Количественная оценка эффективности тестирования и определения потенциальной мутагенной опасности химических соединений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Велибеков, Рамис Махачевич

• Велибеков, Рамис Махачевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Велибеков, Рамис Махачевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая история проблемы

1.2. Этапы действия мутагенов

1.3. Механизмы действия мутагенов

1.4. ДНК-тропные мутагены

1.5. Зависимость частоты мутаций от величины дозы мутагена

1.6. Индуцибельные процессы

1.7. Биотрансформация

1.8. Методология оценки мутагенной активности химических соединений для человека

1.8.1. Проблема затрат на проведение биотестирования

1.8.2. Общие принципы биотестирования

1.8.3. Проблема ложных позитивных и ложных негативных результатов

1.8.4. Схемы биотестирования

1.9. Оценка уровня потенциальной мутагенной опасности химических соединений

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика использующихся в работе баз данных

2.1.1. База данных GAP

2.1.2. База данных Gene-Tox

2.1.3. База данных NTP

2.2. Характеристика рассматриваемых в работе тест-систем

2.2.1. Тест Эймса

2.2.2. Тесты по учёту хромосомных аберраций in vitro

2.2.3. Тесты по учёту генных мутаций in vitro

2.2.4. Цитогенетические тесты in vivo

2.2.5. Тест по учёту рецессивных, сцеплённых с полом летальных мутаций у дрозофилы

2.2.6. Тест по учёту доминантных леталей у грызунов

2.2.7. Тест по учёту наследуемых транслокаций у самцов млекопитающих

2.2.8. Метод специфических локусов на мышах

2.3. Характеристика компьютерных программ

2.4. Статистические методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Математическое обоснование модели оценки эффективности тестирования и определения потенциальной генетической опасности химических соединений

3.1.1. Ретроспективный анализ

3.1.2. Замечания о величине априорной вероятности наличия или отсутствия мутагенных свойств у химических соединений загрязнителей окружающей среды

3.1.3. Оценка получаемой в ходе тестирования информации

3.1.4. Определение потенциальной мутагенной опасности химических соединений

3.2. Формирование базы данных

3.2.1. Принципы формирования

3.2.2. Характеристика базы данных

3.3. Оценка эффективности тестирования

3.3.1. Одиночные тесты

3.3.1.1. Основные характеристики одиночных тест-систем

3.3.1.2. Оценка получаемой информации в одиночных тест-системах

3.3.1.3. Оценка средней информации в одиночных тестах

3.3.2. Эффективность батарей тестов

3.3.2.1. Общие замечания

3.3.2.2. Распределение химических соединений по результатам испытаний при использовании батарей из двух тестов

3.3.2.3. Средняя информация

3.3.2.4. Однозначные позитивные результаты

3.3.2.5. Однозначные негативные результаты

3.3.2.6. Неоднозначные результаты

3.4. Оценка взаимной статистической зависимости тестов

3.4.1. Определение коэффициентов взаимной сопряжённости результатов тестирования при использовании пар тестов

3.5. Использование селективной информации для оценки взаимной зависимости тестов

3.6. Кластерный анализ

3.7. Количественное определение потенциальной генетической опасности химических соединений

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Количественная оценка эффективности тестирования и определения потенциальной мутагенной опасности химических соединений»

Актуальность темы. Актуальность охраны окружающей среды и, в частности, проблемы оценки и предотвращения негативных последствий, связанных с введением в биосферу в связи с деятельностью человека многочисленных химических соединений, в настоящее время очевидна.

Немногим более 30 лет тому назад вначале научным, а вслед за этим и всем обществом был осознан тот факт, что химические соединения -загрязнители окружающей среды, также как и ионизирующая радиация, представляют реальную генетическую опасность для человека. В результате возникло новое направление в генетике - так называемая генетическая токсикология, основной задачей которой является создание методологии для классификации химических соединений по степени их потенциальной генетической опасности для человека, с целью осуществления различных регулирующих действий, направленных на предотвращение или уменьшение возможных генетических последствий химических соединений.

Вторая проблема генетической токсикологии связана с необходимостью постоянного тестирования большого числа химических соединений. В настоящее время число зарегистрированных в международном регистре (CAS - Chemical Abstract Service, http://www.cas.org) соединений составляет более 18 миллионов химических веществ. Это число увеличивается каждый день примерно на тысячу соединений. Понятно, что большая часть вновь синтезируемых соединений не попадает в среду в качестве реальных загрязнителей, однако, число «новых» загрязнителей среды также оказывается достаточно велико и составляет величину порядка 3500 в год, то есть примерно 10 соединений в день. Это обусловливает необходимость создания достаточно оперативной и экономичной системы тестирования химических соединений в отношении их потенциальной генетической опасности для человека.

