Использование rhHsp70 для регуляции активности иммунокомпетентных клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Данилевский, Михаил Игоревич

• Данилевский, Михаил Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Данилевский, Михаил Игоревич

Список сокращений. Стр.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Основные свойства белков теплового шока.

1.1.1. Открытие иммуногенных свойств комплексов

Hsp70 с пептидами.

1.1.2. БТШ. Классификация и функции.

1.1.3. Особенности генов, полиморфизм, строение и локализация БТШ70.

1.2. Рецепторы Hsp70.

1.2.1. Toll-like рецепторы.

1.2.2. Рецептор CD40.

1.2.3. Эндоцитирующие рецепторы: CD91 и scavenger».

1.3. Возможные клетки-мишени для Hsp70.

1.3.1. Влияние на дендритные клетки.

1.3.2. Влияние на естественные киллеры (NK-клетки).

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Характеристика чистоты и иммунохимических свойств препарата rhHsp70А1В.

3.2. Исследование влияния rhHsp70AlB на свойства и функции ДК.

3.2.1. Характеристика ДК.

3.2.2. Исследование способности rhHsp70AlB связываться и эндоцитироваться ДК разной степени зрелости.

3.2.3. Исследование влияния rhHsp70AlB на созревание ДК.

3.2.4. Изучение влияния белка rhHsp70 на уровень секреции ФНОа дендритными клетками человека.

3.2.5. Изучение влияния rhHsp70 на антигенпредставляющую способность ДК.

3.2.6. Изучение влияния белка rhHsp70 на способность дендритных клеток человека стимулировать неспецифическую (спонтанную) ЦТА лимфоцитов.

3.3. Изучение влияния белка rhHsp70 на активность естественных киллеров.

3.4. Исследование влияния АДФ на функции ДК.

3.4.1. Исследование влияния АДФ на способность ДК эндоцитировать ФИТЦ-меченный пептид.

3.4.2. Исследование способности зрелых ДК, обработанных вирусоспецифическим пептидом или лизатами опухолевых клеток в присутствии АДФ, индуцировать продукцию ФНОа и ИФу лимфоцитами.

3.4.3. Исследование влияния АДФ, добавляемого при нагрузке ДК пептидными антигенами и антигенами из лизатов опухолевых клеток, на способность ДК активировать неспецифическую и индуцировать антигенспецифическую ЦТА лимфоцитов.

3.5. Изучение эффективности индукции антигенспецифических ЦТЛ при использовании комплексов rhHsp70 с антигенами для оптимизации введения антигенов в дендритные клетки человека

3.5.1. Изучение влияния обработки дендритных клеток человека свободным меланомаспецифическим пептидом MelanA/Mart и его комплексами с rhHsp70 на цитотоксическую активность индуцированных ими ЦТЛ в зависимости от степени зрелости дендритных клеток

3.5.2. Изучение влияния обработки дендритных клеток человека комплексами rhHsp70 с пептидами лизата опухолевых клеток на цитотоксическую активность индуцированных ими ЦТЛ в зависимости от степени зрелости дендритных клеток.

3.5.3. Анализ уровня секреции цитокинов ИФу и ФНОа лимфоцитами после их стимуляции ДК, обработанными комплексами rhHsp70 с антигенами лизатов опухолевых клеток.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование rhHsp70 для регуляции активности иммунокомпетентных клеток»

Актуальность проблемы. Многие формы онкологических заболеваний до сих пор трудно поддаются современным методам терапии, основанным на хирургическом вмешательстве, использовании химиотерапии и лучевой терапии. Поэтому наряду с совершенствованием классических методов крайне актуальными являются исследования, направленные на создание новых стратегий борьбы с раком с помощью иммунотерапии, целью которых является как предупреждение развития опухолей, так и их элиминация, в частности, с использованием белков теплового шока (БТШ, Hsp) для специфической активации иммунной системы.

В 1980-х годах в экспериментах Р. К Srivastava и соавторов была обнаружена способность выделенных из опухолевых тканей БТШ разных семейств - Hsp70, gp96, Hsp90 - индуцировать клеточный противоопухолевый иммунный ответ [1,2]. Иммуногенность таких препаратов определяется присутствием в их составе опухолеспецифических антигенов (ОСА) или их фрагментов — опухолеспецифических пептидов (ОСП) - в виде прочно связанных комплексов с БТШ [1,3-5]. Это открытие стимулировало исследования, направленные на создание реконструированных противоопухолевых вакцин на основе рекомбинантных белков Hsp70 и gp96 в виде комплексов с ОСА, в том числе с синтетическими МНС-рестриктированными ОСП, или в виде фьюжен-белков БТШ с ОСА, или в виде ДНК-вакцин, содержащих гены БТШ и ОСА [6-9].

Высокая иммуногенность комплексов ОСА с нативными и рекомбинантными Hsp70 и gp96 обусловлена способностью этих БТШ транспортировать ОСА в важнейшие антигенпредставляющие клетки организма - в дендритные клетки (ДК) [10,11]. В результате процессинга экзогенных антигенов в ДК образуются пептиды, которые могут встраиваться в молекулы МНС класса II и пептиды, которые могут встраиваться в молекулы МНС I, презентироваться в контексте этих молекул

Т-лимфоцитам и распознаваться Т-клеточным рецептором CD4+ и CD8+ цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) соответственно. Полагают, что БТШ оптимизируют этот процесс, обеспечивая транспорт ОСП через внутриклеточные мембраны в те везикулы клетки, где происходит формирование комплексов пептидов с белками МНС I.

