Деструкция сульфоароматических соединений бактериями родов Pseudomonas и Comamonas тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Балашов, Сергей Викторович

• Балашов, Сергей Викторович
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Балашов, Сергей Викторович

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность проблемы

1.2 Цель и задачи исследования

1.3 Научная новизна работы

1.4 Практическое значение результатов

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Бактерии рода Pseudomonas

2.2 Бактерии рода Comamonas

2.3 Метаболизм ароматических соединений бактериями родов Pseudomonas и Comamonas

2.4 Разложение ксенобиотиков бактериями родов Pseudomonas и Comamonas

2.5 Сульфоароматические соединения

2.5.1 Химическое строение, физико-химические свойства и области применения ароматических сульфонатов

2.5.2 Сульфоароматические соединения как загрязнители окружающей среды

2.6 Биодеградация сульфоароматических соединений

2.6.1 Разложение микроорганизмами алкилированных ароматических сульфонатов

2.6.2 Бактериальная деструкция арилсульфонатов

2.6.2.1 Микроорганизмы-деструкторы ароматических сульфонатов

2.6.2.2 Биохимические пути деградации арилсульфонатов у микроорганизмов

2.6.2.3 Бактериальные ферменты биодеградации сульфоароматических соединений

2.6.2.4 Генетический контроль катаболизма ароматических сульфонатов у

микроорганизмов

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды

3.2 Среды и другие материалы

3.3 Методы

3.3.1 Отбор проб почвы, воды и активного ила

3.3.2 Изоляция бактерий

3.3.3 Идентификация бактерий

3.3.4 Хранение бактериальных штаммов

3.3.5 Химический мутагенез

3.3.6 Обогащение мутантов

3.3.7 Диагностика ауксотрофных мутантов

3.3.8 Коньюгационный и мобилизационный перенос бактериальных плазмид

3.3.9 Элиминация бактериальных плазмид

3.3.10 Определение размера бактериальных плазмид

3.3.11 Определение групп несовместимости плазмид

3.3.12 Визуализация плазмидной ДНК

3.3.13 Выделение плазмидной ДНК

3.3.14 Скрининг плазмидной ДНК

3.3.15 Очистка плазмидной ДНК

3.3.16 Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.3.17 Гидролиз ДНК сайтспецифическими эндонуклеазами рестрикции

3.3.18 Электроэлюция фрагментов ДНК

3.3.19 Обработка ДНК линеализированного вектора щелочной фосфатазой

3.3.20 Лигирование ДНК

3.3.21 Трансформация клеток Е.соН плазмидной ДНК

3.3.22 Отбор клонов с рекомбинантными плазмидами

3.3.23 Подготовка бактериальных культур для определения активностей ферментов

3.3.24 Приготовление клеточных экстрактов

3.3.25 Определение концентрации белка в клеточных экстрактах

3.3.26 Определение активностей ферментов разрыва ароматического кольца

3.3.27 Анализ скорости окисления субстратов бактериальными клетками

3.3.28 Экстракция органических метаболитов

3.3.29 Определение спектральных характеристик метаболитов

3.3.30 Тонкослойная хроматография

3.3.31 Очистка метаболитов

3.3.32 Определение масс-спектров метаболитов

3.3.33 Определение концентраций органических веществ и ионов в культуральных средах

3.3.34 Изучение динамики и определение параметров роста бактериальных

культур

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Отбор образцов почвы, воды и активного ила

4.2 Выделение бактериальных штаммов-деструкторов ароматических сульфонатов

4.3 Идентификация бактериальных штаммов-деструкторов ароматических сульфонатов

4.4 Усвоение бактериями арилсульфонатов в качестве единственных источников углерода и энергии

4.5 Усвоение бактериями сульфоароматических соединений в качестве единственных источников серы

4.6 Динамика роста бактерий на сульфоароматических субстратах

4.7 Катаболизм арилсульфонатов бактериями вида Pseudomonasputida

4.7.1 Деструкция бензолсульфоновой, п-толуолсульфоновой и сульфаниловой кислот штаммом Р.putida BS 1331 и его производными

4.7.2 Деструкция бензолсульфоновой, п-толуолсульфоновой и сульфаниловой кислот штаммом Р.putida BS 1304

4.8 Катаболизм арилсульфонатов бактериями вида. Pseudomonas stützen

4.9 Катаболизм арилсульфонатов бактериями вида Comamonas testosteroni

4.9.1 Деградация бензолсульфоната и п-толуолсульфоната штаммом С.testosteroni BS1310

4.9.2 Деградация п-толуолсульфоната и п-сульфобензоата штаммом С.testosteroni BS1307

4.9.3 Деградация 5-сульфосалицилата штаммом С.testosteroni ВS1309

4.9.4 Деградация 2-нафталинсульфоната, бензолсульфоната и п-толуолсульфоната штаммом C.testosteroni BS1305

4.10 Генетический контроль деградации арилсульфонатов изучаемыми штаммами

4.10.1 Плазмиды деградации арилсульфонатов бактерий вида Р.putida

4.10.2 Плазмиды деградации арилсульфонатов бактерий вида Comamonas testosteroni

4.10.2.1 Плазмиды деградации бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот бактерий вида Comamonas testosteroni

4.10.2.1.1 Плазмида деградации бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот рВS1010 штамма Comamonas testosteroni BS 1310

4.10.2.1.2 Анализ коньюгативности плазмиды pBS1023 штамма C.testosteroni BS 1323

4.10.2.2 Плазмиды деградации п-толуолсульфоновой и п-сульфобензойной кислот бактерий вида Comamonas testosteroni

4.10.2.3 Плазмиды деградации 5-сульфосалициловой кислоты бактерий вида Comamonas testosteroni

4.11 Создание штаммов с расширенным спектром утилизируемых субстратов

4.12 Клонирование генов ферментов биодеградации арилсульфонатов штамма Р.putida BS 1304

4.12.1 Создание клонотек плазмидной ДНК штамма P.putida BS1304

4.12.2 Анализ клонотек плазмидной ДНК штамма P.putida BS1304

4.12.3 Поиск клонированных генов катехол-2,3-диоксигеназы

4.12.4 Анализ репрезентативности клонотек плазмидной ДНК штамма P.putida BS1304

4.12.5 Поиск клонированных генов бензолсульфонат-диоксигеназы

4.12.6 Анализ клонированного гена катехол-2,3-ДЖ>ксигеназы

4.12.7 Рестрикционный анализ клонированных фрагментов ДНК плазмиды pBS1004, несущих ген катехол-2,3-Диоксигеназы

4.12.8 Анализ экспрессии клонированного гена катехол-2,3-Диоксигеназы в клетках E.coli

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Деструкция сульфоароматических соединений бактериями родов Pseudomonas и Comamonas»

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность проблемы.

Масштабы поступления синтетических органических соединений в окружающую среду в результате хозяйственной деятельности человека возрастают год от года. Различные сульфоароматические соединения чрезвычайно широко применяются в промышленности и в быту, особенно в качестве поверхностно-активных веществ (ПАВ) и азокрасителей. Поэтому они часто и в больших количествах содержатся в индустриальных и бытовых стоках. Весь объем ПАВ на основе арилсульфонатов в силу их назначения целиком попадает в сточные воды. Ксенобиотический характер сульфо-группы придает ароматическим сульфонатам повышенную устойчивость к микробной деструкции. Это является причиной аккумуляции данного класса трудноразлагаемых загрязнителей в различных экосистемах, в первую очередь - в природных водоемах. В связи с этим проблема биодеградации сульфоароматических веществ приобретает все большую актуальность. Вследствие повсеместного применения сульфоароматических соединений особый интерес вызывает распространение способности к деструкции арилсульфонатов среди микроорганизмов, а также роль отдельных микробиологических таксонов в их деградации в естественных условиях. Определение биохимии катаболизма ароматических сульфонатов и генетического контроля биодеградации данных соединений также является неотъемлемым условием формирования целостного представления о роли микроорганизмов в разложении этих веществ в природе. Исследование микробной деструкции арилсульфонатов имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. Изучение деструкции сульфоароматических веществ микроорганизмами необходимо для установления принципиальной биоразлагаемости данного класса загрязнителей, а также служит удобной моделью исследования формирования и распространения способности разлагать ксенобиотики у микроорганизмов. В то же время это является теоретической базой для создания новых эффективных биотехнологических методов борьбы с загрязнением огружающей среды данными химическими соединениями.

1.2 Цель и задачи исследования.

Основной целью данной работы было изучение деструкции различных сульфоароматических соединений природными микроорганизмами. В связи с этим ставились следующие конкретные задачи:

1. Исследовать распространение микроорганизмов, способных разлагать сульфоароматические соединения в различных экосистемах.

2. Выделить бактерии-деструкторы арилсульфонатов, идентифицировать их до вида.

3. Изучить усвоение сульфоароматических субстратов микроорганизмами в качестве источников углерода и серы, а также динамику роста бактерий на данных субстратах.

4. Проанализировать основные ферментные активности разрыва ароматического кольца в клетках всех штаммов. Определить биохимические пути катаболизма арилсульфонатов.

5. Изучить природу генетического контроля деструктивной активности штаммов. Охарактеризовать бактериальные плазмиды био деградации арилсульфонатов.

1.3 Научная новизна работы.

В ходе выполнения настоящей работы впервые описано широкое распространение микроорганизмов, деградирующих ароматические сульфонаты, в активном иле искусственных биологических очистных сооружений. Впервые показано, что среди микроорганизмов активного ила способность разлагать ароматические сульфонаты преимущественно распространена среди бактерий вида Comamonas testosteroni. Создана коллекция бактерий-деструкторов, включающая 30 штаммов. Впервые описана деградация арилсульфонатов бактериями Pseudomonas stützen. Впервые описана бактериальная деструкция 5-сульфосалицилата. На примере штамма Р.putida BS 1331 впервые показана индукция системы десульфонирования бензолсульфонатом. Впервые описана трансформация п-толуолсульфоната с образованием 4-метилкатехола, осуществляемая этим штаммом. На примере штамма Р.putida BS 1332 впервые описано разложение п-толуолсульфоната с участием ферментов орто-окисления

катехола. Впервые показано широкое распространение плазмид биодеградации арилсульфонатов у природных микроорганизмов. Плазмиды биодеградации арилсульфонатов бактерий рода Сотатопая описаны впервые. Впервые проведено клонирование генов биодеградации арилсульфонатов. Клонирован ген катехол-2,3-диоксигеназы, участвующей в катаболизме бензолсульфоната и п-толуолсульфоната штаммом Р.риШа В81304.

1.4 Практическое значение результатов.

Полученные данные по широкому распространению способности разрушать ароматические сульфонаты среди микроорганизмов активного ила демонстрируют принципиальную возможность биологического разложения данных загрязнителей традиционными методами очистки. Использование выделенных бактерий-деструкторов перспективно с точки зрения создания биопрепаратов для очистки локальных загрязнений. Полученный трансконьтюгантный штамм СЛезшгегот В81305(рВ81010) с расширенным спектром утилизируемых сульфоароматических субстратов может быть использован при очистке высокозагрязненных стоков, содержащих различные арилсульфонаты. На основе штамма СЛейШ1егот В81310 (рВ81010) и его бесплазмидного варианта В81320 в сотрудничестве с ВНТК "Биосенсор" ИБФМ РАН сконструирован и апробирован высокоспецифичный, высокочувствительный и стабильный биосенсор для детекции бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Бактерии рода Pseudomonas

Род Pseudomonas описан Мигула в 1894 (Migula, 1895) году для неспорооб-разующих грамотрицательных бактерий с полярными жгутиками. Наряду с родами Bacillus и Bacterium он был включен в состав семейства Bacteriaceae.

В описании рода, опубликованном в 1895 году (Migula, 1895), клетки бактерий характеризовались как "цилиндрические, длинные или короткие, иногда образующие небольшие нити, движущиеся с помощью полярных жгутиков, число которых на одном полюсе колеблется от 1 до 10, чаще 1 или 3-6. Спорообразование редко". Таким образом, первая классификация бактерий рода Pseudomonas строилась на их морфологии, подвижности, характере расположения жгутиков. Среди видов рода первым был описан Pseudomonas руосуапеа. В 1-м издании определителя Берги род Pseudomonas был включен в порядок Eubacteriales, семейство Bacteriaceae, трибу Cromobacteriaceae. Основное внимание в описании рода было уделено пигментам, характер пигментообразования на протяжении долгих лет оставался одним из важных критериев в систематике и идентификации микроорганизмов рода Pseudomonas.

В 1966 году Стейнером, Паллерони и Дудоровым была осуществлена ревизия систематического положения рода Pseudomonas (Stanier, Palleroni, Doudoroff, 1966). Эти исследования позволили провести фенотипическую классификацию 267 штаммов бактерий и выделить среди них несколько хорошо очерченных видов, четко диагностируемых на основании предложенных критериев. Были описаны флюоресцирующая группа с видами Р.aeruginosa, Р.putida и P.fluorescens, ''Асidovorans''-группа с видами P.acidovorans и P.testosteroni, "Аlealigenes"-группа с видами P.alcaligenes и P.pseudoalcaligenes, а также виды Р.multivorans, P.stutzeri, P.maltophilia. Предложенные Стейниером с соавторами методические подходы дали мощный толчок развитию систематики рода Pseudomonas. Полученные данные расширили представления о свойствах бактерий рода Pseudomonas, позволили сформулировать родовой диагноз и были использованы для построения ключей и диагностических таблиц в 8-м и 9-м изданиях определителя Берги (Palleroni, 1984).

Согласно 9-му издания определителя Берги род Pseudomonas вместе с родами Xanthomonas, Zoogloea и Frateuria образуют семейство Pseudomonadaceae. Семейство Pseudomonadaceae Winslow, Broadhurst, Buchanan, Krumwiede, Rogers et Smith, 1917, к которому принадлежит род Pseudomonas, входит наряду с семью семействами (Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Methylococcaceae, Halobacteriaceae, Acetobacteraceae, Legionellaceae и Neisseriaceae) в IV секцию определителя Берги 'Трамотрицательные аэробные палочки и кокки" (Palleroni, 1984).

Описание рода Pseudomonas, приведенное в 9-м издании определителя Берги, включает прежде всего морфологические принципы, на которых строилась концепция рода у Мигула. Это "прямые или слегка изогнутые палочки (но не спиральные), диаметром 0,5-1,0 и длиной 1,5-5 мкм. Многие виды аккумулируют поли-ß-оксибутират как резервный материал, обнаруживаемый в виде суданофильных включений. Не образуют простеки, не окружены чехлами, покоящиеся стадии неизвестны. Грамотрицательны. Подвижны с помощью одного или нескольких полярных жгутиков, редко неподвижны. У некоторых видов образуются более короткие латеральные жгутики. Дальнейшее описание рода строится на его биохимических особенностях. Аэробы, имеющие строго респираторный тип метаболизма, использующие кислород в качестве терминального акцептора электронов. В ряде случаев в качестве альтернативного акцептора электронов может быть использован нитрат. Ксантомонадины не образуются. Большинство (если не все виды) не растут в кислых условиях (pH 4,5), не требуют органических факторов роста. Оксидазпо-ложительны или отрицательны. Каталазположительны. Хемоорганотрофы. Некоторые виды - факультативные хемолитотрофы, способные использовать Н2 Оили СО как источники энергии. Широко распространены в природе. Ряд видов патогенны для человека, животных и растений. Содержание ГЦ в ДНК составляет 58-70%. Типовой вид - Pseudomonas aeruginosa Migula 1900.

