Галотолерантные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Алтынцева, Ольга Викторовна

• Алтынцева, Ольга Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алтынцева, Ольга Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микроорганизмы-деструкторы полициклических ароматических углеводородов.

1.2. Метаболические пути деструкции нафталина и фенантрена.

1.2.1. Биохимические пути утилизации нафталина микроорганизмами.

1.2.2. Метаболические пути разложения фенантрена бактериями.

1.3. Генетические системы биодеградации ПАУ.

1.3.1. Структурно-функциональная организация генетических систем деградации нафталина у бактерий.

1.3.2. Генетические системы биодеградации фенантрена.

1.4. Галофильные микроорганизмы.

1.4.1. Микробная деструкция углеводородов в условиях повышенного содержания NaCl

1.4.2. Механизмы галоадаптации у микроорганизмов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Среды и условия культивирования.

2.3. Накопительные культуры.

2.4. Определение ростовых характеристик.

2.5. Таксономическая характеристика микроорганизмов.

2.6. Выделение и рестрикция плазмидной ДНК.

2.7. Коньюгационный перенос плазмидной ДНК.

2.8. Элиминация бактериальных плазмид.

2.9. Определение стабильности признаков биодеградации ПАУ.

2.10. Определение активностей ферментов биодеградации ПАУ.

2.11. Анализ метаболитов ПАУ методом тонкослойной хроматографии

2.12. Скрининг бактериальных культур методом отпечатков.

2.13. Статистическая обработка.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Образцы почвы, донных отложений и их характеристика.

3.2. Выделение и характеристика штаммов-деструкторов нафталина, фенантрена, бифенила.

3.2.1. Выделение штаммов-деструкторов ПАУ.

3.2.2. Идентификация штаммов-деструкторов ПАУ.

3.2.3. Характеристика деградативных способностей штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена.

3.2.4. Влияние повышенных концентраций хлорида натрия на рост бактерий-деструкторов ПАУ.

3.2.5. Роль плазмид в деградации ПАУ и устойчивости бактерий к повышенным концентрациям NaCl.

3.3. Накопительные культуры микроорганизмов.

3.3.1. Характеристика накопительных культур, инкубированных на полноценных средах с различным содержанием хлорида натрия.

3.3.2. Характеристика накопительных культур микроорганизмов, инкубированных на минеральной среде Раймонда с нафталином при повышенных концентрациях хлорида натрия.

3.3.3. Микробное сообщество, осуществляющее деструкцию нафталина при повышенных концентрациях NaCl.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Галотолерантные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов»

Актуальность проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), к которым относятся нафталин, фенантрен, антрацен, являются одними из наиболее распространенных загрязнителей окружающей среды. Данные соединения содержатся в нефти, продуктах ее переработки, отходах коксохимического и других химических производств, образуются при неполном сгорании различных видов топлива. Многие из данных соединений являются устойчивыми токсичными веществами, при разложении которых возможно накопление опасных метаболитов. Низкая растворимость данных соединений в воде способствует накоплению ПАУ в различных экосистемах, прежде всего в почве и водных системах.

В окружающей среде ПАУ могут подвергаться абиотической деградации вследствие фотолитического и химического окисления, при котором образуется ряд токсичных продуктов. Однако основную роль в утилизации данных соединений играет микробная деструкция. ПАУ подвергаются утилизации или частичной трансформации, как отдельными штаммами микроорганизмов, так и микробными сообществами.

В связи с этим все большую актуальность приобретает проблема изучения биодеградации ПАУ и возможность использования микроорганизмов-деструкторов в процессах биоремедиации почв и стоков, загрязненных данными соединениями. В ряде случаев почвы, загрязненные данным классом трудноразлагаемых соединений, подвергаются воздействию других неблагоприятных факторов, в частности повышенной концентрации солей. Одним из распространенных источников загрязнения почв является разработка нефтяных месторождений, микрофлору которых характеризует устойчивость к экстремальным условиям нефтяного пласта, таким как высокая соленость пластовых вод и рассолов. Деятельность ряда промышленных предприятий, в частности соледобывающих производств, также создают повышенную минерализацию почв и стоков. Это значительно ограничивает применение для биоремедиации таких почв штаммов микроорганизмов, не являющихся представителями местной микрофлоры, адаптированной к экстремальным факторам существования.

В связи с этим особый интерес вызывает изучение разнообразия микроорганизмов и их сообществ, выделенных из экониш с высоким уровнем загрязнения ПАУ и повышенным содержанием солей, а также исследование биохимических и генетических систем биодеградации ПАУ у отдельных представителей данных микробиоценозов. Такие исследования позволят расширить наши представления о распространении микроорганизмов-деструкторов ПАУ в природе,, об особенностях микробной деградации полициклических ароматических углеводородов в экстремальных условиях (в условиях засоления) и внести существенный вклад в разработку новых эффективных биотехнологических методов очистки окружающей среды.

Состояние вопроса. К настоящему времени накоплен большой объем информации о способности бактерий, выделенных из загрязненных почв и водных систем, использовать ряд ПАУ в качестве единственного источника углерода и энергии [57, 93, 174]. Наиболее изученными являются микроорганизмы, разлагающие нафталин. Способность к утилизации нафталина до метаболитов основного обмена изучена у ряда почвенных бактерий рода Pseudomonas, в частности у P.putida [152], P. stutzeri [164], P. aeruginosa [66], а также у представителей родов Nocardia, Bacillus, Rhodococcus [63, 129, 153]. Позднее была обнаружена способность микроорганизмов к деградации ароматических углеводородов, содержащих в своем составе три бензольных кольца, таких как фенантрен и антрацен. Способность к деструкции фенантрена обнаружена у бактерий родов Pseudomonas, Brevibacterium, Nocardioides, Arthrobacter [111, 119, 149, 165], деградации фенантрена наряду с трансформацией антрацена и флюорена -Acidovorax, Sphingomonas, Pseudomonas [175, 199]. Микроорганизмы, способные к трансформации ароматических углеводородов с четырьмя и пятью бензольными кольцами - флюоронафтена, пирена, бензпирена, идентифицированы как представители рода Rhodococcus, Alcaligenes, Mycobacterium, Sphingomonas [47, 52, 49, 200].

Катаболические пути и генетические системы деструкции ПАУ наиболее полно описаны для бактерий-деструкторов нафталина. Полный катаболизм нафталина через салицилат с использованием мета-пути расщепления катехола обнаружен у ряда почвенных бактерий рода Pseudomonas, Nocardia, Rhodococcus [92, 87, 151, 152]. Окисление нафталина до салициловой кислоты, с высвобождением пирувата и накоплением салициловой кислоты в ростовой среде описано для Pseudomonas putida OUS82 [125], полный катаболизм нафталина через гентизиновую кислоту -Pseudomonas sp. U2 [84], полный катаболизм нафталина с использованием орто-пут расщепления катехола - Pseudomnas putida М313 [16]. Известны два возможных пути минерализации фенантрена с образованием 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты как ключевого промежуточного продукта: декарбоксилирование 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты с образованием 1,2-дигидроксинафталина, который расщепляется до салициловой кислоты и катехола [80]; и расщепление 1-гидрокси-2-нафтоата до о/шо-фталата и протокатехата [47].

На примере ряда бактерий-деструкторов нафталина и фенантрена было показано, что начальное окисление широкого круга ПАУ обусловлено работой одной системы ферментов, обладающих широкой субстратной специфичностью [125, 199].

В литературе представлена подробная информация по генетическому контролю биодеградации нафталина. В штаммах почвенных бактерий обнаружены плазмиды, контролирующие полное окисление нафталина и салициловой кислоты (плазмида NAH7) или частичное окисление нафталина до салицилата (плазмида pWW60) [166, 199]. Окисление салицилата до катехола с дальнейшим расщеплением последнего по орто-пуш контролируется хромосомными генами [75]. На хромосоме могут быть полностью локализованы гены окисления нафталина и салицилата [164], или расположены гены только верхнего пути деградации нафталина [126]. О бактериальных генетических системах деструкции высокомолекулярных ПАУ в настоящее время известно немного. У ряда штаммов рода Pseudomonas обнаружены плазмиды, контролирующие деградацию фенантрена, антрацена, нафталина. Данные плазмиды имеют участки гомологичные генам верхнего и нижнего пути утилизации нафталина плазмиды NAH7 [17]. Обнаружена значительная гомология генетических систем среди широкого круга нафталин- и фенантрен-деградирующих штаммов [183]. В то же время низкий уровень гомологии наблюдается среди видовых линий или среди штаммов, способных к деградации ПАУ с высоким молекулярным весом [129, 206].

