Клиническая и молекулярно-генетическа характеристиа мутаций гена-рецептора липопротеидов низкой плотности у российских пациентов с семейной гиерхолестеринемией тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.06, кандидат медицинских наук Мешков, Алексей Николаевич

• Мешков, Алексей Николаевич
• кандидат медицинских наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Мешков, Алексей Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Пациенты

2.2 Материалы

2.3 Анализ липидов

2.4 Выделение ДНК из замороженной цельной крови методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы

2.5 Полимеразная цепная реакция

2.6 Метод анализа полиморфизма подвижности конформаций одноцепочечной ДНК

2.7 Секвенирование

2.8 Методы доказательства патогенности найденных мутаций в гене р-ЛПНП

2.9 Выявление мутации АроВ3531 методом рестриктного анализа

2.10 Выявление мутации АроВ3500 методом аллель-специфической ПЦР

2.11 Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Клиническая характеристика пациентов

3.2 Молекулярно-генетическая характеристика пациентов

3.3 Клиническая характеристика пробандов с найденными мутациями гена р-ЛПНП и их родственников

3 4 Разработка тест-системы для быстрой детекции выявленных мутаций гена р-ЛПНП

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клиническая и молекулярно-генетическа характеристиа мутаций гена-рецептора липопротеидов низкой плотности у российских пациентов с семейной гиерхолестеринемией»

Проблема атеросклероза является одной нэ наиболее значимых проблем современной медицины Се рдеч и о-сосу д и сг ая патология является при чипом более чем половины смертей в мировой популяции [I] Атеросклероз занимает главенствующие позиции в структуре сердечно сосудистых заболеваний Приблизительно в 50% случаев атеросклероз проявляется ИБС, а 40% случаен цереброваскуляриыми заболеваниями 11,911 Для развнтя атеросклероза выявлено несколько факторов риска наследственная предрасположенности. пожилой возраст, сахарный диабет» курение, гипертония, повышенный уровень холестерина |9]] Наследственная предрасположенность является Kiin6afice серыгзным фактором риска Наследственные формы атеросклероза имеют наиболее злокачественное течение и наименее благоприятный прогноз [26,35,36] Наиболее хорошо изученным наследственным заболеванием, приводящим к раннему развитию атеросклероза, является семейная гиперхолестеринемия (СГ) СГ является распространенным наследственным моногенным заболеванием, встречающимся в популяции с частотой 1 на 504) человек J41] Среди пациентов с ИБС" моложе 55 лет, у 5% заболевание обусловлено гетерозиготной формой СГ [99] Основные клинические симптомы заболевания высокий уровень холестерина ЛГ1НП н раннее развитие ИБС. Заболевание в большинстве случаев обусловлено мутациями в гене рецептора Л ПНИ или аполилопротеина В-100 (АноВ-100). вызывающих нарушение захвата и удаления ЛПНГ1 из крови, что приводит к повышению уровня холестерина ЛПНП в крови и раннему развитию атеросклероза |48,52| Показано, что у лиц с СГ, ИБС возникает на 20-25 лет раньше, чем у других людей, и приводит к соответствующему сокращению продолжительности жижи f24,26]

Постановка диагноза СГ основывается на высоком уровне холестерина у пациента и высоких значений холестерина у родственников В тоже время даже в пределах одной семьи уровень холестерина очень вариабелен, что зачастую не позволяет выявить всех носителей [17,44,90]. Единственной альтернативой в настоящее время является ДНК-диагностика. Основными преимуществами данного метода являются: высокая специфичность, возможность диагностики на доклинической стадии, возможность заочной диагностики [11,24]. Ранняя диагностика заболевания позволяет определить прогноз заболевания и назначить соответствующие меры первичной и вторичной профилактики

Если генетическая патология не выявляется вовремя и не проводится специальное лечение, то около 50% мужчин, имеющих СГ, переносят ИМ в возрасте до 50 лет. В случае раннего обнаружения генетической патологии, развитие заболевания у лиц с СГ можно предотвратить с помощью адекватной терапии. К сожалению, гетерозиготная форма СГ очень часто выявляется только тогда, когда появляются клинические симптомы ИБС Это связано с недостаточной информативностью, либо с высокой трудоемкостью и невозможностью широкого применения используемых в настоящее время диагностических подходов [26].

