Интеграция сигналов ядерной и ядрышковой локализации в составе функциональных доменов белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.08, кандидат наук Лисицына Ольга Михайловна

• Лисицына Ольга Михайловна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Лисицына Ольга Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Происхождение клеточного ядра

1.1.1. Эндосимбиотические модели эукариогенеза

1.1.2. Модели аутокариогенеза

1.2. Ядерный поровый комплекс

1.2.1. Структурная организация ядерного порового комплекса

1.2.2. Эволюция ядерного порового комплекса

1.3. Транспорт молекул в ядро

1.4. Сигналы ядерной локализации (NLS)

1.4.1. Классические NLS

1.4.2. Неклассические NLS

1.4.3. Методы предсказания NLS

1.4.4. Неэукариотические NLS

1.4.5. Эволюционная взаимосвязь NLS и ДНК/РНК-связывающих доменов

1.5. Сигналы ядрышковой локализации (NoLS)

1.5.1. Методы предсказания NoLS

1.5.2. NoLS как часть NLS

1.6. Заключительные замечания

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Векторы и плазмиды

2.1.3. Геномная прокариотическая ДНК

2.1.4. Буферные растворы

2.1.5. Культуры эукариотических клеток

2.1.6. Культуры прокариотических клеток

2.1.7. Среда для культивирования эукариотических клеток

2.1.8. Среды для культиврирования Е.свИ

2.2. Методы

2.2.1. Трансфекция

2

2.2.2. Иммуногистохимия

2.2.3. Получение плазмид, кодирующих прокариотические белки слитые с EGFP

2.2.4. Получение мутантов прокариотических белков с EGFP

2.2.5. Получение конструктов iNoLS с EGFP

2.2.6. Приготовление компетентных клеток

2.2.7. Трансформация E. coli

2.2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Сравнительный анализ программ для предсказания NLS

3.2. Коэволюция NLS и окружающего его региона

3.3. NLS интегрированы внутри функциональных доменов прокариотических белков

3.4. Картирование NLS в прокариотических белках с помощью сайт-специфического мутагенеза

3.5. Прокариотические белки взаимодействуют с импортинами

3.6. NLS присутсвуют в составе цитоплазматических белков

3.7. Тропонин I может накапливаться в клеточном ядре

3.8. Интеграция NLS и NoLS

3.9. Эффективность накопления в ядрышке зависит от заряда NoLS

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Для аминокислот и их производных использовались обозначения, рекомендуемые комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPAC, iupac.org) и Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB, iubmb.org).

В работе использовались также следующие сокращения и обозначения: EGFP - зеленый флуоресцирующий белок (Enhanced Green Fluorescent Protein) cNLS - классический NLS (classical NLS)

expNLS - экспериментально аннотированные NLS (experimental NLS)

FPR - ложно положительный результат (False Positive Rate)

IC - информационное содержание (Information content)

ID - идентификатор (Identificator)

iNoLS - искусственный NoLS (imitative NoLS)

ncNLS - неклассический NLS (non-classical NLS)

NES - сигнал экспорта из ядра (Nuclear Export Signal)

NLS - сигнал ядерной локализации (Nuclear Localizatio Signal)

NoLS - сигнал ядрышковой локализации (Nucleolar Localization Signal)

pNLS - предсказанный NLS (predicted NLS)

SD - стандартное отклонение (Standard Deviation)

TMP - трансмембранные белки (transmembrane proteins)

TPR - истинно положительный результаты (True Positive Rate)

WT - дикий тип (Wild Type)

а.о.- аминокислотный остаток

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КММ - коэффициент корреляции Мэтьюса

М.в. - молекулярный вес

мРНК - матричная РНК

ПЦР - полимеразная цепная реакция

рДНК - рибосомная ДНК

РНК - рибонуклеиновая кислота рРНК - рибосомная РНК СММ - скрытая Марковская модель тРНК - транспортная РНК Т-ДНК - трансферная ДНК

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наличие клеточного ядра является главным отличием эукариот от прокариот. Появление клеточного ядра позволило пространственно обособить процессы транскрипции и трансляции, что явилось ключевой предпосылкой для развития сложных механизмов регуляции экспрессии генов, характерных для эукариот [1]. Усложнения структуры и регуляции работы генома позволили не только качественно изменить структуру и функционирование самих клеток, но и развить, по-видимому, недостижимые для прокариот механизмы дифференцировки и интеграции клеток -основу появления и эволюции многоклеточности [2].

Ядерная оболочка является важнейшим структурным компонентом клеточного ядра, который позволяет обособить нуклеоплазму от цитозоля, исполняя при этом роль не только физического барьера, но и высокоселективного фильтра для двунаправленного транспорта макромолекул. В перфорации ядерной оболочки встроены ядерные поровые комплексы - макромолекулярные структуры из более чем 30 различных типов белков [3, 4], осуществляющие импорт из цитоплазмы белков, функционирующих в ядре (гистоны, ДНК и РНК полимеразы, белки регуляторы транскрипции, белки процессинга РНК и т.д.), и экспорт макромолекул из ядра в цитоплазму (например, синтезированных в ядре тРНК и мРНК). Избирательность процесса ядерного импорта регулируется посредством взаимодействия с импортинами (адапторными молекулами ядерного порового комплекса) специальных аминокислотных последовательностей транспортируемых белков - сигналов ядерной локализации (Nuclear Localization Signal, NLS)[5].

Среди изученных экспериментально NLS выделяют классические NLS (classical NLS, cNLS) и неклассические NLS (non-classical, ncNLS). сNLS транспортируют белок в ядро посредством взаимодействия с импортином-а и, как правило, представляют собой одну или две коротких аминокислотных последовательности, обогащенные положительно-заряженными аминокислотными остатками аргинина или лизина [6]. Остальные типы NLS, не удовлетворяющие известным консенсусным последовательностям cNLS, и, как правило, прямо взаимодействующие с импортином-Д

принято относить к ncNLS. Наличие консенсусных последовательностей для cNLS

6

позволяет достаточно надежно предсказывать данный тип NLS в белках. Предсказание ncNLS представляет собой более сложную задачу, которая в настоящее время удовлетворительным образом не решена. Несмотря на то, что на данный момент достаточно детально изучены механизмы взаимодействия импортинов с различными типами NLS [7], остается не ясным, каким образом обеспечивается селективность транспорта белков в ядро при таком большом количественном и качественном разнообразии аминокислотных последовательностей NLS.

Сигналы ядерной локализации встречаются в аминокислотных последовательностях не только эукариотических белков. Так NLS были идентифицированы в белках VirD2 и VirE агробактерии Agrobacterium tumefaciens. Основной функцией данных белков является доставка Т-ДНК агробактерии в ядра клеток растений [8]. Аналогичными примерами могут являться прокариотические белки, ответственные за развитие патогенеза в эукариотических клетках-хозяинах: HsdM бактерии Ksebsiella pneumonia, обеспечивающий метилирование ДНК в ядре зараженной клетки [9], и белок HP0425 Helicobacter pylori, обладающий активностью ДНКазы [10]. Таким образом, считается, что присутствие NLS в некоторых прокариотических белках может быть следствием их паразитической функции в ядре эукариотической клетки-хозяина. NLS также обнаруживаются и в белках бактериофагов [11]. Более того, в вирусных и бактериальных белках NLS наиболее часто ассоциированы с нуклеотид-связывающими доменами, что может предполагать их тесную эволюционную взаимосвязь [11-14].

В составе эукариотических белков для NLS часто отмечается перекрытие с сигналами ядрышковой локализации (Nucleolar Localization Signal, NoLS) [5, 15, 16], которые также весьма вариабельны по последовательности, но при этом обогащены положительно-заряженными аминокислотными остатками лизина/аргинина. Как и NLS, NoLS могут располагаться внутри РНК-связывающих доменов [17], необходимых для взаимодействия с компонентами ядрышка. Можно предположить, что при формировании ядерных структур эукариот определенные участки нуклеотид-/белок-связывающих доменов белков могли дополнительно приобрести не только свойство узнавания системой импортинов (NLS), но и функцию накопления белка в ядрышке (NoLS).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Интеграция сигналов ядерной и ядрышковой локализации в составе функциональных доменов белков»

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью настоящей работы является выявление возможной эволюционной взаимосвязи сигнальных последовательностей и с нуклеотид-/белок-

связывающими доменами белков.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ

1. Провести сравнительный анализ программ, предсказывающих NLS в белках.

2. Изучить возможность эволюционной интеграции и функциональных доменов белков.

3. Изучить интеграцию в составе нуклеотид-связывающих доменов белков прокариот.

4. Изучить интеграцию в составе доменов цитоплазматических белков.

5. Выявить механизм интеграции и

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

На основании анализа последовательностей и белков, в состав которых они входят, предложена гипотеза происхождения этого типа сигналов, как функциональной части нуклеотид-/белок-связывающего домена, распознаваемой системой импортинов для транспорта белка в ядро. На примере прокариотических белков с нуклеотид-связывающими доменами приведены доказательства в пользу вышеописанной гипотезы: 1) идентифицированы прокариотические белки с нуклеотид-связывающими доменами, способные проникать через ядерный поровый комплекс посредством активного, импортин-зависимого транспорта; 2) в составе данных прокариотических белков картированны NLS. На примере тропонина I показана взаимосвязь сигнальных последовательностей и доменов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях: в отсутствии факторов, индуцирующих образование фибрилл, аминокислотные последовательности актин- и тропонин С-связывающих доменов могут играть роль сигналов ядерной локализации, релокализуя цитоплазматический тропонин I в ядро. Среди программ, предсказывающих сигналы ядерной локализации, выявлены наиболее эффективные (обладающие большей предсказательной силой). Для последовательностей сигналов ядрышковой локализации, которые довольно часто перекрываются с

сигналами ядерной локализации, выявлен механизм накопления белков в ядрышке.

8

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Знания об эволюционной взаимосвязи NLS/NoLS c функциональными доменами белка могут быть использованы при разработке методов направленного транспорта макромолекул. В частности, это может иметь значение для модификации уже существующих противоопухолевых препаратов с целью улучшения их проникновения в ядро, увеличения их аффинности к активируемым участкам ДНК или уменьшения их взаимодействиях с «нежелательными партнерами» в ходе терапии. Данные проведенного исследования используются при чтении курса «Клеточная биология» для студентов факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Работа докладывалась на семинаре отдела электронной микроскопии НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ. Материалы работы были представлены на 22-ом, 25-ом и 26-ом симпозиумах Вильгельма Бернхарда по исследованию клеточного ядра, на VII международной конференции «From molecular to cellular events in human pathologies», на Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2018», на Всероссийском симпозиуме и школе-конференции для молодых ученых по биологии клетки в культуре, на I всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет», на XVII российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел, на 50-ой международной ежегодной конференции «American Society for Cell Biology», а также на XXIII российской конференции по электронной микроскопии.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Функционально активные NLS могут быть эволюционно интегрированы в составе различных участков белков, обогащенных положительно заряженными аминокислотными остатками. При этом участок белка может функционировать в качестве NLS вне зависимости от необходимости и/или возможности для белка накапливаться в ядре.

2. Обогащенность положительно заряженными аминокислотными остатками некоторых NLS может быть причиной функционирования этих NLS в качестве

- сигнальных последовательностей, обеспечивающих накопление белков в ядрышке за счет электростатического взаимодействия белков с компонентами ядрышка.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Основные результаты работы были получены самим автором. Личный вклад заключается в анализе данных литературы, планировании и проведении экспериментов, а также в обработке и анализе полученных данных, подготовке публикаций.

