Изучение механизмов роста ядерной ламины в интерфазе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Жиронкина Оксана Андреевна

• Жиронкина Оксана Андреевна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Жиронкина Оксана Андреевна

1.1 Актуальность темы исследования

1.2 Цель работы

1.3 Задачи исследования

1.4 Новизна полученных результатов

1.5 Методология и методы диссертационного исследования

1.6 Апробация результатов исследования

2 Обзор литературы

2.1 Общий план строения ядерной оболочки

2.2 Белки-ламины - основной компонент ламины

2.3 Строение молекул ламинов

2.4 Функции доменов ламинов

2.5 Фарнезилирование ламинов

2.6 Тонкое строение ламины

2.7 Поведение ламинов в митозе

2.8 Скорость обмена ламинов

2.9 Связь ламины и хроматина

2.10 Ламины и транскрипция

2.10.1 Влияние экспрессии ламинов на общий уровень транскрипции

2.10.2 Ламины как транскрипционные факторы

2.10.3 Транскрипция и положение внутри ядра

2.11 Ламины и репликация

2.11.1 Для запуска репликации необходимо образование ламины

2.11.2 Ламины как факторы репликации

2.12 Определение положения хроматина внутри ядра

2.13 Ламины и репарация

2.14 Ламины и апоптоз

2.15 Нарушения, вызванные патологическими изменениями в ламинах

2.15.1 Ламинопатии: один ген, широкий спектр заболеваний

2.15.2 Ламинопатии, связанные с нарушением механической прочности ядерной оболочки

2.15.3 Ламинопатии, связанные с токсичностью незрелых форм ламина

2.15.4 Патологии, связанные с ламином В

2.16 Связь ламинов с цитоскелетом

2.17 Заключение

3 Материалы и методы

3.1 Работа с эукариотическими клетками

3.1.1 Культивирование клеток

3.1.2 Трансфекция эукариотических клеток

3.1.3 Получение стабильных линий

3.1.4 Репликативное мечение, детекция репликативной метки

3.1.5 Синхронизация CHO

3.1.6 Получение ядерных почек

3.2 Работа с прокариотическими клетками

3.2.1 Получение компетентных клеток

3.2.2 Трансформация бактерий

3.2.3 Выделение ДНК из бактерий

3.2.4 Рестрикционный анализ плазмидной ДНК

3.3 Световая микроскопия: пробоподготовка, получение и анализ изображений

3.3.1 Прижизненные наблюдения

3.3.2 Высокопроизводительный микроскопический скрининг

3.3.3 Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP)

3.3.4 Широкопольная флуоресцентная микроскопия

3.3.5 Деконволюция

3.3.6 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

3.3.7 Оптическая микроскопия с суперразрешением

3.4 Электронная микроскопия

3.4.1 Пробоподготовка для корреляционной световой и электронной микроскопии

3.4.2 Пробоподготовка для иммуноэлектронная микроскопия

3.4.3 Реакция серебряного усиления

3.4.4 Обезвоживание и заключение в эпон

3.4.5 Получение срезов, получение изображений

3.5 Белковый электрофорез методом Вестерн-блот гибридизации

3.5.1 Подготовка лизатов клеточной культуры для белкового электрофореза

3.5.2 Белковый электрофорез в денатурирующих условиях

3.5.3 Окрашивание полиакриламидных гелей

3.5.4 Влажный перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану

3.5.5 Окрашивание антителами и проявление

3.6 Использованные антитела

3.7 Приготовление использованных в работе растворов и смесей

3.7.1 Приготовление формальдегидного фиксатора

3.7.2 Приготовление среды для заключения препаратов

3.7.3 Приготовление PBS

3.7.4 Приготовление буфера Зеренсена

4 Результаты

4.1 Рост ядерной оболочки происходит равномерно на протяжении интерфазы

4.1.1 Статистический анализ роста ядерной оболочки методом высокопроизводительного микроскопического скрининга

4.1.2 Прижизненный анализ роста ядра в клеточном цикле

4.2 Микродоменная структура ламины сохраняется неизменной на протяжении интерфазы

4.2.1 Ламины А и В типов образуют независимые, тесно перекрывающиеся сети с микродоменной структурой

4.2.2 Микродомены ламинов образованы не одним уникальным типом ламинов, а комбинацией нескольких типов ламинов в разных соотношениях

4.2.3 Совокупный анализ неоднородности ламины не выявил изменений ее структуры в течение интерфазы

4.2.4 Степень полимеризации ламинов остается неизменной в течение интерфазы

4.2.5 Характер распределения ламинов А и В1 в составе ядерной оболочки отличается

4.3 Моделирование роста ламины на свободной ядерной оболочке в интерфазном ядре

4.3.1 Образование ядерных почек не приводит к значительным нарушениям внутриклеточных процессов

4.3.2 Образование ядерных почек происходит не во всех клетках

4.3.3 В ядерные почки мигрирует хроматин

4.3.4 Динамика установления взаимодействие хроматина и ядерной оболочки в почках

4.3.5 Динамика образования ламины в ядерной почке

4.4 Скорость обмена ламинов на разных стадиях интерфазы

4.4.1 Разработка метода оценки скорости обмена ламинов

4.4.2 Скорость обмена ламина А выше, чем ламина В1

4.4.3 Изменение скорости обмена ламинов в зависимости от стадии интерфазы

4.5 Количество ламина В1 в растворимой фракции меняется в течение интерфазы

4.6 Ламина и репликация периферического гетерохроматина

4.6.1 Скорость обмена ламинов В1 в течение S фазы постоянна

4.6.2 Суммарный анализ плотности мечения ламины относительно репликативных фокусов

4.6.3 Анализ плотности мечения ламины напротив индивидуальных фокусов репликации

4.6.4 Репликация периферического ГХ не требует открепления от ЯО

4.6.5 Обратимое перемещение HSR во время репликации происходит без открепления локуса от ядерной оболочки

5 Обсуждение результатов

6 Заключение

7 Выводы

8 Список сокращений

9 Список цитируемой литературы

10 Приложение

10.1 Плагин для получения информации об интенсивности ламины и

репликативной метки вдоль проведенного вручную профиля

11 Приложение

11.1 Плагин для получения информации о колокализации ламина и фокусов

репликации в тангентальном срезе ядра

12 Приложение

12.1 Процедура для автоматической идентификации ядер по флуоресценции DAPI,

сегментации изображения на фон и ядра, индивидуального анализа репликативного статуса обнаруженных ядер, идентификации индивидуальных фокусов репликации в каждом ядре в программе CellProfiler

1 Введение

1.1 Актуальность темы исследования

Ядро эукариотических клеток отделено от цитоплазмы ядерной оболочкой, образованной расширением и слиянием цистерн эндоплазматического ретикулума. Ядерная оболочка представляет собой мультифункциональную структуру, где связанный с ней периферический гетерохроматин выполняет все свои функции в тесном контакте с ней. Ядерная оболочка состоит из внешней и внутренней мембран, между которыми располагается перинуклеарное пространство, ядерных поровых комплексов и фиброзного слоя - ламины. Ламина представляет собой сеть промежуточных филаментов, в основном состоящую из белков-ламинов. Впервые ламины были идентифицированы как основные компоненты ядерной ламины, белкового слоя, обнаруженного на границе хроматина и внутренней ядерной мембраны (Fawcett, 1966). Вследствие расположения на периферии ядра, первоначально предполагали, что ламины играют роль в обеспечении механической прочности ядерной оболочки и в поддержании контактов между внутренней ядерной мембраной и гранулярным слоем периферического хроматина (Онищенко и Ченцов, 1974). Однако, исследования в области молекулярной генетики продемонстрировали участие ламинов в репликации, транскрипции, репарации, защите клеток от апоптоза и в постмитотической реконструкции ядерной оболочки. Помимо периферической локализации показано наличие ламинов А и В также и в нуклеоплазме эукариотических клеток (Moir et al., 2000a). Пул нуклеоплазмических ламинов выполняет свои уникальные функции, отличающиеся от функций ламинов ядерной оболочки (Dechat et al., 2009; Naetar and Foisner, 2009). Таким образом, ламины являются значимыми ядерными белками с широким спектром функций и со сложной внутриклеточной локализацией. Важность и разнообразие роли ламинов в жизни клетки подчеркивает наличие ламинопатий -заболеваний, вызванных мутациями в генах, кодирующих ламины, степень тяжести которых зависит от места и характера мутации (Parnaik and Manju, 2006).

Несмотря на долгую историю исследования ламины, до сих пор не установлены механизмы ее функционирования, обеспечивающие ее многозадачность в контексте прочно связанного с ней периферического гетерохроматина. Исследование путей регуляции роста, поддержания и функционирования ламины в клеточном цикле является перспективным направлением для фундаментальной и прикладной науки. Расшифровка этих механизмов позволит не только

расширить наши представления о важнейшей структуре клетки - ядерной оболочке, но и приблизиться к решению сложных практических задач - профилактике, коррекции и лечении ламинопатий.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизмов роста ядерной ламины в интерфазе»

1.2 Цель работы

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы было исследование структурных и молекулярных аспектов динамики роста ламины в клеточном цикле, в первую очередь в связи с репликацией хроматина.

1.3 Задачи исследования

1) изучение динамики роста ядерной оболочки в интерфазе

2) изучение тонкой организации ламины методами суперразрешения и иммуноэлектронной микроскопии в связи с репликацией периферического гетерохроматина

3) исследование механизмов встраивания новых ламинов при моделировании свободной ядерной мембраны в интерфазе

4) анализ молекулярной динамики ламинов в клеточном цикле методом FRAP

5) изучение изменении структуры ламины при внутриядерном перемещении ассоциированного с ней хроматина

1.4 Новизна полученных результатов

В настоящей работе был впервые изучен механизм роста ламины в интерфазе. Было выяснено, что рост ламины происходит непрерывно на протяжении всей интерфазы. В процессе роста ламины ее основные структурные компоненты - сети ламинов А и В типов - не претерпевают значительных изменений строения и степени полимеризации.

Тщательное изучение структуры ламиновых сетей методами микроскопии с суперразрешением и иммуноэлектронной микроскопии показало, что микродомены образованы не одним уникальным типом ламинов, а комбинацией нескольких типов ламинов в разных соотношениях. Эти данные противоречат традиционному представлению о строении ламины и свидетельствуют о необходимости аккуратной интерпретации результатов флуоресцентной микроскопии.

Отдельное исследование структуры ламины в контексте удвоения прикрепленного к ней периферического гетерохроматина показало, что функционирование репликативных комплексов не требует ни открепления хроматиновых доменов от ядерной оболочки, ни локальной деполимеризации ламины в непосредственной близости от фокуса репликации. При этом в модельной системе перемещение прикрепленного к ядерной оболочке локуса к центру сопровождается значительным изменением конфигурации ламины, что свидетельствует о ее высокой пластичности.

В ходе моделирования роста ламины на свободной ядерной оболочке и измерения скорости обмена ламинов А и В типов было выяснено, что встраивание ламина В1 регулируется наличием контактов специфической фракции хроматина с ядерной оболочкой и происходит преимущественно в Б-фазе, тогда как ламин А встраивается в ядерную оболочку независимо от способного к контакту с ядерной периферией хроматина. Зависимость встраивания ламина В1 от хроматина подтверждается не только его активным обменом в Б-фазе, но и накоплением ламина В1 в растворимой фракции клетки в 02-фазе, т.е. в отсутствие новосинтезированных доменов хроматина.

Таким образом, по результатам проделанной работы был предложен механизм роста ламины в интерфазе, где ламин В и хроматин находятся в тесной взаимосвязи, тогда как поведение ламина А не столь жестко связано с функционированием хроматина.

Сделанные в работе выводы позволяют предположить возможные механизмы регуляции поведения хроматина посредством воздействия на ламину. Выявленные различия в поведении ламинов А и В, в частности отностительно функционального статуса периферического гетерохроматина, позволяет прогнозировать роль ламины как инструмента для глобального переключения активности генов. Воздействие на структуру и состав ламины, изменение соотношения различных типов ламинов могут служить новым способом повышения эффективности репрограммирования клеток. Эти возможности могут играть вазнейшую роль в разработке терапевтических воздействий, направленных на защиту клеток от старения, лечение ламинопатий и при противоопухолевой терапии.

1.5 Методология и методы диссертационного исследования

В данной диссертационной работе применялись как классические, так и новые современные методы получения и анализа данных. Классические цитологические методы, такие как культивирование эукариотических клеток, репликативное мечение ДНК, синхронизация и фиксация клеток, их иммуноцитохимическое окрашивание, липосомная трансфекция клеток и получение стабильных линий, метод осмотического шока были адаптированы для

использованных клеточных культур и поставленных задач. Различные методы микроскопии, такие как флуоресцентная, конфокальная микроскопия и микроскопия с суперразрешением, прижизненная цейтраферная микроскопия, электронная микроскопия, а также их сочетания позволили исследовать структурные и функциональные особенности ламины в разных ее проявлениях. Для прижизненных наблюдений за ламинами в клеточном цикле были получены различные генетические конструкции. Для количественного анализа белков был использован метод электрофореза с иммуноблоттингом.

1.6 Апробация результатов исследования

Результаты данного исследования были представлены на двух всероссийских и пяти международных конференциях: международная конференция «24 Wilhelm Bernhard Workshop on the Cell Nucleus» (Вена, 2015); международный симпозиум «Superresolution in different dimensions» (Москва, 2015); международная конференция «Labeling & Nanoscopy» (Гейдельберг, 2014); XVII всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2014); XV-я Российская конференция по электронной микроскопии (РКЭМ-2014) (Черноголовка, 2014); XXI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2014» (Москва, 2014); Международная Научно-практическая Конференция молодых ученых в РУДН "SCIENCE4HEALTH 2012" (Москва, 2012), III Съезд Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012).

2 Обзор литературы

2.1 Общий план строения ядерной оболочки

Ядерная оболочка представляет собой комплексную структуру, которая отделяет нуклеоплазму от цитоплазмы, участвует в транспорте веществ между этими компартментами и играет важную роль в структурной организации хроматина. Важнейшими компонентами ядерной оболочки являются внутренняя и внешняя ядерная мембраны, перинуклеарное пространство, комплекс пор и ядерная ламина (рис.1).

Cytoplasm

Ribosomes

С ~

МОК2^ RB

Nucleoplasm Chromatin

Nuclear lamina (lamins А, В and C)

Рисунок 1. Схема строения ядерной оболочки. Обозначены рибосомы, эндоплазматический ретикулум, зоны цитоплазмы и нуклеоплазмы, внешняя и внутренняя ядерные мембраны, ядерные поровые комплексы, ядерная ламина, хроматин. Ядерная ламина выстилает внутреннюю поверхность внутренней ядерной мембраны. Белки ядерной оболочки (nespin, emerin, Lamin-assotiated protein 1 и 2 (LAP1 и LAP2), lamin В receptor (LBR), MAN1) обозначены фиолетовым цветом; транскрипционные факторы (retinoblastoma transcriptional regulator RB, germ cell-less GCL, sterol response element binding protein (SREBP1), FOS и MOK2)- розовым; ассоциированные с хроматином белки (Heterochromatin protein 1 (НР1), Barrier to autointegration factor (BAF) - голубым. (Схема из Coutinho et al., 2009)

Внешняя ядерная мембрана контактирует с полисомами и отдельными рибосомами и структурно связана с эндоплазматическим ретикулумом (Burke and Gerace, 1986). Фиброзный

слой внутренней ядерной мембраны - ламина - представляет собой тонкий слой (до 20 нм) (Oryschak et al., 1974) промежуточных филаментов 5 типа, расположенный между внутренней ядерной мембраной и периферическим гетерохроматином (Aebi et al., 1986; Goldman et al., 1986; McKeon et al., 1986; Zackroff et al., 1984). Также было показана тесная взаимосвязь ядерной ламины с ядерно-поровыми комплексами (Aaronson and Blobel, 1975) и расшифрована её белковая структура: оказалось, что в её состав входят несколько сходных полипептидов (Gerace et al., 1978), позже названных ламинами (Gerace and Blobel, 1980).

Ламины обнаружены у всех многоклеточных животных, начиная от гидры и заканчивая человеком, но они не были обнаружены в растениях и одноклеточных организмах. Помимо эволюционного аспекта, экспрессия ламинов зависит от стадии онтогенеза (Mounkes et al., 2003). Ламин В синтезируется во всех клетках многоклеточный организмов в течение всего развития, экспрессия ламинов А-типа меняется при коммитировании клеток: ламин А/С отсутствует в стволовых, эмбриональных клетках, обнаруживается только в дифференцированных клетках (Prather et al., 1991; Rober et al., 1990). Перечисленные факты свидетельствуют о двоякой роли ламинов: во-первык, защитная функция, особенно востребованная у клеток с большим геномом, и во-вторых, регуляторная функция, проявляющаяся при дифференцировке клеток. В данном обзоре мы будем рассматривать особенности организации и функционирования ламины позвоночных.

2.2 Белки-ламины - основной компонент ламины

Впервые ламины были охарактеризованы при помощи биохимических методов, как главные структурные белки ядра в 1975 году (Aaronson and Blobel, 1975). Ламины характерны для всех многоклеточных животных, начиная от гидры и заканчивая человеком, но они не были обнаружены в одноклеточный организмах и растениях. На биохимическом уровне в дифференцированных клетках многоклеточный животнык выделяют два типа ламинов: А и В, которые различаются по аминокислотной последовательности, характеру экспрессии, биохимическим свойствам и локализации в клетке во время митоза (Burke and Gerace, 1986; Nigg, 1989; Peter et al., 1989). Ламины А-типа обладают нейтральной изоэлектрической точкой и не связаны с мембранными везикулами во время митоза (так называемые "растворимые" ламины). Ламины В-типа характеризуются кислой изоэлектрической точкой, экспрессируются во всех клетках и входят в состав одного из типов мембранных везикул, на которые разбирается ядерная оболочка во время митоза (Gerace and Burke, 1988). Экспрессия ламинов в клетках зависит от стадии онтогенеза. Ламин В синтезируется во всех клетках в течение всего развития, экспрессия ламинов А-типа меняется по мере развития организма: ламин А/С отсутствует в

стволовых, эмбриональных клетках, обнаруживается только в дифференцированных клетках (Prather et al., 1991; Rober et al., 1990). Т.к. экспрессия ламина А/С начинается после коммитирования клеток, возможно, она служит для ограничения пластичности клеток на последующих стадиях дифференцировки (Mounkes et al., 2003; Rober et al., 1989)

В интерфазе ламины вымвляются в ядре в составе разнык структур. Большая часть ламинов ассоциирована с ядерной мембраной и входит в состав ламины. Однако часть этих белков находится в нуклеоплазме во время интерфазы. Были описаны два различных способа локализации ламинов внутри ядра: в виде внутренних фокусов (Bridger et al., 1993; Goldman et al., 1992; Moir et al., 1994), которые содержали ламины либо А, либо В-типа, или ламины, распределенные диффузно внутри ядра (Hozâk et al., 1995).

2.3 Строение молекул ламинов

Традиционное деление ламинов на ламины А и В типов связано с их биохимическими свойствами и не отражает принцип их генетического кодирования. По современным данным ламины А и В типов являются группами белков со сходными свойствами. К ламинам В относят ламин В1, В2 и В3. В1 и В2 ламины закодированы двумя различными генами: ЬМКВ1 и ЬМЫВ2, соответственно. Ламин В3 (экспрессируется в мужских половых клетках) является продуктом альтернативного сплайсинга гена ламина В2. К ламинам А типа относят 2 мажорных белка (ламин А и С) и 2 минорных белка (ламин АД 10 и С2). Все эти белки являются продуктами альтернативного сплайсинга гена ЬМ№А.

