Изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке простаты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Лисицкая, Ксения Валерьевна

• Лисицкая, Ксения Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лисицкая, Ксения Валерьевна

Список сокращений

Введение

1. Исследования полиморфизма некоторых белков человека, регулирующих пролиферацию, апоптоз и клеточную подвижность, и отдельные биомедицинские аспекты изучения рака простаты (обзор литературы).

1.1. Общие характеристики белков, регулирующих клеточную пролиферацию, диф-ференцировку и рост; роль их полиморфизма при раке предстательной железы.

1.1.1. Некоторые биомедицинские аспекты изучения проблем рака предстательной железы в постгеномную эру.

1.1.2. Белки системы гормона роста и инсулиноподобного фактора роста-1.

1.1.3. Некоторые регуляторные белки, участвующие в контроле за апоптозом.

1.1.4. Полиморфизм некоторых актин-связывающих белков при раке предстательной железы.

1.2. Клеточные модели в биохимических исследованиях рака предстательной железы.

1.3. Протеомные технологии в изучении рака предстательной железы.^

1.4. Использование некоторых постгеномных технологий в исследовании роли одно-нуклеотидных замен в патогенезе рака предстательной железы.

2. Материалы и методы.

2.1. Биологические материалы и реактивы.

2.1.1. Клеточные культуры человека.

2.1.2. Образцы ткани простаты человека, цельной крови и сыворотки крови.

2.1.3. Реактивы.

2.2. Методы выращивания клеточных культур и методики определения пролифера-тивной активности.

2.3. Иммуноферментный анализ.

2.4. Протеомные методы исследования.

2.4.1. Подготовка проб.

2.4.2. Фракционирование белков двумерным электрофорезом по О'Фарреллу.

2.4.2.1. Изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле с градиентом рН, мированном амфолинами.

2.4.2.2. SDS-электрофорез в пластинах полиакриламидного геля.

2.4.3. Детекция белков на гелевых пластинах. Дениситометрия двумерных электрофо-реграмм. Компьютерный анализ результатов. Хранение гелевых пластин.

2.4.4. Масс-спектрометрическая идентификация белков.

2.5. Методы получения ДНК и формирование ДНК-коллекций.

2.6. Методы исследования ДНК-полиморфизмов.

2.6.1. Простая ПЦР и рестрикционный анализ.

2.6.2. Метод дискриминации аллелей с помощью ПЦР в реальном времени (RT-PCR).

2.7. Статистическая обработка результатов.

3. Результаты и обсуяадение.

3.1. Изучение биологической активности отдельных регуляторных белков в модельных клеточных биотест-системах.

3.2. Определение концентрации IGF-1 и некоторых регуляторных белков в сыворотке крови пациентов с раком предстательной железы (иммуноферментный анализ).

3.3. Сравнительное протеомное изучение белков в культивируемых клетках рака (РС

3) и доброкачественной гиперплазии простаты (ВРН-1).

3.4. Исследование регуляторного белка Dj-1 у больных злокачественными и доброкачественными опухолями предстательной железы.

3.4.1. Идентификация двух изоформ белка Dj-1 в биопсийных образцах тканей рака предстательной железы.

3.4.2. Иммуноферментное определение белка Dj-1 в сыворотке крови у больных с раком и гиперплазией предстательной железы.

3.5. Изучение однонуклеотидного полиморфизма восьми генов (GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1, MSTN, FMN1, ANXA2, TAGLN) у этнических русских и у пациентов с раком предстательной железы.

3.5.1. Изучение полиморфизма 458A>G (rsl805086, Lysl53Arg) в гене MSTN.

3.5.2. Изучение ассоциаций полиморфных вариантов в генах, относящихся к системе гормона роста и инсулиноподобного фактора роста-1, с раком предстательной железы.