В настоящее время в литературе описаны лишь ограниченные и несистематизированные данные о способности бактерий к трансформации или деструкции токсичных ксенобиотиков при высоких концентрациях солей. Известно, что в условиях высокого засоления среды сильнее ингибируется микробная деструкция ароматических и других гидрофобных соединений, чем растворимых субстратов [138]. В ряде работ описывается способность микроорганизмов к деструкции ароматических субстратов в условиях повышенного засоления среды. Выделен почвенный штамм Alcaligenes faecalis, утилизирующий фенол при 5.6 % солености среды, а также штамм Alteromonas sp., деградирующий высокотоксичные органофосфорные соединения в присутствии 2-24 % соли в среде [43, 70]. Известна способность умеренногалофильного штамма Pseudomonas halodurans, растущего при концентрации NaCl от 1.8 % до 15.5 %, к утилизации бензоата и других ароматических соединений через орто-расщепление ароматического кольца [162]. Микроорганизмы, принадлежащие к семейству Halomonadaceae, выделенные из засоленных почв, загрязненных гербицидами, являются умеренными галофилами и способны к утилизации ароматических соединений, включая бензойную кислоту, 3-хлорбензойную кислоту и 4-хлорфенол при 1 М NaCl [133]. Способность к утилизации бензола обнаружена у почвенного штамма рода Rhodococcus, толерантного к 6 % NaCl в среде, что позволяет применять его для биоремедиации морских экосистем, загрязненных разливами нефти [132].

Утилизация полиароматических и алифатических углеводородов нефти обнаружена у ряда морских организмов. Способность к деградации нафталина, бифенила и фенантрена, а также трансформации высокомолекулярных ПАУ, таких как, флюорен, антрацен, аценафтен, обнаружена у морских микроорганизмов рода Cycloclasticus и Vibrio [90]. Описана утилизация нафталина и его метилированных производных, а также кометаболизм аценафтена штаммом морского микроорганизма Neptunomonas naphthovorans NAG-2N-126 [103]. Для данных микроорганизмов с широким субстратным рядом утилизируемых ПАУ необходимо как минимум 1 % засоление среды, а оптимальная минерализация среды составляет 2.9-3.4 % [91]. Как показали Emerson и Breznac, галофильные, толуат-утилизирующие смешанные культуры бактерий способны к росту в присутствии от 1 % до 13-13.5 % NaCl. Выделенные из данных культур штаммы, утилизирующие толуат, были устойчивы к присутствию в среде не более 10 % NaCl, однако в присутствии глюкозы в качестве источника углерода и энергии бактерии способны к росту при концентрации NaCl 20 % [78].

Установлено, что способность некоторых галотолерантных бактерий к росту при повышенном засолении среды связана с присутствием определенных плазмид, однако в литературе представлены ограниченные сведения о плазмидах у галофильных и галотолерантных штаммов [82]. Как показали исследования Vreeland, элиминация плазмиды штамма Halomonas elongata, приводила к потере способности клеток к росту в присутствии

3.4 M NaCl [188]. Бактерии Spirillum luteum, растущие при концентрации соли в среде до 1.2 М, после элиминации плазмид были способны расти на средах, содержащих не выше 0.7 М NaCl [187].

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение деструкции нафталина и фенантрена отдельными штаммами и сообществами микроорганизмов, выделенными из почв и донных отложений с высоким содержанием хлорида натрия.

В задачи исследования входило:

1. Выделение и идентификация микроорганизмов, способных к деградации нафталина и фенантрена, из почв и донных отложений, загрязненных отходами производств ОАО "Уралкалий".

2. Изучение метаболических путей деградации нафталина и фенантрена у грамположительных и грамотрицательных бактерий-деструкторов.

3. Исследование физиологических характеристик и деструктивных свойств выделенных штаммов при выращивании их на средах с разным содержанием хлорида натрия.

4. Изучение генетического контроля деградации ПАУ и способности к росту в условиях повышенного содержания NaCl в среде у выделенных штаммов-деструкторов.

5. Изучение природных сообществ микроорганизмов, способных разлагать нафталин в условиях высокого содержания NaCl.

Научная новизна. Создана лабораторная коллекция бактерий-деструкторов нафталина, фенантрена, бифенила и галофильных микроорганизмов, которые были выделены из образцов почв и донных отложений, отобранных в районе соледобывающего производства г. Березники Пермской области. Впервые подробно изучены и охарактеризованы галотолерантные бактерии, способные к использованию нафталина (фенантрена), как единственного источника углерода и энергии. Установлено, что данные нггаммы-деструкторы являются грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами, которые были отнесены к родам: Rhodococcus, Arthrobacter (группы A. globiformis и A. nicotianae), Bacillus и Pseudomonas. Исследуемые штаммы характеризуются обширным деградативным потенциалом: среди 12 исследованных штаммов-деструкторов нафталина, 6 штаммов способны к росту на фенантрене, 4 штамма - на бифениле, 3 штамма - на октане и 2 штамма - на феноле. Для большинства штаммов характерно наличие плазмид. Плазмиды из штаммов Pseudomonas spp. (SN11, SN101 и G51) являются конъюгативными и содержат гены деградации нафталина, салицилата. Обнаружено, что трансконъюгантные штаммы, полученные при переносе плазмиды из галотолерантного штамма Pseudomonasputida SN11 в бесплазмидный штамм P. putida BS394 (cys~ nah~ sal'), приобретают способность к росту на средах с повышенным содержанием хлорида натрия. Установлено, что штамм-деструктор фенантрена Arthrobacter globiformis SF27 способен к деструкции фенантрена при концентрации NaCl до 0.7 М и является умеренным галотолерантом. Впервые были выделены и охарактеризованы сообщества микроорганизмов, способные к росту на нафталине при содержании в среде культивирования до 2.5 М NaCl. Установлено, что в состав одной из таких микробных ассоциаций входят галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ (.Brevibacterium sp. и Arthrobacter spp.) и галофильные микроорганизмы (.Halomonas sp.).

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на конференции молодых ученых и студентов "Проблемы химии и экологии", г. Пермь, 1999; Региональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", г. Пермь, 1999; VII Молодежной научной конференции "Актуальные проблемы биологии и экологии", г. Сыктывкар, 2000; XXXVIII Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", г. Новосибирск, 2000; IV и V

11

Международных семинарах-презентациях инновационных научно-технических проектов "Биотехнология-2000" и "Биотехнология-2001" (г. Пущино, 2000, 2001); Международном семинаре "Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса" (г. Пермь, 2001); Organic Soil Contaminants 2001: SETAC, Europe Conference Copenhagen (Denmark, 2001); V Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды" (Волгоград - Пермь, 2001).

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в т.ч. 1 статья в журнале "Микробиология" (2001, №1, С. 61-69).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Алтынцева, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Из почв и донных отложений района солеразработок выделены чистые культуры и сообщества микроорганизмов, способные использовать нафталин и фенантрен в качестве единственного источника углерода и энергии. Среди десяти подробно охарактеризованных штаммов-деструкторов нафталина, отнесенных к родам Rhodococcus, Arthrobacter (вид A. globiformis и A. nicotianae), Bacillus и Pseudomonas, шесть штаммов способны к росту на фенантрене, три штамма - на бифениле и два штамма - на феноле.

2. Выделенные штаммы-деструкторы полициклических ароматических углеводородов являются галотолерантными микроорганизмами. Показана способность штамма Pseudomonas putida SN11 к росту на нафталине при концентрации NaCl до 1 М и штамма Arthrobacter globiformis SF27 - к росту на фенантрене при концентрации NaCl до 0.7 М.

3. Установлено, что разложение нафталина штаммом Pseudomonas putida SN11 происходит через салицилат и катехол, а фенантрена - через 1-гидрокси-2-нафтоат и салицилат. Штамм Arthrobacter globiformis SF27 осуществляет деструкцию нафталина через салицилат, с последующим его расщеплением через гентизат или катехол; утилизация фенантрена происходит через 2-карбоксибензальдегид и орто-фталат.

4. У исследованных бактерий обнаружены плазмиды с молекулярными массами от 85 тпн до 120 тпн. Плазмиды из штаммов рода Pseudomonas являются конъюгативными и содержат гены деградации нафталина, салицилата. У штамма Arthrobacter globiformis SF27 гены, участвующие в деструкции фенантрена и нафталина, также локализованы на плазмиде.