Сравнительный анализ последовательности генов ламинов свидетельствует об их принадлежности к семейству промежуточных филаментов. Белки ламины являются высококонсевативным белками и имеют типичное для промежуточных филаментов строение (рис. 2): обладают трехчастной структурой, состоящей из центрального а-спирального палочковидного центрального домена, фланкированного коротким глобулярным К- концевым доменом - «головой» и длинным С-концевым «хвостом». Центральный домен сложен из четырёх субспиральных областей, содержащих в себе повторы из семи аминокислот и называющихся 1А, 1В, 2А и 2В. Эти отдельные спирали отделены друг от друга короткими линкерами - Ь1, Ь12 и Ь2 из которых Ь12 является самым гибким. «Голова» ламина достаточно неструктурирована, хвостовой же домен содержит высококонсервативный иммуноглобулиноподобный мотив: домен, вовлеченный в белок-белковые взаимодействия и взаимодействия между белком и ДНК (БсЫгшег й а1., 2001). В отличие от других типов промежуточных филаментов, ламины имеют последовательность ядерной локализации (КЬБ)

между С-концевым участком центрального домена и иммуноглобулиноподобным участком (Fuchs and Weber, 1994; McKeon et al., 1986).

u-helical rod

Преламин A

■ CAAX-COOH

Фарнезилтрансфераза

AAX эндопептидаза

Карбоксил -метилтрансфераза

ш ш ■ СЛЛХ-СООН

t^sA^A/vA

с-соон

^Wwk

C-COCH3

фарнезилированный зрелый ламин В1, В2

/карбоксиметилированный преламин А

Zmpste24/FACE1 |-Zmpsle|^FACEl. Pis

IHIIIIII

NLS

lg-fold

В

■ »»■■■»■■■»■■■»■■■и"

389 417 436

544

ламин С МЛАЯАДА"

389 417 436 544 572

ламин В1

СААХ

390 415 438

545 583

404 435 470

зрелый ламин А

Рисунок 2. Схема строения и созревания ламина А, С, В1, В2. (а) - Схема строения, общая для всех типов ламинов. Обозначены альфа-спиральны участок, иммуноглобулиноподобный мотив (1§-1ЪЫ), последовательность ядерной локализации (N1.8), СААХ-домен. (б) - Схема созревания ламинов. После ряда модификаций СААХ-домена биохимические пути ламинов А и В типов расходятся. Ламины В1, В2 сохраняют фарнезилирование, тогда как для созревания ламина А необходимо отщепление карбоксиметил-фарнезильной группы. В. Сравнительная схема строения ламинов разных типов. Из БесЬа! с1 а1., 2010 с изменениями.

2.4 Функции доменов ламинов

Центральный альфа-спиральный палочковидный домен играет важнейшую роль в процессе полимеризации. Подобно белкам цитоплазматических промежуточных филаментов, ламины способны к полимеризации, однако механизмы полимеризации цитоплазматических и ядерных промежуточных филаментов различаются. В результате взаимодействия coiled-coil доменов ламины А и В типов формируют гомодимеры с параллельным расположением цепей, (Aebi et al., 1986; Hennekes and Nigg, 1994) Димеры ламинов взаимодействуют по принципу «голова к хвосту», что приводит к формированию тетрамерного протофиламента. Взаимодействие четырёх протофиламентов ведёт к образованию 10 нм фибрилл. (Stuurman et al., 1998). При in

vitro сборке ламинов беспозвоночных животных на этой стадии процесс объединения протофиламентов завершается. При сборке же ламинов позвоночных животных происходит продолжение этого процесса - образование сложных высокоупорядоченных паракристаллических структур (Shimi et al., 2010). Таким образом, формирование промежуточных филаментов в ядре отличается от формирования цитоплазматических промежуточных филаментов.

Если за полимеризацию ламинов отвечает центральный палочковидный домен, то С-концевой домен обеспечивает специфические функции ламинов. Ламин А и все ламины В-типа содержат С-концевую СААХ-последовательность, где С - цистеин, А -алифатическая аминокислота, Х-любая аминокислота (чаще всего представленная метионином). По этим аминокислотам происходит ряд посттрансляционных модификаций, которые в том числе регулируют встраивание ламинов в ядерную оболочку. Модификация СААХ-бокса представляет собой высокоупорядоченный процесс, протекающий в несколько стадий, включающих фарнезилирование цистеина, удаление ААХ-остатка и карбоксиметилирование терминального цистеина (рис. 3) (Dechat et al., 2010). Дальнейшие стадии созревания различаются у разных типов ламинов, что обеспечивает их специфические свойства. Зрелый ламин А образуется в результате удаления 15 аминокислот с С-конца, из-за чего он теряет фарнезильную группу, тогда как у ламина В она сохраняется. Ламин С отличается от ламина А не имеет СААХ-последовательности, и таким образом не может быть фарнезилирован.

Pre-lamin

■CAAX-COOH

Farnesyltransferase

>1

CAAX-COOH

AAX endopeptidase

l S

Carboxyl-methyltransferase

C-COOH

S

■C-COCH3

Zmpste24/FACE1

l

иМ№

S^wWs

C-COCH3

417 436 544

Mature lamin A

646

415 438 545 583

Mature lamin B1

C-COCH3

435 470 577 617

Mature lamin B2

Рисунок 3. Схема строения С-концевого участка ламинов А, В1 и В2, а также стадии их созревания. Показано, что различия ламинов А и В1, В2 возникают на последнем этапе посттрансляционных модификаций. Из Dechat et al., 2010, с модификациями.

2.5 Фарнезилирование ламинов

Различия в строении С-конца зрелых ламинов А и В типа обуславливает разницу в характере их взаимодействия с мембраной ядерной оболочки. Считается, что фарнезилирование необходимо для встраивания ламинов в ядерную оболочку. Фарнезильная группа, сохраняющаяся у ламинов В, обеспечивает их хорошее взаимодействие с ядерной мембраной. Наиболее ярко различия в характере взаимодействия ламинов А и В с ядерной оболочкой проявляется в митозе. При разборке ядерной оболочки в митозе ламины В - типа остаются связанными с мембранными везикулами на протяжении всего митоза, тогда как ламины А в форме димеров переходят в растворимую фракцию (Foisner, 1997). Блокирование стадии фарнезилирования приводит к накоплению непроцессированного ламина А в нуклеоплазме, при этом последующий запуск фарнезилирования приводит к восстановлению нормальной локализации ламина А, его встраиванию в ламину в течение 3 часов (Lutz et al., 1992). Кроме того, показано, что фарнезилирование и карбоксиметилирование увеличивают гидрофобность белков (Black, 1992), что повышает их сродство к мембранам. На сегодняшний день вопрос о механизмах, по которым фарнезильный хвост участвует во встраивание ламинов в состав

ядерной оболочки не выяснен. Также не ясно, какую роль играет фарнезильный участок у ламина А, до или после интеграции ламина в ядерную оболочку происходит его отщепление, и как этот процесс регулируется.

Интересен вопрос о месте фарнезилирования ламинов. Хорошо установлено, что ферменты, участвующие в посттрансляционных модификациях СААХ-последовательности (Reel, Zmpste24 и Icmt), являются мембранными белками и локализуются в мембране ЭПР. Их активные сайты обращены в сторону цитоплазмы (Corrigan et al., 2005; Romano et al., 1998; Schmidt et al., 1998; Wright and Philips, 2006). Эти факты позволили сформулировать точку зрения, согласно которой фарнезилирование ламинов происходит в цитоплазме и приводит к их взаимодействию с мембранами ЭПР. Дальнейший путь ламинов в ядро происходит за счет латеральной диффузии вдоль всего ЭПР во внутреннюю ядерную мембрану. Однако, в таком случает вызывает вопрос необходимость NLS для транспорта ламинов в ядро. Более того, ингибирование процессов фарнезилирования приводит к накоплению незрелых форм ламинов в нуклеоплазме (Lutz et al., 1992; Sasseville and Raymond, 1995). На основании этого более правдоподобной кажется гипотеза в фарнезилировании ламинов внутри ядра. Действительно, было показано, что ферменты посттрансляционных модификаций ламина А локализованы не только на ЭПР, но и на внутренней ядерной мембране. Функциональные тесты показали, что внутри ядра действительно обеспечивается эффективный процессинг СААХ домена (Barrowman et al., 2008). Таким образом, по-видимому, модификации С-концевого домена происходят внутри ядра, однако неизвестно, какие механизмы препятствуют протеканию тех же самых процессов в цитоплазме, где процессируются многие другие СААХ-содержащие белки.

2.6 Тонкое строение ламины

Структура ламины с точки зрения пространственной организации сети филаментов в ядре исследована недостаточно. Основным источником информации послужило электронно-микроскопическое изучение выделенных ядерных оболочек овоцитов Xenopus Laevis. У этого объекта ламина представляет собой сеть ортогонально ориентированных 10 нм филаментов (рис. 4) (Aebi et al., 1986).

Рисунок 4. Нативная ламина ооцитов Xenopus. Представлен хорошо сохранившийся в процессе выделения участок ламины с ортагонально ориентированными фибриллами с удаленными ядерными порами. Масштабный отрезок 1 мкм. Из Aebi et al., 1986.

Несмотря на очевидные преимущества овоцитов в качестве объектов исследования благодаря их большим размерам и удобству препарирования, структура ядерной оболочки у них существенно отличается от типичных соматических клеток. Во-первых, овоциты представляют собой профазные клетки, в которых функции ламины отличаются от таковых в интерфазных клетках. Во-вторых, ламина овоцитов Xenopus Laevis состоит из одного, специфичного для овоцитов, типа ламинов В, тогда как в соматических клетках ламина состоит из ламинов нескольких типов. Наконец, в отличие от соматических клеток ламина ооцитов на большом протяжении свободна от хроматина (Kaufmann et al., 2011). Таким образом, организация ламины в соматических клетках может быть более сложной и менее гомогенной, чем в овоцитах ксенопуса.

Действительно, хотя в системе in vitro была показана способность ламинов А и В типов непосредственно взаимодействовать друг с другом, методом FRET было установлено, что в ядрах соматических интерфазных клеток ламины А и В1 входят в состав отдельных мультибелковых комплексов (Delbarre et al., 2006).

Детальное изучение строения ламины интерфазных клеток методами световой микроскопии, в том числе и микроскопией с суперразрешением (Schermelleh et al., 2010; Shimi et al., 2008), подтверждает, что она образована раздельными, но тесно взаимодействующими и частично перекрывающимися сетями ламинов А- и В-типов. (рис. 5).

N

У 0 Е

Рисунок 5. Локализация ламииов А/С (зеленый) и ламина В1 (красный) в ядре клетки ИеЬа. Верхний ряд - тангентальный оптический срез ядра, нижний ряд - экваториальный срез. Стрелка указывает на один из участков ламины, положительный только по ламину А-типа. Из 8Ыш1 ег а1., 2008.

Более того, ламины В1 и В2 также формируют независимые, взаимодействующие сети и каждая из них взаимодействует с сетью ламинов А/С по-своему. Промежутки между ламинами В1 и ламинами В2 часто заполнены ламинами А/С и наоборот (8Ыш1 ег а1., 2008). Таким образом, ламина представляет собой неоднородную, пространственно упорядоченную структуру микродоменов, образованную трехмерными тесно взаимодействующими сетями ламинов разного типа.

Ключевую роль в поддержании доменной структуры ламины играет ламин В1. Нокдаун ламина В1 приводит к нарушению организации структуры микродоменов ламинов А/С и В2 и нарушению пространственной организации ЯО, выражающемуся в формировании «почек», обогащенных ламином А/С и не имеющих В2 в своем составе. Хроматин, ассоциированный с ядерной оболочкой почек несет эпигенетические метки, характерные для эухроматина, тогда как гетерохроматиновые участки, в частности центромерный гетерохроматин, наоборот, в почках не обнаруживали (8Ыш1 ег а1., 2008). Таким образом, авторы делают вывод о том, что ламины А/С и В типов связывают разный хроматин и играют разную роль в позиционировании хромосом внутри ядра. Выдвигается гипотеза о преимущественном связывании ламином А/С богатого генами хроматина (факультативного гетерохроматина), тогда как В-ламины вовлечены в связывание бедного генами хроматина (конститутивный гетерохроматин). Ламины В к тому же обеспечивают каркасную функцию ядерной оболочки и отвечают за местоположение ядерных поровых комплексов внутри ламины. Авторы делают вывод о тесном взаимодействии перекрывающихся сетей ламинов, которое обеспечивает согласованную, тонко отрегулированную работу различных ядерных микродоменов. Нельзя однако исключить, что аккумуляция эухроматина в почках не является следствием специфического взаимодействия

его с ламинами А-типа, а объясняется его повышенной по сравнению с прикрепленном к ЯО гетерохроматином подвижностью и способностью перераспределяться во вновь возникшее свободное пространство в ядре. В таком случае предположение о специфическом связывании определенных фракций хроматина с разными ламинами требует дальнейшего исследования.

В любом случае, ламина является структурой намного более значимой, чем просто сеть, механически поддерживающая ядерную оболочку. И действительно, сегодня существует множество данных об участии ламинов в самых разнообразных клеточных процессах.

2.7 Поведение ламинов в митозе

Ламины А и В демонстрируют различающееся поведение в течение клеточного цикла. Наиболее значительно поведение ламинов различается в митозе (Gerace and Blobel, 1980). Во время митоза сеть ламинов обратимо деполимеризуется, что достигается последовательным фосфорилированием ламинов по специфическим сайтам. Фосфорилирование происходит по высококонсервативным участкам ламинов (Heald and McKeon, 1990). В результате этого процесса ламины А переходят в растворимое состояние и первыми аккумулируются внутри ядра и позже распределяются по цитоплазме. В-ламины, напротив, остаются ассоциированными с ядерной мембраной, и поэтому распределяются по цитоплазме лишь частично в растворенном виде, большей же частью остаются связанными с мембранами (Burke and Gerace, 1986; Gerace and Blobel, 1980).

В конце митоза поведение ламинов А и В типа также различается. Дефосфорилирование ламинов - необходимое условие восстановления ядерной оболочки после митоза (Burke and Gerace, 1986). Ламины В типа первыми аккумулируются на поверхности хроматид при переходе из митоза в G1 фазу. Точное время начала аккумулирования вокруг хромосом варьирует у разных типов клеток, так, например, у линии BHK-21 это происходит в поздней анафазе-ранней телофазе. Ламин В1 определяет границу будущего ядра. Сначала ламин В1 аккумулируется на поверхности деконденсирующихся хромосом в зонах кинетохоров, возможно сборка ламины инициируется в этих сайтах. Таким образом, кинетохоры, могут представлять собой «зоны нуклеации» образования ядерной оболочки (Moir et al., 2000a). Зоны хроматина, в предшествующей интерфазе связанные с ядерной оболочкой не служат преимущественными центрами нуклеации новой ядерной оболочки (Kind et al., 2013). Ламин А, в отличие от ламина В, изначально аккумулируется по всей нуклеоплазме без преимущественной концентрации на периферии. Во время G1 фазы большое количество ламинов типа А находятся еще в растворенном виде, представляют собой мобильную,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Жиронкина Оксана Андреевна, 2016 год

3.6 Использованные антитела

В работе были использованы следующие кроличьи поликлональные первичные антитела: против Lamin A (ab26300, Abcam), разведение 1 : 1000, против Lamin B1 (ab16048, Abcam), разведение 1 : 1000, Anti-Alexa Fluor® 488 (A-11094, Invitrogen) 1 : 1000. В качестве вторичных антител для световой микроскопии использовали козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с Alexa 488, либо с Alexa 595 (Invitrogen), 1 : 1000. Для электронной микроскопии использовали козьи антитела против иммуноглобулинов кролика с наночастицами золота 1.2 нм (Fab-фрагменты) (Nanoprobes), 1 : 400. Для белкового фореза использовали те же первичные антитела против ламина А и В1, что и для иммунофлуоресценции. В качестве вторичных антител использовали козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с щелочной фосфатазой (KLP), разведении 1:2000.

3.7 Приготовление использованных в работе растворов и смесей

3.7.1 Приготовление формалъдегидного фиксатора

Фиксатор использовали в конечной концентрации 3,7%. Предварительно готовили 37% концентрированный раствор формальдегида на воде (pH 7.2-7.4). Для этого 1,85 г

параформальдегида (MP Biomedicals) растворяли в 3,5 мл деионизованной воды с добавлением 10Н NaOH на водяной бане (100 °C).

3.7.2 Приготовление среды для заключения препаратов

Среду для заключения препаратов для световой микроскопии готовили по следующему протоколу:

2,4 г Mowiol 4-88 (Calbiochem), 6 г глицерина, 6 мл деионизованной воды смешивали, оставляли на 2 часа при комнатной температуре для лучшего растворения мовиола, после чего добавляли 12 мл Tris (pH 8,5), нагревали до 50°C, перемешивали, добавляли 625 мг DABCO, 0,6 мкг/мл DAPI, центрифугировали 5000 g 10 мин. Готовую среду хранили при - 20°C.

3.7.3 Приготовление PBS

Для приготовления десятикратного раствора PBS (1,37 M NaCl, 27mM KCl, 100mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4) 80 г NaCl, 2 г KCl, 14,4 г Na2HPO4, 2,4 г KH2PO4 растворяли в 800 мл деионизованной воды, доводили pH до 7,4, доводили объем до 1 л.

3.7.4 Приготовление буфера Зеренсена

Для приготовления двукратного раствора Зеренсена (рН7.2-7.4) 200 мМ №2НР04 смешивали с 200 мМ КН2Р04 в соотношении 7:3. Буфер готовили свежим перед каждым применением.

4 Результаты

4.1 Рост ядерной оболочки происходит равномерно на протяжении интерфазы

4.1.1 Статистический анализ роста ядерной оболочки методом высокопроизводительного микроскопического скрининга

Для того, чтобы оценить динамику роста ядерной оболочки в интерфазе, требуется независимый анализ по крайней мере трех клеточных субпопуляций: клеток в 01, Б и 02 фазах клеточного цикла. Неизбежным следствием изменения скорости роста ядра на какой-либо стадии клеточного цикла будет изменение скорости роста ламины. Для того, чтобы исследовать этот вопрос, были выбраны культуры клеток 3Т3 и СПЭВ, для которых характерны плоские ядра на протяжении интерфазы. Плоские ядра, в отличие от ошаренных, позволяют с более высокой точностью оценивать площадь поверхности ядра по площади его проекции (рис. 11).

Рисунок 11. Серии оптических срезов ядра клетки культуры 3Т3 в ортогональных проекциях. КЛСМ, окраска БАРТ. Масштабные отрезки 3 мкм.

Для того, чтобы определить скорость роста ядерной оболочки на каждой стадии клеточного цикла необходимо разработать подход, позволяющий определять стадию интерфазы. Для этой цели мы использовали метод высокопроизводительного микроскопического скрининга. Клетки метили 10 мкм EdU в течение 10 мин, пермеабилизовали 1 мин в PBS c 5 мМ MgCb, фиксировали 15 мин 3,7% формальдегидом, детектировали репликативную метку и заключали препарат в Мовиол с DAPI. В результате микроскопического скрининга полученных препаратов при увеличении 40х (NA 0.95) в двух каналах (DAPI и Alexa 488) было получено изображения 249 ядер. Анализ полученного изображения проводили в автоматизированном режиме в программе CellProfiler 2.0. Ядра клеток анализировали по трем параметрам: площадь ядра, количество ДНК и наличие репликативной метки. Анализ состоял из трех шагов: на первом этапе, осуществляли автоматическую детекцию ядер на основании флуоресценции DAPI и измеряли площади их проекции; далее, для каждого ядра измеряли тотальную интенсивность флуоресценции DAPI и наличие репликативной метки (см. Материалы и методы и Приложение 3); наконец, по маске ядер детектировались вторичные объекты - фокусы репликации, и подчитывалось их число на ядро (рис. 12).

