Изучение хитозанолитической активности папаина с целью получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Черкасова, Елена Игоревна

• Черкасова, Елена Игоревна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Черкасова, Елена Игоревна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Хитин - природный биополимер.

1.1.2. Пространственная организация хитина.

1.1.3. Комплексы хитина с полисахаридами, пигментами, белками.

1.2. Пути метаболизма хитина

1.2.1. Ферменты биосинтеза хитина.

1.2.2. Ферменты деградации хитина

Ф 1.2.2.1. Хитиназы: распространение, классификация.

1.2.2.2. Хитиндеацетилазы: многофункциональность действия.

1.3. Хитозан: получение, основные характеристики.

1.4. Получение олигосахаридов и низкомолекулярного хитозана

1.4.1. Зависимость биологической активности хитозанов от молекулярной массы.

1.4.2. Биологические способы получения олигосахаридов и низкомолекулярного хитозана.

1.4.3.Ферменты деградации хитозана - хитозаназы

1.4.3.1. Классификация.

1.4.3.2. Механизм катализа.

1.4.4. Ферменты других классов, способные к гидролизу хитозана.

1.4.5. Папаин - представитель обширной группы амидгидролаз 1.4.5.1. Место папаина в современной классификации. щ. 1.4.5.2. Специфичность и эффективность.

1.4.5.3. Эстеразная активность.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований.

2.2. Материалы исследований.

2.3. Методы анализов

2.3.1. Определение молекулярно-массовых характеристик

• исходного хитозана и продуктов его гидролиза.

2.3.2. Определение электронейтральных точек хитозанов.

2.3.3. ИК-фурье-спектроскопический анализ хитозана и продуктов его гидролиза папаином.

2.3.4. Измерение величины поверхностного натяжения солей хитозанов и его олигомеров.

2.3.5. Определение бактерицидности солей низкомолекулярного хитозана.

Ф 2.3.6. Определение аминогрупп хитозана и количества кислоты методом потенциометрического титрования.

2.3.7. Колориметрическое определение концентрации продуктов гидролиза хитозана в растворе.

• 2.3.8. Определение белка.

2.3.9. Вискозиметрические методы определения хитозанолитической активности папаина

2.3.9.1. Определение оптимальной температуры гидролиза хитозана папаином.

2.3.9.2. Определение оптимальной рН гидролиза хитозана папаином.

2.3.9.3. Определение остаточной активности папаина при различных температурах.

2.3.9.4. Определение основных кинетических параметров реакции.

2.3.10. Статистическая обработка данных.

1 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Окислительная деструкция хитозана пероксидом водорода.

• 3.2. Установление оптимальных условий гидролиза хитозана папаином

3.2.1. Выбор концентрации ферментного препарата папаина.

3.2.2. Выбор оптимальной температуры проведения реакции

• гидролиза.

3.2.3. Выбор оптимального значения рН проведения реакции гидролиза.

3.3. Особенности гидролиза хитозана папаином

3.3.1. Влияние молекулярной массы и степени деацетилирования хитозана на скорость реакции гидролиза.

3.3.2. Влияние концентрации субстрата на скорость реакции гидролиза.

Ф 3.3.3. Гидролиз хитозана ферментными препаратами различного происхождения.

3.4. Молекулярно-массовые характеристики олигомеров и низкомолекулярного хитозана

3.4.1. Влияние молекулярной массы хитозана на характеристики продуктов гидролиза.

3.4.2. Эффективное использование ферментного препарата папаина в умеренно концентрированных растворах хитозана.

3.4.3 Вискозиметрическое определение молекулярной массы олигомеров хитозана.

3.5. Получение солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана Ф 3.5.1. Получение низкомолекулярного хитозана в среде различных органических кислот.

3.5.2. Получение опытной партии солей низкомолекулярного хитозана.

3.6. Области применения олигомеров и низкомолекулярного хитозана

• 3.6.1. Бактерицидные свойства солевых форм низкомолекулярного хитозана.

Ф 3.6.2. Поверхностноактивные свойства солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана. выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение хитозанолитической активности папаина с целью получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана»

Актуальность проблемы. Хитозан (поли-|3-1—>4-2-амино-2-дезокси-D-глкжопираноза) и его солевые формы в настоящее время являются перспективной основой для получения препаратов фармацевтического и косметического назначения, биологически активных добавок. Это обусловлено комплексом уникальных свойств, присущих данному полисахариду - способности к биодеструкции, гипоаллергенности, совместимости с тканями живых организмов, высокой хелато- и комплексообразующей способности (Муццарелли, 2001; Alsaxra et. al., 2002; Ilium, 1998; Majety, Kumar, 2000; Prasitsilp et. al., 2000).