5. Установлено, что трансконъюгантные штаммы, полученные при переносе плазмиды из галотолерантного штамма Pseudomonas putida SN11 в штамм

116

P.putida BS394 (cys~ nah~ sal'), приобретают способность к росту на нафталине при концентрации NaCl до 0.7 М.

6. Изолировано сообщество микроорганизмов, способное к росту на нафталине при концентрациях хлорида натрия до 2.5 М. Установлено, что данное сообщество состоит как минимум из трех галотолерантных грамположительных бактерий-деструкторов ПАУ и галофильного грамотрицательного штамма, не способного к утилизации полициклических ароматических углеводородов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В большинстве случаев загрязнение объектов окружающей среды в промышленных районах носит комплексный, полихимический характер. Наряду с загрязнением почв и седиментов органическими соединениями различной структуры, включая ароматические и алифатические углеводороды, данные территории могут испытывать высокие нагрузки, связанные с добычей, переработкой минерального сырья и широким использованием неорганических продуктов. Возможность микробной деструкции ПАУ в данных условиях определяется устойчивостью бактерий к повышенной минерализации среды и способностью проявлять при этом биодеградативные свойства.

В настоящей работе были использованы различные способы выделения микроорганизмов из почв и донных отложений, загрязненных отходами химической и соледобывающей промышленности.

Из накопительных культур, инкубированных на минеральной среде К1, не содержащей NaCl, были выделены бактерии-деструкторы нафталина, фенантрена и бифенила. Изолированные бактерии были отнесены к разным родам грамотрицательных (Pseudomonas spp.) и грамположительных микроорганизмов (Rhodococcus spp, Arthrobacter spp., Bacillus sp.). Установлено, что все исследованные штаммы являются деструкторами нафталина и его метаболита - салицилата. Грамотрицательные штаммы осуществляют его утилизацию по описанному в литературе для ряда штаммов рода Pseudomonas пути с образованием салицилата и катехола и расщеплением последнего по орто- и мета-пути [203]. Это подтверждают наши данные по изучению деструкции нафталина у представителя грамотрицательных штаммов - Pseudomonas putida SN11. Штаммы рода Pseudomonas способны к росту на фенантрене и промежуточном продукте его утилизации (1-гидрокси-2-нафтоате). Evans с соавт. установили, что флуоресцирующие псевдомонады деградируют фенантрен через

1-гидрокси-2-нафтоат, салицилат и катехол [80]. Выделенные нами в данной работе галотолерантные штаммы рода Pseudomonas катаболизируют фенантрен по этому же пути.

Из фенантреновых накопительных культур изолированы бактерии рода Arthrobacter, способные к более эффективной утилизации фенантрена, а также растущие на нафталине и промежуточных продуктах их биодеградации. Анализ литературы показал, что имеются лишь единичные сообщения о путях деструкции ПАУ данным родом бактерий [96, 119]. Наиболее изученными бактериями-деструкторами фенантрена являются представителями рода Burkholderia, Pseudomonas [115]. Полученные нами данные по изучению деструкции нафталина и фенантрена для штамма Arthrobacter globiformis SF27 позволяют предположить, что данный штамм осуществляет утилизацию нафталина через гентизат или катехол с утилизацией последнего по орто-пути. Деструкция фенантрена, данными штаммами происходит через 1-гидрокси-2-нафтойную кислоту,

2-карбоксибензальдегид и орто-фталат, без участия ферментов утилизации нафталина [122].

В экспериментах было показано, что выделенные нами микроорганизмы-деструкторы ПАУ являются умеренно галотолерантными бактериями. Известно, что в отличие от водных экосистем, в засоленных почвах, как правило, встречаются не галофильные, а галотолерантные микроорганизмы, поскольку уровень концентрации солей в почве подвержен значительным колебаниям за счет разбавления водой и ее испарения [39]. В наших опытах было выявлено, что на богатой среде все исследованные штаммы способны к росту при более высоких концентрациях NaCl, чем при росте на минеральной среде с нафталином (табл. 8, рис. 7). Из литературных данных известно, что аминокислоты могут выступать в качестве осмопротекторов и накапливаться клетками ряда галотолерантных штаммов при повышенном засолении среды [86, 139]. Этим, вероятно, объясняется факт положительного влияния дрожжевого экстракта на бактериальный рост изучаемых нами культур в условиях повышенного содержания NaCl в среде. Обращает на себя внимание также тот факт, что повышенные концентрации соли оказывают определенное влияние на микробные системы биодеградации нафталина и фенантрена, что проявляется в замедлении скорости роста бактерий и увеличении лаг-периода (рис. 7, 9).

Полученные результаты свидетельствуют, что штамм A. globiformis SF27, выделенный из почв района солеразработок, способен к росту при более высоких концентрациях хлорида натрия, чем штамм A. globiformis КЗТ1, выделенный из подмосковной почвы. Кроме того, штамм A. globiformis SF27 проявляет деструктивные свойства при концентрации NaCl до 1 М, что позволяет предположить наличие систем адаптации к повышенному засолению среды у данного штамма.

Как свидетельствуют данные литературы, деградация нафталина бактериями чаще всего контролируется генами, расположенными на плазмидах [62, 203]. Обнаружено, что выделенные нами бактерии родов Pseudomonas, Arthrobacter Rhodococcus содержат плазмиды большого размера с молекулярными массами от 85 тпн до 120 тпн (рис. 13, 14). В наших экспериментах показано, что плазмиды штаммов рода Pseudomonas являются конъюгативными и несут гены биодеградации нафталина, салицилата и фенантрена (табл. 9). Способность к деструкции ксенобиотиков штаммами рода Arthrobacter также часто определяется плазмидными генами [50, 85, 204]. Установлено, что ферменты биодеградации фенантрена штамма Arthrobacter globiformis SF27 кодируются генами, расположенными на плазмиде. Необходимо отметить, что штаммы P. putida SN11 и P. putida G51, выделенные из разных географически удаленных районов (г. Березники и г. Пермь), вероятно, содержат идентичные плазмиды биодеградации нафталина.

Известны работы, в которых показана связь галотолерантности бактерий с находящимися в них плазмидами [187]. При элиминации плазмид из Halomonas elongata бактериальные клетки утрачивали способность к росту в присутствии высоких концентраций хлористого натрия, однако глубоких исследований роли плазмид в устойчивости бактерий к повышенному содержанию NaCl в среде не проводилось [188]. Полученные нами данные о влиянии плазмид на устойчивость бактерий не исключают того, что плазмида биодеградации нафталина pSNll содержит генетический материал, играющий существенную роль в адаптации бактерий к повышенному содержанию NaCl в среде (табл. 10). Сравнение способности к росту при высоких концентрациях NaCl штамма P. putida SN11 и полученных трансконьюгантов показало, что штамм P. putida SN11 более устойчив к повышению концентрации соли в ростовых средах, чем трансконъюгантные штаммы, из чего следует, что галотолерантность у штамма P. putida SN11 детерминируется не только генетическими элементами, расположенными на плазмиде, а требует участия хромосомных генов клетки.

При инкубации накопительных культур на минеральной среде Раймонда с триптоном и дрожжевым экстрактом в качестве субстратов, и содержащей 3 М NaCl, был изолирован ряд грамположительных и грамотрицательных галофильных микроорганизмов. Среди них не обнаружено деструкторов ПАУ, в то же время показано, что некоторые из них способны к росту на алифатических углеводородах, в частности, октане.

При попытке выделения деструкторов ПАУ из нафталиновых накопительных культур при повышенных концентрациях NaCl чистые культуры микроорганизмов не были изолированы. Были выделены микробные сообщества, способные к росту на нафталине при концентрации соли в ростовой среде до 2.5 М.

