Использование малеиновой кислоты культурой Alcaligenes xylosoxidans 260 и пути повышения эффективности этого процесса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Сафронова, Ирина Юрьевна

• Сафронова, Ирина Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сафронова, Ирина Юрьевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Синтетические органические соединения, как один из видов химического загрязнения и их классификация

ГЛАВА 2, Использование микроорганизмами синтетических

органических соединений

2.1. Трансформация, как один из путей использования микроорганизмами синтетических органических соединений

2.2. Особенности роста микроорганизмов на синтетических органических соединениях

2.3. Генетический контроль процессов деструкции ксенобиотиков

2.3.1. Плазмиды деградации

2.4. Влияние процесса диссоциации бактерий на активность штаммов-деструкторов

ГЛАВА 3. Использование малеиноЕОЙ кислоты микроорганизмами

3.1. Малеиновый ангидрид и малеиновая кислота, как компоненты сточных вод.______

3.2. Бактерии-деструкторы малеиновой кислоты

3.3. Основные пути метаболизма малеиновой кислоты

ГЛАВА 4. Биотехнология очистки сточных вод

4.1. Принципиальная схема очистки сточных вод

4.2. Биологическая основа очистки сточных вод

4.2.1. Активный ил

4.2.2. Применение ассоциаций микроорганизмов для интенсификации биоочистки сточных вод

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. Объекты и методы исследований

5.1. Объекты исследований

5.2. Условия хранения

5.3. Среды и условия культивирования

5.4. Методы исследований

5.4.1. Идентификация исследуемой бактерии

5.4.2. Поиск плазмид деградации малеата у A.xylosoxidans

5.4.3. Выяснение пути использования малеиновой кислоты у

A. xylosoxidans

5.4.4. Исследование природы капсул A.xylosoxidans и

B.subtili s

5.4.5. Иммобилизация клеток A.xylosoxidans,

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА 6. Идентификация исследуемой бактерии

ГЛАВА 7. Поиск плазмид деградации малеата у A.xylosoxidans

или деградация?

8.1. Рост A.xylosoxidans на среде с различными концентрациями малеата в качестве единственного источника углерода

8.2. Особенности роста A.xylosoxidans на среде с двумя источниками углерода

ГЛАВА 9. Биохимический путь трансформации малеиновой кислоты

A.xylosoxidans

ГЛАВА 10. Трансформация малеиновой кислоты диссоциантами

A.xylosoxidans

ГЛАВА 11. Использование малеиновой кислоты смешанной

культурой микроорганизмов

11.1. Трансформация малеиновой кислоты

ассоциацией бактерий в периодической культуре

11.2. Трансформация малеиновой кислоты ассоциацией бактерий в непрерывной культуре

11.3. Физическая организация ассоциации бактерий,

активно использующей малеиновую кислоту

11.3.1. Исследование природы капсул A.xylosoxidans____

11.3.2. Исследование межклеточного матрикса В.subtilis

иммобилизованными клетками A.xylosoxidans

12.1. Трансформация малеата иммобилизованными клетками диссоциантов A.xylosoxidans в периодическом

режиме

12.2. Трансформация малеата иммобилизованными клетками A.xylosoxidans в непрерывном режиме

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование малеиновой кислоты культурой Alcaligenes xylosoxidans 260 и пути повышения эффективности этого процесса»

Введение.

В последнее время в окружающую нас среду в результате антропогенного влияния в больших количествах поступают стойкие, часто токсические синтетические соединения, накопление которых создает реальную опасность для биосферы. Наиболее перспективными, а е ряде случаев единственно возможными, методами восстановления окружающей среды являются микробиологические методы- Существуют микроорганизмы, способные использовать высокие концентрации синтетических аналогов природных соединений. Всестороннее изучение физиологии таких микроорганизмов, причин и механизмов использования ими ксенобиотиков чрезвычайно актуально и имеет общенаучное и прикладное значение.

К числу токсических органических соединений, попадающих в окружающую среду, относится и малеиновая кислота - неприродный транс-изомер фумаровой кислоты. Ее получают химическим путем для использования в производстве винной и яблочной кислот, полимерных материалов, алкидных смол, детергентов. В то же время, малеиновая кислота является побочным продуктом ряда производств. При попадании этого вещества в сточные воды без очистки, его концентрация в водоемах иногда существенно превышает предельно допустимую (60,0 мг/л).

По имеющимся в литературе сведениям способностью использовать малеиновую кислоту в качестве источника углерода и энергии обладают, в основном, некоторые виды родов Alcaligenes и Pseudomonas. Причем, эти микроорганизмы растут на средах, содержащих не более 5,0 г/л малеиновой кислоты (Скрябин, Головлева, 1976; Стейниер и др., 1979; Киприанова, 1984; Bergey's Manual..., 1984; Kimura et al., 1986). Сотрудникам кафедры

микробиологии МГУ удалось выделить штамм N 260, который был способен расти на среде с малеиновой кислотой в концентрации достигающей 25,0 г/л (Аркадьева и др., 1991).

В связи с этим, целью настоящей работы явилось исследование физиолого-биохимических особенностей штамма 260, определяющих способность этого организма использовать высокие концентрации малеиновой кислоты, его идентификация и подбор оптимальных условий утилизации малеата.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1) идентифицировать исследуемый микроорганизм;

2) выяснить направление утилизации высоких концентраций малеиновой кислоты - деградация или трансформация;

3) выяснить путь утилизации малеата, то есть последовательность биохимических реакций и ключевые ферменты;

4) изучить влияние гетерогенности популяции штамма-деструктора на утилизацию малеиновой кислоты;

5) исследовать использование малеиновой кислоты смешанной культурой микроорганизмов;

6) подобрать наиболее оптимальный режим утилизации малеиновой кислоты штаммом 260.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Синтетические органические соединения, как один из видов химического загрязнения, и их классификация.

В настоящее время важную, если не первостепенную, роль в загрязнении окружающей среды играют синтетические органические соединения - вещества, несвойственные органическому миру и ранее (до развития органического синтеза) в природе не встречавшиеся.

К настоящему времени синтезировано более 6,0х10б неприродных соединений (Еекер и др., 1990). Особенно широкое распространение синтетические органические соединения получили в последние 45-50 лет. Производство синтетических химикалий составляет 2,0х108т/год (многие из них опасны), при том, что общий круговорот органических веществ в биосфере оценивается в 2,0xl01:I т/год, и все эти соединения минерализуются в природе. Мировая торговля включает 6,5х103 наименований; около 150 веществ производятся в массовых количествах (более 50,0х103т/год); уже сейчас в сточных водах встречается более 55 тысяч разнообразных синтетических соединений (Chakrabarty, 1991). Однако, возможности экотоксикологических служб по идентификации и обезвреживанию исчерпываются 1000 соединений, вред остальных неизвестен. Увеличение производства и применения этих веществ приводит к тому, что они становятся важным и весьма неприятным экологическим фактором (Shukla, 1990).

Среди применяемых методов очистки стоков от загрязнения синтетическими токсичными органическими соединениями микробиологическая очистка является наиболее дешевой, самой

доступной и, значит, наиболее перспективной, а на практике нередко единственно возможной (Илялетдинов, 1991).

Все синтетические органические соединения, загрязняющие окружающую среду, можно условно разбить на следующие основные группы: 1) неподвергающиеся превращениям под действием микроорганизмов (стойкие синтетические соединения); 2) подвергающиеся частичным превращениям в условиях трансформации или кометаболизма, но не являющиеся источником питания; 3) подвергающиеся неполным превращениям и частично утилизирующиеся; 4) полностью утилизирующиеся микроорганизмами в качестве единственного или основного источника питания (Карасевич, 1982). Позднее, данную классификацию значительно сузили: устойчивые синтетические органические соединения, средней устойчивости и неустойчивые в природных условиях (GalИ, 1990).

Рациональное использование микроорганизмов для разрушения синтетических органических веществ возможно только на основе установления общих закономерностей биодеструкции (Гвоздяк, 1973).

Все синтезированные человеком органические вещества имеют аналоги среди природных, и необычность их строения состоит в своеобразном размещении атомов в молекуле, а отнюдь не в наличии каких-то новых, неизвестных природе типов связи между ними. Исходя из этого, при рассмотрении микробной деструкции синтетических органических соединений ученые придерживаются традиционного для классической микробиологии деления веществ в соответствии с их химическим строением, с учетом того, какая часть молекулы вовлекается в биохимическую реакцию и источником какого элемента является это вещество. Такой подход позволяет объеденить все синтетические органические вещества в несколько

групп: источники углерода; соединения азота; серу-, фосфор- и галоген содержащие вещества; элементорганические соединения (Ротмистров и др., 1975).

Несомненное преимущество представленной выше химической классификации синтетических загрязнителей заключается еще и в том, что она позволяет рассматривать микробное разрушение целых групп веществ в соответствии с их строением, что дает возможность после накопления и систематизации экспериментальных фактов вывести определенные закономерности процесса минерализации самых разнообразных веществ, предвидеть пути их деструкции, предсказать с большой степенью вероятности наиболее подходящие таксономические группы микроорганизмов, способные быстро и эффективно их разрушать, то есть наметить действительно научный, а не чисто эмпирический, подход к решению сложной проблемы микробной очистки воды от синтетических веществ (Котляревский, 1990).

Глава 2. Использование микроорганизмами синтетических органических соединений.

Существует мнение, что есть определенная зависимость качественного состава сообщества микроорганизмов от состава субстрата и условий культивирования. В условиях аэротенков сообщество представлено грамотрицательными палочковидными бактериями, среди которых преобладают псевдомонады, в биофильтрах - это бактерии и грибы, в метантенках - анаэробные гетеротрофные и метановые бактерии. Такая зависимость тем более должна проявляться при очистке промышленных сточных вод, содержащих

специфические, зачастую токсичные для большинства микроорганизмов вещества (Ротмистров и др., 1975).

Однако, бактериологический анализ зарастания поверхности мембран обратного осмоса, используемых в современных процессах очистки сточных вод, показал, что в биопленке преобладали культуры Acinetobacter и Flavobacterium, а с внутренней стороны фильтрующей поверхности мембран - Acinetobacter, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus и Lactobacillus (Ridgway et. al., 1983). С применением стандартных и новых селективных сред проведен анализ популяций бактерий на трех биологических установках по очистке сточных вод химических производств. Анализы показали, что во всех установках качественный состав сообществ микроорганизмов был постоянен и состоял из следующих групп: Alcaligenes, Pseudomonas, Zoogloea (Hamer, 1985). Известно, что метаболическая активность псевдомонад в отношении ксенобиотиков вообще исключительно велика и они, как правило, составляют основу всех сообществ, осуществляющих деградацию этих соединений (Головлева, 1985; Рубан, 1986).

