Структура, регуляция и экспрессия генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Медведев, Сергей Петрович

• Медведев, Сергей Петрович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Медведев, Сергей Петрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Феномен плюрипотентности клеток млекопитающих in vivo и in vitro

1.2. Сигнальные пути, участвующие в поддержании клеточной плюрипотентности

1.2.1. LIF-STAT

1.2.2. ВМР

1.2.3. WNT

1.3. Транскрипционные факторы и плюрипотентность 23 1.3.1 Транскрипционный фактор ОСТ4 23 1.3.2. Транскрипционный фактор NANOG

1.4. Спектр генов-мишеней транскрипционных факторов ОСТ4 и NANOG.

Авторегуляция и взаимодействие с другими транскрипционными факторами

1.4.1. Гены-мишени транскрипционного фактора ОСТ

1.4.2. Анализ распределения сайтов посадки факторов ОСТ4, NANOG и SOX2 в геномах ЭСК человека и мыши

1.5. Структура и хромосомная локализация Oct4 и Nanog. Структура белков

ОСТ4 и NANOG

1.5.1. Структура и хромосомная локализация гена Oct4. Структура белка ОСТ

1.5.2. Предшественники гена Oct4 плацентарных млекопитающих

1.5.3. Структура и хромосомная локализация гена Nanog.

Структура белка NANOG

1.6. Динамика экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе млекопитающих 42 1.6.1. Экспрессия гена Oct

1.6.2. Экспрессия гена Nanog

1.7. Регуляция экспрессии генов Oct4 и Nanog

1.7.1. Регуляция экспрессии гена Oct

1.7.2. Регуляция экспрессии гена Nanog 5 О ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54 2.1 Объект исследования

2.2. Скрининг геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis

2.3. Выделение ДНК фагов

2.4. Микробиологические методы работы

2.4.1. Приготовление компетентных клеток Е. coli

2.4.2. Трансформация компетентных клеток E.coli

2.5. Методики работы с рекомбинантной ДНК

2.5.1. Выделение плазмидной ДНК

2.5.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.5.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.5.4. Выделение фрагментов ДНК из гелей 58 2.5.4. Субклонирование фрагментов ДНК

2.7. Полимеразная цепная реакция

2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.9. Контекстный анализ последовательности ДНК

2.10. Конструирование репортерных векторов

2.11. Временная трансфекция и измерение активности люциферазы 64 2.11. Работа с РНК

2.11.1. Выделение РНК из эмбрионов и органов полевки М. rossiaemeridionalis

2.11.2. Обработка РНК ДНКазой

2.11.3. Синтез кДНК

2.11.4. 3'- и 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 67 2.12. Работа с культурами эукариотических клеток

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Oct4 полевки М. rossiaemeridionalis

3.2. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена Oct4 млекопитающих

3.3. Анализ активности промотора гена Oct4 полевки

3.4. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Nanog полевки М. rossiaemeridionalis

3.5. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей Nanog гена млекопитающих 91V.

3.6. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки M.rossiaemeridionalis

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура, регуляция и экспрессия генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia)»

Актуальность. Получение и исследование эмбриональных стволовых клеток различных видов млекопитающих является одной из актуальных проблем современной биологии. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из внутренней клеточной массы (ВКМ) либо эпибласта предымплантационных эмбрионов млекопитающих. При сохранении оптимальных условий культивирования ЭСК, в течение продолжительного времени могут сохранять ряд свойств, характерных для клеток ВКМ и эпибласта эмбриона (Smith, 2001; Boiani, Sholer, 2005). Одно из основных уникальных свойств ЭСК - плюрипотентность. Плюрипотентность определяет способность ЭСК дифференцироваться, in vitro и in vivo, в производные всех трех зародышевых листков, эктодермы, энтодермы и мезодермы, а также образовывать во время эмбрионального развития клетки предшественники функциональных гамет (Boiani, Sholer, 2005). Это свойство ЭСК делает их перспективным объектом фундаментальных и прикладных исследований (Smith, 2001). ЭСК являются уникальной модельной системой при исследовании процессов, происходящих в раннем эмбриогенезе млекопитающих (Martin, 1981; Evans, Kaufman, 1981; Thomson etal., 1998; Chaumeil et al, 2002; Boiani, Sholer, 2005).

На сегодняшний день известно, что поддержание плюрипотентного статуса клеток предымплантационных эмбрионов и ЭСК обеспечивается сложной системой клеточно-поверхностных белков, их молекулярных сигнальных путей и транскрипционных факторов, инициирующих или модулирующих транскрипцию генов-мишеней. Подсистема, так называемых «внешних регуляторов плюрипотентности», включает в себя несколько сигнальных путей, основными из которых являются каскады, запускаемые белками LIF, ВМР4 и WNT. Оказалось, что действие данных сигнальных путей происходит in vitro, но носит видоспецифичный характер. Одни и те же молекулы могут поддерживать плюрипотентность ЭСК мыши и не влиять на плюрипотентность ЭСК человека. Более того, одни и те же пути могут иметь противоположное влияние на ЭСК мыши и человека (Xu et al., 2002; Humphrey et al, 2004; Sumi et al, 2004; Boiani, Sholer, 2005).

