Получение, строение и свойства низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат химических наук Столбушкина, Полина Петровна

• Столбушкина, Полина Петровна
• кандидат химических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат химических наук Столбушкина, Полина Петровна

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Химическое строение и биологические свойства полисахаридов и их производных.

1.1.1. Химическое строение и биологические свойства гепарина.

1.1.2. Способы получения и биологические свойства гепариноидов.

1.1.3. Способы получения и биологическая активность производных полисахаридов хитина и хитозана.

1.2. Ферментативный гидролиз полисахаридов.

2. Разработка условий получения низкомолекулярных сульфатиро-ванных аминополисахаридов и исследование их строения и свойств.

2.1. Ферментативный гидролиз сульфата хитозана и гепарина.

2.1.1. Характеристика исходных полисахаридов, ферментных препаратов и методов оценки протекания ферментативного гидролиза.

2.1.2. Результаты скрининговых исследований ферментативного гидролиза сульфата хитозана.

2.1.3. Ферментативный гидролиз сульфата хитозана ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii.

2.1.4. Ферментативный гидролиз гепарина ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii.

2.1.5. Ферментативный гидролиз полисахаридов с использованием ферментного комплекса из Streptomyces kurssanovii.

2.2. Сульфатирование низкомолекулярных образцов хитозана.

2.3. Исследование антикоагулянтной активности препаратов сульфата хитозана и гепарина.

3. Методический раздел.

3.1. Исходные материалы и химические реагенты.

3.2. Методы синтеза.

3.3. Методы анализа.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение, строение и свойства низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов»

Биополимеры - хитин, хитозан, а также некоторые их эфиры и соли широко применяются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой отраслях промышленности. Это связано с биологической активностью данных полимеров, их биосовместимостью и биоразрушаемостъю, иммуномо-дулирующим, противомикробным, фунгистатическим, противоопухолевым, радиозащитным, гемостатическим действием и низкой токсичностью. Особый интерес представляют сульфатированные производные хитозана (СХ) как наиболее близкие структурные аналоги природного антикоагулянта крови гепарина (Г), дефицит и высокая стоимость которого стимулирует поиск и синтез его заменителей.

В последнее время большое внимание уделяется исследованию и созданию лекарственных форм на основе низкомолекулярных гепаринов (молекулярная масса 3-6 кД) и других мукополисахаридов, поскольку такие препараты обладают лучшими фармакокинетическими свойствами и меньшей токсичностью.

Ферментативный гидролиз - это мягкий и эффективный способ снижения молекулярной массы полимеров. Для гидролиза гепарина обычно используют гепариназы, но высокая стоимость и отсутствие гепариназ на отечественном рынке обусловливают необходимость поиска других более доступных ферментов, пригодных для получения низкомолекулярных гепарина и гепари-ноидов. Такими ферментами могут быть папаин и лизоцим, а также ферментные препараты целловиридин и Streptomyces kurssanovii, которые с успехом используются для снижения молекулярной массы хитина и хитозана. Принципиальная возможность ферментативного гидролиза сульфата хитозана и гепарина указанными ферментами обусловлена отсутствием у них узкой субстратной специфичности.

В разработке проблемы создания низкомолекулярных форм гепарина ведущее положение занимают американские (R. Linhardt, U. Desai), итальянские (В. Casu, G. Torn), французские (A. Frydman) и японские (S. Hirano) ученые. Российскими учеными В. Макаровым (ГНЦ РАМН), А. Гамзазаде (ИНЭ-ОС РАН) внесен существенный вклад в исследования, направленные на создание эффективных заменителей гепарина. Данная диссертация является продолжением проведенных ранее на кафедре ТХВ МГТУ совместно с ГНЦ исследований и первой из работ, посвященной получению низкомолекулярных форм сульфата хитозана.

Работа выполнена в соответствии с основными направлениями научных исследований кафедры технологии химических волокон МГТУ и лаборатории Центра "Биоинженерия" РАН при финансовой поддержке РФФИ (код проекта 02-04-49850), ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения" и грантом молодых ученых МГТУ.