В последние годы исследования по сравнительной филогении видов, составляющих род Pseudomonas, были значительно продвинуты благодаря новейшим методам исследований, таким как сопоставление относительного содержания цито-хромов в интактных клетках, анализ строения бактериальных хинонов, липидов, липополисахаридов, экстрацелюлярных полисахаридов, анализ последовательно-

стей нуклеотидов 5 S и 16S рРНК , а также ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизация. Использованные методы дали сходные результаты и позволили распределить псевдомонад по трем филогенетическим РНК-группам. В первую вошли флюоресцирующие сапрофитные виды или оппортунистические патогены животных Р.aeruginosa, P.fluorescens, P.chloraphis, P.aureofaciens и P.putida; фитопатогенные виды P.syringae, P.viridiflava и P.cichorii; нефлюоресцирующие виды P.stutzeri, P.mendocina, P.alcaligenes и P.pseudoalcaligenes. Во вторую группу вошли патогены, за исключением P.pickettii: P.mallei, P.pseudomallei, P.caryophylli, P. cepacia, P.gladioli, P.pickettii, P.solanacearum. В третью группу вошли непатогенные P.acidovorans, P.testosteroni, P.delafieldii и виды, растущие аутотрофно в атмосфере водорода: P.facilis, P.saccharophila, Р.flava, P.pseudoflava, P.palieronii. (Смирнов и Киприанова, 1990).

2.2 Бактерии рода Comamonas

В 1987 году виды P.acidovorans и P.testosteroni выделены из состава рода Pseudomonas и переведены в род Comamonas, так как было показано, что по данным секвенирования олигонуклеотидов 16S РНК, показателям ДНК-рРНК-гомологии, составу убихинонов и клеточных жирных кислот, а также другим хемо-таксономическим признакам P.acidovorans и P.testosteroni близки к микроорганизму Comamonas terrigena. Вместе с ним они включены в состав рода Comamonas. (Tamaoka et al, 1987). К отличительным особенностям рода Comamonas относятся специфический спектр углеродного питания, исключающий почти все сахара и многие аминокислоты, характерный метаболизм ароматических соединений, способность накапливать поли- ß-оксибутират, наличие оксидазы и каталазы. Основные клеточные жирные кислоты - 16:0, 16:1 и 18:1, всегда содержится ЗОН 10:0, основной убихинон Q8, содержание ГЦ в ДНК колеблется в пределах 61-67%.

Типовой вид рода Comamonas - С.terrigena - нуждается в факторах роста и усваивает более узкий набор источников углерода, чем родственные ему C.acidovorans и C.testosteroni.

Бактерии вида C.acidovorans - лофотрихи, обильно образующие включения поли-Р-оксимасляной кислоты на средах, дефицитных по азоту. У многих штаммов

и

обнаружена антифунгальная активность, возможно, связанная с синтезом сидеро-форов. Бактерии не синтезируют пигментов, не растут при 42°С, не обладают гидролитической активностью в отношении большинства испытанных субстратов. Будучи неспособными к ассимиляции глюкозы и других Сахаров, за исключением фруктозы, бактерии вида C.acidovorans способны ассимилировать в качестве единственного источника углерода от 35 до 46 соединений. Значительное количество культур усваивает масляную, винную кислоты и такой малодоступный для флюоресцирующих бактерий субстрат, как малеиновую кислоту. Из алифатических спиртов часто усваивается н-бутанол, из ароматических соединений - м- и п-оксибензойная кислота, потребляются многие аминокислоты. Хороший рост C.acidovorans наблюдается на ксантине, ацетамиде, гиппуровой и никотиновой кислотах.

По многим биологическим свойствам бактерии C.testosteroni сходны с C.acidovorans. В отличие от последнего они не гидролизуют желатин и не ассимилируют некоторые источники углерода: малеиновую, винную и никотиновую кислоты, бутиленгликоль и ацетамид. В то же время бактерии C.testosteroni растут на средах с фолиевой кислотой, недоступной C.acidovorans, образуя на них ярко-оранжевые колонии.

Бактерии видов C.acidovorans и C.testosteroni распространены в почве, воде, ризосфере растений, непатогенны для человека и животных (Смирнов и Киприано-ва, 1990).

2.3 Метаболизм ароматических соединений бактериями родов Pseudomonas и Comamonas

Метаболизм ароматических соединений является неотъемлемой частью микробного внутриклеточного метаболизма. Особенности усвоения ароматических соединений у микроорганизмов имеют важное идентификационное значение. Большая часть химических загрязнителей окружающей среды имеет ароматическую природу. В силу этих причин метаболизм различных ароматических соединений микроорганизмами является предметом пристального научного изучения.

Бензоат является модельным ароматическим соединением, его метаболизм бактериями исследуется уже довольно давно. Изучение биохимических путей и ферментов расщепления бензоата и его производных бактериями рода Pseudomonas позволило выделить ряд больших групп, различающихся по нескольким критериям. Пути расщепления бензоата и контрольные механизмы этих реакций сходны у P.cepacia и видов "P.fluorescens-KOMiuiQKca", хотя ферменты, осуществляющие эти реакции, иммунологически различны (см. Рис.1). Контрольные механизмы расщепления ароматических соединений отличают перечисленные виды от микроорганизмов рода Acinetobacter, а химизм процесса - от штаммов C.acidovorans и C.testosteroni (Palleroni, 1975; Смирнов иКиприанова, 1990).

Рис. 1 Метаболизм бензоата псевдомонадами и бактериями близких видов. (Смирнов и Киприанова, 1990)

C.testosteroni

Р. aeruginosa P.putida P.fluorescens P.stutzeri P.mendocina t

Иммунологически родственные ферменты

Общие контрольные механизмы

Acinetobacter spp.

P.cepacia

А

Различные контрольные механизмы

Различные пути

Наиболее изучен процесс разложения бензоата псевдомонадами флюоресцирующей группы. Окисление бензоата осуществляется в два этапа: на первом этапе бензоат окисляется в 3,5-циклогексадиен-1,2-диол-1 -карбоновую кислоту под действием бензоат-диоксигеназной системы. На втором этапе это нестойкое соедине-

ние дегидрируется и декарбоксилируется с образованием катехола, который может окисляться как по орто-, так и по мета-пути. Метаболизм бензоата флюоресцирующими псевдомонадами отображен на Рис.2. Бензоат-оксигеназная система - очень неустойчивый ферментный комплекс, легко инактивируется при разрушении клеток. Впервые он был выделен из клеток Р.риШа С1 Уат^исЫ е! а1. (Уат^исЫ е! а1., 1975). Показано, что бензоат-оксигеназная система состоит из двух белковых компонентов, один из которых является НАДН-цитохромом с редуктазой, а другой - диоксигеназой. Бензоат-оксигеназная система индуцибельна, во всех случаях индуктором является бензоат, а репрессорами - катехол, сукцинат и ацетат - продукты окисления бензоата (Головлева, 1985).

Рис.2 Метаболизм бензоата бактериями рода Pseudomonas. (Clarke and Ornston,

1975).

Метаболизм ароматических соединений бактериями рода Сотатопа8 кардинально отличается от метаболизма псевдомонад. Это послужило одной из причин реклассификации и переноса видов Р .асгйоуогат и Р Ле$1о81егот в состав рода Сотатопа8 (Татаока й а1., 1987). Данный феномен был детально описан Wheelis et

СООН

I

мета-расщепление орто-расщеплеж

а1. (\VheeHs е1 а1., 1967). Авторами отмечалось, что для бактерий Р.ас1йо\огап8 бен-зоат вообще не является ростовым субстратом, и он способен поддерживать лишь слабый рост бактерий РЛе81о$1егот. В то же время оксипроизводные бензоата: м-оксибензоат и п-оксибензоат усваиваются бактериями обоих видов, п-оксибензоат метаболизируется бактериями Р.асгйоуогат и РЛея(оз(егот по одному пути - через образование протокатехата и его окисление по мета-пути. Деструкция м-оксибензоата бактериями РЛезШгегот также проходит стадию образования протокатехата, в то время как бактериями Р.аайоуогат м-оксибензоат разлагается путем окисления образующегося из него гентизата. Метаболизм бензоата бактериями Р\testosteroni осуществляется по уникальному механизму, присущему лишь данному виду, - путем гидроксилирования с образованием м-оксибензоата. Метаболизм ароматических соединений бактериями РЛеяШ1егот и Р.аыйоуогат показан на Рис.3.

Рис.3 Метаболизм ароматических соединений бактериями рода Сотатопая (\Vheelis ег а1., 1967).

ГООН ^ООН

С.ас^оуогапэ *

НО

▼ ▼

ооон ^ ооон

ооон соон

<

но

фумарат + пируват

2 пируват + форм1

Ферментные системы начальных этапов метаболизма м- и п-оксибензоата у бактерий "acidovorans"-группы являются индуцибельными. Хотя и P.acidovorans и P.testosteroni обладают полноценным орто-путями расщепления катехола и прото-катехата, что было показано Robert-Gero et al. (Robert-Gero et al., 1969) и Ornston и Ornston (Ornston and Ornston, 1972), однако, бактерии используют их для утилизации только цис-цис-муконовых кислот, но не ароматических соединений.

Усвоение ароматических соединений бактериями Pseudomonas и Comamonas неизбежно проходит через стадию разрыва ароматического кольца (Рубан, 1986). Этому предшествует образование дифенолов: катехолов, протокатеховой или ген-тизиновой кислот. Протокатеховая кислота может окисляться либо по мета пути с образованием формиата и двух молекул пирувата, либо по орто-пути с образованием сукцината и ацетил КоА. Катехол также может разлагаться двумя путями с образованием аналогичных метаболитов. Метилированные катехолы окисляются исключительно по мета-пути. Продуктами мета-окисления 4-метилкатехола являются пропионовый альдегид и пируват. Гентизат окисляется с образованием фумарата и пирувата. Все перечисленные метаболиты являются субстратами ферментов цикла Кребса и включаются в центральный клеточный метаболизм (Clarke and Ornston, 1975).

Ферменты расщепления ароматического кольца, как большинство ферментов периферического метаболизма ароматических соединений у псевдомонад индуци-бельны. Индукция и репрессия являются двумя контрольными механизмами, обеспечивающими биосинтез ферментов с высокой скоростью лишь в условиях появления в среде разлагаемых субстратов.

Регуляция синтеза ферментов орто-пути окисления катехола и протокатехата изучена наиболее детально. Синтез протокатехат-3,4-диоксигеназы - первого фермента орто-пути окисления протокатеховой кислоты - индуцируется у псевдомонад протокатехатом. Синтез трех последующих ферментов: ß-карбокси-цис-цис-муконат лактонизирующего фермента, у-карбоксимуконолактон декарбоксилазы и ß-кетоадипинатеноллактон гидролазы - индуцируется ß-кетоадипинатом. У большинства псевдомонад легко метаболизируемые субстраты, подобные сукцинату, репрессируют синтез ферментов ß-кетоадипинатного пути. При орто-окислении ка-

техола индуктором синтеза катехол-1,2-диоксигеназы является цис,цис-муконат. В то же время цис,цис-муконат является индуктором координированного синтеза двух последующих ферментов муконат-лактонизирующего фермента и муконолак-тон изомеразы. То есть муконат выполняет роль двойного индуктора, ускоряя синтез фермента, его образующего, и фермента, его разрушающего. Такой специфический контроль дает проверку на наличие заместителей в ароматическом кольце, уменьшая вероятность "запуска" катаболического пути, не идущего до конца (Го-ловлева, 1985). У бактерий рода Comamonas синтез ферментов орто-расщепления протокатехата и катехола регулируется иначе. Авторами, впервые описавшими данный процесс (Robert-Gero et al., 1969; Ornston and Ornston, 1972) показано, что у бактерий P.acidovorans и P.testosteroni ни протокатехат, ни Р-кетоадипинат не служат индукторами синтеза Р-карбокси-цис-цис-муконат лактонизирующего фермента и у-карбоксимуконолактон декарбоксилазы. Роль индукторов синтеза данных ферментов у этих микроорганизмов выполняют Р-карбокси-цис-цис-муконат или у-карбоксимуконолактон. Р-кетоадипинат является индуктором синетза муконолак-тонизомеразы в клетках P.testosteroni, но не P.acidovorans (Ornston and Ornston, 1972).

Синтез катехол-2,3-диоксигеназы и последующих ферментов мета-окисления катехола как правило индуцируется у псевдомонад ароматическими соединениями, стоящими в начале катаболического пути. По-видимому, основная физиологическая роль ферментов мета-пути у псевдомонад заключается в диссимиляции ароматических соединений, имеющих алкильные заместители в бензольном кольце, из-за широкой субстратной специфичности этих ферментов, которые в качестве субстратов могут использовать не только метилзамещенные катехолы, но и диметил и этилкатехол. (Clarke and Ornston, 1975).

2.4 Разложение ксенобиотиков бактериями родов Pseudomonas и Coma-

monas

Классическое определение биодеградации как процесса частичного или полного разрушения химических веществ микроорганизмами с использованием продуктов разложения в качестве источников углерода и энергии (Slater and Somerville,

1979) отражает способность микроорганизмов вовлекать различные соединения в клеточный метаболизм углерода, используя их при этом в конструктивном и энергетическом обмене. Исследования по биодеградации различных химических соединений строятся на данных принципах и изучают превращение органических веществ микроорганизмами, конечными продуктами которого являются диоксид углерода и вода. Микроорганизмы, способные осуществлять данный процесс, таким образом, должны обладать полным ферментативным набором для минерализации конкретных ксенобиотиков. Однако ключевую роль в деградации химических загрязнителей микроорганизмами играют ферменты начальных этапов катаболизма данных веществ. Благодаря особенностям ферментов периферического клеточного метаболизма бактерий-деструкторов молекулы ксенобиотиков могут разлагаться ими до обычных клеточных метаболитов, вовлекаемых в биохимические циклы обмена углерода. Благодаря этому различные химические поллютанты могут служить субстратами для роста микроорганизмов. Особенности ферментативных систем разложения ксенобиотиков естественно основаны на изменении генетического материала клетки или на формировании новых соответствующих генетических систем и регуляторных механизмов.

Процесс трансформации химических веществ микроорганизмами отличается от процесса деградации рядом особенностей. Во-первых, молекула трансформируемого соединения может быть доступна микроорганизмам лишь частично. При этом микроорганизмы, потребляя ксенобиотики, выделяют в окружающую среду продукты трансформации, которые могут быть как менее, так и более токсичными, чем первоначальный субстрат (Головлева, 1985). Во-вторых, продукты трансформации могут вообще не усваиваться бактериями. В этом случае ксенобиотики не служат для микроорганизмов источником углерода и могут трансформироваться лишь в процессе кометаболизма при росте на иных субстратах (Форстер и Вейз, 1990). В-третьих, ксенобиотики, содержащие в составе молекул различные элементы: азот, фосфор, серу - могут служить для бактерий источниками этих элементов для роста. Углеродная часть молекулы при этом может как утилизироваться, так и выделяться в окружающую среду.

