Гам-УЬР-мультивак (169 ± 3); Гам-УЬР-рота (168 ± 2). Значения электрокинетического потенциала (( ± БЭ), мВ: Гам-УЬР-мультивак (-34,5 ± 0,7) и Гам-УЬР- рота (-43,0 ± 0,4) свидетельствуют о высокой стабильности вакцин как коллоидных систем. Результаты включены в стандарт предприятия «Метод контроля стабильности УЬР вакцин», № 01897357-002-2023.

3. Продемонстрирована возможность использования:

поляриметрии для идентификации настоек календулы и эвкалипта (3-х

кратные различия угла оптического вращения а°) и отличия их от с настоек других ботанических родов;

удельной электропроводности и рН для экспрессного обнаружения недоброкачественной продукции;

ГХ-МС для обнаружения биомаркеров: календулы - 7-ацетил-2-гидрокси-2-метил-5-изопропилбицикло[4,3,0]нонана (эпизонарен) и эвкалипта - 1,8-цинеола (эвкалиптол).

4. Разработаны методики определения подлинности ЛРП разных ботанических родов (календулы, эвкалипта, коры дуба, чабреца травы) без использования СО путем обработки спектральных данных (ИКФС НПВО, РФА, УФ) МГК. Методики определения подлинности охарактеризованы по фармакопейному валидационному параметру - специфичности.

5. Разработаны ККСА-диаграммы для сравнительной характеристики липофильных свойств (^Р) компонентов растений и синтетических ЛС класса НПВС, позволяющие оценить различия в их биодоступности.

6. На основе аррениусовской кинетики (^ргто1ох-тест) оценена комбинированная биологическая активность настоек (оЬ!5Еа ± SD), кДж/моль: календулы (103 ± 2) и эвкалипта (159 ± 5), что позволило дополнить корреляционную диаграмму «о1мЕа - ЬВ50».

AUC - area under curve / площадь под кривой

DLS - dynamic light scattering / динамическое светорассеяние

obsEa - кажущаяся энергия активации биологической активности соединений

HSV-1 / ВПГ-1 - human alphaherpesvirus 1 / вирус простого герпеса типа 1

IC50 / ИД50 - half-maximal inhibitory concentration / ингибирующая доза

LALLS - low-angle laser light scattering / малоугловое рассеяние лазерного

света

LD5o/ЛД5o - lethal dose / полулетальная доза

LogP - логарифм отношения концентраций исследуемой субстанции в октаноле и в воде (Соктанол/Свода)

NDDS / НСДЛ - novel drug delivery system / новая система доставки лекарств Ph. Eur. - European Pharmacopoeia / фармакопея Евросоюза RSD - relative standard deviation / относительное стандартное отклонение SD - стандартное отклонение

SI / ХТИ - selectivity index / химико-терапевтический индекс USP NF - United States Pharmacopeia and National formulary / Фармакопея США и Национальный формуляр

VLP - virus like particles / вирусоподобные частицы

Vал - объем аликвоты

^^общ - общий объем

W - топологический индекс Винера

А8-ТГК - Д8-тетрагидроканнабинол

А9-ТГК - Д9-тетрагидроканнабинол

ААС - атомно-абсорбционная спектроскопия

АПК - антигенпрезентующие клетки

АСМ - атомно-силовоя микроскопия

АЭС - атомно-эмиссионная спектроскопия

АФИ - активный фармацевтический ингредиент

фазой

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота ГК/PC - главная компонента/principal component ГЛФ - готовая лекарственная форма

ГФ РФ - государственная фармакопея Российской Федерации ГХ-МС - газовая хроматография с селективным масс-детектированием ГЭБ - гематоэнцефалический барьер ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дцРНК - двуцепочечная рибонуклеиновая кислота ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ИБЛП - иммунобиологические лекарственные препараты ИКФС НПВО - инфракрасная спектроскопия нарушенного полного внутреннего отражения с Фурье преобразованием КБД - каннабидиол КЖ - культуральная жидкость

ККСА/QSAR - количественная корреляция структура-активность/quantitative structure - activity relationship

крио-ЭМ - криоэлектронная микроскопия

ЛП - лекарственный препарат

ЛРП - лекарственный растительный препарат

ЛРС - лекарственное растительное сырье

ЛС - лекарственное средство

ЛФ - лекарственная форма

МГК/PCA - метод главных компонент/principal component analysis

МС - масс-спектрометрия

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

НАА - нейтронно-активационный анализ

НПВС - нестероидные противовоспалительные лекарственные средства

НПР - нежелательные побочные реакции

ОФС - общая фармакопейная статья

ПО - программное обеспечение

ПТМ - посттрансляционные модификацийи

ПЦР - полимеразной цепной реакции

Р. н. - регистрационный номер

РФА - рентгенофлуоресцентный анализ

СО - стандартный образец

СТП - стандарт предприятия

ТГВ - тетрагидроканнабиварин

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

УФ - ультрафиолетовая (спектрофотометрия)

ФНО - фактор некроза опухолей

ФС - фармакопейная статья

ЦОГ-2 - циклооксигеназа-2

1. Liu, С. On Drug-Membrane Permeability of Antivirals for SARS-CoV-2 / C. Liu, P. Elvati, A. Violi // J Phys. Chem. Lett. - 2021. - № 11;12(5). P. 1384-1389. DOI: 10.1021/acs.jpclett.0c02397.