Другой подсистемой, регулирующей плюрипотентность ЭСК, является подсистема «внутренних регуляторов плюрипотентности» - транскрипционных факторов, действующих в ядрах клеток. К числу ключевых регуляторов в данной подсистеме относятся транскрипционные факторы ОСТ4 и NANOG. Данные факторы участвуют в поддержании плюрипотентности клеток как in vivo так и in vitro. Эмбрионы мыши, гомозиготные по нокауту генов Oct4 и Nanog, гибнут в предымплантоционный период развития вследствие недоразвития ВКМ и эпибласта, соответственно (Nichols et ah, 1998; Chambers et ah, 2003; Mitsui et al., 2003). Подавление экспрессии генов Oct4 и Nanog в ЭСК мыши и человека вызывает дифференцировку клеток в трофобластные производные и производные примитивной энтодермы и мезодермы, соответственно (Niwa et ah, 2000; Vekey, О'Shea, 2003; Hay et ah, 2004; Hyslop et ah, 2005). Совместно с транскрипционным фактором SOX2 они образуют единую систему регуляции транскрипции генов в ЭСК. Взаимодействие этих факторов приводит к формированию двух регуляторных подсистем: авторегуляторной и подсистемы прямой регуляции широкого спектра генов мишеней, большинство из которых участвует в процессах дифференцировки ЭСК (Boyer et ah, 2005; Loh et ah, 2006). Геномная организация, экспрессия и регуляция генов, кодирующих факторы ОСТ4 и NANOG, подробно исследованы только у человека и мыши - видов, для которых получены стабильные линии ЭСК (Chambers, Smith, 2004). Получение линий ЭСК других видов млекопитающих представляет на сегодняшний день серьезную проблему. Открытым остается вопрос о причинах высокой разницы в эффективности получения плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток у различных видов млекопитающих. Некоторые экспериментальные данные говорят о том, что отрицательный результат экспериментов по получению стабильных линий ЭСК может быть следствием видоспецифичных особенностей регуляции и экспрессии генов системы поддержания плюрипотентности, таких как Oct4 и Nanog (Buehr et ah, 2003).

Исследование структуры, регуляции и экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы ОСТ4 и NANOG у различных видов млекопитающих важно для формирования представлений о функционировании системы поддержания плюрипотентности в целом и особенностях данной системы у каждого вида в отдельности. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей регуляторных и кодирующих частей генов Oct4 и Nanog млекопитающих позволяет выявить наиболее эволюционно консервативные последовательности, несущие функциональную нагрузку. Кроме того, сравнение нуклеотидных последовательностей и паттерна экспрессии генов Oct4 и Nanog у различных видов млекопитающих позволяет проследить отличия, которые могут являться причиной неудач при получении ЭСК.

Обыкновенные полевки рода Microtus являются модельным объектом для которого ведутся работы по получению ЭСК (Nesterova et al., 2001; Шевченко и др., 2006). Использование стандартных протоколов получения ЭСК мыши и человека на полевках не привели к получению стабильных, плюрипотентных ЭСК. Исследование молекулярно-генетических особенностей структуры генов Oct4 и Nanog, их регуляции и экспрессии у полевок может способствовать выявлению видоспецифических особенностей подсистемы «внутренних регуляторов плюрипотентности» и разработке оптимальной стратегии исследования характеристик «генов плюрипотентности», критичных для получения ЭСК. Полученные знания позволят составить модифицированные, более эффективные, протоколы получения эмбриональных стволовых клеток для видов млекопитающих, получение ЭСК у которых затруднено.

Для полноценного решения этой проблемы необходимо ответить на вопрос, справедлива ли для полевок характерная для мыши схема дифференцированной экспрессии Oct4 и Nanog в предымплантационном эмбрионе, т.е. ограничена ли экспрессия Oct4 и Nanog только плюрипотентными клетками эмбриона (ВКМ, эпибласт). Важно проследить, динамику экспрессии генов Oct4 и Nanog в течение развития эмбриона полевки, поскольку от времени начала репрессии этих генов во многом зависит успешность получения ЭСК. Кроме того, необходимы знания об особенностях структуры и регуляции генов Oct4 и Nanog у полевок.

Для решения проблемы, безусловно, были необходимы комплексные исследования, включающие полное секвенирование геномных и кДНК последовательностей генов Oct4 и Nanog полевок, сравнительный анализ структуры полученных последовательностей, изучение особенностей строения регуляторных областей этих генов с помощью репортерных конструкций, исследование экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевок.

Цели и задачи работы.

Цель работы — исследовать структуру, регуляцию и особенности экспрессии генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus.

Задачи работы:

1. Определить последовательность нуклеотидов кодирующих и регуляторных частей генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis.