Генодиагностика наследственных заболеваний основана на двух различных подходах. Первый - детекция известных мутаций Второй - методы сплошного скрининга, для проверки идентичности последовательности исследуемого гена нормальной последовательности Базой первого принципа является тот факт, что в популяциях обычно существует ограниченный набор мутаций, перекрывающий подавляющее большинство случаев многих известных наследственных заболеваний Данный подход применим в обследованных популяциях. Он дешев, точен и уже применяется в настоящее время в западных клиниках [24,25]. Работы по определению генетической структуры СГ в развитых странах начались более 15 лег назад и на сегодняшний момент накоплена уже значительная информация в настоящее время в мире известно более 900 мутаций в гене р-ЛПНП приводящих к развитию СГ [64,65,66]. В Российской популяции данный метод неприменим и:j-за се необследованное™ Кроме того. Российская популяция значительно больше и гетсрогеннсс описанных западных популяции, что позволяет предполагать наличие н кашей популяции чначнтелыю большего числа уиикал ьиых лля нее мутаций

В отличие от гена рецептора-ЛЛНП, в гене АроВ-100 известно всего несколько мутаций (АроВ3500 и АроВ353(), располагающихся в 26 *кчонс. который кодирует Л ИНН репегттор-связынакицнй участок кполнпопротенна В-100 [55,80.98] Доля этих мутаций в структуре заболевания, в разных странах, составляет 2-5%. данных по РФ в настоящий момент не достаточно 15,27.12,1)Я] В связи с ттим является актуальным вопрос о проведении исследований для поиска и характеристики мутаций в генах р-ЛПНП и АроВ] 00 вы зывающих СГ в России

Цель исследовании клиническая и молекулярно-генетическая характеристика мутаций гена рецептора-ЛГШП у пациентов с клиническим диагнозом СГ', наблюдающихся в клинике Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ Задачи:

1 Сформировать выборку папистов с клиническим диагнозом семенная гипсрхолестсринсмня, гетерозиготная фирма, охарактеризовать данную выборку с применением фискальных, лабораторных и инструментальных методов диагностики, и клнннко-геиеалогического метода

2 Наладить методы поиска мутаций, метод ан&тим полнморфщма конформацнй одноцепочечного ДНК фрагмента (SSCP - single stiand con Гог mat ion polymorphism) для кодирующей последовательности гена ЯПНГ| и 26-го чкчонл гена АроВ-100 и негад поднморфи зма длины рестрикшюнных фрагментов для поиска мутаций АроВ-3500 н АроВ-3531

3 Обследовать мегодом SSCP все 18 пеонов и промоторную области гена ]>-ЛПНП у 50 пробандов с диагнозом СГ для определения у ннх мутации в этом гене При наличии образцов с аномальной картиной подвижности эти образцы секвенировать. Для исключения СДБ провести поиск мутаций АроВ-3500 и АроВ-3531 у всех 50 пациентов

4 Обследовать методом SSCP 50 взрослых пробандов с нормальным уровнем холестерина для сравнения с результатами, полученными при обследовании пациентов с СГ и исключения функционально незначащих генетических перестроек.

5 Обследовать всех родственников пациентов с найденными мутациями, провести гено-фенотипические корреляции, а также определить особенности клинического течения заболевания при данных мутациях

Научная новизна. При проведении данного исследования впервые в России у больных с семейной гиперхолестеринемией охарактеризовано 13 мутаций гена рецептора-ЛПНП, из которых 10 обнаружены впервые в мире, только одна мутация C139G, найденная в этом исследовании, была ранее описана в России. Всем мутациям дана клиническая и молекулярно-генетическая характеристика. Патогенность выявленных мутаций хорошо доказана косвенными методами. Продемонстрирована большая вариабельность мутаций гена рецептора ЛПНП и отсутствие мажорных мутаций в этом гене

Практическая значимость. Данная работа позволила отработать один из методов сплошного скрининга - метод SSCP, в этот метод внесено ряд изменений:

• отказ от использования денатуранта, что позволяет повысить качество картины и чувствительность метода;

• использование 5%-го концентрирующего геля, позволяет применять для разделения одноцепочечной ДНК гели более высокой процентности 1015%, обладающие большей разрешающей способностью;

• окраска гелей флуоресцентным красителем является более дешевым, быстрым и технологичным методом, чем окраска серебром или применение радиоактивной метки.