Рисунок 12. Процедура идентификации и автоматического анализа ядер культуры 3Т3. (а, б, в) - фрагменты изображений, полученных в результате автоматического микроскопического скрининга. Широкопольная флуоресцентная микроскопия, (а) -окраска ВЛР1, (б) - репликативная метка, (в) - наложение. (г, д, е) - этапы процедуры автоматического анализа в программе Се11РгоШег2.0. (г) -идентифицированные ядра в канале ВЛР1, (д) - создание маски по границам ядер, (е) - идентификация репликативных фокусов в канале флуоресценции репликативной метки внутри маски ядер.

Распределение интегральных интенсивностей ВАР1 воспроизводит классическую картину анализа концентрации ДНК в клеточном цикле методом проточной цитофлуориметрии (рис. 13а). Аналогичные данные были ранее показаны другими авторами, что позволяет нам с уверенностью использовать данный подход для анализа изменений содержания ДНК в клетках в ходе клеточного цикла. Первый пик соответствует клеткам в 01 периоде. Действительно, 01 стадия клеточного цикла характеризуется большой продолжительностью (около половины интерфазы) и малой по сравнению с 02 концентрацией ДНК, что выражается большой высотой пика и его смещением влево. Правый пик соответствует клеткам в 02 фазе, этот пик низкий в связи с небольшой длительностью 02 фазы. Наличие нескольких пиков в правой области гистограммы может быть связано как с анеуплоидией клеточной культуры, так и с недостаточным размером выборки. Промежуток между пиками соответствует клеткам в Б фазе. Таким образом, интенсивность флуоресценции БЛР1 может служить надежным параметром для определения стадии клеточного цикла.

Рисунок 13. Анализ интегральной интенсивности БЛР1 клеток культуры 3Т3. (а) - гистограмма распределения интегральных интенсивностей клеток БАР! (б) - зависимость интегральной интенсивности ВАР1 от площади ядра.

На следующем этапе необходимо было проанализировать изменение размеров ядра в клеточном цикле, на основании корреляции между содержанием ДНК и размерами ядер. Анализ по двум параметрам показал, что внутри каждой субпопуляции клеток существует значительный разброс по размера ядра. Таким образом, исключительно по площади ядра популяции 01, Б и 02 клеток различить невозможно (рис. 13б). Это может быть связано с анеуплоидностью клеток, а также с зависимостью формы ядра, а значит и площади его проекции, от локальной плотности клеточной популяции (более высокая плотность клеток создает ограничения для их распластывания и приводит к большему ошариванию ядер).

Введение дополнительного параметра - репликативной метки - позволило нам, во-первых, проанализировать параметры ядер в Б - фазе, во-вторых, исследовать размеры ядер 01 и 02 субпопуляций клеток несмотря на их перекрывание (рис. 14). Мы выделили 3 субпопуляции: субпопуляция клеток с малыми ядрами, без репликативной метки, с низкой концентрацией ДНК (01), субпопуляция клеток с крупными ядрами, без репликативной метки, с высокой концентрацией ДНК (02) , субпопуляция клеток с ядрами средних относительно 01 и 02 клеток размеров и промежуточной концентрации ДНК, положительных по репликативной метке (Б).

Рисунок 14. Анализ интегральной интенсивности БЛР1 и площади ядра с учетом репликативного статуса клеток. (а) - зависимость интегральной интенсивности БЛР1 от площади ядра в контексте репликативного статуса клеток. красные зведочки - клетки без репликативной метки, синие точки - клетки в Б-фазе. (б, в, г) - раздельный анализ зависимости интегральной интенсивности БЛР1 от площади ядра в трех субпопуляциях клеток. (б) - клетки без репликативной метки с малой интегральной интенсивностью БЛР1, (в) - клетки с репликативной меткой, (г) - клетки без репликативной метки с большими ядрами. (д) - анализ корреляции площади ядра и интегральной интенсивности БЛРТ.

Субпопуляция реплицирующих клеток демонстрирует хорошую корреляцию между площадью ядра и концентрацией ДНК (рис. 14). В G1 и G2 субпопуляциях такой зависимости не обнаружили, что связано с отсутствием роста количества ДНК вне синтетического периода. Таким образом, такой анализ не позволяет эффективно проследить рост ядра вне S-фазы.

Для более подробного анализа S - фазы мы использовали количество репликативных фокусов как индикатор прогрессии по S-фазе (Dimitrova and Gilbert, 1999). Для удобства анализа мы выделили в S-фазе 3 этапа: ранний, средний и поздний, основываясь на количестве идентифицированных фокусов репликации. В каждом из этапов мы обнаружили рост ядра, без различий в скорости роста (рис. 15) (скорость определяли как тангенс угла наклона аппроксимирующей линейной функции). Эти данные могут свидетельствовать о равномерности роста ядра в S-фазе, однако, использованные нами параметры получения изображений не позволяют надежно идентифицировать все репликативные фокусы, особенно в ранней S-фазе.

Рисунок 15. Анализ зависимости площади ядра от интегральной интенсивности БАР! (а) -клетки ранней Б-фазы с большим количеством идентифицированных репликативных фокусов

(20-31 фокус на клетку), (б) - клетки средней Б-фазы со средним количеством идентифицированных репликативных фокусов (10-19 фокусов на клетку), (в) - клетки поздней Б-фазы с малым количеством идентифицированных репликативных фокусов (1-9 фокус на клетку).

Сходные результаты были получены на культуре СПЭВ. Таким образом, сделанные нами выводы не являются специфическими для какого-то определенного типа клеток.

Одним из возможных объяснений всех возникших вопросов может быть ограничение примененного метода: статистический анализ популяции клеток может скрывать различия в скорости роста ядра на определенных стадиях интерфазы, тем более, если быстрый рост -кратковременный. Также это может быть причиной недооценки роста площади ядра на протяжении всей интерфазы.

4.1.2 Прижизненный анализ роста ядра в клеточном цикле

Использование метода, основанного на тотальном анализе популяции клеток, для оценки динамики роста ядра обладает рядом недостатков, несмотря на очевидное преимущество анализа большой выборки. Недостатки связаны с невозможностью регистрации кратковременных различий в скорости роста ядерной оболочки из-за неточностей определения стадии интерфазы у каждой клетки по интегральной интенсивности ВАР1, а также из-за индивидуальных различий клеток.

Для того, чтобы ответить на вопросы, оставшиеся после популяционного анализа скорости роста ядра, была проведена серия прижизненных наблюдений. Были использованы клетки СПЭВ, стабильно экспрессирующие ламин А-0БР в качестве маркера границы ядра. Для клеток культуры СПЭВ, отличающихся высокой степенью распластывания, характерны плоские ядра, что делает площадь проекции ядра надежным параметром для оценки площади ядерной оболочки. Размер клеточного ядра отслеживали в течение всей интерфазы, начиная с митоза, до следующего деления клетки (рис. 16).

Рисунок 16. Прижизненный анализ роста ядерной оболочки в интерфазе. Клетки культуры СПЭВ, экспрессирующие ламин А-ОБР, широкопольная флуоресцентная микроскопия, интервал между кадрами 20 мин. (а) - центрованное изображение одного ядра, (б) -сегментированное изображение того же ядра, пригодное для определения площади ядра, (в) -график увеличения площади ядра в ходе наблюдения.

Прижизненные наблюдения показали, что рост ядра происходит непрерывно на протяжении всей интерфазы, начинаясь сразу после замыкания ядерной оболочки в ранней О1 и равномерно без ускорений продолжаясь до следующей разборки ламины в профазе митоза.

Прижизненные наблюдения за индивидуальными клетками, так же, как и популяционный анализ, не показали удвоения размера ядра в течение интерфазы. В среднем, за один клеточный цикл площадь ядра увеличивается на 60% +/- 4%, но не на 100%, что, очевидно, необходимо для обеспечения постоянства размера клеточного ядра в ряду клеточных поколений. Такой неожиданный результат, по-видимому, связан с увеличением плотности клеточной популяции в ходе эксперимента, что вызывает изменение формы ядра, его ошаривание, меньшую распластанность, а значит изменение соотношения объема и площади ядра. Таким образом, для более корректной оценки изменения размеров ядра следует использовать препараты клеток с низкой плотностью посадки.

Тем не менее, полученные результаты однозначно свидетельствуют о равномерном, постоянном характере роста ядерной оболочки на протяжении всей интерфазы, несмотря на удвоение прикрепленного к ламине периферического гетерохроматина в S-фазе.

4.2 Микродоменная структура ламины сохраняется неизменной на протяжении

интерфазы

Структурная организация ламины в интерфазном ядре соматических клеток до сих пор не выяснена. Классическое представление о ламине как об ортогональной сети филаментов является результатом исследования ядерной оболочки ооцитов Xenopus (Aebi et al, 1986). Однако, ооциты являются особыми клетками, с повышенными требованиями к прочности ламины в связи с их большим размером, а также характеризуются значительно меньшей долей поверхности ядра, контактирующей с хромосомами. Последние исследования микроархитектуры ламины соматических клеток показали, что она состоит из взаимодействующих сетей разных типов филаментов, образованных ламинами А и В типов. Сети ламинов А и В типов независимы, но тесно переплетены, при этом они выполняют различные функции, взаимодействуя с разными фракциями хроматина (Shimi et al., 2008). Характер взаимодействия сетей друг с другом, а также с хроматином в процессе роста ядра, в том числе в контексте удвоения периферического гетерохроматина не выяснен.

4.2.1 Ламины А и В типов образуют независимые, тесно перекрывающиеся сети с

микродоменной структурой

Для выявления неоднородностей плотности ламины была использована микроскопия со структурированным освещением (SIM). В отличие от стандартной флуоресцентной микроскопии, разрешающая способность которой ограничена 200 нм, микроскопия со структурированным освещением позволяет преодолевать дифракционный предел и выявлять структуры в диапазоне 100—200 нм. Это улучшение разрешения существенно для исследования структуры ламины, поскольку размеры микродоменов, по литературным данным, лежат на границе разрешающей способности конфокальной микроскопии (Shimi et al., 2008). Помимо этого, SIM микроскопия имеет улучшенное аксиальное разрешение, что позволяет аккуратнее анализировать структуру ламины не только на тангентальных поверхностях, но и на экваториальных сечениях ядер.

Рисунок 17. Структура ламины при субдифракционном разрешении. (а, б, в) - распределение ламинов в составе ламины, (а) - ламин А, (б) - ламин В1, (в) - наложение. Б1М-микроскопия, размер масштабного отрезка 1 мкм. (г) - график распределения интенсивностей флуоресценции ламинов по профилю, проведенному вдоль ядерной оболочки.

Визуализация ламина А и В1 в составе ламины позволила нам выявить микродомены сетей ламинов в клетках культуры СНО и НТ1080. При анализе экваториальных срезов ядра выявляются как участки, содержащие оба типа ламинов, так и микродомены, обогащенные только одним из двух белков (рис. 17). Также присутствуют участки, где не выявлен ни один ламин, что, по-видимому, соответствует локализации комплексов ядерной поры. Полученные данные подтверждают ранее высказанную гипотезу о существовании независимых сетей ламинов А и В типа.

4.2.2 Микродомены ламинов образованы не одним уникальным типом ламинов, а комбинацией нескольких типов ламинов в разных соотношениях

Для выяснения природы изменения плотности ламинов в составе ламины был проведен электронномикроскопический анализ ядерной оболочки. Так как ламина соматических клеток не выявляется без специальных манипуляций, мы применили иммуноэлектронную микроскопию с последующей металлографией, что позволило однозначно идентифицировать положение ламинов А, либо В в клетке.

Анализ полученных изображений показал неоднородность распределения ламинов в составе ядерной оболочки (рис. 18). В отличие от результатов, полученных при помощи микроскопии с суперразрешением, мы не обнаружили в составе ядерной оболочки протяженных (более 200 нм) зон, полностью свободных от ламина А или В, за исключением небольших участков, по-видимому, соответствующим ядерным порам (рис. 18в,г,д). Отсутствие пробелов в мечение ламины наблюдается несмотря на более тонкий физический (100 нм), по сравнению с оптическим (250 нм) срез, а значит, меньшее количество молекул, попадающих в анализ. В то же время, интенсивность окрашивания не была равномерной: в составе ядерной ламины выявляются участки со сниженной концентрацией метки относительно среднего уровня сигнала. По-видимому, разница в результатах оптической и электронной микроскопии вызвана большей чувствительностью и разрешением метода иммуноТЭМ. Кроме того, оптическая микроскопии с суперразрешением не позволяет отличить снижение интенсивности мечения ламины, вызванное не строго поперечной ориентацией ядерной оболочки в плоскости оптического среза от локального снижения плотности ламинов, тогда как электронномикроскопический анализ более четко дискриминирует эти ситуации в участках ядерной оболочки, демонстрирующих сложный рельеф с многочисленными неровностями.

Рисунок 18. Распределение ламинов в составе ядерной оболочки. Иммуноэлектронная микроскопия. (а, б) - общий вид распределения ламинов, (а) - ламин В1, (б) - ламин А. (в, г, д) - примеры различного характера распределения ламина А, (в) - вариации концентрации ламина А, микродомены, (г) - участок с тангентальным срезом ядерной оболочки, (д) - локальное снижение плотности мечения, предположительно, ядерная пора. Размер масштабного ответа 0,5 мкм для (а, б), 0,3 мкм для (в,г,д).

Таким образом, микродомены, по-видимому, образованы не одним уникальным типом ламинов, а комбинацией нескольких типов, в разных концентрациях. Наши результаты хорошо согласуются с данными, полученными ранее для ламина В1 в клетках HeLa (Belmont et al., 1993), где также были отмечены сходные отличия результатов, полученных при помощи оптической и электронной микроскопии.

4.2.3 Совокупный анализ неоднородности ламины не выявил изменений ее структуры в

течение интерфазы

Для выяснения механизмов роста ламины необходимо исследовать ее микроархитектуру по мере прогрессии ядра по клеточному циклу. Мы предложили несколько возможных механизмов роста ламины. Один из возможных путей состоит в увеличении размеров индивидуальных доменов. Другой возможный путь - увеличение расстояния между соседствующими микродоменами. Наконец, рост ядерной оболочки может обеспечиваться возникновением новых микродоменов в дополнение к уже существующим. В первом и втором случаях следует ожидать изменение соотношения микродоменов и промежутков между ними, тогда в последнем случае это соотношение останется неизменным. Также не следует исключать более сложных механизмов роста, сочетающих несколько описанных путей роста.

Для исследования изменения микродоменной структуры ламины в процессе клеточного цикла препараты готовили следующим образом: клетки культуры CHO и HT1080 импульсно метили EdU, фиксировали, окрашивали антителами к ламину А либо В1 и исследовали методом 3D-SIM. Для исследования выбирали экваториальный оптический срез ядра.

Анализ микродоменной организации ламины показал, что она имеет неоднородную структуру как во время S-фазы, так и в клетках без репликативной метки (рис. 19). Для более аккуратной количественной оценки степени неоднородности ламины в связи со стадией интерфазы был произведен анализ изменений интенсивностей флуоресценции ламинов вдоль контура ядра по экваториальному срезу. Неоднородность ламины измеряли как долю стандартного отклонения от среднего по всему массиву данных данного ядра, т.е. оценивали разброс значений интенсивности флуоресценции относительно среднего по всей ламине. Наиболее подробно анализировали S-фазу, т.к. по распределению сайтов репликации в ядре можно наиболее точно определить степень прогрессии клетки по интерфазе. Различали раннюю, среднюю и позднюю S-фазу (Dimitrova and Gilbert, 1999). Клетки, не несущие репликативную метку, анализировали совокупно.

По результатам количественного анализа достоверных различий в степени отклонения значений флуоресценции от среднего по всей ламине в зависимости от стадии клеточного цикла выявлено не было (рис. 19д). Отсутствие такой зависимости говорит о том, что в ходе клеточного цикла не происходит глобальных единовременных изменений структуры ламиновой сети в определенный момент времени.

Рисунок 19. Количественный анализ степени неоднородности ламины в клеточном цикле по разбросу значений флуоресценции. (а,б,в,г) - примеры распределения ламинов в разные стадии клеточного цикла, БШ-микроскопия, размер масштабного отрезка 1 мкм. (а, б) - распределение ламина А (зеленый), (в, г) - распределение ламина В1 (зеленый). (а,в) -клетка в Б-фазе, репликативная метка - красный. (б,г) - клетки не в Б-фазе. (д) - анализ стандартного отклонения от среднего значение интенсивности ламина А в клеточном цикле.

Исследование неоднородности ламины путем анализа разброса значений флуоресценции относительно средней интенсивности позволяет выявить только такие перестройки ламины, которые вызывают значительные структурные изменения сети. Для выяснения механизма роста ламины в интерфазе необходимо сравнить состояние микродоменной организации сети ламинов на разных стадиях клеточного цикла. Для того, чтобы охарактеризовать микроархитектуру ламины, был разработан плагин для программы 1ша§е1 (приложение 1), позволяющий собирать информацию об интенсивностях флуоресценции вдоль проведенного вручную профиля. В каждой точке профиля анализировали суммарную интенсивность сигнала

вдоль нормали к профилю. Результаты такого анализа представлены на рисунке 20. На графике каждый пик соответствует микродомену, между пиками - локальное снижение плотности мечения. Для стандартизации анализа пиком считали значения интенсивностей выше среднего значения вдоль всего профиля. В качестве характеристики строения сети ламинов использовали отношение количества пикселей, соответствующих пиками к сумме пикселей со значениями ниже среднего (рис. 20г). Для определения стадии интерфазы использовали распределение сайтов репликации. В результате проведенного анализа обнаружилось, что соотношение пиков и зон локального снижения концентрации ламинов сохраняется неизменным в течение Б-фазы. Важно отметить, что это соотношение характерно и для клеток в 01 и 02-фазах клеточного цикла.

Рисунок 20. Количественный анализ степени неоднородности ламины в клеточном цикле при помощи плагина 1ша§е1. (а) пример экваториального среза ламина А с проведенным вдоль ядерной оболочки профилем. БГМ-микроскопия, масштабный отрезок 2 мкм, (б) - график распределения интенсивности флуоресценции вдоль профиля. (в) - фрагмент сети ламина А, БГМ-микроскопия, масштабный отрезок 300 нм, (г) - график распределения интенсивностей фрагмента сети ламина А вдоль профиля относительно среднего значения, вычисленного вдоль всего профиля. Микродомены отмечены светло-зеленым, зоны локального снижения плотности

сети ламинов отмечены темно-зеленым. (д) - анализ доли участков со сниженной плотностью ламинов, на примере ламина В1.

Таким образом, сохранение соотношения микродоменов и промежутков свидетельствует в пользу третьей из предложенных нами гипотетических схем роста ламины. Однако, примененный способ анализа не может выявить локальные и редкие изменения плотности ламиновой сети на фоне свойственной ламине неоднородности, связанной с ее доменной организацией, а также изменение архитектуры индивидуальных микродоменов в процессе роста ядра.