2. Произвести анализ полученных нуклеотидных последовательностей и сравнение нуклеотидных последовательностей генов Oct4 и Nanog полевки с ортологами этих генов у других видов млекопитающих.

3. Исследовать экспрессию мРНК генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки.

4. Построить репортерные конструкции, содержащие ген люциферазы под контролем различных элементов регуляторной области гена Oct4, и исследовать активность данных конструкций в линиях плюрипотентных и неплюрипотентных клеток.

Научная новизна.

1. Впервые получены геномные нуклеотидные последовательности генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis. Установлена их экзон-интронная структура. Для гена Oct4 установлена нуклеотидная последовательность регуляторной области, размером 4017 п.н. Геномные нуклеотидные последовательности и последовательности кДНК генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis зарегистрированы в базе данных GeneBank под номерами: Oct4 (EF032593 и EF030115, соответственно); Nanog (EU908043 и EU908044, соответственно).

2. В данной работе впервые исследована экспрессия генов Oct4 и Nanog в онтогенезе и отдельных органах полевки М. rossiaemeridionalis. Показаны сходства и отличия в паттерне экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе мыши и полевки.

3. Впервые исследована активность репортерных конструкций, содержащих различные части регуляторной области гена Oct4 полевки в линиях плюрипотентных клеток мыши и трофобластных стволовых клетках полевки. Показано, что регуляторная область гена Oct4 полевки активна в клетках мыши и неактивна в неплюрипотентных клетках полевки.

Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют знания о функционировании отдельных элементов системы поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих и могут быть использованы при планировании и проведении экспериментов по получению ЭСК.

Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.).

По теме диссертации опубликованы две работы. Одна - в рецензируемом зарубежном журнале, другая — в рецензируемом отечественном журнале. Еще две статьи приняты в печать, в рецензируемые отечественные журналы.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Скрининг фаговой геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis проводился совместно с к.б.н. А.И. Шевченко, анализ нуклеотидных последовательностей генов Oct4 и Nanog проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах, содержит 12 рисунков и 15 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Медведев, Сергей Петрович

102 ВЫВОДЫ

1. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена Oct4 полевки

М. rossiaemeridionalis размером 4607 п.н. и установлена его структурно-функциональная организация. Ген Oct4 полевки состоит из 5 экзонов и 4 интронов. Размер мРНК равен 1357 н., размер кодируемого белка составляет 354 а.о.

2. Анализ 5'-регуляторной области гена Oct4 полевки, размером 4017 п.н., показал наличие консервативных элементов: GC-богатых сайтов, потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства Sp, гормончувствительного элемента, а также авторегуляторного композиционного сайта связывания факторов ОСТ4 и SOX2.

3. 5'-регуляторная область гена Oct4 полевки, встроенная в состав репортерных конструкции проявляет активность в шпорипотентных клетках мыши (TG-2a, Р19) и неактивна в трофобластных стволовых клетках полевки (R1). Делеция дистального энхансера регуляторной области гена Oct4 полевки существенно снижает активность конструкций в клетках TG-2a и не влияет на нее в клетках линии Р19. Делеции и инверсии других элементов регуляторной области также вызывают снижение активности репортерных конструкций в разной степени. Показана важность ориентации регуляторных элементов в модуляции транскрипции.

4. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена Nanog полевки

М. rossiaemeridionalis размером 7586 п.н. и его структурно-функциональная организация. Ген Nanog полевки состоит из 4 экзонов и 3 интронов. Размер мРНК составляет 2411 н., размер кодируемого белка составляет 319 а.о. Четвертый экзон гена Nanog полевки содержит протяженную 3'-нетронслируемую область размером 1291 п.н.

5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков NANOG полевки и шести видов млекопитающих показал высокий уровень гомологии гомеодоменов данных белков. В последовательности белка NANOG полевки выявлен блок триптофановых повторов, характерный для белков NANOG других видов млекопитающих. Обнаружено, что несколько из остатков ароматических аминокислот, влияющих на трансактивационные свойства домена CD2 белка NANOG мыши, отсутствуют у полевок.

6. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки М. rossiaemeridionalis показал, что транскрипция гена Nanog впервые выявляется в 2-х клеточных эмбрионах и ограничивается предымплантационными стадиями развития эмбриона. Транскрипция гена Oct4 впервые выявляется на стадии морулы и продолжается до семнадцатого дня эмбрионального развития. Транскрипция генов Oct4 и Nanog не обнаружена в линиях трофобластных стволовых клеток (R1) и клеток примитивной энтодермы (XEN Мб) полевок, а также в восьми органах взрослых полевок (мозге, сердце, тимусе, желудке, печени, кишечнике, яичнике и семеннике). Ген Nanog можно использовать как * маркер плюрипотентности клеток полевок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе представлены результаты исследований структуры, регуляции и особенностей экспрессии генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus.

