Роль белка PCID2 в транспорте мРНК у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Глухова Анна Анатольевна

• Глухова Анна Анатольевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Глухова Анна Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Цели и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость исследования

Личное участие автора в исследовании

Методология и методы исследования

Степень достоверности и апробация результатов

Структура и объем работы

Положения, выносимые на защиту

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экспорт мРНК из ядра

1.1.1. РНП-частицы - функциональные единицы экспорта мРНК

1.1.2. Рецепторы экспорта мРНК из ядра

1.1.3. Комплекс ТНО / TREX

1.1.4. Sac3-Thp1-Sus1-Cdc31 комплекс

1.1.5. РСГО2

1.1.6. Транспорт через КРС

1.1.7. Ремоделинг РНП-частицы в цитоплазме

1.1.8. Регуляция экспорта мРНК

1.2. Биогенез мРНК в цитоплазме

1.2.1 Транспорт мРНК в цитоплазме

1.2.1 .1. Кинезин-зависимый транспорт РНК

1.2.1 .2. Динеин-зависимый транспорт РНК

1.2.1 .3. Миозин-зависимый транспорт РНК

1.2.1 .4. Координация

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1 Штаммы и вектора Е. coli,, клеточные линии и среды, использованные в

работе

2.1.2. Праймеры

2.1.3. Конструкции для экспрессии рекомбинантных белков и полипептидов

2.1.4. Антитела

2.2. Методы

2.2.1. Эмбриональный цитоплазматический экстракт

2.2.2. Хроматографическая очистка

2.2.3. Работа с эукариотическими клетками

2.2.3.1. Трансфекция Б2 клеток

2.2.3.2. Приготовление лизата из Б2 клеток

2.2.3.3. Разделение ядерной, мембранной и цитоплазматической фракций

2.2.4. Работа с ДНК

2.2.4.1. Трансформация бактерий

2.2.4.2. Выделение плазмидной ДНК

2.2.4.3. Обработка ДНК рестриктазами

2.2.4.4. Лигирование

2.2.4.5. Гель-электрофорез ДНК

2.2.4.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.4.7. Количественная ПЦР

2.2.5. Работа с белками

2.2.5.1. Экспрессия рекомбинантных белков

2.2.5.2. Приготовление бактериальных клеточных лизатов, содержащих белки с His эпитопом

2.2.5.3. Очистка рекомбинантных белков при помощи Ni-NTA сефарозы

2.2.5.4. Приготовление бактериальных клеточных лизатов, содержащих белки с GST эпитопом

2.2.5.5. Pull Down assay

2.2.5.6. Получение антител и их очистка

2.2.5.7. Пришивание антител к Protein A-сефарозе при помощи DMP

2.2.5.8. Конкурентное связывание антител с антигеном (сошреййоп)

2.2.5.9. Соосаждение белков антителами (иммунопреципитация, IP)

2.2.5.10. Белковый гель-электрофорез

2.2.5.11. Вестерн-блот анализ

2.2.5.12. Окрашивание серебром белковых гелей

2.2.5.13. Иммуноокрашивание S2 клеток

2.2.6. Работа с РНК

2.2.6.1. Выделение РНК тризолом

2.2.6.2. РНК интерференция

2.2.6.3. РНК иммунопреципитация (RIP)

2.2.6.4. FISH с Cy3-Oligo(dT) 50 праймером

2.2.7. Анализ изображений

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Характеристика PCID2

3.1.1. В S2 клетках Drosophila melanogaster белок PCID2 имеет три изоформы

3.1.2. Белок PCID2 колокализуется с NPC в S2 клетках Drosophila melanogaster

3.1.3. PCID2 присутствует в цитоплазме клеток Drosophila melanogaster в

убиквитинилированной форме

3.2. PCID2 в составе ядерного комплекса TREX-2

3.2.1. ENY2 и Xmas-2 взаимодействуют только с формой PCID2, находящейся

в составе ядерного комплекса

3.3. Комплекс и функциональные взаимодействия PCID2 в цитоплазме

3.3.1. PCID2 состоит в комплексе с белком NudC в цитоплазме клеток Drosophila melanogaster

3.3.1.1. Выделение цитоплазматической фракции (DREX) из эмбрионального экстракта Drosophila melanogaster

3.3.1.2. Иммунопреципитация белкового комплекса, содержащего белок PCID2 из обогащенного эмбрионального цитоплазматического экстракта Drosophila melanogaster

3.3.2. PCID2 и NudC напрямую взаимодействуют друг с другом как в цитоплазме клеток Drosophila melanogaster, так и в системе in vitro, формируя гомо- или гетеродимеры

3.3.2.1. PCID2 и NudC взаимодействуют между собой в лизате S2 клеток Drosophila melanogaster

3.3.2.2. Взаимодействие белков PCID2 и NudC Drosophila melanogaster в системе in vitro