Целью работы являлось исследование возможности получения низкомолекулярных сульфатированных аминополисахаридов - сульфата хитозана и гепарина, а также изучение строения и биологических свойств полученных препаратов. Для достижения поставленной цели было необходимо:

-изучить возможность получения низкомолекулярных сульфатов хитозана и гепарина с использованием метода ферментативного гидролиза неспецифическими доступными ферментами и ферментными препаратами;

-осуществить выбор наиболее эффективного ферментного препарата и оптимальных условий его действия в нативном и иммобилизованном состоянии;

-провести сульфатирование низкомолекулярных хитозанов, полученных разными способами;

-охарактеризовать биологическую активность низкомолекулярных образцов сульфата хитозана и гепарина, полученных различными методами. Научная новизна работы

Установлены закономерности ферментативного гидролиза сульфатированных аминополисахаридов - сульфата хитозана и гепарина неспецифическим ферментным комплексом (ФК) из Streptomyces kurssanovii, в том числе в иммобилизованном состоянии, главными из которых являются следующие:

- ферментативный гидролиз полисахаридов наиболее эффективным ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii протекает преимущественно по эндомеханизму;

- сульфат хитозана как более специфический субстрат, содержащий ио-ногенные группы основного и кислотного типа, гидролизуется с большей скоростью, чем гепарин, содержащий лишь кислотные группы;

- иммобилизованный ферментный комплекс по эффективности не уступает нативному, что может быть связано с фиксацией на носителе в предложенных условиях наиболее активных компонентов ферментного комплекса и минимальным изменением конформации активного центра.

При исследовании сульфатирования низкомолекулярных хитозанов показано, что низкомолекулярный хитозан, полученный ферментативным гидролизом, протекающим, главным образом, в аморфных областях, обладает наиболее упорядоченной надмолекулярной структурой и наименьшей реакционной способностью.

Впервые показана общая для гепарина и сульфата хитозана закономерность преимущественного проявления анти Ха активности с понижением молекулярной массы препаратов.

Практическая значимость работы

Предложены условия и разработан лабораторный регламент получения низкомолекулярных препаратов гепарина с молекулярной массой 3-6 кД с использованием доступного и дешевого ферментного комплекса из Streptomyces kurssanovii. Полученные препараты проявляют выраженную анти Ха активность, и имеют соотношение анти Ха и антитром биновой активности на уровне коммерческих образцов низкомолекулярного гепарина. Наработаны образцы низкомолекулярного гепарина и сульфата хитозана, необходимые для проведения исследований в тестах in vivo, в том числе в композициях и в виде микрокапсулированных форм.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, методической части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 22 рисунка, библиографию из 145 наименований.

Заключение диссертации по теме «Высокомолекулярные соединения», Столбушкина, Полина Петровна

выводы

С целью разработки способа получения низкомолекулярных препаратов гепарина и сульфата хитозана, потенциально обладающих улучшенными фар-макокинетическими характеристиками, проведено исследование закономерностей ферментативного гидролиза полисахаридов доступными неспецифическими ферментными препаратами, а также закономерностей сульфатирования низкомолекулярных хитозанов, полученных разными способами.

1. Впервые показана возможность получения низкомолекулярных препаратов сульфата хитозана двумя способами: ферментативным гидролизом высокомолекулярного полисахарида и сульфатированием низкомолекулярного хитозана. Определены параметры гидролиза (рН и температурный оптиму-мы) наиболее эффективным ферментным комплексом из S. kurssanovii, в том числе в иммобилизованном состоянии, позволяющие в 4-5 раза снизить молекулярную массу и получить препараты с ММ 5-17 кД. Для получения сульфата хитозана с такой же ММ сульфатированием низкомолекулярного хитозана необходимым является использование аморфизованного исходного хитозана с ММ не более 10 кД.

2. Установлено, что гепарин в меньшей степени подвергается ферментативному гидролизу, однако даже 2-х кратное снижение его молекулярной массы обеспечивает получение с хорошим выходом образцов с ММ 3-6 кД, что находится на уровне коммерческих препаратов низкомолекулярного гепарина,

3. Показано, что иммобилизация ферментного комплекса из S. kurssanovii приводит к повышению его устойчивости к температурным воздействиям и смещению температурного оптимума действия с 37 до 40-45°С. Иммобилизованный ферментный комплекс практически не уступает нативному в эффективности действия при гидролизе полисахаридов в оптимальных условиях.

4. Исследование строения полученных ферментативным гидролизом низкомолекулярных препаратов гепарина и СХ методами ИК и 13С ЯМР-спектроскопии показало идентичность химического строения гидролизованных и исходных полисахаридов, однако по данным элементного анализа при гидролизе протекает побочный процесс десульфатирования, более выраженный в случае СХ.