4.2.4 Степень полимеризации ламинов остается неизменной в течение интерфазы

Поскольку ламина считается высокополимерной и ригидной структурой, обеспечивающей прочность ядерной оболочки, следует предположить, что рост ламины за счет образования новых микродоменов требует ее активной перестройки. Возникает вопрос о механизме, обеспечивающем данный процесс. Можно предположить, что локальная деполимеризация сети ламинов в месте возникновения новых микродоменов может позволить осуществить подобные перестройки. Наиболее ожидаема реализация такого механизма в тот момент, когда происходит удвоение периферического гетерохроматина. Известно, что ассоциированные с ламиной домены хроматина реплицируются синхронно в середине S-фазы (Dimitrova and Gilbert, 1999). Если предполагаемый механизм действительно используется, популяция клеток в этой стадии клеточного цикла будет демонстрировать отличную от остальных клеток организацию ламины. Деполимеризацию ламинов можно выявить, применяя пермеабилизацию клеток непосредственно до фиксации. За счет этого не связанные с сетью белки-ламины будут вымыты, и, соответственно, в местах деполимеризации ламинов интенсивность флуоресценции будет снижена. Препараты для данного типа анализа пермеабилизовали в 0.1% растворе Тритона Х-100 в PBS, а затем готовили так же, как и в предыдущих экспериментах, и изучали с применением микроскопии с суперразрешением. Анализ профиля флуоресценции ламины проводили на экваториальных срезах с использованием описанного плагина для ImageJ. Оказалось, что соотношение пиков флуоресценции, соответствующих микродоменам, и мест локального разрежения плотности ламинов достоверно не различается в пермеабилизованных клетках и при стандартной пробоподготовке (рис. 21). Таким образом, по-видимому, рост ламины осуществляется без изменения степени ее полимеризации, затрагивающего целые микродомены.

60%

О I

М ф

к *

с; х

О X

Ч о

50% 40% 30% 20% 10% 0%

без лизиса с лизисом

Рисунок 21. Количественный анализ степени неоднородности ламины на примере ламина В1, связанной со степенью полимеризации ламинов, с использованием плагина для ImageJ.

4.2.5 Характер распределения ламинов Ли В1 в составе ядерной оболочки отличается

Анализ экваториальных срезов не позволяет исследовать общую конфигурацию сетей ламинов А и В. Для того, чтобы охарактеризовать распределение ламинов А и В1 в составе ядерной оболочки мы исследовали при помощи микроскопии с суперразрешением тангентальные сечения ядер, где сети ламинов располагаются в плоскости оптического среза (рис. 22).

С N.

.» * . 7 : V ' V •'-•*-

1 •

С'-; г •*

• т '..• "

м . *

• V « *»

Рисунок 22. Распределение ламинов А и В1 в тангентальном оптическом срезе ядра. БГМ-микроскопия. (а) - ламин А, (б) - репликативная метка, (в) - наложение. (г) - ламин В1, (д) -репликативная метка, (е) - наложение. (а-е) размер масштабного отрезка 2 мкм. (ж,з) -увеличенные фрагменты изображений, (ж) - ламин В1, (з) - ламин А. (ж,з) размер масштабного отрезка 0,5 мкм

Проведенный анализ позволил обнаружить, что ламины А и В1 образуют тяжи, слияние и расхождение которых образует сеть, т.е. микродомены ламинов, выявленные на экваториальном срезе не являются независимыми «островками», а связаны в единый каркас в составе ядерной оболочки (рис. 22). При этом характер распределения ламинов А и В1 незначительно различается: ламин А равномерно, диффузно распределяется в составе тяжей (рис. 22з), тогда как тяжи ламина В1 образованы чередой плотных скоплений (по типу «бусы на нитке», рис. 22ж).

Вероятно, обнаруженные отличия в характере распределения ламинов отражают различия в их функциях и регуляции роста ламиновых сетей. По-видимому, тесно связанные ламиновые сети тем не менее образуют независимые функциональные единицы в составе ядерной оболочки.

4.3 Моделирование роста ламины на свободной ядерной оболочке в интерфазном ядре

По результатам проведенных экспериментов можно заключить, что рост ламины осуществляется непрерывно на протяжении всей интерфазы с сохранением периодичности и размеров доменов ламиновых сетей. и не сопровождается ее локальной деполимеризацией. Механизм, при помощи которого осуществляется равномерный рост ламиновой сети без изменения ее микроархитектуры неизвестен. Так как рост ламины осуществляется без драматических изменений ее морфологии, для исследования механизмов увеличения сети было необходимо разработать модельную систему, где процесс роста будет максимально ярко выражен.

Нами было замечено, что гипотоническое воздействие на клетки и последующий возврат клеток в изотонию приводят к образованию выростов на поверхности ядра - почек. Так как ядерные почки образуются вследствие увеличения площади ядерной оболочки в контролируемых условиях, данная модель позволяет проследить состав, динамику образования ядерной оболочки и характер взаимодействия хроматина с новообразующейся ламиной.

4.3.1 Образование ядерных почек не приводит к значительным нарушениям

внутриклеточных процессов

Изначально, обработка клеток гипотоническим раствором Хенкса и последующий перенос клеток в среду культивирования использовалась для получения клеток с микроядрами (Зацепина и др. 1982, Владимирская и др., 1999). Инкубация живых клеток в гипотоническом растворе Хенкса приводит к значительным изменениям в структуре хроматина и митотических хромосом: декомпактизации высших уровней организации хроматина, диссоциации ядрышек и т. д. ((Киреев е! а1., 1988). Эти изменения являются обратимыми при переносе клеток в среду культивирования. Однако в некоторых интерфазных клетках наблюдаются стабильные изменения формы ядра, проявляющиеся в форме одиночных, реже парных, выпячиваний ядерной оболочки (рис. 23). Такие структуры, названные нами почками, отчетливо выявлялись уже после 1 часа гипотонического воздействия и последующего возврата клеток в среду

культивирования. Помимо клеток культуры СПЭВ, образование почек после гипотонического и изотонического воздействий мы наблюдали в клетках НеЬа и НТ1080. Почки легко детектируются после окрашивания клеток ДНК-связывающими красителями. При этом концентрация ДНК в почке и в ядре практически не отличается (рис. 23).

Рисунок 23. Ядерные почки, образующиеся после воздействия гипотонии. Клетки СПЭВ, КЛСМ. Размер масштабного отрезка 3 мкм. (а-в) распределение БЛР1 в клетках с почками. (г) -распределение репликативной метки в клетке с почкой.

Клетки с почками не окрашиваются трипановым синим, что подтверждает их жизнеспособность, и включают меченные предшественники синтеза ДНК, что подтверждает прохождение в них репликации (рис. 23г). Таким образом, можно заключить, что несмотря на стрессовые условия, возникающие в гипотонических условиях, клетки переживают описанные манипуляции, продолжая осуществлять важнейшие внутриклеточные процессы.

4.3.2 Образование ядерных почек происходит не во всех клетках

Образование почек после 1 часа гипотонического и 2 часов изотонического воздействий наблюдается в 4±1,1% клеток, тогда как в контроле только 0.14% клеток содержат почки. Возникает вопрос, зависит ли формирование почек от какой-либо определенной стадии клеточного цикла. После импульсного мечения этинилдезоксиуридином и последующей

инкубации в гипотоническом и изотоническом растворах 70% наблюдаемых клеток с почками включили импульсную метку этинилдезоксиуридина. Это означает, что, по крайней мере, в культуре СПЭВ большая часть клеток с почками находится в синтетическом периоде клеточного цикла. Очевидно, образование почек связано с локальным нарушением механических свойств ядерной оболочки, обеспечиваемых ламиной. Связь частоты образования почек со стадией клеточного цикла позволяет предположить функциональную значимость локального снижения прочности ламины во время репликации хроматина.

4.3.3 В ядерные почки мигрирует хроматин

Ядерная почка представляет интерес с двух точек зрения: с одной стороны, ее образование приводит к возникновению значительной площади ядерной оболочки, которую необходимо стабилизировать, в том числе за счет ламинов. Именно для исследования динамики образования ламины на свободной ядерной мембране мы использовали описанную модель. С другой стороны, интерес представляет поведение хроматина в условиях возникновения свободного пространства. Тесная связь хроматина с ядерной периферией позволяет предположить взаимосвязанность миграции хроматина в почку и образования ламины.

Как показано при окраске БЛР1, в клетках с почками отчетливо выявляются изменения внутренней структуры ядра. В таких клетках выявляются тяжи хроматина, направленные в сторону той части ядерной оболочки, где формируется ядерная почка. Описанные наблюдения, по-видимому, свидетельствуют о направленном перемещении хроматина в область почки.

Считается, что хроматин не обладает способностью перемещаться на большие расстояния внутри интерфазного ядра, за исключением специфических случаев (Ы е! а1., 1998). При этом, мы наблюдаем перемещение хроматина в ядерную почку. Можно предположить по крайней мере два механизма перераспределения хроматина в почку: неспецифический, связанный со стохастическим (диффузионным) движением незаякоренного хроматина, стремящегося заполнить свободное пространство ядра, и специфический, в котором важную роль должно играть прикрепление хроматина к оболочке почки. Для того, чтобы прояснить вопрос о том, какой из этих механизмов реализуется, необходимо исследовать характер взаимодействия хроматина с ядерной оболочкой в почках. Поскольку разрешения световой микроскопии не достаточно, мы исследовали почки при помощи трансмиссионной электронной микроскопии. На ультраструктурном уровне морфология хроматина в почках практически не отличается от остального хроматина вне почки, взаимодействующего с неизмененной ядерной оболочкой (рис. 24). Спустя 2 часа в изотонических условиях после гипотонического воздействия почки в клетках выстланы конденсированным хроматином, по структуре не отличимым от

гетерохроматина вне почки. Это значит, что на поздних сроках характер взаимодействия хроматина и ламины воспроизводит картину, характерную для «интактного» хроматина, установившего связь с ядерной периферией еще в ранней 01.

4f /fZ * ЧЩ- A- % ш V - wv

i- ■ * \ vV

.r * —

Рисунок 24. Морфологический анализ хроматина в ядерной почке. Клетки СПЭВ, электронная микроскопия, серийная резка. Размер масштабного отрезка 0,5 мкм.

4.3.4 Динамика установления взаимодействие хроматина и ядерной оболочки в почках

Для того, чтобы исследовать процесс установления взаимодействие хроматина с ядерной оболочкой в ядерной почке, было проведено исследование морфологии почки на разных сроках после гипотонии. Так как на ранних сроках изотонии (5-15 мин) клетки не успевают адаптироваться, выявление ядерных почек затруднено из-за многочисленных складок ядерной оболочки. Чтобы отличать почки на ранних сроках, мы применяли корреляционную микроскопию: препараты после фиксации окрашивали DAPI, находили клетки с почками, после чего исследовали найденные клетки при помощи трансмиссионного электронного микроскопа (рис. 25).

Почки, исследованные у клеток через 5 мин изотонии, имеют неправильную форму с фестончатым краем, так что проследить ядерную оболочку на большом протяжении не представляется возможным. Неровности ядерной оболочки в почке наиболее выражены на ее дистальном конце. Из-за гиперконденсации хроматина после переноса клеток в изотонию плотность фибрилл эухроматина приближается к плотности гетерохроматиновых доменов, в связи с чем невозможно определить, какая фракция хроматина находится на периферии почки (рис. 25в). По-видимому, специфические взаимодействия между хроматином и ядерной оболочкой не успевают сформироваться за столь короткий срок.

Спустя 15 мин после возврата клеток в изотонию общая степень конденсации хроматина падает, становится возможным отличить эу и гетерохроматин. На рисунке 25в видно, что почка по периферии выстлана гетерохроматином, по своему строению сходным с гетерохроматином на интактной ядерной оболочке, а также с периферическим гетерохроматином в контрольных

образцах. На этой стадии почка еще сформирована не окончательно: если у основания она имеет гладкие границы, то на внешней ее стороне есть участки с неопределенной морфологией, размытой границей. Таким образом, уже через 15 мин пребывания в изотонии устанавливаются контакты между хроматином и ядерной оболочкой.

Исследование клеток через 30 мин после их переноса в изотонию показало полностью сформированную почку с ярко выраженным гетерохроматином, прикрепленным к ядерной оболочке по всей площади почки.

Таким образом, электронномикроскопическое исследование динамики установления контактов между хроматином и ядерной оболочкой показало, что уже через 15 мин хроматин способен взаимодействовать с ядерной оболочкой, при этом установленная связь с периферией почки морфологически неотличима от периферического гетерохроматина контрольных клеток.

Рисунок 25. Динамика образования контактов хроматина и ядерной оболочки в ядерных почках. Корреляционная световая и электронная микроскопия. (а, б) - пример корреляции светового и электронномикроскопического изображения. (а) - окреска БЛР1, широкопольная световая микроскопия, масштабный отрезок 3 мкм. (б) - электронная микроскопия, масштабный отрезок 1 мкм. (в) - электронная микроскопия ядерных почек на разных сроках (5, 15, 30 мин) после гипотонии.

4.3.5 Динамика образования ламины в ядерной почке

Для изучения динамики образования ламины в ядерной почке клетки подвергали гипотоническому воздействию в течение 1 часа, после чего возвращали клетки в изотонический раствор и фиксировали спустя 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч и 4 ч. Ламин В1 выявляли в паре с ламином А либо С. В результате проведенного эксперимента было обнаружено, что ламин А, В1 и С демонстрируют разную динамику накопления в ядерной почке. Ламин В1 не выявлялся в составе оболочки почки ни в одной из экспериментальных точек, даже через 4 часа после возврата в изотонические условия (рис. 26). Ламин А через 5 мин в ядерной почке не обнаруживался, однако, появлялся через 15 мин после гипотонического воздействия, достигая нормальной, т.е. неотличимой от других участков ламины плотности мечения через 30 мин. На последующих сроках изменения концентрации ламинов А в ядерной оболочке почки не было обнаружено (рис. 26а). Ламин С выявлялся в составе почки еще раньше - уже через 5 мин после гипотонии ламин С на низком уровне обнаруживался в почке и через 15 мин достигал своей максимальной концентрации (рис.26б).

Рисунок 26. Динамика образования ламины в ядерной почке через 5, 15, 30 мин, 2ч, 4ч после гипотонии. Клетки культуры СПЭВ. Широкопольная флуоресцентная микроскопия, масштабный отрезок 3 мкм. (а) - сопоставление динамики встраивания ламина А и В1 в ядерную оболочку почки. (б) - сопоставление динамики встраивания ламина С и В1 в ядерную оболочку почки.

Важно отметить, что распределение ламинов А/С в ядерной оболочки почки не было равномерным. Особенно это заметно на ранних сроках образования ламины в почке. Мы установили, что плотность хроматина вдоль ядерной оболочки не коррелирует с плотностью ламиновой сети, т.е. по-видимому, хроматин не влияет на образование сетей ламинов А/С.

Таким образом, образование сетей ламинов А и С происходит независимо от ламина В1, при этом ламин В1 не в состоянии образовывать ламину на ядерной оболочке в почке, тогда как ламин А и С в течение 15-30 мин выстилают ядерную оболочку, по-видимому, независимо от присутствия хроматина.

4.4 Скорость обмена ламннов на разных стадиях интерфазы

По результатам описанных выше экспериментов можно заключить, что ламин А и В демонстрируют разное поведение, а именно по-разному встраиваются в ядерную оболочку. Однако, различие в динамике встраивания ламинов в ядерную оболочку мы наблюдали на специфической экспериментальной модели - на ядерных почках, где кинетика встраивания может отличаться от нормального поведения ламинов в клетке без стрессовых воздействий. Поэтому мы решили проанализировать динамические свойства ламинов в составе ядерной оболочки интактных клеток методом восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания. Для этой цели были использованы клетки СПЭВ и НТ1080, экспрессирующие ОБР-меченые ламины.

4.4.1 Разработка метода оценки скорости обмена ламинов

Стандартный метод оценки скорости обмена молекул по определению времени полувосстановления флуоресценции после выжигания оказался неприменим в случае ламинов из-за крайне низкой скорости их обмена в составе ядерной оболочки (Goldman et al., 1992). Поэтому в качестве характеристики динамики ламинов использовали начальную фазу восстановления флуоресценции (1 ч после обесцвечивания). Данные собирали каждые 10 мин, среднюю флуоресценцию оценивали вдоль проведенного вручную профиля. Такой подход позволил избежать ошибок, связанных с неизбежным перемещением живой клетки в пространстве в ходе эксперимента. Данные по средней флуоресценции аппроксимировали линейной функцией, которая позволила нивелировать стохастические отклонения в отдельных точках, и анализировали среднюю скорость восстановления за период наблюдения (рис. 27).

Рисунок 27. Измерение скорости восстановления флуоресценции ламина B1-GFP после фотообесцвечивания. Ламин В1 - зеленый, РСМД - красный. а - клетка непосредственно до фотообесцвечивания, б - сразу после фотообесцвечивания, в - 2 часа после обесцвечивания. Отмечена зона фотообесцвечивания, стрелка указывает на место фотообесцвечивания спустя 2 часа, масштабный отрезок - 3 мкм. г - количественная оценка скорости восстановления, показана линейная функция аппроксимации.

4.4.2 Скорость обмена ламина А выше, чем ламина В1

Для того, чтобы измерить скорость обмена ламинов А и В типов в интерфазных клетках, были получены клеточные линии, экспрессирующие ламин А, либо ламин В1, слитый с GFP. Анализ скорости восстановления флуоресценции после обесцвечивания ламина А и В1 в интерфазных клетках показал, что скорость обмена ламина А в 1.5 раза выше, чем скорость обмена ламина В1, что согласуется с литературными данными (Moir et al., 2000a) и принятым на сегодняшний день представлением о строении ламины (рис. 28). Действительно, ламин В1, связанный с ядерной мембраной при помощи фарнезильного хвоста, выполняет армирующую функцию, тогда как ламин А в результате работы Zmpste24 частично теряет способность связываться с внутренней ядерной мембраной и, по-видимому, удерживается в составе ламины за счет взаимодействия с ламином В1 или другими интегральными ламин-связывающими белками (Black, 1992).

Низкая скорость обмена ламина В1 по сравнению с ламином А в интерфазе согласуется с данными по встраиванию ламинов в ядерную почку, где ламин В1 не обнаруживался в составе ядерной оболочки почки в течение 4 часов, тогда как ламин А выявлялся уже через 15 мин после гипотонии. Однако, неясным остается механизм, позволяющий при разной скорости обмена ламинов А и В1 поддерживать постоянство структуры микродоменов на протяжении интерфазы.

клетках культуры СПЭВ.

4.4.3 Изменение скорости обмена ламинов в зависимости от стадии интерфазы

По результатам описанных выше экспериментов мы предположили, что способность ламина В1 встраиваться в ламину зависит от состояния периферического гетерохроматина. Известно, что ламина-ассоциированные домены хроматина устанавливают контакты с ядерной оболочкой в ранней Gl-фазе, и после timing decision point (Gilbert et al., 2010) глобальная реорганизация хроматина в пространстве ядра, по-видимому, не происходит. Исходя из этого, можно предположить, что хроматин, мигрировавший в ядерную почку, не способен образовывать контакты с ядерной оболочкой. Если способность ламина В1 встраиваться в ламину зависит от наличия контактов с хроматином, то это, с одной стороны, объясняет отсутствие ламина В1 в ядерной оболочке почки, и с другой стороны, может влиять на скорость обмена ламинов в зависимости от репликативного статуса периферического хроматина.

Ламин А при этом показал способность встраиваться ядерную оболочку почки без участия ламина В1 и хроматина, что, позволяет предположить отсутствие зависимости скорости обмена ламина А от стадии клеточного цикла.