3.3.3. NudC играет роль в стабилизации PCID2 в цитоплазме

3.4. Роль PCID2 в экспорте и транспорте мРНК в ядре и в цитоплазме

3.4.1. PCID2 взаимодействует с мРНК в ядрах и в цитоплазме клеток S2

3.4.2. PCID2 взаимодействует с тубулином и динактином в цитоплазме клеток S2

3.4.3. PCID2 необходим для общего транспорта мРНК в цитоплазме

4. ОБСУЖДЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................9S

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНП - рибонуклеопротеин

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

hnRNP белки - гетерогенные ядерные белки рибонуклеопротеина

NPC - ядерный поровый комплекс (nuclear pore complex)

RBD - РНК связывающий домен (RNA binding domain)

RGG бокс - Arg-Gly-Gly последовательность

RRM - РНК-распознающий мотив (RNA recognition motif)

тРНК - трансферная рибонуклеиновая кислота

SR белки - serine-arginine белки

snRNP белки - small nuclear RNP белки

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

TREX - transcription-export complex

CID домен - CTD (C-terminal domain)-interacting domain

PCI домен - proteasome component domain

DEAD-бокс - мотив asp-glu-ala-asp

EJC - exon junction complex

SAGA - Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase

Nups - нуклеопорины

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

MD - моторный домен (motor domain)

CBD - карго связывающий домен (cargo binding domain)

HC - тяжелая цепь (heavy chain)

LC - легкая цепь (light chain)

KAP - kinesin associated protein

LIC - легкая средняя цепь (light intermediate chain)

IC - средняя цепь (intermediate chain)

АТФ - аденозинтрифосфат

NES - сигнал ядерного экспорта (nuclear export signal) TBP - TATA binding protein

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль белка PCID2 в транспорте мРНК у Drosophila melanogaster»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Все этапы существования и развития живых организмов зависят от процессов реализации наследственной информации. Эти биохимические пути сложны и многочисленны, однако, все базируются на важнейших процессах транскрипции и трансляции. Данные процессы тесно связаны между собой обширной сетью реакций и регуляторных факторов. Одним из крупнейших этапов можно выделить процесс транспорта мРНК. Процессы транскрипции и трансляции мРНК разделены ядерной мембраной. И для достижения места трансляции мРНК должна пройти путь до ядерной мембраны в ядре, транслоцироваться через ядерную пору и транспортироваться от ядерной поры к месту своей локализации в цитоплазме.

С начала своего синтеза в ядре мРНК взаимодействует с различными регуляторными белками и белковыми комплексами, которые влияют на её дальнейшую судьбу [1]. При участии транспортных факторов происходит формирование мРНП-частицы, которая впоследствии транспортируется к ядерной поре и переходит в цитоплазму [2]. После ядерного экспорта мРНП частица подвергается ремоделированию на цитоплазматической стороне ядерной оболочки [3]. Для дальнейшего передвижения мРНП частицы связываются с моторными белками, связанными с микротрубочками, и транспортируются по микротрубочкам к месту своей локализации. Хотя были охарактеризованы различные стадии и компоненты транспорта мРНК [4], многие из них всё ещё остаются неизвестными.

У Drosophila melanogaster одним из главных участников экспорта мРНК является комплекс THSC/TREX-2. Комплекс THSC/TREX-2 высоко консервативен у эукариот [5-9]. Впервые он был обнаружен у дрожжей [5], а позже описан у Drosophila melanogaster (обозначенный как AMEX), человека и растений [10-14]. TREX-2 необходим для общего экспорта мРНК из ядра, а

истощение субъединиц TREX-2 вызывает накопление мРНК в ядре [5,10,14-18]. Белки, входящие в его состав, находясь в комплексе, осуществляют связь транскрипции с экспортом мРНК из ядра [19][20]. Комплекс ТЯЕХ-2, выделенный у Втоъоркйа melanogaster [2], содержал субъединицы Xmas-2, РСГО2 и БКУ2. Было показано, что белки Xmas-2 и ENY2 локализуются в нуклеоплазме и взаимодействуют с ядерными порами; а их нокдаун приводит к блоку экспорта мРНК из ядра [10].

РСГО2 Drosophila melanogaster был впервые идентифицирован при геномном скрининге белков, участвующих в ядерном экспорте мРНК. Было показано, что он перемещается между ядром и цитоплазмой и связан с фракцией полисом [21]. Рентгеноструктурный анализ комплекса ТЯБХ-2 дрожжей показал формирование общей поверхности для взаимодействия с мРНК на базе двух белков Sac3 (dXmas-2) и С-концевой части ^р1 (ёРСГО2) [12,22]. Показано, что РСГО2 необходим для дифференциации и развития В-клеток [23], способствует подавлению развития рака груди, связанного с нарушениями функций ВЯСА2 [24], повышенный уровень экспрессии РСГО2 коррелирует с неблагоприятным прогнозом развития рака почек, головы и шеи.