2. Aungst, B. J. / Novel Formulation Strategies For Improving Oral Bioavailability of Drugs with Poor Membrane Permeation or Presystemic Metabolism // J. Pharm. Sci. - 1993. - № 82. P. 979-987.

3. Le, Z. Hydrogen-bonded tannic acid-based anticancer nanoparticle for enhancement of oral chemotherapy / Z. Le, Y. Chen, H. Han, H. Tian, P. Zhao, C. Yang, Z. He, L. Liu, K. W. Leong, H-Q. Mao, Z. Liu, Y. Chen // ACS Appl Mater Interfaces. -2018. - № 10(49). P. 42186-42197. D0I:10. 1021/acsami.8b18979

4. Wang, Y. The Influence of Nanoparticle Properties on Oral Bioavailability of Drugs / Y. Wang, C. Pi, X. Feng, Y. Hou, L. Zhao, Y. Wei // Int J Nanomedicine. -2020. - №24(15). P. 6295-6310. DOI: 10.2147/IJN.S257269.

5. Hu, L. Solid lipid nanoparticles (SLNs) to improve oral bioavailability of poorly soluble drugs / L. Hu, X. Tang, F. Cui // J. Pharm. Pharmacol. - 2004. - №56(12). P. 1527-1535. DOI: 10.1211/0022357044959

6. Das, S. Recent advances in lipid nanoparticle formulations with solid matrix for oral drug delivery / S. Das, A. Chaudhury // AAPS PharmSciTech. - 2011. - № 12(1):62. P.76. DOI: 10.1208/s12249-010-9563-0.

7. Li, H. Size-exclusive effect of nanostructured lipid carriers on oral drug delivery / H. Li, M. Chen, Z. Su, M. Sun, Q. Ping // Int. J. Pharm. - 2016. - №511(1). P. 524-537. DOI:10.1016/j.ijpharm.2016.07.049

8. Кочегаров И. И., Трусов В. А., Юрков Н. К. Методы контроля дисперсности порошков // НиКа. 2010. №. URL: https://cyberleninka.ru/article/n7metody-kontrolya-dispersnosti-poroshkov (дата обращения: 31.10.2023).

9. Общая фармакопейная статья 1.4.1.0017.15 Эмульсии / Государственная фармакопея Российской Федерации. - 2018. [Электронное

издание]. - Режим доступа: https://docs. rucml. ru/feml/pharma/v14/vol2/119/#zoom=z (дата обращения: 31.11.2023).

10. Общая фармакопейная статья 1.4.1.0010.15 Порошки / Государственная фармакопея Российской Федерации. 2018. [Электронное издание]. - Режим доступа: https://docs.rucml.ru/feml/pharma/v14/vol2/93/ (дата обращения: 31.11.2023).

11. Общая фармакопейная статья 1.4.1.0008.15 Мази / Государственная фармакопея Российской Федерации. 2018. [Электронное издание]. - Режим доступа: https://docs.rucml.ru/feml/pharma/v 14/vol2/79/#zoom=z (дата обращения: 31.11.2023).

12. Общая фармакопейная статья 1.4.1.0014.15 Суспензии / Государственная фармакопея Российской Федерации. 2018. [Электронное издание]. - Режим доступа: https://docs. rucml. ru/feml/pharma/v14/vol2/119/#zoom=z (дата обращения: 31.11.2023).

13. Clogston, J.D. Zeta potential measurement. / J.D. Clogston, A.K. Patri // J. Methods Mol Biol. - 2011. № 697. P. 63-70. DOI: 10.1007/978-1-60327-198-1_6.

14. Kim, Y.H. Preclinical efficacy and safety assessment of nano-oxaliplatin oral formulation prepared by novel Fat Employing Supercritical Nano System / K. Y.H., S.J. Lee, S.H. Lee, M.Hahn // Pharm Dev Technol. - 2012. - № 17(6). - Р.677- 86.

15. Микиртичан, Г.Л. Из истории вакцинопрофилактики: оспопрививание / Г.Л. Микиртичан // Российский педиатрический журнал. -2016. - №1. - Режим доступа: https://cyberleninka.ru/article/n/iz-istorii-vaktsinoprofilaktiki-ospoprivivanie (дата обращения: 05.07.2023).

16. WHO commemorates the 40th anniversary of smallpox eradication [электронный ресурс]. - World Health Organization. - 2019. - Режим доступа: https://www.who.int/news/item/13-12-2019-who-commemorates-the-40th-anniversary-of-smallpox-eradication (дата обращения: 05.07.2023)

17. Маркиш, Д. МАХАТМА Вольные фантазии из жизни самого неизвестного человека / Д. Маркиш // М. Буки Веди. - 2020. - Р.224.

18. Steele, JC Jr. Rotavirus / JC Jr. Steele, // Clin Lab Med. - 1999. - №19(3). P. 691-703.

19. Kirkwood, C.D. The rotavirus vaccine development pipeline / Kirkwood CD, Ma LF, Carey ME, Steele AD. // Vaccine. - 2019. - №28;37(50). P. 7328-7335. DOI: 10.1016/j.vaccine.2017.03.076.