Известно, что биологическая активность хитозана, его бактериостатические, иммуностимулирующие и другие полезные свойства зависят от молекулярных характеристик - молекулярной массы (ММ) и степени деацетилирования (СД). Клинически подтверждены гипохолестеринемический и гиполипидимический эффекты хитозана ММ (1,0 - 3,0)х105 (Муццарелли, 2001). Хитозан с ММ (1,0-5,0)х104 и его олигомеры (менее 104) обладают выраженным бактерицидным действием на ряд патогенных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, способностью образовывать устойчивые комплексы с полианионами различной природы (в т. ч. и ДНК), гепатопротекторной и противоопухолевой активностью (Варламов, Ильина, 2005; Герасименко и др., 2004; S-J Kimet al., 1998).

Для получения низкомолекулярного хитозана и его олигомеров применяют различные методы: химические (среди которых наиболее распространены гидролиз высокомолекулярного хитозана при помощи пероксида водорода и гидролиз высококонцентрированными кислотами) и биологические (ферментативные) (Новиков, 2003; Lu et. al., 2004; No et. al., 2003). В настоящее время внимание исследователей все больше акцентируется на ферментативной деструкции хитозана, что позволяет считать получаемые продукты более натуральными, нежели при химическом гидролизе, менее затрагивает исходную природную структуру полимеров и соответствует требованиям экологической безопасности производства. При производстве олигомеров и хитозана с низкими значениями ММ высокоэффективны хитозанолитические ферменты со специфической активностью - хитозаназы различного происхождения (Fucamizo et al., 1994). Вместе с этим, при всех преимуществах и перспективах применения препаратов хитозаназ, для них отмечается несколько серьезных недостатков: аллергенность для человеческого организма, высокая цена, неспособность эффективно работать при значениях рН <5,0. Расширение областей использования хитозанов с различной ММ делает актуальным использование коммерческих препаратов с неспецифической активностью (целлюлаз, липаз, амидгидролаз) для деполимеризации природного высокомолекулярного хитозана (Vishi Kumar et. al., 2004).

Эффективность действия амидгидролазы растительного происхождения папаина (К.Ф. 3.4.22.2) на высокомолекулярный хитозан по сравнению с ферментами других групп (липазами, лизоцимом) была констатирована многими авторами (Grigolon et. al., 2001, Muzzarelli et. al., 2001), однако до сих пор остаются открытыми вопросы о механизмах гидролитического расщепления хитозана папаином, о выборе оптимальных условий проведения реакции, о влиянии характеристик субстрата (ММ и СД) на скорость гидролиза.

Актуальность темы диссертации связана с выявлением особенностей гидролиза хитозана с использованием папаина, определением кинетических характеристик процесса, а также с разработкой научной основы для технологичного ферментативного способа получения олигомеров и хитозанов с низкими регулируемыми значениями ММ. Полученные результаты оказались чрезвычайно важны для организации промышленного производства солей олигомеров и хитозанов с ММ (2,5-3,2)х104.

Цели и задачи работы. Целью данной работы явилось изучение хитозанолитической активности папаина в различных условиях для разработки эффективных методов получения олигомеров и хитозана с низкими регулируемыми значениями ММ. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: изучение молекулярных характеристик продуктов, полученных в результате гидролиза хитозана пероксидом водорода в присутствии аскорбиновой кислоты, выяснение возможности и преимуществ использования папаина для гидролиза хитозана, выбор оптимальных условий проведения ферментативной реакции (температура, рН, концентрация субстрата), определение кинетических параметров реакции гидролиза (кт, Vmax), и выявление особенностей гидролиза хитозана папаином по сравнению с другими ферментными препаратами амидгидролаз и хитозаназ растительного и микробиологического происхождения,

- изучение влияния ММ и СД исходного хитозана на скорость ферментативной реакции и на молекулярные характеристики получаемых продуктов, исследование влияния органических кислот на характеристики получаемых продуктов гидролиза хитозана папаином: средневязкостную ММ, бактерицидность, поверхностно-активные свойства, изучение возможности создания технологического процесса получения различных солей хитозана с прогнозируемыми значениями ММ.

Научная новизна и практическая значимость

- Методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na доказана высокая чистота используемого препарата папаина и подтверждено, что гидролитическое расщепление полимерной цепи хитозана осуществляет папаин, а не хитозаназы примесей.

Впервые методом ИК-фурье-спектроскопии доказана полная идентичность структуры исходного хитозана и продуктов, получаемых в результате гидролиза хитозана папаином в среде различных органических кислот.

Гидролиз хитозана пероксидом водорода в окислительно-восстановительной системе с участием аскорбиновой кислоты является перспективным методом получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана, поскольку также не приводит к изменению структуры основной цепи хитозана.