Эксперименты по экспрессии прокариотических белков в эукариотической культуре клеток ИеЬа, были проведены при участии Я.Р. Мусиновой, Р.А. Курнаевой, Е.А. Арифулина. Клонирование контрольной группы прокариотических белков осуществлялось совместно с М.Ю. Шубиной. Изучение локализации тропонина I было проведено при участии А.В. Харитонова. Данные, характеризующие механизм накопления белков в ядрышке за счет сигналов ядрышковой локализации, получены совместно с Я.Р. Мусиновой и Е.Ю. Кананыхиной. Таблица сигналов ядрышковой локализации составлялась при участии Я.Р. Мусиновой, Е.В. Шеваля и Д.М. Свистуновой.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Ядро - клеточная органелла, присутствующая во всех эукариотических клетках, за исключением терминально дифференцированных клеток, избавляющихся от ядра в ходе дифференцировки (например, эритроциты). В животных клетках ядро является самой большой и плотной органеллой легко различимой посредством световой микроскопии. В среднем ядро у млекопитающих занимает около 10% объема клетки, и имеет диаметр около 6 мкм.

Основными функциями клеточного ядра являются хранение генетической информации (поддержание целостности ДНК), ее воспроизведение (репликация) и реализация (транксрипкция). ДНК и множество белков, участвующих в структурной организации генетического материала, отделены от цитоплазмы двойной мембраной -ядерной оболочкой, которая выполняет функцию физического барьера и осуществляет

U 1 и и гр

селективный трафик компонентов между нуклеоплазмой и цитоплазмой. Транспорт макромолекул осуществляется преимущественно через специальные белковые комплексы, пронизывающие насквозь ядерную оболочку - ядерные поровые комплексы. Ионы металлов, малые метаболиты и макромолекулы с молекулярной массой менее 40 кДа или размером менее 5 нм в диаметре могут свободно проникать через ядерный поровый комплекс из цитоплазмы в ядро и обратно1. Для импорта в ядро молекул с молекулярным весом более 40 кДа необходимо взаимодействие со специальными адапторными белками - импортинами (также называемыми кариоферинами). Связывание белка происходит за счет узнавания импортинами специальной сигнальной последовательности - сигнала ядерной локализации (Nuclear Localization Signal, NLS), после чего комплекс белок-импортин транслоцируется в ядро. В нуклеоплазме распад комплекса осуществляется посредством взаимодействия с Ran-ГТФ (Рис.1) [18].

1 Данное пороговое значение является достаточно условным, так как на проникновение через пору оказывает влияние, в частности, конформация макромолекул. Обычно уточняется, что данная цифра относится только к глобулярным белкам.

Рис.1. Схема транслокации молекул через ядерный поровый комплекс [18]. Импорт глобулярных молекул с молекулярной массой более 40 кДа осуществляется посредством взаимодействия их КЬБ с адапторными белками - импортинами (кариоферинами). После транслокации в ядро через ядерные поровые комплексы Яап-ГТФ связывается с импортином, в результате чего высвобождается транспортируемый белок, а комплекс импортин-Кап-ГТФ транслоцируется обратно в цитоплазму. В результате гидролиза ГТФ комплекс импортин-Кап-ГТФ диссоциирует на свободный импортин и Яап-ГДФ [18].

1.1. Происхождение клеточного ядра

Возникновение ядра как обособленной клеточной структуры стало ключевым событием в эволюции эукариотической клетки. Разделение ядра и цитоплазмы на два отдельных клеточных компартмента позволило пространственно обособить процессы транскрипции и трансляции, что явилось ключевой предпосылкой для эволюции изощренных способов регуляции экспрессии генов, характерных для эукариот [19].

Ранние этапы эволюции эукариотической клетки остаются малоизученными. В настоящее время отсутствуют способы экспериментального изучения эволюции клетки, большая часть данных получена в результате биоинформатического анализа геномов и

изучения молекулярной организации биологических макромолекул, прежде всего белков. Эти данные касаются в большей степени молекулярной эволюции, а не эволюции структур клетки. Тем не менее, на их основе удалось прояснить многие существенные моменты возникновения эукариотической клетки и, как будет обсуждаться ниже, в первом приближении описать эволюцию некоторых ядерных структур.

Предложено множество различных сценариев происхождения клеточного ядра, которые условно можно разделить на две группы: эндосимбиотические и аутокариогенетические [20]. Согласно эндосимбиотическим гипотезам ядро возникло в результате симбиоза двух предковых форм. В случае аутокариогенеза ядро могло возникнуть в процессе постепенной дифференцировки эндомембранной системы клетки-предшественника, в результате чего геном был обособлен от цитоплазмы системой мембран (Рис. 2).

1.1.1. Эндосимбиотические модели эукариогенеза

В соответствии с эндосимбиотическими теориями эукариогенеза ядро является результатом трансформации эндосимбионта (прокариотической клетки или вируса), ранее поглощенного клеткой-хозяином. Идея об эндосимбиотической происхождении ядра впервые была высказана Константином Сергеевичем Мережковским в 1905 году [21]. К.С. Мережковский постулировал, что ядро эволюционировало из прокариотической клетки, поглощенной амебоидной клеткой, в результате чего первая дала начало ядру, а вторая - цитоплазме. Позднее неоднократно предлагались различные модификации эндосимбиотической теории происхождения ядра [22-26]. Одной из таких модификаций является модель анаэробной синтрофии (Ш-зависимости), описывающая образование цитоплазмы в результате слияния мембран сообщества 3-протеобактерий, окруживших археобактерию метаногена, которая впоследствии стала ядром [27, 28].

Рис. 2. Два основных возможных пути возникновения клеточного ядра (эукариогенеза) [29].

Согласно теориям эндосимбиоза в результате эукариогенеза должен

1 \J \J XJ XJ /— \J \J

сформироваться окруженный непрерывной двойной мембраной клеточный домен, при

этом никак не объясняется взаимосвязь ядерной оболочки с эндоплазматическим

ретикулумом и возникновение в ней ядерных поровых комплексов [30-34]. У эукариот

описан процесс de novo формирования ядерных поровых комплексов [35, 36]. Однако

сложно представить, что такой механизм мог появиться одновременно с

14

возникновением ядра и, причем, очень быстро. Существование ядерного компартмента, окруженного двумя мембранами, без ядерных пор кажется достаточно маловероятным, что уже создает сложности для такого рода гипотез. Более того, у современных эукариот ядерная оболочка и эндоплазматический ретикулум составляют единую вакуолярную систему. Одним из следствий этого является то, что гиперэкспрессия белков ядерной оболочки может драматическим образом изменять организацию эндоплазматического ретикулума [37-39].

Для устранения перечисленных выше противоречий была предложена модель, согласно которой ядро возникло в ответ на поглощение архебактерией а-протеобактерии [40]. В соответствии с данной гипотезой будущая клетка-хозяин (архаеон) для более эффективного обмена веществами увеличивал площадь контакта с прото-митохондрией за счет множественных выпячиваний внешней мембраны (протрузий). Постепенно разрастаясь, протрузии окружили а-протеобактерию, образовав длинную разветвленную сеть каналов, впоследствии ставшую межмембранным пространством ядерной оболочки и эндоплазматического ретикулума эукариот. Просвет же внутри выпячиваний мог быть впоследствии занят ядерным поровым комплексом. Однако на данный момент эта теория пока не имеет каких-либо экспериментальных подтверждений.

1.1.2. Модели аутокариогенеза.

Наиболее распространенный вариант модели аутокариогенеза предполагает возникновение ядерной оболочки и эндоплазматического ретикулума в результате инвагинаций плазматической мембраны прокариотической клетки [34, 41-43]. Одним из ключевых факторов, повлиявших на формирование клеточного ядра, мог являться большой размер генома предкового организма эукариот, по-видимому, организованного в линейные хромосомы, которые посредством своих теломерных участков взаимодействовали с множественными инвагинациями плазматической мембраны -предшественниками эндоплазматического ретикулума [44].

Модель эндоспоры может также рассматриваться как частный случай аутокариогенеза. Согласно данной теории ядро возникло как результат неправильного клеточного деления, когда одна из сестринских клеток была поглощена другой, как это

происходит у некоторых грамположительных бактерий при формировании эндоспор [45].

Также интересна гипотеза, в рамках которой возникновение ядерной оболочки обусловлено липидными пузырьками, сформированными липидами бактерий (прото-митохондрий) в архебактериальной клетке-хозяине [31]. В любом случае, развитие системы внутриклеточных мембран могло способствовать появлению ядерной оболочки. Следовательно, гипотезы аутокариогенеза способны объяснить появление мембранного компонента ядерной оболочки и как результат компартментализацию клетки на цитоплазму и ядро. Следует также отметить, что наличие даже неполной ядерной оболочки без ядерных поровых комплексов может ограничивать диффузию и способствовать возникновению градиентов белков (например, взаимодействующих с хроматином) между генетическим материалом и остальной цитоплазмой [46]. Последнее очень важно по следующей причине. Возникновение сложных клеточных структур не могло происходить мгновенно, поэтому необходимо, чтобы промежуточные состояния этих структур также повышали приспособленность клетки. То, что ядерная оболочка без полностью сформированных поровых комплексов могла приводить к фактическому образованию ядерного и цитоплазматического компартмента или, по крайней мере, к формированию зон клетки, немного различающихся по составу белков, делает такой сценарий происхождения ядра более предпочтительным, по сравнению с эндосимбиотическими гипотезами, которые требуют наличие структур, для которых сложно представить какие-то промежуточные состояния. Впрочем, дальнейшие исследования могут выявить новые факты, которые позволят устранить существующие недостатки эндосимбиотических моделей.

1.2. Ядерный поровый комплекс

Экспрессия генов, рост и деление эукариотической клетки напрямую зависят от постоянного обмена молекулами между ядром и цитоплазмой. Данный транспорт обеспечивается ядерными поровыми комплексами, которые представляют собой гигантские макромолекулярные структуры в составе ядерной мембраны (~60 МДа (дрожжи) и ~ 120 МДа (человек)) (Рис. 3). Для сравнения - рибосомы имеют размер ~3,5 МДа. Количество поровых комплексов в составе ядерной оболочки варьируется среди различных организмов и зависит от типа клетки, а также от условий ее роста.

Например, для ядерной оболочки клеток млекопитающих характерно наличие от 3000 до 5000 поровых комплексов на ядро [7].

1.2.1. Структурная организация ядерного порового комплекса

В состав ядерного порового комплекса современных эукариот входит около 30 различных белков, которые принято называть нуклеопоринами [4, 47]. Нуклеопорины формируют полый цилиндр с симметрией восьмого [4, 47] или девятого порядка [48]. Структурно в ядерном поровом комплексе можно выделить три региона: ядерную корзинку, цитоплазматические филаменты и кольцо [49] (Рис. 3).

Рис. 3. Ядерный поровый комплекс в составе билипидного слоя ядерной мембраны.

Экспериментально полученная томографическая структура БМВ-3105 [50] схематично дополнена элементами ядерной корзинки и цитоплазматическими филаментами [51]. СЯ-внешнее (цитоплазматическое кольцо), ГОС-мембранное кольцо, КЯ - внутреннее (ядерное кольцо).

Ядерная корзинка состоит из кольца нуклеопоринов (№р153 и №р50), которые при взаимодействии с филаментами белка Трг формируют структуру внешне похожую на корзинку [52, 53]. Цитоплазматические филаменты образованы нуклеопоринами №р88, №р124 и №р358 [52, 53]. Кольцо ядерного порового комплекса подразделяют на четыре части: мембранное кольцо, колесо со спицами, внутреннее (ядерное) кольцо и внешнее (цитоплазматическое) кольцо. Мембранное кольцо, состоящее из

нуклеопоринов gp210, Ndc1 и Рот121, выполняет функцию фиксации ядерного порового комплекса в мембране. Структура колеса со спицами, располагающаяся ближе к центру порового комплекса относительно мембранного кольца, сформирована нуклеопоринами Шр53, Шр54, Шр58, Nup62, Nup93, Nup98, Nup155, Шр188 и Nup205 [52, 53]. Внешнее и внутренние кольца состоят из нуклеопоринов №р37, №р43, Nup85, №р96, Nup107, Nup133, Nup160, Sec13 и Seh1[52-58]. Белки аладин и адракалин [59] также являются белками ядерного порового комплекса и взаимодействуют с нуклеопорином Ndc1[59, 60] (Рис.4).

