Получение низкомолекулярного хитозана и его производных, обладающих защитными и репарационными свойствами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат технических наук Львова, Анна Александровна

• Львова, Анна Александровна
• кандидат технических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат технических наук Львова, Анна Александровна

Содержание.

Список используемых сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Хитин.Ю

2.2. Хитозан.

2.3. Получение низкомолекулярного хитозана.

2.3.1 Химические способы гидролиза.

2.3.2. Физические способы гидролиза.

2.3.3. Ферментативный гидролиз.

2.3.3.1. Гидролиз хитозана протеолитическими ферментами.

2.4. Области применения хитозана.

2.5. Индукция устойчивости растений.

2.5.1 Локальная индуцированная устойчивость.

2.5.2. Системная индуцированная устойчивость.

2.5.3. Раневая репарация.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Объекты исследования.

3.2. Физико-химические методы исследования.

3.3. Биологические методы исследования.

3.3.1. Элиситорная активность.

3.3.2. Раневая репарация.

3.4. Статистическая обработка данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Определение качественных и количественных характеристик ферментного препарата Фитопаин.

4.2. Оптимизация процесса ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана с помощью ферментного препарата Фитопаин.

4.2.1. Выбор оптимального значения рН.

4.2.2. Выбор оптимальной температуры.

4.2.3. Выбор оптимальной продолжительности процесса.

4.2.4. Выбор оптимального фермент-субстратного соотношения.

4.2.5. Влияние активаторов на процесс ферментативного гидролиза.

4.2.6. Методика ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана Фитопаином.

4.2.7. Технологическая схема процесса получения низкомолекулярного хитозана из высокомолекулярного хитозана с помощью ферментного препарата Фитопаин.

4.3. Влияние параметров хитозана на его элиситорную активность.

4.3.1. Молекулярная масса хитозана.

4.3.2. Степень дезацетилирования хитозана.

4.3.3. Концентрации хитозана.

4.3.3.1. Влияние концентрации хитозана на его способность индуцировать локальную устойчивость.

4.3.3.2. Влияние концентрации хитозана на раневую репарацию тканей клубней картофеля.

4.3.4. Индукция хитозаном системной устойчивости клубней картофеля.

4.4. Интенсификация элиситорной активности хитозана с помощью салициловой кислоты.

4.4.1. Композиция хитозана с салициловой кислотой.

4.4.2. Производные хитозана с салициловой кислотой.

4.4.3 .Влияние производных хитозана на развитие фитофтороустойчивости клубней картофеля.

4.4.4. Влияние производных хитозана на процесс раневой репарации клубней картофеля.

4.4.5. Технологическая схема получения >Т-2-гидрокси-3-метоксибензш1-1Я-пиридоксхитозана.

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение низкомолекулярного хитозана и его производных, обладающих защитными и репарационными свойствами»

Актуальность темы. Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому применению этих природных полимеров в таких областях как медицина, косметология, пищевая промышленность, ветеринария, а также в сельском хозяйстве для защиты растений от болезней.

Сельскохозяйственные растения постоянно находятся в условиях экологического стресса. Они страдают от болезней и вредителей, бесконтрольного применения пестицидов и избытка удобрений, а также других неблагоприятных факторов. В этих условиях защита растений от болезней и стрессов является особенно актуальной. Одним из наиболее перспективных способов повышения защитных ответов растений является метод индуцирования их устойчивости с помощью экологически безопасных биогенных элиситоров [87,10], к числу которых относится хитозан [19].

Элиситоры - соединения, вызывающие или индуцирующие защитные механизмы в растительных тканях и тем самым предохраняющие растения от болезней и стрессов [96].

Препятствием в использовании хитозана в качестве элиситора является его плохая растворимость в воде при нейтральном рН, с чем, по-видимому, частично может быть связана его невысокая биологическая активность. Для решения этой проблемы предпринимаются попытки снижения молекулярной массы хитозана, создания композиционных препаратов на его основе, а также синтеза новых производных, водорастворимых при нейтральном значении рН.

Одной из возможностей интенсификации защитных свойств хитозана является его комбинация с салициловой кислотой (СК) [92].