Кроме того, показано, что многие БТШ обладают иммунорегуляторной активностью и стимулируют созревание незрелых ДК и секрецию ДК цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа и ИЛ-12, которые обеспечивают и поддерживают индукцию и пролиферацию антигенспецифических, в том числе, опухолеспецифических ЦТЛ [12-14]. Однако, сведения об иммунорегуляторной активности БТШ весьма противоречивы. Важно отметить, что при исследовании даже высоко очищенных от эндотоксинов нативных и рекомбинантных эукариотических БТШ одни авторы обнаруживают у Hsp70 способность ускорять созревание ДК и активировать их функции [13-15], в то время как другие не находят у этого белка свойств цитокина и показывают, что его способность усиливать презентацию антигенов целиком определяется влиянием Hsp70 на внутриклеточную доставку пептидов при использовании антигенов в виде комплексов с Hsp70 [16,17]. Разногласия в оценке иммунорегуляторной активности БТШ могут зависеть как от особенностей использованных препаратов Hsp70, так и от выбранных клеточных моделей.

В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение влияния рекомбинантного белка Hsp70AlB человека (rhHsp70) на активность ДК человека разной стадии созревания и возможности оптимизации противоопухолевого клеточного иммунного ответа при использовании реконструированных комплексов Hsp70 с ОСА.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выделение и очистка rhHsp70AlB из бактериальной массы штамма клеток E.coli, трансформированных экспрессионной плазмидой pQE80-hHSP70AlB, конструкция которой содержит полноразмерную последовательность гена HSP70A1B.

2. Характеристика полученного белка по молекулярной массе и иммунохимической активности с помощью электрофореза в ПААГе и иммуноблоттинга.

3. Исследование влияния rhHsp70 на активность NK-клеток, уровень секреции ФНОа незрелыми ДК (нзДК) и зрелыми ДК (зрДК) и способность ДК разной степени зрелости стимулировать пролиферацию и цитотоксическую активность (ЦТА) лимфоцитов.

4. Исследование возможности оптимизации индукции опухолеспецифических ЦТЛ при использовании комплексов ОСП MelanA/Mart с rhHsp70.

5. Исследование возможности оптимизации индукции опухолеспецифических ЦТЛ при использовании комплексов ОСА лизатов опухолевых клеток с rhHsp70.

Научная новизна работы.

Впервые обнаружено, что выделенный и очищенный из штамма-продуцента E.coli рекомбинантный белок теплового шока человека rhHsp70AlB по иммунохимическим свойствам отличается от rhHsc70 и rHsp70 М. tuberculosis, несмотря на высокую степень гомологии этих белков.

Впервые обнаружено, что rhHsp70AlB стимулирует секрецию ФНОа и повышает способность дендритных клеток стимулировать спонтанную ЦТА лимфоцитов только при действии на зрелые дендритные клетки.

Впервые показано, что введение комплексов опухолеспецифических антигенов с Hsp70 в ДК можно проводить в присутствии АДФ и Mg~ , что обеспечивает стабильность этих комплексов.

Впервые обнаружено, что использование различных опухолеспецифических антигенов при нагрузке зрелых ДК в форме комплексов с rhHsp70AlB позволяет индуцировать ЦТЛ с более высокой специфической цитотоксической активностью, чем при использовании свободных антигенов.

Практическая значимость исследования.

Обнаружено, что выделенный и очищенный из штамма-продуцента E.coli рекомбинантный белок теплового шока человека rhHsp70AlB обладает иммунорегулирующей активностью, но при этом оказывает разные эффекты на ДК человека на разных стадиях их дифференцировки: ускоряет созревание незрелых ДК и повышает их антигенпредставляющую способность, но активирует только зрелые ДК, стимулируя секрецию ФНОа и повышая их способность стимулировать ЦТА лимфоцитов, что необходимо учитывать, при создании вакцин на основе этого белка.

Обнаруженная возможность проводить введение комплексов антигенов с л 1

Hsp70 в ДК в присутствии комплексообразующих агентов АДФ и Mg упрощает и делает более стабильной процедуру введения антигенов в ДК. Продемонстрированная в работе оптимизация индукции клеточного иммунного ответа при стимуляция лимфоцитов ДК, в которые опухолеспецифические антигены вводили в виде комплексов с rhHsp70AlB позволяет рекомендовать этот белок для разработки реконструированных вакцин и для оптимизации приготовления ДК-вакцин.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Российском Медицинском Форуме-2006 «Фундаментальная наука и практика» (2006, Москва), на International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies in Medicine and Experimental Biology" (2007,

Bangkok-Pattaya, Thailand), на Международной конференции "Физиология и патология иммунной системы" и IV Международной конференции по иммунотерапии (2008 г., Москва), на XII Онкологическом конгрессе (2008 г., Москва), на Иммунологическом форуме с международным участием (2008 г., Санкт-Петербург).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ: 3 статьи, опубликованные в журналах, состоящих в перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК, и 5 публикаций, представленных в материалах конференций.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Данилевский, Михаил Игоревич

Выводы.

1. Обнаружено, что выделенный и очищенный из штамма-продуцента E.coli рекомбинантный белок теплового шока человека rhHsp70AlB по иммунохимическим свойствам отличается от rhHsc70 и rHsp70 М. tuberculosis.

2. Показано, что rhHsp70AlB специфически связывается и эндоцитируется дендритными клетками человека.

3. Показано, что rhHsp70AlB ускоряет созревание незрелых дендритных клеток человека и повышает их антигенпредставляющую способность, а также активирует NK-клетки.

4. Обнаружено, что rhHsp70AlB стимулирует секрецию ФНОа и повышает способность дендритных клеток стимулировать спонтанную ЦТА лимфоцитов при действии только на зрелые дендритные клетки.