20. Phelan, A. L. The Novel Coronavirus Originating in Wuhan, China: Challenges for Global Health Governance / A.L. Phelan, R. Katz, L. O.Gostin / JAMA. - 2020. - №25;323(8). P. 709-710. DOI: 10.1001/jama.2020.1097.

21. Wang, C. A novel coronavirus outbreak of global health concern / C. Wang, P.W. Horby, F.G. Hayden, G.F. Gao // Lancet. - 2020. - №15;395(10223). P. 470-473. DOI: 10.1016/S0140-6736(20)30185-9.

22. Khot, W.Y. The 2019 Novel Coronavirus Outbreak - A Global Threat / W.Y. Khot, M. Y. Nadkar // J Assoc Physicians India. - 2020. - №68(3). P. 67-71.

23. Owen, D.R. An oral SARS-CoV-2 Mpro inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19 / C.M.N. Allerton, A.S. Anderson, L. Aschenbrenner, M. Avery, S. Berritt, B. Boras, R.D. Cardin, A. Carlo, K.J. Coffman, A. Dantonio, L. Di, H. Eng, R. Ferre, K.S. Gajiwala, S.A. Gibson, S.E. Greasley, B.L. Hurst, E.P. Kadar, A.S. Kalgutkar, J.C. Lee, J. Lee, W. Liu, S.W. Mason, S. Noell, J.J. Novak, R.S. Obach, K. Ogilvie, N.C. Patel, M. Pettersson, D.K. Rai, M.R. Reese, M.F. Sammons, J.G. Sathish, R.S.P. Singh, C.M. Steppan, A.E. Stewart, J.B. Tuttle, L. Updyke, P.R. Verhoest, L. Wei, Q. Yang, Y. Zhu // Science. - 2021. - № 24;374(6575). P. 1586-1593. DOI: 10.1126/science.abl4784.

24. Muralidar, S. The emergence of COVID-19 as a global pandemic: Understanding the epidemiology, immune response and potential therapeutic targets of SARS-CoV-2 / S. Muralidar, S.V. Ambi, S. Sekaran, U.M. Krishnan. // Biochimie. -2020. - №179. P. 85-100. DOI: 10.1016/j.biochi.2020.09.018.

25. Corbett, K.S. SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness / K.S. Corbett, D.K. Edwards, S.R. Leist, O.M. Abiona, S. Boyoglu-Barnum, R.A. Gillespie, S. Himansu, A. Schäfer, C.T. Ziwawo, A.T. DiPiazza, K.H. Dinnon, S.M. Elbashir, C.A. Shaw, A. Woods, E.J. Fritch, D.R. Martinez, K.W. Bock, M. Minai, B.M. Nagata, G.B. Hutchinson, K. Wu, C. Henry, K. Bahl, D. Garcia-

Dominguez, L. Ma, I. Renzi, W.P. Kong, S.D. Schmidt, L. Wang, Y. Zhang, E. Phung, L.A. Chang, R.J. Loomis, N.E. Altaras, E. Narayanan, M. Metkar, V. Presnyak, C. Liu, M.K. Louder, W. Shi, K. Leung, E.S. Yang, A. West, K.L. Gully, L.J. Stevens, N. Wang, D. Wrapp, N.A. Doria-Rose, G. Stewart-Jones, H. Bennett, G. S. Alvarado, M.C. Nason, T.J. Ruckwardt, J.S. McLellan, M.R. Denison, J. D. Chappell, I. N. Moore, K. M. Morabito, J. R. Mascola, R. S. Baric, A. Carfi, B. S. Graham // Nature. - 2020. -№586(7830). P. 567-571. DOI: 10.1038/s41586-020-2622-0.

26. Jackson, L.A. mRNA-1273 Study Group. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report / L.A. Jackson, E.J. Anderson, N.G. Rouphael, P.C. Roberts, M. Makhene, R.N. Coler, M.P. McCullough, J.D. Chappell, M.R. Denison, L.J. Stevens, A.J. Pruijssers, A. McDermott, B. Flach, N.A. Doria-Rose, K.S. Corbett, K.M. Morabito, S. O'Dell, S.D. Schmidt, P.A. Swanson, M. Padilla, J.R. Mascola, K.M. Neuzil, H. Bennett, W. Sun, E. Peters, M. Makowski, J. Albert, K. Cross, W. Buchanan, R. Pikaart-Tautges, J.E. Ledgerwood, B.S. Graham, J. H. Beigel. // N Engl J Med. - 2020. - № 12;383(20). P. 1920-1931. DOI: 10.1056/NEJMoa2022483.

27. Folegatti P.M. COVID Vaccine Trial Group. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial / P.M. Folegatti, K.J. Ewer, P.K. Aley, B. Angus, S. Becker, S. Belij-Rammerstorfer, D. Bellamy, S. Bibi, M. Bittaye, E.A. Clutterbuck, C. Dold, S.N. A. Faust, Finn, A.L. Flaxman, B. Hallis, P. Heath, D. Jenkin, R. Lazarus, R. Makinson, A. M. Minassian, K. M. Pollock, M. Ramasamy, H. Robinson, M. Snape, R. Tarrant, M. Voysey, C. Green, A. D. Douglas, A. V. S. Hill, T. Lambe, S. C. Gilbert, A. J. Pollard // Lancet. - 2020. - №15;396(10249). P. 467-478. DOI: 10.1016/S0140-6736(20)31604-4.

