Исследование молекулярно-генетических механизмов нейрогенеза неокортекса и сетчатки человека in vivo и in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.05, кандидат биологических наук Вердиев, Бахтияр Исраил оглы

• Вердиев, Бахтияр Исраил оглы
• кандидат биологических наук
• 2010

Заключение диссертации по теме «Биология развития, эмбриология», Вердиев, Бахтияр Исраил оглы

выводы

1. Впервые выявленные значительные различия в уровне экспрессии РАХ6 в неокортексе и сетчатке глаза человека в развитии отражают специфику их клеточной дифференцировки.

2. Впервые выявлена экспрессия РКОХ1 в ходе нейрогенеза неокортекса мозга человека. Сравнение динамики экспрессии РЯОХ1 в развитии неокортекса и сетчатки говорит о сходстве регуляторных механизмов на ранних стадиях их формирования и о нарастании различий в дальнейшем.

3. Впервые показана динамика экспрессии генов ОСТ4 и Л^А^ОС в ходе нейрогенеза в неокортексе и сетчатке эмбриона человека, которая отражает наличие пула клеток с высокой пластичностью.

4. При культивировании клетки сетчатки проявляют большую консервативность экспрессии изученных генов-маркеров клеточной дифференцировки, чем клетки неокортекса.

Работа выполнена при использовании оборудования Центра коллективного пользования «По биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов» ОБН РАН при ИБР РАН. Работа поддержана грантами РФФИ №08-04-00081 и №08-04-00462.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе развития из нейроэпителиальных клеток переднего мозгового пузыря помимо структур центрального мозга формируется сетчатка глаза (которая является частью ЦНС), в которой также найдены клетки со стволовыми и прогениторными свойствами. Зоны постоянного нейрогенеза у взрослых млекопитающих в сетчатке отсутствуют, но ее клетки проявляют мультипотентные свойства при травме глаза и in vitro.

Как и в неокортикальных отделах, НСК сетчатки в развитии генерируют клетки разных типов в строгой временной последовательности: сначала нейроны, затем глию.

В регуляции эмбрионального развития важную роль играют специфические ядерные транскрипционные факторы. Механизмы развития сетчатки и неокортекса имеют близкую транскрипционную машинерию, которая регулирует пластичность НСК, что, по-видимому, и приводит к сходному морфогенезу этих ламинарных структур ЦНС. В связи с этим необходимость исследования активности общих для обеих структур генов в ходе развития становится очевидной. Мы сконцентрировались на генах Рахб, Proxl, Oct4 и Nanog.

НСК человека имеют значительные отличия от грызунов по экспрессии ряда генов и по поведению клеток. В связи с этим изучение нейральных стволовых клеток человека, их пролиферативного потенциала и дифференцировки в организме и при культивировании имеет фундаментальное значение.

Настоящая работа посвящена сравнительному анализу экспрессии регуляторных и тканеспецифических генов в ходе нейрогенеза неокортекса и сетчатки человека in vivo и in vitro. Мы провели анализ экспрессии генов Рахб, Proxl, Oct4, Nanog и белков-маркеров нейральной дифференцировки в неокортикальных отделах мозга и сетчатке глаза в ходе развития плодов человека. Получены культуры клеток неокортекса и сетчатки плодов человека и исследованы с целью определения дифференцировочных потенций стволовых и прогениторных клеток. Проведен анализ экспрессии траскрипционных факторов Рахб, Proxl, Oct4, Nanog и генов-маркеров дифференцировки в неокортексе и сетчатке человека и in vivo и in vitro.

Данные сравнительного количественного анализа экспрессии гена транскрипционного фактора Рахб, критически необходимого в развитии ЦНС впервые показали, что в исследованный период нейрогенеза его экспрессия находится на постоянном уровне в неокортикальных отделах мозга и сетчатке глаза. При этом уровень экспрессии мРНК Рахб в сетчатке выше. Данный факт можно объяснить тем, что экспрессия Рахб в развивающемся неокортексе характерна только для НСК. Тогда как в сетчатке данный транскрипционный фактор необходим для реализации программы стволовых клеток и для поддержания дифференцировки и функционирования определенных типов нейронов (ганглиозные, амакриновые и горизонтальные клетки).

Аналогичный анализ, проведенный на клеточных культурах неокортикальных отделов мозга и сетчатки показал, что в стандартных условиях культивирования профиль экспрессии Рахб повторяет нативные ткани. Эти данные показывают, что при культивировании сохраняются субпопуляции клеток, для которых Рахб является специфичным регулятором.

В нашем исследовании впервые показана экспрессия гена транскрипционного фактора Proxl в неокортексе мозга и подтверждена для тканей сетчатки плода человека. Этот фактор важен для регуляции клеточного цикла поздних прогениторов и дифференцировки некоторых популяций клеток. Результаты показали, что уровень экспрессии Proxl с 9 по

20 неделю развития в неокортикальных отделах мозга падает, тогда как в сетчатке растет. Различие в уровнях экспрессии Proxl отражает специфичность клеточной дифференцировки в этих структурах ЦНС. В неокортексе данный транскрипционный фактор регулирует клеточный цикл поздних прогениторов и направляет их дифференцировку по нейрональному

116 или астроцитариому пути. В дифференцированных клетках неокортекса он отсутствует. Можно полагать, что обнаруженное нами снижение уровня экспрессии гена Ргох1 связано со снижением уровня нейроногенеза и переходом к глиогенезу. Еще одной возможностью является увеличивающийся вклад радиальной глии в генерацию нейробластов по сравнению с базальными прогениторами на поздних стадиях нейрогенеза. В противоположность неокртексу в сетчатке, наряду с прогениторными клетками, Ргох1 экспрессируется терминально дифференцированными нейронами (амакриновыми, биполярными и горизонтальными клетками).