Все это позволило повысить чувствительность метода и значительно упростило его На все 14 мутаций разработана тест-система для их диагностики методом пиросиквенса, что уже сегодня позволяет быстро и относительно дешево обследовать лиц с подозрением на СГ на эти мутации, а в дальнейшем послужит предпосылкой для более широкого скрининга лиц с СГ с применением диагностических тест систем для выявления мутаций гена р-ЛПНП среди населения.

Внедрение Результаты исследования внедрены в практическую деятельность лаборатории гемодиализа и плазмафереза и лаборатории медицинской генетики НИИ кардиологии им А.Л. Мясникова, ФГУ РКНПК Росздрава.

Заключение диссертации по теме «Кардиология», Мешков, Алексей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. В процессе исследования больных с семейной гиперхолестеринемией выявлено 14 мутаций гена рецептора-ЛПНП, 10 мутаций являются новыми и описаны впервые в мире: Е8Х, 230insG, W144X, Е180К, dup204K-206D, FsD97, W422R, D461Y, V698L, G>C at 2389+5, 3 мутации ранее были описаны в популяциях стран западной Европы: D200Y, Е207К, R395W. а мутация C139G ранее была описана в России

2. Течение заболевания и основные его клинические характеристики (уровни липидов, наличие ИБС, возраст при развитии ИБС) у носителей рецептор-негативных мутаций достоверно не отличались по сравнению с носителями рецептор-дефективных мутаций.

3. Из всех мутаций гена р-ЛПНП ни одна не встречалась больше, чем у двух неродственных пробандов, что может свидетельствовать об отсутствии мажорных мутаций в гене р-ЛПНП у российских пациентов с семейной гиперхолестеринемией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Найденные мутации гена рецептора-ЛПНП - Е207К, C139G, D200Y, R395W, Е8Х, 230insG, W144X, Е180К, dup204K-206D, FsD97, W422R, D461Y, V698L, G>C at 2389+5 - могут быть включены в диагностическую панель прямой ДНК диагностики семейной гиперхолестеринемии у российских пациентов.

2. ДНК-диагностику семейной гиперхолестеринемии возможно применять в крупных диагностических центрах как эффективный и технологичный метод диагностики.

3. Для быстрой детекции в клинической практике всех найденных мутаций может быть использован метод пиросеквенирования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Мешков, Алексей Николаевич, 2006 год

1. Болезни органов кровообращения Руководство для врачей Под ред В.И Чазова Медицина, 2001

2. Введение в молекулярную диагностику и генотерапню наследственных заболеваний В,Н Горбунова, В,С Баранов, СПб, Специальная Литература. 1997

3. Иванов И Б., Ершов Г.М., Барский В.Е и др. Диагностика генетических мутаций на олипжуклеотидных микрочипах Молекулярная биология 1997, том 31, №1 159-167

4. Крапнанср С.Р, Малышев П П , Полтараус А.Б. н лр Случай семейной гипсрхолсстсрннсмнн, вызванной новой мутацией D46IY в гене рецептора лнполротеидов низкой плотности Кардиология 2001, I 92-95

5. Крапивнер С Р., Малышев П П , Рожкова Т А , Полтараус А, Б , Кухарчук В В , Бочков В. Н, Дифференциальная диагностика с помощью анализа ДНК семейной гнперхолестерннемнн и семейного дефекта алоВ-100 Терапевтический архив 2000,72(4 ):9-12

6. Томпсон ГР Руководство по гнперлипндемни, 1991 год. репринт Мерк и Ко инк.