Таким образом, большинство бактерий, выделенных из активного ила, очищающего бытовые и промышленные стоки, это грамотрицательные палочки, среди которых доминирующими родами являются A leal i genes и Pseudomonas. Спектр ксенобиотиков, утилизируемых бактериями, принадлежащими к роду Alcaligenes, весьма широк (Ротмистров и др., 1978; Engesser et al., 1980; Taylor et al., 1981; Тарнопольская и др., 1986; Зайцев, 1988; Steffan et al., 1989; Burt et al., 1990; Таранова и др., 1991; Селифонов и др., 1993; Davison et al., 1994; Herman et al., 1994; Tett et al., 1994).

Для того, чтобы утилизировать синтетические органические соединения, микроорганизмы должны либо поглощать и усваивать их в качестве источника питания, либо вызывать ферментативную деструкцию, используя химическую энергию, освобождающуюся при упрощении строения органического соединения (Ротмистров и др., 1975). Таким образом, существует два основных направления микробиологической утилизации соединений: 1) полная деградация; 2) трансформация (НащгЫот, 1990).

2.1. Танс^ормгциг, как один ш путей использования

твдроорганигмами синтетические органических соединений.

Микробиологической трансформацией называется неполное превращение органических соединений ферментами микроорганизмов, сопровождающееся накоплением в среде продуктов этого превращения (Скрябин, Головлева, 1984).

Для большей части процессов микробиологической трансформации характерна незначительная перестройка молекулы субстрата, осуществляемая одним или несколькими ферментами. Она проявляется как в образовании соединений, которые далее не используются микроорганизмом (Скрябин, Головлева и др., 1972), так и во временном накоплении промежуточных продуктов в процессе использования различных органических соединений в качестве ростовых субстратов (Ьоскигоос!, 1954). Выделяют пять основных типов процессов микробиологической трансформации:

1) накопление продуктов действия отдельных ферментов или фрагментов метаболической системы нормально функционирующей микробной клетки, происходящее в связи со специфическими

особенностями регуляции ее обмена;

2) накопление продуктов превращения ферментами микробной клетки структурных аналогов их естественных субстратов;

3) накопление частично превращенного субстрата в результате действия специфических трансформирующих ферментных систем (модификация);

4) накопление продуктов действия отдельных ферментов или фрагментов метаболической системы микробной клетки как результат экспериментального нарушения ее нормального метаболизма;

5) превращения органических веществ ферментными препаратами микробного происхождения.

Классификация процессов микробиологической трансформации строится по типу возникновения и элиминирования функциональных групп: окисление, восстановление, декарбоксилирование, дезаминирование, образование гликозидов, гидролиз, метилирование, этерификация, дегидратация, диспропорционирование, конденсация, аминирование, ацетилирование, амидирование, деметоксилирование, нуклеотизация, галогенирование, деметилирование, аосиметризация, рацемизация, изомеризация (Скрябин, Головлева, 1976; Shoemer, Martin, 1980; Malik, 1982; Kieslich, 1984).

В настоящее время существуют следующие методы микробиологической трансформации органических соединений:

I. Использование ферментативных свойств интактных клеток:

1) трансформация растущей культурой в периодических условиях;

2) использование ферментативной активности определенных фаз развития: а) трансформация суспензиями неразмножающихся клеток;

б) транформация опорами; в) непрерывные процессы;

3) кометаболизм.

II. Методы, основанные на дезорганизации обменных процессов клетки:

1) применение в различной степени поврежденных и дезинтегрированных клеток;

2) ингибирование определенных участков метаболических путей;

3) применение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов.

III. Конструирование штаммов с повышенной способностью к трансформации органических соединений.

IV. Использование ферментных препаратов, иммобилизованных ферментов и клеток ( Fukui, Tanaka, 1980; Кощеенко, 1981).

V. Политрансформация.

Методы микробиологической трансформации имеют ряд преимуществ перед химическими реакциями. Энергия активации химических реакций значительно снижена фермент-субстратным взаимодействием. Таким образом, ферменты проявляют высокую каталитическую активность даже в мягких реакционных условиях, при температуре меньше 40°С, нормальном давлении и pH. Кроме того, реакции микробиологической трансформации характеризуются высокой реакционной, стерео- и региоспецифичностью, то есть микроорганизмы позволяют проводить реакции, трудно осуществляемые с помощью химических методов, с выходом химически чистого, а часто и оптически активного конечного продукта (Иерусалимский, 1965). Однако, существуют и недостатки у процессов микробиологической трансформации. Это большие затраты на проведение реакций и выделение продукта. В большинстве случаев время реакции велико, концентрация субстрата / продукта низка и стабильность биокатализаторов ограничена (Haggblom, 1990;

Leuenberger, 1990).

Современная методология микробиологической трансформации позволяет использовать для осуществления того или иного химического превращения в принципе любой микроорганизм, имеющий соответствующие ферменты, и далеко не всегда можно заранее указать узкую таксономическую группу, в которой следует искать активные организмы осуществляющие определенный трансформационный процесс. Существуют, однако, некоторые таксоны - роды и даже виды, известные своей способностью проводить разнообразные превращения органических веществ с накоплением продуктов трансформации. Очень часто упоминаются в литературе проводящие различные трансформации представители родов Acetobacter, Acetomorias, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium,, Pseudomonas (Скрябин, Головлева, 1984).

Трансформирующая активность зтих ... групп, очевидно, объясняется особенностями регуляции ферментативных систем. Специфика заключается в том, что способность осуществлять какое-либо трансформационное превращение зависит не только от наличия соответствующего фермента, но и от его субстратной специфичности, а также специфичности следующих ферментов данной метаболической последовательности, что может быть причиной накопления частично превращенного субстрата. Например, первый один или два фермента обладают весьма широкой субстратной специфичностью и могут катализировать превращения структурных аналогов субстрата, а следующий фермент более специфичен и не способен атаковать модифицированный субстрат. В результате частично трансформированное соединение накапливается в среде. В других случаях причиной накопления интермедиата может быть

спонтанная мутация, блокирующая синтез одного из ферментов метаболической последовательности, или синтез витамина, являющегося кофактором какого-либо фермента, или, наконец, просто влияние нефизиологических концентраций исходного продукта (Скрябин, Головлева, 1975).

В наибольшей степени способность трансформировать субстрат и накапливать продукты этого превращения выражена у многих микроорганизмов в отношении веществ, не вполне обычных для живой клетки, ксенобиотиков. Это обусловлено тем, что большая часть микробиологических трансформаций относится к сфере периферийного или подготовительного метаболизма. Ферменты, участвующие в процессах периферийного обмена, имеют ряд специфических особенностей. В частности, именно для этих процессов характерно накопление в среде иктермедиатов, широкая субстратная специфичность ферментов и разного рода побочные реакции как результат полифункциональности.

Очевидно, нельзя говорить об общем биологическом смысле всех процессов микробиологической трансформации, так как он может быть различным в зависимости от вида микроорганизма и используемого субстрата. До последнего времени была популярна точка зрения на трансформацию органических соединений как реакции их детоксикации. Скрябин и Головлева (1976) считают, что большая часть реакций трансформации является этапами использования органических соединений в качестве источников углерода и энергии или стадиями синтеза вторичных метаболитов. С другой стороны, можно говорить о приспособительном значении реакций микробиологической трансформации. Трансформация имеет большое значение для микроорганизмов в отношении активного освоения ими

среды обитания, что создает определенные преимущества для данного вида.

2.2. Особенности роста микроорганизмов на синтетических органических соединениях.

Многие синтетические органические соединения оказывают токсическое действие на микроорганизмы. Характер действия любого токсического соединения зависит от его концентрации. Токсический эффект, как правило, проявляется при относительно низких концентрациях синтетических органических соединений в среде, поэтому основным является вопрос о реакции микроорганизмов на определенную концентрацию субстрата-яда в среде.

Рост микроорганизмов в средах, содержащих субстраты-яды, в общем подчиняется таким же закономерностям, как и рост на нетоксических субстратах (Перт, 1978). Однако при этом наблюдаются отклонения, имеющие принципиальное значение. Эти отклонения выражены тем четче, чем токсичнее субстрат (Карасевич, 1982).

Известно, что при наличии в среде токсического соединеия наблюдается либо торможение роста, либо гибель культуры. При торможении роста либо возрастает время генерации, но рост остается экспоненциальным, либо культура переходит к линейному росту, либо рост полностью тормозится. Если культура перешла к линейному росту, сохранить ее при пересевах обычно не удается.

Имеются три типа реакции микроорганизмов на изменение концентрации любого субстрата: 1) в определенном диапазоне

м

концентрации скорость роста прямо пропорциональна концентрации;

2) б определенном диапазоне скорость роста не зависит от концентрации; 3) в определенном диапазоне скорость роста обратно пропорциональна концентрации.

Своеобразие субстратов-ядов в том, что их ингибирующее действие в большинстве случаев начинает проявляться задолго до того, как будет достигнута максимальная скорость роста в результате возрастания концентрации субстрата в среде. Микроорганизм находится под влиянием двух противоположно действующих факторов: концентрация субстрата недостаточно высока, чтобы была достигнута максимальная скорость роста, но, в то же время, она уже достаточна, чтобы проявилось ингибирующее действие на микроорганизм. Поэтому физиологическая реакция микроорганизма характеризуется рядом особенностей:

1) Максимальная скорость роста на субстрата/;-ядах может быть значительно ниже, чем наблюдаемая при росте этого же микроорганизма на нетоксических субстратах;

2) Кривые роста характеризуются отсутствием плато, когда скорость роста не зависит от концентрации. Вместо этого наблюдается пик максимально возможной скорости роста. Концентрация субстрата-яда, при которой наблюдается максимальная скорость роста, называется критической (2Крит);

3) скорость роста при возрастании концентрации субстрата-яда до определенного предела возрастает, но медленней, чем в случае нетоксического субстрата.

Устойчивый рост микроорганизмов на субстратах-ядах во многих случаях характеризуется еще двумя особенностями: а) из-за низкой скорости роста время генерации является необычно большим; б) по мере возрастания исходной концентрации субстрата-яда

экономический коэффициент будет снижаться ив-за необходимости "преодолевать" токсический эффект субстрата, то есть будет возрастать энергия поддержания.

Концентрация субстрата-яда оказывает существенное влияние ка характер поведения культуры микроорганизмов в каждой фазе.

При возрастании концентрации субстрата-яда в среде продолжительность лаг-фазы возрастает, а при достижении определенной концентрации становится бесконечной. Другими словами, микроорганизм, хотя и сохраняет жизнеспособность, никогда не переходит к размножению. Эта закономерность проявляется при любых условиях, и особенно четко, если субстрат-яд является единственным источником углерода и энергии в среде. Возрастание лаг-периода в этом случае чаще всего связано только с тем, что субстрат-яд тормозит одну или несколько биосинтетических реакций. Только если торможение определенного процесса будет неполным, возможен переход к следующей фазе роста.