Впервые установлено влияние СД и ММ исходного хитозана на скорость ферментативного гидролиза хитозана папаином и свойства получаемых продуктов: с увеличением СД возрастает значение Vmax, в то время как ММ субстрата практически не оказывает влияния на данный кинетический параметр и на km. Вместе с тем, величина ММ существенно сказывается на ММР продуктов ферментативного гидролиза.

Наибольшее значение Vmax наблюдается при рН реакции (4,8 - 5,5), когда аминогруппы хитозана переходят в непротонированное состояние, а макромолекула не несет никакого заряда.

Величина поверхностного натяжения растворов солей олигомеров хитозана зависит как от природы аниона остатка органической кислоты, так и от ММ олигомеров.

Изученные соли низкомолекулярного хитозана обладают бактерицидной активностью в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

- В работе предложен и реализован ферментативный метод получения олигомеров и хитозана с ММ (2,5-3,2)х104 с использованием папаина в водных растворах различных органических кислот и умеренной концентрацией субстрата (до 10 мае. %). Метод основан на дробном введении ферментного препарата в высоковязкостную среду реакции. Обнаружено, что при этом ММ и индекс полидисперсности получаемых продуктов несколько выше, чем при проведении реакции в растворах с концентрацией менее 3 мас.%.

Практическая значимость работы заключается в разработке научных основ технологии промышленного способа биодеструкции высокомолекулярного хитозана с использованием недорогого ферментного препарата растительного происхождения. Совокупность полученных научных результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными прогнозируемыми значениями ММ (2,5-3,2)х104. Отличительной особенностью данного метода гидролиза хитозана от уже существующих является использование амидгидролазы растительного происхождения -папаина в умеренно концентрированных растворах хитозана (до 10 мас.%).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 8-й Международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «0лигомеры-2002» (Черноголовка, 2002), на 7-й Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург, 2003), на 8-9-й Нижегородских сессиях молодых ученых (Нижний Новгород, 2003,2004), на 8-й Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), на конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2005), на третьем съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005), на заседании Нижегородского отделения биохимического общества (Нижний Новгород, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 18 работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 33 рисунка. Список цитируемой литературы включает 131 наименование.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Черкасова, Елена Игоревна

108 ВЫВОДЫ

1. Гидролиз хитозана в условиях окислительно-восстановительной системы пероксид водорода - аскорбиновая кислота не приводит к изменению групп основного звена полимерной цепи даже при использовании высоких концентраций пероксида водорода (до 0,9 мас.% в системе реакции). Увеличение концентрации пероксида водорода с 0,15 до 0,9 мас.% приводит к сужению индекса полидисперсности (с 47 до 8) и сдвигу ММ продуктов гидролиза в низкомолекулярную область (с 4,4x104 до 4,Зх103).

2. Гидролитическое расщепление полимерной цепи хитозана осуществляет папаин, а не хитозаназы примесей. Оптимальные условия для ферментативной реакции гидролиза папаином хитозанов с различными значениями ММ и СД: 45°С, рН 4,8-5,5, концентрация субстрата 0,05 - 0,19 моль/л. Установлено, что на оптимальные значения рН и концентрации субстрата влияют характеристики исходного хитозана (ММ и СД).

3. Впервые установлено, что Vmax реакции гидролиза хитозана папаином при проведении ее в оптимальных условиях зависит от СД хитозана и практически не зависит от его ММ. Впервые показано, что уменьшение количества ацетильных групп в молекуле хитозана значительно снижает значения Vmax реакции гидролиза. Так, при увеличении СД с 76 до 96 %, значение Vmax уменьшается с 37х10"4 до

4х10"4 моль гл. св./(лхмин). Влияния ММ и СД исследуемых хитозанов на значения кт не было установлено, однако достаточно высокие значения кт 2 2

9,0x10" - 0,7x10" моль/литр свидетельствуют о небольшой специфичности папаина к хитозанам.

4. ММР продуктов гидролиза, получаемых при помощи папаина, зависит от молекулярных характеристик субстратов. С увеличением Mw и

М п исходных хитозанов у продуктов реакции гидролиза наблюдается уменьшение средних значений Мп (от 1,92х104 до 1,11х104) , и увеличением^, /М „ (от 1,7 до 4,8).

5. Впервые установлено, что соли сукцинат и никотинат хитозана с ММ (2,5-3,2)х104 проявляют бактерицидное либо бактериостатическое действие, по отношению к Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Proteus vulgaris, в то время как аскорбат не обладает подобной активностью.

6. Хитозан с ММ от 2,8х104 до 1,8х103 проявляет поверхностно -активные свойства. Величина снижения поверхностного натяжения растворов зависит от природы кислоты-растворителя и от ММ хитозана.