7. S. Хал л л Ш.П. Спектр мутационных повреждений гена рецептора лнпопротендов ноткой плотности в популяции бальных семейной гиперхолсстеринсмни г. Санкт-Петербург Санкт-Петербург, 1999 Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

8. Шевцов С.П. Отсутствие ДНК-полиморфизмов на участке гена АРОВ, кодирующем предполагаемый домен связывания белка АроВ-100 с рецептором липопротеидов низкой плотности // Генетика. 1996. Т. 32. N 2.1. С. 295 297.

9. Agaton С. Gene expression analysis by signature pyrosequencing. Gene 2002; 289:31-39.

10. A genetic strategy for preventing early deaths- familial hypercholesterolemia, report of a WHO temporary adviser. Geneva, 1996.

11. Abifadel M, Varret M, Rabes JP, Allard D, Ouguerram K, Devillers M, Cruaud C, et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nat Genet 34:154-156, 2003.

12. Ahmadian A, Gharizadeh B, Gustafsson AC, Sterky F, Nyren P, Uhlen M, Lundeberg J. 2000. Single-nucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing. Anal Biochem. 280(1): 103-10

13. Alderborn A., Kristofferson A., Determination of Single-Nucleotide polimorphism by real-time pyrophosphate DNA Sequencing. Reseach and Development, Pyrosequencing AB, Sweden

14. Alexander A. Pyrosequencing sheds light on HLA genotiping. Hum.Immunol 2002;63:95

15. Arguello, J.R., A.-M. Little, A.L. Pay, D. Gallardo, I. Rojas, S.G.E. Marsh, J.M Goldman, and J.A. Madrigal. Mutation detection and typing of polymorphic loci through double strand conformation analysis. Nat. Genet. 1998; 18.192-194

16. Bertolini S., Garuti R., Lelli W., et, al. Four novel partial deletions of LDL-receptor gene in Italian patients with familial hypercholesterolemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and vascular Biology 1995; vol 15, №1 81-88

17. Chen, J and P.D.N. Hebert 1998. Directed temunation PCR a one step approach to mutation detection Nucleic Acids Res 26:1546-1547

18. Ciccarcsc M. Pacifico A,, Tonolo G, el, al. A new locus for autosomal rccessive hypercholesterolemia maps to human chromosome 15q25-<i26 Am J Hum Genet 2000, 66(2) 453-460

19. Civeira F Guidelines for the diagnosis and management of heterozygous familial hypercholesterolemia Atherosclerosis 2004. 173:55-68

20. Cotton RGH, Edkms E, Forrest S Mutation Detection, the practical approach series, Oxford University Press, 1998

21. Dalya Marks, Margaret Thorogood, H Andrew W Neil, Steve E Humphries A review on the diagnosis, natural history, and treatment of familial Hvperchotesterolaemia Atherosclerosis 2003,168 1-14

22. Daniel J. Rader, Jonathan Cohen, and Helen H Hobbs Monogenic hypercholesterolemia: new insights in pathogenesis and treatment The Journal of Clinical Investigation, June 2003, Volume 111, Number 12

23. Emily S. van Aalst-Cohen, Angelique C.M. Jansen, Saskia de Jongh, et al. Clinical, diagnostic, and therapeutic aspects of familial hypercholesterolemia SEMINARS IN VASCULAR MEDICINE/VOLUME 4, NUMBER 1 2004

24. Eric J G Sijbrands, Rudi G J Westendorp, Joep С Defesche, et al Mortality over two centuries in large pedigree with familial hypercholesterolaemia: family tree mortality study. ВMJ VOLUME 322 28 APRIL 2001

25. Ericson S.,Berg L.Cytochrome P450 Genotiping by Multiplex real-time DNA Sequencing with Pyrosequencinq Technoloqy. Assay and drug development technologies №1-1,2002

26. Fakhrai-Rad.H. Pyrosequencing an accurate detection platform for single nucleotide polimorphism. Hum.Mutation 2002; 19:479-485.

27. Familial hypercholesterolemia, MED-PED Program.

28. Familial hypercholesterolemia, report of a WHO consultation Paris, 1997

29. Footz T, Somerville MJ, Tomaszewski R, Sprysak K.A, Backhouse CJ. Heteroduplex-based genotyping with microchip electrophoresis and dHPLC Genet Test. 2003 Winter;7(4):283-93.