5. Показано, что введение комплексов антигенов с Hsp70 в дендритные клетки можно проводить в присутствии АДФ и Mg , что обеспечивает стабильность этих комплексов.

6. Обнаружено, что использование различных опухолеспецифических антигенов при нагрузке зрелых дендритных клеток в форме комплексов с rhHsp70AlB позволяет индуцировать ЦТЛ с более высокой специфической цитотоксической активностью, чем при использовании свободных антигенов.

7. Показано, что стимуляция лимфоцитов дендритными клетками, в которые опухолеспецифические антигены вводили в виде комплексов с rhHsp70AlB, сопровождалась более высоким уровнем секреции цитокинов ФНОа и ИФу.

Заключение.

В результате проведенной работы был выделен из штамма-продуцента, очищен и охарактеризован рекомбинантный белок Hsp70AlB человека. Используемый при очистке протокол позволяет получить белок с чистотой не менее 99% (рис. 1). Чистота препарата подтверждена данными электрофореза и иммуноблоттинга. Кроме того, с помощью иммуноблоттинга показано отсутствие взаимодействия препаратов rhHsc70 и rHsp M.tuberculosis в отличие от rhHsp70 с использовавшимися нами МоАТ к белку rhHsp70 (рис. 2). Этот факт свидетельствует о том, что, несмотря на очень высокий уровень гомологии между белками семейства HSP70, их иммунохимические свойства имеют значительные различия, что может обусловливать различия и в иммунорегулирующих свойствах. Содержание эндотоксина в полученных нами препаратах rhHsp70 согласно результатам JIAJI-теста составляло от 150 до 480 нг ЛПС на 1мг белка. В связи с этим, а также для исключения влияния на результаты исследований возможных примесей ЛПС в других реактивах, все эксперименты проводили с использованием полимиксина В, связывающего ЛПС.

Иммунорегуляторные свойства rhHsp70AlB и иммуногенные свойства его комплексов с ОСА были изучены нами в экспериментах с ДК.

В экспериментах с ФИТЦ-меченным белком нами показано, что rhHsp70AlB связывается с ДК, причем это связывание является высокоспецифическим (рис. 4). Уровень связывания rhHsp70 с ДК зависит от степени их зрелости, достигая более высоких значений при взаимодействии белка со зрелыми ДК, что, по всей видимости, связано с увеличением количества рецепторов к Hsp70 при созревании ДК (рис. 5). В соответствии с литературными данными, одним из наиболее вероятных рецепторов в этом случае является CD40 [101,102]. Показана также способность ДК накапливать rhHsp70AlB. Таким образом, rhHsp70AlB специфически взаимодействует с ДК и, следовательно, может оказывать влияние на их свойства и функции.

Взаимодействуя с незрелыми ДК, rhHsp70 несколько ускоряет их созревание, что наблюдается по повышению уровня экспрессии CD80, CD86 и в меньшей степени CD83 (рис. 6). Тем не менее, созревание, индуцированное rhHsp70, выражено в значительно меньшей степени, по сравнению с созреванием, вызванным ФНОа и лейкинфероном, и ДК, полученные при обработке rhHsp70, занимают промежуточное положение между зрелыми и незрелыми ДК. Таким образом, для получения полноценных зрелых ДК недостаточно сигнала только от rhHsp70. В то же время в исследовании по изучению влияния rhHsp70 на АПС незрелых ДК, проведенные в аллогенной системе, выявили стимулирующие свойства rhHsp70 (рис. 8).

Кроме того, показано, что обработка зрелых ДК белком rhHsp70 приводит к увеличению уровня секреции ФНОа (рис. 7) и повышает их способность к индукции спонтанной ЦТА лимфоцитов (рис. 9).

Таким образом, в условиях, исключающих действие незначительной примеси ЛПС благодаря использованию полимиксина В, обнаружено, что rhHsp70AlB обладает иммунорегулирующей активностью.

Для образования комплексов ОСА с rhHsp70 необходимо использовать

АДФ и Mg2+ и целесообразно добавлять приготовленные комплексы, не удаляя эти компоненты, что обеспечило бы более длительную стабильность комплексов. Но поскольку присутствие АДФ и Mg в смеси для получения комплексов могло повлиять на результаты исследований при добавлении к

ДК, нами было изучено их воздействие на способность ДК индуцировать специфические ЦТЛ. Эксперименты, проведенные с этой целью, показали

2+ отсутствие отрицательного влияния АДФ и Mg на накопление зрелыми ДК антигенов. Более того, инкубация зрелых ДК с АДФ приводила к повышению их способности активировать лимфоциты, что оценивалось по уровню продукции цитокинов индуцированными лимфоцитами (рис. 12). В целом же,

2+ влияние АДФ и Mg на функции ДК является незначительным по сравнению с эффектами, обусловленными воздействием на ДК комплексов rhHsp70-антиген.

Исследования, проведенные нами для изучения иммуногенных свойств комплексов rhHsp70 с антигенами, показали, что введение опухолеспецифического пептида в зрелые ДК в виде комплексов с rhHsp70 позволяет за два цикла стимуляции такими ДК индуцировать специфическую ЦТА лимфоцитов, чего не происходит при введении в ДК свободного пептида (рис. 16). Более того, нагрузка ДК комплексами rhHsp70 с лизатами опухолевых клеток, даже в случае использования незрелых ДК, позволяет индуцировать более активные ЦТЛ (рис. 17; рис. 18). Также показано, что предварительная обработка ДК комплексами rhHsp70 с антигенами лизатов опухолевых клеток, независимо от степени зрелости ДК, приводит к значительному повышению секреции ИФу (рис. 19) и ФНОа (рис. 20) индуцированными лимфоцитами, что свидетельствует об оптимизации развития иммунного ответа при использовании комплексов.