Хорошо известна способность микроорганизмов, относящихся к разнообразным таксономическим группам, разлагать различные химические соединения. Среди огромного царства Procariotae особенно выделяются своими катаболитными возможностями бактерии рода Pseudomonas. Характерной чертой бактерий данного рода является чрезвычайно широкий спектр углеродного питания. Неслучайно, что даже сама схема классификации этих бактерий, предложенная Стейниером и соавторами в 1966 году, во многом основывалась на способности этих микроорганизмов к утилизации тех или иных наборов субстратов из 167 соединений (Stanier et al., 1966). К настоящему времени описаны псевдомонады, разлагающие различные химические загрязнители, такие, как: фенол (Herrmann et al., 1987), фенилацетат (Pickup et al., 1983), толуол (Duggleby et al., 1977), п-крезол (Hewetson et al., 1978) ни м-ксилолы (Wong and Dunn, 1974), н-алканы (Пориц и соавт., 1983), е-капролактам (Есикова, 1990), камфору (Rheinwald et al., 1973), никотин и никотинат (Thacker et al., 1978), анилин (Anson and Mackinnon, 1984), стирол (Bestetti et al., 1984), дибензотиофен (Monticello et al., 1985), салицилат (Chakrabarty , 1972), бифе-нил (Kochetkov et al, 1982), полициклические ароматические углеводороды (Dunn and Gunsalus, 1973; Sanseverino et al., 1993; Кочетков, 1985), хлорароматические углеводороды (Chatterjee and Chakrabarty, 1983; Vandenbergh et al., 1981), сульфоаро-матические углеводороды (Cain and Farr, 1968). Данный перечень является далеко неполным и не претендует на отображение огромного катаболического потенциала бактерий рода Pseudomonas.

Подобная "всеядность" псевдомонад может быть объяснена рядом особенностей их метаболизма и участвующих в нем ферментов, а также особенностями организации генетического материала. Широкая субстратная специфичность ферментов периферического метаболизма псевдомонад позволяет им вовлекать в метаболизм новые соединения и может служить основой для эволюционной дивергенции и формирования новых катаболических путей разложения ксенобиотиков. Одним из объяснений уникальной способности псевдомонад к деградации широкого спектра органических соединений является широкое распространение в бактериях этого рода плазмид, детерминирующих деградативные активности.

В последнее время все большее внимание исследователей в области микробиологической деструкции привлекает род Comamonas. Описываются все новые штаммы бактерий этого рода, активные в отношении различных ксенобиотиков: хлоро- и метилфенолов (Hollender et al., 1994), бифенила (Hurtubise et al., 1996), нитробензола (Shirley et al., 1995), фталевых кислот (Lee et al., 1994; Schlafli et al., 1994), полициклических ароматических углеводородов (Goyal and Zylstra, 1996), дигексилсульфосукцината (Toth et al., 1996), бензолсульфоновой (Ripin et al., 1971) и п-толуолсульфоновой кислот (Locher et al., 1989; Khlebnikov and Peringer, 1996). Причем большинство из описанных штаммов-деструкторов принадлежит к виду Comamonas testosteroni.

Большинство бактерий-деструкторов различных ксенобиотиков выделены из природных сред (почвы, воды), подвергшихся длительным химическим загрязнениям, которые служат не только селективным прессом отбора устойчивых форм, но и мощным эволюционным фактором формирования новых бактериальных путей катаболизма. Лабильность систем внутриклеточного метаболизма и обмен генетическими детерминантами биодеградации, позволяющие утилизировать новые химические соединения, сообщают микроорганизмам определенные селективные преимущества при загрязнении среды их обитания ксенобиотиками. По-видимому, неслучаен как тот факт, что среди изолированных бактерий-деструкторов ксенобиотиков бактерии рода Pseudomonas составляют большую часть, так и то, что бактерии Pseudomonas и Comamonas доминируют в микробных сообществах загрязненных почв и природных вод. По данным Hiraishi et al.(Hiraishi et al., 1989) бактерии родов Pseudomonas и Comamonas составляют большинство видового разнообразия среди аэробных гетеротрофных микроорганизмов активного ила очистных сооружений. 50% бактериальных изолятов, выделенных из активного ила, были отнесены к этим родам. Смешанная бактериальная культура, выделенная Mallakin и Ward из торфяного болота, загрязненного отходами газолинового производства, и способная деградировать бензол и ксилолы, состояла из микроорганизмов видов P.maltophilla, P.putida и C.testosteron (Mallakin and Ward, 1996).

2.5 Сульфоароматические соединения

2.5.1 Химическое строение, физико-химические свойства и области применения ароматических сульфонатов

Ароматические сульфокислоты - кристаллические гигроскопические вещества, как и их соли хорошо растворимы в воде. Все сульфокислоты являются такими же сильными кислотами, как азотная или соляная. Основной способ получения ароматических сульфокислот состоит в прямом сульфировании ароматических углеводородов действием концентрированной серной кислоты или олеума. Характерной особенностью сульфокислот является обмен сульфогруппы на другие функциональные группы. Типичные реакции ароматических сульфокислот, сопровождающиеся заменой сульфогруппы, показаны на Рис 4.

Рис.4 Характерные химические реакции ароматических сульфокислот. (Краткая хим.энцикл., 1965).

АгСМ «— КСЫ к * Н20 —► АгН

АгЭН МаБН ( Аго020Н \ —► МаОН —► АгОН

АгМН2 «— МаМН2 Н1Ч03 —•" Аг1Ч02

Ароматические сульфокислоты и их производные находят разнообразное применение: полупродукты в производстве фенолов и нафтолов, катализаторы многих реакций конденсации и полимеризации, многие окси- и аминонафталин-сульфокислоты используются в производстве азокрасителей, алкилбензолсульфо-наты - синтетические моющие средства, эфиры ароматических сульфокислот - ал-килирующие агенты, п-сульфаниламид и его производные представляют собой большую группу лекарств, 1Ч,1Ч-дихлорсульфамиды ("хлорамины") - Аг802КС12 обладают дезинфицирующими свойствами, к производным ароматических сульфокислот относится сахарин (Краткая хим.энцикл., 1965).

/^/ЗОзН Бензолсульфокислота. М.в. 158,18 Применяется главным и образом при производстве фенола, а также в качестве к—

тора многих реакций конденсации и полимеризации. Алкил-бензолсульфонаты (сульфонолы) - анионные поверхностно-активные вещества.

НзС

/^.БОзН п-Толуолсульфокислота. М.в. 172,2 Применяется при

производстве дезинфицирующих и лекарственных веществ, ядохимикатов, поверхностно-активных веществ, полимеров (Белоусова и др., 1987).

S03H 2-Нафталинсульфокислота. М.в. 230.22 В основном

применяется в производстве азо-красителей. Алкилнафталин-сульфокислота (некаль) - анионное поверхностно-активное соединение (Brilon et al., 1981).

Сульфаниловая кислота. (4-аминобензолсульфоновая кислота) М.в. 173 Применяется в производстве лекарственных веществ, азо-красителей и гербицидов (Feigel, Кпасктшз, 1988).

5-Сульфосалициловая кислота. М.в. 218.19 Качаствен-ный реагент на соли некоторых металлов.

Свойство сульфо-группы придавать молекулам ароматических соединений большую полярность и следовательно, большую растворимость в воде широко используется главным образом при при производстве двух больших групп сульфоа-роматических веществ, продукция и применение которых носит огромные масштабы: анионные поверхностно-активные вещества (ПАВ) и красители. Мировое про-

/X/SO3H

нсГЧ^

изводство поверхностно-активных веществ и красителей на основе арилсульфона-тов в 1987 г. составило 1.8x106 и более 3x105 тонн соответственно.

Алкилбензолсульфонаты (АБС) общей формулы (коммерческое название -сульфонолы):

- являются основой большой части производимых синтетических моющих средств. Дешевизна и хорошие моющие качества являются главными преимуществами АБС по сравнению с ПАВ иной химической структуры. В 1991 году доля АБС в общем объеме производимых в США и Западной Европе ПАВ составляла 45%. В бывшем СССР по данным 1981 года доля АБС от производившихся тогда в стране ПАВ (годовой объем производства - 8x105 тонн) составляла 40%. Для получения АБС бензол алкилируют, образовавшийся алкилбензол сульфируют и полученнную алкил-бензолсульфокислоту нейтрализуют. Производятся также ПАВ на основе других алкиларилсульфонатов, при этом для их синтеза вместо бензола используются ди-фенил или нафталин. Например, технический ПАВ некаль, представляющий собой смесь натриевых солей алкилзамещенных нафталинсульфокислот (Ставская, 1981). Важной характеристикой АБС является длина и строение алкильного радикала. Количество атомов углерода в алкильной цепи у коммерческих АБС варьирует от 5 до 20 (КеЛевг е1; а1., 1994). До середины 60-х годов преимущественно производились АБС с алкильной цепью, содержащих несколько разветвлений, - тетрапропилен-бензолсульфонаты. Однако, после того, как было показано, что наличие разветвлений в алкильной цепи является одной из основных причин устойчивости таких АБС к биологическому разложению, был освоен выпуск АБС с линейным алкильным радикалом (Саш, 1981).

Другой большой группой широко используемых арилсульфонатов являются синтетические красители. Ассортимент выпускаемых сульфоароматических красителей чрезвычайно широк, также как их химическая структура. Достаточно сказать, что только перечисление их коммерческих названий является довольно большим объемом информации. Сульфо-группу содержат как конечные продукты синтеза

красителей, так и их предшественники. В качестве примера можно привести ами-нонафтолсульфокислоты - предшественники синтеза азо-красителей. Технически-важные аминонафтолсульфокислоты (Лурье, 1989): 1 -Амино-2-нафтол-4-сульфокислота (ЭХТ-кислота), 1 -амино-5-нафтол-7-сульфокислота (М-кислота), 1-амино-8-нафтол-4-сульфокислота (С-кислота), 2-амино-5-нафтол-7-сульфокислота (И-кислота), 2-амино-8-нафтол-6-сульфокислота (гамма-кислота), 1-амино-8-нафтол-2,4-дисульфокислота (СС-кислота), 1-амино-8-нафтол-3,6-дисульфокислота (Аш-кислота), 1 -амино-8-нафтол-4,6-дисульфокислота (К-кислота), 2-амино-8-нафтолЗ,6-дисульфокислота (РР-кислота).

Некоторые ароматические красители, имеющие в качестве заместителей одну или несколько сульфо-групп (Лурье, 1989):

Ализариновый красный, ализариновый желтый РС, альберон, антразохрон, арсеназо I, арсеназо III, арсеназо М, бензиловый оранжевый, бензопурпурин 4Б, бе-риллон II, бериллон IV, бромкрезоловый синий, бромкрезоловый пурпурный, бромфеноловый синий, бромфеноловый красный, бромхлорфеноловый синий, гал-лион, диаминоантрахинонсульфокислота, дисульфофенилфлуорон, 2,7-дихлорхромотроповая кислота, индигокармин, кадион II, кальмагит, карбоксиарсе-назо, кислотный хром фиолетовый К, ксиленоловый синий, ксиленоловый оранжевый, конго красный, крезоловый красный, м-крезоловый пурпурный, люмогаллион, люмомагнезон, магнезон ХС, метаниловый желтый, метиловый оранжевый, метил-тимоловый синий, 2-нафтоловый фиолетовый, невазол НС, нитразин желтый, нит-розо-Я-соль, нитроксаминазо, нитросульфофенол С, нитхромазо, оранжевый Ж, ор-таниловый Б, ортаниловый К, ортаниловый С, пикрамин Р, пикрамин-эпсилон, пи-рокатехиновый фиолетовый, СПАДНС, стильбазо, стильбексон, сульфарсазен, сульфоназо, сульфонитразо Э, сульфонитрофенол М, сульфохлорфенол С, сульфо-хром, тайрон, тимоловый синий, титановый желтый, торон I, тропеолин 00, феноловый красный, феррон, хинолиназо Р, хинолиназо Э, хлорфеноловый синий, хлорфосфоназо I, хлорфосфоназо III, хромотроповая кислота, цинкон, цирконон, эриохромчерный Т, эриохромцианин II.

Большинство перечисленных красителей принадлежат к классу азо-красителей (содержат группу). Как и в случае поверхностно-активных ве-

ществ сульфо-группа введена в состав их молекул для большей растворимости красителей в воде.

2.5.2 Сульфоароматические соединениякак загрязнители окружающей среды.

Арилсульфонаты чрезвычайно редко встречаются в природе. Известно единственное сульфоароматическое соединение природного происхождения - аэругино-зин В, являющийся пигментом группы феназина бактерий вида Pseudomonas aeruginosa (Herbert and Holliman, 1964; Cook and Leisinger, 1991). По этой причине все ароматические сульфонаты могут быть отнесены к разряду ксенобиотиков как "веществ, освобождаемых в отдельные районы окружающей среды под действием человека, и поэтому встречающихся в этих или других районах в концентрациях выше, чем "природные" (Kertesz et al., 1994).

C-S связь в молекулах арилсульфонатов термодинамически высокостабильна (Cain, 1981). Известны два механизма химического десульфонирования п-толуолсульфоната. Это или кислотный гидролиз, при котором сульфо-группа освобождается в виде бисульфита, или освобождение сульфо-группы в виде сульфита и замещение гидроксильной группой в пара-положении по отношению к метальной (Ставская, 1981). Химическая стабильность и ксенобиотический характер сульфо-группы в составе арилсульфонатов придают этим соединениям повышенную устойчивость к микробной деструкции (Leidner et al., 1980).

Ароматические сульфонаты часто и в больших концентрациях содержатся в индустриальных и бытовых сточных водах. Так, арилсульфонаты и их производные составляют от 7 до 15 % органических загрязнителей воды реки Рейн (Malle, 1978). Большинство сульфоароматических соединений являются нормируемыми в воде соединениями: ПДК бензолсульфоната натрия -1.0 мг/л, бензолсульфохлорида - 0.5 мг/л, бензолсульфамида - 6 мг/л, хлорбензолсульфоната натрия - 2 мг/л, п-толуолсульфоната натрия - 0.05 мг/л, п-толуолсульфохлорида - 1 мг/л, п-алкилбензолсульфоната натрия - 0.04 мг/л, дибутилнафталин-сульфоната натрия (некаля) - 0.5 мг/л, ПДК сульфонолов - 0.5 мг/л (Белоусова и соавт., 1987).

Основной группой загрязнителей окружающей среды сульфоароматической природы являются ПАВ на основе АБС. Устойчивость сульфоароматических ПАВ к биологическому разложению обусловлена не только присутствием абиотической сульфо-группы, но и дифильным характером молекулы АБС за счет наличия ал-кильного радикала. В силу своего назначения весь объем используемых сульфоароматических ПАВ попадает в сточные воды и с ними в окружающую среду. Стоки некоторых предприятий, например текстильных, могут содержать до 2.5 г/л анионных ПАВ. Попадая в воду, ПАВ придают ей неприятный запах и привкус. Так, привкус вода приобретает при содержании АБС 0.1 мг/л, а запах - при содержании 0.2 мг/л (Ставская и соавт., 1988). Отрицательным с экологической точки зрения свойством ПАВ является их способность к ценообразованию. При наличии пены на поверхности водоемов ухудшается аэрация воды и замедляются процессы самоочищения. ПАВ крайне вредно действуют на гидробионтов и, прежде всего на рыб, так как адсорбируются на жабрах, нарушая газообмен, что часто приводит к гибели рыб. По отношению к теплокровным животным ПАВ обладают невысокой токсичностью. Летальная доза АБС для белых крыс при пероральном введении составляет 5.4 г/кг (Ставская и соавт., 1988). Все ПАВ, в том числе и АБС, являются бактерицидными веществами, нарушающими функционирование и целостность бактериальных оболочек, в первую очередь мембран (Тукмачев и соавт., 1979).