Для того, чтобы проверить справедливость этой гипотезы, мы провели анализ скорости обмена ламина А и В1 в реплицирующихся и нереплицирующихся клетках. Подвижность ламинов измеряли по скорости восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). В этих экспериментах мы использовали клетки культуры СПЭВ со стабильной экспрессией ламина B1-GFP либо ламина А-GFP. Для того, чтобы отличить клетки в S фазе от нереплицирующих клеток, клеткам с начале эксперимента давали репликативную метку в течение 10 мин, после измерения скорости восстановления флуоресценции клетки фиксировали и проявляли репликативную метку. В каждой исследованной клетке определяли стадию S-фазы по характеру распределения репликативной метки в ядре. К сожалению, в описанной системе невозможно дискриминировать клетки в G1- и в G2-фазе.

В наших экспериментах было показано, что ламин В1 в S фазе демонстрирует более высокую скорость восстановления, по сравнению с нереплицирующимися клетками: скорость обмена ламинов В1 вне S фазы (n = 5) за 1 час составила 5.8% +/- 1.7%, тогда как в S фазе (n = 16) скорость обмена составила 10.1% +/-1.9% за час (p<0.01) (рис. 29).

Аналогичные измерения скорости обмена ламина А показали, что скорость восстановления флуоресценции не меняется в ходе клеточного цикла: скорость обмена ламина А составила 15.2% +/- 3.1% (n=9) за 1 час в нереплицирующих клетках, и 14.8% +/- 1.5% (n=21) в S фазе.

Для того, чтобы поверить универсальность наблюдаемого явления, скорость обмена ламина В1 в зависимости от стадии клеточного цикла была исследования на клетках культуры HT1080, стабильно экспрессирующих PCNA-mRFP и ламин B1-GFP. В этом случае мы определяли стадию интерфазы клетки по распредению PCNA в ядре. В отличие от клеток культуры СПЭВ, имеющих эпителиальное происхождение, клетки НТ1080 - фибробласты, склонные к активной миграции, что препятствует эффективному длительному наблюдению: из-за подвижности как целой клетки, так и ядра внутри нее, в данные вносится систематическая ошибка. Несмотря на описанные ограничения, в результате исследования 45 клеток мы обнаружили, что клетки в S фазе также демонстрируют более высокую скорость обмена ламина В1 3.7% +/- 0.8% за 1 час (n=26) по сравнению с клетками вне S фазы 1.4% +/- 0.4% (n=19).

Рисунок 29. Анализ скорости восстановления флуоресценции ламина А и В1 в клетках культуры СПЭВ в разные стадии клеточного цикла. (а) - скорость обмена ламина А в реплицирующих (синяя линия) и нереплицирующих (черная линия) клетках. (б) - скорость обмена ламина В1 в реплицирующих (красная линия) и нереплицирующих (черная линия) клетках.

Таким образом, наша гипотеза о разных механизмах регуляции встраивания ламинов А и В1 подтверждается. Действительно, способность ламина В1 встраиваться в ядерную оболочку зависит от наличия ламина-ассоциированных доменов хроматина (ЬАОб), которые образуют контакты с ядерной оболочкой. Ламин А не зависит от хроматиновых контактов, поэтому сохраняет неизменную скорость обмена на протяжении всей интерфазы.

4.5 Количество ламина В1 в растворимой фракции меняется в течение интерфазы

Проведенные эксперименты позволяют сделать вывод о зависимости встраивания ламина В1 в ядерную оболочку от синтеза хроматина. Возникает вопрос, каков механизм регуляции встраивания ламина В1 в состав ламины. Необходимо учитывать, что обмен ламина В1 происходит и вне Б фазы. Мы предположили, что две наиболее вероятные возможности такой регуляции осуществляются на уровне экспрессии генов ламина В1, либо на уровне посттрансляционных модификаций белков. Для исследования вопроса о количестве синтезированных ламинов В1 в определенной стадии клеточного цикла мы проанализировали количество синтезированного белка методом Вестерн-блот. Для этого мы раздельно анализировали ламин В1 в полимеризованной форме в составе ламины и в растворимой фракции в разные стадии клеточного цикла. Для этой цели клетки СНО синхронизировали и собирали фракцию 01, Б и 02 клеток. Для того, чтобы различить ламин В1 в полимеризованной

и неполимеризованной форме, клетки пермеабилизовали для экстракции растворимых белков, центрифугировали и параллельно анализировали осадочную и растворимую фракции. Для нормализации сигналов на количество нанесенного белка использовали белок ОАРОН.

Результаты синхронизации клеток СНО представлены на рисунке 30. Из представленного графика можно заключить, что синхронизация прошла, в ходе эксперимента происходит смена фаз клеточного цикла: до отмывки гидроксимочевины мы не наблюдаем лишь клетки без репликативной метки и небольшой процент клеток в ранней 8-фазе. Через 4 ч после отмывки гидроксимочевины появляются клетки в средней Б-фазе (16%), увеличивается доля клеток в ранней Б-фазе (31%). Через 8 ч после отмывки гидроксимочевины доля клеток в ранней и средней Б-фазе снижается (до 10% и 9%, соответственно), появляется значительное количество клеток в поздней 8-фазе. Также, только в этой пробе обнаружено небольшое количество митозов (2%). Таким образом, измеряя содержание ламинов в растворимой фракции в трех полученных пробах, мы можем судить о преимущественном вкладе клеток в известной стадии клеточного цикла.

до отмывки 4ч после отмывки 8ч после отмывки

гидроксимочевины гидроксимочевины гидроксимочевины

Рисунок 30. Эффективность синхронизации клеток СНО. Представлено распределение в клеточной популяции клеток без репликативной метки, клеток в ранней, средней, поздней Б фазе, митотических клеток.

На рисунке 31 представлены результаты анализа содержания ламина А и В1 в растворимой фракции в трех точках синхронизации, соответствующим преобладанию клеток в 01, |> и 02 фазах клеточного цикла. Для ламинов А и В типов удалось обнаружить как общие закономерности поведения, так и некоторые различия. Для ламинов обоего типа характерно накопление в 02 фазе в растворимой фракции. Увеличение концентрации растворимого ламина А и В1 может объясняться двумя причинами: во-первых, это может быть связано с

незначительным присутствием митотических клеток (2%). Известно, что в митозе происходит деполимеризация ядерной оболочки, что приводит к переходу ламинов в растворимую фракцию клетки. Однако, нельзя исключить вклада 02 фазы в накопление ламинов. Так как мы показали связь между встраиванием ламина В1 в состав ядерной оболочки и репликацией хроматина, накопление, по крайней мере, ламина В1 в 02 фазе может быть отчасти обусловлено невозможностью его встраивания. В таком случае, регуляция встраивания ламина В1 происходит не на уровне синтеза (и, соответственно, количества присутствующего в клетке невстроившегося белка), а за счет других мезанизмов.

Это предположение подтверждает наблюдение за количеством ламинов в растворимой фракции вШ и8 фазах. Если ламин В1 присутствует в 01 и Б фазах в незначительном количестве, то ламин А на этих стадиях вовсе не удалось обнаружить. Вероятно, наблюдаемая разница связана с разной динамикой обмена ламинов в составе ламины. Ламин А обменивается быстрее, чем ламин В1, что приводит к его быстрой утилизации. Однако, в любом случае, наличие ламина В1 в растворимой фракции в 01 и Б фазах подтверждает наше предположение о регуляции встраивания ламинов не на уровне синтеза белка.

Таким образом, было показано, что наличие растворимого ламина В1 не является достаточным условием для его встраивания в ядерную оболочку. По-видимому, для роста сети ламина В1 необходимы дополнительные условия,что приводит к его накоплению в растворимом состоянии. Для ламина А подобного накопления в растворимой фракции обнаружить не удалось, по-видимому, в связи с его свободной и более быстрой интеграцией в состав ламиновой сети.

61

а-1_атт А

сНЗАРРН

62

— 69

— 37

а-1_атт В

в2

— 68

сКИАРОН

— 37

Рисунок 31. Вестерн-блот анализ количества ламинов А и В1 в растворимой фракции клеток на разных стадиях клеточного цикла. Анализ субпопуляций клеток с преобладанием клеток на 01, Б и 02 стадиях. О АРОО использован в качестве контроля количества анализируемого белка в каждой пробе.

4.6 Ламина и репликация периферического гетерохроматина

4.6.1 Скорость обмена ламинов В1 в течение S фазы постоянна

Повышение скорости обмена ламина В1 в S фазе по сравнению с нереплицирующими клетками может отражать связь способности ламина В1 встраиваться в зависимости от наличия контактов с хроматином. Однако, с другой стороны, можно выдвинуть предположение о роли ламинов в репликации. Репликация периферического, прикрепленного к ядерной оболочке гетерохроматина, происходящая во второй половине S фазы, сталкивается с топологическими затруднениями. Действительно, прочная связь хроматина с полимеризованной сетью ламинов (Онищенко и Ченцов, 1974) представляет собой препятствие для прохождения репликативных молекулярных комплексов. Преодоление пространственных трудностей может происходить либо за счет нарушения связи хроматина с ламиной, либо за счет нарушения прочности ламины.

Чтобы проверить гипотезу об изменении степени полимеризации ламинов для обеспечения репликации периферического гетерохроматина, была проанализирована подвижность ламинов методом FRAP в разных стадиях S-фазы. Мобильность ламинов оценивали по скорости восстановления флуоресценции LaminB1-GFP, стадию S-фазы определяли по расположению сайтов репликации в ядре (Leonhardt et al., 2000), т.е. по распределению PCNA-mRFP. В качестве объекта наблюдения был выбран ламин В1, так как именно его скорость обмена повышается в S-фазе. Описанным выше методом (рис. 26) было проанализировано 16 клеток, 8 из них в ранней S-фазе, 8 - в поздней. В первой половине S-фазы скорость обмена ламина В1 составила 5 ± 2.04 %, во второй половине S-фазы - 3 ± 0.63 % (рис. 32).

Статистически значимых различий между клетками в начале и в конце S-фазы выявлено не было. Таким образом, репликация периферического, прикрепленного к ядерной оболочке хроматина, происходящая во второй половине S-фазы, не требует морфологической перестройки прикрепленной ламины.

<D "

I!

m

Ф

¡5 Ф

8 | m-&

10% 9% 8% 7% 6% 5% 4% 3% 2% 1% 0%

т

шш

ранняя S-фаза поздняя S-фаза

Рисунок 32. Анализ скорости восстановления флуоресценции ламина В1 в клетках культуры НТ1080 в ранней и поздней Б-фазе.

Так как нашей задачей было проследить тонкие изменения в структуре ламины, необходимо учитывать возможные недостатки примененной методики. Естественным ограничением метода был размер зоны выжигания, значительно превышающей размер фокуса репликации (рис. 27). Возможно, локальная перестройка ламины происходила в намного меньшем масштабе и поэтому осталась не выявленной. Кроме того, многочасовые прижизненные наблюдения осложнены перемещением клеток в поле зрения либо поворотом ядра внутри клетки (рис. 27). В любом случае, значительное увеличение подвижности ламинов в составе ламины во второй половине Б-фазы, несмотря на удвоение прикрепленного гетерохоматина и координированный с 5-фазой синтез ламина В1, не было обнаружено.

4.6.2 Суммарный анализ плотности мечения ламины относительно репликативных

фокусов

Для выявления неоднородности плотности ламины более мелкого масштаба, сравнимого с размером фокуса репликации в структуре ламины была использована микроскопия со структурированным освещением. В отличие от стандартной флуоресцентной микроскопии, разрешающая способность которой ограничена 200 нм, микроскопия со структурированным освещением позволяет преодолевать дифракционный предел и выявлять структуры в диапазоне 100—200 нм, что существенно меньше средних размеров фокусов репликации в поздней S-фазе (Kireev et al., 2008). Этот метод, в отличие от FRAP, не позволяет прижизненно выявлять подвижность молекул. Поэтому для проверки гипотезы о локальной разборке ламины во время репликации прикрепленного к ядерной оболочке гетерохроматина мы применяли методику, позволяющую отличить фракцию полимеризованных ламинов в составе ламины от деполимеризованных (растворимых) ламинов. Для этого мы производили подготовку

материала двумя способами: с пермеабилизацией перед фиксацией для вымывания ламинов, находящихся в деполимеризованном состоянии, и без пермеабилизации перед фиксацией.

Препараты готовили следующим образом: клеткам культуры СНО давали импульсную репликативную метку, пермеабилизировали, если это было необходимо, фиксировали, окрашивали антителами к ламину А либо В1, образцы заключали в Мовиол. Для исследования выбирали экваториальный, либо тангентальный оптический срез ядра.

В экваториальном срезе анализировали плотность ламины в зависимости от наличия сайтов репликации в непосредственной близости от ядерной оболочки. Для этого был разработан плагин для программы 1ша§е1 (приложение 1), позволяющий собирать информацию об интенсивностях флуоресценции ламины и сайтов репликации, находящихся в непосредственной близости от ядерной оболочки, но не перекрывающихся с ней. В результате автоматизированного анализа были получены два массива данных: интенсивности мечения ламина А, либо В1 и интенсивности репликативной метки вдоль ядерной оболочки на расстоянии не более 8 пикселей (180 нм) (рис. 33).

Корреляционный анализ поздних стадий Б-фазы, когда собственно осуществляется репликация прикрепленного к ламине гетерохроматина, не показал зависимости распределения ламинов обоих типов от наличия сайтов репликации ни в пермеабилизированных препаратах, ни в препаратах, приготовленных без стадии лизиса до фиксации.

Рисунок 33. Корреляционный анализ плотности мечения ламины и сайтов репликации периферического хроматина в поздней Б-фазе. (а) Экваториальный оптический срез, ламин А -зеленый, репликативная метка - красный. БГМ-микроскопия, масштабный отрезок 2 мкм. (б) -профиль флуоресценции ламина А и репликативной метки, полученный в результате автоматизированного анализа микроскопических изображений. (г) - увеличенный фрагмент сети ламинов А и прилежащих к ней фокусов репликации, БШ-микроскопия, масштабный отрезок 0,5 мкм, (в) - профиль флуоресценции увеличенного фрагмента. Цифры на (в) и (г) отмечают фокусы репликации и соответствующие им пики на графике. (д) - анализ корреляции интенсивностей флуоресценции ламина А и фокусов репликации.

Помимо анализа связи степени полимеризации ламины с репликацией по экваториальному срезу ядра, был проведен анализ колокализации по тангентальному оптическому срезу. Эта плоскость из-за оптических свойств микроскопа, с одной стороны, позволяет включить в анализ и ламину и фокусы репликации, т.к. толщина оптического среза при применении метода суперразрешения составляет 250 нм. С другой стороны, толщина оптического среза не позволяет точно определить положение фокуса репликации по ъ, в результате чего в анализ могут попадать фокусы репликации, не находящиеся в непосредственном контакте с ядерной оболочки, и искажать результаты.

Для анализа получали изображения методом суперразрешения в двух каналах в 3 оптических срезах: в тангентальной оптической плоскости и с шагом в 120 нм еще два среза внутрь ядра. Для анализа колокализации ламинов А и В1 с фокусами репликации был разработан плагин для программы 1ша§е1 (Приложение 2), позволяющий в автоматическом режиме находить центры максимумов флуоресценции фокусов репликации и сопоставлять их со значениями ламина А либо В1 в тех же координатах во всех оптических срезах. Тангентальный срез использовали для выяснения зависимости концентрации ламинов А и В типов от наличия фокуса репликации, два оптических среза внутри ядра использовали в качестве контроля: корреляция положения фокусов репликации и мест локального разрежения плотности ламинов должна отсутствовать.

По результатам анализа не была обнаружена корреляции между расположением фокусов репликации и локальными разряжениями ламинов А и В1 ни в тангентальном, ни в контрольных срезах (рис. 34б,г) как в образцах с пермеабилизацией, так и без нее.

Однако результат корреляционного анализа массивов данных по всему периметру ядерной оболочки в экваториальном срезе, либо по всей поверхности тангентального среза может искажать неоднородность ламины, не связанная с репликацией. Действительно, показано, что ламины А и В1 образуют независимые, тесно связанные сети (БЫш1 е! а1., 2011), что внешне выражается в наличии большого количества субдоменов, положительных только по одному из ламинов. Во-вторых, места отсутствия окраски ламина могут соответствовать локализации ядерных пор (8сЬегше11еЬ е! а1., 2010). В третьих, частота изменения интенсивностей мечения ламины выше, чем репликативной метки (рис. 33 б), что также может нивелировать возможную корреляцию данных по ламине и сайтам репликации. Таким образом, использованный подход для анализа данных в связи с его низкой чувствительностью позволяет лишь исключить массированную разборку ламины напротив сайтов репликации, сохраняющуюся в течение долгого времени.

Рисунок 34. Пример корреляционного анализа положения фокусов репликации и микродоменов ламинов в тангентальном срезе ядра. (а) - красный - ламин А, зеленый - репликативная метка. БГМ-микроскопия, масштабный отрезок 2 мкм. (б) - корреляционный анализ локализации микродоменов ламинов и фокусов репликации на разных оптических срезах. Первый оптический срез соответствует оптическому сечению ламины и расположенных наиболее близко к ней фокусов репликации. Корреляционный анализ того же оптического среза ламины и второго либо третьего оптических срезов репликативной метки с шагом в 120 нм вглубь ядра выполняют функцию контрольного эксперимента. (в, г) - то же для ламина В1.

4.6.3 Анализ плотности мечения ламины напротив индивидуальных фокусов репликации

Для исключения погрешностей анализа тотальных массивов данных мы проанализировали структуру ламины непосредственно напротив сайтов репликации (рис. 35а). Были обнаружены участки меньшей плотности ламины, которые находились напротив сайта репликации, что исключало возможность присутствия здесь ядерной поры. Были найдены также участки меньшей плотности ламины, которые располагались с некоторым смещением относительно максимальной интенсивности флуоресценции репликативного фокуса. Тем не менее, такие фокусы сохраняли контакт с зоной пониженной концентрации ламинов. Таким образом, тщательный анализ индивидуальных фокусов репликации позволил выявить примеры самого разного поведения ламины.

Пробоподготовку и получение данных об интенсивности флуоресценции ламины и фокусов репликации проводили как описано выше для суммарного анализа корреляции флуоресценции ламины и фокусов репликации в экваториальном срезе. В отличие от тотального анализа всего массива данных, ламину анализировали только напротив сайтов репликации, таким образом исключая из анализа не связанную с репликацией неоднородность ламины.

Для стандартизации статистического анализа мечения ламины напротив сайтов репликации мы использовали «окно», центром которого был фокус репликации. Фокусом репликации считали пик интенсивности флуоресценции репликативной метки выше ее среднего значения по всему профилю (рис. 35б). Это максимальное значение не всегда находилось в центре «окна» из-за несимметричности пика, «окно» анализа было шире пика репликативной метки на два пикселя (60 нм) в обе стороны. Статистический анализ индивидуальных пиков в клетках также не позволил выявить достоверного снижения плотности ламинов А и В1 напротив сайтов репликации. Усреднение значений интенсивности флуоресценции ламины напротив всех сайтов репликации в каждой клетке соответствовало среднему значению интенсивности мечения всей ее ламины (рис. 35в).

При сравнении распределения ламинов в клетках после пермеабилизации были получены аналогичные результаты.

Таким образом, неоднородность распределения ламинов А и В1 в ядерной оболочке, выявленная с помощью иммунофлуоресценции, не отражает репликативный статус прикрепленного к ламине гетерохроматина и не связана с локальным изменением растворимости ламинов.

Рисунок 35. Пример статистического анализа поведения ламины напротив индивидуальных фокусов репликации. (а) - фрагмент ламины с реплицирующимися периферическими хроматиновыми доменами. Зеленый - ламин А, красный - репликативная метка. Линии соответствуют профилю, вдоль которого проводился сбор информации об интенсивности ламины и репликативной метки и нормали в одной из точек профиля. 81М-микроскопия, масштабный отрезок 0,25 мкм. (б) - профиль флуоресценции ламина А и репликативной метки, полученный в результате автоматизированного анализа микроскопических изображений. Линию, соответствующую максимальному значению флуоресценции репликативной метки, выбирали в качестве центра окна анализа плотности мечения ламины относительно центра фокуса репликации. (в) - усредненые значения плотности ламины напротив сайтов репликации по всей клетке. Пунктиром обозначено положение центров фокусов репликации.