Рис.4. Компоненты ядерного порового комплекса у дрожжей и позвоночных.

Распределение и приблизительное расположение дрожжевых нуклеопоринов (слева) по сравнению с нуклеопоринами позвоночных (справа). Мембранный слой нуклеопоринов обозначен коричневым цветом, каркасный - сиреневым, барьерный - зеленым [61].

Нуклеопорины в составе ядерного порового комплекса можно подразделить на

три функциональные группы: 1) мембранные (membrane nucleoporins), удерживающие

весь комплекс в мембране и составляющие около 10% от общего числа, 2) каркасные

или структурные (scaffold nucleoporins), формирующие его остов (50%) и 3) барьерные

или FG-нуклеопорины (barrier nucleoporins), обеспечивающие селективный транспорт

молекул через поры (40% от общего числа) [62, 63].

Данные три класса нуклеопоринов расположены в трех различных зонах или

слоях ядерного порового комплекса [54, 64]. Первый слой представлен

трансмембранными и мембран-ассоциированными нуклеопоринами, которые помогают

удерживать каркасный слой ядерного порового комплекса в ядерной оболочке. В свою

18

очередь посредством каркасных нуклеопоринов удерживается слой барьерных белков поры, обращенный в центральный туннель и формирующий асимметрию всего комплекса в целом (Рис.4). Именно барьерные нуклеопорины вовлечены в селективный транспорт компонентов через ядерный поровый комплекс. Они обладают неструктурированными пептидными фрагментами, состоящими из многочисленных повторов GLFG (глицин (0)-лейцин^)-фенилаланин^)-глицин^)), FXFG (фенилаланин^)-х-фенилаланин^)-глицин^)) и FG (фенилаланин^)-глицин^)), которые экспонированы в просвет ядерной поры. Посредством данных фрагментов осуществляется удерживание молекулы груза, а также ее транспорт [65, 66].

С помощью белка Pom121 ядерные поровые комплексы прочно связаны не только с ядерной мембраной, но и с белками ядерной ламины [67, 68]. Составляя основную часть мембранного кольца порового комплекса [67], белок Pom121 удерживает пору в мембране, в то время как другие белки комплекса вовлечены во взаимодействия с белками ядерной ламины (ламинами А и B). Данная взаимосвязь также влияет на локализацию ядерного порового комплекса в мембране: ядерных пор больше всего в регионах обогащенных ламином В, и меньше всего рядом с ламинами А. Взаимодействие ядерного порового комплекса с ламинами В осуществляется посредством нуклеопоринов Nup53, Nup153 и Pom121, тогда как Nup88 связывают ламины А [67-70].

1.2.2. Эволюция ядерного порового комплекса

Формирование системы ядерных поровых комплексов произошло, по-видимому, в ответ на формирование ядерной оболочки - физического барьера между геномом и окружающей цитоплазмой, который необходимо было преодолевать для транспорта различных компонентов между ядром и цитоплазмой.

Наибольший вклад в изучение эволюционного происхождения компонентов ядерных поровых комплексов на данный момент внесли работы по расшифровке атомной структуры множества различных каркасных нуклеопоринов. Оказалось, что шесть каркасных нуклеопоринов по своей пространственной организации сходны с элементами коатомерного комплекса COPII (coat protein II), ответственного за транспорт везикул от эндоплазматического ретикулума до комплекса Гольджи. Показано, что нуклеопорины Nup84, Nup125(C) и Nic96 обладают сходной U-образной архитектурой с

белком Sec31, компонентом Sec13/31 комплекса COPП, несмотря на низкую степень консервативности их аминокислотных последовательностей [71-76]. Характер же встраивания молекул белка Sec31 между «лопастями» белка Sec13 аналогичен структурной организации гетеродимеров Кир145(С)^ес13 и Кир85^Ы (Рис. 5) [71, 76, 77]. При этом антипараллельная организация комплекса N^84-^^145(0 сходна с таковой для белка Sec13 внутри димера Sec13/Sec31 (Рис. 6) [72, 77]. Следовательно, весьма вероятно, что, по крайней мере, шесть каркасных нуклеопоринов, составляющих 60% от всего каркасного слоя, и некоторые элементы комплекса COPП имеют общее происхождение.

Рис. 5. Каркасная модель комплекса белков с N^84 и структура каркасных белков ядерного порового комплекса [78]. А. Схематическая диаграмма организации внешнего слоя белков СОР11 комплекса: кубооктаедрона, состоящего из 24 внешних элементов (гетеротетрамеров 8ее31*8ее31). Б. Схема предсказанной пространственной организации каркасных нуклеопоринов, сходной по структуре с внешним слоем белков СОР11 комплекса. Относительное расположение белков в комплексе с №р84 показано для белков Бее13, БеЫ, №р133 и №р120, окрашенными в серый цвет [78].

А Б

1Чир145С Ыир84 ЭесЗ! ЭесЗГ

Рис. 6. Сходство пространственной организации комплекса белков N^84 и Nup145С (А) и аналогичного комплекса Sec31•Sec31 (Б) [79].

Эволюция остальных каркасных нуклеопоринов на данный момент изучена плохо. Структуры белков №р170, №р133 и №р120 [80-83] не обнаруживают какого-либо сходства с другими нуклеопоринами [84] и не гомологичны каким-либо везикулярным белкам. В то же время, для данных нуклеопоринов характерно наличие большого количества взаимодействий с мембранными белками ядерного порового комплекса. Дрожжевые нуклеопорины N^170 и N^157, а также нуклеопорин позвоночных N^155 образуют множественные контакты с мембранными нуклеопоринами [68, 85, 86]. Для структур белков у№р120, vNup133 и у№р170 характерно наличие а-спиралей, взаимодействующих с липидным слоем мембраны [87, 88]. Таким образом, связывание каркасных нуклеопоринов с белками ядерной оболочки похоже на взаимодействие адапторных белков комплекса СОР/клатрин с белками транспортных везикул. Возможно, что некоторые каркасные нуклеопорины имеют эволюционную взаимосвязь с адапторными белками транспортных везикул, хотя нельзя исключать и независимое происхождение этих двух систем белков.

Для мембранных нуклеопоринов удается найти гомологов среди транспортных белков. Люменальный домен §р210 обладает сходством с внеклеточной частью прокариотических интимин-подобных трансмембранных белков [89, 90], тогда как люменальный домен дрожжевого белка Рот152 гомологичен кадгеринам плазматической мембраны [91]. Таким образом, можно предположить, что мембранные

нуклеопорины могли произойти от белков, изначально участвовавших в сортировке молекул на поверхности клеточной мембраны.

Для барьерных FG-нуклеопоринов не обнаруживается каких-либо гомологов среди внешних покровных белков COP/клатриновых комплексов. Однако взаимодействие FG-нуклеопоринов с трансмембранными белками [92, 93] весьма сходно с функцией покровных белков COP/клатринового комплекса по удерживанию молекул груза и обогащению ими формирующейся везикулы.

В случае импортинов-в сравнительный анализ структур и последовательностей выявил их сходство с адапторными белками коатомерного комплекса а и в [90]. Архитектура же импортинов оказалась аналогичной пространственным структурам каркасных нуклеопоринов ядерного порового комплекса [91, 94], в то же время каркасные нуклеопорины Nup188 и Nup192 аналогично импортинам-в могут взаимодействовать с FG-повторами барьерных нуклеопоринов [95]. Таким образом, прослеживается эволюционная взаимосвязь между каркасными нуклеопоринами, импортинами и белками комплекса покровных белков везикул.

1.3. Транспорт молекул в ядро

В отличие от метаболитов, ионов и молекул весом менее ~40 кДа, которые способны диффундировать через ядерный поровый комплекс, большие молекулы, такие как мРНК, тРНК, рибосомные субъединицы и вирусы, оказываются в ядре посредством активного транспорта [96, 97].

Для транслокации белка размером более ~40 кДа через ядерный поровый комплекс ему необходимо наличие определенной сигнальной последовательности -сигнала ядерной локализации (Nuclear Localization Signal, NLS). Существует два основных способа импорта белков в ядро. Канонический путь импорта белка начинается с узнавания NLS адапторным белком - импортином-а, который впоследствии взаимодействует с импортином (кариоферином)-в, в результате чего образуется тримерный комплекс «белок с NLS - импортин-а - импортин-в» [98-100]. Данный комплекс связывается с FG - нуклеопорином ядерного порового комплекса Nup50 [101, 102]. Нуклеопорин Nup50 обладает тремя функциональными доменами: С-концевым, FG - доменом и N-концевым доменом. В ядерной корзинке взаимодействие импортина-в с FG - доменом Nup 50 проводит к его диссоциации из тримерного комплекса. В свою

очередь импортин-а связывается с N-концевым доменом Nup50, в результате чего происходит высвобождение белка с NLS в нуклеоплазму [100]. Далее под действием экспортина CAS (Cellular Apoptosis Susceptibility) и Ran-ГТФ импортин-а диссоциирует с Nup 50 и переходит в комплекс с CAS и Ran-ГТФ [103]. В случае неклассических вариантов NLS, взаимодействие целевого белка с импортином-^ осуществляется напрямую и его транслокация через ядерный поровый комплекс происходит без участия импортина-а [104-106].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лисицына Ольга Михайловна, 2019 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Martin W. Introns and the origin of nucleus-cytosol compartmentalization. / Martin W., Koonin E. V // Nature - 2006. - Vol. 440 - no. 7080 - P.41-45.

2. Hinman V. The evolution of gene regulation / Hinman V., Cary G. // eLife - 2017. - Vol. 6.

3. Alber F. The molecular architecture of the nuclear pore complex. / Alber F., Dokudovskaya S., Veenhoff L.M., Zhang W., Kipper J., Devos D., Suprapto A., Karni-Schmidt O., Williams R., Chait B.T., Sali A., Rout M.P. // Nature - 2007. - Vol. 450 - no. 7170 - P.695-701.

4. Grossman E. Functional Architecture of the Nuclear Pore Complex / Grossman E., Medalia O., Zwerger M. // Annual Review of Biophysics - 2012. - Vol. 41 - no. 1 - P.557-584.

5. Horke S. Nuclear trafficking of la protein depends on a newly identified nucleolar localization signal and the ability to bind RNA / Horke S., Reumann K., Schweizer M., Will H., Heise T. // Journal of Biological Chemistry - 2004. - Vol. 279 - no. 25 - P.26563-26570.

6. Feldherr C.M. The location of the transport gate in the nuclear pore complex. / Feldherr C.M., Akin D. // Journal of cell science - 1997. - Vol. 110 - no. 2 - P.3065-3070.

7. Macara I. Transport into and out of the Nucleus / Macara I. // Microbiology and Molecular Biology Reviews - 2001. - Vol. 65 - no. 4 - P.570-594.

8. Ballas N. Nuclear localization signal binding protein from Arabidopsis mediates nuclear import of Agrobacterium VirD2 protein. / Ballas N., Citovsky V. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 1997. - Vol. 94 - no. 20 -P.10723-8.

9. Lee J.C. Prediction of bacterial proteins carrying a nuclear localization signal and nuclear targeting of HsdM from klebsiella pneumoniae / Lee J.C., Kim D.S., Moon D.C., Lee J.H., Kim M.J., Lee S.M., Lee Y.S., Kang S.W., Lee E.J., Kang S.S., Lee E., Hyun S.H. // Journal of Microbiology - 2009. - Vol. 47 - no. 5 - P.641-645.