Одно из таких микробных сообществ было исследовано более подробно. Установлено, что данное сообщество состоит как минимум из

114 четырех индивидуальных культур микроорганизмов. Среди данных культур были идентифицированы три грамположительных штамма-деструктора нафталина родов Arthrobacter и Brevibacterium, проявляющие галотолерантные свойства, а также грамотрицательный штамм Halomonas sp. В7, не утилизирующий нафталин, но являющийся истинным галофилом. Для эффективного роста штамма Halomonas sp. В7 на полноценной среде было необходимо присутствие NaCl в концентрации от 0.5 М до 3 М. Слабый рост данного штамма наблюдался на полноценной среде, содержащей 4 М и 5 М NaCl. Показано, что штаммы-деструкторы не способны к росту на нафталине при концентрации NaCl выше 1 М, тогда как исследуемое сообщество микроорганизмов способно к росту на нафталине, как единственном источнике углерода, при концентрации NaCl - до 2.5 М. Эти результаты позволили нам предположить, что в выделенной микробной ассоциации галофильные микроорганизмы рода Halomonas способны выделять осмопротекторы, которые определяют возможность другим микроорганизмам-деструкторам катаболизировать нафталин в присутствии повышенных концентраций хлористого натрия. Очевидно, что такие микробные сообщества, осуществляющие разложение различных ксенобиотиков, в данном случае нафталина, при повышенном содержании хлорида натрия, могут представлять интерес для использования их при биоремедиации засоленных почв.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Алтынцева, Ольга Викторовна, 2001 год

1. Бабыкин М.М., Зинченко В.В., Бибиков М.В., Шестаков С.В. Плазмиды различных штаммов Pseudomonas spheroides // Молекулярная генетика микроорганизмов и вирусов. 1984. - № 7. - С. 23-28.

2. Балашова Н.В., Кошелева И.А., Филонов А.Е., Гаязов P.P., Воронин A.M. Штамм Pseudomonas putida BS3701 деструктор фенантрена и нафталина //Микробиология. - 1997. - Т.66. - С. 488-493.

3. Беляев С.С., Борзенков И.А., Милехина Е.И., Чарахьян И.А., Иванов М.В. Развитие микробиологических процессов в разрабатываемых пластах Ромашкинского нефтяного месторождения // Микробиология. 1990. -Т.59-С. 1118-1125.

4. Воронин A.M., Кочетков В.В., Старовойтов И.И., Скрябин Г. К., Плазмиды pBS2 и pBS3, контролирующие окисление нафталина у бактерий рода Pseudomonas // Докл. АН СССР. 1977. - Т.237. - №5. -С. 1205-1218.

5. Воронин A.M., Старовойтов И.И., Борисоглебская А.Н., Скрябин Г.К. Плазмида Pseudomonas putida, контролирующая первичные этапы окисления нафталина // Докл. АН СССР. 1976. - Т.228. - №4. с. 962.

6. Воронин A.M., Филонов А.Е., Балакшина В.В., Кулакова А.Н. Стабильность плазмид био деградации нафталина NPL-1 и NPL-41 в популяциях Pseudomonas putida в условиях непрерывного культивирования // Микробиология. 1985. - Т.54. - №4. - С. 610-615.

7. Воронин A.M., Цой Т.В. Генетические системы био деградации: организация и регуляция экспрессии // Микробиология. 1989. - Т.25, вып.4. - С. 581-594.

8. Головлева JI.A., Филькенштейн З.И., Баскунов Б.П., Алиева P.M., Шустова JI.F. Микробная детоксикация сточных вод коксохимического производства//Микробиология. 1995. - Т.64. - С. 197-200.

9. Горлатов С.Н., Беляев С.С. Аэробная микрофлора нефтяного месторождения и способность ее к деструкции нефти // Микробиология. -1984.-Т.53,-С. 843-849.

10. П.Доронина Н.В., Сахаровский В.Г., Драчук С.В., Троценко Ю.А. Органические осмопротекторы аэробных, умеренно галофильных метилобактерий // Микробиология. 1998. - Т.67. - №4. - с. 458-463.

11. Зайцев Г.М., Карасевич Ю. Н. Утилизация 4-хлорбензойной кислоты штаммом Arthrobacter globiformis II Микробиология. 1981. - Т.50. -С. 35-40.

12. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М. Наука. 1982. - 142с.

13. М.Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир. 1981. -365с.

14. Комплексная оценка влияния предприятий калийной промышленности на здоровье населения и биоту. 1997, отчет лаборатории геологической микробиологии ИЭГМ.

15. Кочеков В.В., Воронин A.M. Сравнительное изучение плазмид, контролирующих биодеградацию нафталина культурой Pseudomonas II Микробиология. 1984. - Т.53. - С. 639-644.

16. Кошелева И.А., Цой Т.В., Кулакова А.Н., Воронин A.M. Сравнительный анализ организации плазмиды NPL-1, контролирующей окисление нафталина клетками Pseudomonas putida и ее производными // Генетика. -1986. Т.22. - №10. - С. 2389-2397.

17. Кошелева И.А, Соколов С.Л., Балашова Н.В., Филонов, А.Е., Мелешко Е.И., Гаязов P.P., Воронин A.M. Генетический контроль биодеградациинафталина штаммом Pseudomonas sp. 8909N // Генетика. 1997. - Т.33. -№6. - С. 762-768.

18. Кошелева И.А, Балашова Н.В., Измалкова Т.Ю., Филонов А.Е., Соколов СЛ., Слепенькин А.В., Воронин A.M. Деградация фенантрена мутантными штаммами-деструкторами нафталина // Микробиология. -2000. Т.69. - №4. - С. 783-789.

19. Кулакова А.Н., Воронин A.M. Мутанты плазмид биодеградации нафталина, детерминирующие окисление катехола по мета-пути // Микробиология. 1989. - Т.25. - С. 298-304.

20. Кунтиков Е.И., Горленко В.М. Взаимосвязь гало- и термотолерантности у аноксигенных фототрофных бактерий // Микробиология. 1998. - Т.67. -№3. - С. 298-304.

21. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии // Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. - 390с.

22. Матвеева Н.И., Николаев Ю.А. Воронина Н.А., Борзенков И.А., Беляев С.С. Осморегуляция в клетках углеводородокисляющих бактерий из нефтяных месторождений Татарии // Микробиология. 1993. - Т.62. -№5. - С. 835-842.

23. Методы общей бактериологии: Пер. с англ.; под ред. Ф. Герхардт и др. М.: Мир. 1983. - Том 1,2,3.

24. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Миллер Ю.М., Беляев С.С., Иванов М.В. Углеводородокисляющая микрофлора заводняемых нефтяных месторождений Татарии с различной минерализацией пластовых вод // Микробиология. -1991. Т.60. - С. 747-755.

25. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Кострикина Н.А., Беляев С.С. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий нефтяных месторождений Татарстана // Микробиология. 1998. - Т.67. -С. 208-214.

26. Определитель бактерий Берджи: Пер. с англ.; под ред. Дж. Хоулта и др. М.: Мир.- 1997.-Том 1,2.

27. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.:Мир. 1978.-С. 14-33.

28. Плакунов В.К., Арзуманян В.Г., Воронина Н.А., Беляев С.С. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей // Микробиология. 1999. - Т.68. - №1. - С. 40-44.

29. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Углеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах // Микробиология. 1982. - Т.51. -С. 324-348.

30. Скрябин Г.К., Старовойтов И.И., Борисоглебская А.Н., Воронин A.M. Окисление нафталина штаммом Pseudomonas putida, несущим мутантную плазмиду // Микробиология. 1978. - Т.47. - №2. - С. 273-277.

31. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наукова думка. 1990. - 234с.

32. Соколов C.JL, Кошелева И.А., Мавроди Д.В., Мавроди О.В., Воронин A.M. Структурная организация и экспрессия гена салицилат гидроксилазы //Генетика. 1998. - Т.34. - №2. - С. 206-212.

33. Старовойтов И.И. Регуляция синтеза ключевых ферментов катаболизма нафталина у Pseudomonas putida и Pseudomonas fluorescens, несущих плазмиды биодеградации NAH, pBS2 и NPL-1 // Микробиология. 1985. -Т.54. - С. 755-762.

34. Хмелина В.Н., Сахаровский В.Г., Решетников А.С., Троценко Ю.А. Синтез осмопротекторов галофильными и алкалофильными метанотрофами // Микробиология. 2000. - Т.69. - №4. - С. 465-470.

35. Цой Т.В., Кошелева И.А., Воронин A.M. Nah-гены Pseudomonas putida: молекулярно-генетический анализ плазмиды pBS286 // Генетика. 1986. -Т.22. - -№11. - С. 2702-2711.

36. Assinder S.G., Williams P.A. Comparison of the meta-pathway operons on NAH plasmid pWW60-22 and TOL plasmid pWW53-4 and its evolutionary significance // J. Gen. Microbiol. 1988. - V.234. - P. 2769-2778.