Как уже говорилось, различия в эффектах rhHsp70, а, соответственно, и его комплексов с антигенами при воздействии на незрелые и зрелые ДК обусловлены, по всей видимости, соотношением на поверхности клеток рецепторов, участвующих в распознавании rhHsp70. Несмотря на то, что в настоящей работе не ставилось задачи определить данные рецепторы, сопоставление данных литературы и полученных нами результатов позволяет сделать вывод, что эффекты исследовавшегося нами белка rhHsp70AlB косвенно подтверждают участие в его распознавании рецептора CD40, являющегося одним из основных рецепторов, изучаемых в качестве рецептора Hsp70 [101,102]. Данный вывод следует из того, что наблюдавшиеся в наших исследованиях эффекты rhHsp70 и его комплексов с антигенами были наиболее выражены при взаимодействии со зрелыми ДК, на поверхности которых экспрессируется значительно большее количество молекул CD40 по сравнению с незрелыми ДК. В тоже время, не стоит исключать возможности наличия и других рецепторов к Hsp70. Тем не менее, маловероятным является возможное участие TLR4 в наблюдавшихся нами эффектах, так как многие исследования показали необходимость присутствия молекул CD 14 для его взаимодействия с Hsp70 [13,16], а их экспрессия на поверхности зрелых ДК практически полностью прекращается. В тоже время, это еще раз подтверждает, что эффекты rhHsp70, наблюдавшиеся в наших экспериментах, не являются результатом загрязненности ЛПС, для распознавания которых также необходимы молекулы CD14.

В контексте ведущихся в литературе дискуссий о свойствах Hsp70 необходимо отметить, что полученные в наших исследованиях результаты характеризуют белок rhHsp70AlB как перспективный препарат, комплексы с которым позволяют оптимизировать доставку антигенов в ДК, и, в то же время, свидетельствуют о слабой выраженности цитокиновых (так называемых, шаперокиновых) свойств индивидуального белка.

Выявленные в результате настоящей работы различия в эффектах rhHsp70 и его комплексов на ДК разной степени зрелости являются важным аспектом для планирования будущих исследований, в частности, при использовании комплексов rhHsp70 с антигенами в качестве основы для вакцин предстоит решить вопрос о наилучшем способе их введения в организм.

Таким образом, в проведенных исследованиях показано, что полученный нами белок rhHsp70AlB обладает иммунорегулирующими свойствами, а его комплексы с различными антигенами позволяют оптимизировать введение антигенов в ДК, что позволяет рекомендовать использование белка rhHsp70AlB в качестве основы для создания противоопухолевых вакцин, а также для приготовления ДК-вакцин.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Данилевский, Михаил Игоревич, 2009 год

1. Srivastava РК, Menoret A, Basu S, et al. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. // Immunity. — 1998. — Vol.8.-P.657-65.

2. Udono H, Srivastava PK. Comparison of tumor-specific immunogenicities of stress-induced proteins gp96, hsp90, and hsp70. // J. Immunol. 1994. -Vol. 152(1 l).-P.5398-403.

3. Suto R, Srivastava PK. A mechanism for the specific immunogenicity of heat shock protein-chaperoned peptides. // Science. 1995. - Vol.269(5230). — P.1585-8.

4. Przepiorka D, Srivastava PK. Heat shock protein—peptide complexes as immunotherapy for human cancer. // Mol. Med. Today. 1998. - Vol.4(ll). -P.478-84.

5. Ishii T, Udono H, Yamano T, Ohta H, et al. Isolation of MHC class I-restricted tumor antigen peptide and its precursors associated with heat shock proteins hsp70, hsp90, and gp96. // J. Immunol. 1999. - Vol. 162(3). - P. 1303-9.

6. Blachere NE, Li Z, Chandawarkar RY, et al. Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity.//J. Exp. Med. 1997. - Vol.186. -P.1315-22.

7. Li Z. In vitro reconstitution of heat shock protein-peptide complexes for generating peptide-specific vaccines against cancers and infectious diseases. // Methods. 2004. - Vol.32(l). - P.25-8.

8. Wang XY, Li Y, Yang G, Subjeck JR. Current ideas about applications of heat shock proteins in vaccine design and immunotherapy. // Int. J. Hyperthermia. 2005. - Vol.21(8). - P.717-22.

9. Zhang X, Yu C, Zhao J, et al. Vaccination with a DNA vaccine based on human PSCA and HSP70 adjuvant enhances the antigen-specific CD8+ T-cellresponse and inhibits the PSCA+ tumors growth in mice.J Gene Med. 2007 Aug;9(8):715-26.

10. Arnold-Schild D, Hanau D, Spehner D, et al. Cutting edge: receptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells. //J. Immunol. 1999. - 162(7).-P.3757-60.

11. Noessner E, Gastpar R, Milani V, et al. Tumor-derived heat shock protein 70 peptide complexes are cross-presented by human dendritic cells. // J. Immunol. 2002. - Vol.169(10). — P.5424-32.

12. Asea A, Rehli M, Kabingu E et al. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70 role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277. - P. 15028-43.

13. Asea A. Stress proteins and initiation of immune response: chaperokine activity of hsp72. // Exerc. Immunol. Rev. 2005. - Vol.11. - P.34-45.

14. Tsan MF, Gao B. Heat Shock Protein and Innate Immunity. // Cellular & Molecular Immunology. 2004. - Vol. 1(4). - P.274-279.

15. Bausinger H, Lipsker D, Ziylan U et al. Endotoxin-free heat-shock protein 70 fails to induce APC activation. // Eur. J. Immunol. 2002. - Vol.32. -P.3708-13.