10. Kim J.M. Helicobacter pylori HP0425 Targets the Nucleus with DNase I-Like Activity / Kim J.M., Choe M.H., Asaithambi K., Song J.Y., Lee Y.S., Lee J.C., Seo J.H., Kang H.L., Lee K.H., Lee W.K., Cho M.J., Rhee K.H., Youn H.S., Baik S.C. // Helicobacter - 2016. - Vol. 21 - no. 3 - P.218-225.

11. Redrejo-Rodriguez M. Functional eukaryotic nuclear localization signals are widespread in terminal proteins of bacteriophages / Redrejo-Rodriguez M., Munoz-Espin D., Holguera I., Mencia M., Salas M. // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2012. - P.3-8.

12. Cokol M. Finding nuclear localization signals. / Cokol M., Nair R., Rost B. // EMBO

106

reports - 2000. - Vol. 1 - no. 5 - P.411-5.

13. Lacasse E.C. Nuclear localization signals overlap DNA- or RNA-binding domains in nucleic acid-binding proteins // Nucleic Acids Res. - 1995. - Vol. 23. - no. 10. - P. 1647-1656c.

14. Lai G.H. Characterization of the DNA binding activity of structural protein VP1 from chicken anaemia virus / Lai G.H., Lin M.K., Lien Y.Y., Cheng J.H., Sun F.C., Lee M.S., Chen H.J., Lee M.S. // BMC Veterinary Research - 2018. - Vol. 14 - no. 1.

15. Sheng Z. Nuclear and nucleolar localization of 18-kDa fibroblast growth factor-2 is controlled by C-terminal signals / Sheng Z., Lewis J.A., Chirico W.J. // Journal of Biological Chemistry - 2004. - Vol. 279 - no. 38 - P.40153-40160.

16. Boyne J.R. Nucleolar trafficking is essential for nuclear export of intronless herpesvirus mRNA. / Boyne J.R., Whitehouse A. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2006. - Vol. 103 - no. 41 - P.15190-5.

17. Schmidt-Zachmann M.S. Protein localization to the nucleolus: a search for targeting domains in nucleolin. / Schmidt-Zachmann M.S., Nigg E. A. // Journal of cell science - 1993.

- Vol. 105 - no. 3 - P.799-806.

18. Wente S.R. The nuclear pore complex and nuclear transport. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. - 2010.

19. Martin W. Introns and the origin of nucleus-cytosol compartmentalization / Martin W., Koonin E. V. // Nature - 2006- Vol. 440 - P.41-45.

20. Martin W.F. Endosymbiotic theories for eukaryote origin / Martin W.F., Garg S., Zimorski V. // Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences

- 2015. - Vol. 370 - no. 1678.

21. Mereschkowsky C. Über Natur und Ursprung der Chromatophoren im Pflanzenreiche / Mereschkowsky C. // Biologisches Zentrablatt - 1905. - Vol. 25 - P.593-604.

22. Zillig W. Did Eukaryotes Originate by a Fusion Event? / Zillig W., Klenk H.-P., Palm P., Leffers H., Pühler G., Gropp F., Garrett R.A. // Endocytobiosis and Cell Research - 1989. -Vol. 6 - no. 1 - P. 1-25.

23. Gupta R.S. The origin of the eukaryotic cell / Gupta R.S., Golding G.B. // Trends in Biochemical Sciences - 1996. - Vol. 21 - no. 5 - P.166-171.

24. Margulis L. The chimeric eukaryote: origin of the nucleus from the karyomastigont in amitochondriate protists. / Margulis L., Dolan M.F., Guerrero R. // Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America - 2000. - Vol. 97 - no. 13 - P.6954-6959.

25. Forterre P. A new fusion hypothesis for the origin of Eukarya: Better than previous ones, but probably also wrong / Forterre P. // Research in Microbiology - 2011. - Vol. 162 - no. 1 -P. 77-91.

26. Lake J. a Was the nucleus the first endosymbiont? / Lake J. a, Rivera M.C. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 1994. - Vol. 91 - no. 8 - P. 2880-2881.

27. Moreira D. Symbiosis between methanogenic archaea and S-proteobacteria as the origin of eukaryotes: The syntrophic hypothesis / Moreira D., Lopez-Garcia P. // Journal of Molecular Evolution - 1998. - Vol. 47 - no. 5 - P. 517-530.

28. Lopez-Garcia P. Selective forces for the origin of the eukaryotic nucleus / Lopez-Garcia P., Moreira D. // BioEssays - 2006. - Vol. 28 - no. 5 - P. 525-533.

29. Лисицына О.М. Происхождение И Ранние Этапы Эволюции Ядерной Оболочки / Лисицына О.М., Шеваль Е.В. // Биологические Мембраны: Журнал Мембранной И Клеточной Биологии - 2016. - Т. 33 - № 4 - С.243-251.

30. Cavalier-Smith T. Origin of the cell nucleus, mitosis and sex: roles of intracellular coevolution. / Cavalier-Smith T. // Biology direct - 2010. - Vol. 5 - P.7.

31. Martin W. A briefly argued case that mitochondria and plastids are descendants of endosymbionts, but that the nuclear compartment is not / Martin W. // Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences - 1999. - Vol. 266 - no. 1426 - P.1387.

32. Martin W. Archaebacteria (Archaea) and the origin of the eukaryotic nucleus / Martin W. // Current Opinion in Microbiology - 2005. - Vol. 8 - no. 6 - P.630-637.

33. Thiergart T. An evolutionary network of genes present in the eukaryote common ancestor polls genomes on eukaryotic and mitochondrial origin / Thiergart T., Landan G., Schenk M., Dagan T., Martin W.F. // Genome Biology and Evolution - 2012. - Vol. 4 - no. 4 - P.466-485.

34. Cavalier-Smith T. The phagotrophic origin of eukaryotes and phylogenetic classification on protozoa / Cavalier-Smith T. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology - 2002. - Vol. 52 - no. 2 - P.297-354.

35. D'Angelo M. a Supp Data: Nuclear pores form de novo from both sides of the nuclear envelope. / D'Angelo M. a, Anderson D.J., Richard E., Hetzer M.W. // Science (New York,

N.Y.) - 2006. - Vol. 312 - no. 5772 - P.440-443.

36. Dultz E. Live imaging of single nuclear pores reveals unique assembly kinetics and mechanism in interphase / Dultz E., Ellenberg J. // Journal of Cell Biology - 2010. - Vol. 191 - no. 1 - P.15-22.

37. Volkova E.G. Self-organization of cellular structures induced by the overexpression of nuclear envelope proteins: a correlative light and electron microscopy study / Volkova E.G., Kurchashova S.Y., Polyakov V.Y., Sheval E. V. // Journal of Electron Microscopy - 2011. -Vol. 60 - no. 1 - P.57-71.

38. Volkova E.G. The overexpression of nuclear envelope protein Lap2p induces endoplasmic reticulum reorganisation via membrane stacking. / Volkova E.G., Abramchuk S.S., Sheval E. V // Biology open - 2012. - Vol. 1 - no. 8 - P.802-5.

39. Волкова Е.Г., Курчашова С.Ю., Шеваль Е.В. Поляков.В.Ю. Самоорганизация агрегатов мембран эндоплазматического ретикулума в клетках с гиперэкспрессией нуклеопорина POM121 / Волкова Е.Г., Курчашова С.Ю., Шеваль Е.В. Поляков.В.Ю. // Биологические мембраны - 2009. - Т. 26 - С.401-407.

40. Baum D. An inside-out origin for the eukaryotic cell / Baum D. a, Baum B. // BMC Biology - 2014. - Vol. 12 - P.76.

41. Cavalier-Smith T. The origin of eukaryote and archaebacterial cells / Cavalier-Smith T. // Annals of the New York Academy of Science - 1987. - Vol. 503 - P. 17-54.

42. Cavalier-Smith T. Origin of the cell nucleus / Cavalier-Smith T. // BioEssays - 1988. -Vol. 9 - no. 2-3 - P.72-78.

43. Cavalier-Smith T. Only six kingdoms of life. / Cavalier-Smith T. // Proceedings. Biological sciences / The Royal Society - 2004. - Vol. 271 - no. 1545 - P. 1251-62.

44. Lode T. For quite a few chromosomes more: The origin of eukaryotes... / Lode T. // Journal of Molecular Biology - 2012. - Vol. 423 - no. 2 - P. 135-142.

45. Gould G.W. On a possible relationship between bacterial endospore formation and the origin of eukaryotic cells. / Gould G.W., Dring G.J. // Journal of theoretical biology - 1979. -Vol. 81 - no. 1 - P.47-53.

46. Jekely G. Origin of the nucleus and Ran-dependent transport to safeguard ribosome biogenesis in a chimeric cell / Jekely G. // Biology Direct - 2008. - Vol. 3 - no. 1 - P.31.

47. Alber F. The molecular architecture of the nuclear pore complex / Alber F., Dokudovskaya S., Veenhoff L.M., Zhang W., Kipper J., Devos D., Suprapto A., Karni-Schmidt O., Williams

R., Chait B.T., Sali A., Rout M.P. // Nature - 2007. - Vol. 450 - no. 7170 - P.695-701.

48. Loschberger a. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution / Loschberger a., Franke C., Krohne G., Linde S. van de, Sauer M. // Journal of Cell Science - 2014. - Vol. 127 - no. 20 - P.4351-4355.

49. D'Angelo M.A. Structure, dynamics and function of nuclear pore complexes // Trends Cell Biol. - 2008. - Vol. 18. - no. 10. - 456-466c.

50. Appen A. Von In situ structural analysis of the human nuclear pore complex / Appen A. Von, Kosinski J., Sparks L., Ori A., DiGuilio A.L., Vollmer B., Mackmull M.-T., Banterle N., Parca L., Kastritis P., Buczak K., Mosalaganti S., Hagen W., Andres-Pons A., Lemke E. a., Bork P., Antonin W., Glavy J.S., Bui K.H., Beck M. // Nature - 2015. - Vol. 526 - no. 7571 -P.140-143.

51. Schwartz T.U. The Structure Inventory of the Nuclear Pore Complex / Schwartz T.U. // Journal of Molecular Biology - 2016. - Vol. 428 - no. 10 - P. 1986-2000.

52. Hoelz A. The structure of the nuclear pore complex. / Hoelz A., Debler E.W., Blobel G. // Annual review of biochemistry - 2011. - Vol. 80 - P.613-643.

53. Brohawn S.G. The Nuclear Pore Complex Has Entered the Atomic Age // Structure. -2009. - Vol. 17. - no. 9. - 1156-1168c.

54. Alber F. Determining the architectures of macromolecular assemblies. / Alber F., Dokudovskaya S., Veenhoff L.M., Zhang W., Kipper J., Devos D., Suprapto A., Karni-Schmidt O., Williams R., Chait B.T., Rout M.P., Sali A. // Nature - 2007. - Vol. 450 - no. November - P.683-694.

55. Beck M. Snapshots of nuclear pore complexes in action captured by cryo-electron tomography. / Beck M., Lucic V., Förster F., Baumeister W., Medalia O. // Nature - 2007. -Vol. 449 - no. 7162 - P.611-615.

56. Cronshaw J.M. Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex / Cronshaw J.M., Krutchinsky A.N., Zhang W., Chait B.T., Matunis M.J. // The Journal of Cell Biology -2002. - Vol. 991513 - no. 5 - P.21-9525.

57. Lim R.Y.H. Towards reconciling structure and function in the nuclear pore complex / Lim R.Y.H., Aebi U., Fahrenkrog B. // Histochemistry and cell biology - 2008. - Vol. 129 - no. 2 - P.105-16.

58. Stoffler D. Cryo-electron tomography provides novel insights into nuclear pore architecture: Implications for nucleocytoplasmic transport / Stoffler D., Feja B., Fahrenkrog

B., Walz J., Typke D., Aebi U. // Journal of Molecular Biology - 2003. - Vol. 328 - no. 1 -P.119-130.