30. Fouchier SW, Defesche JC, Umans-Eckenhausen MAW, Kastelein JJP The molecular basis of familial hypercholesterolemia in the Netherlands. Hum Genet 2001; 109:602-615.

31. Fnkke-Schmidt R, Nordestgaard BG, Sehnohr P, Tybjaerg-Hanscn A A common mural ion in the low density lipoprotein receptor is associated with a three-fold risk of stroke. The Copenhagen City Heart Study Atherosclerosis 2002. 3<Suppl) 224

32. Goldstein JL, Hobbs HH, Brown MS. Familial hypercholesterolemia In Scrivcr CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds); The metabolic and molecular basis of inherited disease New York McGraw-Hill, 1995 1981-2030

33. Goldstein JL. Hobbs, H,. and Brown, M Familial hypercholesterolemia In The metabolic and molecular bases of inherited disease C, Scriver. A Beaudet, W Sly, and l> Valle, editors McGraw-Hill New York. New York, USA 2001 2863-2913.

34. Gorski В, Kubalska J„ Naruszewie* M. et, al LDL-R and ApoB-100 gene mutations in Potish familial hypercholesterolemias Hum Genet 1998, 102:562565.

35. Gruber J D ct al Estimationof SNP allele frequency in DNA pools by pyrosequencing. Hum Genetics 2002.10 395-401

36. Gudnason V , Day INM, Humphries SE Effect on plasma lipid levels of different classes of mutations m the low-density lipoprotein receptor gene in patients with familial hypercholesterolemia. Arteno&cler Thromb 1994,14.1717-1722

37. Gudnason V , Patel O. Sun X-M, Humphries SE, Soutar АКЧ Knight BL Effect of the Stul polymorphism in the LDL receptor gene (Ala 370 to Thr) on lipid levels in healthy individuals Clin Genet 1995.47: 68-74

38. Hacia. J.G. and F.S. Collins. Mutation analysis using oligonucleotide microarrays J Med. Genet 1999,36:730-736,

39. Hansen PS, Rudiger N, Tybjaerg-Hansen A, Fairgeman O, Gregersen N Detection of ihe apoB-3500 mutation (glutamine for argmine) by gene amplification and cleavage with Mspl J Lip Res 1991.32: 1229-1233

40. Heath KE. Gahau M, Whitiall RA, Humphries SE Low-density lipoprotein receptor gene (LDLR) world-wide website in familial hypercholcslerol aemia update, new features and mutation analysis Atherosclerosis 200., 154: 243-246

41. Herbert Schuster High risk/high priority, familial hypercholesterolemia a paradigm for molecular medicine Atherosclerosis Supplements 2 (2002) 27-32

42. Hirayama T, Yamaki E., Hata A el, al Five familial hypcrcholesteroicmic kinderds in Japan with novel mutations of the LDL receptor gene. Hum Genet 1998; 4:250-255.

43. Hobbs HH, Brown MS and Goldstein JL "Molecular genetics of the LDL rcccptor gene in familial hypercholesterolemia " Hum Mtitai 1992. 1 445-466

44. Horton J.D., Goldstein J.L., Brown M.S. SREBPs. activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in liver J Clin Invest. 2002. V 109(9). P. 1325-1131.

45. Humphries SE. Gallon D, Nicholls P Genetic testing for familial hypercholesterolaemia practical and ethical issues Q J Med 1997. 90:169-181

46. Jan Bore'n, Ulf Ekstro m, Bo Agreni, et at. The molecular mechanism for the genetic disorder familial defective apolipopcoiein В100 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol 276. No 12, Issue of March 23, pp 92149218.2001

47. Jensen HK, Jensen LG, Meinertz H. Hansen PS, Gregersen N, Faergcman О Spectrum of LDL receptor gene mutations in Denmark amplications for molecular diagnostic strategy in heterozygous familial hypercholesterolemia Atherosclerosis 1999,146 33 7-344