Фаза экспоненциального роста имеет место при росте микроорганизма на субстратах-ядах. При этом она иногда бывает весьма короткой, охватывая две-три генерации, что характерно для субстратов-ядов высокой степени токсичности. Однако, по мере снижения концентрации субстрата-яда в среде во время роста микроорганизма время генерации будет снижаться, пройдя через оптимум, а затем начнет возрастать по мере убывания субстрата.

Вслед за фазой экспоненциального роста в периодической культуре наступают фазы замедления роста, стационарная и отмирания. При росте на субстратах-ядах фаза отмирания наступает быстрее и выражена отчетливей, чем при росте на нетоксических субстратах, причем имеется прямая зависимость между исходной

концентрацией субстрата-яда, скоростью и полнотой отмирания клеток. Этот факт можно объяснить двумя причинами: а) при росте на высоких концентрациях субстрата-яда велика анергия поддержания, и клетки переходят в покоящуюся стадию без достаточного запаса резервных веществ, то есть ослабленными; б) в среде могут накапливаться токсические продукты метаболизма, ускоряющие гибель клеток (Карасевич, 1382).

Как указывалось выше, одним из направлений микробиологической детоксикации субстратов-ядов является трансформация. Изучение корреляции между ростовым и трансформационным процессами служит непременным условием для успешного регулирования и оптимизации трансформации. Существуют три физиологических типа трансформационных процессов, классификация которых основывается на соотношении между ростом клеточного вещества и образованием продуктов (Скрябин, Головлева, 1976).

Трансформации I характеризуются тесной связью между ростом и накоплением продукта, так что второй процесс является непосредственным результатом превращения источника углерода в энергетическом обмене. К процессам этого типа относятся трансформации, представляющие собой накопление промежуточных продуктов катаболизма, например, неассимилируемых фрагментов молекул ростового субстрата, где ростовой субстрат является трансформируемым веществом. Отличительная черта этих трансформаций - совпадение максимумов скоростей ростового и трансформационного процессов. Поэтому воздействия, регулирующие рост, соответственно влияют на накопление продукта трансформации.

Сложнее для изучения и регулирования процессы, где ростовой

и трансформируемый субстраты различны. У трансформаций II типа максимумы скоростей ростового и трансформационного процессов несколько сдвинуты. Типичен случай, когда наибольшая трансформационная активность приходится па фазу замедления роста (следующую за экспоненциальной). Биомасса в это время нарастает линейно.

Трансформация III типа отличается четко выраженной двухфазностью. Трансформационный процесс является в данном случае типичным вторичным процессом, его максимальная удельная скорость соответствует стационарной фазе роста культуры. В некоторых случаях трансформация начинается лишь по окончании роста (Скрябин, Головлева, 1984).

2.3. Генетический контроль процессов деструкции ксенобиотиков.

Генетический контроль процессов деструкции синтетических органических соединений у микроорганизмов осуществляется хромосомными структурными генами или структурными генами, которые несут плазмиды биодеградации (Селифонов, СтароЕойтов, 1988).

2.3.1. Плавмиды деградации.

Ричмонд (Richmond, Clarke, 1975), говоря о генетическом аппарате бактериальной клетки, выделяет главный репликон хромосому, содержащую генетический материал необходимый для выживания клетки в любых условиях окружающей среды (репликация хромосомы, контроль клеточного деления, энергетического

- so -

метаболизма и так далее), и добавочные репликоны - плазмиды, которые могут содержать гены, имеющие тенденцию отражать особенности окружающей среды, в которой клетки находятся в данный период времени (например, гены резистенции к антибиотикам, катаболизма органических соединений и так далее).

Вопрос о распространенности и функциях плазмид у прокариот был предметом специального обсуждения в ряде обзоров (Novíck, 1974; Воронин, 1983). Здесь уместно лишь отметить, что около 50% энтеробактерий, псевдомонад и более 10% бацилл содержат в своих клетках внехромосомные элементы (Смирнов, 1984).

В клетке может содержаться несколько десятков копий мелких плазмид размером от 1,5 мегадальтон, что повышает вероятность их переноса, тогда как число копий крупных плазмид (как правило, с молекулярной массой более 20 мегадальтон) составляет обычно 1-2 на хромосому (Хесин, 1985).

В начале 70-х годов было предложено называть плазмиды, контролирующие деградацию многих органических соединений (в том числе синтетических), d-плазмидами ("degradation") или плазмидами деградации (Воронин, 1983).

D-плазмида может контролировать либо только первые этапы деградации органических соединений, как плазмида, контролирующая окисление алифатических углеводородов до альдегидов (Sahasrabudhe, 1987; Беляков и др., 1990; Агапова и др., 1992; Tan, 1992; Tani et al., 1992), либо полное их разложение. К плазмидам второго типа относятся большинство плазмид деградации нафталина и толуола (Yen, Gunsalus, 1985; Головлева и др., 1987).

2.4. Влияние процесса диссоциации бактерий на активность штаммов-деструкторов.

Диссоциация - атс расщепление одной популяции бактерий на варианты, различающиеся стойкими изменениями ряда свойств: г енетических, физиологе- биохимических, морфологических, культурзльных. В процессе диссоциации изменения происходят с высокой частотой порядка 10~2-10~4 на одно клеточное деление, что на несколько порядков превышает частоту случайных мутаций, при зтом изменения носят постоянный и обратимый характер.

Процесс расщепления популяции на варианты широко распространен и наблюдается у большинства грамположителькых и грамотрицательных бактерий.

В зависимости от морфологии колоний различают следующие основные диссоцианты бактерий: R (rough) тлеет шероховатый тип колоний, S (smooth) - гладкий, М (mucoid) - слизистый, причем, возможен взаимный переход вариантов, например: М == S == R. Иногда используют и другие обозначения диссоциантов: I, Т, Р, С, О, g и другие (Милько, Егоров, 1991).

Диссоциация складывается из двух процессов: возникновения диссоциантов в результате из2у!енений генетических свойств клетки и селекции возникших вариантов под действием внешних факторов (Dubos, 1976; Panopoulos, Peet, 19S5; Беляков и др., 1985).

Причиной возникновения диссоциантов, помимо случайных мутаций, может быть перенос генетического материала (конъюгация, трансформация, транедукция). Однако, в настоящее время ведущую роль в диссоциативных переходах отводят мигрирующим генетическим элементам (Хесин, 1985). Так, взаимные переходы R, S и

М-вариантов Rhodococcus rubropertinctus обусловлены перестройкой генетического материала клетки, в которой принимает участие ДНК умеренного фага, выделенного из данного штамма родококка, и плазмида (Милько, Егоров, 1991). Различия в ДНК трех диссоциантов Bacillus subtilis установлены при использовании в качестве меченного зонда ДНК бактериофага ¡i 13 (Иванов и др., 1S90).

Первичные фенотипичеокие изменения у диссоциантов происходят в компонентах клеточных оболочек (в размере и химическом строении капсулы, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны), что определяет их физиологе-биохимические и морфологические особенности: а) тип деления клеток и характер их расхождения после деления, морфологию колоний; б) различия в скорости роста, устойчивости к внешнему воздействию, способности к синтезу и трансформации биологически активных веществ и деструкции ксенобиотиков (Милько, 1390). Так, дегидрирование кортизона и дигидрокортизона более интенсивно осуществлял S-диссоциант Mycobacterium globiforme 193, чем R- (Звягинцев, Скрябин, 1955; Кощеенко и др., 1976; Hill et al., 1982). Из 12 штаммов 5 видов сапротрофных микобактерий разрушали ситостерин наиболее быстро М-диссоцианты, наименее R-, а трансформировали ситостерин наиболее интенсивно клетки S-варианта по сравнению о R- и М-клетками (Милько и др., 1982). S-диссоцианты бактерий рода Pseudomonas ~ P.putida, P.desmolytica, P.rathonis - не разрушали алкилсульфаты и устойчивы к ним, a R-диссоцианты активно разрушали ПАВ и более чувствительны к их воздействию (Кривец и др., 1992). Установлено, что на загрязненных тяжелыми металлами почвах состав популяции Bacillus megaterium резко изменяется в сторону увеличения количества R-формы (Скворцова, 1997).

Биолог ическик смысл процесса расщепления популяции на варианты заключается в увеличение гетерогенности популяции бактерий, что расширяет границы выживаемости вида. Так, например, изменение у диссоциантов бактерий способности к синтезу биологически активных Ееществ (их количества и качественного состава) может расширить возможности вида в использовании новых субстратов.

Однако, диссоциация нежелателена в микробиологических производствах и в исследовательской работе, так как генетическая нестабильность используемых штаммов - одна из главных причин снижения продуктивности биотехкологических процессов. Важно также выяснение и создание условий, при которых селективные преимущества будет иметь высокоактивный диоооциант (Егоров, Самуилов, 1985). Данная проблема в настоящее время вызывает огромный интерес общих и промышленных микробиологов.

Глава 3. Использование малеиноЕой кислоты шжроорганшмаш.

Одним, из представителей многочисленных синтетических органических соединений, попадающих в воду в качестве побочных продуктов производства или отходов промышленности, являются малеиновый ангидрид и малеиновая кислота.

3.1. Малеиновый ангидрид и ыалгиновая кислота, как компоненты сточных год.

Основными компонентами сточных вод ряда производств таких, как производство винной, фумаровой и яблочной кислот, полимерных

О А

материалов, ненасыщенных полиэфирных и алкидных смол, детергентов, присадок к смазочным маслам, ПАВ, пестицидов и так далее, являются малеиновый ангидрид и малеиновая кислота.

Малеиновый ангидрид - ангидрид цис-бутендикиолоты, 2,5-фурандион. Это чрезвычайно реакционноспособное соединение. О Хорошо растворяется в воде с образованием

II малеиновой кислоты: из 1,0 мг малеинового

НС — С \ ангидрида образуется 1,18 мг малеиновой кислоты II 0 (Досонидр., 1331).

НС — С х Малеиновый ангидрид применяется в

II производстве ненасыщенных полиэфирных смол,

0 пестицидов, присадок к смазочным маслам, ПАВ

(Бекер и др., 1330). Малеиновый ангидрид также используется для получения фумаровой кислоты. Кроме того, малеиновый ангидрид является побочным продуктом при производстве нафталина, красителей, при очистке ароматических углеводородов от серосодержащих веществ (Краткая химическая энциклопедия, 1357; Беспамятов, Кротов, 1985).

Из литературы известно, что незначительные концентрации малеинового ангидрида (1,0-2,0 мг/л) придают воде неприятный запах и привкус. Наблюдали возможность токсичного влияния малеинового ангидрида на организм теплокровных животных: при длительном поступлении малеинового ангидрида в дозах 2,5-5,0 мг/кг веса у животных отмечено нарушение глзжогенообразующей функции печени и фагоцитарной активности лейкоцитов. Доза 0,5 мг/кг не вызывает нарушений в состоянии животных. Эта доза соответствует концентрации вещества в воде примерно 10,0 мг/л. Было также установлено, что малеиновый ангидрид в концентрации

0,1-1,0 мг/л не оказывает существенного влияния на процессы биохимического потребления кислорода. Таким образом, предельно допустимая концентрация малеинового ангидрида в водоеме соответствует 1,0 мг/л, а максимальная концентрация, не влияющая на процесс биохимического окисления в очистных сооружениях - 10,0 мг/л (Лисовская, Макещенко, 1854).