5. Исследование антикоагулянтной активности образцов гепарина показало, что с понижением молекулярной массы происходит закономерное увеличение их аХа активности и снижение антитромбиновой активности, и для образцов с ММ меньше 5 кД соотношение аХа: alia, равное 2-4, находится на уровне лучших коммерческих препаратов низкомолекулярного гепарина. Для сульфата хитозана подобная закономерность наблюдается при молекулярной массе ниже 10 кД,

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Столбушкина, Полина Петровна, 2003 год

1. Феофилова Е.П. Биологические функции и практическое использование хитина // Прикладная биохимия и микробиология.-1984.-Т.20, вып.2.-С.147-160.

2. Стейси М., Баркер С. Углеводы живых тканей. Пер. с англ.- М: Мир. 1965.324 с.

3. Химия биологически активных природных соединений (углевод-белковые комплексы, хромопротеиды, липиды, липопротеиды, обмен веществ ) / Под ред. Преображенского Н.А., Евстигнеевой Р.П.-М: Химия. 1976.424 с.

4. Meyer К.Н., Schwartz D.E. 214. Les substatuants des groupes amino de heparine // Helv.Chem.Acta.-1950.-V.33.-P.1651-1662.

5. Lindahl U., Hook M., Backtrom G. Structure and biosynthsis of heparin-like polysaccharides // Fed. Proc.-1977.-V.36.-P.19-23.

6. Исследование системы крови в клинической практике / Под ред. Козин-ца Г.И, Макарова В.А. М.: Триада-Х. 1997.480 с.

7. Макаров В.А., Дрозд Н.Н., Малыхина JI.C. Роль полисульфата хитозана в развитии антикоагулянтной терапии // Мат. пятой конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.-Щёлково:ВНИРО.-1999,-С.160-162.

8. Кожевникова И.В., Волковинская Л.П., Соколова Л.В., Норейка P.M. Способы получения гепарина // Обзорная информация ЦБНТИ Минмед-пром. сер. Химико-фармацевтическая промышленность.-1977.-№11.-С.28.

9. Cifonelli Y.A. Heparin structure, function and clinical implications. New York - London : Plenum Press, 1975.

10. Коршак A.B., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука. 1984.260 с.

11. Foster А.В., Haggard A.I. The chemistry of heparin // Adv. in Carbohydr. Chem.-1955.-V.10.-P.335-368.

12. Cifonelli J.A. The relationship of molecular weight and sulfate content and distribution to anticoagulant activity of heparin preparation // Carbohydr.Res.-1985.-V.37.-N.1.-P.145-154.

13. Graham D.T., Pomeroy A.R. Relative activites of heparin fractions obtained by gel chromatography // Thromb. and Haemost.-1980.-V.42.-P. 1598-1603.

14. Бычков C.M. Новые данные о гепарине // Вопросы мед. химии.-1981.-№2.-С.725-735.

15. Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Получение гепарина из животной ткани методом ультрафильтрации // Мясная индустрия.-2000.-№7.-С.29-31.

16. Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Получение гепарина и хондроитинсуль-фата из животной ткани ионообменным методом // Прикладная биохимия и микробиология.-1998.-Т.34.-№6.-С.692-697.

17. Кудряшов Б.А., Аммосова Я.М., Ляпина J1.A., Осипова Н.Н. Гепарин из таволги вязколистной, его свойства // Изв. АН СССР. Серия биологиче-ская.-1991.-№6.-С.939-943.

18. Макаров В.А., Кондратьева Т.Б. Применение гепаринов в клинической практике // Русский медицинский журнал.-1998,- Т.6.-№3.-С. 1-4.

19. Kelton J.G. Heparin-induced thrombocytopenia // Haemostasis. -1986,-V.16.-P.173-186.

20. Matzsch Т., Bergqvist D., Hender U., Nilsson В., Ostergaard P. Heparin-induced osteoporosis in rats // Thrombosis and Haemostasis.-1986.-V.56.-N.3.-P.293-294.

21. Frydman A. Low-molecular-weight heparins: an overview of their pharmacodynamics, pharmacokinetics and metabolism in humans // Haemostasis.-1996.-V.26.-N.2.-P.24-38.

22. Linhardt R.J., Gunay N.S. Production and chemical processing of low molecular weight heparins// Semin. Thromb. Hemost.-1999.-V.25.-N.3.-P.5-16.