В данной работе была изучена функция РСГО2 Drosophila melanogaster в ядре и цитоплазме. Данные, полученные в ходе исследований, вносят важный вклад в решение проблем нарушения транспорта мРНК, приводящих к различным отклонениям на более высоких уровнях организации систем тканей и органов.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было изучить роль белка РСГО2 в ядре и цитоплазме у Drosophila melanogaster.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Изучить распределение белка РСГО2 в клетках Drosophila melanogaster.

2) Охарактеризовать белок PCID2 в составе комплекса экспорта мРНК из ядра TREX-2 в клетках Втоъоркйа melanogaster.

3) Показать функцию белка PCID2 в ядре клеток Drosophila melanogaster.

4) Определить партнеров белка PCID2 в цитоплазме клеток Drosophila melanogaster.

5) Показать функции белка PCID2 в цитоплазматическом компартменте клеток Drosophila melanogaster.

Научная новизна

Впервые показано, что PCID2 имеет три изоформы, и каждая из трёх форм белка имеет различную локализацию в клетке.

Показано, что в состав комплекса экспорта мРНК TREX-2 входит неубиквитинированная форма белка PCID2.

Впервые показано, что PCID2 Drosophila melanogaster взаимодействует с мРНК как в ядре, так и в цитоплазме.

Выделен цитоплазматический PCID2-содержащий комплекс. Показано, что PCID2 в цитоплазме ассоциирован с белком NudC, который принимает участие в его стабилизации.

Впервые показано участие PCID2 в общем транспорте мРНК в цитоплазме.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Полученные данные о том, что только одна ядерная изоформа PCID2 входит в состав комплекса TREX-2, привели к ограничению функций TREX-2 и показали, что действие комплекса не распространяется дальше ядерной мембраны. В то же время данные по существованию трёх изоформ PCID2 привели к расширению

наших представлений о функции РСГО2, принимающего участие в транспорте мРНК как в ядре, так и в цитоплазме. Было охарактеризовано взаимодействие белков РСГО2 и К^С, необходимое для существования РСГО2 в цитоплазматическом компартменте. Были также показаны новые аспекты транспорта мРНК в цитоплазме в отношении уже известных участников данного процесса в ядре клеток. На основании полученных данных предложена модель участия РСГО2 в экспорте и транспорте мРНК в ядре и цитоплазме.

Любые нарушения в механизмах транспорта мРНК могут служить причиной нестабильности генома и приводить к различным формам онкологических заболеваний. Кроме того, транспорт мРНК имеет решающее значение для установления полярности и сегментации клеток. Изучение РНК-связывающих белков и белковых комплексов, участвующих в транспорте, имеет исключительное значение для эмбриогенеза, органогенеза, клеточной дифференциации, регуляции клеточного цикла. Поскольку известно, что белок РСГО2 необходим для дифференцировки и развития В-клеток [23], и связан с некоторыми видами рака, полученные в ходе работы данные могут помочь в дальнейшем поиске, исследовании и разработке лекарственных препаратов против онкологических или нейродегенеративных заболеваний.

Личное участие автора в исследовании

Автором был выполнен основной объем экспериментальной работы. Автор принимал непосредственное участие в планировании экспериментов и анализе результатов. Ключевые эксперименты: получение белков при помощи методики клонирования и работы с бактериальной системой экспрессии и очистки, характеристика белков и межбелковых взаимодействий при помощи разделения клеток на фракции, приготовление клеточных лизатов, Вестерн блот анализ, котрансфекции клеток линии S2 генетическими конструкциями, содержащими последовательности интересующих белков с эпитопами и коиммунопреципитации, а также получение антител, очистка

цитоплазматического комплекса, содержащего белок PCID2, серия Pull Down экспериментов, иммуноцитохимическое окрашивание клеток, РНК -интерференции были выполнены автором самостоятельно. Некоторые эксперименты были проведены совместно с коллегами. Выделение эмбрионального цитоплазматического экстракта при помощи нескольких стадий хроматографической очистки осуществлялось совместно с Бречаловым А.В. Иммунопреципитации РНК из ядерного экстракта клеток линии S2, окрашивание клеток Cy3-Oligo(dT) 50 праймером и анализ изображений осуществлялись Копытовой Д.В. Автор внес непосредственный вклад в написание научных публикаций по теме диссертации.

Методология и методы исследования

В работе применялись современные методы молекулярной биологии и биохимии, иммуноцитохимии, микроскопии. Использовались подходы по подавлению экспрессии и оверэкспрессии генов.

В качестве модельного объекта были использованы S2 клетки и эмбрионы Drosophila melanogaster.

Степень достоверности и апробация результатов

По теме проведенного исследования опубликованы 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК. Результаты работы были представлены на 4 международных конференциях.