Малеиновая кислота (цис-зтилек-1,2 дикарбоновая кислота, цис-бутендионовая кислота) является изомером фумаровой кислоты, НС — СООН но, в отличие от последней, не встречается в II природе. Малеиновую кислоту получают химическим

НС — СООН путем из малеинового ангидрида для использования б производстве винной и яблочной кислоты, полимерных материалов, алкидных смол, детергентов и так далее. В то же время, как было указано выше, малеиновая кислота является побочным продуктом анилино-красочной промышленности и вместе с малеиновым ангидридом попадает в сточные воды. Однако, количество малеиновой гшслоты резко колеблется и часто превышает установленную предельно допустимую величину (60,0 мг/л). В таких случаях биологические очистные сооружения заводов работают неудовлетворительно, аэрационная система их не справляется со сверхрегламентными нагрузками по органическим веществам, происходит коррозия труб, и сооружения выходят из строя.

3.2. Бактерии-деструкторы малеиновой кислоты.

В литературе содержится не много сведений об использовании малеиновой кислоты. Однако, известно, что ряд бактерий может использовать малеиновую кислоту в качестве источника углерода и

ЗНбрГИИ. аЭКОИ СПОСОБНОСТЬЮ ОиЛЗДЗЮТ, Е ОСНОВНОМ, НбКОТОрЫе ВИДЫ родов Alcaligen.es и Pseudomonas.

Стейниер о соавторами (1979), исследуя физиолого-биохимические особенности представителей рода Pseudomonas, сообщили о способности P.acidovorans использовать малеиновую 'кислоту (1,0 г/л) б качестве единственного источника углерода и энергии.

По данным Киприаковои (1984) способностью ассимилировать малеиновую кислоту (1,0 г/л) обладали девять из десяти штаммов P.acidovorans, шесть штаммов нового вида P.batumici (выделенных автором из батумских почв) и три неидентифицированных штамма из флюоресцирующей группы рода Pseudomonas.

В девятом издании определителя Берги (Bergey's Manual..., 1984) утилизация малеиновой кислоты является таксономическим признаком для бактерий рода Alcaligenes. Однако, из одинадцати видов, включенных в этот род, на среде с малеиновой кислотой могут расти только три: A.faecalis} А. deni trificans (с двумя подвидами) и A.paradoxus.

Японские авторы (Kimura et al., 1985) отмечают, что способность расти на среде с 5,0 г/л малеиновой кислоты присуща не только некоторым штаммам P.putida, P.fragi, A.faecalis, A.eutrophus, но и Aerobacter cloacae, Arthrobacter globiformis, Brevibacterium ammoniagenes, Serratia mar се see ns.

Итак, как указывалось выше, представители родов Pseudomonas и Alcaligenes являются наиболее часто встречающимися деструкторами ксенобиотиков. Однако, значение бактерий рода Alcaligenes в деградации синтетических органических соединений часто занижено. Это связано со сходством не только их

МбТаиОЛИЗМЗ, НО И МОрфОЛОГИИ С ТЗК0Е0И ПСеВДОМОНЗД, В0Л9Д0ТВИ6 чего многих представителей рода Aîcaîigenes причисляют к роду Pseudomonas (Шлегель, 1987). Единственный признак, некоторому микроорганизм можно отнести к роду Alcaligenes, дегенеративно-перитрихиальный тип жгутикования (Стейнер и др., 1979).

Использование молекулярно- биологических методов гекосистема-тики бактерий позволило внести некоторую ясность в филогенетические взаимоотношения между представителями родов Pseudomonas и Alcaligenes. Род Pseudomonas был распределен по трем крупным ветвям ("суперсемействам"), одну из которых составили виды псевдомонад, принадлежащие ко II и III РНК-группам, вместе с родами Ohromobacterium, Janthinobacterium, Alcaligenes (рис.1, De Srr.edt et al., 1980; De Vos, 1980; De Vos, De Ley, 1983).

Однако, несмотря на очевидное родство с родом Pseudomonas, род Alcaligenes не включен в семейство Pseudomonadaceae. В последнем, девятом издании определителя бактерий Берти отмечается гетерогенность рода Alcaligenes, полигенетический характер зтого таксона и необходимость его ревизии (Sergey's Manual..., 1984).

Недавно был пересмотрен видовой состаЕ рода Alcaligenes, и из 11 видов, описанных в девятом определителе Берги, осталось только шесть (The Prokariotes, 1992). Ряд видов был переведен в другие рода, некоторые - объединены в один вид. Так, А.denitrificans subsp. denitrificans, A. denitrificans subsp. xylosoxidans и A.ruhlandii были опубликовании под названием A.xylosoxidans с двумя подвидами: denitrificans и xylosoxidans (Kiredjian et al., 1986).

ДНК -рРНК

30 р A. denitrifícans subsp. xylosoxydans

<о с:

s

ч; £ с

.¡о

"5 о ф Л

О

о

£ i-

70

60

ли

"A. ruhlandii"

Derxia Chromobacteríum Janthinobacterium

s

■с

I ф

/

i

<0 ф

о (0 с •5 о <о

1

<ч а

<0 с

2 §

€ 3 (0

A.latu

R1 .gelatinosa

</>

ra с

о ^

S *

■8 я

а з-

=з 2

ф ф » о О.

<р о

ф с 3 ® .О) о -з о <ч & ¿i § 5

A. aquamarínus A. aestus A.venustus A. pacificus A. cupidus

Рис.1. Одна из ветвей ("суперсемейство") рода Pseudomonas

(секции II и III), полученных в результате ДНК-рРНК гибридизации (Bergey's Manual..., 1986). 1 - Rhodopseudomonas.

Уровень изучения отдельных видов в биохимическом плане неодинаков. Некоторые из них изучены подробно, большинство же исследовано недостаточно.

3.3. Основные пути метаболизма ыалеиногой гаюлоты.

Как указывалось выше, малеиновая кислота является неприродным цис-изомером бутендионовой кислоты. Следовательно, возможность использования микроорганизмами этого соединения

определяется наличием широко распространенного природного аналога - фумаровой кислоты. Фумаровая кислота является интермедиатом цикла трикарбоновых кислот, чем объясняется принципиальная возможность ее широкого использования микроорганизмами. Таким образом, при попадании фумарата в клетку, микроорганизмы, имеющие ферменты цикла трикарбоновых кислот, должны обладать способностью использовать его в качестве источника углерода и энергии. Тем не менее, очень немногие микроорганизмы способны утилизировать малеиновую кислоту, что объясняется отсутствием специфических ферментов С Классификация и номенклатура ферментов, 1962).

В литературе имеются сведения о существовании двух путей использования малеата микроорганизмами. В одних случаях продуктом утилизации является в других - Б-яблочная кислота. Так, из 170 изученных штаммов (Кшига еЬ а1., 1986) только 15 способны ассимилировать малеат, из них 10 штаммов продуцируют Ь-малат, а 5 штаммов - О-малат. Данный факт объясняется наличием разных путей метаболизма малеиновой кислоты (рис.2).

Фумараза

ЦТК — фумарат ======== Ь-малат === ЦТК

малеатиаомораза I 1(1)

малеаза малеат ======== Б-малат

(II)

Рис.2. Схема путей метаболизма малеиновой кислоты.

Один из них - утилизация малеата через фумарат при помощи ферментов малеатизомеразы (малеинат-цис-транс-изомеразы КФ

5.2.1.1) и фумаразы (фумаратгидратазы или L-малатгидролиазы КФ

4.2.1.2) (Clarke, Ornston, 1375; Kimurs et al., 1986; Еекер и др., 1990). Другой путь - гидратация ыалеиковой кислоты, продуктом которого является D-яблочная кислота. Эта реакция катализируется малеазой (малеатгидратазой КФ 4.2.1.31) (Hopper et al., 1958; V»erf et al., 1992; Toshiaki et al., 1933).

Малеатизомераза принадлежит к группе ферментов, катализирующих реакции цис-транс изомеризации вокруг углерод-углерод двойной связи, в конечных продуктах которых не наблюдается миграции двойной связи. Данный класс цис-транс изомераз нуждается в одной или более сульфгидрильной группе для поддержания ферментативной активности. SH-группа может быть интегральной частью фермента или служить коферментом.

В настоящее время известно небольшое число изомераз классифицировано 120 изомераз и только 5 исследований и имеются в наличии (Faber, 1995). Очевидно, поэтому детали механизма действия этих изомераз до конца не изучены, хотя свойства этих ферментов описаны достаточно полно (The Enzymes, 1972).

Из различных бактериальных источников было выделено в чистом виде три малеатизомеразы: из Pseudomonas sp., P. fluoresceins и Alcaligen.es faecal is IB-14 (Scher, Jakoby, 1963; The Enzymes, 1972). Свойства Есех трех малеатизомераз совпадали, однако, разница заключалась в специфичности ферментов: малеатизомеразы из A. faecal is и Pseudomonas sp. были специфичны по отношению к малеату, фермент из P. fluoresceins - кет. Малеатизомераза выделенная из зтого микроорганизма проявляла активность б отношении большого числа субстратов: малеамид, цис-аконитат, аскорбат, цис-бутен-1,4-диол, цитраконат, кротонат, дизтилмалеат,

транс-зпоксисукцинат, глютаконат, изокротонат, линолеат, малеурат, оксалогликолат, тиглат и ферулах.

Малеаза принадлежит к группе углерод-кислород гидролиаз и осуществляет обратимый катализ реакции транс-гидратации малеата в D-малат. Механизм действия малеазы сходен с механиз2уюм действия фумаратгидратазы, различия заключаются только в конфигурации конечного продукта (Englard et al.} 1957; Hopper et al., 1968; Kimura et al., 1985). Свойства малеазы такие же как у фуыаразы ■■■ широко распространенного и прекрасно изученного ее аналога (The Enzymes, 1971; Авсюк 1991).

Глава 4. Биотехнология очистки стачкык вод.

Способы борьбы с загрязнением окружающей среды делятся на два типа: интенсивные - специально созданные человеком, сконцентрированные в определенных местах; и экстенсивные -распределенные по всей планете, связанные с естественной активностью живых организмов (Печуркин, 1981, 1985). В настоящее время нагрузка на естественные процессы самоочищения биосферы является избыточной, и параллельно с деструкцией загрязнений идет их постепенное накопление в окружающей среде. Причина этого кроется в том, что интенсивные процессы очистки среды пока еще налажены недостаточно.