48. Jensen HK., Jensen L.G. Hansen P.S., et, al Higli sensitivity of (He smgJe-stnmd conformational polymorphism method for detecting sequence variations m the

49. L receptor gene validated by DNA sequencing Clinical Chemistry' 1996. 428:1140-1146.

50. Joep С Defesche. Low-density lipoprotein reccptor—its structure, function, and mutations SEMINARS IN VASCULAR MEDICINE/VOLUME 4, NUMBER I 2004

51. Karen E Heath, Mike Gahan, Ros A Whittall ct, a) Low-density lipoprotein receptor gene (LDLR) world-wide website in familial hyperholesterolaeuua update, new features and mutation analysis. Atherosclerosis 2001, 154 243-246

52. Khachadurian AK The inheritance of essential familial hypercholesterolemia Am J Med 1964:37 402^407

53. Khoo KL, P van Acker, Defeschc JC ct, al LDL receptor gene mutations in a South Asian population with familial hypercholesterolemia Clin Genet 2000. 58(2)98-105

54. Kotze MJ, Langcnhovcn E, Warnich L. De Ptessis L, Marx MP, Qosthuzen CJJ. Relief AE The identification of two low-densrty lipoprotein receptor gene mutations in South African familial hypercholestcrolaemia. S Afr Med J 1989, 76; 399-401

55. Knslcnscn, T,. V Nedelcheva Kristensen, and A-L Borrcsen-Dale High throughput screening for known mutations by automated analysis of single sequencing reactions (SSR) BioTechmques 1998, 24:832-835

56. LDL-Receptor Database Available at htlpV/wwwjojogcnetics nl

57. LDL-Reccptor Database A%-ailablc at http //www.ucl ac uk/'fh

58. LDL-Receptor Database. Available at: http://www.umd.necker fr

59. I.eitersdorf EE, Tobm EJ, Davingnon J, Hobbs HH Common low-density lipoprotein receptor mutations in the French Canadian population J CI in Invest 1990. 85 1014-1023

60. Leren Т. P., Bakken K. S., Hod V, et. al Screening for mutations of the apolipoprotein В gene causing hypocholesterolemia Hum Genet 1998; 102 4449

61. Leren "Г P. Sundvotd H., Rodningen О. K., et, al. Screening For known mutations in the LDL receptor gene causing familial hypercholesterolemia Hum Genet 1995,95:671-676

62. Leren TP. Cascade genetic screening for familial hypercholesterolemia. Clin Genet 2004 66: 4S3^487

63. J Li, J„ J M Btrtler, J. Tan, H Lm, S Royer, L Qhier, Т.Л. Shaler. J M Hunter. D.J Pollart, J A Monforte, and C H Becker Single nucleotide polymorphism determination using primer extension and time off mass spectrometry Electrophoresis 1999,20 1258-1265

64. Liu, W, D.I. Smith, KJ. Rechtzigel. N.S. Thibodeau. and C D James Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) used in the detection of germline and somatic mutations. Nucleic Acids Res 1998; 26; 13961400

65. Lou XJ, Panaro MJ, Wilding P, l ortma P, Kncka IJ. Mutation detection using ligase chain reaction in passivalcd silicon-glass microchips and microchip capillary electrophoresis Biotechmques 2004 Scp.37(3):392, 394. 396-8

66. Maher VM, Gallagher JJ, Thompson GR, el, al Docs the presence of the 3500 mutant apolipoprotetn B-100 and LDL receptor particles affect their atheroge tit city? Atherosclerosis 1995, 118 105-110

67. Maruyama T , Miyakc Y,, Tajima S. et, al Common mutations in the LDL receptor gene causing FH in Japanese populacion Arteriosclerosis, Thrombosis, and vascular Biology 1995. vol 15, №10:1713-1719

68. Miscrez A,, Keller U, Differences in the phenotypic characteristics of subjects with familial defective apolipoprotcin B-100 and familial hypercholesterolemia Arteriosclerosis. Thrombosis, and vascular Biology 1995; vol 15, №10:17191729

69. Miscrez A.R., Muller P.Y., Barella L. Barella S. Staehclm H В . Lettersdorf E, Kark J D , Fnedlandcr Y Slcrol-regulatoiy element-binding protein (SREBP)-2contributes to polygenic hypercholesterolaemia. Atherosclerosis 2002 V 164(1). P. 15-26.