Известно, что СК принимает участие в процессе формирования устойчивости растений [72; 41; 96; 10], и является сигнальной мобильной молекулой, способной транспортироваться по тканям растений, вызывая их системную устойчивость. Создание и использование на практике композиционных препаратов хитозана с сигнальными молекулами, обладающих высокой скоростью и интенсивностью индуцирования в растениях системных защитных реакций, являются достаточно перспективными.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в получении низкомолекулярного хитозана и его производных с салициловой кислотой для поиска среди них новых высокоэффективных защитных препаратов, индуцирующих фитофтороустойчивость и стимулирующих процесс залечивания механических поранений у клубней картофеля.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

1. Оптимизировать метод ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана (ВМХ 700 кДа) с помощью ферментного препарата (ФП) Фитопаин и определить условия получения низкомолекулярных образцов хитозана (НМХ) с заданной молекулярной массой 5-50 кДа.

2. Разработать технологическую схему производства НМХ из ВМХ с помощью ФП Фитопаин.

3. Исследовать влияние степени дезацетилирования (СД), молекулярной массы (ММ) и концентрации полученных образцов хитозана, на элиситорную и репарационную способность тканей клубней картофеля. Из полученных НМХ выбрать образец, обладающий наибольшей биологической активностью.

4. На основе выбранного образца хитозана, синтезировать его производные с салициловой кислотой (СК), изучить их биологическую активность. Определить препарат, проявляющий наибольшую способность индуцировать локальную и системную устойчивость клубней картофеля. Разработать технологическую схему его получения.

Научная новизна работы. Установлена возможность гидролиза ВМХ (700 кДа) ферментным препаратом Фитопаин. Оптимизирован метод и подобраны условия для получения образцов НМХ с заданной характеристикой молекулярной массы от 5 до 50 кДа. Разработана технологическая схема и подобраны условия проведения ферментативного гидролиза хитозана с помощью Фитопаина. Наибольшей элиситорной и репарационной активностью обладает образец хитозана с ММ 5 кДа и СД 85%, индуцирующий фитофтороустойчивость и стимулирующий процесс залечивания механических поранений клубней картофеля. Показано, что элиситорная и репарационная активность хитозана имеет не только локальный, но и системный характер.

С целью интенсификации защитных свойств хитозана (ММ 5 кДа и СД 85%) были синтезированы его производные с системной мобильной сигнальной молекулой СК. Впервые проведенный скрининг производных хитозана позволил установить, что наибольшим защитным эффектом обладает >1-2-гидрокси-3-метоксибензил-1М-пиридоксхитозан, который в диапазоне испытанных концентраций превосходит свойства исходного хитозана. Установлено, что N-2-гидрокси-З-метоксибензил-КГ-пиридоксхитозан обладает:

• элиситорной активностью, защищая картофель от возбудителя фитофтороза;

• репарационными свойствами, активно залечивая участки механических поранений клубней картофеля и тем самым предохраняя их от проникновения инфекции;

• защитными и репарационными свойствами в низких концентрациях (0,1-1 мкг/мл), в которых исходный хитозан активностью не обладает.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе НМХ (5 кДа), полученного, по разработанной методике, ферментативным гидролизом с помощью ФП Фитопаин, был синтезирован новый высоко активный препарат -элиситор, способный в малых концентрациях повышать фитофтороустойчивость и репарационную активность клубней картофеля.

Фитофтороз является одной из наиболее вредоносных болезней картофеля, уносящей в годы эпифитотий до 50% его урожая. Репарационная способность картофеля также представляет немалую важность для сельскохозяйственного производства, поскольку пораненная поверхность клубней, неизбежная при уборке и транспортировке, открывает возможность беспрепятственного проникновения инфекции. Полученный препарат (N-2-гидрокси-З-метоксибензил-N-пиридоксхитозан) даже в малых концентрациях интенсифицировал защитные ответы картофеля и увеличивал скорость их распространения, что является весьма существенным для сохранения урожая.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на 4-ом Международном научно-практическом симпозиуме «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологии», (г. Москва, 2008); Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Технологии и оборудование химической, биологической и пищевой промышленности» (г. Бийск, 2008); 9-ой международной конференции «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» (г. Ставрополь,

2008); 5-ом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. tb

Москва, 2008); 9 International Conference of the European Chitin Society (Venice, Italy, 2009); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково,