59. Kind B. The nuclear pore complex protein ALADIN is anchored via NDC1 but not via POM121 and GP210 in the nuclear envelope / Kind B., Koehler K., Lorenz M., Huebner A. // Biochemical and Biophysical Research Communications - 2009. - Vol. 390 - no. 2 - P.205-210.

60. Yamazumi Y. The transmembrane nucleoporin NDC1 is required for targeting of ALADIN to nuclear pore complexes / Yamazumi Y., Kamiya A., Nishida A., Nishihara A., Iemura S. ichiro, Natsume T., Akiyama T. // Biochemical and Biophysical Research Communications -2009. - Vol. 389 - no. 1 - P. 100-104.

61. Onischenko E. Role of the Ndc1 interaction network in yeast nuclear pore complex assembly and maintenance / Onischenko E., Stanton L.H., Madrid a. S., Kieselbach T., Weis K. // The Journal of Cell Biology - 2009. - Vol. 185 - no. 3 - P.475-491.

62. Grossman E. Functional Architecture of the Nuclear Pore Complex / Grossman E., Medalia O., Zwerger M. // Annual Review of Biophysics - 2012. - Vol. 41 - no. 1 - P.557-584.

63. Rout M.P. Pores for thought: nuclear pore complex proteins / Rout M.P., Wente S.R. // Trends Cell Biol - 1994. - Vol. 4 - no. 10 - P.357-365.

64. Alber F. The molecular architecture of the nuclear pore complex. / Alber F., Dokudovskaya S., Veenhoff L., Zhang W., Kipper J., Devos D., Suprapto A., Karni-Schmidt O., Williams R., Chait B., Sali A., Rout M. // Nature - 2007. - Vol. 450 - no. 7170 - P.695-701.

65. Yang W. "Natively unfolded" nucleoporins in nucleocytoplasmic transport: clustered or evenly distributed? / Yang W. // Nucleus (Austin, Tex.) - 2011. - Vol. 2 - no. 1 - P. 10-6.

66. Denning D.P. Disorder in the nuclear pore complex: the FG repeat regions of nucleoporins are natively unfolded. / Denning D.P., Patel S.S., Uversky V., Fink A.L., Rexach M. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2003. -Vol. 100 - no. 5 - P.2450-2455.

67. Mitchell J.M. Pom121 links two essential subcomplexes of the nuclear pore complex core to the membrane / Mitchell J.M., Mansfeld J., Capitanio J., Kutay U., Wozniak R.W. // Journal of Cell Biology - 2010. - Vol. 191 - no. 3 - P.505-521.

68. Hawryluk-Gara L.A. Nup53 Is Required for Nuclear Envelope and Nuclear Pore Complex Assembly / Hawryluk-Gara L.A., Platani M., Santarella R., Wozniak R.W., Mattaj I.W. //

Molecular Biology of the Cell - 2008. - Vol. 19 - P. 1753-1762.

69. Smythe C. Incorporation of the nuclear pore basket protein nup153 into nuclear pore structures is dependent upon lamina assembly: evidence from cell-free extracts of Xenopus eggs. / Smythe C., Jenkins H.E., Hutchison C.J. // The EMBO journal - 2000. - Vol. 19 - no. 15 - P.3918-3931.

70. Lussi Y.C. The nucleoporin Nup88 is interacting with nuclear lamin A. / Lussi Y.C., Hugi I., Laurell E., Kutay U., Fahrenkrog B. // Molecular biology of the cell - 2011. - Vol. 22 - no. 7 - P.1080-90.

71. Brohawn S.G. NIH Public Access / Brohawn S.G., Leksa N.C., Spear E.D., Rajashankar K.R., Schwartz T.U. - 2009. - Vol. 322 - no. 5906 - P. 1369-1373.

72. Brohawn S.G. Molecular architecture of the Nup84-Nup145-Sec13 edge element in the nuclear pore complex lattice / Brohawn S.G., Schwartz T.U. - 2012. - Vol. 16 - no. 11 -P. 1173-1177.

73. Nagy V. Structure of a trimeric nucleoporin complex reveals alternate oligomerization states. / Nagy V., Hsia K.-C., Debler E.W., Kampmann M., Davenport A.M., Blobel G., Hoelz A. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America -2009. - Vol. 106 - no. 42 - P. 17693-17698.

74. Jeudy S. Crystal Structure of Nucleoporin Nic96 Reveals a Novel, Intricate Helical Domain Architecture / Jeudy S., Schwartz T.U. // Journal of Biological Chemistry - 2007. -Vol. 282 - no. 48 - P.34904-34912.

75. Schrader N. Structural Basis of the Nic96 Subcomplex Organization in the Nuclear Pore Channel / Schrader N., Stelter P., Flemming D., Kunze R., Hurt E., Vetter I.R. // Molecular Cell - 2008. - Vol. 29 - no. 1 - P.46-55.

76. Debler E.W. A Fence-like Coat for the Nuclear Pore Membrane / Debler E.W., Ma Y., Seo H.-S., Hsia K.-C., Noriega T.R., Blobel G., Hoelz A. // Molecular Cell - 2008. - Vol. 32 - no. 6 - P.815-826.

77. Fath S. Structure and Organization of Coat Proteins in the COPII Cage / Fath S., Mancias J.D., Bi X., Goldberg J. // Cell - 2007. - Vol. 129 - no. 7 - P.1325-1336.

78. Brohawn S.G. Structural evidence for common ancestry of the nuclear pore complex and vesicle coats. / Brohawn S.G., Leksa N.C., Spear E.D., Rajashankar K.R., Schwartz T.U. // Science (New York, N.Y.) - 2008.

79. Brohawn S.G. Molecular architecture of the Nup84-Nup145C-Sec13 edge element in the

nuclear pore complex lattice / Brohawn S.G., Schwartz T.U. // Nature Structural and Molecular Biology - 2009.

80. Berke I.C. Structural and functional analysis of Nup133 domains reveals modular building blocks of the nuclear pore complex / Berke I.C. // The Journal of Cell Biology - 2004. - Vol. 167 - no. 4 - P.591-597.

81. Boehmer T. Structural and functional studies of Nup107/Nup133 interaction and its implications for the architecture of the nuclear pore complex. / Boehmer T., Jeudy S., Berke I.C., Schwartz T.U. // Molecular cell - 2008. - Vol. 30 - no. 6 - P.721-31.

82. Leksa N.C. The structure of the scaffold nucleoporin Nup120 reveals a new and unexpected domain architecture. / Leksa N.C., Brohawn S.G., Schwartz T.U. // Structure (London, England : 1993) - 2009. - Vol. 17 - no. 8 - P. 1082-91.

83. Seo H.-S. Structural and functional analysis of Nup120 suggests ring formation of the Nup84 complex. / Seo H.-S., Ma Y., Debler E.W., Wacker D., Kutik S., Blobel G., Hoelz A. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2009. -Vol. 106 - no. 34 - P. 14281-6.

84. Whittle J.R.R. Architectural nucleoporins Nup157/170 and Nup133 are structurally related and descend from a second ancestral element. / Whittle J.R.R., Schwartz T.U. // The Journal of biological chemistry - 2009. - Vol. 284 - no. 41 - P.28442-52.

85. Makio T. The nucleoporins Nup170p and Nup157p are essential for nuclear pore complex assembly / Makio T., Stanton L.H., Lin C.-C., Goldfarb D.S., Weis K., Wozniak R.W. // The Journal of Cell Biology - 2009. - Vol. 185 - no. 3 - P.459-473.

86. Mitchell J.M. Pom121 links two essential subcomplexes of the nuclear pore complex core to the membrane / Mitchell J.M., Mansfeld J., Capitanio J., Kutay U., Wozniak R.W. // The Journal of Cell Biology - 2010. - Vol. 191 - no. 3 - P.505-521.

87. Doucet C.M. Cell Cycle-Dependent Differences in Nuclear Pore Complex Assembly in Metazoa / Doucet C.M., Talamas J. a., Hetzer M.W. // Cell - 2010. - Vol. 141 - no. 6 -P.1030-1041.

88. Drin G. A general amphipathic alpha-helical motif for sensing membrane curvature. / Drin G., Casella J.-F., Gautier R., Boehmer T., Schwartz T.U., Antonny B. // Nature structural & molecular biology - 2007. - Vol. 14 - no. 2 - P. 138-46.

89. Luo Y. Crystal structure of enteropathogenic Escherichia coli intimin-receptor complex. / Luo Y., Frey E. a, Pfuetzner R. a, Creagh a L., Knoechel D.G., Haynes C. a, Finlay B.B.,

Strynadka N.C. // Nature - 2000. - Vol. 405 - no. 1999 - P. 1073-1077.

90. Mans B.J. Comparative genomics, evolution and origins of the nuclear envelope and nuclear pore complex / Mans B.J., Anantharaman V., Aravind L., Koonin E. V. // Cell Cycle -2004. - Vol. 3 - no. 12 - P.1612-1637.

91. Devos D. Simple fold composition and modular architecture of the nuclear pore complex. / Devos D., Dokudovskaya S., Williams R., Alber F., Eswar N., Chait B.T., Rout M.P., Sali A. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2006. -Vol. 103 - no. 7 - P.2172-2177.

92. King M.C. Karyopherin-mediated import of integral inner nuclear membrane proteins. / King M.C., Lusk C.P., Blobel G. // Nature - 2006. - Vol. 442 - no. August - P. 1003-1007.

93. Theerthagiri G. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. / Theerthagiri G., Eisenhardt N., Schwarz H., Antonin W. // The Journal of cell biology - 2010. - Vol. 189 - no. 7 - P.1129-42.

94. Stuwe T. Evidence for an evolutionary relationship between the large adaptor nucleoporin Nup192 and karyopherins. / Stuwe T., Lin D.H., Collins L.N., Hurt E., Hoelz A. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2014. - Vol. 111 - no. 7 - P.2530-5.

95. Andersen K.R. Scaffold nucleoporins Nup188 and Nup192 share structural and functional properties with nuclear transport receptors / Andersen K.R., Onischenko E., Tang J.H., Kumar P., Chen J.Z., Ulrich A., Liphardt J.T., Weis K., Schwartz T.U. // eLife - 2013. - Vol. 2013 -no. 2 - P.1-20.

96. Weis K. Regulating access to the genome: Nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle // Cell. - 2003. - Vol. 112. - no. 4. - 441-451c.

97. Gorlich D. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. / Gorlich D., Kutay U. // Annual review of cell and developmental biology - 1999. - Vol. 15 - P.607-60.

98. Fried H. Nucleocytoplasmic transport: Taking an inventory // Cell. Mol. Life Sci. - 2003. -Vol. 60. - no. 8. - 1659-1688c.

99. Cook A. Structural biology of nucleocytoplasmic transport. / Cook A., Bono F., Jinek M., Conti E. // Annual review of biochemistry - 2007. - Vol. 76 - P.647-671.

100. Stewart M. Molecular mechanism of the nuclear protein import cycle. / Stewart M. // Nature reviews. Molecular cell biology - 2007. - Vol. 8 - no. 3 - P. 195-208.

101. Ribbeck K. The permeability barrier of nuclear pore complexes appears to operate via

hydrophobic exclusion / Ribbeck K., Görlich D. // EMBO Journal - 2002. - Vol. 21 - no. 11 -P.2664-2671.

102. Bayliss R. Structural basis for the interaction between FxFG nucleoporin repeats and importin-beta in nuclear trafficking. / Bayliss R., Littlewood T., Stewart M. // Cell - 2000. -Vol. 102 - no. 1 - P.99-108.