7. Совокупность полученных теоретических результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными прогнозируемыми значениями ММ (2,5-3,2)х104.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Черкасова, Елена Игоревна, 2005 год

1. Абрамзон А А. Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества. Справочник / Под ред. А.А. Абрамзона, Е.Д. Щукина. J0L: Химия, 1984.-392с.

2. Актуганов Г.Э. Выделение хитозаназы штамма Bacillus sp. / Г.Э. Актуганов, А.В. Широков, А.Н. Мелентьев // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т.39, №5. - С.536-541.

3. Александров С.А. Эффективность протеолитических ферментов / С.А. Александров // Биоорганическая химия. 1994. - Т.20, №2. - С. 126133.

4. Антонов В.К. Химия протеолиза / В.К. Антонов. М.: Наука, 1991. -510с.

5. Банникова Г.Е. Гидролиз сульфата хитозана ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii / Г.Е. Банникова, П.П. Суханова, Г.А. Вихорева и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. -Т.38, №5. - С.486-489.

6. Безуглый В.Ю. Анализ полимеризационных пластмасс / Под ред. В.Ю. Безуглого. JL: химия, 1967. - 512с.

7. Беллами JI. Инфракрасные спектры сложных молекул / JI. Беллами. -М.: Изд-во Иностранной литературы, 1963. 591с.

8. Березин И.В. Практический курс химической и ферментативной кинетики / И.В. Березин, А.А. Клесов. М.: Изд-во Московского университета, 1976. - 326с.

9. Билай В.И. Методы экспериментальной микологии. Справочник / Под ред. В.И. Билай. Киев: Наукова Думка, 1982. - 310с.

10. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982. -464с.

11. Герасименко Д.В. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов / Д.В. Герасименко, И.Д. Авдйенко, Г.Е. Банниковаи др. // Прикладная биохимия и микробиология 2004. - Т.40, №3. -С.301-306.

12. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. М.: Практика, 1998.-459с.

13. Данилов С.Н. Изучение хитина / С.Н. Данилов, Е.А. Плиско // Журнал общей химии. 1954. - Т.24. - С.1761-1768.

14. Дормидонтова О.В. Экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса биодеструкции хитозана микроскопическими грибами. Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.16. / О.В. Дормидонтова. Н. Новгород, 2003. - 23с.

15. Дормидонтова О.В. Возможность получения водорастворимых олигомеров хитозана с помощью микромицетов / О.В. Дормидонтова, В.Ф. Смирнов, JI.A. Смирнова // Биотехнология. 2002. - №6. - С.27-34.

16. Ежова Е.А. Модификация «холодного» способа деацетилирования хитина / Е.А. Ежова // Материалы седьмой Международной конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». С.-Петербург: Изд-во ВНИРО, 2003. - С. 17-19.

17. Зуев Ю.С. Разрушение полимеров под действием агрессивных сред / Ю.С. Зуев. М.: Химия, 1972. - 340с.

18. Ильина А.В. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г 20Х // А.В. Ильина, Ю.В. Ткачева, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология -2002. Т.38, №2. - С.132-135.

19. Ильина А.В. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г 20Х / А.В. Ильина, Ю.В.

20. Ткачева, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. -2003. Т.39, №3. - С.273-277.

21. Ильина А.В. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана (обзор) / А.В. Ильина, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т.41, №1. - С.9-16.

22. Кабанов В.А. Практикум по высокомолекулярным соединениям / Под ред. В.А. Кабанова. М.: Химия, 1985. - 224с.

23. Комаров Б.А. Некоторые проблемы инноваций с хитозансодержащими фитопрепаратами и перспективы исследований / А.Б. Комаров, А.И. Албулов, К.А. Трескунов и др. // Бутлеровские сообщения. 2001. -№5. - С.38-41.

24. Комаров Б.А. Способ получения водорастворимых форм хитозана. Комаров Б.А., Албулов А.И. Пат. №22 15 749 С2 11.10.2003

25. Кочетков Н.К. Методы химии углеводов / Под ред. Н.К. Кочеткова. -М.: Мир, 1967.-580с.

26. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. М.: Высшая школа, 1980. - 346 с.

27. Кочкина 3. М. Влияние хитозана на фаговые инфекции / З.М. Кочкина, С.Н. Чирков // Материалы пятой Международной конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИРО. -1999.-С.1511

28. Кривцов Г.Г. Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углеводсодержащих векторов / Г.Г. Кривцов, Р.И. Жданов // Вопросы медицинской химии. 2000. - №3. - С.24-31.

29. Локшина Л.А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов / Л.А. Локшина // Биоорганическая химия. -1994. Т.20, №2. - С.134-141.

30. Марри Р. Биохимия человека / Р. Марри, Д. Гриннер, П. Мейес, В. Родуэлл. Т.1. - М.: Мир, 1993. - 382с.