2009); 10-ой международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (г. Нижний Новгород, 2010).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования в лаборатории инженерии ферментов (Центр «Биоинженерия» РАН) й в лаборатории биохимии фитоиммунитета (Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН), а также обобщение результатов по теме диссертационной работы выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 24 рисунков, библиографию из 105 наименований, из них 68 на иностранном языке.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Львова, Анна Александровна

-875. ВЫВОДЫ

1. Изучен процесс'7 гидролиза высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Фитопаин, и подобраны условия для получения низкомолекулярного хитозана с заданной ММ 5-50 кДа.

2. Разработана, опробована и оптимизирована технологическая схема процесса ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана с помощью ферментного препарата Фитопаин.

3. Из полученных образцов низкомолекулярного хитозана наибольшую защитную (элиситорную) и репарационную активность проявил образец хитозана с ММ 5 кДа и СД 85%, максимально индуцирующий фитофтороустойчивость и стимулирующий процесс залечивания механических поранений клубней картофеля в концентрации 100 мкг/мл. Установлено, что элиситорная и репарационная активность хитозана имеет как локальный, так и системный характер.

4. Впервые для интенсификации защитных свойств хитозана были синтезированы и испытаны на биологическую активность его производные с системной сигнальной молекулой (салициловой кислотой).

5. Проведенный скрининг производных хитозана позволил установить, что наибольшим защитный эффект проявлял >Т-2-гидрокси-3-метоксибензил-1Ч-пиридоксхитозан, обладая: элиситорной активностью, защищая картофель от возбудителя фитофтороза; высокими репарационными свойствами, активно залечивая участки поранений клубней картофеля, предохраняя их от проникновения инфекции; защитной и репарационной активностью в более низких концентрациях

0,1-1 мкг/мл) по сравнению с хитозаном.

6. Оптимизированы условия для получения Н-2-гидрокси-3-метоксибензил-!М-пиридоксхитозана и разработана технологическая схема процесса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Львова, Анна Александровна, 2010 год

1. Allan G.G., Peyron M. Molecular weight manipulation of chitosan II: prediction and control of extent of depolymerization by nitrous acid // Carbohydrate research. -1995.-V.277.-N.2.- P.273-282.

2. Bolwell G.P. Role of active oxygen species and NO in plant defence responses Cur. Opin. Plant Biol. -1999. -V. 2. 4. -P. 287-294.

3. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976.-V. 72.-P. 248-254.

4. Cauchie H-M. Chitin production by arthropods in the hydrosphere // Hydrobiologia. 2002. -V. 470. - N. 1/3.- P. 63-95.

5. Chen Z., Klessig D.F. Identification of a soluble salicylic acid-binding protein that may function in signal transduction in the plant disease-resistance response Proc.// Nath. Acad. Sci.USA. -1991. -V. 88. -P. 8179-8183

6. Cruickshank I.A., Perrin D.R. The isolation and partial characterization of Monilicolin A, a polypeptid with phaseollin-inducing activity from Monilinia fructicola// Life Sci. -1968.-V. 7. -P. 449-458.

7. Dempsey D.M.A., Shah J., Klessig D.F. Salicylic acid and disease resistance in plants // Critical Review of Plant Science. -1999. -V.18. P.547-575

8. Dong X. Finding the missing pieces in the puzzle of plant disease resistance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -V. 92. - P. 7137-7139.

9. Dumer J., Wendehemme D., Klessig D.F. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP and cyclic ADP-ribose // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95.-P. 10328-10333.

10. Durrant W.E., Dong X. Systemic acquired resistance // Annu. Rev. Phytopathol. -2004. -V. 42. -P. 185-209.

11. Feussner I., Wasternack C., The Lipoxygenase way// Annu. Rev. Plant Biol. -2002. -V. 53. -P.275-280

12. Gaffney T., Friedrich L., Vernooij E., Negrotto D., Nye G., Uknes S., Ward E., Kessmann H., and Ryals J. Requirementof salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance // Science, -1993. -261. -P. 754-756.

13. Gallie D.R. Posttranscriptional regulation of gene expression in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1993. -44. -P. 77-105.