3.5.3. Изучение ассоциаций полиморфных вариантов в генах, кодирующих синтез ак-тин-связывающих белков, с раком предстательной железы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке простаты»

Актуальность темы

В биохимических исследованиях белков традиционно в особые группы объединяют различные макромолекулы, выполняющие сложные регуляторные функции, в том числе связанные с клеточной пролиферацией, апоптозом, ростом и развитием [Culig Z. et al., 1996; Zinkel S. et al., 2006]. Изучение свойств и особенностей функционирования таких белков-регуляторов, а также кодирующих их генов, часть из которых относится к онкогенам, усилилось в постгеномную эру в связи необходимостью выяснения молекулярных основ возникновения различных злокачественных опухолей, в частности, рака предстательной железы (РПЖ) [Yu Н., Rohan Т., 2000; Peltonen L., McKusick V.A., 2001; Bidosee М. et al., 2009; Turner N., Grose R., 2010].

РПЖ является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. Согласно статистике, в 2009 г. в США РПЖ занимал лидирующее значение по количеству выявленных случаев заболевания и второе место по количеству летальных случаев [Jemal А. et al., 2009]. В России РПЖ находится на 4-м месте в структуре онкологической заболеваемости мужчин [Чиссов В.И. с соавт., 2008]. Более того, за период с 1998 по 2008 гг. отмечается значительный рост заболеваемости РПЖ, составляющий в странах Запада в среднем 3% за год [Boyle Р. et al. 1996], а по оценкам, сделанным в нашей стране - более 7% в год [Чиссов В.И. с соавт., 2008]. Широкая распространенность РПЖ, вариабельность клинических симптомов и высокий процент летальности больных РПЖ во многом определяют пристальное внимание к этому заболеванию не только онкологов, но и биохимиков, молекулярных биологов, а также специалистов других биологических дисциплин.

Хотя к настоящему времени получен ряд данных, указывающих на участие в развитии РПЖ различных ростовых факторов и регуляторных белков [Russell et al. 1998; Reynolds A.R., Kyprianou N., 2006], однако остается много нерешенных вопросов, связанных с определением их непосредственного вклада в онкогенез. Среди них наиболее активно исследуемыми являются белки, входящие -в так называемую ось «гормон рос-та/инсулиноподобный фактор роста-1» (axis GH/IGF-1) [Cohen Р. et al., 2000; Koyama S. et al., 2010]. В числе особенно актуальных и интенсивно изучаемых вопросов - перспективы использования белковых факторов, вовлеченных в патогенез РПЖ, для диагностики и определения риска возникновения заболевания. О важности поисков новых биомаркеров и разработок на этой основе молекулярных диагностикумов РПЖ говорят накапливающиеся сведения о недостатках традиционно используемого в клинике теста на простат-специфический антиген (ПСА) [Stamey Т.А. et al., 2004].

Проблему осложняет то, что для многих ростовых факторов и других регуляторных белков характерен выраженный биохимический полиморфизм, проявляющийся их качественными и/или количественными изменениями. Эти изменения, в свою очередь, играют важные роли в процессах пролиферации клеток, приобретении ими способности к инвазии и метастазированию, что приводит, в конечном счете, к формированию злокачественного фенотипа клеток [Djavan В. et al., 2001; Weber G.F., 2007; Bidosee M. et al., 2009].

Известно, что биохимический полиморфизм белков человека может быть обусловлен как генетическими, так и эпигенетическими причинами [Beaudet A.L. et al. 1989; Zhang F. et al. 2009]. К генетическим причинам относят множественность генов, или поли-локусность, а также полиаллелизм и альтернативный сплайсинг. Среди эпигенетических причин наиболее распространены постсинтетические модификации белков [Вудс Р., 1983; Beaudet A.L. et al., 1989; Шишкин C.C. и др., 2007].

С началом постгеномного периода особое внимание исследователей привлекает полиморфизм белков, обусловленный однонуклеотидными заменами в соответствующих генах (так называемые single nucleotide polymorphisms, SNP's) [Zhang F. et al., 2009]. В частности, ведутся многочисленные работы, направленные на выяснение ассоциации отдельных полиморфных вариантов с риском различных онкологических заболеваний [Gsur A. et al., 2001; Chen С. et al., 2006; Jain M. et al., 2007; Hirata H. et al., 20096; Pilato B. et al., 2010]. По мнению ряда авторов, результаты таких исследований представляют интерес для развития представлений о молекулярных предпосылках возникновения раковых опухолей и могут найти применение для формирования групп высокого риска этих заболеваний, в частности, РПЖ [MononenN., Schleutker J., 2009].