31. Маурер Г. Диск-электрофорез / Г. Маурер. М.: Мир, 1971. - 247с.

32. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты / В.В. Мосолов. М.: Наука, 1971.-321с.

33. Муллагалиев И.Р. О деструкции хитозана под действием пероксида водорода / И.Р. Муллагалиев, Ю.Б. Монаков, Г.Г. Галиаскарова // Доклады РАН. 1995. - Т.345, №2. - С.199-204.

34. Муллагалиев И.Р. О деструкции хитозана под действиемперекиси водорода / И.Р. Муллагалиев, Ю.Б. Монаков, Г.Г. Галиаскарова // Доклады РАН 1995. - Т.345. №2. - С.199-204

35. Муринов К.Ю. Окислительная деструкция хитозана под действием гипохлорита натрия, пероксида водорода. Автореферат на соисканиеученой степени кандидата химических наук 02.00.04. физическая химия. - Уфа. - 2002

36. Муринов К.Ю. Хемшпоминисценция, сопровождающая деструкцию хитозана в присутствии пероксида водорода в солянокислых растворах / Муринов К.Ю., Волошин А.И., Красногорская Н.Н„ Соков Ю.Ф. // Известия Академии наук, серия химическая 2002. - №1. -С.52-55

37. Муццарелли Р.А.А. Хитозан per os. Нижний Новгород: Вектор-Тис, 2001.-370с.

38. Нието Акоста О.М. Изучение хитина из скелетов лангустов Panulirus argus / Нието Акоста О.М., Энрикас Родригес Р.Д., Витовская Г.А., Блинов Н.П. // Прикладная биохимия и микробиология 1977. - №13. - С.782-785

39. Никитин С.Ю. Экспериментальные методы в адсорбции и молекулярной хроматографии / Под ред. С.Ю. Никитина, Р.С. Петровой. М.: Изд-во МГУ, 1990. - 315с.

40. Новиков В.Ю. Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепетопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus / В.Ю. Новиков, В.А. Мухин // Прикладная биохимия и микробиология. -2003. Т.39, №5. - С.530-535.

41. Новиков В.Ю. Химический гидролиз хитина и хитозана // Материалы седьмой Международной конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». Санкт-Петербург: Изд-во ВНИРО, 2003. - С.38-43.

42. Нудьга JI.A. Получение хитозана и изучение его фракционного состава / JI.A. Нудьга, Е.А. Плиско, С.Н. Данилов // Журнал общей химии. 1973. - Т.43. - С.2555-2558.

43. Нудьга JI.A. Реологические свойства и надмолекулярная организация умеренно концентрированных растворов хитозана в уксусной кислоте в зависимости от рН / Нудьга JI.A., Бочек A.M., Каллистов О.В.,

44. Кучинский С.А., Петропавловский Г.А. // Журнал прикладной химии 1993. - Т.66, Вып. 1. - С. 198-202.

45. Остерман J1.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование / JI.A. Остерман. М.: Наука, 1981.-286с.

46. Платэ Н.А. Макромолекулярные реакции / Н.А. Платэ, А.Д. Литманович, А.В. Ноа. М.: химия, 1977. - 247с.

47. Плиско Е.А. Хитин и его химические превращения / Е.А. Плиско, JI.A. Нудьга, С.Н. Данилов // Успехи химии. 1977. - T.XLVI, Вып. 8. -С.1470-1487.

48. Плохинский Н.А. Биометрия / Н.А. Плохинский. М.: Изд-во МГУ, 1970.-367с.

49. Погодина Н.В. Конформационные характеристики молекул хитозана по данным диффузионно-седиментационного анализа и вискозиметрии / Погодина Н.В., Павлов Г.М., Бушин С.В. и др. // Высокомолекулярные соединения. 1986. - Т.28,№2. - С.232-239.

50. Рафиков С.Р. Методы определения молекулярных весов и полидисперсности высокомолекулярных соединений. Рафиков С.Р., Павлова С.А., Твердохлебова И.И. М.: Изд-во АН СССР, 1963. -462с.

51. Сильверстейн Р. Спектрофотометрическая идентификация органических соединений / Р. Сильверстейн, Г. Басслер, Т. Моррил. -М.: Мир, 1977.-590с.

52. Скорикова Е.Е. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана / Скорикова Е.Е., Вихорева Г.А., Калюжная Р.И., Зезин А.Б., Гальбрайх

53. Л.С., Кабанов В.А. // Высокомолекулярные соединения, серия А -1988. Т.ХХХ, №1. - С. 18-24.

54. Скрябин К.Г. Хитин и хитозан. Свойства, получение, применение / Под ред. К.Г. Скрябина, В.П. Варламова, Г.А. Вихоревой. М.: Наука, 2002. - 368с.

55. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М.: Химия, 1981. 284с.

56. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов / Е.П. Феофилова. М.: Наука, 1983.-258с.

57. Феофилова Е.П. О действии димилина на образование каротина Blakeslea trispora / Феофилова Е.П., Ушанова Е.А., Иванова Г.Б. // Микробиология. Вып.51. - С.267-272

58. Феофилова Е.П. Физико-химические свойства хитина крабов и некоторых микроскопических грибов / Феофилова Е.П., Терешина В.М., Иванова И.Н., Генин Я.В., Гопенгауз Ф.Л. // Прикладная биохимия и микробиология 1980. - №16. - С.377-382

59. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии / Д.А. Фридрихсберг. -Л.: Химия, 1984.-368с.

60. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии / Ю.Г. Фролов. М.: химия, 1982.-400с.

61. Цюрупа Н.Н. Практикум по коллоидной химии / Н.Н. Цюрупа. М.: Высшая школа, 1963. - 278с.

62. Чернецкий В.Н. Хитозан вещество XXI века. Есть ли у него будущее в России ? / Чернецкий В.Н., Нифатьев Н.Э. // Российский химический журнал им. Менделеева. - 1997. - T.XLI, №1. - С.80-83.

63. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана / С.Н. Чирков // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. - Т.38, №1. - С.5-13.

64. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. М.: Наука, 1965. -265с.

65. Alsarra A.I. / Molecular weight and degree of deacetylation effects on lipase-loaded chitosan bead characteristics // Alsarra A.I, Betigeri S.S., Zhang H., Evans B.A., Neau H.S. Biomaterials. 2002. - №23. - P. 36373644.

66. Ando A. / Primary structure of chitosanase produced by Bacillus circulans MH-K1. Ando A., Noguchi K., Yanagi M., Shinoyama H., Kagawa Y., Hirata H., Yabuki M., Fujii T. Journal of General and Applied Microbiology. 1992. - №38. - P. 135-144

67. Cheng C.Y. / An Aspergillus chitosanase with potential for large-scale preparation of chitosan oligosaccharides. Cheng C.Y., Li Y-K // Biotechnology and Applied Biochemistry. 2000. - №32. - P. 197-203.

68. Cheng C-Y. // An Aspergillus chitosanase with potential for large-scale preparation of chitosan oligosaccharides // Cheng C-Y, Li Y-K. BiotechnologyApplay Biochemistry. 2000. - Vol. 32. - P. 197 - 203.

69. Fenton D.M. / Purification and mode of action of a chitosanase from Penicillium islandicum // Fenton D.M., Eveleigh D.E. Journal of General Microbiology. 1981. - №126. - P. 151-165.

70. Fu J.Y. / Characterization of three chitosanase isozymes isolated from a commercial crude porcine pepsin preparation // Fu J.Y., Wu S.H., Chang S.T., Sung H.Y. Journal agriculture food chemistry. 2003. -Vol. 51, №4. -P. 1042-1048.

71. Fukamizo T. / Chitinous components of the cell wall of Fusarium oxysporum// Fukamizo Т., Ohkawa Т., Sonoda K., Toyoda H., Nishiguchi Т., Ouchi S., Goto S. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1992.- №56. P. 1632-1636

72. Fukamizo T. / Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp. N174 // Fukamizo Т., Honda Y., Goto S., Boucher I., Brzezinski R. Biochemical Journal. 1995. - №311. - P. 377-383.

73. Fukamizo T. / Specificity of chitosanase from Bacillus pumilus // Fukamizo Т., Ohkawa Т., Ikeda Y., Goto S. Biochimica et Biophysica Acta 1994. -№1205.-P. 183-188.

74. Grigolon L.B. / Modification of chitosan with free and immobilized papaine // Grigolon L.B., Azevedo A., Santos R.R., Franco T.T. In Chitin Enzymology Atec, Italy: 2001. - P. 63 - 71.

75. Henrissat B. / Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases // Henrissat В., Bairoch A. Biochemical Journal. 1996. -№316. P. 695-696.

76. Hu Zhang / Preparation of Chitooligosaccharides from Chitosan by a Complex Enzyme // Hu Zhang, Yuguang Du, Xingju Yu, Masaru Mitsutomi, Sei-ichi Aiba. Carbohydrate Research. -1999. №320. - P. 257- 260.

77. Hung Т.Н. / Purification and characterization of hydrolase with chitinase and chitosanase activity from commercial stem bromelain // Hung Т.Н., Chang Y.M., Sung H.Y., Chens C.T. Journal Agriculture food chemistry. -2002. Vol. 50, №16. - P. 4666 - 4673.