16. Bendz H, Ruhland SC, Pandya MJ, et al. Human heat shock protein 70 enhances tumor antigen presentation through complex formation and intracellular antigen delivery without innate immune signaling. // J. Biol. Chem. 2007. -Vol.282(43). - P.31688-702.

17. Srivastava PK. Peptide-binding heat shock proteins in the endoplasmic reticulum: role in immune response to cancer and in antigen presentation.// Adv. Cancer. Res. 1993. - Vol.62. - P. 153-77.

18. Udono H, Srivastava PK. Heat Shock Protein 70-associated Peptides Elicit Specific Cancer Immunity.// J. Exp. Med. 1993. - Vol.l78(4). - P.1391-6.

19. Ciupitu AM, Petersson M, Kono K, et al. Immunization with heat shock protein 70 from methylcholanthrene-induced sarcomas induces tumor protection correlating with in vitro T cell responses.// Cancer Immunol. Immunother. 2002. - Vol.51. - P. 163-170.

20. Navaratnam M, Deshpande MS, Hariharan MJ, Zatechka DS, Srikumaran S. Heat shock protein-peptide complexes elicit cytotoxic T-lymphocyte and antibody responses specific for bovine herpesvirus 1. // Vaccine. — 2001. Vol.19(11-12). - P.1425-1434.

21. Wallin RP, Lundqvist A, More SH, et al. Heat-shock proteins as activators of the innate immune system. // Trends Immunol. 2002. - Vol.23. -P.130-135.

22. Tsan MF, Gao B. Cytokine function of heat shock proteins. // Am. J. Physiol. 2004. - Vol.286. - P.739-744.

23. Ritossa FA. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila. // Experientia. 1962. - Vol.l8. - P.571-573.

24. Tissieres A, Mitchell HK, Tracy U. Protein synthesis in salvary glands of Drosophila melanpgaster: relation to chromosome puffs. // J. Mol. Biol. 1974. - Vol.84.-P.389-398.

25. Fink AL. Chaperone-mediated protein folding. // Physiol. Rev. -1999. Vol.79. - P.425-449.

26. Hard FU, Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. // Science. 2002. - Vol.295. - P.l852-1858.

27. Lindquist S, Craig EA. The heat-shock proteins. // Annu. Rev. Genet. 1988.- Vol.22. -P.631-677.

28. Jaattela M. Heat shock proteins as cellular lifeguards. // Ann Med. -1999.-Vol.31.-P.261-271.

29. Hightower LE, Hendershot LM. Molecular chaperones and the heat shock response at Cold Spring Harbor. Cell Stress Chaperon. 1997. - Vol.2. — P.l-11.

30. Ingolia T.D., Craig E.A. Four small Drosophila heat shock proteins are related to each other and to mammalian alpha-crystallin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982. - Vol.79. -P.2360-2364.

31. Brocchieri L, Conway de Macario E, Macario AJ. hsp70 genes in the human genome: Conservation and differentiation patterns predict a wide array of overlapping and specialized functions. // BMC Evol. Biol. 2008. - Vol.8. - P. 19.

32. Singh R, Kolvraa S, Rattan SI. Genetics of human longevity with emphasis on the relevance of HSP70 as candidate genes. // Front. Biosci. 2007. -Vol.12.-P.4504-4513.

33. Milner CM, Campbell RD. Structure and expression of the three МНС-linked HSP70 genes. // Immunogenetics. 1990. - Vol.32. - P.242-251.

34. Flaherty KM, DeLuca-Flaherty C, McKay DB. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. // Nature. -1990. Vol.346. - P.623-628.

35. Cegielska A, Georgopoulos C. Functional Domains of the Escherihia coli dnaK Heat Shock Protein as Revealed by Mutational Analysis // J. Biol. Chem. — 1998. — Vol. 264(35). — P.21122-21130.

36. Caplan AJ, Cyr DM, Douglas MG. Eukaiyotic homologues of Escherichia coli dnaj: a diverse protein family that functions with hsp70 stress proteins. // Mol. Biol. Cell. 1993. - Vol.4. - P.555-563.

37. Kathryn V. Anderson, Gerd Jiirgens, Christiane Nusslein-Volhard. Establishment of dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo: Genetic studies on the role of the Toll gene product. // Cell. 1985. -Vol.42(3). - P.779-89.

38. Anderson KV, Bokla L, Nusslein-Volhard C. Establishment of dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo: the induction of polarity by the Toll gene product. // Cell. 1985. - Vol.42(3). - P.791-8.

39. Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, et al. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/ToII/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. // Cell. 1996. - Vol.86(6). - P.973-83.

40. Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway С A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. // Nature. -1997. Vol.388 (6640). - P.394-7.

41. Gay N, Keith F. Drosophila Toll and IL-1 receptor. // Nature — 1991. — Vol.351. -P.355-356.

42. Bowie A, O'Neill LA. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: signal generators for pro-inflammatory interleukins and microbial products. // J. Leukoc. Biol. 2000. - Vol.67(4). -P.508-14.

43. Poltorak A, He X, Smirnova I, et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. // Science. 1998. -Vol.282. -P.2085-2088.

44. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide:evidence for TLR4 as the Lps gene product. // J. Immunol. 1999. - Vol.162. — P.3749-3752.

45. Kurt-Jones EA, Popova L, Kwinn L, et al. Pattern recognition receptors TLR4 and CD 14 mediate response to respiratory syncytial virus. // Nat. Immunol. 2000. - Vol. 1. - P.398-401.

46. Smiley ST, King JA, Hancock WW. Fibrinogen stimulates macrophage chemokine secretion through tolllike receptor 4. // J. Immunol. — 2001. Vol.167. - P.2887-2894.