103. Matsuura Y. Nup50/Npap60 function in nuclear protein import complex disassembly and importin recycling / Matsuura Y., Stewart M. // EMBO Journal - 2005. - Vol. 24 - no. 21 -P.3681-3689.

104. Cingolani G. Molecular basis for the recognition of a nonclassical nuclear localization signal by importin beta. / Cingolani G., Bednenko J., Gillespie M.T., Gerace L. // Molecular cell - 2002. - Vol. 10 - P.1345-1353.

105. Lee S.J. The structure of importin-beta bound to SREBP-2: nuclear import of a transcription factor. / Lee S.J., Sekimoto T., Yamashita E., Nagoshi E., Nakagawa A., Imamoto N., Yoshimura M., Sakai H., Chong K.T., Tsukihara T., Yoneda Y. // Science (New York, N.Y.) - 2003. - Vol. 302 - no. 5650 - P.1571-5.

106. Lee B.J. Rules for nuclear localization sequence recognition by karyopherin beta 2. / Lee B.J., Cansizoglu A.E., Süel K.E., Louis T.H., Zhang Z., Chook Y.M. // Cell - 2006. - Vol. 126 - no. 3 - P.543-58.

107. Ström A.C. Importin-beta-like nuclear transport receptors. / Ström A.C., Weis K. // Genome biology - 2001. - Vol. 2 - no. 6 - P.REVIEWS3008.

108. Yang W. Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes / Yang W., Gelles J., Musser S.M. // Proc Natl Acad Sci U S A - 2004. - Vol. 101 - no. 35 -P.12887-12892.

109. Ribbeck K. Kinetic analysis of translocation through nuclear pore complexes. / Ribbeck K., Görlich D. // The EMBO journal - 2001. - Vol. 20 - no. 6 - P.1320-30.

110. Martoglio B. Signal sequences: More than just greasy peptides // Trends Cell Biol. -1998. - Vol. 8. - no. 10. - 410-415c.

111. Lange A. Classical nuclear localization signals: definition, function, and interaction with importin alpha. / Lange A., Mills R.E., Lange C.J., Stewart M., Devine S.E., Corbett A.H. // The Journal of biological chemistry - 2007. - Vol. 282 - no. 8 - P.5101-5.

112. Dingwall C. Nuclear targeting sequences--a consensus? / Dingwall C., Laskey R.A. // Trends in biochemical sciences - 1991. - Vol. 16 - no. 12 - P.478-81.

113. Kalderon D. A short amino acid sequence able to specify nuclear location / Kalderon D., Roberts B.L., Richardson W.D., Smith A.E. // Cell - 1984. - Vol. 39 - no. 3 PART 2 - P.499-509.

114. Dingwall C. The nucleoplasmin nuclear location sequence is larger and more complex than that of SV-40 large T antigen. / Dingwall C., Robbins J., Dilworth S.M., Roberts B., Richardson W.D. // Journal of Cell Biology - 1988. - Vol. 107 - no. 3 - P.841-849.

115. Robbins J. Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: Identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence / Robbins J., Dilworth S.M., Laskey R.A., Dingwall C. // Cell - 1991. - Vol. 64 - no. 3 - P.615-623.

116. Chelsky D. Sequence requirements for synthetic peptide-mediated translocation to the nucleus. / Chelsky D., Ralph R., Jonak G. // Molecular and cellular biology - 1989. - Vol. 9 -no. 6 - P.2487-2492.

117. Hodel M.R. Dissection of a nuclear localization signal. / Hodel M.R., Corbett a H., Hodel a E. // The Journal of biological chemistry - 2001. - Vol. 276 - no. 2 - P.1317-1325.

118. Fontes M.R.M. Structural basis for the specificity of bipartite nuclear localization sequence binding by importin-a / Fontes M.R.M., Teh T., Jan D., Brinkworth R.I., Kobe B. // Journal of Biological Chemistry - 2003. - Vol. 278 - no. 30 - P.27981-27987.

119. Kosugi S. Design of Peptide Inhibitors for the Importin a/p Nuclear Import Pathway by Activity-Based Profiling / Kosugi S., Hasebe M., Entani T., Takayama S., Tomita M., Yanagawa H. // Chemistry and Biology - 2008. - Vol. 15 - no. 9 - P.940-949.

120. Kosugi S. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. / Kosugi S., Hasebe M., Tomita M., Yanagawa H. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2009. - Vol. 106 - no. 25 - P. 10171-10176.

121. Conti E. Crystallographic analysis of the recognition of a nuclear localization signal by the nuclear import factor karyopherin a / Conti E., Uy M., Leighton L., Blobel G., Kuriyan J. // Cell - 1998. - Vol. 94 - no. 2 - P. 193-204.

122. Kobe B. Autoinhibition by an internal nuclear localization signal revealed by the crystal structure of mammalian importin a. / Kobe B. // Nature structural biology - 1999. - Vol. 6 -no. 4 - P.388-397.

123. Soniat M. Nuclear localization signals for four distinct karyopherin-P nuclear import systems / Soniat M., Chook Y.M. // Biochemical Journal - 2015.

124. Fontes M.R. Structural basis of recognition of monopartite and bipartite nuclear localization sequences by mammalian importin-alpha. / Fontes M.R., Teh T., Kobe B. // Journal of molecular biology - 2000. - Vol. 297 - no. 5 - P. 1183-94.

125. Conti E. Crystallographic analysis of the specific yet versatile recognition of distinct nuclear localization signals by karyopherin a / Conti E., Kuriyan J. // Structure - 2000. - Vol. 8 - no. 3 - P.329-338.

126. Gross S. Five subunits are required for reconstitution of the cleavage and polyadenylation activities of Saccharomyces cerevisiae cleavage factor I. / Gross S., Moore C. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2001. - Vol. 98 - no. 11

- P.6080-5.

127. Leung S.W. Dissection of the karyopherin a nuclear localization signal (NLS)-binding groove: Functional requirements for NLS binding / Leung S.W., Harreman M.T., Hodel M.R., Hodel A.E., Corbett A.H. // Journal of Biological Chemistry - 2003. - Vol. 278 - no. 43 -P.41947-41953.

128. Lange A. A PY-NLS nuclear targeting signal is required for nuclear localization and function of the Saccharomyces cerevisiae mRNA-binding protein Hrp1 / Lange A., Mills R.E., Devine S.E., Corbett A.H. // Journal of Biological Chemistry - 2008. - Vol. 283 - no. 19 -P.12926-12934.

129. Xu D. Recognition of nuclear targeting signals by Karyopherin-ß proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2010. - Vol. 20. - no. 6. - 782-790c.

130. Palmeri D. Importin Beta Can Mediate the Nuclear Import of an Arginine-Rich Nuclear Localization Signal in the Absence of Importin Alpha / Palmeri D., Malim M.H. // Molecular and Cellular Biology - 1999. - Vol. 19 - no. 2 - P.1218-1225.

131. Truant R. The Arginine-Rich Domains Present in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Tat and Rev Function as Direct Importin beta -Dependent Nuclear Localization Signals / Truant R., Cullen B.R. // Mol. Cell. Biol. - 1999. - Vol. 19 - no. 2 - P.1210-1217.

132. Henderson B.R. Interactions between HIV Rev and nuclear import and export factors: the Rev nuclear localisation signal mediates specific binding to human importin-beta. / Henderson B.R., Percipalle P. // Journal of molecular biology - 1997. - Vol. 274 - no. 5 - P.693-707.

133. Jäkel S. Importin ß, transportin, RanBP5 and RanBP7 mediate nuclear import of ribosomal proteins in mammalian cells / Jäkel S., Görlich D. // EMBO Journal - 1998. - Vol. 17 - no. 15 - P.4491-4502.

134. Leslie D.M. Characterization of karyopherin cargoes reveals unique mechanisms of Kap121p-mediated nuclear import. / Leslie D.M., Zhang W., Timney B.L., Chait B.T., Rout M.P., Wozniak R.W., Aitchison J.D. // Molecular and cellular biology - 2004. - Vol. 24 - no. 19 - P.8487-503.

135. Lee D.C. Kap104p-mediated nuclear import. Nuclear localization signals in mRNA-binding proteins and the role of Ran and RNA. / Lee D.C., Aitchison J.D. // The Journal of biological chemistry - 1999. - Vol. 274 - no. 41 - P.29031-7.

136. Moroianu J. Distinct nuclear import and export pathways mediated by members of the karyopherin p family // J. Cell. Biochem. - 1998. - Vol. 70. - no. 2. - 231-239c.

137. Lam M.H. Molecular dissection of the importin beta1-recognized nuclear targeting signal of parathyroid hormone-related protein. / Lam M.H., Hu W., Xiao C.Y., Gillespie M.T., Jans D. a // Biochemical and biophysical research communications - 2001. - Vol. 282 - no. 2 -P.629-34.

138. Weighardt F. Nucleo-cytoplasmic distribution of human hnRNP proteins: a search for the targeting domains in hnRNP A1 / Weighardt F., Biamonti G., Riva S. // J Cell Sci - 1995. -Vol. 108- no. Pt 2- P.545-55.

139. Siomi H. A nuclear localization domain in the hnRNP A1 protein / Siomi H., Dreyfuss G. // Journal of Cell Biology - 1995. - Vol. 129 - no. 3 - P.551-560.

140. Wodrich H. Adenovirus core protein pVII is translocated into the nucleus by multiple import receptor pathways. / Wodrich H., Cassany A., D'Angelo M.A., Guan T., Nemerow G., Gerace L. // Journal of virology - 2006. - Vol. 80 - no. 19 - P.9608-9618.

141. Nakai K. A knowledge base for predicting protein localization sites in eukaryotic cells. / Nakai K., Kanehisa M. // Genomics - 1992. - Vol. 14 - no. 4 - P.897-911.

142. Brameier M. NucPred-predicting nuclear localization of proteins. / Brameier M., Krings A., MacCallum R.M. // Bioinformatics (Oxford, England) - 2007. - Vol. 23 - no. 9 - P.1159-60.

143. Kosugi S. Six classes of nuclear localization signals specific to different binding grooves of importin a / Kosugi S., Hasebe M., Matsumura N., Takashima H., Miyamoto-Sato E., Tomita M., Yanagawa H. // Journal of Biological Chemistry - 2009. - Vol. 284 - no. 1 -P.478-485.

144. Nguyen Ba A.N. NLStradamus: a simple Hidden Markov Model for nuclear localization signal prediction. / Nguyen Ba A.N., Pogoutse A., Provart N., Moses A.M. // BMC

bioinformatics - 2009. - Vol. 10 - no. 1 - P.202.

145. Mehdi A.M. A probabilistic model of nuclear import of proteins. / Mehdi A.M., Sehgal M.S.B., Kobe B., Bailey T.L., Bodén M. // Bioinformatics (Oxford, England) - 2011. - Vol. 27 - no. 9 - P.1239-1246.

146. Lin J. SeqNLS: nuclear localization signal prediction based on frequent pattern mining and linear motif scoring. / Lin J., Hu J. // PloS one - 2013. - Vol. 8 - no. 10 - P.e76864.

147. Cherezova L. Conservation of complex nuclear localization signals utilizing classical and non-classical nuclear import pathways in LANA homologs of KSHV and RFHV / Cherezova L., Burnside K.L., Rose T.M. // PLoS ONE - 2011. - Vol. 6 - no. 4.

148. Neumann G. Nuclear import and export of influenza virus nucleoprotein. / Neumann G., Castrucci M.R., Kawaoka Y. // Journal of virology - 1997. - Vol. 71 - no. 12 - P.9690-700.

149. Cros J.F. An unconventional NLS is critical for the nuclear import of the influenza A virus nucleoprotein and ribonucleoprotein / Cros J.F., García-Sastre A., Palese P. // Traffic -2005. - Vol. 6 - no. 3 - P.205-213.