78. Ilium L. / Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient // Ilium L. Pharmaceutical Research. 1998. - Vol. 15, №9. p. 1326-1331.

79. Izume M. / Action pattern of Bacillus sp. No. 7-M chitosanase on partially N-acetylated chitosan // Izume M., Nagae S., Kawagishi H., Mitsutomi M., Ohtakara A. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1992. - №56. -P. 448-453.

80. Kolodziejska I. / Deacetylation of chitin in two-stage chemical and enzymatic process // Kolodziejska I., Wojtasz Pajak A., Ogonowska G., Sikorski Z. Bulletin of the sea fisheries institute. - 2000. - Vol. 150, №2. -P. 15-24.

81. Kumar G. / Enzymatic gelation of the natural polymer chitosan // Kumar G., Bristow J.F., Smth P.S., Payne G.F. Polymer. 2000. - №41.- P. 21572168.

82. Lee M. / Water-soluble and low molecular weight chitosan-based plasmid DNA delivery // Lee M., Nah J-W, Kwon Y., Koh J.J., Ко K.S., Kim S.W. Pharmaceutical Research. 2001. - Vol.18, №4. - P. 427-431.

83. Lowry O.N., Rosenbrough N.J., Tarr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.-1951.-V. 193 ,№ 1 .-P.265-275.

84. Lu S. // Preparation of water-soluble chitosan / Lu S., Song X., Cao D., Chen Y., Yao K. // Journal of applied Polymer Science. 2004 - Vol. 91, №6.-P. 3497-3503.

85. Lu Z. / Analysis of 94 kb of the Chlorella virus PBCV-1 330-kb genome: map positions 88 to 182 // Lu Z., II Y., Que Q., Kutish G.F., Rock D.L., Van Etten J.L. Virology. 1996. - №216. - P. 102-123.

86. Majeti N.V. / A review of chitin and chitosan applications // Majeti N.V., Kumar R. Reactive and functional polymers. 2000. - № 46. - P. 2-27.

87. Marcotte E.M. / X-ray structure of an anti-fungal chitosanase from Streptomyces N174 // Marcotte E.M., Monzingo A.F., Ernst S.R., Brzezinski R., Robertas J.D. Nature Structural Biology. 1996. - №3. - P. 155-162.

88. Masson J.-Y. / A new chitosanase gene from a Nocardioides sp. is a third member of glycosyl hydrolase family 46 // Masson J.-Y., Boucher I., Neugebauer W.A., Ramotar D., Brzezinski R. Microbiology 1995. -№141.-P. 2629-2635.

89. Masson J-Y. / Primary sequence of the chitosanase gene from Streptomyces N174 and comparison with other endoglycosidases // Masson J-Y., Denis F., Brzezinski R. Gene 1994. - № 140. - P. 103-107.

90. Mima S. / Highly deacetylated chitosan and its properties. // Mima S., Mima H., Iwamoto R., Yoshikawa S. Journal of Applied Polymer Science. 1983. - Vol. 28, №6. - P. 1909-1917.

91. Mitsutomi M. / Action of chitosanase on partially N-acetylated chitosan // Mitsutomi M., Kidoh H., Ando A. Chitin and Chitosan Research. 1995. -№1.-P. 132-133.

92. Mitsutomi M. / The action of Bacillus circulans WL-12 chitinases on partially N-acetylated chitosan // Mitsutomi M., Kidoh H., Tomita H., Watanabe T. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1995. - №59. -P. 529-531.

93. Muzzarelli R.A.A. / Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation // Muzzarelli R.A.A., Xia W., Tomasetti M., Ilari P. Enzyme and Microbial Technology. 1995. -№17. P.541-545.

94. Muzzarelli R.A.A. / Partial depolemerization of chitosans with the aid of papaine // Muzzarelli R.A.A., Terbojevich M., Muzzarelli C., Miliani M., Francescangeli O. In Chitin Enzymology. Atec, Italy: 2001. P. 63 - 71.

95. Muzzarelli R.A.A. Advances in N-acetyl-beta-D-glucosaminidases. Chitin Enzymology (R.A.A. Muzzarelli, editor) European Chitin Society, Ancona: 1993, P. 357-373.

96. Nanjo F. / Purification and characterization of an exo-beta-D-glucosaminidase, a novel type of enzyme, from Nocardia orientalis // Nanjo F., Katsumi R., Sakai K. Journal of Biological Chemistry. 1990. - №265 -P. 10088-10094.

97. Nishimura K. / Adjuvant activity of chitinderivatives in mice and guinea pigs // Nishimura K., Nishimura S., Nishi N. Vaccine. - 1985. - Vol.3, №5.-P. 375-383.