37. Baldwin B.R., M.B. Mesarch, L. Nies. Broad substrate specificity of naphthalene and biphenyl- utilizing bacteria // Applied Microbiology and Biotechnology. 2000. - V.53. - P. 748.

38. Barnsley E.A. The induction of the enzymes of naphthalene metabolism in Pseudomonas by salicylate and 2-aminobenzoate // J. Gen. Microbiol. 1975. -V.88. - P. 193-196.

39. Barnsley E.A. Bacterial oxidation of naphthalene and phenanthrene // J. Bacteriol. 1983. - V.153. - P. 1069-1071.

40. Bastos A.E.R., Moon D.H., Rossi A., Trevors J.T., Tsi S.M. Salt-tolerant microorganisms isolated from Amazonian soil samples // Arch. Microbiol. -2000.-V.174.-P. 346-352.

41. Becker В., Lechevalier M.P., Gordon R.E., Lechevalier H.A. Rapid differentiation of between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates // Appl.Microbiol. Biotech. 1964. -V.12.-P. 421-423.

42. Berardesco G., Dyhrman S., Gallagher E., Shiaris M. Spatial and temporal variation of phenanthrene-degrading bacteria in intertidal sediments // Applied and Environmental Microbiology. 1998. - V.64. - №7. - P. 2560-2565.

43. Blumer M. Polycyclic aromatic hydrocarbons in nature // Sci. Am. 1976. -V.234. - P. 35-45.

44. Boldrin В., Tiehm A., Fritzsche C. Degradation of phenanthrene, fluorene, fluoronaphthene, and pyrene by a Mycobacterium sp. II Applied and Environmental Microbiology. 1993. - V.59. - P. 1927-1930.

45. Bosch R., Moore E.R.B., Garcia-Valdes E., Pieper D.H. NahW, a novel, inducible salicylate hydroxylase involved in mineralization of naphthalene by Pseudomonas stutzeri AN10 // J.Bacteriol. 1999. - V.181. - P. 2315-2322.

46. Bouches M., Blanchet D., Vandecasteele J.-P. The microbial fate of polycyclic aromatic hydrocarbons: carbon and oxygen balances for bacterial degradation of model compounds // Applied Microbiology and Biotechnology. 1996. -V.45.-P. 556-560.

47. Brandsch R., Hinkkanen A.E., Decker K. Plasmid-mediated nicotine degradation in Arthrobacter oxidans II Arch. Microbiol. 1982. - V.132. - P. 26-30.

48. Brown A.D. Microbial water stress // Bacteriol Rev. 1976. - V.40. -P. 803-846.

49. Buchan A., Collier L.S., Neidle E.L., Moran M.N. Key aromatic-ring cleaving enzyme, protocatecuate-3,4-dioxygenase, in the ecologically important marine Roseobacter lineage // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V.66. - №11. -P. 4662-4672.

50. Cane P.A., Williams P.A. The plasmid-coded metabolism of naphthalene and 2-methylnaphthalene in Pseudomonas strains: phenotypic changes correlated with structural modification of the plasmid pWW60-l // J. Gen. Microbiol. 1982. -V.128. - P. 2281-2290.

51. Cane P.A., Williams P.A. A restriction map of naphthalene catabolic genes // J. Gen. Microbiol. 1986. - V.132. - P. 2919.

52. CasellasM., Grifoll M., Bayona J.M., Solanas A.M. New metabolites in the degradation of fluorene by Arthrobacter sp. strain F101 // Appl. Envir. Microbiol. 1997. - V.63. - №3. - P. 819-826.

53. Catterall F.A., Sala-Trepat J.M., Williams P.A. The coexistence of two pathways for the metabolism of 2-hydroxymuconic semialdehyde in naphthalene grown pseudomonad // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1971. -V.43.-P. 463-469.

54. Cerniglia C.E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Biodegradation. 1992. - V.3. - P. 351-368.

55. Chemical Methods in Bacterial Systematics. M. Goodfellow & D.E. Minnikin (eds). London: Academic Press. 1985. - 412 p.

56. Clements W.H., Oris J.Т., Wissing Т.Е., Accumulation and food chain transfer of fluoranthene and benzoa.pyrene in Chironomus riparius and Lepomis macrochirus //1 Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1994. - V.26. - P. 261-266.

57. Connors M.A., Barnsley E.A. Metabolism of naphthalene by Pseudomonas: salicylaldehyde as the first possible inducer in the metabolic pathway // J. Bacteriol. 1980. - V.141. - P. 1052-1060.

58. Connors M.A., Barnsley E.A. Naphthalene plasmids in Pseudomonas II J. Bacteriol. 1982. - V.149. - №3. - P. 1096-1101.

59. Crawford R.L. Novel pathway for degradation of protocatechuic acid in Bacillus species // J. Bacteriol. 1975. - V.121. - №2. - P. 531-536.

60. Cummings S.P., Williamson M.P., Cilmour J.D. Turgor regulation in a novel Halomonas species //Arch. Microbiol. 1993. - V.160. - P. 319-323.

61. Daane L.L., Harjono I., Zylstra G.J., Haggblom M.M. Isolation and characterization of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria associated with the rhizosphere of salt marsh plants // Appl. Envir. Microbiol. -2001. V.67. - №6. - P. 2683-2691.

62. Dagher F., Deziel E., Lirette P., Paquette G., Bisaillon J.G., Villemur R. Comparative study of five polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacterial strains isolated from contaminated soils // Can. J. Microbiol. 1997. - V.43. -№4. - P. 368-377.

63. Dagley S., Gibson D.T. The bacterial degradation of catechol // Biochem. Journal. 1965. - V.95. - P. 466-474.

64. Dagley S. Catabolism of aromatic compounds by microorganisms // Adv. Microb. Phisiol. -1971. V.6. - P. 1-21.

65. Davies J.I., Evans W.C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil pseudomonas: The ring fission mechanism // Biochem. Journal. 1964. - V.91. -P. 251-261.

66. DeFrank J. J., Cheng T. Purification and properties of an organophosphorus acid anhydrase from a halophilic bacterial isolate // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. -P. 1938-1943.

67. Diaz M.R., Taylor B.F. Metabolism of methylated osmolytes by aerobic bacteria from Mono Lake, a moderative alkaline environment // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. - V.19. - P. 239-247.

68. Dua R.D., Meera S. Purification and characterization of naphthalene oxygenase from Corynebacterium renale II Eur. J. Biochem. 1981. - V. 120. - P. 461-465.

69. Dunn N.W., Dunn H.M., Austen R.A. Evidence for the existence of two catabolic plasmids coding for the degradation of naphthalene // J. Gen. Microbiol. 1980. - V.117. - P. 529-536.

70. Dunn N.W., Gunsalus I.S. Transmissible plasmids coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida II J. Bacteriol. 1973. - V. 114. -P.974-980.

71. Dutta Т.К., Selifonov S.A., Gunsalus I.C. Oxidation of methyl-substituted naphthalenes: pathways in a versatile Shingomonas paucimobilis strain // Applied and Environmental Microbiology. 1998. - V64. - №5. - P. 1884-1889.

72. Eaton R.W., Chapman P.J. Bacterial metabolism of naphthalene: construction and use of recombinant bacteria to study ring cleavage of 1,2-dihydroxynaphthalene and subsequent reactions // J. Bacteriol. 1992. -V.174. -№23. -P. 7542-7550.

73. Emerson D., Breznac J.A. The response of microbial populations from oil-brine contaminated soil to gradients of NaCl and sodium p-toluate in diffusion gradient chamber // FEMS Microbiology Ecology. 1997. - V.23. - P. 285-300.

74. Ensley B.D., Gibson D.T. Naphthalene dioxygenase: purification and properties of a terminal oxygenase component // J. Bacteriol. 1983. - Y.155. -P. 505-511.

75. Evans W.C., Fernley H.N. Griffiths E. Oxidative metabolism of phenantrene and anthracene by soil pseudomonads: the ring fission mechanism // Biochem. Journal. 1965. - V. 95. - P 819-831.

76. Feist C.F., Hegman G.D. Phenol and benzoate metabolism by Pseudomonas putida of tangetial pathways // J. Bacteriol. 1969. - V.100. - P. 869-877.

77. Fernandez-Castillo R., Vargas C., Nieto J.J., Ventosa A., Ruitz-Berraquero. Characterization of plasmid from moderately halophilic eubacteria // J. Gen. Microbiol. 1992. - V.138. - P. 1133-1137.