Таким образом, ведущиеся в настоящее время исследования по изучению свойств регуляторных белков человека позволяют надеяться на получение важных результатов, которые расширят представления о молекулярных механизмах РПЖ и будут способствовать разработкам новых подходов к пресимптоматической диагностике, профилактике и лечению этого заболевания.

Цель и задачи исследования.

Основной целью данной диссертационной работы стало изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке предстательной железы, с помощью ряда традиционных и постгеномных технологий.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: 1. Разработать биотест-систему, использующую в качестве тестируемого объекта культивируемые эпителиальные и мышечные клетки, которая позволяла бы определять биологические эффекты различных регуляторных белков, присутствующих в сыворотке крови.

2. Провести иммуноферментное определение сывороточной концентрации отдельных регуляторных белков у пациентов с раком предстательной железы и в группе контроля и оценить проявления количественного полиморфизма этих белков.

3. Провести посредством двумерного электрофореза сравнительный протеомный анализ белков в клеточных линиях, моделирующих рак и доброкачественную гиперплазию предстательной железы, для обнаружения качественного и количественного полиморфизма белков как потенциальных маркеров рака предстательной железы.

4. Изучить встречаемость отдельных регуляторных белков в образах тканей простаты у больных раком и гиперплазией.

5. Исследовать возможность ассоциации различных полиморфных вариантов в некоторых генах, относящихся к системе гормона роста/инсулиноподобного фактора роста-1, а также в генах отдельных актин-связывающих белков с риском рака предстательной железы у этнических русских.

Научная новизна работы

Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве тестируемого объекта культивируемые клетки рака простаты (ЬИСаР), и с помощью этой биотест-системы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком простаты на клетки.

В тканях простаты человека впервые обнаружены две электрофоретические изо-формы белка Ць1, различающиеся по р1, и, возможно, представляющие собой результат посттрансляционных модификаций. При иммуноферментном анализе сывороточного уровня Ць1 у больных раком и гиперплазией предстательной железы получены новые данные, свидетельствующие о достоверном повышении уровня данного белка в сыворотке крови больных РПЖ по сравнению с группой ДГПЖ.

Впервые проведен сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (ОНЯ, ЮРВРЗ, ЮПИ, Ш1, МЭТИ, РШ1, АЫХА2, ТАЫЫ), вызванного десятью известными однонуклеотидными заменами (ЗЫР'э), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты. Показано, что распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388Т/С (Ьеи463Рго) в гене РМЫ1 достоверно различалось в группе больных и в контрольной выборке, в частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития рака простаты. Кроме того, при анализе полиморфного сайта 2911 О/А (01и917Агд) гена ШБ7 обнаружено достоверно значимое накопление алле-ля А у больных раком по сравнению с контрольной группой. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии полиморфизма генов БМШ и ГОШ в формировании предрасположенности к раку предстательной железы.

Научно-практическая значимость.

Оптимизированная клеточная биотест-система может быть использована для изучения биологических эффектов ростовых факторов на культивируемые клетки рака предстательной железы и для исследований молекулярных нарушений клеточной пролиферации при данном заболевании.

При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака простаты) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в многоуровневую информационную базу данных «Протеомика рака простаты-2009», созданную в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН совместно с ООО «Инновационные биотехнологии» (http://ef.inbi.ras.ru).

При сравнительном исследовании идентифицированного белка Щ-1 в четырех клеточных линиях показано его более низкое содержание в клетках, моделирующих доброкачественную гиперплазию (ВРН-1), по сравнению с клетками, моделирующими рак простаты (РС-3, 01Ы45 и ЬИСаР).