Публикации в рецензируемых журналах:

1. Попова В.В., Глухова А.А., Георгиева С.Г., Георгиев Г.П., Копытова Д.В. Взаимодействие комплекса TREX-2 с мРНП-частицей гена в-тубулина 56D // Молекулярная биология. - 2016. - Т. 50(6). - С. 1030-1038.

2. Глухова А.А., Набирочкина Е.Н., Копытова Д.В. Транспорт мРНП у эукариот. Экспорт мРНП - частицы из ядра // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2018. - Т. 36(3) - С. 25-29.

3. Глухова А.А., Набирочкина Е.Н., Копытова Д.В. Транспорт мРНП у эукариот. Транспорт мРНП - частицы в цитоплазме // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2019. - Т. 37(1) - С. 3-8.

4. Glukhova, A.A., Kurshakova, M.M., Nabirochkina, E.N., Georgieva, S.G., Kopytova, D.V. PCID2, a subunit of the Drosophila TREX-2 nuclear export complex, is essential for both mRNA nuclear export and its subsequent cytoplasmic trafficking // RNA Biology. - 2021. - С. 1-12.

Конференции:

1. Глухова А.А., Копытова Д.В. Белок PCID2, участвующий в экспорте мРНК, и его комплекс в ядре и в цитоплазме клеток линии Drosophila melanogaster // Международный молодежный научный форум Ломоносов. Москва. Россия. 11/04/2016 - 15/04/2016. - С.10

2. Glukhova A., Kopytova D., New functions of the PCID2 protein in the cytoplasm of the Drosophila melanogaster cells // FEBS OPEN BIO. Prague. Czech Republic. 7/07/2018 - 12/07/2018. - V. 8. - P. 401 - 402.

3. Глухова А.А., Копытова Д.В. Исследование Взаимодействия Белков PCID2 и NudC Drosophila melanogaster in vitro // Международная Конференция Хромосома. Новосибирск. Россия. 20/08/2018 - 24/08/2018. - С. 110.

4. Glukhova A., Kopytova D., Interaction of PCID2 and NUDC Proteins of Drosophila melanogaster in vitro // FEBS OPEN BIO. Krakow. Poland. 06/07/2019 - 11/07/2019. - V. 9. - P. 414 - 415.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав («Обзор литературы»,

«Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение»,) и выводов.

Работа изложена на 112 страницах, содержит 23 рисунка и 3 таблицы. Список

литературы включает 165 источников.

Положения, выносимые на защиту

1) В работе показано, что в клетках Drosophila melanogaster белок РСГО2 имеет три изоформы. Эти изоформы образуются убиквитинированием и обнаруживаются в различных компартментах клетки.

2) При исследовании взаимодействий компонентов ТЯБХ-2 комплекса: БКУ2 и Xmas-2, с РСГО2, установлено, что только лёгкая (ядерная) форма белка РСГО2 входит в состав TREX-2.

3) Охарактеризовано участие РСГО2 в экспорте мРНК из ядра в цитоплазму Показано его взаимодействие с мРНК некоторых генов, экспорт которых, контролируется TREX-2.

4) Выделен РСГО2-содержащий цитоплазматический комплекс. Показано, что в цитоплазме РСГО2 взаимодействует с белком К^С, который играет роль в его стабилизации.

5) Исследование функций РСГО2 в цитоплазме показало, что он участвует в транспорте мРНК в цитоплазме, взаимодействуя с мРНК, динактином и тубулином.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экспорт мРНК из ядра

Активно транскрибируемые гены часто располагаются на периферии ядра [25]. К ним привлекается множество РНК полимераз, и на электронных микрофотографиях они напоминают известную структуру «Christmas-tree» [26]. На таких структурах активно идет процесс транскрипции, регуляция которой крайне важна для определения клеточной идентичности. Базовый контроль клеточной дифференцировки осуществляется путем сложной взаимосвязи между ДНК-связывающими факторами и последовательностями ДНК с определённым эпигенетическим статусом. Кроме того, регуляция транскрипции включает в себя взаимодействие генов с NPC (nuclear pore complex) [27].

1.1.1. РНП-частицы - функциональные единицы экспорта мРНК

Во время транскрипции новосинтезированная РНК постепенно увеличивается в размерах, и с ней начинают связываться многочисленные РНК-связывающие и РНК-модифицирующие белки: факторы кэпирования, сплайсинга и процессинга, белки, организующие экспорт мРНК. Иначе говоря, рибонуклеопротеиновые комплексы представляют собой функциональные формы пре-мРНК и мРНК [28]. Известно, что в ядре мРНК ассоциирована со множеством белков, называемых hnRNP белки (гетерогенные ядерные RNP белки). Комплексы hnRNP необычайно разнообразны и необходимы как для процессинга, так и для локализации, стабильности и экспорта РНП-частиц. Как правило, эти белки могут связываться с широким спектром различных последовательностей [29]. Было показано, что различные виды РНК связываются с уникальными комбинациями hnRNP белков [28]. В своей аминокислотной последовательности hnRNP белки содержат один или несколько РНК связывающих мотивов, таких как RBD (RNA

binding domain, также называемый RNA recognition motif - RRM), КН домены, RGG боксы [30].