78. Foght J.M., Fedorak P.M., Westelake D.W.S. Mineralization of 14C.hexadecane and [14C]phenanthrene in crude oil: speciality among bacteria isolates // Can. J. Microbiol. 1990. - V.36. - P. 169-175.

79. Fuenmayor S.L., Wild M., Boyes A.L., Williams P.A. A gene cluster encoding conversion of naphthalene to gentisate in Pseudomonas sp. strain U2 // J. Bacteriol. 1998. - V.180. - P. 2522-2530.

80. Furukawa K., Chakrabarty A.M. Involvement of plasmids in total degradation of chlorinated biphenyls // Appl. Envir. Microbiol. 1982. - V.44. - P. 619629.

81. Galinski E.A. Compatible solutes of halophilic eubacteria: molecular principles, water-solute interaction, stress protection // Experientia. 1993. - V.49. -P. 487-496.

82. Galinski E.A. Osmoadaptation in bacteria // Adv. Microb. Physiol. 1995. -V.37. - P. 273-328.

83. Garsia-Valdes E., Cozar E., Rotger R., Lalucat J., Ursing J. New naphthalene-degrading marine Pseudomonas strains // Applied and Environmental Microbiology. 1988. - V.54. - №10. - P. 2478-2485.

84. Geiselbrecht A., Hedlund В., Tuchi M.A., Staley J.T. Isolation of marine polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)-degrading Cycloclasticus strain from the Gulf of Mexico and comparison of the PAH degradation ability with that of

85. Paget Sound Cycloclasticus strains // Applied and Environmental Microbiology. 1998. - V.64. - №12. - P. 4703-4710.

86. Gibson D.T., Vencatanayarana M., Jerina D.M., Yagy H., Yen H. Oxidation of the cancirogens benzoa.pyrene and benzo[a]anthracene to dihydrodiols by a bacterium // Science. 1975. - V.189. - P. 295-297.

87. Gibson D.T., Subramanian V. Microbial degradation of aromatic hydrocarbons.- Gibson (ed.), Microbial degradation of organic compounds. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. 1984. - P. 181-152.

88. Gibson D.T., Parales R.E. Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology // Current Opinion in Biotecnology. 2000. -№11.-P. 236-243.

89. Goyal A.K, Zilstra G.J., Molecular cloning of novel genes for polycyclic aromatic degradation from Comamonas testosteroni GZ39 // Applied and Environmental Microbiology. 1996. - V.62. - P. 230-236.

90. Grifoll M., Casellas M., Bayona J.M., Solanas A.M. Isolation and characterization of a flyorene-degrading bacterium: identification of ring oxidation and ring fission products // Applied and Environmental Microbiology.- 1992.-V.58.-P.2910-2917.

91. Grimm A.C., Harwood C.S. NahY. A catabolic plasmid-encoded receptor, required for chemotaxis of Pseudomonas putida to the aromatic hydrocarbon naphthalene // J. Bacteriol. 1999. - V.181. - P. 3310-3316.

92. Grund E., Denecke В., Eichenlaub R. Naphthalene degradation via salicylate and gentisate by Rhodococcus sp. strain B4 // Applied and Environmental Microbiology. 1992. - V.58. - P. 1874-1877.

93. Guerin W.F., Jones G.E. Two-stage mineralization of phenantrene by estuarine enrichment cultures // Applied and Environmental Microbiology. 1988. -V.54. - P. 929-936.

94. Hall M., Grover P.L. Polycyclic aromatic hydrocarbons: Metabolism, activation and tumor initiation. Cooper C.S., Grover P.L. (eds):Chemicalcancirogenic and mutagenesis. Berlin: Springer-Verlag. 1990. - V.l. -P. 327-372.

95. Harayama S., Rekik M. Bacterial aromatic ring- cleavage enzymes are classified into two different gene families // J. Biol. Chem. 1989. - V.264. -P. 15328-15333.

96. Harayama S. Polycyclic aromatic hydrocarbon biodegradation design // Curr. Opin. Biotechnol. 1997. - V.8. - P. 268-273.

97. Hedlund B.P., Geiselbrecht A.D., Bair T.J., Staley J.T. Polycyclic aromatic hydrocarbon biodegradation by marine bacterium, Neptunomonas naphthovorans gen. nov., sp. Nov // Applied and Environmental Microbiology. 1999.-V.65.-№>1.-P. 251-259.

98. Heitkamp M.A., Cerniglia C.E. Mineralization of polycyclic aromatic hydrocarbons by bacterium, isolated from sediment below an oil field // Applied and Environmental Microbiology. 1988. - V.54. - P. 1612-1614.

99. Heitkamp M.A., Freeman J.P., Miller D.W., Cerniglia C.E. Pyrene degradation by Mycobacterium sp.: identification of ring oxidation and ring fission products // Applied and Environmental Microbiology. 1988. - V.54. -P. 2556-2565.

100. Herbes S.E., Schwall L.R. Microbial transformation of polycyclic aromatic hydrocarbons in pristine and petroleum-contaminated sediments // Applied and Environmental Microbiology. 1978. - V.35. - P. 306-316.

101. Herrick J.B. Stuart-Keil K.G., Ghiorse W.C., Madsen E.L. Natural horizontal transfer of naphthalene dioxygenase gene between bacteria native to a coal tar-contaminated site // Applied and Environmental Microbiology. -1997. V.63. - №6. - P. 2330-2337.

102. Holman H.Y.N., Tsang Y.W., Holman W.R. Mineralization of sparsely water-soluble polycyclic aromatic, hydrocarbons in a water table fluctuation zone //Emir. Sci. Technol. 1999. - V.33. - P. 1819-1824.

103. Imhoff J., Rodrigues-Valera F. Betaine is the main compatible solute of halophilic eubacteria//J. Bacteriol. 1984. - V.160. - P.478-479.

104. Imhoff J.F. Osmoregulation and compatible solutes in eubacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1986. - V.39. - P. 57-66.

105. Iwabuchi Т., Harayama S. Biochemical and genetic characterization of *ra/i$-2-carboxybensalpyruvate hydratase-aldolase from a phenanthrene-dQgradingNocardioides strain// J. Bacteriol. 1998. - V.180. - P. 945-949.

106. Jerina D.M., Selander H., Yagi H., Wells M.C., Davey J.F., Mahadevan V., Gibson D.T. Dihydrodiols from anthracene and phenanthrene // J. Am. Chem. Soc. 1976. - V.98. - P. 5988-5996.

107. Kalb V.F., Bernlohr R.W. A new spectrophotometric assay for protein in cell extract // Anal.Biochem. 1977. - V.82. - P. 362.

108. Kanaly R.A., Harayama S. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria // J. Bacteriol. 2000. - V.182. -№8. - P. 2059-2067.

109. Kazunga C., Aitken M.D. Products from the incomplete metabolism of pyrene by polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria // Applied and Environmental Microbiology. 2000. - V.66. - №5. - P. 1917-1922.

110. Keith L.H., Telliard W.A. Priority pollutants I a perspective view // Environ. Sci. Technol. - 1979. - V.13. - P. 416-420.

111. Kelley I., Freeman G.P., Evans F.E., Cerniglia C.E. Identification of metabolites from the degradation of fluoranthene by Mycobacterium sp. strain PYR-1 // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V.59. - P. 800-806.

112. Keuth S., Rehm J.H. Biodegradation of phenanthrene by Arthrobacter polychromogenes isolated from a contaminated soil // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. - У.34. - P. 804-808.

113. Kim C.K., Kim J.W., Mheen T.I. Isolation of aromatic hydrocarbon-degrading bacteria and genetic characterization of their plasmid genes // Kor. J. Microbiol. 1986. - V.24. - P. 67-72.

114. King J.M.H., DiGrazia P.M., Applegate В., Burlage R., Sanseverino J., Dunbar P., Larimer F., Sayler J.S. Rapid, sensitive, bioluminescent reporter technology for naphthalene exposure and biodegradation // Science. 1990. -V.249. - P. 778-781.

115. Kiyohara H. Nagao K., Nomi R. Degradation of phenanthrene through o-phthalate by Aeromonas sp. // Agric. Biol. Chem. 1976. - V.40. -P. 1075-1082.

116. Kiyohara H., Nagao K. The catabolism of phenanthrene and naphthalene by bacteria // J. Gen. Microbiol. 1978. - V. 105. - P. 69-75.