150. Timani K.A. Nuclear/nucleolar localization properties of C-terminal nucleocapsid protein of SARS coronavirus / Timani K.A., Liao Q., Ye L., Zeng Y., Liu J., Zheng Y., Ye L., Yang X., Lingbao K., Gao J., Zhu Y. // Virus Research - 2005. - Vol. 114 - no. 1-2 - P.23-34.

151. Lee J.H. Prediction and screening of nuclear targeting proteins with nuclear localization signals in Helicobacter pylori / Lee J.H., Jun S.H., Baik S.C., Kim D.R., Park J.Y., Lee Y.S., Choi C.H., Lee J.C. // Journal of Microbiological Methods - 2012. - Vol. 91 - no. 3 - P.490-496.

152. Guo M. Evolutionary gradient of predicted nuclear localization signals (NLS)-bearing proteins in genomes of family Planctomycetaceae / Guo M., Yang R., Huang C., Liao Q., Fan G., Sun C., Lee S.M.Y. // BMC Microbiology - 2017. - Vol. 17 - no. 1 - P.1-10.

153. Melnikov S. Insights into the origin of the nuclear localization signals in conserved ribosomal proteins. / Melnikov S., Ben-Shem A., Yusupova G., Yusupov M. // Nature communications - 2015. - Vol. 6 - P.7382.

154. Moroianu J. Identification of the nucleolar targeting signal of human angiogenin / Moroianu J., Riordan J.F. // Biochem Biophys Res Commun - 1994. - Vol. 203 - no. 3 -P.1765-1772.

155. Créancier L. Determination of the functional domains involved in nucleolar targeting of nucleolin. / Créancier L., Prats H., Zanibellato C., Amalric F., Bugler B. // Molecular biology

of the cell - 1993. - Vol. 4 - no. 12 - P.1239-1250.

156. Carmo-Fonseca M. To be or not to be in the nucleolus / Carmo-Fonseca M., Mendes-Soares L., Campos I. // Nat Cell Biol - 2000. - Vol. 2 - no. 6 - P.E107-12.

157. Catez F. Unique motif for nucleolar retention and nuclear export regulated by phosphorylation. / Catez F., Erard M., Schaerer-Uthurralt N., Kindbeiter K., Madjar J.-J., Diaz J.-J. // Molecular and cellular biology - 2002. - Vol. 22 - no. 4 - P.1126-1139.

158. Rowland R.R. The localization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus of infected cells and identification of a potential nucleolar localization signal sequence / Rowland R.R., Kervin R., Kuckleburg C., Sperlich A., Benfield D.A. // Virus Res - 1999. - Vol. 64 - no. 1 - P.1-12.

159. You J. A model for the dynamic nuclear/nucleolar/cytoplasmic trafficking of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) nucleocapsid protein based on live cell imaging / You J., Howell G., Pattnaik A.K., Osorio F.A., Hiscox J.A. // Virology - 2008. -Vol. 378 - no. 1 - P.34-47.

160. Rowland R.R. Peptide domains involved in the localization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus / Rowland R.R., Schneider P., Fang Y., Wootton S., Yoo D., Benfield D.A. // Virology - 2003. - Vol. 316 - no. 0042-6822 (Print) - P. 135-145.

161. Yoo D. Colocalization and interaction of the porcine arterivirus nucleocapsid protein with the small nucleolar RNA-associated protein fibrillarin. / Yoo D., Wootton S.K., Li G., Song C., Rowland R.R. // Journal of virology - 2003. - Vol. 77 - no. 22 - P.12173-12183.

162. Korgaonkar C. Nucleophosmin (B23) targets ARF to nucleoli and inhibits its function. / Korgaonkar C., Hagen J., Tompkins V., Frazier A.A., Allamargot C., Quelle F.W., Quelle D.E. // Molecular and cellular biology - 2005. - Vol. 25 - no. 4 - P. 1258-71.

163. Gunawardena S.R. NOM1 targets protein phosphatase I to the nucleolus / Gunawardena S.R., Ruis B.L., Meyer J.A., Kapoor M., Conklin K.F. // Journal of Biological Chemistry -2008. - Vol. 283 - no. 1 - P.398-404.

164. Hiscox J. a RNA viruses: hijacking the dynamic nucleolus / Hiscox J. a // Nature Reviews Microbiology - 2007. - Vol. 5 - no. 2 - P. 119-127.

165. Kim S.H. Interaction of a plant virus-encoded protein with the major nucleolar protein fibrillarin is required for systemic virus infection. / Kim S.H., Macfarlane S., Kalinina N.O., Rakitina D. V, Ryabov E. V, Gillespie T., Haupt S., Brown J.W.S., Taliansky M. //

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2007. -Vol. 104 - no. 26 - P.11115-20.

166. Scott M.S. NoD: a Nucleolar localization sequence detector for eukaryotic and viral proteins. / Scott M.S., Troshin P. V, Barton G.J. // BMC bioinformatics - 2011. - Vol. 12 -P.317.

167. Scott M.S. Characterization and prediction of protein nucleolar localization sequences / Scott M.S., Boisvert F.M., McDowall M.D., Lamond A.I., Barton G.J. // Nucleic Acids Research - 2010. - Vol. 38 - no. 21 - P.7388-7399.

168. Stegh A.H. DEDD, a novel death effector domain-containing protein, targeted to the nucleolus / Stegh A.H., Schickling O., Ehret A., Scaffidi C., Peterhansel C., Hofmann T.G., Grummt I., Krammer P.H., Peter M.E. // EMBO Journal - 1998. - Vol. 17 - no. 20 - P.5974-5986.

169. Stark L. a Nucleolar Sequestration of RelA ( p65 ) Regulates NF- k B-Driven Transcription and Apoptosis / Stark L. a, Dunlop M.G. // Molecular and Cellular Biology -2005. - Vol. 25 - no. 14 - P.5985-6004.

170. Goyal P. Phosphorylation-dependent regulation of unique nuclear and nucleolar localization signals of LIM kinase 2 in endothelial cells / Goyal P., Pandey D., Siess W. // Journal of Biological Chemistry - 2006. - Vol. 281 - no. 35 - P.25223-25230.

171. Caron E. Identification of two distinct intracellular localization signals in STT3-B / Caron E., Cote C., Parisien M., Major F., Perreault C. // Arch Biochem Biophys - 2006. - Vol. 445 -no. 1 - P.108-114.

172. Antoine M. Fibroblast growth factor 3, a protein with dual subcellular localization, is targeted to the nucleus and nucleolus by the concerted action of two nuclear localization signals and a nucleolar retention signal / Antoine M., Reimers K., Dickson C., Kiefer P. // Journal of Biological Chemistry - 1997. - Vol. 272 - no. 47 - P.29475-29481.

173. Dang C. V. Nuclear and nucleolar targeting sequences of c-erb-A, c-myc, N-myc, p53, HSP70, and HIV tat proteins / Dang C. V., Lee W.M.F. // Journal of Biological Chemistry -1989. - Vol. 264 - no. 30 - P.18019-18023.

174. Henderson J.E. Nucleolar localization of parathyroid hormone-related peptide enhances survival of chondrocytes under conditions that promote apoptotic cell death. / Henderson J.E., Amizuka N., Warshawsky H., Biasotto D., Lanske B.M., Goltzman D., Karaplis A.C. // Molecular and cellular biology - 1995. - Vol. 15 - no. 8 - P.4064-75.

175. Wang Y. PNRC accumulates in the nucleolus by interaction with B23/nucleophosmin via its nucleolar localization sequence / Wang Y., Chen B., Li Y., Zhou D., Chen S. // Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research - 2011. - Vol. 1813 - no. 1 - P. 109-119.

176. Emmott E. Nucleolar targeting: the hub of the matter. / Emmott E., Hiscox J.A. // EMBO reports - 2009. - Vol. 10 - no. 3 - P.231-8.

177. Moriguchi K. Functional Isolation of Novel Nuclear Proteins Showing a Variety of Subnuclear Localizations / Moriguchi K., Suzuki T., Ito Y., Yamazaki Y., Niwa Y., Kurata N. // The Plant Cell - 2005. - Vol. 17 - no. 2 - P.389-403.

178. Pandey A. The nuclear proteome of chickpea (Cicer arietinum L.) reveals predicted and unexpected proteins / Pandey A., Choudhary M.K., Bhushan D., Chattopadhyay A., Chakraborty S., Datta A., Chakraborty N. // Journal of Proteome Research - 2006. - Vol. 5 -no. 12 - P.3301-3311.

179. Miyamoto Y. Importin a: a key molecule in nuclear transport and non-transport functions // J. Biochem. - 2016. - Vol. 160. - no. 2. - 69-75c.

180. Krüger D.M. Protein-RNA interactions: Structural characteristics and hotspot amino acids / Krüger D.M., Neubacher S., Grossmann T.N. // RNA - 2018. - Vol. 24 - no. 11 -P.1457-1465.

181. Sathyapriya R. Insights into protein-DNA interactions through structure network analysis / Sathyapriya R., Vijayabaskar M.S., Vishveshwara S. // PLoS Computational Biology - 2008. - Vol. 4 - no. 9.

182. Bogan A.A. Anatomy of hot spots in protein interfaces / Bogan A.A., Thorn K.S. // Journal of Molecular Biology - 1998. - Vol. 280 - no. 1 - P. 1-9.

183. Lichtarge O. An evolutionary trace method defines binding surfaces common to protein families / Lichtarge O., Bourne H.R., Cohen F.E. // Journal of Molecular Biology - 1996. -Vol. 257 - no. 2 - P.342-358.

184. Nagarajan U.M. A hierarchy of nuclear localization signals governs the import of the regulatory factor X complex subunits and MHC class II expression / Nagarajan U.M., Long A.B., Harreman M., Corbett A., Boss J.M. // The Journal of Immunology - 2004. - Vol. 173 -no. 24 - P.410 - 419.

185. Matthews B.W. Comparison of the predicted and observed secondary structure of T4 phage lysozyme / Matthews B.W. // BBA - Protein Structure - 1975. - Vol. 405 - no. 2 -P.442-451.

186. Bernhofer M. NLSdb-major update for database of nuclear localization signals and nuclear export signals / Bernhofer M., Goldberg T., Wolf S., Ahmed M., Zaugg J., Boden M., Rost B. // Nucleic Acids Research - 2018. - Vol. 46 - no. D1 - P.D503-D508.

187. Zdobnov E.M. OrthoDB v9.1: Cataloging evolutionary and functional annotations for animal, fungal, plant, archaeal, bacterial and viral orthologs / Zdobnov E.M., Tegenfeldt F., Kuznetsov D., Waterhouse R.M., Simao F.A., Ioannidis P., Seppey M., Loetscher A., Kriventseva E. V. // Nucleic Acids Research - 2017.

188. Schneider T.D. Information content of binding sites on nucleotide sequences / Schneider T.D., Stormo G.D., Gold L., Ehrenfeucht A. // Journal of Molecular Biology - 1986. - Vol. 188 - no. 3 - P.415-431.

189. Gaur R.K. Amino acid frequency distribution among eukaryotic proteins / Gaur R.K. // IIOAB Journal - 2014. - Vol. 5 - no. 2 - P.6-11.

190. Takahata N. The Neutral Theory of Molecular Evolution / Takahata N., Kimura M. // Principles of Medical Biology - 1994. - Vol. 1 - no. PB - P.205-234.

191. Li F.L. Acetylation accumulates PFKFB3 in cytoplasm to promote glycolysis and protects cells from cisplatin-induced apoptosis / Li F.L., Liu J.P., Bao R.X., Yan G., Feng X., Xu Y.P., Sun Y.P., Yan W., Ling Z.Q., Xiong Y., Guan K.L., Yuan H.X. // Nature Communications -2018. - Vol. 9 - no. 1.