28. Bown, C.P. How COVID-19 vaccine supply chains emerged in the midst of a pandemic / C. P. Bown, T. J.Bollyky // World Econ. - 2022. - №45(2). P. 468-522. DOI: 10.1111/twec.13183.

29. Logunov, DY. Gam-COVID-Vac Vaccine Trial Group. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia / DY. Logunov, I. V.

Dolzhikova, D. V. Shcheblyakov, A. I. Tukhvatulin, O. V. Zubkova, A. S. Dzharullaeva, A. V. Kovyrshina, N. L. Lubenets, D. M. Grousova, A. S. Erokhova, A. G. Botikov, F. M. Izhaeva, O. Popova, T. A. Ozharovskaya, I. B. Esmagambetov, I. A. Favorskaya, D. I. Zrelkin, D. V. Voronina, D. N. Shcherbinin, A. S. Semikhin, Y. V. Simakova, E. A. Tokarskaya, D. A. Egorova, M. M. Shmarov, N. A. Nikitenko, V. A. Gushchin, E. A. Smolyarchuk, S. K. Zyryanov, S. V. Borisevich, B. S. Naroditsky, A. L. Gintsburg // Lancet. - 2021. - №20;397(10275). P. 671-681. DOI: 10.1016/S0140-6736(21)00234-8.

30. Leao, J.C, Coronaviridae-Old friends, new enemy! / J.C Leao, T.P.L. Gusmao, A.M. Zarzar, J.C. Leao Filho, A. Barkokebas Santos de Faria, I.H. Morais Silva, L.A.M. Gueiros, N.A. Robinson, S. Porter, A.A.T. Carvalho // Oral Dis. - 2022. - № 1. P. 858-866. DOI: 10.1111/odi.13447.

31. Lu, R. Genomic Characterisation and Epidemiology of 2019 Novel Coronavirus: Implications for Virus Origins and Receptor Binding / R. Lu; X. Zhao; J. Li, P. Niu; B. Yang, H. Wu, W. Wang, H. Song, B. Huang, N. Zhu // Lancet. - 2020. -№395. P. 565-574.

32. Dormitzer, P.R. Structure-Based Antigen Design: A Strategy for next Generation Vaccines / P.R. Dormitzer, J.B. Ulmer, R. Rappuoli // Trends Biotechnol. -2008. - №26. P.659-667.

33. Liu, Y. Neutralizing Activity of BNT162b2-Elicited Serum / Y. Liu, J. Liu, H. Xia, X. Zhang, C.R. Fontes-Garfias, K.A. Swanson, H. Cai, R. Sarkar, W. Chen, M. Cutler, et al. // N. Engl. J. Med. - 2021. - №384, P.1466-1468.

34. Fehr, A.R. Coronaviruses: an overview of their replication and pathogenesis / A.R. Fehr, S. Perlman // Methods Mol Biol. - 2015. - №1282. P.1-23. DOI: 10.1007/978-1 -4939-2438-7_1.

35. Neuman, B.W. Proteomics Analysis Unravels the Functional Repertoire of Coronavirus Nonstructural Protein 3 / J.S. Joseph, K.S. Saikatendu, P. Serrano, A. Chatterjee, M.A. Johnson, L. Liao, J.P. Klaus, J.R. Yates, K. Wuthrich, C.S. Raymond, J.B. Michael, K. Peter // J. Virol. - 2008. - №82. P.5279-5294.

36. Pervushin, K. Structure and Inhibition of the SARS Coronavirus Envelope Protein Ion Channel / E. Tan, K. Parthasarathy, X. Lin, F.L. Jiang, D. Yu, A.

Vararattanavech, T.W. Soong, D.X. Liu, J. Torres // PLoS Pathog. - 2009. - №№5(7). DOI: 10.1371/journal.ppat.1000511

37. Boscarino, J.A. Envelope Protein Palmitoylations Are Crucial for Murine Coronavirus Assembly / J.A. Boscarino; H.L. Logan, J.J. Lacny, T.M. Gallagher // J. Virol. - 2008. - №82. P.2989-2999. DOI: 10.1128/JVI.01906-07. Epub 2008 Jan 9.

38. Ruch, T.R. The Hydrophobic Domain of Infectious Bronchitis Virus E Protein Alters the Host Secretory Pathway and Is Important for Release of Infectious Virus / T.R. Ruch, C.E. Machamer // J. Virol. - 2011. - №85. P.675-685. DOI: 10.1128/JVI.01570-10. Epub 2010 Nov 3.

39. Kumar, S. Structural, Glycosylation and Antigenic Variation between 2019 Novel Coronavirus (2019-NCoV) and SARS Coronavirus (SARS-CoV) / S. Kumar, V.K. Maurya, A.K. Prasad, M.L.B. Bhatt, S.K. Saxen // VirusDisease. - 2020. - №31. P.13-21.

40. Singh Tomar, P.P. SARS-CoV-2 E Protein Is a Potential Ion Channel That Can Be Inhibited by Gliclazide and Memantine / P.P. Singh Tomar, I.T. Arkin // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2020. - №530. P.10-14.