23. Jeske W., Fareed J. In vitro studies on the biochemistry and pharmacology of low molecular heparins // Semin. Thromb. Hemost.-1999.-V.25.-N.3.-P.27-33.

24. Fareed J., Hoppensteadt D., Jeske W., Clarizio R., Walenga J.M. Low molecular weight heparins: are they different? // Can. J. Cardiology.-1998.-V.14.-N.2.-P.28-34.

25. Choo J., Kereiakes D. Low molecular weight heparin therapy for percutaneous coronary intervention: a practice in evolution // J.Thromb.Thrombolysis.-2001.-V.ll.-N.3.-P.235-246.

26. Verhaeghe R. The use of low-molecular-weight heparins in cardiovascular disease // Acta Cardiol.-1998.-V.53.-P. 15-21.

27. Nunnelee J.D. Low-molecular-weight heparin // J. Vase. Nurs.- 1997.-V.15,-P.94-96.

28. Hirsh J. Heparin and low-molecular weight heparins // Coron Artery Dis.-1992.-N.3.-P.990-1002.

29. Wang Q.L., Shang X.Y., Zhang S.L., Ji J.В., Cheng Y.N., Meng Y.J. Effect of inhaled low molecular weight heparin on airway allergic inflammation in aerosol-ovalbumin-sensitized guinea pigs // Jpn. J. Pharmacol.-2000.-V.82.-N.4.-P.326-330.

30. Linhardt R.J., Loganathan D.,A1-Hakim A., Wang H-M., Walenga J.M., Hoppensteadt D., Fareed J. Oligosaccharide mapping of low molecular weight heparins:structure and activity differences // J. Med. Chem.-1990.-V.33.-N.6.-P. 1639-1645.

31. Volpi N. Characterization of heparins with different relative molecular masses by various analytical techniques // J. Chromatogr.-1993.-V.622.-N.l,-P.13-20.

32. Nagasawa K., Uchiyama H., Sato N., Hatano A. Chemical change involved in the oxidative-reductive depolymerization of heparin // Carbohydr. Res.-1992-V.236.-N.15.-P. 165-180.

33. Lahiri В., Lai P.S., Pousada M., Stanton D., Danishefsky I. Depolymerization of heparin by complexed ferrous ions // Arch. Biochem. Bio-phys.-1992.-V.293.-N.14.-P.54-60.

34. Дутремпюиш К.Р., Содюпрей Ф., Дебиофарм С.А. Антитромботиче-ские негеморрагические композиции на основе гепарина, способ их получения и терапевтические дозы. Пат.№97104917/14.Россия.27.06.2000г.

35. Jeske W., Iqbal О., Gonella S., Boveri G., Torn G., De Ambrosi L., Fareed J. Pharmacologic profile of low-molecular-weight heparin depolymerized by gamma-irradiation//Semin. Tromb. Hemost.-1995.-V.21.-N.2.-P.201-211.

36. Bisio A., Ambrosi L., Gonella S., Gonella M., Guglieri S., Maggi G., Torn G. Preserving the original heparin structure of a novel low-molecular-weight heparin by gamma-irradiation // Arzneimittelforschung.-2001.-V.51.-N.10.-P.806-813.

37. Шоай С.А. Очищенная гепариновая фракция, способ ее получения и содержащая ее фармацевтическая композиция. Пат.№2133253.Россия. 1999 г.

38. Naggi A., Torri G., Casu В. "Supersulfated" heparin fragments, a new type of low-molecular weight heparin // Biochemical Pharmocological.-1987.-V.36.-N 12.-P.1895-1900.

39. Hoppensteadt D., Walenga J.M., Fareed J. Low molecular weight heparins. An objective overview // Drugs Aging.-1992.-V.2.-N.5.-P.406-422.

40. Nightingale S.L. From the Food and Drug Administration. // JAMA.-1993.-V.270.-N.22.-P. 1672-1674.

41. White R.H., Ginsberg J.S. Low-molecular-weight herarins: are they all the same? // British J. Haematology.-2003.-V.121.-P.12-20.

42. Morris T.A., Marsc J.J., Konopka R., Pedersen C.A., Chiles P.G. Antithrombotic efficacies of Enoxaparin, Dalteparin, and Unfractionated Heparin in venous thrombo-embolism // Thromb. Res.-2000.-V.100.-P.185-194.