Результаты проведенных протеомных и иммуноферментных исследований на образцах тканей простаты и сыворотках крови больных раком и гиперплазией простаты позволяют считать белок Ц)-1 перспективным маркером рака предстательной железы и дают основание поставить вопрос о расширении его исследований с целью валидации для последующего использования в диагностике заболевания.

Полученные данные о полиморфизме двух из десяти исследованных ДНК-локусов могут найти применение при урологических обследованиях мужчин для формирования групп высокого риска рака простаты.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака простаты (ЬИСаР), и с помощью этой биотест-системы у обследованных пациентов с раком предстательной железы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком простаты на клетки:

2. При протеомном изучении белков* в клеточных линиях РС-3 (модель рака) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фрак9 ций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты-2009».

3. Изучение белка Dj-1 в четырех клеточных линиях показало его наименьшее содержание в клетках, моделирующих гиперплазию (ВРН-1) по сравнению с клетками, моделирующими рак предстательной железы (РС-3, DU-145 и LNCaP).

4. Протеомные и иммуноферментные исследования образцов тканей простаты и сыворотки крови у больных*раком и гиперплазией позволяют считать белок Dj-1 перспективным биомаркером рака простаты.

5. Сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1, MSTN, FMN1, ANXA2, TAGLN), вызванного десятью известными однонуклеотидными заменами (SNP's), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты показал достоверно значимое различие рапределения частот аллелей и генотипов по полиморфным сайтам 1388 Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1и2911G/A (Glu917Arg) в гене 7i?iSi (rsl801278) у больных РПЖ по,сравнению с контрольной группой.

Апробация работы

Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, в том числе: конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (Москва,' 2008),, IV Съезде Российског го общества биохимиков и молекулярных биологов,. (Новосибирску 2008), VII Съезде онкологов России (Москва, 2009), 25-ом;Ежегодном съезде, Европейской ассоциации урологов (25thAnniversary EAU Congress, Barcelona; 2010);.

Публикации

По теме диссертации опубликовано, 15 научных работ (из них 2 в зарубежной печати), включая 4 статьи в профильных рецензируемых российских ^ международных журналах, 1, статью в сборниках, 2 информационно-методических письма и 8 тезисов докладов. . .

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 146 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (386 наименований). Работа содержит 17 таблиц и 27 рисунков;

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Лисицкая, Ксения Валерьевна

выводы

1. Разработана клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака предстательной железы (ЬЫСаР), с помощью которой выявлен стимулирующий пролиферацию клеток эффект сыворотки крови больных раком предстательной железы.

2. Иммуноферментный анализ сывороточной концентрации двух белков - регуляторов клеточной пролиферации ростового фактора ГСЯМ и его транспортного белка ЮРВР-З, а также белка Вс1-2 - регулятора апоптоза - не показал статистически достоверных различий между группами пациентов с раком и гиперплазией предстательной железы.

3. При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака простаты) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии): а) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты»; б) показано, что идентифицированный белок Ц)-1 характеризуется наименьшим содержанием в клетках, моделирующих гиперплазию (ВРН-1) по сравнению с клетками, моделирующими рак предстательной железы (РС-3, 011-145 и ЫчГСаР).

4. При протеомном исследовании биоптатов тканей простаты, полученных от пациентов с раком и гиперплазией предстательной железы, показано, что белок Цн1 в большинстве случаев присутствовал в виде двух электрофоретических изоформ, при этом содержание белка Щ-1 было существенно выше при раке, чем при гиперплазии.

5. Иммуноферментный анализ сывороточной концентрации белка ЦИ выявил статистически достоверные различия между группами больных раком и гиперплазией предстательной железы, что позволяет считать белок Ц]'-1 перспективным биомаркером рака простаты.