Определена полная нуклеотидная последовательность гена Oct4 полевки М. rossiaemeridionalis размером 4607 п.н. Проведено детальное исследование экзон-интронной организации генов Oct4 и Nanog, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей данных генов у полевки и шести видов, относящихся к разным отрядам млекопитающих. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов Oct4 полевки М. rossiaemeridionalis и шести видов млекопитающих (мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки) показало высокую консервативность кодирующей последовательности гена Oct4 (до 89%). Наибольшей гомологией обладают второй (до 95%) и третий (до 92%) экзоны генов Oct4, кодирующие POU-домен. Наибольший уровень гомологии наблюдается между эволюционно близкими видами: полевкой, мышью и крысой.

Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 5'-регуляторных областей ортологичных генов Oct4. Основные функциональные элементы данной области (область минимального промотора, дистальный и проксимальный энхансер) проявляют высокую степень сходства у всех сравниваемых видов млекопитающих. Показано, что наибольшей консервативностью обладают: GC-богатые сайты, потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов семейства Sp, гормончувствительный элемент (HRE), а также авторегуляторный композиционный сайт связывания факторов ОСТ4 и SOX2. Гомология сайтов транскрипционных факторов MASH-2 и РЕМ низка.

Показано, что последовательность 5'-регуляторной области гена Oct4 проявляет способность активировать транскрипцию в составе репортерных конструкций в плюрипотентных клетках мыши. Отдельные элементы регуляторной области гена Oct4 полевки проявляют функциональную гомологию с таковыми у мыши. Дистальный энхансер гена Oct4 полевки, как и у мыши, активен в ЭСК.

В ходе работы, определена полная нуклеотидная последовательность гена Nanog полевки М. rossiaemeridionalis размером 7586 п.н., установлена его экзон-интронная структура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов Nanog и шести видов млекопитающих (мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки) выявил более низкий по сравнению с геном Oct4 уровень гомологии (до 77%). Наибольшей гомологией обладают второй и третий экзоны генов Nanog, кодирующие основной функциональный элемент белка NANOG - гомеодомен. Сравнение аминокислотных последовательностей предсказанного белка NANOG полевки и шести видов млекопитающих показало относительно высокий уровень гомологии (8588%) гомеодомена во всех парах сравниваемых видов. N- и С-трансактивационные домены, а также область W-повтора показали относительно высокий уровень гомологии только между эволюционно близкими видами: полевкой, мышью и крысой. Однако, показано, что остатки ароматических аминокислот в домене CD2 белка NANOG, играющим важную роль в трансактивации генов-мишеней у мыши, обладают низкой консервативностью среди изученных видов.

Исследование экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки показало, что данные гены в основном сохраняют паттерн экспрессии характерный для мыши, т.е. их экспрессия ограничивается плюрипотентными клетками. Однако, экспрессия гена Nanog, в отличие от мыши, ограничивается предымплантационными стадиями развития эмбриона. Возможно, на стадии бластоцисты, той стадии развития эмбриона, которая используется для получения ЭСК, у полевок, уже происходят процессы связанные с репрессией транскрипции гена Nanog. Снижение уровня транскрипции гена Nanog в свою очередь может критически снижать вероятность получения стабильных линий ЭСК. Вероятно, выходом из данной ситуации может быть использование для получения ЭСК более ранних стадий развития эмбрионов, например, морул.

Описанные в работе данные, позволяют лучше понять особенности функционирования элементов системы поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих и будут полезны при проведении экспериментов по получению ЭСК различных видов млекопитающих.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Медведев, Сергей Петрович, 2009 год

1. Забаровский Е.Р., Турина О.В. Быстрое выделение ДНК фага XII Молекулярная биология. 1998. Т. 22. №. 6. С. 1451-1455.

2. Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В. и др. Модификации хроматина в процессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1225-1234.

3. Abeyta M.J., Clark А.Т., Rodriguez R.T. et al. Unique gene expression signatures of independently-derived human embryonic stem cell lines // Hum. Mol. Genet. 2004. V. 13. №6. P. 601-608.

4. Altschul S.F., Gish W., Miller W. et al. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. № 3. P. 403-410.

5. Aubert J., Dunstan H., Chambers I., Smith A. Functional gene screening in embryonic stem cells implicates Wnt antagonism in neural differentiation // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. № 12. P. 1240-1245.

6. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function // Cell. 2004. V. 116. № 2. P. 281-297.

7. Boiani M., Sholer H. Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. № 11. P. 872-884.

8. Booth H.A., Holland P. W. Eleven daughters of NANOG // Genomics. 2004. V. 84. № 2. P. 229-238.

9. Botquin V., Hess H., Fuhrmann G. et al. New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct-4 and Sox-2 // Genes Dev. 1998. V. 12. № 13. P. 2073-2090.

10. Boyer L.A, Lee T.I, Cole M.F. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells // Cell. 2005. V.122. № 6. P. 947-956.