43. Ostergaard P.B., Nilsson В., Bergqvist D., Hedner U., Pedersen P.C. The effect of low molecular weight heparin on experimental thrombosis and

44. Casu В., Torn G. Structural characterization of low-molecular weight heparins. // Semin. Thromb. Hemost.-1999.-V.25.-N.3.-P.17-25.

45. Rasine E. Differentiation of low-molecular weight heparins // Pharmacother-apy.-2001.-V.21.-P.62-70.

46. Daud A.N., Ahsan A, Iqbal O., Walenga J.M., Silver P.J., Ahmad S., Fareed J. Synthetic heparin pentasaccharide depolymerization by heparinase 1 molecular and biological implications // Clin. Appl. Thromb. Hemost.-2001.-V.7.-N.1.-P.58-64.

47. Mattsson C., Palm M., Soderberg K., Holmer E. Antitrombotic effects of heparin oligosaccharides // Ann.N.Y.Acad.Sci.-1989.-V.556.-P.323-332.

48. Petitou M., Herault J.P., Bernat A., Driguez P.A., Duchaussoy P. Synthesis of thrombin-inhibiting heparin mimetics without side effects // Nature.-1999.-Y.398.-P.417-422.

49. Buchanan M.R., Blister S.J., Ofosu F. Prevention and treatment of thrombosis: novel strategies arising from our understanding the healthy endothelium // Wien. Klin. Wochenschr.-1993.-V.105.-N.l 1 .-P.309-313.

50. Buchanan M. R., Liao P., Smith L. J., Ofusu F. A. Prevention of thrombus formation and growth by antithrombin III and heparin cofactor II-dependent thrombin inhibitors: importance of heparin cofactor II // Thromb. Res.-1994.-V.74.-N.5.-P.463-475.

51. Назаров И.В., Шевченко H.M., Ковалев Б.М., Хотимченко Ю.С. Имму-номоделирующие свойства полисахаридов из красных водорослей: влияние на систему комплемента // Биология моря.-1998.-Т.24.-№1.-С.50-53.

52. Усов А.И., Смирнова Г.П., Билан М.И., Шашков А.С. Полисахариды водорослей. Бурая водоросль Laminaria saccharina как источник фукоидана // Биоорган, химия.-1998.-Т.24.-С.437-445.

53. Nishino Т., Nagumo Т. The sulfate-content dependence of the anticoagulant activity of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome // Carbohydr. Res.-1991.-V.214.-P. 193-197.

54. Наджи А., Торри Д. Полусинтетические сульфаминогепаросансульфа-ты, имеющие высокую антиметастатическую активность и пониженный геморрагический риск. Патент №2176915 Россия.

55. Casu В., Grazioli G., Razi N., Guerrini M., Naggi A. Heparin-like compounds prepared by chemical modification of capsular polysaccharide from Escherichia coli K5 // Carbohydr. Res.-1994.-V.263.-N.2.-P.271-284.

56. Razi N., Feyzi E., Bjork I., Naggi A., Casu В., Lindahl U. Structural and functional properties of heparin analogues obtained by chemical sulphation of Escherichia coli K5 capsular polysaccharide // Biochem. J.-1995.-V.15.-P.465-472.

57. Geresh Sh., Mamontov A., Weinstein J. Sulfation of extracellular polysaccharides of red microalgae: preparation, characterization and properties //J. Biochem. Biophys. Methods.-2002.-V.50.-P.179-187.

58. Плиско E.A., Нудьга JI.А. Хитин и его химические превращения // Успехи химии,- 1984.-Т.46, №8.-С. 1470-1487.

59. Марьин А.П., Феофилова Е.П., Генин Я.В. Влияние кристалличности на сорбционные и термические свойства хитина и хитозана // Высокомолекулярные соединения. Сер.Б.-1982,- Т.24.-№9.-С.658-662.

60. Феофилова Е.П. Биологические функции и практическое использование хитина // Прикладная биохимия и микробиология.-1984.-Т.20, вып.2.-С.147-160.

61. Зеленецкий С.Н. О пластифицирующем действии воды при получении хитозана из хитина непрерывным способом в двухшнековом экструдере // Пластические массы.-1998.-№1 .-С.29-33.

62. Гафуров Ю.Ф., Мамонтова В.А., Рассказов В.А. Средство наружного применения препаратов "Полимед", "Автохит", "Гидрохит" // Мат. шестой Международной конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана".-М.-Щёлково:ВНИРО.-2001 .-С. 150-152.

63. Быкова В.М., Кривошеина Л.Н. Хитин, хитозан биополимеры XXI века // Пища, вкус, аромат.-2000.-№1 .-С.4-7.