6. Методом дискриминации аллелей с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени обнаружено, что в обследованной группе пациентов с раком предстательной железы имеется достоверно значимое накопление аллеля А в полиморфном сайте 291Ш/А (01и917А^) гена //?57 (ге 1801278) по сравнению с контрольной группой. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388 Т/С (Ьеи4бЗРго) в гене РМИ1 (гэ2306277) также различалось в группе больных и в контрольной выборке, в частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития рака простаты.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Белки человека, выполняющие сложные регуляторные функции, связанные с клеточной пролиферацией, апоптозом, ростом и развитием, представлены многочисленными семействами и суперсемействами [Le Roith D. et al., 1999; Blobe G.C. et al., 2000; Knillová J., Kolár Z., 2003; Reynolds A.R., Kyprianou N., 2006; Zinkel S. et al., 2006]. Как правило, их рассматривают в составе особых систем, включающих отдельные гормоны и/или ростовые факторы, соответствующие рецепторы и целые группы участников так называемых процессов сигналинга, которые обеспечивают целенаправленные изменения работы клеточного генома [Chang L. et al., 2004; Katz M. et al., 2007]. Одной из таких систем является система гормона роста/инсулиноподобного фактора роста-1 (GH/IGF-1) [Rodriguez S., et al., 2007; Baumann G.P., 2009; Rosenfeld R.G., Hwa V., 2009]. Функционирование этой системы представляется в виде целого ряда последовательных молекулярных процессов, в которых принимают участие десятки белков и пептидов. Система GH/IGF-1 распространяет свое действие на клетки с самыми разными типами дифференцировки [Thörey I.S. et al., 2004], в частности, на клетки ПЖ [Colao A. et al., 1998; 2000; Wang Z. et al., 2005]. Нарушения работы системы GH нередко становятся причинами тяжелой наследственной патологии [Phillips J.А., 1995; Le Roith D. et al., 1999], a также вовлекаются в патогенез онкологических заболеваний [Rodriguez S. et al., 2007; Creighton С J. et al., 2008].

Для многих белков - участников системы GH/IGF-1 характерен выраженный биохимический полиморфизм [Baumann G., 1991; Phillips J.A., 1995; Baumann G.P., 2009]. Это дало основание поставить в качестве одной из целей данной диссертационной работы изучение роли полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и раке предстательной железы.

В 21 веке заболеваемость РПЖ оценивалась величиной 25,3 человека на 100 000 населения по всему миру, однако данный показатель сильно варьирует в разных странах [Ramon J., Denis L.J., 2007]. В России в начале 21 века заболеваемость РПЖ вышла на четвертое место в общей структуре онкологических заболеваний и характеризовалась весьма высокими темпами ежегодного прироста, занимая по этому показателю первое место среди онкопатологий [Чиссов В.И. и др., 2008].Таким образом, эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что РПЖ можно рассматривать уже не просто как медицинскую проблему, а более широко - ряд авторов отмечают ее существенные социальные и экономические аспекты [Stephenson A.J. et al., 2007].

Одной из существенных проблем РПЖ является ранняя диагностика данного заболевания, поскольку на ранних стадиях существуют методы радикального и эффективного лечения [Кушлинский Н.Е. с соавт., 2002]. Решение проблемы ранней диагностики РПЖ в настоящее время связывают с внедрением в клиническую практику методов, основнанных на определении в крови или моче некоторых биомаркеров, которые могли бы позволить диагностировать наличие злокачественной опухоли ПЖ.

Для развития исследований в данном направлении и оценки места в нем многочисленных разработок принципиально важным представляется создание общепринятого определения для термина «биомаркер» [Ludwig J.A., Weinstein J.N., 2005].

Биологические маркеры (биомаркеры) - молекулы, которые могут служить индикаторами нормальных или патологических процессов в организме или фармакологических ответов организма на действие терапевтических агентов [Cummings J. et al., 2008]. По мнению Ludwig J.A., Weinstein J.N. (2005), при онкологических заболеваниях биомаркеры могут использоваться как индикаторы различных проявлений канцерогенеза и найти применение в диагностике, могут иметь прогностический характер, а также могут являться индикаторами терапевтического эффекта.

Спектр исследований биомаркеров разных типов обычно начинается с обнаружения потенциального биомаркера и развивается как три основных варианта многостадийного пути, включающих определение связей с самочувствием, функциями или выживаемостью пациентов к валидации биомаркера до решения о применении его в клинике (Рис. 4.1).