98. Nishimura K. / Immunological activity of chitin and its derivatives // Nishimura K., Nishimura S., Nishi N. Vaccine. -1994. - Vol 2, №1. - P. 93-99.

99. Nishimura K. / Macrophage activation with multi-porous beadspreparad from partially deacetylated chitin // Nishimura K., Nishimura S., Seo H. J. Biomedical Materials Research. 1986. - Vol 20, №9. - P. 1359 - 13721.

100. No H.K. / Effect of time-temperature treatment parameters on depolymerization of chitosan. // No H.K., Nah J.W., Meyers S.P. Journal of Applied Polymer Science. 2003. - Vol 87, №12. - P. 1890-1894

101. Nwe N. / Production of fungal chitosan by solid substrate fermentation followed by enzymatic extraction // Nwe N, Stevens W.F. Biotechnology Letters. 2002. - №24. - P. 131 - 134.

102. Ohno T. / A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griseus HUT 6037 // Ohno Т., Armand S., Hata Т., Nikaidou

103. N., Henrissat В., Mitsutomi M., Watanabe T. Journal of Bacteriology. -1996. №178. - P. 5065-5070.

104. Prasitsilp M. / Cellular responces to chitosan in vitro: the importance of deacetylation // Prasitsilp M., Jenwithisuk R., Kongsuwan K., Damrongchai N., Watts P. Journal of materials science: materials in medicine. 2000. -№11.-P. 773-778.

105. Sakai K. / Purification and hydrolytic action of a chitosanase from Nocardia orientalis // Sakai K., Katsumi R., Isobe A., Nanjo F. Biochimica et Biophysica Acta. 1991. - №1079. - P. 65-72.

106. Se-Jae Kim / Effects of chitooligosaccharides on liver function in the mouse // Se-Jae Kim, So-Young Kang, Seung-Lim Park, Taekyum Shin and Young Hwan Ко. Korean J. Food Sci. Technol. 1998. - Vol. 30, №3. - P. 693-696.

107. Shimosaka, M. / Cloning and characterization of a chitosanase gene from the plant pathogenic fungus Fusarium solani // Shimosaka M., Kumehara M., Zhang X.-Y., Nogawa M., Okazaki M. Journal of Fermentation and Bioengineering. 1996. - №82. - P.426-431.

108. Stokke B.T. / Sequence specificities for lysozyme depolymerization of partially N-acetylated chitosans // Stokke, B.T., Varum, K.M., Holme, H.K., Hjerde, R.J.N., Smidsrod, O. Canadian Journal of Chemistry. 1995. -№73.-P. 1972-1981.

109. Sugiyama H. / The confirmation study of chitin and chitosan oligomers in solution. // Sugiyama H, Hisamichi K., Sakai K., Usui Т., Ishiyama J. I., Kudo H., Ito H., Senda Y. Dioorganic and medicinal chemistry. - 2001. -№9.-P. 11-216.

110. Tolaimate A. / On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin. // Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi M., Alagui A., VincendomM., Vottero P. Polymer. 2000.-№ 41. - P. 2463-2469.

111. Tremblay H. / A common molecular signature unifies the chitosanases belonging to families 46 and 80 of glycoside hydrolases // Tremblay H., Blanchard J., Brzezinski R. Canadian Journal of Microbiology. 2000. -№46.-P. 952-955.

112. Vishu Kumar A.B. / Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization. // Vishu Kumar A.B., Varodaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Biochemical Biophysiology Acta. 2004. -№1670. - P.137-146

113. Vishu Kumar A.B. / Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products // Vishu Kumar A.B., Gowda L.R., Tharanathan R.N. European journal Biochemistry. 2004. - №271. -P. 713-723.

114. Varum K.M. / Determination of enzymatic hydrolysis specificity of partially N-acetylated chitosans // Varum K.M., Holme H.K., Izume M.,

115. Stokke B.T., Smidsrod О. Biochimica et Biophysica Acta. 1996. -№1291.-P. 5-15.

116. Wang W. / Determination of the Mark-Houwin K. equation for chitosan with different degrees of deacetylation. / Wang W., Bo S.Q., Li S.Q., Qin W. / Internetional Journal Biological Macromolecular. -1991.-№1315.-P. 281 -285.

117. Yamada T. / Alternative expression of a chitosanase gene produces two different proteins in cells infected with Chlorella virus CVK2 // Yamada Т., Hiramatsu S., Songsri P., Fujie M. Virology. 1997. - №230. - P. 361-368.

118. Zhang H. / Preparation of chitosanoligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Carbohydrate Research. 1999. - Vol. 320. - P. 257 - 260.

119. Zhang H. / In vitro degradation of chitosan by a commercial enzyme preparation: effect of molecular weight and degree of deacetylation / Zhang H., Neau S.H. // Biomaterials 2001. - №22. - P. 653 - 1658.