Наиболее перспективными, а в ряде случаев единственно возможными, методами охраны окружающей среды от загрязнения синтетическими токсичными органическими соединениями являются микробиологические методы (Лукиных, 1994).

4.1. Принципиальная схема очистки сточных вод.

TT? ** i \ » йт *гг» fy Т^Т тл ."■« гтт т«г*»» » -г-- ч-r» т .—;ттгртттг í—i1-рч » рч» ч—. «-t ^r-n r~t гтч «гч»* я m « ^

о uüiiuünuivij Uäix'UiSblö i_/XU4iaóit líu^tü u-ííitl^diuiL/л x) oapuХсамал u

помощью активного ила, на биологических фильтрах с помощью биопленки и в метантенках - путем анаэробного сбраживания, а также на основе самоочищения водоемов (Нас, Kirn, 1S9G). Это наиболее распространенный, надежный биологический метод очистки воды, хотя он и имеет ряд недостатков! требует огромных очистных сооружений, значительных земельных площадей, а в случае очистки промышленных стоков - часто и дополнительного количества воды для разведения сточных вод с целью уменьшения концентрации того или иного токсического вещества в них (Irvine, 1939:, MoCarty, Seinprini, 1993).

Современная очистка сточных вод представляет собой сложный процесс, состоящий из нескольких этапов:

1) Первичная очистка. На этом этапе сточные воды освобождаются от крупного плавучего мусора и песка фильтрованием, от масла и жира, а также от мелкого плавучего мусора и земли процеживанием, после чего поступают в седиментационный тенк. В седиментационном тенке твердые компоненты сточных вод осаждаются, формируя на дне первичный ил, который впоследствии анаэробно перерабатывается в метантенке, а элюент подвергается вторичной очистке (Tortora et al., 1998).

2) Целью вторичной очистки является удаление большей части органических веществ сточных вод. Во вторичной очистке используются, в основном, микробиологические процессы, поэто2уГ/ сточные воды подвергаются мощной аэрации для стимулирования роста аэробных бактерий, которые окисляют растворенные органические

вещества до углекислого газа и воды. Для очистки бытовых сточных вод пользуются различными методами, однако наиболее известными являются тонкоструйная фильтрация и система активного ила (шлама)

Г! Агг, ЛППП, — -4. „т <)ППО\

^¿ш, хи! ии± а ей сьх. , юии/ .

Тонкоструйный фильтр представляет собой большой тенк или бассейн, заполненный раздробленными камнями, гравием, шлаком или другим пористым материалом. Сточные воды разбрызгиваются в виде водной пыли на камни и медленно тонкими струйками просачиваются на дно тенка. Во время этого процесса, сточные воды метаболизируются адсорбированной на ¡камнях микробной биопленкои до газов и неорганических продуктов. 'Эффективность работы тонкоструйного фильта 30-85%.

Система активного ила также предполагает использование сообществ аэробных микроорганизмов, однако, подробно об этом будет сообщаться ниже. Здесь уместно отметить, что активный ид работает в условиях, сходных с условиями хемостата, так как добавление сточных вод в аэротенк происходит при постоянном оттоке смеси активного ила с обработанной водой в отстойник. В отстойнике флоки активного ила оседают, удаляя практически все органические вещества. Эффективность работы системы активного ила 75-'30%. Часть осевшего в отстойнике активного ила возвращается в аэротенк в качестве инокулята непрерывного процесса, а остатки (вторичный ил) претерпевают дальнейшую переработку в метантенке или утилизируется путем захоронения или сжигания.

3) Как указывалось выше, первичный и вторичный ил разрушаются в метантенках путем анаэробного микробиологического сбраживания. После предварительной обработки в метантенках осадки обогащаются анаэробными метансгенами и сливаются на иловые

площадки, представляющие собой чеки площадью 1-2 га и глубиной несколько метров. Метановое брожение в них происходит при пониженной температуре и продолжается десятилетиями. По мере подсыхания осадки частично вывозят на объекты захоронения твердых бытовых отходов (Ножевникова, 1995).

4) Очищенные сточные воды дезинфицирутся, в основном, путем хлорирования, и сбрасываются в проточные водоемы (Tortora et al., 1998).

4.2. Биологическая основа очистки сточных вод.

Биохимическая очистка сточных вод базируется либо на использовании широкого круга водных микроорганизмов, которые входят в состав разнообразных естественных ценозоЕ - илов, биопленки и так далее; либо на применении адаптированных, высокоактивных микроорганизмов особенно их ассоциаций, нашедших широкое применение особенно для очистки промышленных высококонцентрированных стоков (Ono et al., 1971; Kobayashi, Tchan, 1973); или, наконец, на внедрении в технику очистки иммобилизованных (адсорбированных или химически закрепленных на твердых поверхностях) отдельных высокоактивных чистых культур микроорганизмов и биологических катализаторов - ферментов (Синицын и др., 1994).

4.2.1. Активный ил.

Как было указано выше, биотехнология очистки сточных вод основывается на использовании аэробных и анаэробных

микроорганизмов. В азробкой очистке применяют активный ил и биопленку, являющиеся скоплением разнообразных микроорганизмов, видовой состав которых регулируется конкретными экологическими условиями. Активный ил представляет собой хлопья размером до сотен микрон, причем он состоит примерно на 70% ив живых организмов и около 30% составляют частицы неорганической природы (Burt et al., 1990; Li, Ganczarczyk, 1990). Важную роль в формировании хлопьев, оседании и отделении ила от очищенной воды играют бактерии, образующие вооглеи, в частности, Zc-Ggloea rami ge га (Beinerna, Zevenhuizen, 1971; Ротмистров и др., 1975). Живые организмы вместе с твердыми носителями, к которому они прикреплены, образуют так называемые зооглеи-симбиоз популяций организмов, покрытый общей слизистой оболочкой (Lim, 1993; Tortora et al., 1998).

Зооглей может формироваться как за счет флокуляции, так и адгезии клеток на поверхности носителя (Сикпцын и др., 1994). Функции материала, объединяющего клетки б популяции и часто способствующего прикреплению бактерий к поверхностям, у большинства бактерий выполняют внеклеточные полисахариды (Sheintuch et al., 1986;- Karapanagiotis et al., 1989). Экзополисахариды, то есть полимеры, локализованные снаружи от клеточной стенки, существуют в виде капсулы и/пли свободной слизи и являются составляющими межклеточного матрикса популяций (Ботвинко, 1985).

Механизм флокуляции не выяснен окончательно. Доказано, что соединение бактерий в хлопья является физико-химическим процессом (McKinney, 1955; Eriksson, 1989; Садовский и др., 1989). Одни ученые считают, что при образовании хлопьев отрицательно

заряженные поверхности смежных клеток соединяются ионными мостиками через катионы (Friedman, Dugan, 1988); другие полагают, что клетки склеиваются полимером полипептидной или гетерополисахаридной природы (Parsons, Dugan, 1971).

4.2.2. Применение ассоциаций микроорганизмов для интенсификации биоочистки сточных вод.

В 70-х годах выяснилось, что хорошо разработанная как в теоретическом, так и в практическом отношениях и ставшая классической биотехнология чистых культур в области биотоксикации и биодеградации различных стойких ксенобиотиков оказалась несостоятельной и не дала ожидаемого аффекта.. В то же время появились работы о том, что некоторые стойкие к деградации пестициды, а также смеси различных ксенобиотиков более эффективно разлагаются не чистыми культурами, а адаптированными микробными ассоциациями. В смешанных популяциях, как правило, наблюдалось более быстрое и полное разрушение многих других синтетических соединений, так как, во-первых, представители смешанной популяции могут утилизировать продукты, накапливающиеся в процессе метаболизма определенного синтетического соединения другими ее представителями, и, во-вторых, могут оптимизировать условия окружающей среды, синтезируя, например, витамины или изменяя значение рН среды (Карасевич, 1982; Cain, 1984; Рыбальский, Лях, 1990).

Принципиальная возможность создания продуктивных микробных ассоциаций не вызывает сомнения и в литературе активно

обсуждается (Máteles., Chian, 1969; Meers, 1971; Veldkamp, 1976; Harrison,1980; Печуркин, 1981; Егоров, Ландау, 1982; Яковлева, 1983). В наши дни в ряде микробиологических производств, например, при очистке сточных вод, применение микробных ассоциаций давно уже стало традицией.

Очень часто в ассоциациях используются бактерии рода Bacillus в качестве основных (Ротмистров и др., 1975; Алиева, Илялетдинов, 1986; Hou Ching., 1986; Грищенко и др., 1988; Ягафарава, 1994; Fu.jimura et al., 1996) или сопутствующих культур (Тарнопольская и др., 1986; Романова и др., 1988; Mori et al., 1996).

Гуревич (1981) рассматривает два основных принципа получения оптимальных смешанных популяций для микробиологических производств: "случайный" и "градиентный" поиск. Первое направление заключается в подборе оптимальной структуры смешанной популяции в природных реально существующих условиях. Это направление основывается на том, что складывающаяся под влиянием отбора в нестерильных условиях ассоциация всегда более устойчива и обладает способностью к повышенной степени утилизации субстрата. Второй подход заключается в том, что в смешанную популяцию микроорганизмов вводится вид, "экзотичный" для данной системы, но обладающий некоторыми выраженными положительными свойствами (синтез стимуляторов роста, различие в способности окислять отдельные компоненты сложного субстрата в сравнении с основным видом и другие). Оба принципа поиска оптимальных микробных ассоциаций могут дополнять друг друга.

Однако, следует учитывать тот факт, что смешанная популяция может быть полезна только там, где ее эффективность оказывается

выше, чем сумма эффективностей составляющих ее монокультур при

прочих равных условиях (Дегерменджи, 1981).

* *

тк

Итак, синтетические соединения тлеют самое разнообразное химическое строение, физиологические свойства, назначение и применение. Исследования, связанные с изучением деструкции этих веществ с помощью микроорганизмов, постоянно расширяются. Необходимо не только обобщить весь накопленный экспериментальный материал, найти правильные подходы к классификации загрязнений с точки зрения их возможной биодеструкции, что является вопросом самим по себе очень сложным, но и изучить широчайшие природные возможности бактерий связанные с их уникальными способностями по утилизации ксенобиотиков. Таким образом, исследования по данному направлению приобретают как общенаучное, так и практическое значение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Сафронова, Ирина Юрьевна

Выводы:

1. Штамм 260 КМ МГУ, растущий на малеиновой кислоте, идентифицирован как Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidaiis; его рост отмечен в широком диапазоне концентраций малеата - от 0,2 до 45,0 г/л.

2. Использование малеата происходит путем быстрой трансформации его через фумарат в L-яблочную кислоту;, плазмид в клетках A.xylosoxidans не обнаружено.

3. Ключевым ферментом трансформации малеиновой кислоты является мембрансвязанная малеинат-цис-транс-изомераза, максимальный уровень активности которой наблюдается при температуре +40°С и рН 7,6. Малеинат-цис-транс-изомераза A.xylosoxidans имеет индуцибельную природу, а регуляция работы данного фермента осуществляется отсутствием или наличием второго субстрата и его природой.