41. Nieto-Torres, J.L. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus E Protein Transports Calcium Ions and Activates the NLRP3 Inflammasome / J.L. Nieto-Torres, C. Verdiá-Báguena, J.M. Jimenez-Guardeño, J.A. Regla-Nava, C. Castaño-Rodriguez, R. Fernandez-Delgado, J. Torres, V.M. Aguilella, L. Enjuanes // Virology. -2015. - № 485. P.330-339.

42. Chang, C. Modular Organization of SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein / C. Chang, S.C. Sue, T. Yu, C.-M. Hsieh, C.-K. Tsai; Y.-C. Chiang, S. Lee, H. Hsiao, W.-J. Wu, W.-L. Chang // J. Biomed. Sci. - 2006. - №13. P. 59-72. DOI: 10.1007/s11373-005-9035-9. Epub 2005 Oct 14.

43. Li, F.Q. Sumoylation of the Nucleocapsid Protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus / F.Q. Li, H. Xiao, J.P. Tam, D.X Liu // FEBS Lett. - 2005. - №579. P.2387-2396. DOI: 10.1016/j.febslet.2005.03.039

44. Plescia, C.B. SARS-CoV-2 Viral Budding and Entry Can Be Modeled Using BSL-2 Level Virus-like Particles / C.B. Plescia, E.A. David, D. Patra, R. Sengupta, S. Amiar, Y. Su, R. Stahelin // J. Biol. Chem. - 2021. - №296.

45. Kuo, L. Recognition of the Murine Coronavirus Genomic RNA Packaging Signal Depends on the Second RNA-Binding Domain of the Nucleocapsid Protein / L. Kuo, C.A. Koetzner, K.R. Hurst, P.S. Masters // J. Virol. - 2014. - №88. P.4451-4465.

46. Kang, S. Crystal Structure of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein RNA Binding Domain Reveals Potential Unique Drug Targeting Sites / S. Kang, M. Yang, Z. Hong, L. Zhang, Z. Huang, X. Chen, S. He, Z. Zhou, Z. Zhou, Q. Chen, Y. Yan, Z. Changsheng, S. Hong, C. Shoudeng // Acta Pharm. Sin. B. - 2020. - №10. P.1228-1238. DOI: 10.1016/j.apsb.2020.04.009

47. Chang, C. Transient Oligomerization of the SARS-CoV N Protein-Implication for Virus Ribonucleoprotein Packaging. / C.-M.M. Chen, M. Chiang, Y. Hsu, T. Huang // PLoS ONE. - 2013. - №8, DOI: 10.1371/journal.pone.0065045

48. Yao, H. Molecular Architecture of the SARS-CoV-2 Virus / H. Yao, Y. Song, Y. Chen, N. Wu, J. Xu, C. Sun, J. Zhang, T. Weng, Z Zhang, Z. Wu, L. Cheng, D. Shi, X. Lu, J. Lei, M. Crispin, Y. Shi, L. Li, and S. Li // Z.Cell. - 2020. - №183. P.730-738. DOI: 10.1016/j.cell.2020.09.018

49. Caldas, L.A. Ultrastructural Analysis of SARS-CoV-2 Interactions with the Host Cell via High Resolution Scanning Electron Microscopy / F.A. Carneiro, L.M. Higa, F.L. Monteiro, G.P. da Silva, L.J. da Costa, E.L. Durigon, A. Tanuri, W. de Souza, // Sci. Rep. -2020. - №10. DOI: 10.1038/s41598-020-73162-5.

50. Kuo, L. Recognition of the Murine Coronavirus Genomic RNA Packaging Signal Depends on the Second RNA-Binding Domain of the Nucleocapsid Protein / L. Kuo, C.A. Koetzner, K.R. Hurst, P.S. Masters // J. Virol. - 2014. - №88. P.4451-4465. DOI: 10.1128/JVI.03866-13

51. Hurst, K.R. An Interaction between the Nucleocapsid Protein and a Component of the Replicase-Transcriptase Complex Is Crucial for the Infectivity of Coronavirus Genomic RNA / K.R. Hurst, R. Ye, S.J. Goebel, P.J ayaraman, P.S. Masters // J. Virol. - 2010. - №84. P.10276-10288. DOI: 10.1128/JVI.01287-10.

52. Zhao, P. Virus-Receptor Interactions of Glycosylated SARS-CoV-2 Spike and Human ACE2 Receptor / P. Zhao, J.L. Praissman, O.C. Grant, Y.Cai, T. Xiao, K.E. Rosenbalm, K. Aoki, B.P. Kellman, R. Bridger, D.H. Barouch, M.A. Brindley, N.E. Lewis, M. Tiemeyer, B. Chen, R.J. Woods, L. Wells // Cell Host Microbe. - 2020. - № 28. P.586-601.

53. Muus, C. Single-Cell Meta-Analysis of SARS-CoV-2 Entry Genes across Tissues and Demographics / C. Muus, M.D. Luecken, G. Eraslan, L. Sikkema, A. Waghray, G. Heimberg, Y. Kobayashi, E.D. Vaishnav, A. Subramanian, C. Smillie, K.A. Jagadeesh, E.T. Duong, E. Fiskin, E. T. Triglia, M. Ansari, P. Cai, B. Lin, J. Buchanan, S. Chen, J. Shu, A. L. Haber, H. Chung, D.T. Montoro, T. Adams at all // Nat. Med. -2021. - №27. P.546-559. DOI: 10.1038/s41591-020-01227-z.