4.6.4 Репликация периферического ГХ не требует открепления от ЯО

По результатам исследования структуры ламины во время репликации преодоление пространственных трудностей во время удвоения периферического гетерохроматина происходит без изменения степени полимеризации ламины. Поэтому, наиболее вероятной оказывается гипотеза о временном нарушении связи хроматина с ламиной без изменения прочности сети ламинов. Для изучения характера предполагаемого нарушения взаимодействия ламины и хроматина во время репликации применяли метод иммуноэлектронной микроскопии. Для выявления сайтов репликации клеткам культуры СНО давали репликативную метку, далее клетки пермеабилизировали, фиксировали, проявляли репликативную метку, инкубировали с антителами, дофиксировали, проводили металлографию, обезвоживали, заключали в эпон. Для изготовления срезов выбирали клетки, находящиеся в средней и поздней Б фазе, хорошо отличимые по распределению фокусов репликации в пространстве ядра (рис. 36).

Рисунок 36. Процедура выбора клетки для электронной микроскопии репликативных сайтов. а - заключенный в эпон препарат с проявленной репликативной меткой, после металлографии. б - распределение сайтов репликации позволяет однозначно идентифицировать необходимую стадию Б-фазы. в - электронномикроскопическое изображение тех же клеток, ультратонкий срез.

В середине Б фазы происходит репликация выстилающего ядерную оболочку хроматина, в конце Б фазы реплицируются большие домены гетерохроматина, прикрепленные к ламине. Таким образом, на полученных срезах репликативные фокусы были помечены во всем своем объеме, что необходимо для анализа контакта реплицирующихся доменов хроматина с ядерной оболочкой.

Ультраструктурное исследование локализации реплицирующихся доменов гетерохроматина относительно ядерной оболочки показало, что ни на стадии средней, ни на стадии поздней Б фазы не происходит открепления доменов периферического гетерохроматина от ядерной

ламины (рис. 37). По литературным данным, репликация хроматинового домена занимает в среднем 45-60 мин (Ма е! а1., 1998), что значительно превосходит использованное в наших экспериментах время мечения (15 мин). Таким образом, репликация, несмотря на возможные топологические затруднения, вызванные прочной связью хроматина и ламины, не требует морфологически выявляемого пространственного разобщения периферических хроматиновых доменов с ядерной ламиной. По-видимому, для доступа молекулярных комплексов, осуществляющих репликацию, не требуется такое отдаление, которое выявлялось бы на электронномикроскопическом уровне.

Рисунок 37. Репликация периферического хроматина не сопровождается выявляемым отдалением хроматина от ядерной периферии. Иммуноэлектронная микроскопия. Масштабный отрезок 0,5 мкм

4.6.5 Обратимое перемещение HSR во время репликации происходит без открепления

локуса от ядерной оболочки

Результаты исследования реплицирующего хроматина и ламины во время репликации на высоком разрешении позволяют исключить, с одной стороны, деполимеризацию ламины в

ответ на удвоение прикрепленных к ней доменов хроматина, с другой стороны, видимого открепления хроматина от ядерной оболочки в процессе репликации. Однако, вопрос о механизме, обеспечивающем протекание репликации в контексте прочного взаимодействия компактизованного хроматина и высокополимерной ламины остается нерешенным. Проведенный морфологический анализ основан на статистической обработке большого количества изображений. Такой тип анализа не позволяет отслеживать поведение индивидуальных хромосомных локусов в процессе изменения их функционального состояния — репликативного статуса. Главную техническую сложность при анализе динамических взаимоотношений хроматина и ядерной оболочки представляет необходимость наблюдения за известным доменом хроматина без деструктивных воздействий на структуру хроматина. Наиболее предпочтительной является возможность наблюдения за известным локусом in vivo, без фиксации. Удобной модельной системой для этих исследований являются клеточные линии с трансгенными локусами, связывающими слитый с GFP Lac-репрессор (Robinett et al., 1996), что делает их доступными для прижизненных наблюдений. Для одной из таких линий было показано обратимое перемещение гетерохроматического локуса от ядерной периферии в центр ядра при его репликации (Li et al., 1998). В данной работе мы исследовали изменения структуры ламины при подобного рода перемещениях, связанных с синтезом ДНК. Для этого клетки CHO клона AO_3 трансфицировали плазмидой, кодирующей LaminB1-mRFP, и исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Было обнаружено, что перемещение HSR в центр ядра происходит без потери связи с ядерной ламиной (рис. 38). Напротив, в этих клетках всегда выявлялись инвагинации ламины, контактирующие с центрально расположенным HSR. Непосредственный физический контакт HSR с ядерной оболочкой в таких клетках подтверждается на ультраструктурном уровне, что исключает ошибки интерпретации результатов световой микроскопии, связанные с недостаточным осевым разрешением (рис. 38в,г).

Рисунок 38. Обратимое перемещения гетерохроматического локуса от ядерной периферии в центр ядра при его репликации не приводит к потере его связи с ядерной оболочкой. (а, б -световая микроскопия, экваториальный срез, ламин B1 - красный, GFP - зеленый, масштабный отрезок 3 мкм; в, г - иммуноэлектронное выявление GFP, масштабный отрезок 1 мкм. а, в - HRS (искусственный гетерохроматический хромосомный локус) не в состоянии репликации, б, г -HSR в развернутом состоянии в центральной части ядра, т.е. в состоянии репликации. Виден контакт HRS с инвагинацией ядерной оболочки.

Вне зависимости от того, какие механизмы являются причиной связанного с репликацией перемещения HSR, представляется вероятным, что изменения в структуре ламины, сопровождающие это перемещение, требуют активации динамики ламинов. Хотя подобных масштабных изменений ламины в норме не происходит, нельзя исключить, что наблюдаемое явление отражает нормальный механизм поведения ламины в процессе репликации прикрепленного к ней гетерохроматина. Таким образом, прочность ламины и ее устойчивость к различного рода химическим воздействиям сочетается с высокой пластичностью.

5 Обсуждение результатов

Известно, что ламнна несет разнообразную функциональную нагрузку. Часть функций, таких как обеспечение прочности ядерной оболочки, необходимой для защиты генома, и участие в эпигенетической регуляции состояния хроматина за счет создания репрессивного микроокружения, являются предметом активного исследования (Akhtar and Gasser, 2007). На различнык экспериметнальнык моделях (Constantinescu et al., 2006; Mounkes et al., 2003; Pekovic and Hutchison, 2008; Peric-Hupkes et al., 2010; Prather et al., 1991; Röber et al., 1989, 1990; Vergnes et al., 2004) была показана важная роль ламины в дифференцировке клеток. Существуют данные, свидетельствующие об участие ламинов в таких базовых внутриклеточных процессах как транскрипция (Benavente et al., 1985; Shimi et al., 2008; Spann et al., 2002; Stick and Hausen, 1985), репликация (Dimitrova and Gilbert, 1999; Ellis et al., 1997; Meier et al., 1991; Newport et al., 1990; Shumaker et al., 2008), репарация (Liu et al., 2005; Manju et al., 2006) и апоптоз (Rao et al., 1996; Steen and Collas, 2001). Вероятно, этим спектр функциональных возможностей ламины не исчерпывается.

Ламина обладает несколькими особенностями строения и функционирования, которые осложняют ее исследование. Во-первых, мажорные белки ламины - ламины А, В и С - могут находиться в нескольких структурных состояниях, отличающихся степенью полимеризации и внутриклеточной локализацией (Kolb et al., 2011; Moir et al., 1995). Таким образом, при исследовании ламины необходимо учитывать как положение изучаемого ламина в трехмерном пространстве клетки, так и его состояние.

Во-вторых, ламины претерпевают серию посттрансляционных модификаций, которые довольно подробно исследованы in vitro (Dechat et al., 2010; Shimi et al., 2010), однако не изучены в клетке. Не ясно, где в пространстве цитоплазмы и ядра происходят необходимые стадии созревания, не установлена их роль в регуляции образования и функционирования ламины. В-третьих, ламина представляет собой многокомпонентную структуру, где помимо ламинов разных типов - А, В и С - присутствуют мембраны и множество белковых комплексов (Wilson and Berk, 2010). Кроме того, ламина является связующим звеном между хроматином и цитоплазматическим компартментом (Razafsky and Hodzic, 2009; Wilson and Foisner, 2010). Все это в совокупности осложняет исследование роли ламинов в жизни клетки.

Упомянутая сложность и многокомпонентность ламины ставит вопрос о регуляции ее функционирования и о поддержании ее постоянства в ряду клеточных поколений. Поведение ламины в митозе изучено довольно подробно (Ellenberg et al., 1997; Moir et al., 2000a),

установлено, что особенности строения обуславливают значительно разнящееся поведение ламинов А и В типов в митозе (Black, 1992; Dechat et al., 2010). Однако, механизмы, обеспечивающие рост ламины в интерфазе в контексте множества выполняемых ею функций, в том числе при репликации заякоренного на ядерную оболочку хроматина, не установлены.

В нашей работе мы выяснили, что рост ядра происходит равномерно на протяжении всей интерфазы. В ходе прижизненных наблюдений за динамикой роста ядра, без определения стадии клеточного цикла, и при статистическом анализе большого числа клеток с выявленным репликативным статусом мы установили, что размер ядра меняется линейно на протяжении интерфазы. Несмотря на то, что в ходе интерфазы выделяются три с функциональной точки зрения четко различимых периода: G1, S и G2, - никаких изменений в скорости роста ядерной оболочки не происходит. Это тем более удивительно, если учесть, что в S фазе, которая занимает лишь около 1/3 всего времени интерфазы, происходит удвоение всего генетического материала, в том числе, прикрепленного к ламине. Прочность связи периферического хроматина с ламиной очень высока, даже обработка ядер солями высокой концентрации и детергентами (Infante et al., 1976; O'Brien et al., 1972), центрифугирование (Онищенко and Ченцов, 1974) и обработка нуклеазами (Cook and Brazell, 1980) не приводит к полной очистке ламины от связанного с ней хроматина.

Для выяснения механизмов роста ламины в контексте множества выполняемых ею функций мы исследовали морфологию ламины в масштабе микродоменов ламиновых сетей. Известно, что ламина состоит из двух типов ламинов - А и В, каждый из которых образует сеть микродоменов (Shimi et al., 2008). Считается, ламины А и В типов взаимодействуют с разными типами хроматина (ламины А с факультативным гетерохроматином, ламины В - с конститутивным гетерохроматином), что, предположительно, позволяет тонко регулировать функциональное состояние связанного с периферией генетического материала (Shimi et al., 2008). Известно, что репликация эухроматина, факультативного и конститутивного гетерохроматина происходят последовательно в ходе S-фазы (Dimitrova, 2002; Dimitrova and Gilbert, 1999). Однако, в результате исследования микродоменной организации ламины никаких изменений в S-фазе относительно G1 и G2 выявлено не было. Рост ламиновых сетей в ходе интерфазы происходит равномерно относительно друг друга. Обеспечение функций ламины на протяжении всей интерфазы не приводит к выявляемым изменениям характера микродоменной организации.

Помимо поддержания структуры микродоменов в ходе интерфазы, неизменной остается степень полимеризации сети ламинов. Локальная деполимеризация ламиновой сети предположительно может служить для преодоления топологических затруднений при процессах, требующих доступа макромолекулярных комплексов к периферическому

хроматину. Это особенно актуально в середине и конце S-фазы, когда происходит удвоение периферического гетерохроматина. Мы предположили, что на этой стадии изменение степени полимеризации ламины должно быть наиболее выраженным, а значит легко выявляемым. Однако, пермеабилизация клеток перед фиксацией, применяемая для удаления ламинов, находящихся в растворенном состоянии, не приводит к изменению рисунка микродоменной структуры ламины. Более подробно степень полимеризации ламины была исследована в контексте удвоения прикрепленного к ней гетерохроматина. Строение ламины изучали в непосредственной близости от доменов периферического гетерохроматина, находящихся в состоянии репликации. Отсутствие каких-либо закономерностей в плотности ламиновой сети в ответ на дупликацию заякоренного на ядерную оболочку хроматина позволяет сделать вывод о том, доступ макромолекулярных комплексов к периферическому хроматину, по-видимому, обеспечивается без изменения локального строения ламины.

Действительно, при выявлении сайтов репликации на электронно-микроскопическом уровне в недеструктивных условиях с сохранением нативной структуры хроматина мы установили, что репликация происходит в тесном контакте с ядерной периферией. Таким образом, по-видимому, доступ макромолекулярных комплексов к конденсированному хроматину не представляет собой топологическую проблему. Не требуется ни локальная разборка ламиновой сети, ни отдаление хроматинового домена от ядерной оболочки. При этом нельзя исключить, что поведение ламины в ответ на репликацию периферического хроматина регулируется более сложным образом: степень полимеризации ламины может изменяться до начала синтеза ДНК, равно как и после его завершения. Кроме того, следует учитывать, что микроскопия с суперразрешением дает значительное увеличение качества получаемого изображения, однако, тем не менее не может эффективно выявить объекты менее 120 нм. Таким образом, кратковременные, либо очень незначительные изменения ламиновой сети могли остаться за пределами чувствительности метода.

Тем более удивительным в контексте обсуждаемой стабильности ядерной оболочки при репликации связанного с ней гетерохроматина выглядит обнаруженное нами изменение геометрии ядерной оболочки при удвоении HSR-локуса. HSR-локус - уникальный домен конденсированного хроматина, для которого обнаружено перемещение в центр ядра при репликации (Li et al., 1998) и возвращение обратно на периферию ядра после завершения процесса. Мы показали, что при перемещении HSR в центр ядра ламина не теряет с ним физический контакт, образует инвагинации. Обратимые масштабные изменения геометрии ламины свидетельствуют о ее высокой пластичности. Вероятно, описываемый феномен не является универсальным при репликации периферического гетерохроматина, однако ярко демонстрирует способность ламины сочетать механическую функцию с высокой гибкостью.

Отдельного внимания требует вопрос о механизме поддержания постоянства строения сети ламинов. Известная из литературы (Moir et al., 2000a) и подтвержденная в наших исследованиях разница в скорости обмена ламина А и В неясным образом сочетается с сохранением мелкой морфологии ламины и ее равномерным ростом на протяжении интерфазы. Скорость обмена ламина А в 3-8 раз выше, чем скорость обмена ламина В1. Механизм, который позволяет поддерживать постоянство строения ламины при разной скорости встраивания ламинов неизвестен. Это может быть связано с тем, что чрезвычайно низкая скорость обмена ламинов отражает в первую очередь не рост ламины, а функциональную нагрузку на разные типы ламинов и необходимость их обновлять. Можно предположить, что ламины А подвергаются большему стрессу по сравнению с ламинами В1, таким образом, требуют более частой замены. Однако, подобные предположения остаются спекулятивными до тех пор, пока не будет выяснен механизм регуляции встраивания ламинов в состав полимеризованной сети.

По результатам наших исследований механизм роста сети ламинов А и В типов значительно отличается. Рост ламина В1, вероятно, зависит от наличия ламина-ассоциированных доменов, способных к заякориванию на периферию. Этот вывод опирается на несколько фактов. Мы обнаружили, что скорость обмена ламина В1 зависит от стадии клеточного цикла. Во время S-фазы скорость восстановления флуоресценции ламина В1 в два раза выше, чем в G1 и G2 фазах. Именно в S-фазе удваивается хроматин, а значит и количество ЬАОов. По-видимому, в ответ на появление ЬАОов ламин В1 начинает встраиваться. Однако, мы не выявили разницы в скорости обмена ламина В1 в ранней и поздней S-фазе. LADbi удваиваются во второй половине S-фазы, в первой половине происходит репликация эухроматина, не взаимодействующего с ядерной оболочкой (Cimbora and Groudine, 2001). Это может свидетельствовать о непрямой зависимости между возникновением LAD и встраиванием ламинов В1.

Подтверждением зависимости встраивания ламина В1 в ламину от LADов является отсутствие ламина В1 в составе ядерной оболочки почки. Известно, что после митоза положение хроматина в ядре устанавливается не сразу: лишь спустя 40-60 мин после начала G1 наступает TDP, когда происходит сортировка хроматина и он занимает свое нормальное положение в пространстве ядра (Gilbert et al., 2010). После этого, вплоть до следующего митоза, хроматин в макромасштабе неподвижен. Более того, даже изменение уровня экспрессии, связанное с перемещением гена в радиальном направлении в ядре, происходит только после прохождения митоза (Reddy et al., 2008). Исходя из литературных данных и наших результатов, после того, как положение LADов определено, они не могут перемещаться и образовывать новые контакты. По-видимому, LADbi не перемещаются в ядерную почку, в связи с тем что они уже заякорены, либо не образуют новые контакты с новообразованной ламиной. В каждой конкретной клетке не все LADы контактируют с ламиной, часть из них, около 75%, заякорена

на ядрышко, либо образует интеркалярный гетерохроматин (Kind et al., 2013). Несмотря на это, вероятно, они не в состоянии реализовать возможность взаимодействия с ламиной, если ее предоставить после TDP. Мы предполагаем, что из-за отсутствия в почке ЬАОов, способных к взаимодействию с ядерной оболочкой, встраивание ламина В1 в ламину почки заблокировано.

Косвенным подтверждением связи встраивания ламинов В1 с образованием новых LADов с является отсутствие локального снижения плотности ламиновой сети напротив сайтов репликации периферического гетерохроматина. По нашим данным, средняя интенсивность мечения ламины по всему ядру, рассматриваемая в качестве контроля, не отличается от средней интенсивности ламиновой сети в непосредственном контакте с сайтом репликации заякоренного на нее хроматина. Связь между степенью полимеризации ламина В1 и репликацией периферического гетерохроматина не выявлена, таким образом, напротив сайтов репликации нет разборки ламина В1, что не противоречит предпочтительному встраиванию ламинов В1 в ламину при удвоении LADов.

Дополнительным свидетельством различия механизмов роста сетей ламинов А и В в интерфазе является наблюдение за их строением в тангентальной плоскости ядра. Хроматин выстилает периферию ядра тяжами, по морфологии очень близкими к строению сети ламина В1. Тяжи ламина В1, в отличие от ламина А, имеют четкие края, более высокую плотность мечения. Подобные закономерности распределения ламинов А и В типов были выявлены, но недостаточно тщательно исследованы в работе Shimi с соавторами (Shimi et al., 2008). Это наблюдение хорошо согласуется с данными Belmont (Belmont et al., 1993), где методами иммуноэлектронной микроскопии была показана корреляция распределения ламина В1 и периферического гетерохроматина. Вероятно, ламин В1 предпочтительно встраивается вдоль фибрилл хроматина, что и обусловливает сходство их строения.

По совокупности наблюдений мы предполагаем зависимость встраивания ламина В1 в состав ламины от хроматина. Вероятно, если на протяжении всей интерфазы встраивание ламинов В1 происходит для поддержания уже существующей сети, то в S-фазе, когда удваиваются LADbi, происходит образование затравок ламина В1 de novo, которые и обеспечивают рост сети ламинов В1.

В отличие от ламина В1, встраивание ламина А, по-видимому, не зависит от образования контактов с LAD. Нами обнаружено несколько свидетельств в пользу этого предположения.

Во-первых, скорость обмена ламина А не зависит от стадии интерфазы. Несмотря на то, что дупликация хроматина происходит в S-фазе, ламин А сохраняет скорость восстановления флуоресценции на протяжении всей интерфазы постоянной.