4. A.xylosoxidans диссоциирует на R-, S- и М-формы, отличающиеся диапазоном концентраций малеиновой кислоты, на которых возможен их рост, и эффективностью ее использования. Лучшими деструкторами являются М- и S-варианты.

5. Смешанная культура A.xylosoxidans 260 и B.subtilis 271 в условиях периодического культивирования использует малеиновую кислоту без накопления в культуральной жидкости яблочной кислоты. В режиме протока данная ассоциация оказывается неустойчивой.

6. Иммобилизованные клетки A.xylosoxidans в периодическом режиме за 4 суток почти полностью трансформируют 30,0 г/л малеата в малат, а в непрерывном режиме при скорости протока 0,03 ч-1 -15,0 г/л.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сафронова, Ирина Юрьевна, 1999 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Авсюк И-В. Фумаратгидратазная активность у разных бактерий // Прикл. биохим. и микробиол. 1991. Т.27. Вып.5. С.658-664.

2. Агапова O.P., Андреев А.Л., Старовойтов И.И. и др. Плазмида биодеградации 2,6-диметилпиридина, 2,4-диметилпиридина и пиридина у штаммов Arthrobacter // Мол. ген., микробиол. и вирусол. 1992. N 5-6. С.10-13.

3. Алиева P.M., Илялетдинов А.Н. Реализация экологического принципа в микробиологической очистке промышленных сточных вод // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1986. N 4. С.517-527.

4. Аркадьева S.A., Семенова Е.В., Оршанская Ф.Б. Микроорганизмы, окисляющие малеиновую кислоту в сточных водах /У Биол. науки. 1991. N 11. С.105-108.

5. Асатиани B.C. Биохимическая фотометрия. / М. : Изд-во Академ, наук СССР, 1957. 835с.

6. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. / М. : Агропромиздат, 1990. 334с.

7. Беляков В.Д., Каминский Г.Д., Каминская С.Г. Гипотеза направленной самоперестройки популяции микроорганизмов и ее общебиологическое значение // Журн. микробиол., эпидемиол. и ! иммунобиол. 1985. N 1. С.93-100. )

8. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и ' псевдомонозы. / М.: Медицина, 1990. 223с.

9. Беспамятов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. / Л.: Химия, 1985. 320с.

10. БлохинаИ.Н., Леванова Г.Ф., Антонов A.C. Систематика бактерий (с основами геносистематики). / Н. Новгород: Изд-во Нижегор. ун-та, 1992. 169с.

11. Воронин A.M. Биология плазмид // Успехи микробиол. 1983. Вып.18. С.143-163.

12. Ботвинко И. В. Экзополисахариды бактерий /У Успехи микробиол. 1985. Т.20. С.79-116.

13. Войшвилло H.Е., Турута A.M., Камерницкий A.B. и др. Стероидтрансформирующая активность диссоциативных вариантов Rhodococcus sp. // Прикл. биохим. и микробиол. 1993. Т.29. N 3. 0.424-430.

14. Гвоздяк П.И. Теоретические и прикладные аспекты использования микроорганизмов для очистки воды. / В кн.: Научные основы технологии воды. К.: Наукова Думка, 1973. 62с.

15. Головлева Л.А. Метаболическая активность псевдомонад, деградирующих ксенобиотики. /В кн.: Генетика и физиология микроорганизмов - перспективные объекты генетической инженерии. Пущино, 1985. 0.10-24.

16. Головлева Л.А., Воронин A.M., Козловский O.A. и др. Деградация кельтана и функционирование ферментов окисления ароматических соединений у Pseudomonas aeruginosa // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1987. N 6.

17. Готовцева В.А., Гусакова Е.Г., Коровкина A.C. 0 диссоциации культуры Mycobacterium globiforme 193 на S- и R-формы // Микробиол. 1968. Т.37. N 3. С.505-510.

18. Грищенко C.B., Газиева A.M., Филиппов H.A. Использование адаптированной микрофлоры для очистки сточных вод. / В кн. : Микробиол. очистка воды: Тез. докл. I Всесю конф., Киев, 7-10 дек. 1988. Киев, 1988. С.99-100.

19. Гуревич Ю.А. Перспективы использования смешанной культуры дрожжей и бактерий на сложном субстрате. / В кн.: Смешанные

проточные культуры микроорганизмов. Новосибирск, 1981. С.168-181.

20. Дегерменджи А.Г. Проблемы сосуществования взаимодействующих проточных популяций. / В кн.: Смешанные проточные культуры микроорганизмов. Новосибирск: Наука, 1981. С.26-106.

21. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У. и др. Справочник биохимика. ./ М.: Мир, 1991. 544с.

22. Егоров Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез биологически активных соединений смешанными культурами микроорганизмов // Прикл. биохим. и микробиол. 1982. Т.18. Вып.6. С.335-349.

23. Егоров Н.С., Самуилов В.Д. Состояние и перспективы развития научных исследований в области биотехнологии в высших учебных заведениях // Виол, науки. 1985. N 12. С.24-31.

24. Егоров Н.С., Аркадьева З.А., Выборных С.Н. и др. Влияние условий хранения на стабильность таксономических признаков Serratia marcescens // Прикл. биохим. микробиол. 1980. Т.16. Вып.5. С.729-733.

25. Елинов Н.П. Химическая микробиология. / М.: Высшая школа, 1989. 448с.

26. Ермохина Т.М., Пахомова М.В., Крашенинников И. А. и др., Практикум по биохимии. / М.: Изд-во МГУ, 1991. Т.1. С.20-21.

27. Заторная Н.Б., Никоненко В.У., Чеховская Т.П. Биотехнология очистки надсмольных сточных вод. / В кн.: Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. С.86.

28. Зайцев Г.М. Утилизация 3-хлорбензойной кислоты смешанной культурой микроорганизмов // Микробиология. 1988. Т.57. N 4. С.550-553.

- ige -

29. Звягинцева И.С., Скрябин Г.К. Диссоциация культуры Mycobacterium globiforme и ее способность дегидрировать стероиды // Микробиол. 1965. Т.34. N 3. С.461-464.

30. Иванов П.Л., Вербовая Л.В., Рысков А.П. и др. Геномный полиморфизм у диссоциативных форм Bacillus subtilis (mesentericus) 76. Идентификация дисооциантов методом геномной "дактилоскопии" // Молекул, биол. 1990. Т.24. N 2. С.560-565.

31. Иерусалимский Н.Ф. Теоретические и промышленные аспекты микробиологического синтеза // Вестник АН СССР. 1965. Т.35. N 4. С.42-50.

32. Избранные задачи большого практикума по микробиологии. / М.: Изд-во МГУ, 1985. 72с.

33. Избранные задачи большого практикума по микробиологии. / М.: Изд-во МГУ, 1991. 126с.

34. Илялетдинов А.Н. Вклад микробиологии в решение экологических проблем. / В кн.: Тр. Всес. симп. "Микробиол. охрана биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия, Оренбург, 1991". Оренбург, 1991. С.47.

35. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. / М.: Наука, 1982. 141с.

36. Киприанова Е.А. Систематика и биологически активные вещества бактерий рода Pseudomonas. / Докт. дисс. Киев, 1984.

37. Классификация и номенклатура ферментов (Отчет комиссии по ферментам Междунар. биохим. союза. 1961). / М.: Изд-во иностр. лит-ра, 1962. 199с.

38. Козляк Е.И., Якимов М.М., Фадюшина Т.В. и др. Изучение жизнеспособности клеток-деструкторов ароматических соединений в процессе иммобилизации на волокнистых носителях. / В кн.:

Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущине, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. С.93.

39. Котляревский Д.И. Микробиологическая деградация пестицидов. / Новосибирск: Изд-во ин-та хим. кинет, и горения СО АН СССР, 1990. 32с.

40. Кощеенко К.А. Живые иммобилизованные клетки как биокатализаторы процессов трансформации и биосинтеза органических соединений // Прикл. биохимия и микробиол. 1981. Т.17. Вып.4. С.477-493.

41. Кощеенко К.А., Борман Е.А., Бычкова Г.Г. Микробиологическая трансформация микрокристаллического ацетата кортизона в преднизолон // Прикл. биохим. и микробиол. 1976. Т.12. N 5. С.650-553.

42. Краткая химическая энциклопедия. / М.: Наука, 1967. С.1047.

43. Кривец И.А., Настоящая Н.И., Ставская С.С. Гидрофильно-гидрофобные свойства бактерий-деструкторов ПАВ // Химия и технология воды. 1992. Т.14. N 7. С.547-552.

44. Лисовская Э.В., Макещенко К.Ф. Генетическое нормирование некоторых вредных сточных вод и промышленных выбросов. / Киев: Наукова думка, 1964. 72с.

45. Лукиных H.A. Биологическая очистка городских сточных вод и перспективы ее развития в России. /В кн.: Тр. науч.-практ. конф. "Решение экол. пробл. г.Москвы" в рамках прогр. "Конверсия - городу", Москва, 14-16 декабря, 1994. М., 1994. С.106-107.

46. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. / М.: Мир, 1984. 479с.

47. Методы общей бактериологии. / Ред. Герхард Ф. и др. М.: Мир, 1984. Т.2. С.360.

48. Методы химии углеводов. / Ред. Н.К.Кочетков. М.: Мир, 1967. 512 с.

49. Милько Е.С. Нестабильность синтеза практически ценных веществ бактериями и процесс диссоциации // Приклад. биохим. и микробиол. 1990. Т.26. N 6. С.732-742.

50. Милько E.G., Коробова Ю.Н., Габинская К.Н. и др. Отщепление боковой цепи ситостерина R-, S- и М-вариантами микобактерий // Микробиол. 1982. Т.51. Ml. С.166-167.

51. Милько E.G., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации (корине- и нокардиоподобные бактерии). / М.: Изд-BO МГУ, 1991. 143с.

52. Михайлюк Н.В. , Богушевский А.Н., Коробов В.П. Трансформация метилпаратиона иммобилизованными клетками бактерий. /В кн.: Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. С ЛОЗ.

53. Могилевич Н.Ф. Иммобилизованные микроорганизмы и очистка воды // Мшробшл. ж. 1995. Т.57. N 5. С.90-105.

54. Никовская Г.Н. Агрегация бактерий и микробиологическая очистка воды. / В кн.: Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. С.44.

55. Ножевникова А.Н. Мусорные залежи - "метановые бомбы" планеты // Природа. 1995. N 6. С.25-34.

56. Определитель бактерий Берджи. / М.: Мир, 1997. Т.1. С.77; 99.

57. Павленко Н.И., Бега 3.Т., Изжеурова В.В. и др. Деструкция нефтепродуктов иммобилизованным активным илом. / В кн.: Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. 0.108-109.

58. Перт Дж.С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. / М.: Мир, 1978. 331с.