54. Sungnak, W. SARS-CoV-2 Entry Factors Are Highly Expressed in Nasal Epithelial Cells Together with Innate Immune Genes / W. Sungnak, N. Huang, C. Becavin, M. Berg, R. Queen, M. Litvinukova, C. Talavera-Lopez, H. Maatz, D. Reichart, F. Sampaziotis, et al. // Nat. Med. - 2020. - №26. P. 681-687. DOI: 10.1038/s41591-020-0868-6.

55. Mercurio, I. Protein Structure Analysis of the Interactions between SARS-CoV-2 Spike Protein and the Human ACE2 Receptor: From Conformational Changes to Novel Neutralizing Antibodies / I. Mercurio, V. Tragni, F. Busto, A. De Grassi, C.L. Pierri // Cell. Mol. Life Sci. - 2021. - №78, P.1501-1522. DOI: 10.1007/s00018-020-03580-1.

56. Giron, C.C. Up State of the SARS-CoV-2 Spike Homotrimer Favors an Increased Virulence for New Variants / C.C. Giron, A. Laaksonen, F.L. Barroso da Silva // Front. Med. Technol. - 2021. - № 3. DOI: 10.3389/fmedt.2021.694347

57. Letko, M. Functional Assessment of Cell Entry and Receptor Usage for SARS-CoV-2 and Other Lineage B Betacoronaviruses / M. Letko, A. Marzi, V. Munster //. Nat. Microbiol. - 2020. - №5. P.562-569. DOI: 10.1038/s41564-020-0688-y

58. Davies, N.G. Estimated transmissibility and impact of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 in England. Science / S. Abbott, R.C. Barnard, C.I. Jarvis, A.J. Kucharski, J.D. Munday, C.A.B. Pearson, T.W. Russell, D.C. Tully, A.D. Washburne, T. Wenseleers, A.

Gimma, W. Waites, K.L.M. Wong, van K. Zandvoort, J.D. Silverman, K .Diaz-Ordaz, R. Keogh, R.M. Eggo, S. Funk, M. Jit, K.E. Atkins, W.J. Edmunds // Science. - 2020. - №9. P.372. DOI: 10.1126/science.abg3055. Epub 2021 Mar 3.

59. Cosar, B. SARS-CoV-2 Mutations and their Viral Variants / B. Cosar, Z.Y. Karagulleoglu, S. Unal, A.T. Ince, D.B. Uncuoglu, G. Tuncer, B.R. Kilinc, Y.E. Ozkan,

H.C. Ozkoc, I.N. Demir, A. Eker, F. Karagoz, S.Y. Simsek, B. Yasar, M. Pala, A. Demir,

I.N. Atak, A.H. Mendi, V.U. Bengi, G. Cengiz Seval, E. Gunes Altuntas, P. Kilic, D. Demir-Dora // Cytokine Growth Factor Rev. - 2020. - №63. P.10-22. DOI: 10.1016/j.cytogfr.2021.06.001. Epub 2021 Jul 2.

60. Davies, N.G. Estimated Transmissibility and Impact of SARS-CoV-2 Lineage B.1.1.7 in England / S. Abbott, R.C. Barnard, C.I. Jarvis, A.J. Kucharski, J.D. Munday, C.A.B. Pearson, T.W. Russell, D.C. Tully, A.D. Washburne, T. Wenseleers, A. Gimma, W. Waites, K. L.M Wong, K. van Zandvoort, J.D. Silverman, K. Diaz-Ordaz, R. Keogh, R.M. Eggo, S. Funk, M. Jit, K. E. Atkins, W. J. Edmunds // Science. - 2020. -№372. DOI: 10.1126/science.abg3055

61. Plante, J.A. Spike Mutation D614G Alters SARS-CoV-2 Fitness / J.A. Plante, Y. Liu, J. Liu, H. Xia, B.A. Johnson, K.G. Lokugamage, X. Zhang, A.E. Muruato,; J. Zou, C.R. Fontes-Garfias, D. Mirchandani, D. Scharton, J. P. Bilello, Z. Ku, Z. An, B. Kalveram, A. N. Freiberg, V. D. Menachery, X. Xie, K. S. Plante, S. C. Weaver, P.-Y. Shi // Nature. - 2021. - №592. P. 116-121. DOI: 10.1038/s41586-020-2895-3.

62. Tegally, H. Detection of a SARS-CoV-2 Variant of Concern in South Africa / H. Tegally, E. Wilkinson, M. Giovanetti, A. Iranzadeh, V. Fonseca, J. Giandhari, D. Doolabh, S. Pillay, E.J. San, N. Msomi, K. Mlisana, A. von Gottberg, S. Walaza, M. Allam, A. Ismail, T. Mohale, A. J. Glass, S. Engelbrecht, G. Van Zyl, W. Preiser, F. Petruccione, A. Sigal, D. Hardie, G.Marais, N. Hsiao, S. Korsman, M. Davies, L. Tyers, I. Mudau, D. York, C. Maslo, D. Goedhals, S. Abrahams, O. Laguda-Akingba, A. Alisoltani-Dehkordi, A. Godzik, C.K. Wibmer, B.T. Sewell, J. Lourenfo, L. Carlos Junior Alcantara, S.L. Kosakovsky Pond, S. Weaver, D. Martin, R.J. Lessells, J.N. Bhiman, C. Williamson, T. de Oliveira // Nature. - 2021. - №592. P. 438-443. DOI: 10.1038/s41586-021-03402-9.