Спектр исследований биомаркеров

Научно-исследовательские технологии

Развернутые клинические исследования 1

Исследования (доклинический этап)

Определение вероятности валидации

Установление валидации

Выявление новых (потенциальных) биомарке

Оценка ранних фармако-динамических пока »а те - лей

Оценка поздних фарма-кодинамических показатвлей

Пилотные клинические исследования

Исследования биологии опухолей, поиск диагностических биомаркеров

Оценки прогностической значимости или влияния течения заболевания

Рис. 4.1. Схема основных вариантов в спектре исследований биомаркеров разных типов по Ситтищв J. й а1. (2008).

Хотя в ранней диагностике РПЖ в настоящее время фактически центральное место принадлежит определению в крови одного из наиболее изученных биомаркеров - простат-специфического антигена, однако известно, что этот тест сопровождается значительным количеством ложноположительных и ложноотрицательных результатов, которые помимо серьезных негативных медицинских последствий приводят и большим финансовым потерям [Stamey Т.А. et al., 2004]. Как следствие, в США и других западных странах, а также в нашей стране развернулись активные поиски новых, более эффективных биомаркеров РПЖ, для чего широко применяются постгеномные технологии [Примроуз С., Тваймен Р., 2008].

В связи с этим отдельные участники системы GH/IGF-1, а также целый ряд других регуляторных белков исследуются разными авторами как потенциальные биомаркеры РПЖ [Nam R.K. et al., 2003]. В частности, в данной работе было проведено изучение возможностей определения биологической активности отдельных регуляторных факторов, потенциально вовлеченных в патогенез РПЖ, с помощью созданной ранее [Черников и соавт., 1998; 2001] и оптимизированной в последующем клеточной биотест-системы. В результате оптимизированная клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака простаты (LNCaP), дала возможность выявить стимулирующий пролиферацию клеток эффект сыворотки от обследованных пациентов с РПЖ. Однако, при исследовании методом ИФА содержания в образцах сыворотки крови двух белков - регуляторов клеточной пролиферации IGF-1 и его транспортного белка IGFBP-3, а также белка Вс1-2, регулирующего апоптоза, не было обнаружено статистически достоверных различий по изучавшимся показателям между группами пациентов с РПЖ и ДГПЖ.

В обзоре литературы данной работы отмечено, что в исследованиях биомаркеров РПЖ в настоящее время широко используются результаты успешного завершения международного проекта «Геном человека» (2000 - 2001 гг.) и целого комплекса других связанных с ним работ. По мнению многих авторов, выполнение геномных проектов привело к качественным изменениям в биологии и медицине 21-го века - в итоге фактически началась новая, так называемая постгеномная эра в развитии науки [Downes M.R. et al., 2006; Примроуз С., Тваймен Р., 2008]. Характерной чертой начала постгеномной эры стало возникновение ряда новых научных дисциплин, использующих в исследованиях системный подход и соответствующие технологии, в частности, протеомика.

В данной работе при протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель РПЖ) и ВРН-1 (модель ДГПЖ) было показано, что идентифицированный белок Dj-1 характеризуется наименьшим содержанием в клетках, моделирующих ДГПЖ (ВРН-1) по сравнению с клетками, моделирующими РПЖ (РС-3, DU-145 и LNCaP). Белок Dj-1 был ранее описан как продукт онкогена DJL Начиная с 2001 г., накапливаются сообщения об участии данного белка в патогенезе опухолевых заболеваний и его ценности как потенциf ального онкомаркера. Установлено, что белок Dj-1 присутствует в клетках многих злокаt 113 чественных опухолей и играет роль в повышении клеточной пролиферации и устойчивости опухолевых клеток к апоптозу. В частности, белок Dj-1 был обнаружен ранее и в клетках ПЖ.

При дальнейшем протеомном исследовании биоптатов тканей ПЖ, полученных от пациентов с РПЖ и ДГПЖ, было установлено, что содержание белка Dj-1 существенно выше при РПЖ, чем при ДГПЖ. Таким образом, указанные результаты давали основание для того, чтобы рассматривать белок в качестве потенциального биомаркера РПЖ.