Поступление арилсульфонатов в окружающую среду с промышленными и бытовыми стоками, токсичность и устойчивость к разложению многих сульфоароматических соединений поднимают проблему предотвращения их накопления в окружающей среде.

2.6 Биодеградация сульфоароматических соединений

Алкилирование арилсульфонатов кардинально меняет их свойства, сообщая дифильность молекулам. Поверхностная активность алкил-замещенных ароматических сульфонатов придает им бактерицидные качества и уменьшает их доступность для микроорганизмов. Поэтому далее биодеградация алкилированных и неалкили-рованных арилсульфонатов будет рассмотрена отдельно.

2.6.1 Разложение микроорганизмами алкилированных ароматических сульфонатов.

Работы по изучению биологического разложения сульфоароматических соединений были начаты в конце 50-х годов в связи с увеличением поступления данного класса загрязнителей в окружающую среду, главным образом, в виде сульфоароматических ПАВ.

Первоначально предметом исследовательских работ была констатация принципиальной биологической разлагаемости алкилированных арилсульфонатов в окружающей стреде. Для подтверждения факта деструкции алкилбензолсульфонатов (АБС) микроорганизмами авторами использовались различные методики: тест на биохимическое потребление кислорода (БПК), определение поглощения кислорода по Варбургу, определение количества выделяющегося углекислого газа, определение освобождающегося сульфита и сульфата. Наиболее распространенным методом изучения биодеградации анионных ПАВ, в том числе и АБС, является прямое наблюдение снижения концентрации ПАВ под действием микроорганизмов, измеряемое с помощью экстракции хлороформом комплексного соединения ПАВ с метил еновым синим (так называемый МВАБ-тест). Однако ни один из вышеперечисленных методов не позволяет определить биохимию процесса разложения и отражает лишь изменение структуры АБС или его количества, в частности - снижение поверхностной активности (МВА8-тест), или десульфонирование (определение сульфата и сульфита). К более точным методам можно отнести исследование деструкции С14-меченного АБС, с помощью которого можно установить глубину деструкции. Определение промежуточных метаболитов дает возможность представить последовательность биохимических реакций при биодеградации ПАВ, и, поэтому, является наиболее информативным методом.

Используя вышеперечисленные подходы и методики, рядом авторов была показана биоразлагаемость алкилированных ароматических сульфонатов под воздействием различных микроорганизмов и микробных сообществ. Отмечалось, что на доступность АБС для бактерий, и, следовательно, на биоразлагаемость сильно влияют такие характеристики АБС, как: разветвленность алкильной цепи, ее длина,

положение в ней фенильного радикала, наличие других заместителей в бензольном кольце.

Впервые биологическое разложение АБС было изучено в активном иле. Впоследствии были изолированы и охарактеризованы индивидуальные штаммы бактерий» деструкторов. McKinney и Symons (McKinney and Symons, 1959) из почвы, сточных вод и активного ила были выделены следующие бактерии, способные расти на среде с алкилбензолсульфонатом в качестве единственного источника углерода: Alcaligenes faecalis (7 культур), A.viscosus (2), A.bookeri (1), P.putrefaciens (2), P.denitrificans (1), P.convexa (1), Pseudomonas ¿/7.(11), Flavobacterium aerogenoides (3), Bacillus sp. (1). Хорошо росли на АБС 15 штаммов из 34. Для 7 культур не была токсичной даже такая высокая концентрация вещества, как 1000 мг/л. Рядом авторов описаны пути деградации АБС, осуществляемые бактериями Bacillus sp. (Willets, 1973), Pseudomonas С12B (Payne andFeisal, 1963), P.alcaligenes TR (Ротмистров и соавт., 1986).

Лишение молекулы АБС дифильности может происходить двумя путями: де-сульфонирование (отщепление сульфо-группы) и деалкилирование (отщепление или укорочение алкильного радикала). В литературе имеются данные об использовании микроорганизмами обеих тактик разложения АБС. Так Willets и Cain (Willets and Cain, 1972) описали штамм Bacillus sp., инициирующий деградацию АБС с замещения сульфонатной группы гидроксилом и освобождения ее в виде сульфита. Гриб Cladosporium resinae, описанный Willets (Willets, 1973), осуществлял десуль-фонирование молекулы АБС с образованием иона сульфата и незамещенного ароматического кольца. Baggi (Baggi, 1974) описали штамм Pseudomonas acidovorans, разрушающий С12-АБС с образованием ß-сульфофенилбутирата и его десульфони-рованием до 1-метил-З-инданона. Штамм Pseudomonas putida S-313, описанный Kertesz et al. (Kertesz et al., 1994), способен десульфонировать сульфофенилоктан, сульфофенилбутират и АБС с образованием соответствующих фенолов, используя вышеуказанные сульфоароматические вещества в качестве единственных источников серы при отсутствии иных источников серы в среде.

Однако большинство исследователей склоняются к мнению, что деградация АБС путем первоначального окисления гидрофобной части молекулы - алкильного

радикала - более распространена в природе. Большая часть изолированных и охарактеризованных бактерий-деструкторов АБС используют именно этот механизм (Swisher, 1987). Способность бактерий усваивать АБС сильно зависит от структуры алкильной цепи, в первую очередь - от наличия или отсутствия разветвлений. Как впервые показали Sawyer (Sawyer, 1956) и McKinney (McKinney, 1959) АБС с разветвленной цепью на основе тетрапропилена крайне устойчивы к биологическому разложению. Это отрицательное с экологической точки зрения качество тетрапро-пиленовых АБС послужило причиной отказа от их производства и перехода на синтез линейных АБС, что почти не сказалось на свойствах и цене коммерческих ПАВ (Cain, 1981). Основными механизмами окисления алкильной цепи АБС микроорганизмами являются первоначальное со-окисление концевого углеродного атома и последующие а- или р-окисление, последнее встречается чаще (Swisher, 1987). АБС с разветвленной цепью, например содержащие метальную группу у Р-атома углеводородной цепи, не могут разлагаться путем Р-окисления. Микроорганизмы, разрушающие такие АБС комбинируют а- и Р-окисление (Cain, 1981). По-видимому, способность комбинировать а- и Р-окисление мало распространена в природе, так как изоляты, осуществляющие эти реакции очень немногочисленны. Именно этим можно объяснить устойчивость подобных изомеров АБС к биоразложению. К трудноразлагаемым относятся также изомеры с двумя метальными группами у терминального атома углерода алифатической цепи, а также содержащие четвертичный концевой атом углерода (Ставская, 1981).

Положение фенильного радикала оказывает существенное влияние на скорость биодеградации АБС. Swisher (Swisher, 1963) показал, что значительно быстрее окисляются 1-й 2-фенилизомеры АБС, чем 3-, 4-, 5- и 6-производные. Аналогичные данные были получены Huddleston и Allred (Huddleston and Allred, 1963). Сравнение скорости деградации гомологов АБС с различной длиной алкильной группы, сделанное авторами, показало, что гомологи с большим числом углеродных атомов в алкильной цепи разлагаются быстрее. Эти и другие работы легли в основу "принципа дистанции", согласно которому скорость биодеградации АБС увеличивается с увеличением расстояния между сульфо-группой и концом алкильной цепи (Swisher, 1987).

Судьба ароматической части молекулы при биодеградации АБС может быть различной. В целом ряде статей авторы подчеркивают, что изолированные бактерии-деструкторы способны окислять лишь алкильную цепь АБС. Так, 26 штаммов-деструкторов АБС, описанных Sigoillot и Nguyen (Sigoillot and Nguyen, 1990), разрушали данное соединение путем окисления алифатического радикала. Из возможных промежуточных метаболитов некоторым штаммам были доступны только 4-оксибензоат и 4-оксифенилпируват. Jimenez et al. (Jimenez et al., 1991) описали бактериальный консорциум, способный к полной минерализации АБС. Три бактериальные культуры из четырех, входящих в него, осуществляли лишь начальный этап деградации - окисление алкильной цепи. Swisher (Swisher, 1972) изучали "акклиматизацию" бактериальных культур к разложению ароматической части молекулы АБС. Бактериальный консорциум, поддерживаемый на С12-АБС с 7-дневным циклом в течение одного года, не утилизировал фенильный радикал. 14-дневный цикл поддержания культуры позволял бактериям "акклиматизироваться" к разрушению ароматических интермедиатов деструкции АБС. Данная способность отсутствовала в начальных 14-дневных циклах и появлялась у микроорганизмов только в восьмом цикле. К семнадцатому циклу бактериальная культура уже осуществляла полную деструкцию АБС, включая окисление бензольного кольца.

Как указывает Swisher (Swisher ,1987), достаточно оснований, чтобы предполагать, что в природных условиях алкилбензолсульфонаты преимущественно разлагаются микроорганизмами путем первоначального окисления алкильного радикала. Ферментативные активности, необходимые для этого, неуникальны и широко представлены у микроорганизмов, окисляющих предельные углеводороды (Cain, 1981). Укорочение или полное окисление алкильной цепи ведет к снижению поверхностной активности АБС. Сульфофенилалканаты - продукты окисления АБС -являются ключевыми метаболитами на пути к деструкции ароматического кольца (Swisher ,1987). Однако окисление ароматической части молекулы, содержащей сульфо-группу и остатки алкильного радикала, требует иных активностей - в первую очередь десульфонирующей и ферментов разрыва ароматического кольца.

2.6.2 Бактериальная деструкция арилсульфонатов.

Арилсульфонаты по сравнению с исходными ароматическими веществами обладают значительно большей растворимостью в воде и поэтому могут быть более доступными для микроорганизмов. Однако, абиотический характер сульфогруппы затрудняет биодеградацию данных соединений (Leidner et al., 1980). Сульфоарома-тические соединения за единственным исключением - продукты химического синтеза (Смирнов, Киприанова, 1990; Cook and Leisinger, 1991). Следовательно, ферментативные активности, позволяющие утилизировать арилсульфонаты, весьма специфичны и являются следствием эволюционного развития систем метаболизма микроорганизмов за какие-то 40-50 лет с тех пор, как было начато широкомасштабное производство и освобождение в окружающую среду ароматических суль-фонатов.

К первым упоминаниям возможности биодеградации отдельных составных частей молекулы АБС, в частности бензолсульфоната, можно отнести работы Bogan (Bogan, 1955) и Hammerton (Hammerton, 1955). Окисление бензолсульфоната подтверждалось потреблением кислорода. Symons и del Valle Rivera (Symons and del Valle Rivera, 1961) описали восемь бактериальных культур, полученных из активного ила, способных к окислению бензолсульфоната, п-толуолсульфоната, п-фенолсульфоната, сульфанилата. В дальнейшем предметом исследований служили индивидуальные бактериальные штаммы и осуществляемые ими биохимические пути катаболизма арилсульфонатов.

2.6.2.1 Микроорганизмы-деструкторы ароматических сульфонатов.

Способность использовать арилсульфонаты в качестве субстратов для роста не столь широко распространена среди микроорганизмов окружающей среды, как способность утилизировать их алкилированные гомологи. До сих пор описаны единичные штаммы-деструкторы ароматических сульфонатов. Все они изолированы из водных экосистем, подвергшихся значительным и долговременным загрязнениям АБС. Микробиологические сообщества данных экосистем, следовательно, прошли длительный период адаптации к данным соединениям.

К первым описаниям микроорганизмов-деструкторов ароматических сульфонатов можно отнести работу Cain и Farr (Cain and Farr, 1968), в которой авторы

описывают 12 штаммов-деструкторов бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот, принадлежащих к виду Pseudomonas aeruginosa. Работа Cain и Farr (Cain and Farr, 1968) является, пожалуй, единственным примером масштабного выделения из окружающей среды и характеристики штаммов-деструкторов арилсульфона-тов. Впоследствии исследователи уделяли большее внимание детальному описанию отдельных бактериальных штаммов. Focht и Williams (Focht and Williams, 1970) описали штамм Pseudomonas sp., разрушающий бензолсульфоновую и п-толуолсульфоновую кислоты. Bird и Cain (Bird and Cain, 1974) был описан штамм Alcaligenes sp., утилизирующий бензолсульфоновую, п-толуолсульфоновую и п-фенилэтансульфоновую кислоты. Штамм Pseudomonas testosteroni Н-8, описанный Ripin et al. (Ripin et al., 1975), деградировал бензолсульфонат и п-толуолсульфонат. Brilon et al. (Brilon et al., 1981) описали штаммы Pseudomonas sp., разрушающие 1-и 2-нафталинсульфоновые кислоты. Ohe и Watanabe (Ohe and Watanabe, 1986) был описан штамм Pseudomonas sp., деградирующий 2-нафтиламин-1-сульфоновую, 1-нафталинсульфоновую и 2-нафтол-1-сульфоновую кислоты. Thurnheer et al. (Thurnheer et al., 1986) изолировали 17 бактериальных штаммов-деструкторов орта-ниловой, сульфаниловой, 4-сульфобензойной, бензолсульфоновой, п-толуолсульфоновой и фенолсульфоновой кислот, к сожалению, культуры не были идентифицированы авторами. Штамм-деструктор бензолсульфоновой, п-толуолсульфоновой и ортаниловой кислот был идентифицирован Thurnheer et al. (Thurnheer et al., 1990) как Alcaligenes sp. 0-1. Штаммы-деструкторы 3-аминобензолсульфоната и 4-аминобензолсульфоната идентифицированы как Comamonas acidovorans (Locher et al., 1989). Детально изучен группой под руководством Cook штамм Comamonas testosteroni Т2, утилизирующий п-толуолсульфоновую и п-сульфобензойную кислоты (Locher et al., 1989). Wittich et al. (Wittich et al., 1988) описан штамм Moraxella sp., деградирующий нафталин-2,6-и нафталин- 1,6-дисульфоновые кислоты. Lee и Clark (Lee and Clark, 1993) описан штамм Pseudomonas maltophila с довольно широким спектром утилизируемых сульфоароматических субстратов: бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, 2-сульфобензоат, 4-оксибензоат, 1-нафталинсульфонат и 2-нафталинсульфонат. Ду-

бейковским и соавт. (Дубейковский и соавт., 1992) описан штамм Pseudomonas sp. BS 1304, усваивающий бензолсульфонат и п-толуолсульфонат.

Все вышеперечисленные микроорганизмы использовали сульфоароматиче-ские соединения в качестве единственных источников углерода и энергии для роста. Недавно описаны бактериальные штаммы, использующие различные арилсуль-фонаты в качестве единственных источников серы, но не углерода и энергии. Так, штамм Pseudomonas putida S-313 при отсутствии иных источников серы использовал в качестве таковых 1-й 2-нафталинсульфонат, 5-амино-1-нафталинсульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, сульфофенилбутират и сульфофенилоктан (Zurrer et al., 1987; Kertesz et al., 1994). Штамм Comamonas acidovorans 191 использовал в качестве источника серы п-толуолсульфонат (Seitz et al., 1993).

В разрушении различных ароматических сульфонатов сложной структуры, особенно содержащих амино-группу, большую роль играют бактериальные консорциумы. Nortemann et al. (Nortemann et al., 1986) описали бактериальный консорциум, разлагающий амино- и гидроксинафталин-2-сульфонаты, в котором доминировали бактерии, принадлежащие к роду Pseudomonas. Rozgaj и Glancer-Soljan (Rozgaj and Glancer-Soljan, 1992) описана ассоциация бактерий Flavobacterium, Bacillus и Pseudomonas, деградирующая 6-аминонафталин-2-сульфоновую кислоту. Сульфаниловая кислота разлагалась смешанной культурой Hydrogenophaga palleroni и Agrobacterium radiobacter (Feigel and Knackmuss, 1993).