64. Новик А.А., Цыган В.Н., Жоголев К.Д., Никитин В.Ю. Применение препаратов на основе хитина и хитозана в медицине // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов.-М:ВИНИТИ.-2000.-№8.-С.90-106.

65. Дубинская A.M., Добротворская А.Е. Применение хитина и его производных в медицине // Хим-фарм. журнал.-1989.-Т.23.-№5.-С.623-628.

66. Kweon D.-K., Song S.-B., Park Y.-Y. Preparation of water-soluble chito-san/heparin complex and its application as wound healing accelerator // Bioma-terials.-2003.-V.24.-P. 1595 -1601.

67. Марквичева E.A. Хитозан и его производные в биоинкапсулировании приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под редакцией К.Г. Скрябиа, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова.-М: Наука, 2002.-365 с.

68. Червинец В.М., Комаров Б.А. Способ лечения хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Пат.№2145975. Россия. 2000 г.

69. Niscimura К., Niscimura S., Nisei N. Immunological activity of chitin and its derivaties // Vaccine.-1984.-V.2.-N.l.-P.93-99.

70. Немцев C.B., Ильина A.B., Шинкарев C.M., Албулов А.И., Варламов В.П. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана // Био-технология.-2001.- № 6.-С. 37-42.

71. Бегунов И.И., Калугин Н.Ф., Догаленко В.Н., Стрелков Е.В. Нарцисс-альтернативахимическим протравителям // Мат. шестой Международной конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана".-М.-Щёлково:ВНИРО.-2001 .-С.16-11.

72. Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г. и др. Производные хитина и хитозана как элиситоры фитофторустойчивости картофеля // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.-Т.36.-№4.-С.433-438.

73. Таирова А.Р. Состояние минерального обмена в организме коров на фоне применения хитозана // Мат. шестой Международной конф. "Новые

74. Косяков В.Н., Яковлев Н.Г., Велешко И.Е. Хитин-хитосодержащие материалы для дезактивации жидких радиоактивных отходов // Мат. 6-ей Международной конф. "Новые достижения в исследовании хитина и хито-зана".-М.-Щёлково:ВНИРО.-2001.-С.287-290.

75. Горбачева И.Н. Разработка способа получения водорастворимых сульфатов хитина и хитозана и исследование их свойств Дис.к.х.н.-М.: Текстильный Институт .-1990.С.236.

76. Hirano S., Nanako Y., Tobetto К. Effect of sulfated derivatives of chitosan on some blood // Carbohydr. Res.-1985.-V.137.-P.205-215.

77. Норейка P.M., Колодзейскис B.C., Дуденас Г.Э. Исследования фракционного состава сульфата хитозана // Тез. докл.конф. "Актуальные вопросы разработки, изучения и производства лекарственных средств" Каунас,-1985.-С.113-116.

78. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана // Прикладная биохимия и микробиология.-2002 -Т.38.-№1.-С.5-13.

79. Корнилаева Г.В., Макарова Т.В., Гамзазаде А.И., Скляр A.M. Сульфа-тированные производные как ингибиторы ВИЧ-инфекции // Иммуноло-гия.-1995.-№5.-С. 13-16.

80. Nishimura S., Kai Н., Yoshida Т. Regiocelective syntheses of sulfated polysaccharides: specific anti-HIV-1 activity of novel chitin sulfates // Carbohydr. Res.-1998.-V.306.-N.3.-P.427-433.

81. Соловьева M.A., Горбачева И.Н., Вихорева Г.А., Гальбрайх JI.C., Ры-женков В.Е. Влияние сульфата хитозана на активность липопротеинлипазы // Вопросы медицинской химии.-1994.-Т.40.-№2.-С.37-39.

82. Gamzazade A.I., Nasibov S.M., Rogozhin S.V. Study of lipoprotein sorption by some sulfoderivatives of chitosan // Carbohydr. Polymer.-1997.-V.31.-P.l-4.

83. Chen C.S., Liau W.Y., Tsai G.J. Antibacterial effects of N-sulfonated and N-sulfobenzoyl chitosan and application to oyster preservation // J. Food Prot.-1998.-V.69.-N.9.-P.1124-1128.