В ядре наряду с hnRNP белками с РНК также могут связываться snRNP белки (small nuclear RNP). Они вовлекают пре-мРНК в процесс сплайсинга совместно с другими многочисленными факторами. snRNP белки рекрутируются на пре-мРНК на ранних стадиях сборки сплайсосомы [31]. Основными snRNP, ответственными за сплайсинг подавляющего большинства пре-мРНП-частиц, являются U1, U2, U4, U5 и U6. snRNP катализируют реакции, приводящие к удалению интронов и лигированию 3' и 5' экзонов, что приводит к присоединению и удалению белков с РНП-частицы [32].

Также, белки, связывающие РНК, играют очень важную роль в процессе экспорта мРНК из ядра в цитоплазму. Наряду с hnRNP и snRNP, среди белков, связывающих мРНК, изучена группа SR белков (serine - arginine (SR) белки) [33]. Белки данной группы рекрутируются на растущие пре-мРНК активных генов из ядерных телец и представляют собой белки-шаттлы, перемещающиеся между ядром и цитоплазмой. Кроме N-концевого домена, содержащего RRM, такие белки содержат С-концевой домен, включающий в себя серин-аргининовые повторы [34]. Некоторые SR белки, такие как ASF/SF2, 9G8, и SRp20 постоянно перемещаются между ядром и цитоплазмой и, таким образом, вовлечены в процессы, происходящие по обе стороны ядерной мембраны. Примером взаимодействия белков, относящихся к двум разным группам, являются hrp 45 [35] и hrp 23 [36]. Эти белки являются факторами сплайсинга и участвуют в транспортировке РНП-частицы. hrp 23 необходим для связывания RNP частицы и ядерного порового комплекса. Данный белок диссоциирует непосредственно в момент связывания рибонуклеопротеина с NPC. hrp 45, относящийся к группе SR белков, необходим для прохождения транскрипта через центральный канал NPC и не диссоциирует в момент связывания с ним. На примере hrp 45 и hrp 23 было показано, что ядерно-цитоплазматический транспорт представляет собой сложный многоступенчатый процесс, а РНП-частица является крайне динамичной

структурой. В каждый момент своего пути мРНК вплоть до выхода в цитоплазму [28].

- белковый комплекс изменяется

1.1.2. Рецепторы экспорта мРНК из ядра

Некоторые SR белки действуют как адаптеры для рецепторов экспорта мРНК. Так, например, основной рецептор экспорта мРНК эукариот Nxfl/Nxtl (yMex67-Mtr2) использует для связывания с мРНК адаптерный белок Aly/REF (yYral). Данный адаптер является составляющей ядерного комплекса TREX (transcription/export) и котранскрипционно привлекается на мРНК, связываясь, таким образом, со строго определенными РНП-частицами [37]. Кроме того, белок Yralp является компонентом комплекса EJC (exon junction complex), ответственного за соединение экзонов во время сплайсинга. Избирательному взаимодействию данного рецептора с мРНК способствуют разные способы привлечения: при помощи EJC или путем взаимодействия с белком PCFl, белком Cbp80 или другими SR белками [38]. У дрожжей Yral привлекает к новосинтезирующейся РНК фактор Sub2p. Это консервативный экспортный фактор (у позвоночных - UAP56), который может иметь РНК-связывающую активность и в качестве РНК-хеликазы связывается с различными белковыми комплексами, участвующими в созревании мРНК [39-41]. В отличие от Yralp, Sub2p не является компонентом комплекса EJC, но вступает с ним во взаимодействие. Однако, хотя известно, что все адаптерные белки котранскрипционно взаимодействуют с мРНК, сам фактор Nxfl связывается только с уже полностью сформированной РНП-частицей в нуклеоплазме [42]. Комплекс Nxfl/Nxtl (Mex67-Mtr2) взаимодействует с нуклеопоринами NPC (nuclear pore complex), осуществляя перенос РНП-частицы через канал ядерной поры. Таким образом экспортируется большая часть мРНК. Однако существует еще альтернативный путь экспорта, одним из главных участников которого является белок из семейства кариоферинов - Crml. Кариоферины отвечают за транспортировку различных молекул через NPC [43]. В присутствии Ran-GTP и