Во-вторых, ламин А, в отличие от ламина В1, очень быстро обнаруживается в составе ламины почки. Нам не удалось выявить какой-либо закономерности в поведении хроматина и

ламина А в почке. Хроматин по результатам световой и электронной микроскопии обнаруживается в почке на самых ранних сроках, тогда как ламин А выстилает почку через 1530 мин после возврата клеток в изотонию. Кроме того, места контакта хроматина с ядерной оболочкой почки не соответствуют местам накопления ламина А/С. Обнаружены как места с повышенной концентрацией ламина А и С без хроматина, так и контакты хроматина с ядерной оболочкой почки, где ламин А/С еще не встроился.

В-третьих, случайный характер встраивания ламина А объясняет, почему на тангентальном срезе сети ламина А нет структурированных, четко оформленных фибрилл, как у ламина В1. Ламин А имеет нечеткие, размытые границы, что согласуется с нашим предположением о независимости его встраивания от хроматина.

Таким образом, мы можем выдвинуть гипотезу о разных механизмах регуляции встраивания ламинов А и В в ламину в интерфазе. Если встраивание ламина В1 зависит от готового к заякориванию на периферию хроматина, то ламин А, по-видимому встраивается свободно, возможно, в участки обедненные по ламину В1, «пустые» участки. Сочетание разных механизмов роста ламиновых сетей обеспечивает равномерный непрерывный рост ядра на протяжении интерфазы.

Возникает вопрос о неизменности микродоменной структуры ламины в интерфазе. Если сеть ламина В1 более активно растет в Б-фазе, тогда как ламин А равномерно встраивается в течение всей интерфазы, то соотношение ламина А и В должно меняться в при смене фаз клеточного цикла. Действительно, для обеспечения равномерности роста ядерной оболочки в 01 и 02 фазах должен превалировать рост за счет ламина А, тогда как в Б-фазе должно произойти удвоение количества ламинов В1 в ламине. Однако, это замечено не было. Причиной этого могут быть как недостаточная чувствительность микроскопии с суперразрешением для точного количественного анализа соотношения ламинов в ламине, так и дополнительный, не выявленный механизм роста ламины, не связанный со встраиванием новых молекул: ее растяжение.

Важнейшим выводом проделанной работы является установленная связь между увеличением площади ламины и количества хроматина. Особенный интерес этот вывод представляет в свете признанной роли ядерной оболочки как эпигенетического фактора регуляции генома (То^Ып е! а1., 2009), в связи с чем возникает вопрос о специфичности взаимодействия хроматина с определенным типом ламинов. Как было показано в работе БЫш1 (БЫш1 е! а1., 2008) ламин А специфически взаимодействует с факультативным гетерохроматином, тогда как ламин В1 - с конститутивным гетерохроматином. Этот вывод был сделан на модели ядерных почек, полученных отличным от нашего способом: для их образования использовали ламина В1. Полученные ядерные почки, как и в нашей

системе, были выстланы только ламином А. Хроматин, мигрирующий в почку, по результатам Shimi et al был обогащен генами, положителен по гистоновым маркерам активного хроматина, относился к ранореплицируемому эухроматину, из чего авторы делают вывод о специфичности взаимодействия ламинов с разными фракциями хроматина. Наши наблюдения хорошо согласуются с результатами Shimi с соавторами: дейсвительно, в ядерной почке мы наблюдали ламин А/С на ее ядерной оболочке и ДНК, относящуюся к ранореплицирующемуся, т.е. эухроматину. Однако, вызывают вопросы выводы, сделанные авторами. Методика, использованная в работе Shimi с соавторами, имеет ряд ограничений: во-первых, для достижения эффекта при siRNA авторы анализировали клетки спустя 3-5 дней после трансфекции, т. е. не имели возможности проследить динамику установления контактов хроматина и новообразующейся ламины. Во-вторых, при использовании siRNA, ламин В1 не может мигрировать в почку ввиду его отсутствия, поэтому специфичность взаимодействия ламина В1 с хроматином не может быть установлена. Действительно, авторы рассуждали от противного, не имея прямых доказательств специфичности взаимодействия конститутивного гетерохроматина и ламина В1. В-третьих, конститутивный гетерохроматин ограничен в своих возможностях мигрировать, он заякорен, тогда как эухроматин более свободен с пространстве ядра. Поэтому накопление богатого генами хроматина и ламина А в почке может быть связано не со специфичностью их взаимодействия, а со схожестью их способности к свободному перемещению в пространстве ядра. Обнаруженное нами свободное от хроматина встраивание ламина А в ядерную почку согласуется с независимым накоплением ламина А и богатого генами эухроматина в ядерной почке.

Очевидно, модель ядерных почек позволяет не только изучать поведение ламинов в контексте свободной ядерной оболочки при сохранении нормальной экспрессии всех типов ламинов, но и поведение хроматина с точки зрения контролируемого образования большого свободного пространства внутри ядра. Важнейшим свойством разработанной модели является возможность точно регулировать время образования ядерной почки и прослеживать ее во времени. Данная модель является перспективным методом для исследования базовых принципов строения и регуляции хроматина и ядерной оболочки.

Вызывает удивление выявленная способность хроматина устанавливать контакт с ядерной оболочкой при полном отсутствии ламины. В ядерной почке хроматин начинает локально взаимодействовать с ядерной оболочкой раньше, чем ламин А/С выстилает ее поверхность. Возникает вопрос о роли ламины в поддержании трехмерной организации генома и регуляции его активности. Корреляция между уровнем экспрессии генов, степенью их компактизации и положением внутри ядра позволяет сделать вывод о важной роли периферии ядра как эпигенетического фактора (Akhtar and Gasser, 2007; Dechat et al., 2009). В связи с опровергнутой

ролью ядерного матрнкса как жесткой скелетной структуры в пространстве ядра (Razin et al., 2014), ядерная оболочка становится важнейшей точкой отсчета в пространственной организации ДНК. Ламина в этой гипотезе рассматривается как важнейший фактор поддержания репрессивного микроокружения на периферии ядра (Wilson and Berk, 2010). Однако, существуют работы, в которых показано перемещение гена на периферию ядра без подавления его экспрессии (Kumaran and Spector, 2008). Кроме того, недавно было показано, что сайленсинг ламина В1 в стволовых клетках, где снижена/отсутствует экспрессия ламина А, не вызывает нарушения ЬАБов (Amendola and van Steensel, 2015). Таким образом, роль ламины как основополагающего фактора организации периферического гетерохроматина ставится под сомнение. Наши данные, свидетельствующие о формировании контактов хроматина с ядерной оболочкой в ядерной почке, также подтверждают возможность поддержания репрессивного микроокружения в отсутствие ламины. Более того, наши результаты показывают зависимость встраивания ламина В1 от репликации хроматина. Исходя из литературных данных и наших наблюдений, можно предположить роль периферического гетерохроматина в образовании и поддержании ламины. Вероятно, влияние заякоренного хроматина и ламины взаимно, намного более сложно, чем предполагалось ранее, и требует дальнейшего изучения.

Вывод об участии хроматина в регуляции встраивания ламина В1 в ламину проливает свет лишь на конечный этап цепочки превращений ламинов в клетке. Однако, в этом вопросе остается еще очень много нерешенных проблем. Из биохимических и генетических тестов известно, что ламины А и В претерпевают посттрансляционные модификации по С-концевому участку, где содержится СААХ-мотив. Преламин А, для которого характерны одновременно карбоксиметилирование и фарнезилирование, имеет повышенное сродство к мембранам. Возможно, наличие этих двух групп позволяет преламину А встраиваться с ядерную оболочку. Действительно, мутантный ламин А, не способный к фарнезилированию, накапливается в нуклеолпазме в виде агрегатов (Capell et al., 2008; Lutz et al., 1992). К наспособности ламина А встраиваться в состав ядерной оболочки приводит блокирование фарнезилирования (Holtz et al., 1989; Lutz et al., 1992; Sasseville and Raymond, 1995). С другой стороны, прогерин, т.е. мутантный ламин А, сохраняющий фарнезильную и карбоксиметильную группы, приобретает повышенное сродство к ядерной оболочке, демонстрируя значительное снижение скорости обмена молекул в ламине (Dahl et al., 2006). Однако, зрелый ламин А, не имея ни фарнезильного хвоста, ни карбоксиметильной группы после митоза встраивается с ядерную оболочку, образуя нормальную ламиновую сеть (Gerace et al., 1984; Lutz et al., 1992). Функциональная значимость процессинга преламина А, на последнем этапе созревания которого фарнезильная и карбоксиметильная группы удаляются, не известна. Существует предположение, что карбоксиметилирование и фарнезилирование служат этапами регуляции

встраивания ламина А в ядерную оболочку. Также нельзя исключить роль преламина А как самостоятельной молекулы, а не этапа созревания ламина А, тем более, что найден специфический партнер преламина А Narf с неизвестной функцией (Barton and Worman, 1999).

Наши данные свидетельствуют о том, что ламин А не накапливается значительно в неполимеризованном состоянии, по-видимому, ни в одной из стадий клеточного цикла. Следовательно, регуляция этапов созревания ламина А не подразумевает накопления преламина. Наши данные хорошо согласуются с наблюдениями Gerace (Gerace et al., 1984), где показано, что на протяжении всей интерфазы за исключением самого последнего этапа, перехода из G2 в митоз, время полужизни преламина А одинаково. Кроме того, количественный анализ белка (www.peptracker.com) и мРНК (www.cyclebase.org) ламина А в клетке показывает, что их количество поддерживается постоянным на протяжении всей интерфазы. По-видимому, равномерное, не привязанные к стадии клеточного цикла встраивание ламина А, так же как и возможные функции незрелых форм ламина А не требуют накопления преламинаА/ламина А в неполимеризованном состоянии в клетке. Кроме того, если принять о внимание то, что зрелый ламин А после митоза образует ядерную оболочку заново и в интерфазе в нуклеоплазме присутствует пул растворимого ламина А, можно предположить, что существует система регуляции встраивания уже зрелого ламина А, не связанная с экспрессией, созреванием и накоплением преламина А или ламина А в растворимой фракции клеток.

В отличие от ламина А, ламин В сохраняет свой фарнезильный хвост в зрелом состоянии. По-видимому, это свойство помогает ламину В прочно связываться с ядерной оболочкой. Действительно, даже в митозе, когда в результате фосфорилирования ламиновой сети происходит ее разборка, ламин В сохраняет связь с ядерными мембранами (Ellenberg et al., 1997; Gerace and Blobel, 1980). Отсутствие столь сложного, как у ламина А каскада превращений оставляет меньше возможностей для регулирования поведения ламина В1 в клетке. В результате наших экспериментов было показано, что ламин В1 существует в двух формах: полимеризованной, т.е. в составе ламины, и неполимеризованной. Мы установили, что ламин В1 способен незначительно накапливается в растворимой фракции клеток. Фракция неполимеризованных ламинов, по-видимому, представляет собой «наивные» молекулы ламина В1, еще не встроенные в ядерную оболочку. Исходя из наших наблюдений о связи способности ламина В встраиваться в ядерную оболочку с наличием готового к взаимодействию периферического гетерохроматина, его накопление в растворенном состоянии ожидаемо. Мы предполагаем, что это может быть связано с регуляцией количества ламина В1 не на уровне экспрессии, а за счет других механизмов. То, что мы наблюдаем наличие ламина В1 в растворимой фракции и в G1, и в S, и, вероятно, в G2 фазе, говорит о том, что регуляции

встраивания ламина В1 зависит не только от удвоения хроматина, присутствуют и иные факторы. На сегодняшний день не существует единой точки зрения на уровень экспрессии ламина В1 клеточном цикле. Существуют данные о равномерном синтезе на протяжении всей интерфазы (Gerace et al., 1984), однако некоторые работы показывают сниженный уровень синтеза ламина В1 (Ottaviano and Gerace, 1985), либо даже его отсутствие (Foisy and Bibor-Hardy, 1988) в G1 фазе. Противоречивые данные об уровне экспрессии ламина В1 в клеточном цикле, а также необходимость раздельного анализа вклада митотических клеток и 02-клеток свидетельствуют о потребности в новых методических подходах и дальнейшем исследовании этого вопроса.

Подводя итог, можно сделать вывод о сложном механизме роста ядра в интерфазе. Мы показали, что рост сетей ламинов А и В происходит по разным механизмам (рис. 39), их совместная, тонко сбалансированная работа обеспечивает равномерный рост всего ядра и поддержание микродоменной организации ламины в течение всей интерфазы несмотря на значительно меняющуюся функциональную нагрузку. Важным участником регуляции роста ламиновой сети является непосредственный партнер ядерной оболочки - хроматин. Защитная функция ламины, ее прочность и устойчивость к различного рода химическим воздействиям сочетается с высокой пластичностью.

Ламин А ЛАД

Ламин В1 новосинтезированные ЛАД

Рисунок 39. Механизмы регуляции встраивания ламинов А и В типов в ламину. Ламины А типа встраиваются в ламину в течение всей интерфазы, ламины В типа встраиваются в ламину при наличии контактирующих с ядерной оболочкой новосинтезированных доменов хроматинов, т.е. преимущественно в Б-фазе.

112

6 Заключение

Ламина, являясь сложно устроенной, многокомпонентной структурой, выполняет разнообразные функции: во-первых, защитную функцию, особенно востребованную у клеток с большим геномом, и во-вторых, регуляторную функцию, проявляющуюся при дифференцировке клеток. Механизмы, позволяющие ламине сочетать механическую прочность и активное участие в регуляции геномной активности до сих пор были не выяснены. Помимо регуляции активности генов и обеспечении защиты хроматина ламина удваивает свою площадь в ходе интерфазы для поддержания постоянства размеров ядра в ряду клеточных поколений.

В настоящей работе была впервые изучен механизм роста ламины в интерфазе. Было выяснено, что рост ламины происходит непрерывно на протяжении всей интерфазы. В процессе роста ламины ее основные структурные компоненты - сети ламинов А и В типов - не претерпевают значительных изменений строения и степени полимеризации. Таким образом, несмотря на разнообразие выполняемых функций в клеточном цикле, микроархитектура ламины поддерживается неизменной.

Тщательное изучение структуры ламиновых сетей методами микроскопии с суперразрешением и иммуноэлектронной микроскопии показало, что микродомены образованы не одним уникальным типом ламинов, а комбинацией нескольких типов ламинов в разных соотношениях. Таким образом традиционное представление о микродоменной структуре ламиновых сетей, наблюдаемой во флуоресцентный микроскоп, требует аккуратной интерпретации с учетом ограничений метода. Представление о ламине как о комбинации ламинов разного типа с различной локальной концентрацией позволяет предположить возможность локальных изменений ее характеристик (степени полимеризации, пластичности, плотности) без утери базовых свойств ламины как целого.

Отдельное исследование структуры ламины в контексте удвоения прикрепленного к ней периферического гетерохроматина показало, что функционирование репликативных комплексов не требует ни открепления хроматиновых доменов от ядерной оболочки, ни локальной деполимеризации ламины в непосредственной близости от фокуса репликации. При этом в модельной системе перемещение прикрепленного к ядерной оболочке локуса к центру сопровождается значительным изменением конфигурации ламины, что свидетельствует о ее высокой пластичности. Эти данные демонстрируют новые особенности функционирования ламины, противоречащие традиционному представлению о ламине как о чрезвычайно стабильной, жесткой структуре. Прочная связь ламины и хроматина сочетается со способностью быстро образовывать и нарушать контакты между хроматином и ядерной

оболочкой, а также не препятствует быстрым обменным процессам и перестройкам ламины, необходимым для обеспечения пластичности.

В ходе моделирования роста ламины на свободной ядерной оболочке и измерения скорости обмена ламинов А и В типов было выяснено, что встраивание ламина В1 регулируется наличием контактов специфической фракции хроматина с ядерной оболочкой и происходит преимущественно в Б-фазе, тогда как ламин А встраивается в ядерную оболочку независимо от хроматина. По-видимому, встраивание ламина В1 «лицензируется» только после образования ламина-ассоциированных доменов, способных к контактц с ламиной. В таком случае не только ламина как эпигенетический фактор регулирует поведение хроматина, но и хроматин напрямую влияет на строение ламины. Сложный механизм регуляции встраивания ламина В1 в ламину подтверждается не только его активным обменом в Б-фазе, но и накоплением ламина В1 в растворимой фракции клетки.

Таким образом, по результатам проделанной работы был предложен механизм роста ламины в интерфазе, где ламин В и хроматин находятся в тесной взаимосвязи, тогда как поведение ламина А не столь жестко связано с функционированием хроматина. Полученные данные интересны с эволюционной точки зрения: для ламина В1, в первую очередь обеспечивающего механическую прочность ядра, эволюционно более древнего, логично ожидать тесную связь с хроматином, тогда как ламин А, появляющийся и в филогенезе и в онтогенезе позже, с усложнением генома, действительно должен демонстрировать большую независимость от хроматина для выполнения регуляторных функций, что мы и показали в нашей работе.

Полученные результаты позволяют предположить дальнейшие перспективы разработки данной тематики. Выявленная микродоменная архитектура ламины и различные механизмы роста микродоменов в клеточном цикле заставляют обратить более пристальное внимание на их структуру. Доступные на данный момент технологии не позволяют обеспечить необходимого разрешения, что требует разработки новых подходов для перехода на нанометровый уровень. Для применения этой методики необходимо разработать методы прямого мечения интересующих белков устойчивыми флуорохромами. Одним из возможным подходов может служить применение экспрессируемых в исследуемых клетках наноантител. Данный способ мечения может обеспечить прижизненное наблюдение за структурой ламинов с применением современных методов локализационной световой микроскопии с точностью локализации до 3-4 нм.

Разработка новых методов мечения и адаптация существующих технологий локализационной микроскопии для изучения структуры ламины позволит прогнозировать поведение клеточной оболочки в различных функциональных состояниях клетки. В частности,

изучение ламины может предоставить информацию о способах глобального переключения активности генов. Таким образом, поиск способов направленного воздействия на ламину раскроет новые возможности для разработки терапевтических подходов в лечении ламинопатий, в противоопухолевой терапии и репрограммировании клеток.

1. Рост ядерной оболочки происходит равномерно на протяжении интерфазы.

2. Структурной единицей ламины являются микродомены, состоящие из ламинов А и В в различных соотношениях.

3. Рост ядерной оболочки и функционирование прикрепленного к ядерной оболочке хроматина не вызывает изменения микроархитектуры ламины. Микродоменная организация ламины и степень ее полимеризации поддерживаются неизменными на протяжении интерфазы.

4. Встраивание ламина А в состав ламиновой сети происходит независимо от стадии интерфазы и независимо от контактов хроматина с ядерной оболочкой.

5. Встраивание ламина В1 в состав ламиновой сети зависит от стадии клеточного цикла, а именно от удвоения хроматина, поэтому преимущественно происходит в Б-фазе.

6. Репликация периферического гетерохроматина не требует открепления хроматина от ядерной оболочки, и не вызывает локальных изменений степени полимеризации ламины в непосредственной близости от фокуса репликации прикрепленного к ядерной оболочки хроматина.

7. Ламина обладает высокой пластичностью и способна значительно менять свою конфигурацию вслед за перемещением хроматинового домена, ассоциированного с ядерной оболочкой.