11. Brandenberger R., Khrebtukova I., Thies R.S. et al. MPSS profiling of human embryonic stem cells // BMC Dev. Biol. 2004. V. 4. № 10. P. 10-25.

12. Buehr M., Nichols J., Stenhouse F. et al. Rapid loss of Oct-4 and pluripotency in cultured rodent blastocysts and derivative cell lines // Biol. Reprod. 2003. V. 68. № 1. P. 222-229.

13. Burdon Т., Chambers I., Stracey C. et al. Signaling mechanisms regulating self-renewal and differentiation of pluripotent embryonic stem cells // Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. № 3-4. P. 131-143.

14. Catena R., Tiveron C., Ronchi A. et al. Conserved POU binding DNA sites in the Sox2 upstream enhancer regulate gene expression in embryonic and neural stem cells // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 40. P. 41846-41857.

15. Cauffinan G., Van de Velde H., Liebaers I., Van Steirteghem A. Oct-4 mRNA and protein expression during human preimplantation development // Mol. Hum. Reprod. 2005. V. 11. №3. P. 173-181.

16. Chambers I., Colby D., Robertson M. et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. 2003. V. 113. № 5. P. 643-655.

17. Chambers I., Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells // Oncogene. 2004. V. 23. № 43. P. 7150-7160.

18. Chambers I., Silva J., Colby D. et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development//Nature. 2007. V. 450. № 7173. P. 1230-1235.

19. Chaumeil J., Okamoto I., Guggiari M., Heard E. Integrated kinetics of X chromosome inactivation in differentiating embryonic stem cells // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. № 1-4. P. 75-84.

20. Chew J.L., Loh Y.H., Zhang W. et al. Reciprocal transcriptional regulation of Pou5fl and Sox2 via the Oct4/Sox2 complex in embryonic stem cells // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 14. P. 6031-6046.

21. Darr H., Mayshar Y., Benvenisty N. Overexpression of NANOG in human ES cells enables feeder-free growth while inducing primitive ectoderm features // Development. 2006. V. 133. № 6. P. 1193-1201.

22. Evans M.J., Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature. 1981. V. 292. № 5819. P. 154-156.

23. Ezashi Т., Ghosh D., Roberts R.M. Repression of Ets-2-induced transactivation of the Tau interferon promoter by Oct-4 // Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. № 23. P. 78837891.

24. Fairbanks D.J., Maughan P.J. Evolution of the NANOG pseudogene family in the human and chimpanzee genomes // BMC Evol. Biol. 2006. V.6. № 12.

25. Frankenberg S., Tisdall D., Selwood L. Identification of a homologue of POU5F1 (OCT3/4) in a marsupial, the brushtail possum // Mol. Reprod. Dev. 2001. Y. 58. № 3. P. 255-261.

26. Gu P., Goodwin В., Chung А. С. et al. Orphan nuclear receptor LRH-1 is required to maintain Oct4 expression at the epiblast stage of embryonic development // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 9. P. 3492-3505.

27. Gu P., LeMenuet D., Chung A. C. et al. Orphan nuclear receptor GCNF is required for the repression of pluripotency genes during retinoic acid-induced embryonic stem cell differentiation // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 19. P.8507-8519.

28. Guo Y., Costa R., Ramsey H. et al. The embryonic stem cell transcription factors Oct-4 and FoxD3 interact to regulate endodermal-specific promoter expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 6. P. 3663-3667.

29. Hamazaki Т., Kehoe S.M., Nakano Т., Terada N. The Grb2/Mek pathway represses Nanog in murine embryonic stem cells // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. № 20. P. 7539-7549.

30. Hanna L.A., Foreman R.K., Tarasenko I.A. et al. Requirement for Foxd3 in maintaining pluripotent cells of the early mouse embryo // Genes Dev. 2002. V. 16. №20. P. 2650-2661.

31. Hansis C., Grifo J.A., Krey L.C. Oct-4 expression in inner cell mass and trophectoderm of human blastocysts // Mol. Hum. Reprod. 2000. V. 6. № 11. P. 9991004.

32. Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Rabb L. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotensy promoting Nanog genes in mouse and human // Dev. Dyn. 2004. V. 230. № 1. P. 187-198.

33. Hatano S.Y., Tada M., Kimura H. et al. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity // Mech. Dev. 2005. V. 122. № 1. P. 67-79.

34. Hattori N., Imao Y., Nishino K. et al. Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells // Genes Cells. 2007. V. 12. № 3. P. 38796.

35. Hattori N. Nishino К., Ко Y. et al. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 17. P. 17063-17069.

36. Hay D.C., Sutherland L., Clark J., Burdon T. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells // Stem Cells. 2004. V. 22. № 2. P. 225-235.

37. He S., Pant D., Schijfmacher A. et al. Developmental expression of pluripotency determining factors in caprine embryos: novel pattern of NANOG protein localization in the nucleolus // Mol. Reprod. Dev. 2006. V. 73. № 12. P. 1512-1522.