своих адаптерных белков Crml связывается с мРНК. Адаптерами для Crml служат белки: HuR [44], LRPPRC (содержит РНК-связывающий мотив) [45], Nxf3 (экспортный фактор) [46]. Рецептор экспорта Crml важен в биогенезе eIF4E-зависимых мРНК на стадии экспорта из ядра. В ходе этого процесса РНК -связывающий адаптер LRPPRC взаимодействует с 4ESE (4E-sensetivity element). 4ESE является структурным элементом на 3'-конце некоторых мРНК, длиной около 50 нуклеотидов. Также белок LRPPRPC связывается и с белком eIF4E, после чего на образовавшийся комплекс 4ESE-мРНК- LRPPRPC привлекается Crml, который способствует прохождению через NPC [45]. Другой белок -адаптер Crml, HuR, способен связывать РНК с ARE-мотивом. Nxf3 - еще один адаптер — отличается от других белков семейства Nxf тем, что у него отсутствует последовательность для связывания с NPC [46]. Перечень адаптерных белков для Crml не ограничивается перечисленными, и в него также входят: RanBPl, RanBP2(hNup358), Ran-GAP, ГТФ-связывающий Ran-GTP и RanBP3 (Таблица 1). Последние два отвечают за связывание с NES (nuclear export signal) на РНК [47].

Рецепторы экспорта Nxfl Crm1

Адаптерные белки Thoc5, Nab2, SRp20, Aly/Ref, Hpr1, 9G8 LRPPRPC, Nxf3, Hur

Ядерные, центральные нуклеопорины и белки ядерной «корзины» Mlp1,2/TPR, Nup96, Nup98, Rae1 TPR, Nup96, Nup98, Rae1

Ремоделинг РНП-частицы hDDX19, Gle/IP6, Nup88, Nup214, Nup358 RanBP1, RanGAP, Nup88, Nup214, Nup358

Таблица 1 Рецепторы ядерного экспорта и взаимодействующие с ними белки

После связывания со сформированной РНП-частицей белок Сгт1 взаимодействует с белками ядерной поры - нуклеопоринами, содержащими FG-повторы, и выходит в комплексе с РНП-частицей в цитоплазму. Далее на

цитоплазматической стороне поры посредством гидролиза ГТФ ядерные рецепторы экспорта диссоциируют от РНП-частицы при участии белков Ran-GAP и RanBPl [48]. В случае Nxfl - зависимого пути экспорта мРНК в процессе диссоциации от NPC важную роль играют белки Nup88, Nup2l4 и Ran -BP1 (Таблица l).

1.1.3. Комплекс THO / TREX

В эукариотических клетках для экспорта мРНК из ядра в цитоплазму требуется правильный процессинг и объединение нескольких РНК-связывающих белков с образованием РНП-частиц. У дрожжей для осуществления связи между транскрипцией и биогенезом РНП-частиц на активные гены привлекаются белки Tho2, Hprl, Mftl и Thp2 в стехиометрических количествах. Эти четыре белка показывают схожие паттерны связывания с транскриптом. Их количество на транскрипте возрастает от 5' к 3' концу открытой рамки считывания. Кроме того, известно, что Tho2, Hprl, Mftl и Thp2 диссоциируют от сайтов транскрипции, совпадающих с разрывами РНК и участками полиаденилирования [49]. Вместе Tho2, Hprl, Mftl и Thp2 входят в состав консервативного комплекса THO. Эксперименты по РНК-интерференции в организме Drosophila melanogaster в сочетании с анализом профилей экспрессии генов показали, что большая часть мРНК синтезируется и экспортируется с участием компонентов комплекса THO [50]. Данный комплекс был выделен также у человека и Drosophila melanogaster. Кроме того, было выяснено, что два крупнейших его компонента T^2 и Hprl присутствуют у всех эукариот, которые были изучены в ходе исследования [49,50]. У белка Hprl был обнаружен человеческий функциональный ортолог -Thocl [51]. Он экспрессируется в раковых клетках молочной железы на более высоком уровне, чем в клетках нормального эпителия и уровни его экспрессии коррелируют с размером опухоли [52]. У Drosophila melanogaster комплекс THO состоит из пяти ассоциированных белков, из которых только два (Tho2 и Hprl) имеют ортологи у дрожжей. Еще три субъединицы (Thoc5 -Thoc7) консервативны

также у высших эукариот. Причем две из них (Thoc5, Thoc7) имеют копии у S. Pombe [50].

Совместно с экспортными факторами Sub2/UAP56 и Yra1/Aly, THO в свою очередь формирует более крупный комплекс, называемый TREX (transcription/export) (Рисунок 1). Данный комплекс является ключевым в транспорте мРНК из ядра в цитоплазму. TREX сохраняет свою консервативность у дрожжей и человека, и был охарактеризован у Drosophila melanogaster [53].