Для проверки этой рабочей гипотезы было проведено с помощью ИФА пилотное исследование содержания белка Dj-1 в группах пациентов с РПЖ и ДГПЖ. Результаты выявили статистически достоверные различия между этими группами, что позволяет считать белок Dj-1 перспективным биомаркером РПЖ. При этом в доступной литературе не удалось найти публикаций об измерениях уровней белка Dj-1 в крови пациентов с РПЖ и ДГПЖ.

Основываясь на полученных результатах проведенных протеомных и иммунофер-ментных исследований, можно сделать заключение, что белок Dj-1 является перспективным биомаркером РПЖ, положительно зарекомендовавшим себя в ходе первых трех эта/ пов исследований. В целом, представленные данные дают основание поставить вопрос о продолжении изучения белка Dj-1 с целью его валидации как биомаркера РПЖ и, в случе успеха, для последующего использования при диагностике этого заболевания.

Продолжения изучения, очевидно, заслуживает и факт обнаружения в тканях простаты человека (в основном, при РПЖ) двух электрофоретических изоформ белка Dj-1, различающиеся по pl. Возможно, что эти изоформы представляют собой результат посттрансляционных модификаций общего белкового продукта онкогена DJ1.

К настоящему времени известно, что во многих случаях биохимический полиморфизм белков человека может быть обусловлен различными генетическими причинами. В частности, с развитием ДНК-технологий появился целый поток работ, направленных на изучение различных видов ДНК-полиморфизма в генах, включая однонуклеотидные замены (SNP's).

Соответственно, одной из задач данной работы стало изучение у этнических русских возможных ассоциаций отдельных полиморфных вариантов по 10 полиморфизмам в 8 генах, относящихся к системе GH/IGF-1 и актин-связывающим белкам, с риском РПЖ. В результате удалось обнаружить достоверно значимое накопление аллеля А в полиморфном сайте 2911G/A (Glu917Arg) гена IRS1 (rsl801278) у больных РПЖ по сравнению с контрольной группой. Также было показано, что распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388 Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1 (rs2306277) достоверно различалось в группе больных и в контрольной выборке. В частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития РПЖ. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии полиморфизма генов РМЫ1 и ШБ! в формировании предрасположенности к РПЖ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лисицкая, Ксения Валерьевна, 2010 год

1. Александров В.П., Карелин М.И. (2004) Рак предстательной железы. СПб.: СПбМА-ПО. 148 с.

2. Арчаков А.И. (2000) Что после геномики? Протеомика. Вопр Мед химии, 46, 335-343

3. Брызгунова O.E., Власов В.В., Лактионов И.И. (2007) Современные методы диагностики рака предстательной железы. Биомедицинская химия, 53, 128-139

4. Бялик В.В., Пинчук В.Г. (1977) Патологическая анатомия и ультраструктура гиперплазии и рака предстательной железы. Киев, Пауко-ва думка, 165 с.

5. Вудс Р. (1983) Биохимическая генетика. М.: Мир, 127 с.

6. Говорун В.М., Арчаков А.И. (2002) Протеомные технологии в современной биомедицинской науке. Биохимия, 67, 1341-1359

7. Ивахно С., Корнелюк А. (2006) Количественная протеомика и ее применение в системной биологии. Биохимия, 71,1312-1327

8. Краевский H.A., Смольянников A.B., Саркисов Д.С. (ред) Патологоанатомическая диагностика опухолей человека: Руководство для врачей: В 2 томах. М.: Медицина, 1993.

9. Крахмалева И.Н., Липатова H.A., Шишкин С.С., Шаховская Н.И. (1999) Структура дистрофинового гена у больных миодистрофией Дюшена. Журнал неврологии и психиатрии, 99,41-43

10. Кушлинский Н.Е, Соловьев Ю.Н., Трапезникова М.Ф. (2002) Рак предстательной железы. М.: РАМН, 432 с.14,15