38. Herr W., Cleary M.A. The POU domain: versatility in transcriptional regulation by a flexible two-in-one DNA-binding domain // Genes Dev. 1995. V. 9. № 14. P. 16791693.

39. Humphrey R.K., Beattie G.M., Lopez A.D. et al. Maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells is STAT3 independent // Stem Cells. 2004. V. 22. № 4. P. 522-530.

40. Hyslop L., Stojkovic M., Armstrong L. et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages // Stem Cells. 2005. V. 23. № 8. P. 1035-1043.

41. James D., Levine A.J., Besser D., Hemmati-Brivanlou A. TGFbeta/activin/nodal signaling is necessary for the maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells // Development. 2005. V. 132. № 6. P. 1273-1282.

42. Jurka J. Database of repetitive elements (repbase). NCBI Database Repository. 1995. (ftp: //ncbi.nlm.nih.gov/repository/ repbase/).

43. Kanellopoulou C., Muljo S.A., Kung A.L. et al. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing // Genes Dev. 2005. V. 19. № 4. P. 489-501.

44. Kehler J., Tolkunova E., Koschorz B. et al. Oct4 is required for primordial germ cell survival //EMBO Rep. 2004. V. 5. № 11. P. 1078-1083.

45. Kim J.S., Kim J., Kim B.S. et al. Identification and functional characterization of an alternative splice variant within the fourth exon of human nanog // Exp. Mol. Med. 2005. V. 37. № 6. P. 601-607.

46. Kirchhof N., Carnwath J.W., Lemme E. et al. Expression pattern of Oct-4 in preimplantation embryos of different species // Biol. Reprod. 2000. V. 63. № 6. P. 1698-1705.

47. Kuroda Т., Tada M., Kubota H. et al. Octamer and Sox elements are required for transcriptional cis regulation of Nanog gene expression // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 6. P. 2475-2485.

48. Larroux C., Luke G.N., Koopman P. et al. Genesis and expansion of metazoan transcription factor gene classes // Mol. Biol. Evol. 2008. V. 25. № 5. P. 980-996.

49. Lavial F., Acloque H., Bertocchini F. et al. The Oct4 homologue PouV and Nanog regulate pluripotency in chicken embryonic stem cells // Development. 2007. V. 134. № 19. P. 3549-3563.

50. Lee J., Kim H.K., Rho J.Y. et al. The human OCT-4 isoforms differ in their ability to confer self-renewal // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 44. P. 33554-33565.

51. Lewis B.P., Burge C.B., Bartel D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets // Cell. 2005. V. 120. № l.P. 15-20.

52. Lin Т., Chao C., Saito S. et al. p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression // Nat. Cell Biol. 2005. V. 7. № 2. P. 165-171.

53. Liu L., Leaman D., Villalta M., Roberts R.M. Silencing of the gene for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin by the embryonic transcription factor Oct-3/4//Mol. Endocrinol. 1997. V. 11. № 11. p. 1651-1658.

54. Liu L., Roberts R.M. Silencing of the gene for the beta subunit of human chorionic gonadotropin by the embryonic transcription factor Oct-3/4 // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. №28. P. 16683-16689.

55. Loh Y.H., Wu Q., Chew J.L. et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells // Nat. Genet. 2006. V. 38. № 4. P. 431-440.

56. Lunde K., Belting H.G., Driever W. Zebrafish pou5fl/pou2, homolog of mammalian Oct4, functions in the endoderm specification cascade // Curr. Biol. 2004. V. 14. № l.P. 48-55.

57. Martin G.R. Isolation of a pluripotentcell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. № 12. P. 7634-7638.

58. Matsuda Т., Nakamura Т., Nakao К. et al. STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells // EMBO J. 1999. V. 18. № 15. P. 4261-4269.

59. Minucci S., Botquin V., Yeom Y.I. et al. Retinoic acid-mediated down-regulation of Oct3/4 coincides with the loss of promoter occupancy in vivo // EMBO J. 1996. V. 15. №4. P. 888-899.

60. Mitalipov S.M., Кио H.C., Hennebold J.D., Wolf D.P. Oct-4 expression in pluripotent cells of the rhesus monkey // Biol. Reprod. 2003. V. 69. № 6. P. 1785-1792.

61. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H. et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003. V. 113. № 5. P. 631-642.

62. Mullin N.P., Yates A., Rowe A.J. et al. The pluripotency rheostat Nanog functions as a dimer // Biochem. J. 2008. V. 411. № 2. P. 227-231.

63. Nichols J., Chambers I., Taga Т., Smith A. Physiological rationale for responsiveness of mouse embryonic stem cells to gpl30 cytokines // Development. 2001. V. 128. № 12. P.2333-2339.

64. Nichols J., Zevnik В., Anastassiadis K. et al. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct-4 // Cell. 1998. V. 95. №3. P. 379-391.