При исследовании культур клеток было показано, что в культуре клеток сетчатки экспрессия транскрипционного фактора Ргох1 сохраняется, тогда, как в культуре неокортикальных отделов мозга отсутствует. Что свидетельствует о сохранении дифференцировочных потенций НСК в культуре клеток сетчатки и нарушении таковой в культуре клеток неокортекса.

В процессе культивирования клетки эмбриональной сетчатки сохраняют большее сходство с нативной тканью, по сравнению с неокортексом. Учитывая, что сетчатка эволюционно более консервативна, мы полагаем, что механизмы регуляции в развитии сетчатки сильнее ограничивают потенции НСК, чем в неокортикальных отделах мозга, что говорит о большей пластичности НСК последнего.

Впервые был проведен сравнительный количественный анализ экспрессии генов плюрипотентного статуса 0&4 и Nanog в неокортикальных отделах мозга и сетчатки глаза плода человека в ходе нейрогенеза на 8-12 и

18-20 неделях развития. Исследования показали, что в этих тканях данные гены экспрессируются на низком уровне. Наличие белкового продукта 1\Гапо§ было подтверждено методом вестерн-блоттинга. Мы полагаем, что присутствие этих транскрипционных факторов отражает наличие пула клеток с высокой пластичностью. Возможно, они также необходимы для навигации пионерных аксонов первичных нейронов ЦНС. В клеточных культурах

117 неокортекса мозга и сетчатки глаза плода человека, в стандартных условиях культивирования клетки сетчатки сохраняют сходство с нативной тканью, в отличие от клеток неокортекса.

При длительном культивировании клеток сетчатки и неокортекса снижается количество клеток с нейрональными маркерами. Полученная нами культура неокортекса, растившаяся в течение 115 суток на среде без сыворотки, продемонстрировала отсутствие экспрессии рШ-тубулина и наличие Рахб и СЕ АР, что говорит о замещении нейроногенеза глиогенезом. Возможно, что длительное пребывание в культуре приводит к трансформации клеток радиальной глии в астроцитарные клетки со стволовыми свойствами, подобными прогениторам взрослого мозга.

Проведенные исследования дополняют представления о молекулярных механизмах развития неокортекса мозга и сетчатки глаза человека. Они создают предпосылки для дальнейшего изучения свойств НСК. Изучение механизмов, лежащих в основе высокой пластичности этих клеток, является приоритетной задачей современной фундаментальной и прикладной науки. Полученные результаты могут иметь значение при разработке научно обоснованных подходов к трансплантационной терапии нейродегенеративных заболеваний ЦНС и сетчатки.

В последнее время в литературе появляется все больше данных о том, что молекулярно-генетические механизмы нейрогенеза человека имеют значительные отличия от других млекопитающих, несмотря на общепринятые взгляды об эволюционной консервативности таких процессов. Данные исследования существенно затруднены в силу малой доступности материала. В связи с вышесказанным особую актуальность приобретают немногочисленные работы, проведенные на образцах, полученных из человеческих тканей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Вердиев, Бахтияр Исраил оглы, 2010 год

1. Александрова М.А., Подгорный О.В., Полтавцева Р.А., Панова И.Г., Сухих Г.Т. Структура и клеточный состав сфер, культивированных из сетчатки плодов человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2006. №3. - С.171

2. Заварзин А.А. Очерки по эволюционной гистологии нервной системы //М—JL: Изд-во АН СССР. 379 с. - 1941.

3. Adler R. & Canto-Soler M.V. Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies // Dev Biol. 2007. - V.305. - N.l.- P.l-13.

4. Alvarez-Buylla A. & Garcia-Verdugo J.M. Neurogenesis in adult subventricular zone // J Neurosci. 2002. - V.22. -N.3.- P.629-634.

5. Alvarez-Buylla A. & Lim D.A. For the long run: maintaining germinal niches in the adult brain // Neuron. 2004. - V.41. - N.5.- P.683-686.

6. Anderson T.R., Hedlund E. & Carpenter E.M. Differential Рахб promoter activity and transcript expression during forebrain development // Mech Dev. 2002. - V.l 14. - N.l -2.- P.l 71-175.

7. Andrews G.L. & Mastick G.S. R-cadherin is a Pax6-regulated, growth-promoting cue for pioneer axons // J Neurosci. 2003. - V.23. - N.30.- P.9873-9880.

8. Appolloni I., Calzolari F., Corte G., Perris R. & Malatesta P. Six3 controls the neural progenitor status in the murine CNS // Cereb Cortex. 2008. - V.l8. - N.3.- P.553-562.