84. Wolfrom M.L. Sulfated aminopolysasccharides. Patent N. 283 2766. USA 1958.

85. Гальбрайх Jl.С., Ениколопов Н.С., Горбачева И.Н., Вихорева Г.А., Зе-ленецкий С.Н. Способ получения биологически активного сернокислого эфира хитозана // Авторское свидетельство № 2034851.

86. Горбачева И.Н., Скорикова Е.Е., Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С., Баби-евский К.К. Строение и свойства сульфата хитозана // Высокомолекулярные соединения. Сер. А.-1998.-Т,33.-№9.-С.1899-1903.

87. Vongchan P., Sajomsang W., Subyen D., Kongtawelert P. Anticoagulant activity of sulfated chitosan // Carbohydr. Res.-2002.-V.337.-P. 1233-1236.

88. Гамзазаде А.И., Скляр A.M. Способ получения сульфатированного хитозана. Пат.№2048474. Россия. 1995 г.

89. Lin C.W., Lin J.C. Surface characterization and platelet compatibilityevalua-tion of surfase-sulfonated chitosan membrane // J. Biomater. Sci. Polym. Ed.-2001.-V.12.-N.5.-P.543-557.

90. Holme K.R, Perlin A.S. Chitosan N-sulfate. A water-soluble polyelectro-lyte // Carbohydr. Res.-1997.-V.302.-P.7-12.

91. Будовская К.Э. Изучение взаимосвязи строения и свойств производных хитозана с иногенными группами различных типов: Дис.к.х.н.-М.: МГТУ. -2000.-С. 147.

92. Baumann Н. The role of regioselectively sulfated and polysaccharide of biomaterials for reducing platelet and plasma protein adhesion // Semin. Thromb. Hemost -2001 .-V.27.-N.5.-P.445-463.

93. Грачёва И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. -М: Элевар.2000.335 с.

94. Koga D., Mitsutomi М., Kono М., Matsumiya М. Biochemistry of chitinases // Exs.-1999.-V.87.-P.l 11-123.

95. Yoon H.G., Kim H.Y., Kim H.K., Hong B.S., Shin D.H., Cho H.Y. Thermostable chitosanase from Bacillus sp. strain CK4: its purification, characterization, and reaction patterns // Biosci. Biotechnol. Biochem.-2001.-V.65. -P.802-809.

96. Stoyachenko I.A., Varlamov V.P., Davankov V.A. Chitinases of Streptomyces kurssanovi purification and some properties // Carbohydr. Poly-mer.-1994.-V.24.-P.47-54.

97. Стояченко И.А. Выделение, очистка хитиназ Streptomyces Kurssanovii и ферментативное расщепление хитина и хитозана. Дисс.к.х.н.-М.: Институт биохимии.-1992.-С.169.

98. Ильина А.В., Татаринова Н.Ю., Тихонов В.Е., Варламов В.П. Внеклеточные протеаза и хитиназа, продуцируемые культурой Streptomyces kurssanovii // Прикладная биохимия и микробиология.-2000.-Т.36.-№ 2.-С.184-188.

99. Tikhonov V.E., Yamskov 1.А., Varlamov V.P., Ilyina A.V., Davankov V.A. Chitinolytic digestibility of cross-linked chitosan gels by an enzyme complex from Streptomyces Kurssanovii // Biotechnol. Appl. Biochem-1993.-V.17.-P.251-256.

100. Ilyina A.V., Tikhonov V.E., Albulov A.I. Enzymic preparation of asid-free-water-soluble chitosan // Process Biochemistry .-2000.-V.35.-P.563-568.

101. Muzzarelli RAA Depolymerization of chitins and chitosans with hemicellulase, lysosyme, papain and lipases. In Chitin Handbook / R.A.A. Muzzarelli and M.G. Peter. European Chitin Society, Atec, Grottammare, Italy. 1997. P.153-163.

102. Aiba S. Lysozymic hydrolysis of partially N-acetylated chitosans // Int. J. Biol. Macromol.-1992.-V.14.-P.225-228.

103. Muzzarelli R.A.A. Depolymerization of methilpyrrolidinonechitosan by lysozym // Carbohydrate Polymers.-1992.-V.l9.-N.l .-P.29-34.

104. Ильина A.B., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г20Х // Прикладная биохимия и микробиология.-2002.-Т.38.-№ 2.-С.132-135.

105. Lusta К.A., Chung I.K., Sul I.W., Park H.S., Scin D.L. Immobilization of fungus Aspergillus sp. by a novel cryogel technique for production of extracellular hydrolytic enzymes // Proc. Biochem.-2002.-V.35.-P.l 177-1182.