47. Taylor KR, Trowbridge JM, Rudisill JA, et al. Hyaluronan fragments stimulate dermal endothelial recognition of injury through TLR4. // J. Biol. Chem.- 2004. Vol.279. - P. 17079-17084.

48. Termeer C, Benedix F, Sleeman J, et al. Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cells via toll-like receptor 4. // J. Exp. Med. 2002. -Vol.195.-P.99-111.

49. Tobias PS, Soldau K, Ulevitch RJ. Isolation of a lipopolysaccharide-binding acute phase reactant from rabbit serum. // J. Exp. Med. 1986. - Vol.164.- P.777-793.

50. Shimazu R, Akashi S, Ogata H, et al. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4. // J. Exp. Med. 1999. -Vol.189.-P.1777-1782.

51. Viriyakosol S, Kirkland T, Soldau K, Tobias P. MD-2 binds to bacterial lipopolysaccharide. // J. EndotoxinRes. 2000. - Vol.6 - P.489-491.

52. Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Kopp E, et al. MyD88 is an adaptor protein in the hToML-1 receptor family signaling pathways. // Mol. Cell. 1998.- Vol.2.-P.253-258.

53. Muzio M, Ni J, Feng P, Dixit VM. IRAK (Pelle) family member IRAK-2 and MyD88 as proximal mediators of IL-1 signaling. // Science. 1997. -Vol.278.-P.1612-1615.

54. Muzio M, Natoli G, Saccani S, et al. The human toll signaling pathway: divergence of nuclear factor kappaB and JNK/SAPK activation upstream of tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6). // J. Exp. Med. -1998. Vol.187. - P.2097-2101.

55. Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, et al. TRAM is specifically involved in the Toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway. // Nat. Immunol. 2003. - Vol.4(l 1). - P. 1144-50.

56. Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, et al. Essential role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR4. // Nature 2002. -Vol.420(6913). -P.324-9.

57. Schwadner R, Dziarski R, Wesche H, et al. Peptidoglycan- and lipoteichoic acidinduced cell activation is mediated by Toll-like receptor 2. // J. Biol. Chem. 1999. - Vol.274. - P. 17406-17409.

58. Yoshimura A, Lien E, Ingalls RR, et al. Cutting edge: Recognition of Gram-positive bacterial cell wall components by the innate immune system occurs via Toll-like receptor 2. // J. Immunol. 1999. - Vol.165. - P. 1-5.

59. Brightbill HD, Libraty DH, Krutzik SR, et al. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through Toll-like receptors. // Science. 1999. - Vol.285. - P.732-736.

60. Means TK, Wang S, Lien E, et al. Human Toll-like receptors mediate cellular activation by Mycobacterium tuberculosis. // J. Immunol. 1999. -Vol.163.-P.3920-3927.

61. Underhill DM, Ozinsky A, Hajjar AM, et al. The Toll-like receptor 2 is recruited to macrophage phagosomes and discriminates between pathogens. // Nature. 1999. - Vol.401. - P.811-815.

62. Bieback K, Lien E, Klagge IM, et al. Hemagglutinin protein of wild-type measles virus activates toll-like receptor 2 signaling. // J. Virol. 2002. — Vol.76.-P.8729-8736.

63. Compton T, Kurt-Jones EA, Boehme KW, et al. Human cytomegalovirus activates inflammatory cytokine responses via CD 14 and Tolllike receptor 2. // J. Virol. 2003. - Vol.77. - P.4588-4596.

64. Kurt-Jones EA, Chan M, Zhou S, et al. Herpes simplex virus 1 interaction with Toll-like receptor 2 contributes to lethal encephalitis. //Proc. Natl.Acad. Sci. USA 2004. - Vol.101. -P.1315-1320.

65. Werts C, Tapping RI, Mathison JC, et al. Leptospiral lipopolysaccharide activates cells through a TLR2-dependent mechanism. //Nat. Immunol. 2001. - Vol.2. - P.346-352.

66. Ogawa T, Asai Y, Hashimoto M, et al. Cell activation by Porphyromonas gingivalis lipid A molecule through Toll-like receptor 4- and myeloid differentiation factor 88-dependent signaling pathway. // Int. Immunol. -2002. Vol.14. - P.1325-1332.

67. Ozinsky A, Underhill DM, Fontenot JD, et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between Toll-like receptors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. -Vol.97.-P.13766-13771.

68. Takeuchi O, Sato S, Horiuchi T, et al. Role of TLR 1 in mediating immune response to microbial lipoproteins. // J. Immunol. 2002. - Vol.169. — P.10-14.

69. Cooperstock MS. Inactivation of endotoxin by polymyxin B. // Antimicrob. Agents Chemother. 1974. - Vol.6 - P.422-425.

70. Cavaillon JM, Haeffner-Cavaillon N. Polymyxin В inhibition of LPS-induced interleukin-1 secretion by human monocytes is dependent upon the LPS origin. // Mol. Immunol. 1986. - Vol.23. - P.965.

71. Stokes DC, Shenep JL, Fishman M, et al. Polymyxin В prevents lipopolysaccharide-induced release of tumor necrosis factors from alveolar macrophages. // J. Infect. Dis. 1989. - Vol.160. - P.52.

72. Asea A, Kraeft SK, Kurt-Jones EA, et al. Hsp70 stimulates cytokine production through a CD-14-dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. // Nat. Med. 2000. - Vol.6 - P.43 5-442.

73. Chen W, Syldath U, Bellmann K, et al. Human 60-kDa heat-shock protein: a danger signal to the innate immune system. // J. Immunol. 1999. -Vol.162.-P.3212-3219.