За время существования генетической токсикологии созданы сотни тест-систем, многие из которых используются в настоящее время для оценки потенциальной мутагенной или канцерогенной опасности химических соединений. Однако проблема оценки эффективности биотестирования и связанная с этим проблема её оптимизации не решена и в настоящее время.

В значительной степени такое положение связано с отсутствием единого количественного критерия оценки эффективности тестирования и, соответственно, прогностической значимости полученных в ходе тестирования результатов. Отсутствие такого критерия приводит к тому, что определение степени мутагенной и канцерогенной опасности проводится на субъективном, экспертном уровне. В результате, процедуры тестирования и выявляемые в ходе их проведения уровни потенциальной генетической опасности химических соединений различаются в разных странах, что порождает большие социологические и экономические проблемы. Попытки унификации (гармонизации) процедуры тестирования, проводимые с 1994 года, до сих пор не завершились успехом. Таким образом, обоснование единого количественного критерия оценки эффективности тестирования и потенциальной генетической опасности химических соединений для человека представляет в настоящее время центральную проблему генетической токсикологии.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в обосновании и апробации (на примере широко использующихся в настоящее время 6 тест-систем) селективной информации в качестве универсального количественного критерия оценки эффективности тестирования и потенциальной мутагенной опасности химических соединений для млекопитающих. При этом решаются следующие задачи: 1. Создание представительной базы данных, включающей в себя химические соединения для которых имеются экспериментальные данные по мутагенным эффектам в половых клетках грызунов, а также результаты их испытаний в исследуемых в работе тест-системах (тест Эймса, тесты по учёту генных мутаций и хромосомных аберраций in vitro, тесты по учёту цитогенетических повреждений in vivo, тест по учёту рецессивных, сцеплённых с полом летальных мутаций у дрозофилы, тест по учёту доминантных леталей у грызунов).

2. Проведение анализа эффективности исследующихся в работе тест-систем и их парных сочетаний.

3. Обоснование и проведение оценки потенциальной мутагенной опасности химических соединений, изученных с помощью использующихся в работе тест-систем.

Научная новизна. Впервые в работе обоснован и применён количественный критерий, позволяющий проводить оценку эффективности не только отдельных тестов, но и их батарей, - как в среднем, так и для каждого получаемого в ходе тестирования результата в отдельности. В качестве этого критерия выступает селективная информация наличия (или отсутствия) мутагенных свойств у испытуемых соединений. Для построения шкалы потенциальной мутагенной опасности испытанных химических соединений использована специально введённая функция веса (уровня) доказанности, однозначно связанная со значениями полной информации, достигаемой при проведении биотестирования.

Практическая значимость. Обоснование единого количественного критерия оценки эффективности тестирования и определения потенциальной мутагенной опасности химических соединений позволяет оптимизировать процедуру биотестирования и устранить субъективизм при её организации и классификации химических соединений по степени этой опасности.

Предложенная система оценки может быть использована как при проведении валидных исследований отдельных тестов и их батарей, так и

10 при обосновании регулирующих действий. Эти регулирующие действия по запрету и ограничению использования различных химических соединений осуществляются различными государственными службами, созданными для этих целей. В России к числу таких служб относится фармакологический комитет (Дурнев А.Д. и др., 2000), в США - Служба токсических веществ Агенства по охране окружающей среды (OTS US ЕРА - Office of Toxic Substances United States Environmental Protection Agency) (USEPA, 1989), в Великобритании - Экспертный комитет по тестированию мутагенов Департамента здоровья (DH - Department of Health) (Brusick, 1988).

Заключение диссертации по теме «Генетика», Велибеков, Рамис Махачевич

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Генетическая токсикология родилась как наука в конце 60-х начале 70-х годов, то есть примерно 30 лет тому назад, когда научное сообщество осознало, что реальную генетическую опасность для человека представляет не только ионизирующая радиация, но и химические вещества загрязнители окружающей среды. Уже тогда было ясно, что основная задача, стоящая перед этим возникшим направлением науки, является создание методологии оценки потенциальной генетической опасности химических соединений в отношении человека, для того чтобы научно обоснованно осуществлять так называемые регулирующие действия. Эти регулирующие действия могут включать в себя запрет или различные ограничения в использовании и производстве химических соединений.