65. Nishimoto M., Miyagi S., Yamagishi T. et al. Oct-3/4 maintains the proliferative embryonic stem cell state via specific binding to a variant octamer sequence in the regulatory region of the UTF1 locus // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 12. P. 50845094.

66. Niwa H., Burdon Т., Chambers I., Smith A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3 // Genes Dev. 1998. V. 12. № 13. P. 2048-2060.

67. Niwa II., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells // Nat. Genet. 2000. V. 24. № 4. P. 372-376.

68. Niwa, H. Molecular mechanism to maintain stem cell renewal of ES cells // Cell Struct. Funct. 2001. V. 26. № 3. P. 137-148.

69. Nordhoff V., Hubner K., Bauer A. et al. Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences // Mamm. Genome. 2001. V. 12. № 4. P. 309-317.

70. Oh J.H., Do H.J., Yang H.M. et al. Identification of a putative transactivation domain in human Nanog // Exp. Mol. Med. 2005. V. 37. № 3. P. 250-254.

71. Okamoto K., Okazawa II, Okuda A. et al. A novel octamer binding transcription factor is differentially expressed in mouse embryonic cells // Cell. 1990. V. 60. № 3. P. 461-472.

72. Okamura D., Tokitake Y., Niwa H., Matsui Y. Requirement of Oct3/4 function for germ cell specification//Dev. Biol. 2008. V. 317. № 2. P. 576-584.

73. Okuda A., Fukushima A., Nishimoto M. et al. UTF1, a novel transcriptional coactivator expressed in pluripotent embryonic stem cells and extra-embryonic cells // EMBO J. 1998. V. 17. № 7. P. 2019-2032.

74. Okumura-Nakanishi S., Saito M., Niwa H., Ishikawa F. Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 7. P. 53075317.

75. Ovitt С. E., Sholer Н. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo // Mol. Hum. Reprod. 1998. V. 4. №11. P. 1021-1031.

76. Pain D., Chirn G.W., Strassel C., Kemp D.M. Multiple retropseudogenes from pluripotent cell-specific gene expression indicates a potential signature for novel gene identification // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 8. P. 6265-6268.

77. Pan G., Li J., Zhou Y. et al. A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal // FASEB J. 2006. V. 20. № 10. P. 1730-1732.

78. Pan G.J., Pei D.O. Identification of two distinct trans activation domains in the pluripotency sustaining factor Nanog // Cell Res. 2003. V.13. № 6. P. 499-502.

79. Pan G., Pei D. The stem cell pluripotency factor NANOG activates transcription with two unusually potent subdomains at its С terminus // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. №2. P. 1401-1407.

80. Pearson W.R., Lipman D.J. Improved tools for biological sequence comparison // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. № 8. P. 2444-2449.

81. Pereira L., Yi F., Merrill B.J. Repression of Nanog gene transcription by Tcf3 limits embryonic stem cell self-renewal // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. № 20. P.7479-7491.

82. Pesce M., Anastassiadis K, Scholer H.R. Oct-4: lessons of totipotency from embryonic stem cells // Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. № 3-4. P. 144-152.

83. Pesce M., Scholer H.R. Oct-4: control of totipotency and germline determination // Mol. Reprod. Dev. 2000. V. 55. № 4. P. 452-457.

84. Pesce M., Scholer H.R. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development// Stem Cells. 2001. V. 19. № 4. P. 271-278.

85. Robertson M., Stenhouse F., Colby D. et al. Nanog retrotransposed genes with functionally conserved open reading frames // Mamm. Genome. 2006. V. 17. № 7. P. 732-743.

86. Rodda D.J., Chew J.L., Lim L.H. et al. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2 //J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 26. P. 24731-24737.

87. Rosner M.H., Vigano M.A., Ozato К. T. et al. A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo // Nature. 1990. V. 345. № 6277. P. 686-692.

88. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis., T Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

89. Sato N., Meijer L., Skaltsounis L. et al. Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor // Nat. Medicine. 2004. V. 10. № 1. P. 5563.

90. Sato N., Sanjuan I.M., Heke M. et al. Molecular signature of human embryonic stem cells and its comparison with the mouse // Dev. Biol. 2003. V. 260. № 2. P. 404-413.

91. Scholer H.R. Octamania: the POU factors in murine development // Trends Genet. 1991. V. 7. № 10. P. 323-329.

92. Scholer H.R., Balling R., Hatzopoulos A.K. et al. Octamer binding proteins confer transcriptional activity in early mouse embryogenesis // EMBO J. 1989. V. 8. № 9. P. 2551-2557.

93. Shi J.J., Cai D.H., Chen X.J., Sheng H.Z. Cloning and characterization of the rabbit POU5F1 gene // DNA Seq. 2007. V. 8. №1. (Epub. ahead of print).

94. Smith A.G. Embryo-derived stem cells: of mice and men // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. P. 435-462.

95. Snir M., О fir R., Elias S., Frank D. Xenopus laevis POU91 protein, an Oct3/4 homologue, regulates competence transitions from mesoderm to neural cell fates // EMBO J. 2006. V. 25. № 15. P. 3664-3674.