14. Grazebrook J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens//Annu. Rev. Phytopathol. 2005. V. 43. P. 205-227

15. Green T.R., Ryan C.A. Wound-Induced Proteinase Inhibitor in Plant Leaves -Possible Defense Mechanism against Insects// Science. -1972. -V. 175. -P. 776-777

16. Haberlandt G. Uber zellteilungshomone und ihre Bezichungen zur wundheilung//Biol. Zentrelblstt. -1922. -V. 42. -P. 145

17. Hadwiger, L.A., Kendra, D.F., Fristensky, B.W., Wagoner, W. Chitosan both activates genes in plants and inhibits RNA synthesis in fungi// Chitin in Nature and Technology. Plenum Press, NewYork. -1986. -P. 209-214.

18. Halitschke R., Baldwin I.T. Jasmonates and Related Compounds in Plant-Insect Interactions//.!. Plant Growth Regul. -2004. -V. 23. -P. 238-245

19. Hammond-Kosack K.E., Jones J.D. Inducible plant defense mechanisms and resistance gene function//Plant Cell. -1996. -V.8.-P. 1773-1791

20. Heath M.C. Hypersensitive response-related death // Plant Mol. Biol. -2000. -V.44. -№3. -P.321-334-9024. Howe GA. Jasmonates as signals in the wound response// Plant J. -2005. -V. 23. -P. 223-237

21. Hung T.H., Giridhaz R., Chiou S.H., Wen-Teng W. Binary immobilization of Candida ragosa lipase on chitosan // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. -2003. -V. 26. № 1. -P. 69-78.

22. Il'ina A.V., Tatarinova N. Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kursanovii // Process Biochemistry. 1999. - Vol.34. - №9. -P.875-878

23. Kittur F.S., Kumar A.B.V., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans -preparation by depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization //CarbohydrateResearch.-2003.-V.338.-№ 12.-P.1283 -1290.

24. Klessig D.F., Durner J., Noad R. et al. Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -2000. -V. 97. -P. 8849-8855;

25. Kumar A.B.V. Low moleculer weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization / A.B.V. Kumar, M.C Varadaraj, R.G. Lalitha //Biochimia et Biophysica Acta. 2004. V.1670. №2. P137-146

26. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization // Biochim. Biophys. Acta. -2004. -V. 1670.-P. 137-146.

27. Kumar A.B.V., Gowda L.R., Tharanathan R.N. Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products //Eur. J. Biochem. -2004.-V.271.-N.4.-P.713-723

28. Kunkel B.N., Brooks D.M. Cross-talk between signaling pathways in pathogen defense// Curr.Opin.Plant Biol. -2002. -V.5. -P.325-331

29. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — Vol. 227. — P. 680—685.

30. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C. H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response// Cell. 1994. -Y.79. -№5. -P.573-593

31. Li C., Schilmiller A.L., Liu G.I., Jayanty S., Sagaman C., Vrebalov J., Glovannoni J.J., Yagi K., Korabyashi Y. Role of p-Oxidation in Jasmonate Biosynthesis and Systemic Wound Signaling in Tomato // Plant Cell. 2005. -V. 17. -P. 971-986

32. Lorenzo O., Solano R. Molecular Players Regulating the Jasmonate Signaling Network//Curr.Opin. Plant Biol. -2005 -V.8. -P.532-540

33. Majeti, N.V., Kumar, R. A review of chitin and chitosan applications //Reactive and Functional Polymers. -London. 2000. - № 46. - P. 1 - 27

34. Malamy J., Carr J.P., Klessig D.F., Raskin I. Salicylic acid: a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection Science // Science. -1990. -V. 250. -№ 4983. -P.1002-1004

35. McDowell GJ.f, DungU.L. Signal transduction in the plant immune response// Trends Bichem. Sci. 2000. V. 25. P. 79-82.

36. Mehdy M.C. Active oxygen species in plant defense against pathogens // Plant Physiol. 1994. - V.105. - № 2. - P.467-472

37. Muzzarelli, R. A. A. The discovery of chitin, a > 570 Megayear old polymer / R. A. A. Muzzarelli // Chitosan in Pharmacy and Chemistry / Ed. by R. A. A. Muzzarelli and C Muzzarelli. Grottammare, Italy: Atec Edizioni. -2002. -P. 1-8.