63. Garcia-Beltran, W.F. Multiple SARS-CoV-2 Variants Escape Neutralization by Vaccine-Induced Humoral Immunity / W.F. Garcia-Beltran, E.C. Lam, K St. Denis, A.D Nitido, Z.H. Garcia, B.M. Hauser, J. Feldman, M.N. Pavlovic, D.J. Gregory, M.C. Poznansky, et al // Cell. - 2021. - №184. P.2372-2383. DOI: 10.1016/j.cell.2021.03.013.

64. Faria, N.R. Genomics and Epidemiology of the P. 1 SARS-CoV-2 Lineage in Manaus, Brazil / N.R. Faria, T.A. Mellan, C. Whittaker, I.M. Claro, D.d.S. Candido, S. Mishra, M.A.E. Crispim,; F.C.S. Sales, I. Hawryluk, J.T. McCrone, et al / Science. -2021. - №372. P.815-821. DOI: 10.1126/science.abh2644.

65. Giron, C.C. Up State of the SARS-CoV-2 Spike Homotrimer Favors an Increased Virulence for New Variants / C.C. Giron, A. Laaksonen, F.L. Barroso da Silva // Front. Med. Technol. - 2021. - №3. DOI: 10.3389/fmedt.2021.694347.

66. Cherian, S. Convergent Evolution of SARS-CoV-2 Spike Mutations, L452R, E484Q, and P681R, in the Second Wave of COVID-19 in Maharashtra, India / S. Cherian, V. Potdar, S. Jadhav, P. Yadav, N. Gupta, M. Das, P. Rakshit, S. Singh, P. Abraham, S. Panda, N. Team // BioRxiv- 2021. - № 9(7). P. 1542. DOI: 10.3390/microorganisms9071542.

67. Bazargan, M., R. Elahi, A. Esmaeilzadeh. OMICRON: Virology, immunopathogenesis, and laboratory diagnosis / M. Bazargan, R. Elahi, A. Esmaeilzadeh. J. Gene Med. - 2022. - №24(7). P. 3435. DOI: 10.1002/jgm.3435.

68. J.L. Bernal. Effectiveness of COVID-19 Vaccines against the B.1.617.2 Variant / Bernal, J.L., N. Andrews, C. Gower, E. Gallagher, R. Simmons, S. Thelwall, J. Stowe, E. Tessier, N.Groves, G. Dabrera, R. Myers, C.N.J. Campbell, G. Amirthalingam, M. Edmunds, M. Zambon, K.E. Brown, S. Hopkins, M. Chand, M. Ramsay // N Engl J Med. - 2021. - №12;385(7). P.585-594. DOI: 10.1056/NEJMoa2108891.

69. Caddy, S. Rotavirus research: 2014-2020 / S. Caddy, G. Papa, A. Borodavka, U. Desselberger // Virus Res. - 2021. - №15;304:198499. DOI: 10.1016/j.virusres.2021.198499.

70. Komoto, S. Rotaviruses / S. Komoto, K. Taniguchi // Uirusu. - 2014. -№64(2). P. 179-90. DOI: 10.2222/jsv.64.179.

71. Mohsen, M.O. The 3Ds in Virus-like Particle Based-vaccines: "Design, Delivery and Dynamics" / M.O. Mohsen, G. Augusto, M.F. Bachmann // Immunol. Rev. - 2020. - №296, P. 155-168. DOI: 10.1111/imr.12863.

72. Mohsen, M. Interaction of Viral Capsid-Derived Virus-Like Particles (VLPs) with the Innate Immune System // M. Mohsen, A. Gomes, M. Vogel, M. Bachmann // Vaccines. - 2018. - № 6. P.37. DOI: 10.3390/vaccines6030037

73. Bangaru, S. Structural Analysis of Full-Length SARS-CoV-2 Spike Protein from an Advanced Vaccine Candidate / S. Bangaru, G. Ozorowski, H.L. Turner, A. Antanasijevic, D. Huang, X. Wang, J.L. Torres, J.K. Diedrich, J.-H. Tian, A.D. Portnoff, N. Patel, M.J. Massare, J.R. 3rd Yates, D. Nemazee, J.C. Paulson, G. Glenn, G. Smith,

A.B. Ward // Science. - 2020. - №370. P. 1089-1094. DOI: 10.1126/science.abe1502

74. Keech, C. Phase 1-2 Trial of a SARS-CoV-2 Recombinant Spike Protein Nanoparticle Vaccine / C. Keech, G. Albert, I. Cho, A. Robertson, P. Reed, S. Neal, J.S. Plested, M. Zhu, S. Cloney-Clark, H. Zhou, G. Smith, N. Patel, M.B. Frieman, R.E. Haupt, J. Logue, M. McGrath, S. Weston, P.A. Piedra, C. Desai, K. Callahan, M. Lewis, P. Price-Abbott, N. Formica, V. Shinde, L. Fries, J.D. Lickliter, P. Griffin, B. Wilkinson, G.M. Glenn // N. Engl. J. Med. - 2020. - № 383, P. 2320-2332. DOI: 10.1056/NEJMoa2026920