117. Kiyohara H., Takizawa N., Date H., Torigoe S., Yano K. Characterization of a phenanthrene degradation plasmid from Alcaligenes faecalis AFK2 // J. Ferment. Bioeng. 1990. - V.69. - P. 54-56.

118. Kuhm A.E., Stolz A., Ngai K.L., Knackmuss H.J. Purification and characterization of a 1,2-dihydroxynaphthalene oxygenase from a bacterium that degrades naphthalenesulfonic acids // J. Bacteriol. 1991. - V.173. -P. 3795-3802.

119. Kustner D.J. Molecular adaptation of enzymes, metabolic systems and transport systems in halophilic bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1986. - V.39. -P. 121-127.

120. Larkin M.J., Allen C.C.R., Kulakov L.A., Lipsomb D.A. Purification and characterization of a novel naphthalene dioxygenase from Rhodococcus sp. Strain NCIMB 12038 // J. Bacteriol. 1999. - V.181. - P. 6200-6204.

121. Laurie A.D., Lloyd-Jones G. The genes of Burkholderia sp. Strain RP007 constitute a divergent gene cluster for polycyclic aromatic hydrocarbon catabolism // J. Bacteriol. 1999. - V.181. - №2. - P. 531-540.

122. Lewtas J. Complex mixtures of air pollutants. Characterizing the cancer risk of organic matter//Environ Half Perspect. 1993. - V.100. - P. 211-218.

123. Lim L.H., Harrison R.M., Harrad S. The contribution of traffic to atmospheric concentration of polycyclic aromatic hydrocarbons // Environ. Sci. Technol. -1999.-V.33.-P. 3538-3542.

124. Luz M., Paje F. Brett A., Neilan A., Couperwite I. A Rhodococcus species that thrives on medium saturated with liquid benzene // Microbiology. 1997. -V.143.-P. 2975-2981.

125. Marko M.A., Chipperfield R., Birnboim H.C. A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder // Analit. Biochem. 1982. - V.121. - P. 382.

126. Marr L.C., Kirchstetter T.W., Harley R.A., Miguel A.H, Hering S.V., Hammond S.K. Characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons in motor vehicle fuels and exhaust emissions // Environ. Sci. Technol. 1999. - V.33 -P. 3091-3099.

127. Mellado E., Asturias J.A., Nieto J.J., Timmis K.N., Ventosa A. Characterization of the basic replicon of pCMl, a narrow-host-range plasmid from the moderate halophile Chromohalobacter marismortui II J. Bacteriol. -1995. V.177. - P. 3443-3450.

128. Menn F.M., Applegate B.M., Sayler G.S. NAH plasmid-mediated catabolism of anthracene and phenanthrene to naphthoic acid // Applied and Environmental Microbiology. 1993. - V.59. - P. 1938-1942.

129. Mille G., Almallah M, Bianchi M., van Wambeke F., Bertrand G.C. Effect of salinity on petroleum degradation // Fresenius J. Ann. Chem. 1991. - V.339. -P. 788-791.

130. Miller K.J., Leschine S. A halotolerant Planococcus from Antarctic dry valleys // Curr. Microbiol. 1984. - V. 11. - P. 205-210.

131. Minnikin D.E., Alshamaony L., Goodfellow M. Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin-layer chromatographic analysis of whole-cell methanolysates // J. Gen.Microbiol. 1975. - V.88. -P. 200-204.

132. Minnikin D.E., O'Donnel A.G., Goodfellow M., Alderson G., Athalye M., Schaal A., Parlett J.H. An integrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones and polar lipids // J. Microb. Methods. 1984. - V.2. -P. 233-241.

133. Monticello D.J., Bakker D., Shell M., Finnerty W.R. Plasmid-borne Tn5 insertion mutation resulting in accumulation of gentisate from salicylate // Appl. and Environ. Microbiol. 1985. - V.49. - P. 761-767.

134. Morawsky В., Eaton R.W., Rossiter Т., Guoping S., Griengl H., Ribbons D.W. 2-naphthoate catabolic pathway in Burkholderia strain JT 1500 // J. Bacteriol. 1997,-V.179.-P. 115-121.

135. Mueller J.G., Devereux R., Santavy D.L., Lantz S.E., Willis S.G., Pritchard P.H. Phylogenetic and physiological comparisons of РАН-degrading bacteriafrom geographically diverse soils // Antonie Van Leeuwenhoek. 1997. - V.71. -№4. -P. 329-343.

136. Nagata S., Adachi K., Sano H. Intracellular changes in ions and organic solutes in halotolerant Brevibacterium sp. strain JCM6894 after exposure to hyperosmotic shock // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64. - №10. -P. 3641-3647.

137. Nishioka M., Chang H.-Y., Lee M. Structural characteristics of polycyclic aromatic hydrocarbon isomers in coal tars and combustion products // Environ. Sci. Technol. 1986. - V.20. - P. 1023-1027.

138. Oren A., Gurevich P., Azachi M. and Y.Henis. Microbial degradation of pollutants at high salt concentrations // Biodegradation. 1992. - V.3. -P. 387-398.

139. Ornston L.N. The conversion of catechol and protocatechuate to beta-ketoadipate by Pseudomonas putida. Enzymes of catechol pathway // J. Biol. Chem. 1966. - V.166. - P. 9-14.

140. Osorio K.R., Barja J.L., Hutson R.A. and Collins M.D. Atrhrobacter rhombi sp. nov., isolated from Greenland halibut (Reinhardtius hippoglossoides) // Int. J. Syst. Bacterid. 1999. - V.49. - P. 1217-1220.

141. Patel T.R., Gibson D.T. Bacterial cys-dihydrodiol dehydrogenase of Pseudomonas putida II J. Bacteriol. 1974. - V. 119. - P. 879-888.

142. Patel T.R., Gibson D.T. Bacterial dehydrodiol dehydrogenase: comparison of physiochemical and immunological properties // J. Bacteriol. 1976. - V.128. - P. 842-850.

143. Patel T.R., Barnsley E. A. Naphthalene metabolism by Pseudomonas: Purification and properties of 1,2-dihydroxynaphthalene oxygenase // J. Bacteriol. 1980. - V. 143. - P. 668-673.

144. Phillips D.H. Fifty years of benzoot.pyrene. // Nature. 1983. - V.303. -P. 468-472.

145. Quesada E., Ventosa A., Rodrigues-Valera F., Ramos-Cormenzana A. Types and properties of some bacteria isolated from hypersaline soils. // J. Appl. Bacteriol. 1982. - V.53. - P. 155-161.

146. Quesada E., Ventosa A., Rodrigues-Valera F., Megias L., Ramos-Cormenzana A. Numerical taxonomy of moderately halophilic gram-negative bacteria from hypersaline soils // J. Gen. Microbiol. 1983. - V.129. -P. 2649-2657.

147. Rafaeli-Eshkol D., Avi-Dor Y. Studies of halotolerance in a moderately halophilic bacterium. Effect of betaine on salt resistance of the respiratory system // Biochem J. 1968. - V.109. - P. 687-691.

148. Regev R., Peri I., Gilboa H., Avi-Dor Y. 13C NMR study of the interrelation between synthesis and uptake of compatible solutes in two moderately halophilic bacteria//Arch. Biochem. Biophys. -1990. V.278. - P. 106-112.

149. Risher G. Routine use of thin-layer chromatography for cell wall analysis of aerobic actinomycetes, including two strains from sediments of North Sea // Veroff. Inst. Mecreforsch. Bremerh. 1984. - V.16. - №26. - P. 125-138.

150. Rheinwald J., Chakrabarty A.M., Gunsalus I.C. A transmissible plasmids controlling camphor oxidation in Pseudomonas putida // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. - V.70. - P. 885-889.

151. Rosenberg R. Pseudomonas halodurans sp. nov., a halotolerant bacterium I I Microbiol. 1983. - V.136. - P. 117-123.

152. Roslev P., Madsen P.L., Thyme J.B., Henriksen K. Degradation of phthalate and di-(2-etylhexyl)phthalate by indigenous and inoculated Microorganisms in sludge-amended soil // Applied and Environmental Microbiology. 1998. -V.64.-№12.-P. 711-719.

153. Rossello-Mora R.A., Laluoat J., Garoia-Valdes E. Comparative biochemical and genetic analysis of naphthalene degradation among Pseudomonas stutzeri strains // Applied and Environmental Microbiology. 1994. - V.60. -P. 966-972.