Дрожжи

Drosophila melanogaster

Человек

Рисунок 1 Консервативный комплекс TREX

У дрожжей, Drosophila melanogaster и человека в состав комплекса TREX входит комплекс THO. (Адаптировано из (Reed and Cheng, 2005) [53])

Очищенный комплекс, содержащий компоненты TREX, связывается с РНК in vitro, а также c ДНК. Связывание осуществляется за счет присутствия компонента Yralp, который непосредственно взаимодействует с РНК in vitro. Тем не менее, это взаимодействие не опосредовано доменом RRM, а происходит с помощью аргинин-богатых последовательностей [54]. Существует мнение, что, прежде всего, комплекс THO/TREX привлекается на матрицу ДНК, после чего некоторые

его компоненты переходят к новосинтезирующимся пре -мРНК. Общая картина взаимодействий у дрожжей такова, что комплекс TREX привлекается на активные гены, после чего комплекс ТНО перемещается вместе с РНК-полимеразой II и переносит белки Yra1 и Sub2 на вновь синтезирующиеся транскрипты [55]. Полученные данные свидетельствуют о том, что Yra1p и Sub2p привлекаются на сайт транскрипции в ДНК как часть комплекса ТЯБХ, а затем Sub2p и, в меньшей степени, Yra1p переходят на синтезирующуюся пре-мРНК. Меньшая степень связывания Yra1p объясняется тем, что белки Yra1p могут не полностью переноситься на РНК, а часть из них может оставаться связанными с ДНК или с транскрипционным аппаратом [55]. Тот факт, что Sub2p и Yra1p содержат РНК-связывающий домен и являются факторами сплайсинга, может свидетельствовать о том, что данные белки взаимодействуют с определенным набором транскриптов. Согласно проведенным исследованиям, эти белки связываются с высокой эффективностью только с транскриптами генов, не содержащих интроны. С транскриптами генов, содержащих интроны, Sub2p и Yra1p связываются, но уже с небольшой эффективностью [55]. Низкая степень связывания с РНК коррелирует со сборкой сплайсосомы на данном сайте или рядом с ним. Согласно проведенным исследованиям о наличии данного процесса свидетельствует привлечение на пре-мРНК большого количества Ш snRNP [56]. Постепенно собираясь, сплайсосома закрывает собой сайт связывания транспортных факторов Sub2p и Yra1p и ингибирует экспорт пре-мРНК из ядра, осуществляя, таким образом, контроль транспортировки через ядерную мембрану. В результате белки Sub2p и Yra1p осуществляют экспорт уже зрелых мРНК, готовых к выходу в цитоплазму [55].

Комплекс ТНО является функциональным модулем, независимым от экспортных факторов РНК Sub2-Yra1. Такое утверждение согласуется с фактами, что ТНО при отсутствии Sub2 представляет собой стабильный комплекс, в то время как при наличии мутации hpr1 или делеции одной из субъединиц Т^2, нрг1 или Мш ТНО становится крайне неустойчивым [57,58]. Тем не менее, мутации субъединиц ТЯБХ приводят к значительному накоплению мРНК в ядре и

были летальны в комбинациях с мутациями экспортных факторов, что указывает на участие TREX в сцепленном с транскрипцией экспорте мРНК. На базе подобных исследований была выявлена еще одна важная функция комплекса THO/TREX. А именно, то, что этот комплекс может осуществлять удержание синтезируемой мРНК, препятствуя её взаимодействию с транскрибируемой ДНК и формированию РНК-ДНК гибридов между несвернутым транскриптом и ДНК матрицей [59].

1.1.4. Sac3-Thp1-Sus1-Cdc31 комплекс

На данный момент уже известно множество различных факторов экспорта мРНК. У дрожжей в результате генетического скрининга белков, взаимодействующих с Yral, был обнаружен белок Sac3 (GANP - ортолог у млекопитающих) (Таблица 2), который связывается с экспортным рецептором Mex67 и нуклеопоринами Nup60 и Nupl. Делеция Sac3 вызывает накопление мРНК в ядре [5]. Кроме того, выяснилось, что Sac3 ассоциирован с цитоплазматической частью NPC и участвует в высвобождении Mex67 из РНП -частицы на конечном этапе экспорта мРНК [60]. Дальнейшие исследования показали, что Sac3 вместе с белками Thpl, Susi и Cdc31 (у млекопитающих это PCID2, ENY2) образует комплекс in vivo, имеющий название TREX-2 [5,8]. Функции комплекса экспорта мРНК TREX-2 консервативны и сохраняются от дрожжей до человека, однако, несмотря на сходный состав данного экспортного комплекса, у разных групп организмов механизмы действия Sac3 и GANP коренным образом различаются. Так, у дрожжей комплекс TREX-2, основой которого является Sac3, необходим для локализации активно транскрибируемых генов в области NPC [15], чтобы обеспечить транспортировку транскриптов [61].