96. Soodeen-Karamath S., Gibbins A.M. Apparent absence of oct 3/4 from the chicken genome //Mol. Reprod. Dev. 2001. Y. 58. № 2. P. 137-148.

97. Sumi Т., Fujimoto Y., Nakatsuji N. Suemori H. STAT3 is dispensable for maintenance of self-renewal in nonhuman primate embryonic stem cells // Stem Cells. 2004. V. 22. № 5. P. 861-872.

98. Suo G., Han J., Wang X. et al. Oct4 pseudogenes are transcribed in cancers I I Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 337. № 4. P. 1047-1051.

99. Sutton J., Costa R., Klug M. et al. Genesis, a winged helix transcriptional repressor with expression restricted to embryonic stem cells // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. № 38. P. 23126-23133.

100. Tai M.H., Chang С. C„ Kiupel M., Webster J.D. et al. Oct4 expression in adult human stem cells: evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis // Carcinogenesis. 2005. V. 26. № 2. P. 495-502.

101. Takao Y., Yokota Т., Koide H. Beta-catenin up-regulates Nanog expression through interaction with Oct-3/4 in embryonic stem cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 353. № 3. P. 699-705.

102. Takeda J., Seino S., Bell G.I. Human Oct3 gene family: cDNA sequences, alternative splicing, gene organization, chromosomal location, and expression at low levels in adult tissues //Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. № 17. P. 4613-4620.

103. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. №> 5391. P. 1145-1147.

104. Velkey J.M., О'Shea K.S. Oct4 RNA interference induces trophectoderm differentiation in mouse embryonic stem cells // Genesis. 2003. V. 37. № 1. P. 18-23.

105. Wang S.H., Tsai M.S., Chiang M.F., Li H. A novel NK-type homeobox gene, ENK (early embryo specific NK), preferentially expressed in embryonic stem cells // Gene Expr. Patterns. 2003. V. 3. № 1. P. 99-103.

106. Wang Z, Ma Т., ChiX., Pei D. Aromatic Residues in the C-terminal Domain 2 Are Required for Nanog to Mediate LIF-independent Self-renewal of Mouse Embryonic Stem Cells // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. № 8. P. 4480-4489.

107. Wei C.L., Miura Т., Robson P. et al. Transcriptome profiling of human and murine ESCs identifies divergent paths required to maintain the stem cell state // Stem Cells. 2005. V. 23. №2. P. 166-185.

108. Wei F., Scholer H.R., Atchison M.L. Sumoylation of Oct4 enhances its stability, DNA binding, andtransactivation // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 29. P. 21551-21560.

109. Wu D.Y., Yao Z. Functional analysis of two Spl/Sp3 binding sites in murine Nanog gene promoter// Cell Res. 2006. V.16. № 3. P. 319-322.

110. Wu Q., ChenX., Zhang J. et al. Sall4 interacts with Nanog and co-occupies Nanog genomic sites in embryonic stem cells // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 34. P. 24090-24094.

111. Xu H.M., Liao В., Zhang O.J. et al. Wwp2, an E3 ubiquitin ligase that targets transcription factor Oct-4 for ubiquitination // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 22. P. 23495-23503.

112. Xu R.H., Chen X., Li D.S. et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. №. 12. P. 1261-1264.

113. Yamaguchi S., Kimura Я, Tada M. et al. Nanog expression in mouse germ cell development// Gene Expr. Patterns. 2005. V. 5. № 5. P. 639-646.

114. Yasuda S. Y., Tsuneyoshi N., Sumi T. et al. NANOG maintains self-renewal of primate ES cells in the absence of a feeder layer // Genes Cells. 2006. V. 11. № 9. P. 11151123.

115. Yeom Y.I., Fuhrmann G., Ovitt C.E. et al. Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells // Development. 1996. V. 122. № 3.P. 881-894.

116. Yeom Y.I., Ha H.S., Balling R. et al. Structure, expression and chromosomal location of the Oct-4 gene //Mech. Dev. 1991. V. 35. №. 3. P. 171-179.

117. Ying Q.L., Nichols J., Chambers I., Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3 // Cell. 2003. V. 115. № 3. P. 281-292.

118. Yuan Н., Corbi N., Basilico С., Dailey L. Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3 // Genes Dev. 1995. V. 9. № 21. P. 2635-2645.

119. Zhang J., Wang X., Chen B. et al. Expression of Nanog gene promotes NIH3T3 cell proliferation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 338. № 2. P. 1098-1102.

120. Zhang J., Wang X., Li M. et al. NANOGP8 is a retrogene expressed in cancers // FEBS J. 2006. V. 273. № 8. P. 1723-1730.

121. Zhang Z., Liao В., Xu M., Jin Y. Post-translational modification of POU domain transcription factor Oct-4 by SUMO-1 // FASEB J. 2007. Y. 21. № 12. P. 30423051.