На основе индивидуальных штаммов-деструкторов арилсульфонатов исследователями были созданы экспериментальные модельные очистные установки. Так Khlebnikov и Peringer (Khlebnikov and Peringer, 1996) описали проточный биореактор для очистки п-толуолсульфоната. Инокулятом для формирования биопленки служил штамм Comamonas testosteroni.

Как видно из приведенных примеров, подавляющее количество изолированных и изученных микроорганизмов-деструкторов различных сульфоароматических соединений относится к грамотрицательным бактериям. Среди описанных бактерий-деструкторов доминируют представители родов Pseudomonas, Comamonas и Alcaligenes. Однако, несмотря на тщательное, часто детальное описание отдельных штаммов-деструкторов ароматических сульфонатов, экологический аспект пробле-

мы микробной деградации ароматических сульфонатов слабо изучен. Недостаточно данных о распространении способности к деструкции арилсульфонатов среди членов различных природных сообществ микроорганизмов, а также, неясна роль отдельных таксонов микроорганизмов в их деградации в естественных условиях.

2.6.2.2 Биохимические пути деградации арилсульфонатов у микроорганизмов.

Как отмечают в своем обзоре Kertesz et al.(Kertesz et al., 1994), известно три механизма десульфонирования ароматических сульфонатов: до, одновременно или после разрыва ароматического кольца.

Хорошо изучен первый тип десульфонирования, заключающийся в первоначальной диоксигеназой атаке ароматического кольца. Продуктом реакции является нестабильный сульфоно-цис-цис-диол, который затем спонтанно реароматизирует-ся до соответствующих катехолов, что сопровождается освобождением сульфита. Впервые данный механизм был описан Cain и Farr (Cain and Farr, 1968) для 12 штаммов Pseudomonas aeruginosa. Авторами было показано, что десульфонирова-ние является первой стадией окисления бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот. Образующиеся соответственно катехол и 4-метилкатехол далее окисляются по орто-пути (только катехол) или по мета-пути (оба соединения). Катехол-2,3- и катехол-1,2-диоксигеназные активности индуцировались при росте на указанных арилсульфонатах. Биохимический путь катаболизма бензолсульфоната и п-толуолсульфоната бактериями Р. aeruginosa показан на Рис.5. Штамм Pseudomonas testosteroni Н-8 (Ripin et al., 1975) также разлагал бен-золсульфонат путем десульфонирования и мета-окисления катехола. Аналогичный путь использовал штамм Alcaligenes sp (Bird and Cain, 1974) для утилизации бен-золсульфоната, п-толуолсульфоната и фенилэтан-п-сульфоната. Авторы двух последних работ отмечали, что описанные бактериальные штаммы способны десуль-фонировать алкилбензолсульфонаты, например пропилбензолсульфонат, однако катехол-2,3-диоксигеназная активность ингибировалась 4-изопропилкатехолом (Bird and Cain, 1974). Описанный путь разрушения бензол- и п-толуолсульфоната использовали также штаммы Alcaligenes .ур.О-1 (Thurnheer et al., 1990) и

Pseudomonas sp. (Дубейковский и соавт., 1992). Штамм Comamonas testosteroni Т2 (Locher et al., 1989) использовал иной путь для деградации п-толуолсульфоната: сначала окислялась метальная группа, десульфонирование осуществлялось на уровне сульфобензоата, образующийся протокатехат окислялся по мета-пути. Данный путь деструкции п-толуолсульфоната отображен на Рис.6.

Рис.5 Катаболизм бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот бактериями вида P. aeruginosa. (Cain andFarr, 1968)

нр

орто-расщепление мета-расщепление

Рис.6 Деградация п-толуолсульфоновой кислоты штаммом Comamonas testosteroni Т2. (Locher et al., 1989)

CH3 сврн сно

S03H

S03H

S03H

соон

соон

мета- „

расщепление

N^OH он

so3H

Десульфонирование с образованием дигидроксинафталинов использовали штаммы Pseudomonas sp. A3 для деградации 2-нафталинсульфоната и Pseudomonas sp. С22 для деградации 1-й 2-нафталинсульфоната (Brilon et al., 1981), Moraxella sp. для разложения нафталин-2,6- и нафталин-1,6-дисульфоновых кислот (Wittich et al., 1988), Pseudomonas ¿p.TA-1 для утилизации 2-нафтиламин-1-сульфоновой кислоты (Ohe and Watanabe, 1986). Дальнейшее окисление дигидроксинафталинов производилось всеми штаммами одинаково - через салицилат и гентизат. Путь деструкции 2-нафталинсульфоната штаммом Pseudomonas sp. A3 показан на Рис.7.

Рис.7 Деструкция 2-нафталинсульфоната штаммом Pseudomonas sp. A3. (Brilon et al., 1981)

OH.

OH

гентизатныи путь

Во всех перечисленных случаях продуктом реакциии десульфонирования различных арилсульфонатов являлся сульфит. Как указывают Johnston et al. (Johnston et al., 1981) невозможность обнаружения сульфита при десульфонирова-нии арилсульфонатов может быть связана с высокой активностью сульфит оксида-зы, как было показано для штамма P.testosteroni Н-8С, деградирующего бензол-сульфонат с образованием сульфата.

К первому типу десульфонирования можно отнести также десульфонирование широкого спектра нафталинсульфонатов и бензолсульфонатов (см. выше), осуществляяемое штаммом P.putida S-313 (Zurrer et al., 1987; Kertesz et al., 1994).

Десульфонирование по монооксигеназному механизму с образованием соответствующих нафтолов и фенолов производилось данным штаммом только в отсутствие других источников серы. При этом вся освобождающаяся сера усваивалась клетками, углеродная же часть молекулы в описанных авторами условиях напротив не утилизировалась.

Необычный путь разложения п-толуолсульфоната описан Focht и Williams (Focht and Williams, 1970) для штамма Pseudomonas sp. 2,3-Диокси-4-сульфотолуол, образующийся из п-толуолсульфоната, десульфонировался с образованием 3-метилкатехола, который окислялся по мета-пути. Сульфит освобождался в виде сульфата. Данный путь деградации п-толуолсульфоната показан на Рис.8.

Рис.8 Деструкция п-толуолсульфоновой кислоты штаммом Pseudomonas sp. (Focht and Williams, 1970)

СНз

S03H

?Нз

H

-он он

H

so3H

CH3

хЛ^он

Ч^^он so3H

СНз

1

CK /СНз

Г + о=с оно соон

ноне

СНз

CHgCOOH

о=с;

Щ, <«-

\

соон

СНз

н. X ^с^п соон

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Балашов, Сергей Викторович

6 выводы

1. Показано, что микроорганизмы, разрушающие различные сульфоароматические соединения, широко распространены в активном иле искусственных аэрируемых биологических очистных сооружений.

2. Среди микроорганизмов активного ила способность разлагать ароматические сульфонаты преимущественно распространена среди бактерий вида Сотатопая

3. Выделенные бактерии-деструкторы способны усваивать сульфоароматические субстраты как в качестве единственных источников углерода и энергии, так и в качестве единственных источников серы. Бактериальная деструкция 5-сульфосалицилата описана впервые.

4. Для всех исследованных микроорганизмов определены активности ключевых ферментов разрыва ароматического кольца и предложены биохимические пути катаболизма арилсульфонатов. Впервые описана деструкция п-толуолсульфоновой кислоты с участием ферментов орто-окисления катехола.

5. В большинстве исследованных бактерий способность разлагать сульфоароматические соединения детерминируется плазмидами. В ряде штаммов катаболизм ароматических сульфонатов контролируется хромосомными генами. Для некоторых штаммов показано взаимодействие ферментных систем биодеградации, кодируемых плазмидными и хромосомными генами.

6. Плазмиды биодеградации арилсульфонатов бактерий видов Р.риШа и СЛезШгегот охарактеризованы по их размеру, кодируемым признакам, способности к коньюгационному переносу, группе несовместимости, стабильности поддержания и кругу бактериальных хозяев. Плазмиды биодеградации арилсульфонатов бактерий рода Сотатопая описаны впервые.

7. Клонирован ген катехол-2,3-диоксигеназы, участвующей в катаболизме бензолсульфоната и п-толуолсульфоната штаммом Р.риНёа В81304. Показана его экспрессия в клетках штамма Е.соИ БН5а.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Балашов, Сергей Викторович, 1998 год

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абрамзон А А. Поверхностно-активные вещества. Ленинград, Химия, 1979, с 282-290.

2. Бабыкин М.М., Зинченко В.В., Бибикова М.В., Шестаков С.В. Плазмиды различных штаммов Rhodopseudomonas spaeroides.// Мол.генетика, микробиология и вирусология, 1984, N7, с.28-35.

3. Белоусова М.Я., Ашуль T.B., Сафонова Н.С. и др. Основные свойства нормируемых в водах органических соединений. М., Наука, 1987, с.5-104.

4. Воронин А.М., Старовойтов И.И., Борисоглебская А.Н., Скрябин Г.К. Плазмида Pseudomonas putida, контролирующая первичные этапы окисления нафталина.// Докл.АН СССР, 1976, Т.228, с.962-965.

5. Воронин А.М. и др. Плазмиды Pseudomonas, контролирующие биодеградацию органических соединений. В сб.: Микробиологические методы борьбы с загрязнением окружающей среды. Пущино, 1979, с.36-37.

6. Воронин А.М. Состояние и перспективы генетических исследований бактерий рода Pseudomonas. В.сб.: Генетика и физиология микроорганизмов -перспективных объектов генной инженерии. Пущино. Изд-во ОНТИ ЦНБИ АН СССР, 1985, с.25-39.

7. Воронин А.М. Плазмиды резистентности и био деградации бактерий рода Pseudomonas.Дисс.д-ра биол.наук., М., 1987, 500 с.

8. Воронин А.М., Кулакова А.Н., Цой Е.И., Кошелева И.А., Кочетков В.В. Молчащие гены мета-пути окисления катехола в составе плазмид биодеградации нафталина.// Докл.АН СССР, 1988, Т.299, с.237-245.

9. Воронин А.М., Цой Т.В. и др. Клонирование и экспрессия генов первичных этапов окисления нафталина Pseudomonas putida в клетках Escherichia coli.// Генетика, 1989, Т.25, N.2, с.226-238.

10. Воронин А.М.Дой Т.В. Генетика биодеградации у псевдомонад и других грамотрицательных бактерий. В сб.Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. М., Наука, 1990, с. 123-138.

11. Брода П. Плазмиды. М., Мир, 1986, с.4-90.

12. Варфоломеев С.Д., Калюжный C.B. Биотехнология.Кинетические основы микробиологических процессов. Москва, Высшая школа, 1990, с.7-52.

13. Вольф И.В., Ткаченко Н.И. Химия и микробиология природных и сточных вод. Л., Изд-во ЛГУ, 1973, с.5-234.

14. Воробьева Л.И. Техническая микробиология. М., Изд-во МГУ, 1987, с.5-168.

15. Герхард Ф. и др. Методы общей бактериологии. М.Мир., 1984, Т. 2, с.3-242

16. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.Мир, 1982, с.54-65, 368-370.

17. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы. М., Мир, 1988, с.230-249.

18. Головлева Л.А. Метаболическая активность псевдомонад, деградирующих ксенобиотики. В сб.: Генетика и физиология микроорганизмов - перспективных объектов генной инженерии. Пущино, Изд-во ОНТИ ЦНБИ АН СССР, 1985, с.Ю-25.

19. Грушко Я.М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах. Ленинград, Химия, 1982, с. 140-142.

20. Дубейковский А.Н., Гафаров А.Б., Наумов A.B. Плазмидный контроль деградации сульфоароматических соединений штаммом Pseudomonas sp. В S1304.//Генетика, 1992, Т.28, N.II, с.34-40.

21. Досон Р.,Эллиот Д.,Эллиот У.,Джонс К. Справочник биохимика. М.,Мир, 1991, с.323.

22. Дэвис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий. М.Мир, 1984, с. 16-28.

23. Есикова Т.З. Плазмиды биодеградации е-капролактама бактерий рода Pseudomonas.- Дисс.канд.биол.наук, Пущино, 1990, с.5-42.

24. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов. 1983, Л., Изд-во ЛГУ. с.5-15.

25. Ковалева Н.Г., Ковалев В.Г. Биохимическая очистка сточных вод предприятий химической промышленности. М., Химия, 1987, с. 3-160.

26. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. М., Химия, 1970, с.3-343.

27. Костовецкий Я.И., Рахов Г.И., Штейнберг Е.И. Синтетические поверхностно-активные вещества в городских стоках и эффективность очистки от них на биологических станциях.// Гигиена и санитария, 1975, N.2, с.95-96.

28. Кошелева И.А. Молекулярно-генетическая организация плазмид биодеградации нафталина. Дисс.канд.биол.наук, М., 1989, с 11-38, 108-113.

29. Кочетков В.В. Плазмиды биодеградации нафталина бактерий рода Pseudomonas: Распространение, сравнительная характеристика, классификация. -Дисс.канд.биол.наук, Пущино, 1985, с.32-69.

30. Лейте В. Определение органических загрязнений питьевых, природных и сточных вод. М., Химия, 1975, с. 130-136.

31. Лурье Ю.Ю.,Рыбникова А.И. Химический анализ производственных сточных вод. М., Химия, 1974, с. 317-323.

32. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М., Химия, 1984, с.5-488.

33. Маниатис Т.,Фрич Э.,Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.Мир, 1984, с.74-89, 241-244.

34. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.Мир., 1976, с.28-53.

35. Наумова Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений. Изд-во Казанского ун-та, 1985, с.11-21,181-234.

36. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. Москва, Наука, 1981, с.13-32,120-166.

37. Перт Дж.С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Москва, Мир, 1978, с.81-165.

38. Пориц А.Л., Борони А.М., Скрябин Г.К. Штамм Pseudomonas aeruginosa, растущий на углеводородах нефти.// Прикладная биохимия и микробиология, 1983, Т.19, с.347-350.

39. Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставская С.С. Микробная деструкция синтетических органических веществ. Киев, Наук.думка, 1975, с.3-224.

40. Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставская С.С. Микробиология очистки воды. Киев, Наук.думка, 1978, с.3-268.

41. Ротмистров М.Н., Таранова JI.A., Радченко О.С., Ставская С.С. Бактериальная деструкция алкилбензолсульфонатов.// Докл. АН СССР, 1986, Т.288, N.1, с.246-248.

42. Рубан E.JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. М., Наука, 1986, с.30-47, 96-109, 133-138.

43. Смирнов В.В.,Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев, Наукова думка, 1990, с.6-12.

44. Ставская С.С. Биологическое разрушение анионных ПАВ., Киев., Наукова думка, 1981, с.65-85.

45. Ставская С.С., Сузина Н.Е., Григорьева Т.Ю. и др. Ультраструктурная организация бактерий-деструкторов додецилсульфата натрия.// Докл. АН СССР, 1982, Т.226, N.5, с.1261-1264.

46. Ставская С.С.,Таранова JI.A., Радченко О.С., Ротмистров М.Н. Селекция микроорганизмов-деструкторов алкилбензолсульфонатов. // Химия и технология воды, 1986, Т.8, N.6, с.59-62.