74. Dybdahl B, Wahba A, Lien E, et al. Inflammatory response after open heart surgery: release of heat-shock protein 70 and signaling through Toll-like receptor-4. // Circulation. 2002. - Vol.105. - P.685-690,.

75. Kol A, Lichtman AH, Finberg RW, et al. Cutting edge: heat shock protein (HSP) 60 activates the innate immune response: CD 14 is an essential receptor for HSP60 activation of mononuclear cells. // J. Immunol. 2000. -Vol.164. -P.13-17.

76. Retzlaff C, Yamamoto Y, Hoffman PS, et al. Bacterial heat shock proteins directly induce cytokine mRNA and interleukin-1 secretion in macrophage cultures. // Infect. Immun. 1994. - Vol.62. - P.5689-5693.

77. Retzlaff C, Yamamoto Y, Okubo S, et al. Legionella pneumophila heat-shock protein-induced increase of interleukin-1 mRNA involves protein kinase С signaling in macrophages. // Immunology 1996. - Vol.89. - P.281-288.

78. Wang Y, Kelly CG, Singh M, et al. Stimulation of Th-1 polarizing cytokines, C-C chemokines, maturation of dendritic cells, and adjuvant function by the peptide binding fragment of heat shock protein 70. // J. Immunol. — 2002. -Vol.169.-P.2422-2429.

79. Galdiero M, DeL'ero GC, and Marcatili A. Cytokine and adhesion molecule expression in human monocytes and endothelial cells stimulated with bacterial heat shock proteins. // Infect. Immun. 1997. - Vol.65. - P.699-707.

80. Asea A, Kraeft SK, Kurt-Jones EA, et al. Hsp70 stimulates cytokine production through a CD-14-dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. // Nat. Med. 2000. - Vol.6 - P.435-442.

81. McLeish KR, Dean WL, Wellhausen SR, Stelzer GT. Role of intracellular calcium in priming of human peripheral blood monocytes by bacterial lipopolysaccharide. // Inflamation. 1989. - Vol.13. - P.681-92.

82. Gao B, Tsan MF. Induction of cytokines by heat shock proteins and endotoxin in murine macrophages. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. -Vol.317.-P.l 149-54.

83. Gao B, Tsan MF. Endotoxin contamination in recombinant human Hsp70 preparation is responsible for the induction of TNFa release by murine macrophages. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol.278. - P. 174-179.

84. Johnson JD, Fleshner M. Releasing signals, secretory pathways, and function of endogenous extracellular heat shock protein 72. // J. Leucocyte Biol. — 2006. Vol.79. - P.425-433.

85. Banchereau J, Bazan F, Blanchard D, et al. The CD40 antigen and its ligand. // Annu. Rev. Immunol. 1994. - Vol.12. - P.881-922.

86. McWhirter SM, Pullen SS., Holton JM, et al. Crystallographic analysis of CD40 recognition and signaling by human TRAF2. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.-Vol.96.-P.8408-8413.

87. Cheng G, Cleary AM, Ye ZS, et al. Involvement of CRAF1, a relative of TRAF, in CD40 signaling. // Science. 1995. - Vol.267. - P. 1494-1498.

88. Ishida T, Tojo T, Aoki T, et al. TRAF5, a novel tumor necrosis factor receptor-associated factor family protein, mediates CD40 signaling. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol.93. - P.9437-9442.

89. Datta SK, Kalled SL. CD40-CD40 ligand interaction in autoimmune disease. // Arthritis Rheum. 1997. - Vol.40. - P. 1735-1745.

90. Caux С, Massacrier С, Vanbervliet В, et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. // J. Exp. Med. 1994. - Vol.180. -P.1263-1272.

91. Ridge JP, Di Rosa F, Matzinger P. A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell. // Nature. 1998. -Vol.393. -P.474-478.

92. Buhlmann JE, Foy TM, Aruffo A, et al. In the absence of a CD40 signal, В cells are tolerogenic. // Immunity. 1995. - Vol.2. — P.645-653.

93. Bennett SRM, Carbone FR, Karamalis F, et al. Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signalling. // Nature. 1998. - Vol.393 -P.478-480.

94. Kiener PA, Moran-Davis P, Rankin BM, et al. Stimulation of CD40 with purified soluble gp39 induces proinflammatory responses in human monocytes.//J. Immunol. 1995.-Vol.155. - P.4917-4295.

95. Ballantyne J, Henry D.L, Muller J.R, et al. Efficient recombination of a switch substrate retro vector in CD40-activated В lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. // J. Immunol. 1998. - Vol.161. -P.1336-1347.

96. Wang Y, Kelly C.G, Karttunen J.T, et al. 2001. CD40 is a cellular receptor mediating mycobacterial heat shock protein 70 stimulation of CC-chemokines. // Immunity. Vol.15. -P.971-983.

97. Becker T, Hartl F.U, Wieland F. CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes. // J. Cell Biol. 2002. -Vol.158.-P.1277-85.

98. Delneste Y, Magistrelli G, Gauchat J, et al. Involvement of Lox-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation. // Immunity. 2002. - Vol.17. - P.353-62.

99. Binder R.J, Han D.K, Srivastava P.K. CD91: a receptor for heat-shock protein gp96. // Nat. Immunol. 2000. - Vol. 1. - P.l51-155.

100. Basu S, Binder R.J, Ramalingam T, Srivastava P.K. CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. // Immunity. 2001. - Vol.14. - P.303-313.

101. Robert J, Ramanayake T, Maniero G.D, et al. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. // J. Immunol. -2008. Vol. 180(5). -P.3176-82.

102. Chen M, Masaki T, Sawamura T. LOX-1, the receptor for oxidized low-density lipoprotein identified from endothelial cells: implications in endothelial dysfunction and atherosclerosis. // Pharmacol. Ther. 2002. — Vol.95(l). - P.89-100.