75. Tariq, H. Virus-Like Particles: Revolutionary Platforms for Developing Vaccines Against Emerging Infectious Diseases / H. Tariq, S. Batool, S. Asif, M. Ali,

B.H. Abbasi // Front Microbiol. - 2022. - №3. P. 12:790121. DOI: 10.3389/fmicb.2021.790121

76. Lu, W. Review: A systematic review of virus-like particles of coronavirus: Assembly, generation, chimerism and their application in basic research and in the clinic / W. Lu, Z. Zhao, Y.W. Huang, B. Wang // Int J Biol Macromol. - 2022. - №1;200. P. 487-497. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2022.01.108

77. Lua, L.H. Bioengineering virus-like particles as vaccines / L.H. Lua, N.K. F. Connors, Y.P.Sainsbury, N.Chuan, A.P. Wibowo, // Middelberg Biotechnol Bioeng. -2014. - №111(3). P. 425-40. DOI: 10.1002/bit.25159.

79. Shytuhina, A. Development and application of a reversed-phase highperformance liquid chromatographic method for quantitation and characterization of a Chikungunya virus-like particle vaccine / A. Shytuhina, P. Pristatsky, J. He, D.R. Casimiro, R.M. Schwartz, V.M. Hoang, S. J. Ha // Chromatogr A. - 2014. - № 17;1364. P. 192-7. DOI: 10.1016/j.chroma.2014.05.087.

80. Wen, A.M. Design of virus-based nanomaterials for medicine, biotechnology, and energy. / A.M. Wen, N.F. Steinmetz // Chem Soc Rev. - 2016. -№25;45(15). P.4074-126. DOI: 10.1039/c5cs00287g.

81. Steppert, P. Quantification and characterization of virus-like particles by size-exclusion chromatography and nanoparticle tracking analysis / P. Steppert, D. Burgstaller, M. Klausberger, A. Tover, E. Berger, A. Jungbauer // J Chromatogr A. -2017. - №3;1487: P. 89-99. DOI: 10.1016/j.chroma.2016.12.085.

82. Leonard, F. Pease III. Quantitative Characterization of Virus-like Particles by Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation, Electrospray Differential Mobility Analysis, and Transmission Electron Microscopy / F. P. III Leonard, D. I. Lipin, D.-H. Tsai, M. R. Zachariah, L.H.L. Lua, M. J. Tarlov, A.P.J. Middelberg // Biotechnology and Bioengineering. - 2008. - №3. P. 845-855. DOI: 10.1002/bit.22085.

83. Wagner, M, Holzschuh S, Traeger A, Fahr A, Schubert US. Asymmetric flow field-flow fractionation in the field of nanomedicine / M. Wagner, S. Holzschuh, A. Traeger, A. Fahr, U.S. Schubert // Anal Chem. - 2014. - №3;86(11). P. 5201-10. DOI: 10.1021/ac501664t.

84. Mach, H. Disassembly and reassembly of yeast-derived recombinant human papillomavirus virus-like particles (HPV VLPs) / H. Mach, D. B. Volkin, R. D. Troutman, B.e.i. Wang, Z. Luo, K. U. Jansen, L.i. Shi // Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2006. - №95(10). P. 2195-2206. DOI:10.1002/jps.20696.

85. Yang, Y. Size-exclusion HPLC provides a simple, rapid, and versatile alternative method for quality control of vaccines by characterizing the assembly of

antigens / Y. Yang, H. Li, Z. Li, Y. Zhang, S. Zhang, Y. Chen, M. Yu, G. Ma, Z. Su // Vaccine - 2015. - №25;33(9). Р. 1143-50. DOI: 10.1016/j.vaccine.2015.01.031.

86. Magalhaes S, De Sa. Quality assessment of virus-like particle: A new transmission electron microscopy approach / De Sa Magalhaes S, De Santis E, S. Hussein-Gore, M. Colomb-Delsuc, E. Keshavarz-Moore // Front Mol Biosci. - 2022. -№25 Р. 9. DOI: 10.3389/fmolb.2022.975054.

87. Zhao, Q. Virus-like particle-based human vaccines: quality assessment based on structural and functional properties / Q. Zhao, , S. Li, H. Yu, N. Xia, Y. Modis // Trends Biotechnol. - 2013. - №31(11) P. 654-63. DOI: 10.1016/j.tibtech.2013.09.002.

88. Общая фармакопейная статья 1.7.1.0018.18 Иммунобиологические лекарственные препараты / Государственная фармакопея Российской Федерации XV - М.: Министерство здравоохранения Российской Федерации. - 2018. - Режим доступа: https://docs.rucml.ru/feml/pharma/v14/vol2/905/

89. Общая фармакопейная статья 1.7.1.0004.15 Вакцины и анатоксины / Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. - 2024. [Электронное издание]. - Режим доступа: https: //docs. rucml. ru/feml/pharma/v14/vol2/733/