Вторая проблема, стоящая перед генетической токсикологией связана с чрезвычайно большим числом химических соединений, которые необходимо тестировать. В биосфере находится порядка 60-70 тысяч химических соединений и каждый год не менее трёх тысяч вводится новых в качестве реальных загрязнителей среды. В связи с этим при организации процедуры тестирования необходимо учитывать затраты на её проведение. Другими словами необходимо организовать эту процедуру таким образом, чтобы выявленная информация о популяционном генетическом риске испытуемых соединений в пересчёте на единицу затрат оказалась бы максимальной.

Как уже говорилось, основные принципы методологии тестирования были сформулированы ещё в начале 70-х годов, то есть вскоре после возникновения генетической токсикологии. Большое число химических веществ, требующих тестирования, и необходимость учёта затрат на его проведение требует создания процедуры тестирования, которая включает в себя ряд этапов. Отбор химических соединений, который происходит на основе результатов, полученных на последнем этапе, приводит к уменьшению числа соединений, тестируемых на последующем этапе, когда используются более эффективные, но и более "дорогие" тест-системы. Однако наличие такого отбора предполагает проведение оценки прогностической значимости результатов, полученных на каждом из этапов общей процедуры тестирования в том числе и на первом этапе, включающем в себя наиболее "дешёвые", но вместе с тем и наименее эффективные тест-системы. При этом в отношении мутагенов осуществляется негативный отбор, тогда как в отношении канцерогенов позитивный отбор. Однако проведение строгой количественной оценки в настоящее время чрезвычайно затруднено, поскольку остаётся неясным, каким образом следует оценивать в целом эффективность тестирования и каждый из полученных при тестировании результатов в отдельности и, следовательно, достигаемую в ходе тестирования оценку потенциальной генетической опасности для каждого из исследуемых химических соединений. Действительно при использовании батарей тестов мы как правило наблюдаем сложную картину, когда одни тесты показывают негативный результат, тогда как другие - позитивный результат. Такая ситуация не является исключительной, напротив - она является типичной. Трудности усугубляются тем, что при этом нельзя рассматривать набор результатов тестирования, как группу независимых событий. В одних сочетаниях тесты являются взаимно дополнительными комплиментарными, в других сочетаниях в значительной степени подобными, идентичными друг другу. В первом случае, информация, полученная при использовании каждого теста складывается, во втором случае этого не происходит. Дополнительной информации мы не получаем. Как правило, тесты по критерию дополнительности и идентичности занимают промежуточную позицию, они частично являются дополнительными и частично зависимыми друг по отношению к другу. Однако остаётся неясным, как оценить степень этой зависимости и каким образом использовать эту оценку при определении степени потенциальной генетической опасности тестируемых химических соединений.

Трудности существующие в генетической токсикологии в значительной степени обусловлены отсутствием единой количественной меры оценки эффективности тестирования и определения потенциальной генетической опасности химических соединений. В данной работе на примере шести широко использующихся тест-систем показано, что в качестве такой меры может выступать селективная информация, и её использование позволяет количественно оценить эффективность тестирования при использовании отдельных тестов и батарей тестов, как в среднем, так и для каждого получаемого в ходе тестирования результатов в отдельности. Селективная информация может служить критерием степени взаимной независимости тестов при формировании их батарей. Она также может выступать в качестве основы при формировании удобной для восприятия количественной шкалы при оценке выявляемой в ходе тестирования потенциальной генетической опасности (или безопасности) химических соединений. При оценке потенциальной генетической опасности химических соединений нами использована специально введённая для этих целей функция веса (уровня) доказанности являющаяся производной функцией полной информации. При проведении количественных расчётов информации, уровня доказанности в работе использованы специально разработанные компьютерные программы и создана база данных включающая в себя практически все известные в настоящее время химические соединения для которых, с одной стороны, имеются результаты о способности индуцировать генетические эффекты в половых клетках млекопитающих, а с другой - по исходу испытаний этих соединений в рассматриваемых в работе тест-системах.

В работе проведена оценка эффективности тестирования для шести тест-систем и их парных сочетаний, определена степень их взаимной зависимости, а также прогностическая значимость получаемых в ходе тестирования результатов. Последнее позволяет сформировать количественную шкалу для оценки потенциальной мутагенной опасности химических соединений.

Для отобранных из Gene-Tox банка специально для этих целей химических соединений, проведена количественная оценка их потенциальной мутагенной опасности. В целом, полученные результаты показывают, что селективная информация может выступать в качестве единой количественной меры (критерия), как при оценке эффективности тестирования, так и при определении потенциальной генетической опасности химических соединений.