192. Hou Q. Nuclear localization signal regulates porcine circovirus type 2 capsid protein nuclear export through phosphorylation / Hou Q., Hou S., Chen Q., Jia H., Xin T., Jiang Y., Guo X., Zhu H. // Virus Research - 2018. - Vol. 246 - P. 12-22.

193. Cao X. Acetylation promotes TyrRS nuclear translocation to prevent oxidative damage / Cao X., Zhao S., Li J., Li X., Tang Y., Zhang R., Huang J., Xiao S., Yu W., Li C. // Proceedings of the National Academy of Sciences - 2017. - Vol. 114 - no. 4 - P.687-692.

194. Nakada R. Structural basis for the regulation of nuclear import of Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 (EBNA1) by phosphorylation of the nuclear localization signal / Nakada R., Hirano H., Matsuura Y. // Biochemical and Biophysical Research Communications - 2017. -Vol. 484 - no. 1 - P. 113-117.

195. Dormann D. Arginine methylation next to the PY-NLS modulates Transportin binding and nuclear import of FUS / Dormann D., Madl T., Valori C.F., Bentmann E., Tahirovic S., Abou-Ajram C., Kremmer E., Ansorge O., MacKenzie I.R.A., Neumann M., Haass C. // EMBO Journal - 2012. - Vol. 31 - no. 22 - P.4258-4275.

196. Morgen P. von Nuclear localisation of 53BP1 is regulated by phosphorylation of the nuclear localisation signal / Morgen P. von, Lidak T., Horejsi Z., Macurek L. // Biology of the Cell - 2018. - Vol. 110 - no. 6 - P.137-146.

197. Cansizoglu A.E. Structure-based design of a pathway-specific nuclear import inhibitor / Cansizoglu A.E., Lee B.J., Zhang Z.C., Fontoura B.M.A., Chook Y.M. // Nature Structural and Molecular Biology - 2007. - Vol. 14 - no. 5 - P.452-454.

198. Wu M. The Nuclear Proteome of a Vertebrate / Wu M., Gu T., Peshkin L., Mitchison T.J., Kirschner M.W., Gygi Correspondence S.P., Wu Hr M., Mcalister G.C., Sonnett M., Ishihara K., Groen A.C., Presler M., Erickson B.K., Gygi S.P. // Current Biology - 2015. -Vol. 25 - P.2663-2671.

199. Farah C.S. The troponin complex and regulation of muscle contraction. / Farah C.S., Reinach F.C. // The FASEB journal - 1995. - Vol. 9 - no. 9 - P.755-767.

200. Spudich J.A. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction / Spudich J.A., Watt S. // Journal of Biological Chemistry - 1971. - Vol. 246 - no. 15 - P.4866.

201. Ohtsuki I. Regulatory and cytoskeletal proteins of vertebrate skeletal muscle / Ohtsuki I., Maruyama K., Ebashi S. // Advances in Protein Chemistry - 1986. - Vol. 38 - no. C - P. 1-67.

202. Takeda S. Structure of the core domain of human cardiac troponin in the Ca2+-saturated form / Takeda S., Yamashita A., Maeda K., Maeda Y. // Nature - 2003. - Vol. 424 - no. 6944

- P.35-41.

203. Reed M.L. Delineation and modelling of a nucleolar retention signal in the coronavirus nucleocapsid protein / Reed M.L., Dove B.K., Jackson R.M., Collins R., Brooks G., Hiscox J.A. // Traffic - 2006. - Vol. 7 - no. 7 - P.833-848.

204. Smith K.M. Structural Basis for Importin-a Binding of the Human Immunodeficiency Virus Tat / Smith K.M., Himiari Z., Tsimbalyuk S., Forwood J.K. // Scientific Reports - 2017.

- Vol. 7 - no. 1.

ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение. Скрипт 1. Расчет молекулярной массы белка

testlrrteger <- function(xH

test :: all.equal (x, as. i nteger (x) , check, attributes = false) ifftest == true)£ return(true) ] else { return(false) }

}

proteins = (read.table ("xen_result_t.txt", sep="\r"))

di m_protei ns = c(dim(proteins))

Z=NULL

for (i in 1 dim_proteins[l]){

z c:"z,as. character (proteins[[1]] [i]))

}

index=\JLL

MW_table = matrix:'ncol =2, dimnames = 1 i st :"c:""Number ") , c:""id", "MW") )) q=0

result=\IULL

for in in 1:length;z. ){ index = n 2;

if (testlrrteger (i ndex)==TRUE) i

t=t+l k=z[n]

m = c (strspl it(k, "")) MW = 0

for (d in 1:1 engthsCm) ){ if Cm[[l]] [d]=="A"){ MW=MW-71. 0779

}

if:m[[l]][d]=="R"){ MW=MW-156.1657

}

if(m[[l]][d]=="N")£ MW=MW-114.1026

}

if[m[[l]][d]=="d"){ MW=MW-115.0874

}

ifCni[[l]][d]="c"){

MW=MW-103.1429

}

if:m[[l]][d]=="Q")£ MW=MW-128.1292

}

if (m[[l]][d] =="£")£ MW=MW-129. 114

}

if:m[[l]][d]=="G")£ MW=MW-57. 0513

}

if-m[[l]][d]=="h"){ MW=MW-137.1393

}

if-m[[l]][d]=="l"){ MW=MW-113.1576

ifCm[[l]][d]="L"){ MW=MW-113. 1576

}

if(m[[l]][d]="K"){ MW=MW-12fi. 1723

}

if:>[[l]][d]=="M"){ MW=MW-131. 1961

}

ifCm[[l]][d]=="F'1){ MW=MW-147.1739

if[m[[l]][d]=="P"){ MW=MW-97.1152

}

if(m[[l]] [d]="s"){ MW=MW-87.0773

}

ifCm[[l]][d]="T"){ MW=MW-101. 1039

}

i f Cm[[l] ] [d] =="v") { MW=MW-99.1311

}

if:M[l]][d] =="«"){ MW=MW-186. 2099

}

ifCm[[l]][d]="Y"){ MW=MW-163. 1733

el se

MW=MW-1

print (z [n -1]) print (MW)

MW_table=rbind:"MW_table, c[z[n-l], MW) )

}

}

write. table(MW_table, file = "MW table_xen.txt")

pririt("total number of proteins:") pr i rrt (t )

Приложение. Скрипт 2. Расчет информационного содержания выравнивания

readfile = read.table ("fi Iename|.txt") rows - length 'readfile[[1]])

d = c (strsplit(as.character(readfile[[2]][1]),"")) col = lengths :]d)

ar =matrix(nrow=rows, ncol = col) for (i in 1 col)£

for (yz in 1: rows){

stroka = c (strspl it (as.character(readfi1e[[2]][yz]),"")) ar[yz,i] = stroka[[1]] [i]

}

Ibj =0 pM = 0.0247 pi = 0.0526 pL=0.0671 pV=0.0662 pS=0.0630 pW=0. 0114 pA=0.0596 pD=0. 0559 pE=0. 0643 pN=0.0511 pR=0. 0520 pK=0. 0647 pH=0.0256 pF=0.0362 pY=0.0306 pc=0. 0225 pP=0. 0466 pG=0. 0563 pT=0.0626 pQ=0. 0426 l_alignmerrt=0 for (len in 1 col){ ij = 0 = 0

for (r i n 1: rows) {

if (ar[r, llen]=="H"){ Nm = Nm-t-1

}

if (ar[r, ler]=="c")£ Nc = Nc+1

}

if (ar[r, 1 en]--"D"){ Nd = Nd-1

}

if (ar[r, ler.=="E"){ Ne = Ne+1

}

if (ar[r, 1 en]=="F") { Nf = Nf-1

}

if (ar[r, len]=="G"){ Ng = Ng-1

}

if Car[r, len]=="h"){

Nh = Nh-1

}

if (ar[r, ler]=="I")£ Ni = Ni+1

}

if (ar[r, len]=="K"){ Nk = Nk-1

}

if (ar [r , len]=="L"){ Nl = Nl + 1

}

if (ar[r , len]=="N")i

Nn = Nn-1

}

if (ar [r , ler]=="p"){ Np = Np-1

}

if (ar[r, ler]=="Q")i Nq = Nq-t-1

}

if (ar[r, len]="R"){ Nr = Nr-t-1

}

if (ar [r , len]=="s")£ Ns = Ns+1

}

if (ar[r, len]=="T"){ Nt = Nt+1

}

if (ar [r , len]=="v")£ Nv = Nv+1

>

if (ar [r , ler]=="w"){ Nw = Nw-t-1

>

if (ar[r, ler]=="Y"){ Ny = Ny-t-1

}

if (ar [r , ler]=="A")£ Na = Na-1

>

el se]

}

}

Fmj = (Nm-pM)/(rows-l) if (Nm>0)£

Imj = Fmj 1 og2 (Fmj "'рм)

Fc j = (Nc-pcJ/(rows-1) if (Nc>0){

icj = Fcj log2(Fcj pc:

}

FCj = (NC-pC) (rOWS+l) if (NCJ-0) {

Iej = Fej log2:Fcj pc)

>

Fdj = (Nd-pD)/(rows-t-l) if (Nd>o;;i

Idj = Fdj"log2:Fdj pD)

Fej = (Ne-pE] '(rows-t-1) if (Ne>o:i

Iej = Fej log2:Fej pE)

}

Ffj = :'Nf-pF (rows+l) if (Mf>0){

Ifi = Ffj log2Ffj pF)

Fgj = (Ng+pG)/(rows+l) if (Ng>0)i

igj = Fgj-log2:Fgj pG)

■

Faj = (Na+ pA) /[rows+1) if (Nas-O){

iaj = Faj logZFaj pA)

Fyj = Ay |: Y) ( i ( >'/.'> ■ 1 if (Ny>0)i

iyj = Fyj log2 CFyj pv)

}

Fwj = (NW-frt0/(rOW5+l) if (NWS-O) {

iwj = Fwj log2 Fwj pw)

Fvj = (NV+pV)/(rOWS-t-l) if (NVS-O) {

Ivj = Fvj log2(Fvj/pV)

Fsj = (Ns-t-ps; '(rows-t-l) if (N5>0) -i

Isj = Fsj log2:Fsj ps)

}

Frj = (Nr-pR)/(rOWS4-l) if (Nr >0){

irj = Frj log2(Frj pR)

}

Ftj = (Wt+pT)/CrOWS+l) if (Nt>0) {

Itj = Ftj log2:Ftj pT)

Fqj = (Nq-pQ)/(rows-t-l) if (Nq>0) {

iqj - Fqj °:log2 (Fqj/pQ)

Fnj = (Nn-pN)/(rOWS4-l) if ;\n 0'

inj = Fnj :,log2 : Fnj pN)

}

Flj = (Nl+pL: (rows+1) if (Nls-OJi

Ilj = Flj log2 :"Fl j pL)

}

Fkj = (Nk-pK)/(rows+l) if CNkXJ) [

Ik j = Flij;!1og2: Fkj pit)

}

Fhj = (Nh-pH)/(rows+l) if CNhoO)[

ihj = Fhj *~log2: Fhj pH)

Fpj = (Np-pP)/(rOWS4-l) if :;np>o;; [

ipj = Fpj *~log2:Fpj pP)

■

Fij = (Ni + pl; ^(rows-t-l) if fui>0){

Iij = Fi j !~log2 : Fi j pi)

}

ij = Icj-ldj-Ie j-lf j-Igj-lhj-li j-lkj-ll j-t-Imj-Inj-Ipj-t-Iqj-Ir j-lsj-ltj-lpj-lvj-t-lwj-lyj-laj l_alignment=l_alignment-lj

}

print t"I—alignment/number") print :l_alignmerrt col;

Приложение - Таблица S1. Экспериментально определенные NLS.

№ п/п Идентификатор белка согласно Uniprot Последовательность NLS

1 Б3УРО2 сяьякс убломтьоля кьккь