47. Ставская С.С., Григорьева Т.Ю., Гаибова Н.Д., Ротмистров М.Н. Бактериальное разрушение анионных ПАВ сульфоэтоксилатов.// Микробиология, 1987, Т.56, N.4, с.608-612.

48. Ставская С.С., Павлова И.Н., Радченко О.С. и др. Очистка и изучение свойств десульфонирующего фермента Pseudomonas alcaligenes.// Микробиология, Т.56, N.6, с.928-932.

49. Ставская С.С., Удод В.М., Таранова A.A., Кривец И.А. Микробиологическая очистка воды от поверхностно-активных веществ. Киев, Наукова думка, 1988, с.8-16, 124-130.

50. Старовойтов И.И., Тимкина Е.О. pBS2 - Плазмида биодеградации, контролирующая синтез катехол-1,2-оксигеназы.// Докл.АН СССР, 1981, Т.256, N.1, с.196-198.

51. Таранова Л.А., Радченко О.С., Овчаров Л.Ф., Ставская С.С. Бактериальная деструкция сульфонола (алкилбензолсульфоната) в биореакторе.// Химия и технология воды, 1987, Т.9, N.4, с.361-363.

52. Тукмачев В.А., Недопасова JI.B., Заславский Б.Ю., Рогожин С.В. Действие додецилсульфата натрия на биологические мембраны.// Биофизика, 1979, Т.24, N.1, с.55-60.

53. Форстер К.Ф., Вейз Д.А.Дж. Экологическая биотехнология. Л., Химия, 1990, с.318-334.

54. Харди К. Плазмиды. Методы. М.Мир., 1990, с.82-83.

55. Холодилов Н.Г. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса. В сб.: Методы молекулярной генетики и генной инженерии.Новосибирск, Наука, 1990, с.9-10.

56. Цой Т.В., Кошелева И.А. и др. Клонирование и экспрессия гена Pseudomonas putida, контролирующего катехол 2,3-оксигеназную активность в клетках Escherichia соН.//Генетика, 1988, N 9, с. 1550-1561.

57. Anson J.G., Mackinnon G. Novel Pseudomonas plasmid involved in aniline degradation.// Appl.Environ.Microbiol., 1984, V.48, p.868-869.

58. Barnes W.M. Plasmid detection and sizing in single colony lysates.// Science, 1977, V.195, p.393.

59. Barkay Т., Liebert C. and Gillman M. Conjugal gene transfer to aquatic bacteria detected by generation of a new phenotype.// Appl.Environ.Microbiol., 1993, V.59, p.807-814.

60. Bayly R.C.,McKenzie D.I. Catechol oxygenases of Pseudomonas putida mutant strains.// J.Bacteriol., 1976, V.127, p.l 0981107.

61. Beil S., Kehrli H., James P., Staudenmann W., Cook A.M., Leisinger Т., Kertesz M.A. Purification and characterization of the arylsulfatase synthesized by Pseudomonas aeruginosa РАО during growth in sulfate-free medium, and cloning of the arylsulfatase gene (atsA).// Eur.J.Biochem., 1995, V.229, p.385-394.

62. Beil S., Kertesz M.A., Leisinger Т., Cook A.M. The assimilation of sulfur from multiple sources and its correlation with expression of the sulfate-starvation-induced stimulon in Pseudomonas putida S-313.// Microbiology-UK, 1996, V.142, N.8, p.1989-1995.

63. Benarde M.A., Koft B.W., Howath R., Shaulis Microbial degradation of the sulfonate of dodecyl benzene sulfonate.// Appl.Microbiol., 1965, V.13, p.l03-105.

64. Bertolacini R.J.,Barney J.E. Colorimetric determination of sulfate with barium chloranilate.// Anal.Chem.,1957, V.29, N.2, p.281-283.

65. Bestetti G., Galli E., Ruzzi M., Baldacci G., Zennaro E., Frontali L. Molecular characterization of plasmid from Pseudomonas fluorescens involved in styrene degradation.//Plasmid, 1984, V. 12, p. 181-188.

66. Bitton G. Wastewater microbiology. Wiley-Liss, New York-Chichester-Brisbane-Toronto-Singapore, 1994, p. 151-302.

67. Birnboim H.C. and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.// Nucleic Acid Res., 1979, V.7, p. 1513-1523.

68. Bird J.A., Cain R.B. Microbial degradation of alkylbenzenesulphonates by Vibrio sp.// Biochem.J., 1972, V.127, N.2, p.46.

69. Bird J.A., Cain R.B. Microbial degradation of alkylbenzenessulphonates: Metabolism of homologues of short alkyl-chain length of an Alkaligenes sp.// BiochemJ., 1974, V.140, N.2, p.121-134.

70. Bogan R.H. and Sawyer C.N. Biochemical degradation of synthetic detergents. II. Studies on the relation between chemical structure and biochemical oxidation.// Sewage Ind.Wastes, 1955, V.27, p.917-928.

71. Boronin A.M., Kochetkov V.V., Skryabin G.K Incompatibility groups of naphthalene degradative Pseudomonas.// FEMS Microbiol Lett., 1980, V.7, p.249-252.

72. Boronin A.M.,Naumova R.P.,Grishchenkov U.G.,Ilijinskaya O.N. Plasmids specifying E-caprolactam degradation in Pseudomonas.// FEMS Microbiol Lett, 1984, V.22, p. 167-170.

73. Boronin A.M. Diversity of Pseudomonas plasmids: To what exrent?// FEMS MicrobioLLetters, 1992, V.100, p.461-468.

74. Bossier P., Verstraete W. Comamonas testosteroni colony phenotype influences exopolysaccharide production and coaggregation with yeast cells.// Appl.Environ.Microbiol., 1996, V.62, N.8, p.2687-2691.

75. Bossier P., Kersters I., Verstraete W. Resistance to environmental stress by the mucoid end the non-mucoid variant phenotypes of the Comamonas testosteroni strain A20.// FEMS MicrobioLEcol., 1997, V.24, N.4, p.371-376.

76. Breen A., Jimenez L., Sayler G., Federle T. Plasmid incidence and linear alkylbenzene sulfonate biodégradation in wastewater and pristine pond ecosystems.// J.Inustr.Microbiol., 1992, V.9, p.37-44.

77. Brilon C., Beckmann W., Hellwig M., Knackmuss H.-J. Enrichment and isolation of naphthalenesulfonic acid-utilizing Pseudomonads.// Appl.Env.Microb., 1981, V.42, N1, p.39-43.

78. Brilon C.,Beckmann W.,Knackmuss H.-J. Catabolism of Naphthalenesulfonic acid by Pseydomonas sp.A3 and Pseudomonas sp.C22.// Appl.Env.Microb., 1981, V.42, N1, p.44-55.

79. Brunner P.H., Capri S., Marcomini A., Giger W. Occurence and behaviour of linear alkylbenzenesulfonates, nonylphenol, nonylphenol mono- and nonylphenol diethoxylates in sewage and sewage sludge treatment.// Water Res., 1988, V.22, p.1465-1472.

80. Burdon K. Fatty material in Bacteria and Fungi revealed by staining dried, fixed slide preparations.// J.Bacteriol., 1946, V.52, N.6, p.665-668.

81. Burlage R., Hooper S.W., Sayler G.S. The TOL (pWWO) catabolic plasmid.// Appl.Environ.Microb., 1989, V.55, N.6, p.1323-1328.

82. Busse H.-J., El-Banna T., Auling G. Evaluation of different approaches for identification of xenobiotic-degrading pseudomonads.// Appl.Environ.Microb., 1989, V.55, p.1578-1583.

83. Cain R.B. The metabolism of protocatechuic acid by a vibrio. //Biochem.J., 1961, V.79, p.298-312.

84. Cain R.B., Farr D.R. Metabolism of arylsulphonates by microorganisms.// BiochemJ., 1968, V.106, p.859-877.

85. Cain R.B. Microbial degradation of surfactants and 'builder' components. In: Microbial Degradation of Xenobiotics and Recalcitrant Compounds. Leisinger T.,Hutter R., Cook A.M., Nuesch J. - Eds., 1981, London, Academic Press, p.325-370.

86. Campbell J., Jacobsen C., Sorensen J. Species variation and plasmid incidence among fluorescent Pseudomonas strains isolated from agricultural and industrial soils.// FEMS Microb. Ecol., 1995, V.18, p.51-62.

87. Cane P.A., Williams P.A. The plasmid-coded metabolism of naphthalene and 2-methylnaphthalene in Pseudomonas strains: Phenotypic changes correlated with structural modification of the plasmid pWW60-l.// J.Gen.Microbiol., 1982, V.128, p.22812290.

88. Carney B.F., Leary J.V. Novel alterations in plasmid DNA assotiated with aromatic hydrocarbon utilization by Pseudomonas putida R5-3.// Appl.Environ.Microbiol., 1989, V.55, N.6, p.1523-1530.

89. Chakrabarty A.M. Genetic basis of the biodégradation of salicylate in Pseudomonas.// J.Bacteriol., 1972, V.l 12, p.815-823.

90. Chatfield L.K.,Williams P.A. Naturally occurring TOL plasmids in Pseudomonas strain carry either two homologous or two nonhomologous catechol 2,3-oxygenase genes.// J.Bacteriol., 1986, V.168, p.878-885.

91. Chien C.-C., Leadbetter E.R., Godchaux III W. Sulfonatesulfiir can be assimilated for fermentative growth.//FEMS Microb.Letters, 1995, V.129, N.2-3, p.189-195.

92. Clark-Walker G.D., Robinson H.C. //J.Chem.Soc., 1961, p.2810-2819.

93. Clarke P.H. and Ornston N. Metabolic pathways and regulation: II. In:Genetics and biochemistry of Pseudomonas, London - New York - Sydney - Toronto, John Wiley & Sons, 1975, p.,265-284.

94. Contzen M., Wittich R.-M., Knackmuss H.-J., Stolz A. Degradation of benzene 1,3-disulfonate by a mixed bacterial culture. // FEMS Microbiol.Letters, 1996, V.l36, N.l, p.45-50.

95. Cook A.M. and Leisinger T. Desulfonation of aromatic compounds. In: H.Verachtert and W.Verstraete (ed.) Environmental biotechnology. Koninklijke Vlaamse Ingenierusveniging. Brussels, 1991, p.353-367.

96. Cook A.M. Microbial degradation of benzensulfonates. Microbial degradation of environmental pollutants : potential and limitations for practical use. Materials of lOO.WE-Heraeus-Seminar. 2-4 Dec. 1992 at Physikzentrum Bad Honnef.

97. Cook A.M. Abbau von Arylsulfonaten.// BioEnineering, 1994, V.10, N.4, p.58-59.

98. Couturier M., Bex F., Bergquist P.L. and Maas W.K. Identification and classification of bacterial plasmids.// Microbiol. Rev., 1988, V.52, p.375-395.

99. Crawford R.L., Hutton S.W., Chapman P.J. Purification and properties of gentisate 1,2-dioxygenase from Moraxella osloensis.// J.Bacteriol., 1975, V.121, N.3, p.794-799.

100. Duggleby C.J., Bayley S.A., Worsey M.J., Williams P.A., Broda P. Molecular sizes and relationships of TOL plasmids in Pseudomonas.// J.Bacteriol., 1977, V.145, p.1274-1280.

101. Dunn N., Gunsalus I.C. Transmissible plasmid coding early ensymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida // J. Bacteriol., 1973., V.l 14, p.974-980.

102. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria.// Plasmid, 1978, V.l, p.584-588.

103. Endo K., Kondo H.,Ishimoto M. Degradation of benzenesulfonate to sulfite in bacterial exttract.// J.Biochem., 1977, V.82, p.1397-1403.

104. Evans C.G.T., Herbert D. and Tempest D.W. The continuous cultivation of microorganisms.// Methods in Microb., 1970, V.2, p.277-327.

105. Feigel B.J.,Knackmuss H.-J. Bacterial catabolism of sulfanilic acid via catechol-4-sulfonic acid.// FEMS Microbiol.let.,V.55, 1988, p.l 13-118.

106. Feigel B.J., Knackmuss H.-J. Syntrophic interactions during degradation of 4-aminobenzenesulfonic acid by a two species bacterial culture.// Arch.Microbiol., 1993, V.159, p.124-130.

107. Feist C.F., Hegeman G.D. Phenol and benzoat metabolism by Pseudomonas putida of tangential pathways.// J.Bacteriol., 1969, V.100, p.869-875.

108. Field J.A., Giger W., Cook A.M. Anaerobic degradation of LAS? // Chem.Eng.News., 1992, 70, p.3.

109. Figursky D. and Helinski D.R. Replication of an origin containing derivative of plasmid function provided in trans.// Proceeding of the National Academy of Science U.S.A., 1979, V.76, p.1648-1652.

110. Fisher P.R.,Appleton J.,Remberton J.M. Isolation and characterisation of the pesticide-degrading plasmids pJPl from Alcaligenes paradoxus.// J.Bacteriol., 1978, V.135, p.798-800.

111. Focht D.D., Williams F.D. The degradation of p-toluenesulphonate by a Pseudomonas.// Can.J.Microb., 1970, V. 16, p.309-316.

112. Fujisawa H., Hayaishi O. Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. //The Journal of Biological Chemistry . 1969. V.43, N 10, p. 2673-2681.

113. Fulthorpe R.R. Wyndham R.C., Transfer and expression of the catabolic plasmid pBR60 in wild bacterial recipients in a freshwater ecosystem. // Appl.Environ.Microbiol., 1991, V.57, p.1546-1553.

114. Gilardi G. Cultural and biochemical aspects for identification of glucose-nonfermenting Gram-negative rods.//Nonfermentative Gram-negative rods., New-York,Basel, Marcel Dekker Inc., 1985, V.16, p. 17-84.

115. Gledhill W.E. Screening test for assessment of ultimate biodegradability: linear alkylbenzene sulphonates.// Appl.Microb., 1975, V.30, N.6, p.922-929.

116. Gledhill H. Linear alkylbenzene sulfonate: Biodegradation and aquatic interaction.// Appl.and Environ.Microbiol., 1976, V.33, N.6, p.744-756.

117. Goodnow R.A., Harrison A.P.Jr. Bacterial degradation of detergent compounds.// Appl.Microbiol., 1972, V.24, N.4, p.555-560.

118. Goyal A.N. and Zylstra G.J. Molecular cloning of novel genes for polyciclic aromatic hydrocarbon degradation from Comamonas testosteroni GZ39.// Appl.Environ.Microbiol., 1996, V.62, N.l, p.230-236.

119. Hammer A., Stolz A., Knackmuss H.-J. Purification and characterization of a novel type of protocatechuate 3,4-dioxygenase with the ability to oxidize 4-sulfocatechol. // Arch.Microbiol., 1996, V.166, N.2, p.92-100.

120. Hammerton C. Observation on the decay of synthetic anionic detergents in natural waters.// J.Appl.Chem., 1955, V.5, p.517-524.

121. Harayama S., Don R.N. Catabolic plasmids: their analysis and utilization of bacterial metabolic activities. In the: Plasmids in bacteria., Proc.Conf.Urbana, 1984, p.283-307.

122. Harayama S., Timmis K. Catabolism of aromatic hydrocarbons by Pseudomonas. Genetics of bacterial diversity. Academic press, 1989, p. 152-172.