106. Sutherland I.W. Polysaccharide lyases // FEMS Microbiology Reviews.-1995.-V.16.-P.323-347.

107. Jandik K.A., Gu K., Linhardt R.J. Action pattern of polysaccharide lyases on glycosaminoglycans // Glycobiology.-1994.-V.4.-N.3.-P.289-296.

108. Matzsch Т., Berggvist D., Hedner U., Ostergaard P. Effects of an enzymatically depolymerized heparin as compared with conventional heparin in healthy volunteers // Tromb. Haemost.-1987.- V. 57.-P.97-101.

109. Linhardt R.J.,Grant A., Cooney C.L., Langer R. Differential anticoagulant activity of heparin fragments prepared using microbial heparinase // J. Biol, Chem. 1982.-V.257.-P.7310-7313.

110. Godavarti R., Sasisekharan R. A Comparative Analysis of the Primary Sequences and Characteristics of Heparinases I, II, and III from Flavobacterium heparinium II Biochemical and biophysical research communications.-1996,-V.229.-P.770-777.

111. Rhomberg A.J., Shriver Z., Biemann K., Sasisekharan R. Mass spectrometry evidence for the enzymatic mechanism of the depolymerization of heparino-like glycosaminoglycans by heparinase II // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1998.-V.95.-P. 12232-12237.

112. Toida Т., Hileman R., Smith A., Vlahova P.,Linhardt R. Enzymatic preparation of heparin oligosaccharides containing antithrombin III binding sites // J. Biological chemistry.-1996.-V.271 .-N.50.-P.32040-32047.

113. Rice K.G., Linhardt R.J. Study of structurally defined oligosaccharide substrates of heparin and heparan monosulfate lyases // Carbohydr. Res.-1989,-V.190.-P.219-233.

114. Perlin A., Gallo C., Jandik K.A., Han X.J., Linhardt R.J. Preparation and structural characterization of large heparin-derived oligosaccharides // Glycobi-ology.-1995.-V.5.-N.l.-P.83-95.

115. Zimmermann J., Lewis N., Heft R. Metod for the enzymatic neutralization of heparin. Pat. №5262325. USA. 1993.

116. Lasker S.E., Stivala S.S. Physicochemical studies of fractionated bovine heparin // Archives of biochemistry and biophysics.-1966.-V.l 15.-P.360-372.

117. Farndale R.W., Buttle D.J., Barrett A.J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glucosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue //Biochim. Biophis. Acta.-1986.-V.883.-N.2.-P.173-177.11

118. Desai U.R., Linhardt R.J. Molecular weight of heparin using С Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy // Reprinted from J. of Pharmaceutical Sci-ences.-1995.-V.84.-N.2.-P.212-215.

119. Акопова Т.А. Химические превращения хитина и хитозана в твердом состоянии при механическом воздействии. Дис.к.х.н. М.: МГТУ.-2001 120 С.

120. Thurnberg L., Backstrom G., Lindahl L.J. Further characterization of the antithrombin-binding sequence of heparin // Carbohydr. Res.-1982.-V. 100.-P. 393-410.

121. Walenga J.M., Petitou M., Lormeau J.C., Samama M., Fareed J. Antithrombotic activity of a synthetic heparin pentasaccharide in a rabbit stasis thrombosis model using different thrombogenic challengers // Thromb. Res.-1987.-V.46.-P. 187-198.

122. Thomas D.P., Merton R.E., Gray E., Barrowdiffe T.W. The relative antithrombotic effectiveness of heparin, a low molecular weight heparin, and a pentasaccharide fragment in an animal model // Thrombosis and Haemostasis.-1981.-V.61.-P.204-207.

123. Папков С.П. Физико-химические основы переработки полимеров.-М.: Химия. 1971.372 с.

124. Miller G.L. Use of dinitrosalicylis asid reagent for determination of reducing sugar // Anal. Chem.-1959.-V.31 .-P.426-428.

125. Spector T. Refinement of the Comassie Blue method of protein quantitation //Anal. Biochem.-1978.-V.86.-P. 141-146.

126. Plelcher C.H., Cunningham M., Nelsestuen G.L. Kinetic analysis of various fractions and heparin substitutes in the thrombin inhibition reaction // Bio-chimica et Biophysica Acta.-1985.-V.838.P.106-l 13.

127. Баркаган 3.C., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М: Ньюдиамед. 2001. 296 с.