154. Samanta S.K., Chakrabarti A.K., Jain R.K. Degradation of phenanthrene by different bacteria: evidence for novel transformation sequins involving the formation of 1-naphtol // Applied Microbiology and Biotechnology. 1999. -V.53.-P. 98-107.

155. Sanseverino J., Applegate B.M., King J.M.H., Sayler G.S. Plasmid-mediated mineralization of naphthalene, phenanthrene, and anthracene // Applied and Environmental Microbiology. 1993. - V.59. - №6. - P. 1931-1937.

156. Schell M.A. Transcriptional control of the nah and sal hydrocarbon-degradations operons by the nahR gene product // Gen. 1985. - V.36. -P. 301-308.

157. Schell M.A. Homology between nucleotide sequences of promoter regions of nah and sal operons of NAH7 plasmid of Pseudomonas putida // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - Y.83. - P. 369-373.

158. Schneider J., Grosser R., Jayasihulu K., Xue W., Warshawsky D. Degradation of pyrene, benza.anthracene and benz[a]pyrene by Mycobacterium sp. strain RJGII-135, isolated from coal gasification site // Appl. Environ. Microbiol. -1996.-V.62.-P. 13-19.

159. Serdar C.M. Plasmid involvement in the metabolism of naphthalene and parathion. Ph.D. thesis. University of Texas. Austin. - 1985. - 124p.

160. Shiaris M.P., Jambard-Sweet D. Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in surficial sediments of Boston Harbor, Massachusetts, USA // Mar. Pollut. Bull. 1986. - V.17. - P. 469-472.

161. Shiaris M.P. Seasonal transformation of naphthalene, penanthrene, and benza.pyrene in surficial estuarine sediments // Applied Microbiology and Biotechnology. 1989. - V.55. - P. 1391-1399.

162. Shuttlworth K.L., Cerniglia C.E. Environmental aspects of PAH biodegradation // Appl. Biochem. Biotechnol. 1995. - V.54. - P. 291-302.

163. Shuttlworth K.L., Cerniglia C.E. Bacterial degradation of low concentrations of phenanthrene and inhibition by naphthalene // Microbiol Ecology. 1996. -№31.-P. 305-317.

164. Sims J.L., Sims R.H., Matthews J.E. Approach to bioremediation on contaminated soil // Haz. Waste Haz. Matter. 1990. - V.7. - P. 117-149.

165. Smith M.R. The biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria // Biodegradation. 1990. - V.l. - P. 191-206.

166. Sotsky J.B., Greer C.W., Atlas R.M. Frequency of genes in aromatic and aliphatic hydrocarbon pathways within bacterial populations from Alaskan sediments // Can. J. Microbiol. 1994. - V.40. - P. 981-985.

167. Strandberg G.W., Abraham T.J., Frazier G.C. Phenanthrene degradation by Beijerinckia sp. B8/36 // Biotechnol. Bioeng. 1986. - V.28. - P. 142-145.

168. Stringfellow W.T., Atken M. D. Comparative physiology of phenanthrene degradation by two dissimilar pseudomonas isolated from a creosote-contaminated soil // Can. J. Microbiol. 1994. - V.40. - P. 432-438.

169. Sutherland J.B., Rafii F., Khan A., Cerniglia K. Mechanisms of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation // Microbial transformation and degradation of toxic chemicals. 1995. - Wiley-Liss. Inc. - P. 269-306.

170. Tagger S., Truffaut N., Le Petit J. Preliminary study on relationship among strains forming a bacterial community selected on naphthalene from a marine sediment // Can. J. Microbiol. 1990. - V.36. - P. 676-681.

171. Ventosa A., Joaquhn J.N. and A.Oren. Biology of halophilic aerobic bacteria // Microbiol, and Molec.Biol. Rev. 1998. - V.2. - P. 504-544.

172. Vreeland R.H. Mechanisms of halotolerance in microorganisms // Crit. Rev. Microbiol. 1987. - V.14. - P. 311-356.

173. Walter U., Beyer M., Klein J., Rehm H-J. Degradation of pyrene by Rhodococcus sp. UW1 // Applied Microbiology and Biotechnology. 1991. -V.34. -P. 671-676.

174. Walter U., Beyer M., Klein J., Rehm H.J. Degradation of pyrene by Rhodococcus sp. UW1 // Appl. Mcrobiol. Biotechnol. 1991. - V.34. -P. 671-676.

175. Ward D.M., Brock T.D. Hydrocarbon biodegradation in hypersaline environments // Applied and Environmental Microbiology. 1978. - V.35. -№2.-P. 353-359.

176. Weinberger M., Kolenbander P.E. Plasmid-determined 2-hydroxypyridine utilization by Arthrobacter crystallopoites И Can. J. Microbiol. 1979. - V.25. -P. 329-334.

177. Weissenfels W.D., Beyer M., Klein J. Degradation of fluorene and fluoronaphthene by pure bacterial cultures // Applied Microbiology and Biotechnology. 1990. - V.32. - P. 479-484.

178. Whyte L.G., Greer C.W., Inniss W. I. Assessment of the biodegradation potential of psichrotrophic microorganisms // Can. J. Microbiol. 1996. - V.42. -P. 99-106.

179. Williams P.A., Catteral F.A., Murray K. Metabolism of naphthalene, 2-methylnaphthalene, salicylate, and benzoate by Pseudomonas PG: tangential pathways // J. Bacteriol. 1975. - V.124. - P. 679-685.

180. Woolard C.R., Irvine R.L. Biological treatment of hypersaline wastewater by biofilm of halophilic bacteria // Abstracts of the Annual Water Environmental Federation Conference. 1992. - P. 14.

181. Yamomoto S., Katagiri M., Maeno H., Hayaishi O. Salicilate hydroxylase, monooxygenase requiring flavin adenine dinucleotide. 1. Purification and general properties // J. Biol. Chem. -1965. V.230. - P. 3408-3413.

182. Yang Y., Chen R.F., Shiaris M.P. Metabolism of naphthalene, fluorene and phenanthrene: preliminary characterization of a cloned gene cluster from in

183. Pseudomonas putida NCIB9816 // J. Bacteriol. 1994. - V.176. - №8. -P. 2158-2164.

184. Ye D., Siddiqi M.A., Maccubin A.E., Kumar S., Sikka H.C. Degradation of polynuclear aromatic hydrocarbons by Sphingomonas paucimobilis // Env. Sci. Technol. 1996. - V.30. - P. 136-142.

185. Yen K.-M., Gunsalus I.C. Plasmid gene organisation: naphthalene/salicylate oxidation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1982. - V.79. - 874p.

186. Yen K.-M., Gunsalus I.C. Regulation naphthalene catabolic genes of plasmid NAH7 // J. Bacteriol. 1985. - V.162. - №3. - P. 1008.

187. Yen K.M., Serdar C.M. Genetic of naphthalene catabolism in pseudomonads. CRC // Crit. Rev. Microbiol. 1988. - V.15. - P. 247-268.

188. Zhou N.-Y., Fuemayor S.L., Williams P.A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. Strain U2 encoding for gentisate catabolism // J.Bacteriol. 2001. - V.183. - №2. - P. 700-708.

189. Zilstra G.J., Wang X.P., Kim E., Didolcar V.A. Cloning and analysis of the genes for polycyclic aromatic hydrocarbons degradation. In: Recombinant DNA Tecnology II // Ann. of the New York Academy of Sciences. 1994. -V.721.-P. 386-398.1. БЛАГОДАРНОСТИ

190. Выражаю глубокую благодарность научному руководителю, кандидату биологических наук Елене Генриховне Плотниковой за предоставленную тему, помощь при выполнении экспериментов и обсуждении результатов работы.

191. Я искренне благодарна научному консультанту, доктору медицинских наук, профессору Виталию Алексеевичу Демакову за внимание, ценные советы и критические замечания при выполнении данной работы и оформлении диссертации.

192. Выражаю искреннюю благодарность Евтушенко Людмиле Ивановне и сотрудникам Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ за помощь в определении штаммов бактерий.

193. Хочу поблагодарить Кошелеву Ирину Адольфовну, Филонова Андрея Евгеньевича, Пунтус Ирину Филлиповну, Измалкову Татьяну Юрьевну за помощь в работе и обсуждении полученных результатов.

194. Благодарю всех сотрудников лаборатории биологии плазмид ИБФМ и лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН за всестороннюю помощь при выполнении работы.