123. Hegeman G.D. Synthesis of the enzymes of the mandelate pathway by Pseudomonas putida.// J.Bacteriol., 1966, V.91, N.3, p.l 140-1154.

124. Herbert R.B. and Holliman F.G. Aeruginosin B - a naturally occurring phenazinesulfonic acid.//Proc.Chem.Soc., 1964, V.19.

125. Herrmann H., Janice D., Krejsa S., Kunze I. Involvement of plasmid pPGHl in the phenol degradation of Pseudomonas putida strain H.// FEMS Microbiol.Letters, 1987, V.43, p.133-137.

126. Hewetson L.,Dunn H.M., Dunn N.W. Evidence for a transmissible catabolic plasmid Pseudomonas putida encoding the degradation of p-cresol via the protocatechuate ortho cleavage pathway.// Genet.Res.Camb., 1978, V.32, p.249-255.

127. Hiraishi A., Masamune K., Kitamura H. Characterization of the bacterial population structure in an anaerobic-aerobic activated sludge system on the basis of respiratory quinone profiles.// Appl.Environ.Microbiol., 1989, V.55, p.897-901.

128. Hollender J., Dott W., Hopp J. Regulation of chloro- and methylphenol degradation in Comamonas testosteroni JH5.// Appl.and Environ. Microbiol., 1994, V.60, N.7, p.2330-2338

129. Horvath R.S., Koft B.W. Degradation of alkyl benzene sulphonate by Pseudomonas species.// Appl.Microbiol., 1972, V.23, N.2, p.407-414.

130. Huddleston R.L., Allred R.C. Microbial oxidation of sulfonated alkylbenzenes.// Dev.Ind.Microbiol., 1963, V.4, p.24-38.

131. Hugh R., Leifson E. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria.// J.Bacteriol., 1953, V.66, N.l, p.24-25.

132. Hurtubise Y., Barriault D., Sylvestre M. Characterization of active recombinant His-tagget oxygenase component of Comamonas testosteroni B-356 biphenyl dioxygenase.// J.Biol.Chem., 1996, V.271, p.8152-8160.

133. Inouye S., Nakazawa A., Nakazawa T. Molecular cloning of regulatory gene xylR and operator-promoter regions of the xylABC and xylDEFG operons of the TOL plasmid.//J.Bacteriol., 1983, V.155, p.l 192-1199.

134. Janke M.,El-Banna T.,Klintworth R.,Auling G. Mineralisation of orthanilic acid is a plasmid-associated trait in Alcaligenes sp.O-1.// J.Gen.Microbiol., 1990, 136, p.2241-2249.

135. Jimener L., Breen A., Thomas N., Federle T.W., Sayler G.S. Mineralisation of linear alkylbenzene sulfonate by a four-member aerobic bacterial consortium.// Appl.Envirom.Microbiol., 1991, V.57, p. 1566-1569.

136. Johnston J.B., Murray K., Cain R.B. Microbial metabolism of aryl sulphonates. A re-assessment of colorimetric methods for the determination of sulphite and their use in measuring desulphonation of aryl and alkylbenzene sulphonates.//Ant.van Leeuw., 1975, V.41, N 4, p.493-511.

137. Junker F., Field J.A., Bangerter F., Ramsteiner K., Kohler H.-P., Joannon C.L., Mason J.R., Leisinger T., Cook A.M. Oxygenation and spontaneous deamination of 2-aminobenzenesulphonic acid in Alcaligenes sp. strain 0-1 with subsequent meta ring cleavage and spontaneous desulphonation to 2-hydroxymuconic acid.// Biochem.J., 1994, V.300, p.429-436.

138. Junker F., Leisinger T. and A.M. Cook 3-Sulphocatechol 2,3-dioxygenase and other dioxygenases (EC 1.13.11.2 and EC 1.14.12.-) in the degradative pathways of 2-aminobenzenesulphonic, benzenesulphonic and p-toluenesulphonic acids in Alcaligenes sp. strain 0-1.// Microbiology-UK, 1994, V.140, N.7 p.1713-1722

139. Junker F., Sailer E., Oppenberg H.R.S., Kroneck P.M.H., Leisinger T., Cook A.M. Degradative pathways for p-toluenecarboxylate and p-toluenesulfonate and their multicomponent oxygenases in Comamonas testosteroni strains PSB-4 and T-2.// Microbiology-UK, 1996, V.142, N.9, p.2419-2427.

140. Junker F., Kiewitz R., Cook A.M. Characterization of the p-toluenesulfonate operon tsaMBCD and tsaR in Comamonas testosteroni T-2.// J.Bacteriol., 1997, V.179, N.3, p.919-927.

141. Kasak L., Horak R., Nurk A.,Talvik K., Kivisaar M. Regulation of the catechol 1,2-dioxygenase- and phenol monooxygenase-encoding pheBA operon in Pseudomonas putida PaW85.// J.Bacteriol, 1993, N.12, p.8038-8042.

142. Katsuhiko Ono, Mitsuhiro Nozaki, Osamu Hayaishi. Purification and some properties of protocatechuate-4,5-dioxygenase. // Biochimica et biophysica acta. 1970. V.220. P. 224-238.

143. Keil H., Keil S., Pickup R.W., Williams P.A. Evolutionary conservation of genes coding for meta pathway enzymes within TOL plasmids pWWO and pWW53.// J.Bacteriol., 1985, V.164, p.887-895.

144. Keil H. Molecular cloning and expression of a novel catechol 2,3-dioxygenase gene from the benzoate meta-cleavage pathway in Azotobacter vinelandii.// J.Gen. Microbiol, 1990, V.136, p.607-613.

145. Kellog S.T., Chatterjee D.K. Chakrabarty A.M. Plasmid assisted molecular breeding: new technique for enhanced biodégradation of persistent toxic chemicals.// Sciense, 1981, v.124, p.1133.

146. Kertesz M.A.,Leisinger T.,Cook A.M. Protein induced by sulfate limitation in Escherichia coli, Pseudomonas putida, or Staphylococcus aureus.// J.Bacteriol., 1993, V.175,p.ll87-1190.

147. Kertesz M.A., Kolbener P., Stockinger H., Beil S., Cook A.M. Desulfonation of linear alkylbenzenesulfonate surfactants and related compounds by bacteria.//Appl. Environ.Microbiol., 1994, V.60, N.7, p.2296-2303.

148. Kertesz M.A., Cook A.M., Leisinger T. Microbial metabolism of sulfur and phosphorus-containing xenobiotics.// FEMS Microbiol. Reviews, 1994, V.15, N.2-3, p.195-215.

149. Kertesz M.A. Desulfonation of aliphatic sulfonates by Pseudomonas aeruginosa PAO.// FEMS Microbiol.Letters, 1996, V.137, N.2-3, p.221-225.

150. Khlebnikov A., Peringer P. Biodegradation of p-toluenesulphonic acid by Comamonas testosteroni in an aerobic countercurrent structured packing biofilm reactor.// Water Science and Technology, 1996, V.34, N.5-6, p.257-266.

151. Kilbane J.J., Chatterjee D.K., Karns J.S. Kellog S.T., Chakrabarty A.M. Biodegradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by a pure culture of Pseudomonas sepacia.// Appl.Environ. Microbiol., 1983, V.44, p.72.

152. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.// J.Lab.Clin.Med., 1954, V. 44, p.301-307.

153. Kochetkov V.V., Starovoitov I.I., Boronin A.M., Skryabin G.K. Pseudomonas putida plasmid pBS241: Plasmid mediated biphenyl degradation.// Dokl.Akad.Nauk S S SR, 1982, V.226, p.241-243.

154. Kuhm A.E., Stolz A., Ngai K., Knackmuss H.-J. Purification and characterization of a 1,2-dihydroxynaphtalene dioxygenase from a bacterium that degrades naphtalenesulfonic acids.// J.Bacteriol., 1991, V.173, N 12, p.3795-3802.

155. Lee J.-H., Omori T., Kodama T. Identification of the metabolic intermediates of phthalate by TN5 mutants of Pseudomonas testosteroni and analysis of the 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase gene.//J.Ferment.Bioengineer., 1994, V.77, N.6, p.583-590.

156. Lee N., Clark D. A natural isolate of Pseudomonas maltophila which degrades aromatic sulfonic acids.//FEMS Microbiol.Letters.,1993,vol.107,N 2-3,p.l51-157.

157. Leidner H., Gloor R., Wuest D., Wuhrmann K. The influence of the sulfonic group on the biodegradability of n-alkanebenzenesulfonates.// Xenobiotica, 1980, V.10, p.47-56.

158. Levin B.R., Stewart F.M., Rice V.A. The kinetics of conjugative plasmid transmission: fit of a simple mass action model.// Plasmid, 1979, V.2, p.247-260.

159. Locher H.H., Thurnheer T., Leisinger T.,Cook A.M. 3-Nitrobenzenesulfonic acid, 3-aminobenzenesulfonic acid and 4-aminobenzenesulfonic acid as sole carbon sources for bacteria.// Appl.Environ.Microbiol.,1989, V.55, p.492-494.

160. Locher H.H., Leisinger T., Cook A.M. Degradation of p-Toluenesulphonic acid via sidechain oxidation, desulphonation and meta ring cleavage in Pseudomonas (Comamonas) testosteroni T-2.//J.Gen.Microbiol., 1989, V.135, p.1969-1978.

161. Locher H, Leisinger T.,Cook A. 4-Sulphobenzoate 3,4-dioxygenase, Purification and properties of desulphonative two-component enzyme system from Comamonas testosteroni T-2. //Biochem. J.,1991,V.173, p.833-842.

162. Locher H.H.,Leisinger T.,Cook A.M. 4-Toluene sulfonate methylmonooxygenase from Comamonas testosteroni T-2: purification and some properties of the oxygenase component.//J.Bacteriol., 1991, V.173, p.3741-3748.

163. Locher H.H., Poolman B., Cook A.M., Konings W. Uptake of 4-toluene sulfonate by Comamonas testosteroni T-2.// J.Bacteriol., 1993, V. 175, N.4, p. 1075-1080.

164. Mallakin A., Ward O.P. Degradation of BTEX compounds in liquid media and in peat biofilters.// industrial Microbiol., 1996, V.16, N.5, p.309-318.

165. Malle K.G. Wie schmutzig ist der Rhein? // Chemie in unserer Zeit., 1978, V.12, p.111-122.

166. Marcus P.I., Talalay P. Induction and purification of alfaand beta-hydroxysteroid dehydrogenases.// J.Biol.Chem., 1956, V.218, N.2, p.661-674.

167. McKinney R.E. and Symons J.M. Bacterial degradation of ABS. I. Fundamental biochemistry.// Sewage Ind.Wastes, 1959, V.31, N.5, p.549-556.

168. Mechsner K., Wuhrmann K. Cell permeability as a rate limiting factor in the microbial reduction of sulfonated azo dyes.// J.Appl.Microbiol.Biotechnol., 1982, V.15, p. 123-126.

169. Migula W. Shizomycetes.// Engler and Prante. Naturlichen pflanzenfamilien, 1895, p.29.

170. Moeller V., Simplified test for some amino acid decarboxylases and for the arginine dehydrolase system.// Acta pathol. et microbiol. scand., 1955, V.36, N.l, p.158-172.

171. Monticello D.J., Bakker D., Finnerty W.R. Plasmid-mediated degradation of dibenzothiophene by Pseudomonas species.// Appl.Environ.Microbiol., 1989, V.49, p.756-760.

172. Nakazawa T., Yakota T. Benzoate metabolism in Pseudomonas putida (arvilla) mt-z: Demonstration of two benzoate pathways. // J.Bacteriol., 1973, V.l 15, p.262-267.

173. Nakazawa T., Inouye S., Nakazawa A. Positive regulation and transcription initiation of XVL operon on TOL plasmid.// Plasmids in Bacteria, Eds.: Helinski D.R. et al., N.Y., Plenum press, 1985, p.425-430.

174. Nortemann B., Baumgarten J., Rast H.G., Knackmuss H.-J. Bacterial communities degrading amino- and naphthalene-2-sulfonates. // Appl.Environ.Microbiol., 1986, V.52, p.l 195-1202.

175. Nortemann B., Kuhm A.E., Knackmuss H.-J., Stolz A. Conversion of substituted naphthalenesulfonates by Pseudomonas sp BN6.// Archives of Microbiol., 1994, V.161, p. 320-327.

176. Novick R.P. Plasmid incompatibility.// Microbiol. Reviews, 1987, V.51, p.381-394.

177. Ochman M., Klubek B., Boydsun J., Clark D., Nabe S. Mineralization of S from dibenzothiophene, dibenzothiophene sulphone and benzene sulphonic acid by soil isolates.//Microbios, 1990, V.63, p.79-91.

178. Ohe T., Watanabe Y. Degradation of 2-naphtylamine-l-sulfonic acid by Pseudomonas strain TA-1.//Agric.Biol.Chem., 1986, V.50, N.6, p.1419-1426.

179. Ohe T., Watanabe Y. Microbial degradation of 1,6-naphthalenedisulfonic acid and 2,6-naphthalenedisulfonic acid by Pseudomonas sp. DS-1.// Agric.Biol.Chem., 1988, V.52, p.2409-2414.

180. Ohe T.,Ohmoto T., Kobayashi Y.,Sato A.,Watanabe Y. Metabolism of Naphtalenesulfonic acid by Pseudomonas sp. TA-2.// Agric. Biol.Chem.,1990, V.54, N.3, p.669-675.

181. Ohmoto T.,Sakai K., Hamada N., Ohe T. Salicylic acid metabolism through a gentisate pathway by Pseudomonas sp. TA-2.// Agric.Biol.Chem., 1991, V.55, N.7, p.1733-1737.

182. Ohmoto T., Sakai K., Hamada N., Ohe T. Conversion of naphthoates to cis-dihydrodiols by naphthalenesulfonateassimilating Pseudomonas sp.TA-2.// Biosc Biotechn.Biochem., 1996, V.60, N.5, p.00883-00885.

183. Ohwada K. Agar plate method for detection and enumeration of alkylbenzenesulphonate-degrading microorganisms.// Appl. Microbiol., 1975, V.29, N.l, p.40-43.

184. Ono K., Nozaki M., Hayashi O. Purification and some properties of protocatechuate 4,5-dioxygenase.// Biochim. Biophys. Acta, 1970, V.220, p.224-238.

185. Ornston M. and Ornston L.N. The regulation of b-ketoadipate pathway in Pseudomonas acidovorans and Pseudomonas testosteroni.// J.Gen.Microbiol., 1972, V.73, p.455-464.

186. Ornston L.N. The conversion of catechol and protocatechuate to b-ketoadipate by Pseudomonas putida. Ill Enzymes of the catechol pathway.// J.Biolog.Chem., 1966, V.241, p.3795-3799.

187. Ottow J.C.G., Zolg W. Improved procedure and colometric test for the detection of ortho- and meta-clevage of protocatechuate by Pseudomonas isolates.// Can.J.Microbiol., 1974, V.20, p.1059-1061.

188. Palleroni N.J., Doudoroff M., Stanier R.Y., Solanes R.E., Mandel M. Taxonomy of the aerobic pseudomonads: the properties of the Pseudomonas stutzeri group.// J.Gen.Microbiol, 1970, V.60, p.215-231.

189. Palleroni N.J. General properties and taxonomy of the genus Pseudomonas. In: Genetics and biochemistry of Pseudomonas, London-New York-Sydney-Toronto, John Wiley & Sons, 1975, p. 1-36.