103. Shimaoka T, Kume N, Minami M, et al. LOX-1 supports adhesion of Gram-positive and Gram-negative bacteria. // J. Immunol. 2001. - Vol. 166(8). — P.5108-14.

104. Kume N, Murase T, Moriwaki H, et al. Inducible expression of lectin-like oxidized LDL receptor-1 in vascular endothelial cells. // Circ. Res. 1998. -Vol.83(3). -P.322-7.

105. Murase T, Kume N, Korenaga R, et al. Fluid shear stress transcriptionally induces lectin-like oxidized LDL receptor-1 in vascular endothelial cells. // Circ Res. 1998. - Vol.83(3). - P.328-33.

106. Li D, Liu L, Chen H, et al. LOX-1, an oxidized LDL endothelial receptor, induces CD40/CD40L signaling in human coronary artery endothelial cells. //Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2003. -Vol.23(5). -P.816-21.

107. Arnold D, Faath S, Rammensee H, Schild H. Cross-priming of minor histocompatibility antigen-specific cytotoxicT cellsupon immunization with the heat shock protein gp96. // J. Exp. Med. 1995. - Vol.182. - P.885-889.

108. Roman E, Moreno C. Synthetic peptides non-cova-lently bound to bacterial hsp 70 elicit peptide-specific T-cell re-sponses in vivo. // Immunology. -1996. Vol.88 - P.487-492.

109. Roman E, Moreno C. Delayed-type hypersensitivity elicited by synthetic peptides complexed with Mycobacterium tuberculosis hsp 70. // Immunology. 1997. - Vol.90. - P.52-56.

110. Blachere N.E, Udono H, Janetzki S, et al. Heat shock protein vaccines against cancer. // J. Immunother. 1993. — Vol.14. - P.352-356.

111. Banchereau J, Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. //Nature. 1998. - Vol.392. - P.245-252.

112. Banchereau J, Briere F, Caux C, et al. Immunobiology of dendritic cells. // Annu. Rev. Immunol. 2000. - Vol. 18. - P.767-811.

113. Sallusto F, Schaerli P, Loetscher P, et al. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. // Eur. J. Immunol. 1998. - Vol.28. - P.2760-2769.

114. Gunn M.D, Tangemann K, Tam C, et al. A chemokine expressed in lymphoid high endothelial venules promotes the adhesion and chemotaxis of naive T lymphocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol.95. - P.258-263.

115. Dieu M.C, Vanbervliet В, Vicari A, et al. Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed in different anatomic sites. // J. Exp. Med. 1998. - Vol.188. - P.373-386.

116. Chaux P, Moutet M, Faivre J, et al. Inflammatory cells infiltrating human colorectal carcinomas express HLA class II but not В7-1 and В7-2 costimulatory molecules of the T-cell activation. // Lab. Invest. — 1996. — Vol.74. — P.975-983.

117. Marincola F.M., Jaffee E.M., Hicklin D.J. et al. Escape of human solid tumors from T-cell recognition: molecular mechanisms and functional significance // Adv. Immunol. 2000. - Vol. 74. - P. 181 -273.

118. Banchereau J, Schuler-Thurner B, Palucka A.K, Schuler G. Dendritic cells as vectors for therapy. // Cell. 2001. - Vol.106. - P.271-274.

119. Nestle F.O, Alijagic S, Gilliet M, et al. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. // Nat. Med. 1998. -Vol.4. -P.328-332.

120. Mackensen A, Herbst B, Chen J.L., et al. Phase I study in melanoma patients of a vaccine with peptide-pulsed dendritic cells generated in vitro from CD34(+) hematopoietic progenitor cells. // Int. J. Cancer 2000. - Vol.86. -P.385-392.

121. Murphy G.P., Elgamal A.A., Troychak M.J., Kenny G.M. Follow-up ProstaScint scans verify detection of occult soft-tissue recurrence after failure of primary prostate cancer therapy. // Prostate. 2000. — Vol.42. — P.315-317.

122. Brossart P., Wirths S., Stuhler G., et al. Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells. // Blood 2000. - Vol.96. - P.3102-3108.

123. Yu J.S., Wheeler C.J., Zeltzer P.M., et al. Vaccination of malignant glioma patients with peptide-pulsed dendritic cells elicits systemic cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration. // Cancer Res. 2001. - Vol.61. - P.842-847.

124. Hsu F.J., Benike C., Fagnoni F., et al. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. // Nat. Med. -1996,-Vol.2.-P.52-58.

125. Reichardt V.L., Okada C.Y., Liso A., et al. Idiotype vaccination using dendritic cells after autologous peripheral blood stem cell transplantation for multiple myeloma a feasibility study. // Blood. - 1999. - Vol.93. - P.2411-2419.

126. Gao B, Tsan MF. Recombinant human heat shock protein 60 does not induce the release of tumor necrosis factor a from murine macrophages. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol.278. - P.22523-22529.

127. Dhodapkar M.V., Steinman R.M., Krasovsky J., et al. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. // J. Exp. Med. 2001. - Vol.193. - P.233-238.

128. Multhoff G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70. //Int. J. Hyperthermia. -2002. Vol. 18(6). -P.576-85.

129. Батчикова Н.Б., Кулагина M.A., Луценко C.B. и др. Экспрессия синтетического гена интерлейкина-4 человека в клетках Е. coli. Получение- P.766-776.

130. Гукасова H.B., Москалёва Е.Ю., Родина А.В. и др. Характеристика дендритных клеток человека, полученных с использованием стандартного и "ускоренного" методов культивирования. //Молекул. Медицина 2004. - Vol.2. - Р.38-44.