59. Печуркин Н.О. Смешанные проточные культуры микроорганизмов -новый этап в развитии теоретической и прикладной микробиологии. / В кн.: Смешанные проточные культуры микроорганизмов. Новосибирск, 1981. С.3-25.

60. Печуркин Н.С. Некоторые задачи мониторинга в связи с развитием экологически обоснованных технологий: Проблема экологического мониторинга и моделирования экосистем. / Л., 1985. Т.8. С.117-120.

61. Романова Е.А., Ненашева М.Н., Дроздоеич С.В. и др. Ассоциация бактерий - деструкторов этиленгликоля и диэтаноламина. / В кн.: Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. С.53.

62. Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставская С.С. Микробная деструкция синтетических органических веществ. / Киев: Наукова думка, 1975. 222с.

63. Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставская С.С. Микробиология очистки воды. / Киев: Наукова думка, 1978. 267с.

64. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. / М.: Мир, 1986. 120с.

65. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. / М.: Изд-во МГУ, 1995. 221с.

66. Рыбальский Н.Г., Лях С.П. Консорциумы микроорганизмов. Экобиотехнологический потенциал консорциумов микроорганизмов. / М.: БНИШШ, 1990. Т.1. 176с.

67. Садовский М.Г., Гуревич Ю.Л., Мануковский Н.С. Кинетика образования клеточных агрегатов в системах проточного

культивирования. / В кн.: Динам, хим. и Биол. систем. Новосибирск, 1989. С.213-230.

68. Селифонов С.А., Слепенькин А.В., Аданин В.М. и др. Катаболизм аценафтена штаммами A leal i genes eutrophus и Alcaligenes paradoxus // Микробиология. 1993. Т.62. N 1. С.120-128.

69. Селифонов С.А., Старовойтов И.И. Сравнительное изучение ферментов мета-расщепления ароматического кольца у штаммов Pseudomonas с плазмидным и хромосомным генетическим контролем катаболизма бифенила и м-толуилата. / В кн.: Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. С.55-56.

70. Сидоренко С.И. Окислительная активность и особенности метаболизма клеток микроорганизмов при очистке промышленных стоков в хемостате. /В кн.: Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. С.115.

71. Синицын А.П., Райкина Е.й., Лозинский В.И. и др. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. / М.: Изд-во МГУ, 1994. 288с.

72. Скворцова И.Н. Особенности микробных сообществ городских почв и их индикационные возможности. / В кн.: Почва, город, экология. М.: Фонд "За экономическую грамотность", 1997. С.126-140.

73. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. / М.: Наука, 1976. 187с.

74. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Микробиологическая трансформация органических соединений. / В кн.: Биотехнология. М.: Наука, 1984. С.29-35.

75. Скрябин Г.К., Головлева Л.А., Головлев Е.Л. Трансформация

ароматических углеводородов в соокислительных условиях // Изв. АН СССР. Сер. биология. 1972. N 1. С.50-57.

76. Слабова О.И., Никитин Д.И. Утилизация водорода и этилена иммобилизованными клетками олиготрофных бактерий. / В кн.: Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. С.117.

77. Смирнов Г.Б. Роль плазмид и мигрирующих генетических элементов в эволюции бактерий // Успехи микробиол. 1984. Вып. 19. С.35-74.

78. Отавская С.С., Никовская Г.Н., Самойленко Л.С. и др. Очистка воды от анионных ПАВ бактериями-деструкторами, иммобилизованными на синтетических волокнах. / В кн.: Тезисы докладов "Микробиологические методы защиты окружающей среды", Пущино, 5-7 апреля 1988. Пущино, 1988. С.119-120.

79. Стасишина Г.Н., Могильная О.А., Калачева Г.С. и др. Исследование гетерогенности в культуре водородных бактерий А1саН£епез еиЬгорЪиз 1-1. / Красноярск: Изд-во АН СССР, 1989. 30с.

80. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. / М.: Мир, 1979. Т.З. С.118-128.

81. Таранова Л.А., Грищенко С.В., Радченко О.С. и др. Микробная очистка сточных вод производства поверхностно-активных веществ // Химия и технол. воды. 1991. Т.13. N 11. С.1051-1056.

82. Тарнопольская М.Г., Калмыкова Г.Я., Коринченко Н.Б. и др. Применение активных культур микроорганизмов для биорегенерации сорбента фильтра глубокой очистки. / В кн.: Управление культивированием микроорганизмов: Тез. докл. IV Всес. конф., Пущино, 21-23 окт. 1986. Пущино, 1986. С.47-48.

83. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. / М.: Наука, 1985. 472с.

84. Хроматография на бумаге. / М.: Изд-во иностр. лит., 1952. 851с.

85. Ягафарова Г.Г. Опытно-промышленные испытания биоочистки стоков и почвы от токсических соединений // Защита от коррозии и охрана окруж. среды. 1994. N 10. С. 19-21.

86. Яковлева Е.П. Совместное культивирование продуцентов биологически активных веществ с другими микроорганизмами // Прикл. биохим. и микробиол. 1983. Т.19. Т 3. С.330-346.

87. Шлегель Г. Общая микробиология. / М.: Мир, 1987. 566с.

88. Шуст С.М., Северина Л.О., Рубан Е.Л. Некоторые особенности культуры Mycobacterium mucosum, окисляющей холиевую кислоту // Микробиол. 1975. Т.44. N 1. С.81-85.

89. Berg-ey's Manual of Systematic Bacteriology. / Eds Krieg: N.R. et al. 9th ed. Baltimore (London): Williams and Wilkins Co., 1984. V.l. P.361-373.

90. Blok J. Classification of biodegradability by growth kinetic parameters // Ecotox. Environ. Saf. 1994a. V.27. P.294-305.

91. Blok J. Extrapolation of biodegradability test data by use of growth kinetic parameters // Ecotox. Environ. Saf. 1994b. V.27. P.306-315.

92. Boethling- R.S., Howard P.H., Meylan W. et al. Group contribution method for predicting1 probability and rate of aerobic biodegradation // Environ. Sei. Technol. 1994. V. 28. N 3. P.459-465.

93. Bonicke R., Juhasz S.E. Änderung- der enzymbildung: bei mykobacterien durch lysog-enisierung- // Pneumolog-ic. 1970. Bd.142. N.2. P.273-278.

94. Burt P., Morgan S.F., Dancer B.N. et al. Microbial populations

and sludge characteristics in thermophilic aerobic sewage sludge digestion // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1990. V.33. N 6. P.725-730.

95. Cain R.B. Xenobiotic breakdown by mixed cultures // Biochem. Soc. Trans. 1984. V.12. N 6. P.1146-1148.

96. Chakrabarty A.M. Potential role of biotechnology in the remediation of environmental pollution. / In: Biotechnol. et environ, dev. durable: symp. int., Montreal, 23-26 sept., 1991: Programme offic. Montreal, 1991. P.1-27.

97. Clarke P., Ornston N. Metabolic pathway and regulation. Pt.l. / In: Geneties and biochemistry of Pseudomonas. N.Y.; L., 1975. 366p.

98. Davison A.D., Csellner H., Karuso P. et al. Synergistic growth of two members from a mixed microbial consortium growing on biphenyl // FEMS Microbiol. Ecol. 1994. V.14. N 2. P.133-146.

99. De Smedt J., Bauwends M., Tytgat R et al. Intra- and intergeneric similarities of ribosomal ribonucleic acid cistrons of free-living, nitrogenfixing bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol.1980. V.30. N 1. P.106-122.

100. De Vos P. Intrageneric and intergeneric similarities of ribosomal RNA cistrons of the Genus Pseudomonas and the implications for taxonomy // Antonie van Leeuwenhock J. Microbiol, and Serol. 1980. V.46. N 1. P.96.

101. De Vos P., De Ley J. Intra- and intergeneric similarities of Pseudomonas and Xanthomonas ribosomal ribonucleic acid cistron // Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. V.33. N 3. P.487-509.

102. Deinema M.U., Zevenhuizen L.P.T.M. Formation of cellulose fibrils by Gram-negative bacteria and their role in bacterial

flocculation /7 Arch. Mikrobiol. 1971. V.78. N 1. P.42-57.

103. Dubous F. One century of bacterial polymorphism. / In: Role Cult. Collect. Era Mbl. Biol. Washington, 1956. P.35-42.

104. Dubous M., Gilles K.A. Hamilton F.K. et al. Colorimetric method for determination of sugar and related substances // Anal. Chem. 1956. V.28. N 3. P.350-356.

105. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria // Plasmid. 1978. N 1. P.584-588.

106. Engesser K.-H., Schmidt E., Knackmuss H.-J. Adaptation of Alcaligenes eutrophus B9 and Pseudomonas sp. B13 to 2-fluorobenzoate as growth substrate // Appl. and Environ. Microbiol. 1980. V.39. N 1. P.68-73.

107. Englard S., Britten J.S., Listowsky I. Stereochemical course of the maleate hydratase reaction // J. Biol. Chem. 1967. V.242. P.2255-2259.

108. The Enzymes. /'Ed. Boy er P.D. 3th ed. N.Y.; L.: "Academic press", 1971. V.5. 734p.

109. The Enzymes. / Ed. Boyer P.D. 3th ed. N.Y.; L.: "Academic press", 1972. V.6. 678p.

110. Eriksson L. Study of flocculation mechanisms by observing effects of a complexing agent on activated sludge properties. / In: Wysokoef. metody oczyszczania sclekow i odnowa wody: 5 Miedzunar. konf. nauk., Krakow, 25-27 Sept., 1989. Krakow, 1989. V.l. P.31-38.

111. Faber K. Biotransformations in organic chemistry. / 2-nd ed. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. 1995. P.19 (356 p.).

112. Friedman B.A., Dugan P.R. Identification of Zoogloea species

and the relationship to zGogloeal matrix and floo formation // J. Bacterid. 1968. V.95. N 5. P.1903-1909.

113. Fu.iimuraY., Kuwatsuka S., Katayama A. Bioavailability and biodégradation rate of DDT by Bacillus sp. B75 in the presence of dissolved humic substances // Soil. Soi. and Plant Nutr. 1996. V.42. N 2. P.375-381.

114. Fukui S., Tanaka A. Synthetic prepolymer methods for immobilization of biocatalysis. Application of ce11-entrapped microbial cells to bioconversions of lipophilic compounds in hydrophobic condition. / In: Advances in biotechology. N.Y., 1980. ¥.3. P.343-348.

115. Galli E. Biodégradation of toxic waste. / In: 5th Eur. Cong.on Biotechology, Copenhagen, July 8-13, 1990; Prog. Copenhagen, 1990. V.2. P.919-926.

116. Graham L.L,, Beveridge T.J. Effect of chemical fixatives on accurate preservation of Echerichia coli and Bacillus subtilis structure in cells prepared by freeze-substitution // J. Bacteriol. 1990. V.172. N 4. P.2150-2159.