8 Список сокращений

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛАД ламина-ассоциированный домен

РНК рибонуклеиновая кислота

ТЭМ трансмисионная электронная микроскопия

ЯО Ядерная оболочка

BAF barrier autointegration factor

BioID proximity-dependent biotin identification

BrU bromouridine

BSA bovine serum albumin

DABCO 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane

DamID DNA adenine methyltransferase identification

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

EdU 5-ethynyl-2'-deoxyuridine

FRAP fluorescence recovery after photobleaching

GFP green fluorescent protein

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

HP1 Heterochromatin Protein 1

LAP lamina-associated polypeptide

LBR lamin B receptor

LEM LAP2, emerin, MAN1 domain

MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid

NA numerical aperture

PBS Phosphate-buffered saline

PCNA proliferating cell nuclear antigen

PSF point spread function

RFP red Fluorescent Protein

SB sodium boric acid-based conductive medium

SBA sodium boric acid

SIM structured illumination microscopy

ТBST Tris-Buffered Saline and Tween 20 TEMED tetramethylethylenediamine

9 Список цитируемой литературы

Киреев, И.И., Зацепина, О.В., Поляков, В.Ю., и Ченцов, Ю.С. (1988). Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ при их обратимой искусственной деконденсации in vivo. Цитология 30, 926.

Онищенко, Г.Е., и Ченцов, Ю.С. (1974). Гранулярный слой периферического хроматина. Цитология 16, 931.

Aaronson, R.P., and Blobel, G. (1975). Isolation of nuclear pore complexes in association with a lamina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1007-1011.

Aebi, U., Cohn, J., Buhle, L., and Gerace, L. (1986). The nuclear lamina is a meshwork of intermediate-type filaments. Nature 323, 560-564.

Akhtar, A., and Gasser, S.M. (2007). The nuclear envelope and transcriptional control. Nat. Rev. Genet. 8, 507-517.

Amendola, M., and van Steensel, B. (2015). Nuclear lamins are not required for lamina-associated domain organization in mouse embryonic stem cells. EMBO Rep. 16, 610-617.

Andrulis, E.D., Neiman, A.M., Zappulla, D.C., and Sternglanz, R. (1998). Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing. Nature 394, 592-595.

Apel, E.D., Lewis, R.M., Grady, R.M., and Sanes, J.R. (2000). Syne-1, a dystrophin- and Klarsicht-related protein associated with synaptic nuclei at the neuromuscular junction. J. Biol. Chem. 275, 31986-31995.

Baricheva, E.A., Berrios, M., Bogachev, S.S., Borisevich, I. V, Lapik, E.R., Sharakhov, I. V, Stuurman, N., and Fisher, P.A. (1996). DNA from Drosophila melanogaster beta-heterochromatin binds specifically to nuclear lamins in vitro and the nuclear envelope in situ. Gene 171, 171-176.

Barrowman, J., Hamblet, C., George, C.M., and Michaelis, S. (2008). Analysis of Prelamin A Biogenesis Reveals the Nucleus to be a CaaX Processing Compartment Jemima. Mol. Biol. Cell 19, 5398-5408.

Barton, R.M., and Worman, H.J. (1999). Prenylated prelamin A interacts with Narf, a novel nuclear protein. J. Biol. Chem. 274, 30008-30018.

Belmont, A.S., Zhai, Y., and Thilenius, A. (1993). Lamin B distribution and association with peripheral chromatin revealed by optical sectioning and electron microscopy tomography. J. Cell Biol. 123, 1671-1685.

Benavente, R., Krohne, G., and Franke, W.W. (1985). Cell type-specific expression of nuclear lamina proteins during development of Xenopus laevis. Cell 41, 177-190.

Bian, Q., Khanna, N., Alvikas, J., and Belmont, A.S. (2013). _-Globin cis-elements determine differential nuclear targeting through epigenetic modifications. J. Cell Biol. 203, 767-783.

Bione, S., Maestrini, E., Rivella, S., Mancini, M., Regis, S., Romeo, G., and Toniolo, D. (1994). Identification of a novel X-linked gene responsible for Emery-Dreifuss muscular dystrophy. Nat. Genet. 8, 323-327.

Black, S.D. (1992). Development of hydrophobicity parameters for prenylated proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 1437-1442.

Brehm, A., Miska, E.A., McCance, D.J., Reid, J.L., Bannister, A.J., and Kouzarides, T. (1998). Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature 391, 597-601.

Bridger, J.M., Kill, I.R., O'Farrell, M., and Hutchison, C.J. (1993). Internal lamin structures within G1 nuclei of human dermal fibroblasts. J. Cell Sci. 104 (Pt 2, 297-306.

Broers, J.L., Machiels, B.M., van Eys, G.J., Kuijpers, H.J., Manders, E.M., van Driel, R., and Ramaekers, F.C. (1999). Dynamics of the nuclear lamina as monitored by GFP-tagged A-type lamins. J. Cell Sci. 112, 3463-3475.

Broers, J.L. V, Peeters, E. a G., Kuijpers, H.J.H., Endert, J., Bouten, C.V.C., Oomens, C.W.J., Baaijens, F.P.T., and Ramaekers, F.C.S. (2004). Decreased mechanical stiffness in LMNA-/- cells is caused by defective nucleo-cytoskeletal integrity: implications for the development of laminopathies. Hum. Mol. Genet. 13, 2567-2580.

Burke, B., and Gerace, L. (1986). A cell free system to study reassembly of the nuclear envelope at the end of mitosis. Cell 44, 639-652.

Burke, B., and Stewart, C.L. (2012). The nuclear lamins: flexibility in function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 29-31.

Capell, B.C., Olive, M., Erdos, M.R., Cao, K., Faddah, D. a, Tavarez, U.L., Conneely, K.N., Qu, X., San, H., Ganesh, S.K., et al. (2008). A farnesyltransferase inhibitor prevents both the onset and late progression of cardiovascular disease in a progeria mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15902-15907.

Chen, I.-H.B., Huber, M., Guan, T., Bubeck, A., and Gerace, L. (2006). Nuclear envelope transmembrane proteins (NETs) that are up-regulated during myogenesis. BMC Cell Biol. 7, 38.

Cherepaninets, V.D., Zhironkina, O. a, Strelkova, O.S., and Kireev, I.I. (2015). Cohesion Peculiarities in Eu and Heterochromatin in Human Cells. Cell Tissue Biol. 9, 173-181.

Cimbora, D.M., and Groudine, M. (2001). The control of mammalian DNA replication: a brief history of space and timing. Cell 104, 643-646.

Coffinier, C., Jung, H.-J., Nobumori, C., Chang, S., Tu, Y., Barnes, R.H., Yoshinaga, Y., de Jong, P.J., Vergnes, L., Reue, K., et al. (2011). Deficiencies in lamin B1 and lamin B2 cause neurodevelopmental defects and distinct nuclear shape abnormalities in neurons. Mol. Biol. Cell 22, 4683-4693.

Constantinescu, D., Gray, H.L., Sammak, P.J., Schatten, G.P., and Csoka, A.B. (2006). Lamin A/C expression is a marker of mouse and human embryonic stem cell differentiation. Stem Cells 24, 177185.

Cook, P.R., and Brazell, I.A. (1980). Mapping sequences in loops of nuclear DNA by their progressive detachment from the nuclear cage. Nucleic Acids Res. 8, 2895-2906.

Corrigan, D.P., Kuszczak, D., Rusinol, A.E., Thewke, D.P., Hrycyna, C.A., Michaelis, S., and Sinensky, M.S. (2005). Prelamin A endoproteolytic processing in vitro by recombinant Zmpste24. Biochem. J. 387, 129-138.

Coutinho, H.D.M., Falcäo-Silva, V.S., Gon9alves, G.F., and da Nobrega, R.B. (2009). Molecular ageing in progeroid syndromes: Hutchinson-Gilford progeria syndrome as a model. Immun. Ageing 6,

Crisp, M., Liu, Q., Roux, K., Rattner, J.B., Shanahan, C., Burke, B., Stahl, P.D., and Hodzic, D. (2006). Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. J. Cell Biol. 172, 41-53.

Dahl, K.N., Scaffidi, P., Islam, M.F., Yodh, A.G., Wilson, K.L., and Misteli, T. (2006). Distinct structural and mechanical properties of the nuclear lamina in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10271-10276.

Daigle, N., Beaudouin, J., Hartnell, L., Imreh, G., Hallberg, E., Lippincott-Schwartz, J., and Ellenberg, J. (2001). Nuclear pore complexes form immobile networks and have a very low turnover in live mammalian cells. J. Cell Biol. 154, 71-84.

Dechat, T., Korbei, B., Vaughan, O. a, Vlcek, S., Hutchison, C.J., and Foisner, R. (2000). Lamina-associated polypeptide 2alpha binds intranuclear A-type lamins. J. Cell Sci. 113 Pt 19, 3473-3484.

Dechat, T., Adam, S.A., and Goldman, R.D. (2009). Nuclear lamins and chromatin: when structure meets function. Adv. Enzyme Regul. 49, 157-166.

Dechat, T., Adam, S. a, Taimen, P., Shimi, T., and Goldman, R.D. (2010). Nuclear lamins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000547.

Delbarre, E., Tramier, M., Coppey-Moisan, M., Gaillard, C., Courvalin, J.-C., and Buendia, B. (2006). The truncated prelamin A in Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters segregation of A-type and B-type lamin homopolymers. Hum. Mol. Genet. 15, 1113-1122.

Dimitrova, D.S. (2002). The spatio-temporal organization of DNA replication sites is identical in primary, immortalized and transformed mammalian cells. J. Cell Sci. 115, 4037-4051.

Dimitrova, D.S., and Gilbert, D.M. (1999). The Spatial Position and Replication Timing of Chromosomal Domains Are Both Established in Early G1 Phase. Mol. Cell 4, 983-993.

Dorner, D., Vlcek, S., Foeger, N., Gajewski, A., Makolm, C., Gotzmann, J., Hutchison, C.J., and Foisner, R. (2006). Lamina-associated polypeptide 2alpha regulates cell cycle progression and differentiation via the retinoblastoma-E2F pathway. J. Cell Biol. 173, 83-93.

Dunaief, J.L., Strober, B.E., Guha, S., Khavari, P.A., Alin, K., Luban, J., Begemann, M., Crabtree, G.R., and Goff, S.P. (1994). The retinoblastoma protein and BRG1 form a complex and cooperate to induce cell cycle arrest. Cell 79, 119-130.

Ellenberg, J., Siggia, E.D., Moreira, J.E., Smith, C.L., Presley, J.F., Worman, H.J., and Lippincott-Schwartz, J. (1997). Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J. Cell Biol. 138, 1193-1206.

Ellis, D.J., Jenkins, H., Whitfield, W.G., and Hutchison, C.J. (1997). GST-lamin fusion proteins act as dominant negative mutants in Xenopus egg extract and reveal the function of the lamina in DNA replication. J. Cell Sci. 110 (Pt 2, 2507-2518.

Espada, J., Varela, I., Flores, I., Ugalde, A.P., Cadinanos, J., Pendas, A.M., Stewart, C.L., Tryggvason, K., Blasco, M. a, Freije, J.M.P., et al. (2008). Nuclear envelope defects cause stem cell dysfunction in premature-aging mice. J. Cell Biol. 181, 27-35.

Fawcett, D.W. (1966). On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. Am. J. Anat. 119, 129-145.

Finlan, L.E., Sproul, D., Thomson, I., Boyle, S., Kerr, E., Perry, P., Ylstra, B., Chubb, J.R., and Bickmore, W. a (2008). Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genet. 4, e1000039.

Foisner, R. (1997). Dynamic organisation of intermediate filaments and assotiated proteins during the cell cycle. 19.

Foisner, R., and Gerace, L. (1993). Integral membrane proteins of the nuclear envelope interact with lamins and chromosomes, and binding is modulated by mitotic phosphorylation. Cell 73, 1267-1279.

Foisy, S., and Bibor-Hardy, V. (1988). Synthesis of nuclear lamins in BHK-21 cells synchronized with aphidicolin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 205-210.

Fuchs, E., and Weber, K. (1994). Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease. Annu. Rev. Biochem. 63, 345-382.

Gerace, L., and Blobel, G. (1980). The nuclear envelope lamina is reversibly depolymerized during mitosis.

Gerace, L., and Burke, B. (1988). Functional organization of the nuclear envelope. Annu. Rev. Cell Biol. 4, 335-374.

Gerace, L., Blum, A., and Blobel, G. (1978). Immunocytochemical localization of the major polypeptides of the nuclear pore complex-lamina fraction. Interphase and mitotic distribution. J. Cell Biol. 79, 546-566.

Gerace, L., Comeau, C., and Benson, M. (1984). Organization and modulation of nuclear lamina structure. J. Cell Sci. 1, 137-160.

Gilbert, D.M., Takebayashi, S.-I., Ryba, T., Lu, J., Pope, B.D., Wilson, K. a, and Hiratani, I. (2010). Space and time in the nucleus: developmental control of replication timing and chromosome architecture. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 75, 143-153.

Goldberg, M., Jenkins, H., Allen, T., Whitfield, W.G., and Hutchison, C.J. (1995). Xenopus lamin B3 has a direct role in the assembly of a replication competent nucleus: evidence from cell-free egg extracts. J. Cell Sci. 108 (Pt 1, 3451-3461.

Goldberg, M., Harel, A., Brandeis, M., Rechsteiner, T., Richmond, T.J., Weiss, A.M., and Gruenbaum, Y. (1999). The tail domain of lamin Dm0 binds histones H2A and H2B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 2852-2857.

Goldman, A.E., Maul, G., Steinert, P.M., Yang, H.Y., and Goldman, R.D. (1986). Keratin-like proteins that coisolate with intermediate filaments of BHK-21 cells are nuclear lamins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, 3839-3843.

Goldman, A.E., Moir, R.D., Montag-Lowy, M., Stewart, M., and Goldman, R.D. (1992). Pathway of incorporation of microinjected lamin A into the nuclear envelope. J. Cell Biol. 119, 725-735.

Green, M.R., and Sambrook, J. (2012). Molecular cloning : a laboratory manual (New York).

Guelen, L., Pagie, L., Brasset, E., Meuleman, W., Faza, M.B., Talhout, W., Eussen, B.H., de Klein, A., Wessels, L., de Laat, W., et al. (2008). Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature 453, 948-951.

Haque, F., Lloyd, D.J., Smallwood, D.T., Dent, C.L., Shanahan, C.M., Fry, A.M., Trembath, R.C., and Shackleton, S. (2006). SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Mol. Cell. Biol. 26, 3738-3751.

Harborth, J., Elbashir, S.M., Bechert, K., Tuschl, T., and Weber, K. (2001). Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. J. Cell Sci. 114, 4557-4565.

Hasan, S., Güttinger, S., Mühlhäusser, P., Anderegg, F., Bürgler, S., and Kutay, U. (2006). Nuclear envelope localization of human UNC84A does not require nuclear lamins. FEBS Lett. 580, 12631268.

Heald, R., and McKeon, F. (1990). Mutations of phosphorylation sites in lamin A that prevent nuclear lamina disassebly in mitosis. Cell 61, 579-589.

Hennekes, H., and Nigg, E.A. (1994). The role of isoprenylation in membrane attachment of nuclear lamins. A single point mutation prevents proteolytic cleavage of the lamin A precursor and confers membrane binding properties. J. Cell Sci. 107 (Pt 4, 1019-1029.

Hernandez, L., Roux, K.J., Wong, E.S.M., Mounkes, L.C., Mutalif, R., Navasankari, R., Rai, B., Cool, S., Jeong, J.-W., Wang, H., et al. (2010). Functional coupling between the extracellular matrix and nuclear lamina by Wnt signaling in progeria. Dev. Cell 19, 413-425.

Hodzic, D.M., Yeater, D.B., Bengtsson, L., Otto, H., and Stahl, P.D. (2004). Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. J. Biol. Chem. 279, 25805-25812.

Höger, T.H., Krohne, G., and Kleinschmidt, J.A. (1991). Interaction of Xenopus lamins A and LII with chromatin in vitro mediated by a sequence element in the carboxyterminal domain. Exp. Cell Res. 197, 280-289.

Holtz, D., Tanaka, R.A., Hartwig, J., and McKeon, F. (1989). The CaaX motif of lamin A functions in conjunction with the nuclear localization signal to target assembly to the nuclear envelope. Cell 59, 969-977.

Hozak, P., Sasseville, a M., Raymond, Y., and Cook, P.R. (1995). Lamin proteins form an internal nucleoskeleton as well as a peripheral lamina in human cells. J. Cell Sci. 108 (Pt 2, 635-644.

Infante, A.A., Firshein, W., Hobart, P., and Murray, L. (1976). A nuclear membrane-associated DNA complex in cultured mammalian cells capable of synthesizing DNA in vitro. Biochemistry 15, 48104817.

Jaspersen, S.L., Martin, A.E., Glazko, G., Giddings, T.H., Morgan, G., Mushegian, A., and Winey, M. (2006). The Sad1-UNC-84 homology domain in Mps3 interacts with Mps2 to connect the spindle pole body with the nuclear envelope. J. Cell Biol. 174, 665-675.

Jenkins, H., Hölman, T., Lyon, C., Lane, B., Stick, R., and Hutchison, C. (1993). Nuclei that lack a lamina accumulate karyophilic proteins and assemble a nuclear matrix. J. Cell Sci. 106 (Pt 1, 275285.

Jung, H.-J., Coffinier, C., Choe, Y., Beigneux, A.P., Davies, B.S.J., Yang, S.H., Barnes, R.H., Hong, J., Sun, T., Pleasure, S.J., et al. (2012). Regulation of prelamin A but not lamin C by miR-9, a brain-specific microRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, E423-E431.

Kaufmann, A., Heinemann, F., Radmacher, M., and Stick, R. (2011). Amphibian oocyte nuclei expressing lamin A with the progeria mutation E145K exhibit an increased elastic modulus. Nucleus 2, 310-319.

Kim, Y., Sharov, A.A., McDole, K., Cheng, M., Hao, H., Fan, C.-M., Gaiano, N., Ko, M.S.H., and Zheng, Y. (2011). Mouse B-type lamins are required for proper organogenesis but not by embryonic stem cells. Science 334, 1706-1710.

Kind, J., Pagie, L., Ortabozkoyun, H., Boyle, S., de Vries, S.S., Janssen, H., Amendola, M., Nolen, L.D., Bickmore, W. a, and van Steensel, B. (2013). Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell 153, 178-192.

Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V.N., Powell, R., and Belmont, A.S. (2008). In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nat. Methods 5, 311-313.

Kolb, T., Maaß, K., Hergt, M., Aebi, U., and Herrmann, H. (2011). Lamin A and lamin C form homodimers and coexist in higher complex forms both in the nucleoplasmic fraction and in the lamina of cultured human cells. Nucleus 2, 425-433.

Korfali, N., Wilkie, G.S., Swanson, S.K., Srsen, V., Batrakou, D.G., Fairley, E.A.L., Malik, P., Zuleger, N., Goncharevich, A., de Las Heras, J., et al. (2010). The leukocyte nuclear envelope proteome varies with cell activation and contains novel transmembrane proteins that affect genome architecture. Mol. Cell. Proteomics 9, 2571-2585.

Kracklauer, M.P., Banks, S.M.L., Xie, X., Wu, Y., and Fischer, J. a (2007). Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly (Austin). 1, 75-85.

Kumaran, R.I., and Spector, D.L. (2008). A genetic locus targeted to the nuclear periphery in living cells maintains its transcriptional competence. J. Cell Biol. 180, 51-65.

De la Luna, S., Allen, K.E., Mason, S.L., and La Thangue, N.B. (1999). Integration of a growth-suppressing BTB/POZ domain protein with the DP component of the E2F transcription factor. EMBO J. 18, 212-228.

Lawlis, S.J., Keezer, S.M., Wu, J.R., and Gilbert, D.M. (1996). Chromosome architecture can dictate site-specific initiation of DNA replication in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 135, 1207-1218.