38. Muzzarelli R.A.A. Chitin./ R. A. A. Muzzarelli. Oxford: Pergamon Press, 1977. -309 p.

39. Niebel, A.; Heungens, K.; Barthels, N.; Inze, D.; Van Montagu, ' M.; Gheysen, G. Characterization of a pathogen-induced potato catalase and its expression upon nematode and bacterial infection // The Amer. Phytopathol. Soc. -2002. -V. 8. -P. 371378.

40. Nimchuk Z, Eulgem T, Holt B.F. Ill, Dangl J.L. Recognition and response in the plant immune system// Annu. Rev. Genet. -2003. -V.37. P.579-609.

41. Pearce G., Strydom D., Johnson S., Ryan C. A. A Polypeptide from Tomato Leaves Induces Wound-Inducible Proteinase Inhibitor Proteins// Science. -1991. -V. 1991. P. 995-998

42. Raskin I. Role of salicylic acid in plants//Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1992. -P.439-463

43. Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Applied and environmental microbiology.-2000.- V.66.- N.l.-P. 80-86.

44. Roos A.F. Systemic acquired resistance induced by localized virus infection in plants // Virology. -1961. -V. 14. -№3. -P. 340-358

45. Rozahl S., Feussner I. Oxylipins // Plant Lipids: Biology, Utilization and Manipulation / Ed. Murphy D.J. Oxford: Blackwell, -2004. -V. 53. -P.329-454

46. Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G. Systemic acquired resistance// Plant Cell. -1996. -V.8. -P.1809-1819

47. Ryan C.A. The Search for the proteinase-Inhibitor Inducing Factor. PIIF// Plant. Mol. Biol. -1992. -V.19 -P.123-133

48. Schilmiller A.L., Howe G.A. Systemic signaling in the wound response // Curr. Opin. Plant Biol. -2005. -V.8. -P.369-377

49. Shah J., Klessig D.F. // Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormone / Eds. K. Libbenga, M.Hall., P.G.J.Hooykaas. London Elsevier. -1999. -V.33. -P.513-554

50. Shah, J., Klessig, D.F. Kachroo, P., Yoshioka, K. Resistance to turnip crinkle virus in Arabidopsis requires two host genes and is salicylic acid dependent but NPR1, ethylene and Jasmonate independent// Plant Cell -2000. -V.12. -P.677-690

51. Shirasu K., Nakajima H., Rajasekher V.K., Dixon R.A., Lamb C. // Plant Cell. -1997. -V.9. -N2. -P.261-270

52. Tolaimate A., Desbrie'res J., Rhazi M., Alagui A., Vincendon M., Vottero P. On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin // Polymer.- 2001.-V.41.- N.7.- P. 2463-2469

53. Van Loon L.C. Pathogenesis-related proteins // Plant Mol. Biol. -1985. -V.4. -P. 111-116.

54. Van Loon L.C., Van Strien E.A. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins// Physiol. Mol/Plant Pathol. -1999. -V.55. -P.85-97

55. Wang W., Bo S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol. -1991. -V.13. -№5. -P.281-285.

56. Wasternack C., Stenzel I., Hause B., Hause G., Kutter C., Maucher H., Neumerkel J., feussner i., Miersch O. The wound response in tomato Role of jasmonic acid//J. Plant Physiol. -2006. -V.163. -P.297-306

57. Wasternack C., Stenzel I., Hause B., Hause G., Kutter C., Maucher H., Neumerkel J., feussner i., Miersch O. The wound response in tomato Role of jasmonic acid// J. Plant Physiol. -2006. -V. -163. -P.297-306

58. Абдуллин В.Ф., Шиповская А.Б., Фомина В.И., Артеменко С.Е., Овчинникова Г.П., Пчелинцева Е.В. Физико-химические свойства хитозана из разных сырьевых источников // Хим. волокна. -2008. -№1. -С.33-36.

59. Аверьянов A.A. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Успехи современной биологии. -1991. -Т.111. -N5. -С.722-737.

60. Васюкова Н.И., Герасимова Н.Г., Озерецковская О.Л. Роль салициловой кислоты в болезнеустойчивости растений // Прикладная биохимия и микробиология. -1999. -Т. 35. -С. 557-563.

61. Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Индуцированная устойчивость растений и салициловая кислота (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. -2007. -Т. -43. -№ 4. -С.405-411

62. Васюкова П.И., Давыдова М. А., Щербакова Л.А., Озерецковская О. Л., Фитостерины как фактор, предохраняющий возбудитель фитофтороза картофеля от действия фитоалексинов // ДАП. -1977. -Т. 235, -№1. -С.216-219.

63. Гальбрайх Л.С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение Соросовский образовательный журнал. -2001. -Т.7.1. -С.51-56.

64. Гречкин А.Н., Тарчевский И.А, Липоксигеназная сигнальная система// Физиология растений. -1999. -Т. 46. -С. 132-142

65. Дьяков Ю.Г., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология. -М. Общество фитопатологов, -2002. -301 с.

66. Ильина A.B. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловеридин Г20х/ A.B. Ильина, Ю. В. Ткачева, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. -Т. 38. -№2. -С. 132135

67. Ильина A.B., Варламов В.П., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Е. Деполимеризация хитозана хитинолитическим комплексом бактерии рода Bacillus sp. 739 //Прикладная биохимия и микробиология.-2001.-Т. 37.-№2.-С. 160-163

68. Лиу Ю., Пан Ц.Х., Ян Х.Р., Лиу Ю.Ю., Хуан В.Д. Взаимосвязь между Н202 и жасмоновой кислотой в ответной реакции листьев гороха на поранение // Физиология растений. 2008. - Т. 56, № 6. - С. 851-862.

69. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л. Как растения защищаются от болезней //М. Наука.-1985.-188 с.

70. C.B. Немцев, A.B. Ильина, С.М. Шинкарев, А.И. Албулов, В.П. Варламов Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана// Биотехнология. -2001. -№6. -С.37-42

71. В.Ю. Новиков, В.А. Мухин Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепатопакреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus II Прикладная биохимия и микробиология. -2003. -Т. 39. -№5.- С. 530-535

72. Озерецковская О. Л, Чалова Л. И. Индуцирование устойчивости растений к болезням// Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями, Пущино, -1989. -С.178-184

73. Озерецковская О.Л., Давыдова М.А., Васюкова Н.И., Метлицкий Л.В. Гликоалкалоиды в здоровом и поврежденном клубне картофеля// ДАН СССР. 1971. Т. 196 С. 1470-1473

74. Озерецковская О.Л., Ильинская Л.И., Васюкова Н.И. Механизмы индуцирования элиситорами системной устойчивости растений к болезням// Физиология растений. -1994. -Т. 41. -№. 4. -С.626-633.

75. Озерецковская О.Л., Чаленко Г.И. Сравнительное изучение раневой и естественной перидермы клубня картофеля// Биохимия иммунитета и покоя растений. -1969. -М. ВИНИТИ -С.70-82

76. Панина Я.С, Герасимова Н.Г., Чаленко Г.И., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Салициловая кислота и фенилаланинаммиаклиаза в картофеле, инфицированном возбудителем фитофтороза // Физиология растений. -2005. -Т. 52. -№4. -С. 573-577

77. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. М.: МГУ. 1980. 150с.

78. Скрябин К.Г. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение/ К.Г. Скрябин, Г. А. Вихорева, В. П. Варламов. М.: Наука, 2002. -368 с.

79. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений // -М. Наука. -2002. -С.163

80. Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие// Физиология растений. -2000. -Т. 47. -С. 321-331

81. Чаленко Г.И. Интенсификация раневых реакций в иммунизированных биогенными индукторами клубнях картофеля // Биохимия хранения картофеля, овощей и плодов. -М.: Наука, -1990. -С.45-49

82. Черкасова Е.И., Алексеева М.Ф., Пастухов М.О., Фролов В.Г., Смирнова Л.А., Смирнов В.Ф. Деструкция хитозана ферментным комплексом из Carica papayalI Биотехнология. -2005. -№2. -С.73-81

83. Черкасова Е.И., Душкова З.Г., Фролов В.Г. Исследование хитозанолитической активности папаина // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы VIII конференции/ВНИРО. -Москва, 2006. С.315-318