117. Haggblom M. Mechanisms of bacterial degradation and transformation of chlorinated monoaromatic compounds // J. Basic Microbiol. 1990. V.30. N 2. P.115-141.

118. Hao O.J., Kim M.H. Continuous pre-anoxic and aerobic digestion of waste activated sludge // J. Environ. Eng. 1990. V.116. N 5. P.863-879.

119. Hamer G. Lysis and "Cryptic" growth in waster-water and sludge treatment processes // Acta biotechnol. 1985. V.5. N 2. P.117-127.

120. Harrison D.E.F. Mixed cultures in industrial processes. / In:

Adv. Bioteohnol. Proc. 6th Int. Ferment. Symp., L.(Canada), 20-25 July, 1980. Toronto, 1980. V.l. P.15-21.

121. Herman D.C., Fedorak P.M., Mackinnon M.D. et. al. Biodégradation of naphthenio acids by microbial populations indigenous to oil sands tailings /./ Can. J. Microbiol. 1994. V.40. N 6. P.467-477.

122. Hill F.F., Schindler J., Schmid R.D. et al. Microbiological conversion of sterols. 1. Selection of mutants for production of 20-carboxy-pregna-1,4-dien-3-one // Eur. J. Appl. Microbiol, and Biotechol. 1982. V.15. N 1. P.25-32.

123. Hopper D.J., Chapman P.J., Dagley S. Enzymic formation of D-malat .// Biochem. J. 1968. V.110. P.798.

124. Hou Ching T., Barnabe N., Greaney K. Biodégradation of xanthan by salt-tolerant aerobic microorganisms // J. Ind. Microbiol. 1986. V.l. N 1. P.31-37.

125. Irvine R.L. Overview of biological processes as applied to hazardous waste problems. / In: Bioteohnol. Appl. Hazardous Wast. Treat.: Conf., Sarasota, Fla, 30 Oct.-4 Nov., 1988. N. Y., 1989. P.7-25.

126. Karapanagiotis N.K., Rudd T., Sterritt R.M. et al. Extraction and characterisationof extracellular polymers in digested sewage sludge // J. Chem. Technol. and Bioteohnol. 1989. V.44. N 2. P.107-120.

127. Kieslich K. Microbial transformations of non-steroid cyclic compounds. / Stuttgart: Thieme, 1984. 254p.

128. Kimura T., Kawabata Y., Sato E. Enzymatic production of L-malate from maleate by Alcaligenes sp. // Agric. Biol. Chem. 1986. V.50(l). P.89-94.

129. Kiregjian M., Holmes B., Kersters K. et al. Alcaligenes piechaudii a new speoies from human clinical specimens and the environment /./ Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V.36. P.282-287.

130. Kobayashi M., Tchan V.T. Treatment of industrial waste solution and production of useful by-products using1 a photosynthetic bacterial method .// Water Res. 1973. ¥.7. N 8. P. 1219-1229.

131. Kurane R., Nohata Y. Biopolymer from Alcaligeries latus. Part 1. Microbial flocculation of waste liquids and oil emulsion by a bioflocculant from Alcalig-enes latus //Agric. Biol. Chem. 1991. V.55. N 4. P.1127-1129.

132. Leuenberger H.G.M. Biotransformation - a useful tool in organic chemistry // Pure &■ Appl. Chem. IUPAC. V.62. N 4. P.753-768.

133. Li D.-H., Ganczarczyk F.F. Structure of activated sludge floes // Biotechnol. and Bioeng. 1990. V.35. N 1. P.57-65.

134. Lim D. Microbiology. / 2nd ed. Florida: McGraw-Hill Companies, Inc., 1998. 720p.

135. Lockwood L.B. Ketogenic fermentation processes. / In: Industrial fermentations. N.Y., 1954. P.l.

136. Malik V.S. Aspects of biotechnology in steroid biotransformation // Ztschr. allg. Microbiol. 1982. Bd.4. N 22.

5. 261-267.

137. Marmur S. Direct amplification of DNA from colonies of Bacillus subtilis and Escherichia coli by the polymerase chain reaction // J. Mol. Biol. 1961. V.ll. N 3. P.208-214.

138. Mateles R.J., Chian S.K. Kinetics of substrate uptake in pure and mixed culture // Environm. Sci. and Technol. 1969. V.9. N

6. P.569.

139. McCarty P.L., Semprini L. Engieering and hydrogeological

problems associated with in situ treatment // Hydrol. Sci. J. 1993. V.38. N 5. P.261-272.

140. McKinney R.E., Symons J.M. Bacterial degradation of ABC. 1. Fundamental biochemistry // Sew. Int. Wast. 1956. V.31. N 5. P.549-556.

141. Meers J.L. Effect of dilution rate on the outcome chemostat mixed culture experiments // J. Gen. Microbiol. 1971. Pt.3. V.67. P.359-361.

142. Mori T., Sakimoto M., Kagi T. et al. Isolation and characterization of a strain of Bacillus megaterium that degrades poly(vinyl alcohol) // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1996. Y.60. N 2. P.330-332.

143. Nawaz M.S., Franklin W., Cerniglia C.E. Degradation of aliphatic amide mixture by immobilized and nonimmobilized cells Pseudomorias sp. // Environ. Sci. and Technol. 1994. V.28. N 6. P.1106-1109.

144. Novick R.P. Handbook of microbiology. / Clevelan (Ohio): CRS press, 1974. V.4. P.537-587.

145. Ono H., Kaneko V., Ito M. et al. Purification of industrial wastes by microbial methods. / In: Biochemical and Industrial Aspects of Fermentation, 1971. P.297-328.

146. Painter T.J., Morgan W.T.J. Partial acid hydrolysis of a mucopolysaccharide without appreciable N-deacylation of hexosamine // Nature. 1961. V.191. N 4783. P.39-40.

147. Panopoulos N.J., Peet R.C. The molecular genetics of plant pathogenic bacteria and their plasmids // Ann. Rev. Phytopathol. 1985. V.23. P.381-419.

148. Park Y.-M., Choi E.-S., Rhee S.-K. Effect of toluene -

permeabilizati on on ox idation of D-sorbitol to L-sorbose by Gluconobacter suboxydans cells immobilized in calcium alginate // Biotechnol. Lett. 1994. V.16. N 4. P.345-348.

149. Parsons A.B., Dugan P.R. Production of extracellular polysaccharide matrix by Zoogloea ramigera // Appl. Microbiol. 1971. V.21. N 4. P.657-661.

150. Powell D.A. Structure, solution properties and biological interactions of some microbial extracellular polysaccharides. / In: Microbial Polysaccharides and Polysaccharases (Ed. Berkeley R.C.W., Gooday S.W., Ellwood D.O.). L.: Acad. Press., 1979. P.117-160.

151. the Prokaryotes. / Ed. Balows A., Truper H.G., Dworkin M. et al. 2d.ed. N.Y., Berlin, Heiderberg, L., Paris, Tokyo, H.K., Barcelona, Budapest: Springer-verlag., 1992. V.3. P.2544-2552.

152. Richmond M.N., Clarke P.H. Genetics and biochemistry of Pseudomonas. / N.Y.: JoHn Wiley a. Sons, 1975. P.341-358.

153. Ridgway H.F., Kelly A., Justice C. et al. Microbial fouling of reverse osmosis membranes used in advanced wastewater treatment technology: chemical, bacteriological and ultrastructural analyses // Appl. and Environ. Microbiol. 1983. V.45. N 3. P.1066-1084.

154. Saffran M., Denstedt O.F. A rapid method for the determination of citric acid // Meth. Enzym. 1948. V.13. P.849-855.

155. Sahasrabudhe S.R. Microbial degradation of chlorinated aromatic compounds // Microbiol. Sei. 1987. V.4. N 10. P.300-303.

156. Scher W., Jakoby W.B. Maleate isomerase // J. Biol. Chem. 1969. Y.244. P.1878-1882.

157. Sheintuch M., Lev o., Einav P. et al. Role of exocellular

polymer in the design of activated sludge // Biotechnol. and Bioeng. 1986. V.28. N 10. P.1564-1576.

158. Shoemer M., Martin 0. Microbial transformation of steroids // Biotechol. and Bioeng. 1980. V.22. N 1. P.11-25.

159. Shukla O.P. Biodegradation for environmental management // Everyman's Sei. 1990. V.25. N 2. P.46-50.

160. Steffan R.J., Breen A., Atlas R.M. et al. Monitoring genetically engineered microorganisms in freshwater microcosms // J. Ind. Microbiol. 1989. V.4. N 6. P.441-446.

161. Tan H.-M. Pseudomonas putida ML2 contains a novel plasmid involved in benzene degradation. / In: 6th Symp. Microb. Ecol. (ISME-6), Barcelona, 6-11 Sept., 1992: Abstr. Barcelona, 1992. P. 292.

162. Tani K., Narahara M., Nasu M. et al. Aniline degradation by Alcaligenes. / In: 6th Symp. Microb. Ecol. (ISME-6), Barcelona, 6-11 sept., 1992: Abstr. Barcelona, 1992. P.289.

163. Taylor P.A., Baker O.A., Glaus S.W. Biological degradation of water-based machining coolants. / In: Adv. Biotechnol. Proc. 6th Int. Ferment. Symp., L.(Canada), 20-25 July, 1980. Toronto, 1981. P.615-620.

164. Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L. Microbiology: an Introduction. / 6th ed. California: Addison Wesley Longman, Inc., 1998. 832p.

165. Toshiaki N., Satoko M., Toshiya S. Production of d-rnalic acid from maleic acid by resting cells of Ustilago sphaerogena strain S 402 // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1993. V.57. N 3. P.490-491.

166. Tett V.A., Willetts A.J., Lappin-Scott H.M. Enantioselective

degradation of the herbicide mecoprop E2-(2-methyl-4-chlorophe-noxy) propionic add] by mixed and pure bacterial cultures // FEMS Microbiol. Ecol. 1994. V.14. N3. P.191-200.

167. Usui T., Yamaoka N., Matsuda K. et al. 13C Nuclear magnetic resonanse spectra of glucobioses, glucotrioses, and glucans // J. Chem. Soc., Perkin I. 1973. N 20. P.2425-2432.

168. Veldkamp H. Mixed continuous culture studies with the chemostat. / In: Continious culture 6: Application and New Fields. L., 1976. P.315.

169. Werf van der M.J., Tweei van der W.J.J., Sybe H. Screening for microorganisms producing D-malate from maleate // Appl. and Environ. Microbiol. 1992. V.58. N 9. P.2854-2860.

170. Whitaker J.R., Deatherage F.E. Behavior of Dowex-50 as an aminopeptidase // J. Amer. Chem. Soc. 1955. V.77. N 20. P.5298-5303.

171. Yen K.-M., Gunsalus I.C. Regulation of naphthalene catabolic genes of plasmid NAH 7 // J. Bacterid. 1985. V.162. N 3. P.1008-1013.