70. Naoumova RP, Neuwirth C, Pottinger B, Whittal R, Humphries SE, Soutar AK. Genetic diagnosis of familial hypercholesterolaemia: a mutation and a rare nonpathogenic amino acid variant in the same family. Atherosclerosis 2004 May; 174(1 ):67-71.

71. Nordstrom T. Method for one step preparation of double stranded DNA template applicable for use with pyrosequencing technology. J.Biochem.Biophys.Methods 2002; 52,71-82

72. Philip R. Wenham, Bryony G. Henderson, Michael D. Penney et, al. Familial ligand-defective apolipoprotein B-100: detection, biochemical features and haplotype analysis of the R3531C mutation in the UK. Atherosclerosis 1997; 129:185-192.

73. Pimstone S. N., Defesche J., Clee S. M., et, al. Differences in the phenotype between children with familial defective apolipoprotein B-100 and familial hypercholesterolemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and vascular Biology 1997; vol 17, №5:826-833.

74. Pourmand N et al. Multiplex Pyrosequencing.Nucl.Acid Reseach. 2002; 30,31. 83.Raungaard В., Heath F., Brorholt-Petersen J.U., Jensen H.K., Faergeman О

75. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning, 2nd edn. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

76. Shevchenko Y.O., Bale S.J, Compton J.G. Mutation screening using automated bidirectional dideoxy fingerprinting. BioTechniques 2000; 28:134-138.

77. Sigrid W. Fouchier, Joep C. Defesche, John J.P. Kastelein, et al. Familial defective apolipoprotein В versus familial hypercholesterolemia: an assessment of risk. SEMINARS IN VASCULAR MEDICINE/VOLUME 4, NUMBER 3 2004

78. Sijbrands EJ, Westendorp RG, Paola Lombardi M, Havekes LM, Frants RR, Kastelein JJ, Smelt AH. Additional risk factors influence excess mortality in heterozygous familial Hypercholesterolaemia. Atherosclerosis 2000, 149:421425.

79. Smilde TJ, van Wissen S, Wollersheim H, Kastelein JJ. Genetic and metabolic factors predicting risk of cardiovascular disease in familial hypercholesterolemia NethJMed 2001;59:184-95.

80. Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) final report. Circulation. 2002 Dec 17; 106(25):3143-3421

81. Thompson GR, Seed M., Niththyananthan S. Genotypic and phenotypic variation in familial hypercholesterolemia. Arter Suppl. 1989; 9:75-80

82. Tyberg-Hansen A., Steffensen R., Meinertz H., et al. Association of mutations in the apolipoprotein B-100 gene with hypercholesterolemia and the rise of ischemic heart disease. The New Eng J of Med 1998; May 28:1577-1584

83. Vallve J.C., Alonso-Villaverde C., Ribalta J., Perez-Jimenez F., Masara L. Exon 4, and in particular codon 152 of the LDL receptor gene, is a hot spot for point mutations//Atherosclerosis. 1998. V. 140. P. 191 192.

84. Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Homes. A Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, and M. Zabeau. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 1995; 23:4407-4414.

85. Vrablic M , Cesca R., Horinek A. Major apolipoprotem B-100 mutations in lipoprotein metabolism and atherosclerosis. Physiol. Res. 2001; 50: 337-343.

86. Vuorio AF, Kontula K., Turtola H., et, al. Post mortem molecularly defined familial hypercholesterolemia and sudden cardiac death of young men Forensic Sci. Int. 1999; 6:106(2):87-92.

87. Wilkinson CF, Hand EA, Fliegelman MT. Essential familial hypercholesterolemia. Ann Intern Med 1948; 29:671-676.

88. Yabe D , Brown M S, Goldstein J L Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory clement-binding proteins //Proceed. Natl Acad Sci USA 2002 V 99(20) P 12753 -12758