190. Palleroni N.J. Genus Pseudomonas Migula 1894. In: Bergey's manual of systematic bacteriology, Baltimore-London, Williams & Wilkins, 1984, V.l, p. 141-198.

191. Palleroni N.J. Present situation of the taxonomy of aerobic pseudomonads. In: Pseudomonas: molecular biology and biotechnology, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1992, p.105-115.

192. Paszcynski A., Pasti-Grigsby M.B., Goszczynski S., Crawford R.L., Crawford D.L. Mineralization of sulfonated azo dyes and sulfanilic acid by Phanerochaete chrysosporium and Streptomyces chromofuscus.// Appl.Environ.Microbiol., 1992, V.58, N.ll, p.3598-3604.

193. Payne W.J., Feisal V.E. Bacterial utilization of dodecyl sulphate and dodecyl benzene sulphonate.// Appl.Microbiol., 1963, V.l 1, N.2, p.339-344.

194. Pickup R.W., Lewis R.J., Williams P.A. Pseudomonas sp.MT14, a soil isolate which contain two large catabolic plasmids, one a TOL plasmid and one coding for phenylacetate catabolism and mercury resistance.// J.Gen.Microbiol., 1983, V.129, p.153-158.

195. Reemtsma T. Methods of analysis of polar aromatic sulfonates from aquatic environments.// J.Chromatogr., 1996, V.733, p.473-489.

196. Rheinwald J., Chakrabarty A.M. Gunsalus I.C. A transmissible plasmids controlling camphor oxidation in Pseudomonas putida. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1973, V.70, p.885-889.

197. Ribbons D.W. & Evans W.C. Oxidative metabolism of protocatechuic acid by certain soil pseudomonads: a new ring-fission mechanism.// Biochem.J., 1961, V.83, p.482-492.

198. Ripin M.J., Noon K.F., Cook T.M. Bacterial metabolism of arylsulphonates. Benzene sulphonate as growth substrate for Pseudomonas testosteroni H-8.// Appl.Microbiol., 1971, V.21, p.495-499.

199. Ripin M.J., Noon K.F., Cook T.M. Bacterial metabolism of arylsulphonates: role of meta-cleavage in benzene sulphonate oxidation by Pseudomonas testosteroni.// Appl.Microbiol., 1975, V.29, N.3, p.382-387.

200. Robert-Gero M., Poiret M., Stanier R.Y. The function of b-ketoadipate pathway in Pseudomonas acidovorans.// J.Gen. Microbiol., 1969, V.57, p.207-214.

201. Rochelle P.A., Fry J.C., Day M.J., Bale M.J. An accurate method for estimating sizes of small and large plasmids and DNA fragments by gel electrophoresis.// J.General Microb., 1985, V.132, p.53-59.

202. Rosello-Mora R.A., Laluoat J., Garoia-Valdes E. Comparative biochemical and genetic analysis of naphthalene degradation among Pseudomonas stutzeri strains.// Appl.Environ.Microbiol., 1994, V.60, p.966-972.

203. Rozgaj R. and M.Glancer-Soljan Total degradation of 6-aminonaphthalene-2-sulphonic acid by mixed culture consisting of different bacterial genera.// FEMS Microbiol.Ecol., 1992, V.86, p.229-235.

204. Sanseverino J., Applegate B.M., King J.M., Sayler G.S. Plasmid-mediated mineralization of naphthalene, phenanthrene and anthracene.// Appl.Environ.Microbiol., 1993, V.59, N.6, p.1931-1937.

205. Schlafli H.R., Weiss M.A., Leisinger T. and A.M. Cook Terephthalate 1,2-dioxygenase system from Comamonas testosteroni T-2: Purification and some properties of the oxygenase component. // J. of Bacteriol., 1994, V.176, N.21, p.6644-6652

206. Schlafli H.R., Baker D., Leisinger T., Cook A.M. Stereospecifity of hydride removal from NADH by reductases of multicomponent non-heme iron oxygenase system.// J.Bacteriol., 1995, V.177, p.831-834.

207. Schoberl P. Basic principles of LAS biodégradation.// Tenside Surfactant Deterg., 1989, V.26, p.86-94.

208. Seitz A.P., Leadbetter E.R. and Godchaux III,W. Utilization of sulfonates as sole sulfur source by soil bacteria including Comamonas acidovorans.// Arch.Microbiol., 1993, V.159, p.440-444.

209. Shirley F., Spain N., Spain J. Oxidative pathway for the biodégradation of nitrobenzene by Comamonas sp. strain JS765. // Appl.Environ.Microbiol., 1995, V.61, p.2308-2313.

210. Sierra J. A simple method for the detection of lipolytic activity of microorganisms and some observations in the influence of the contact between cells and fatty substrates.// Antoni van Leeuwenhoek J.Microbiol and Serol., 1957, V.23, N.l, p.15-16.

211. Sigoillot J.-C., Nguyen M.-H. Isolation and characterization of surfactant degrading bacteria in a marine environment.// FEMS Microbiol.Ecol., 1990, V.73, p.59-68.

212. Sigoillot J.-C., Nguyen M.-H. Complexe oxidation of linear alkylbenzene sulfonate by bacterial communities selected from coastal seawater.// Appl.Environ.Microbiol., 1992,v.58, N.4, p.1308-1312.

213. Simon R., Prifer U., Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engeneering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria.// J.Biotechnology, 1983, V.l, p.784.

214. Simonsen L. Dynamics of plasmid transfer on surfaces.// J.of General Microbiol., 1990, V.136, p.1001-1007.

215. Simonsen L., Gordon D.M., Stewart F.M., Levin B.R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method.// J.General Microbiol., 1990, V.136, N.ll, p.2319-2325.

216. Sinclair M.I., Maxwell P.C., Lyon B.R., Holloway B.W. Chromosomal location of TOL plasmid DNA in Pseudomonas putida. //J.of Bacteriol., 1986, V.l68, p. 13021308.

217. Sistrom W.R.,Stanier R.Y. The mechanism of formation of b-ketoadipate by bacteria.// J.Biol.Chem., 1954, V.l20, p.821-836.

218. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.//J.Molec.Biology. 1975, V.98, p.503-517.

219. Sparnins V.L., Chapman P.J., Dagley S. Bacterial degradation of 4-hydroxyphenylacetic acid and homoprotocatechuic acid.// J.Bacteriol., 1974, V.l20, p.159-167.

220. Stanier R.Y. The oxidation of aromatic compounds by fluorescent pseudomonads.// J.Bacteriol., 1947, V.54, N.2, p.339-348.

221. Stanier R.Y.,Palleroni N.J.,Doudoroff M. The aerobic Pseudomonads: a taxonomic study,//J.Jen.Microbiol., 1966, V.43, p.159-271.

222. Swisher R.D. Biodégradation of ABS in relation to chemical structure.//JWPCF,

1963, V.35, p.877-892.

223. Swisher R.D. LAS benzene rings: Biodégradation and acclimation studies.// Yukagaku, 1972, V.21, p.130-142.

224. Swisher R.D. Surfactant biodegradation.2nd ed.Marcel Dekker, New York, 1987.

225. Symons J.M. and del Valle Rivera L.A. Metabolism of organic sulfonates by activated sludge.// Purdue Conf., 1961, V.16, p.555-571.

226. Tabatabai M.A. Determination of sulfate in water samples.// Sulf. Inst J., 1974, V.10, p.11-13.

227. Taber W.A., Wiley B.B. Antimicrobial activity of monoalkylbenzene sulphonate complex.// Can.J.Microbiol., 1962, V.8, N.5, p.621-628.

228. Tamaoka J.,Ha D.-M., Komagata K. Reclassification of Pseudomonas acidovorans den Dooren de Jong 1926 and Pseudomonas testosteroni Marcus and Talalay 1956 as Comamonas acidovorans comb. nav. and Comamonas testosteroni comb, nov., with an emended description of the genus Comamonas.// International Jornal of Systematic Bacteriology, 1987, V.37, N.l, p.52-59.

229. Thacker R., Rorvig O., Kahlon P., Gunsalus I.C., NIC, conjugative nicotine-nicotinate degradative plasmid in Pseudomonas convexa.// J.Bacteriol., 1978, V.135, p.289-290.

230. Thurnheer T., Kohler T., Cook A.M., Leisinger T. Orthanilic acid and analogues as carbon sources for bacteria: growth physiology and enzymatic desulfonation.// J.Gen.Microbiol., 1986, v.132, p.1215-1220.

231. Thurnheer T., Cook A.M., Leisinger T. Co-culture of defined bacteria to degrade seven sulfonated aromatic compounds: efficiency, rates and phenotypic variations.// Appl.Microbiol. Biotechnol., 1988, v.29, p.605-609.

232. Thurnheer T., Zunner D.,Hodlinger 0.,Leysinger T.,Cook A. Initial steps in the degradation of bensene sulfonic acid, 4toluene sulfonic acid and orthanilic acid in Alcaligenes sp. strain 0-1.//Biodégradation 1, 1990, p.55-64.

233. Toth D., Huska J., Zavadska I., Dobrotova M. Effect of bacterial starvation on surfactant biotransformation.// Folia Microbiologica, 1996, V.41, N.6, p.477-479.

234. Trevors J.T., Plasmid curing in bacteria.// FEMS Microbiol. Reviews, 1986, V.32, p.149-157.

235. Trevors J.T., Barkay T. and Bourquin A.W. Gene transfer among bacteria in soil and aquatic environments: a review.// Can. J. Microbiol., 1987, V.33, p. 191-198.

236. Valla S., Coucheron D.H., Kjosbakken J. The plasmids of Acetobacter xylinum and their interaction with the host chromosome.// Mol.Gen.Genet., 1987, V.208, p.76-83.

237. Vandenbergh P.A., Olsen R.H., Colaruotolo J.F., Isolation and genetic characterization of bacteria that degrade chloroaromatic compounds.// Appl.Environ.Microbiol., 1981, V.42, p.737-739.

238. Van Elsas J.D.,Trevors J.T., Starodub M.E.,Van Overbeek L.S. Transfer of plasmid RP4 between pseudomonads after introduction into soil, influence of spatial and temporal aspects of inoculation.//FEMS Microbiol.Ecol., 1990, V.73, N.l, p. 1-12.

239. Wayman C.H., Robertson J.B. Biodégradation of anionic and nonionic surfactants under aerobic and anaerobic condition.// Biotechnol.and Bioeng., 1963, V.5, N.3, p.367-384.

240. Wheatcroft R., Williams P.A., Rapid method for the study of both stable and unstable plasmids in Pseudomonas.// J.General Microbiol., 1981, V.124, p.433-437.

241. Wheelis M.C., N.J. Palleroni, R.Y. Stanier The metabolism of aromatic acids by Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans.// Arch.Microbiol., 1967, V.59, p.303-314.

242. Wickham G.S. and Atlas R.M. Plasmid frequency fluctuation in bacterial populations from chemically stressed soil communities.// Appl. Environ. Microbiol., 1988, V.54, p.2192-2196.

243. Willets A.J. Microbial metabolism of alkylbenzenesulphonates// Antonie van Leeuwenhoek J.Microbiol.Serol.,1970, V.42, N.3, p.287-292.

244. Willets A.J. Microbial metabolism of alkylbenzene sulphonates: Enzyme system of a Bacillus species responsible for b-oxidation of the alkyl side chain of alkylbenzene sulphonates.// Antonie van Leeuwenhoek J.Microbiol.Serol., 1972, V.38, N.4, p.543-555.

245. Willets A.J.Microbial metabolism of alkylbenzene sulphonates: Fungal metabolism of 1-phenylundecane-p-sulphonate and lphenyldodecane-p-sulphonate. // Antonie van Leeuwenhoek J.Microbiol.Serol., 1973, V.39, N.4, p.585-597.

246. Willets A.J. How detergents are degraded biologically.// Environ.Change, 1973, V.2, p.110-116.

247. Willets A.J.Microbial metabolism of alkylbenzene sulphonates: The oxidation of key aromatic compounds by Bacillus. // Antonie van Leeuwenhoek J.Microbiol. Serol., 1974, V.40, N.4, p.547-559.

248. Willets A.J., Cain R.B. Microbial metabolism of alkylbenzene sulphonates. // Biochem.J., 1972, V.129, N.3, p.389-402.

249. Willets A.J., Cain R.B. Microbial metabolism of alkylbenzene sulphonates. Bacterial metabolism of undecylbenzene-psulphonate and dodecylbenzene-p-sulphonate.//Biochem.J., 1972, vol.129, p.389-402.

250. Williams P.A., Murray K. Metabolism of benzoate and the methylbenzoate by Pseudomonas putida (arvilla) mt-2: evidence for the existence of a TOL plasmid.// ¿Bacterid., 1974, V.120, p.416-423.

251. Williams P.A., Worsey M.J. Ubiquity of plasmids in coding for toluene and xylene metabolism in soil bacteria: Evidence for the existence of new TOL plasmids.// J.Bacteriol., 1976, V.125, p.818-828.

252. Wittich R.M., Rast H.G., Knackmuss H.-J., Degradation of naphthalene-2,6- and naphthalene-1,6-disulfonic acid by a Moraxella sp.// Appl.Environ.Microbiol., 1988,V.54,p. 1842-1847.

253. Wong C., Dunn N.W. Transmissible plasmid coding for the degradation of benzoate and m-toluate in Pseudomonas arvilla mt-2.// Genet.Res., 1974, V.29, p.227-232.

254. Yamaguchi M., Yamaguchi T., Fujisawa H. // Biochem.Biophys. Res.Commun., 1975, V.67, N.l, p.264-268.

255. Zurrer D., Cook A., Leisinger T. Microbial desulfonation of substituted naphtalenesulfonic acids and benzenesulfonic asids. //Appl.Env.Microb., 1987,vol.53,N 7,p.l459-1463.

256. Zylstra G.J., Gibson D.T. Toluene degradation by Pseudomonas putida Fl: nucleotide sequence of the todCIC2BADE genes and their expression in Escherichia coli.// J.Biol.Chem., 1989, V.264, p. 14940-14946.

Считаю своим долгом поблагодарить своего научного руководителя, Александра Михайловича Воронина за неоценимую помощь и ценные рекомендации в планировании экспериментов, интерпретации результатов и редактировании диссертации.

Я признателен всему коллективу лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН за поддержку и помощь в работе.

Хочу выразить благодарность персонально:

Александру Николаевичу Дубейковскому за помощь в планировании и проведении экспериментов по клонированию генов биодеградации.

Владимиру Германовичу Грищенкову за моральную поддержку и внимание.

Ренату Рашидовичу Гаязову за моральную поддержку и внимание.

Михаилу Утевлевичу Аринбасарову за помощь в изоляции метаболитов.

Владимиру Матвеевичу Аданину за помощь в идентификации метаболитов.

Анатолию Николаевичу Решетилову за плодотворное сотрудничество в создании биосенсора на ароматические сульфонаты.

Павлу Владимировичу Ильясову за помощь в определении скорости окисления сульфоароматических субстратов бактериями.

Михаилу Борисовичу Вайнштейну за помощь в идентификации бактериальных штаммов.

Наталье Григорьевне Винокуровой за помощь в синтезе 2,4-динитроанилиномалеимида.

Анатолию Викторовичу Наумову за помощь в оформлении диссертации и публикаций по теме исследований.

Андрею Евгеньевичу Филонову за предоставление компьютерной базы для оформления диссертации.