Yeast D. melanogaster H. sapiens

Sus1 ENY2 ENY2

Sac3 Xmas2 GANP

Mex67 NXF1 NXF/TAP

Mtr2 N^1 P15

Crm1/Xpo1 Crm1 CRM1/XPO1

dmPCID2 PCID2

MLP1p/2p Tpr/Megator TPR/Megator

N^1 dmNup153 NUP153

Yra1 Aly/Ref1 ALY/REF/THOC4

N^159 dmNup214 NUP214

RanBP2 RanBP2/dmNup358 NUP358

Таблица 2 Названия гомологов основных белков-участников транспорта РНП-частиц, используемых в данном обзоре литературы

Тем не менее, у млекопитающих белок GANP в составе подобного комплекса в первую очередь работает как шаперон для зрелых РНП-частиц, пока они перемещаются от центров процессинга в глубине ядра к ядерным порам [62]. Основываясь на многочисленных исследованиях, было сделано заключение, что комплекс TREX и комплекс Sus1p-Thp1p-Sac3p представляют параллельные пути, связывающие механизмы транскрипции и экспорта (Рисунок 2) [10,20,63].

ЫРС

1

- О

Рисунок 2 Модель транскрипции, сочетающая в себе экспорт с помощью комплексов Sus1-Thp1-Sac3 и THO-Sub2-Yra1 (TREX)

Suslp соединяет комплекс SAGA, который участвует в инициации транскрипции, с комплексом Thp1p-Sac3p, который связан с NPC через Nuplp. Sac3p способствует присоединению РНП-частиц к NPC через взаимодействие с Mex67p и нуклеопоринами. Факторы экспорта мРНК Sub2p и Yralp рекрутируются на синтезирующуюся мРНК во время элонгации транскрипции. Процесс облегчается действием комплекса THO, связанного с РНК Pol II. Sub2p и Yralp привлекают экспортный рецептор Mex67p, ориентированный на транспортировку РНП-частиц через NPC (Адаптировано из (Vinciguerra and Stutz 2004) [63]).

Белок Sac3 формирует каркас комплекса TREX-2 [13], с которым связаны белки Thpl, Susi, и Cdc31. Структура, формирующаяся в результате этих взаимодействий, является поверхностью для связывания нуклеиновых кислот. Белки Susi и Cdc31 связываются с "CID" доменом в С-концевой части Sac3 и требуются для объединения TREX-2 с NPC. Исследования in vivo с использованием мутаций показывают, что функции Susi и Cdc31 способствуют ассоциации NPC-TREX-2. В ходе исследований было выявлено, что в клетках млекопитающих существует определенный порядок взаимодействия между комплексами TREX и TREX-2. TREX привлекается к РНП-частице по 5'кэп-зависимому и сплайсинг-зависимому механизму [64]. Потеря THO комплекса и UAP56 в сочетании с привлечением экспортера мРНК NXF1 с помощью ALY у млекопитающих сигнализирует о созревании РНП-частицы до компетентного к транспорту состояния [6]. Исследователи предполагают, что именно на данной стадии экспрессии генов к РНП-частицам привлекается комплекс TREX-2, что обусловлено взаимодействием белка GANP с NXF1, и способствует эффективной доставке РНП-частиц к NPC. При достижении NPC GANP присоединяется к ним через белок Nup153 [13]. Sus1 локализуется как внутри ядра, так и на периферии, где совпадает с ядерными порами [10,65]. Помимо комплекса TREX-2, белок Sus1 входит также в состав комплекса SAGA, необходимого для инициации транскрипции ряда генов у дрожжей. Sus1 присутствует на промоторах SAGA-

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Глухова Анна Анатольевна, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kurshakova M.M., Georgieva S.G., Kopytova D. V. Protein complexes coordinating mRNA export from the nucleus into the cytoplasm // Mol. Biol. 2016. Vol. 50, № 5. P. 639-644.

2. Kopytova D. et al. ORC interacts with THSC/TREX-2 and its subunits promote Nxfl association with mRNP and mRNA export in Drosophila // Nucleic Acids Res. 2016. Vol. 44, № 10. P. 4920-4933.

3. Di Liegro C.M., Schiera G., Di Liegro I. Regulation of mRNA transport, localization and translation in the nervous system of mammals (Review). // Int. J. Mol. Med. 2014. Vol. 33, № 4. P. 747-762.

4. Gagnon J.A., Mowry K.L. Molecular motors: directing traffic during RNA localization. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2011. Vol. 46, № March. P. 229239.

5. Fischer T, Strässer K, Rácz A, Rodriguez-Navarro S, Oppizzi M, Ihrig P, Lechner J H.E. The mRNA export machinery requires the novel Sac3p-Thp1p complex to dock at the nucleoplasmic entrance of the nuclear pores // EMBO J. Vol. 21(21): P. 5843-52.

6. Köhler A., Hurt E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007. Vol. 8, № 10. P. 761-773.

7. Luna R., González-Aguilera C., Aguilera A. Transcription at the proximity of the nuclear pore // RNA Biol. 2009. Vol. 6, № 2. P. 145-148.

8. Fischer T, Rodríguez-Navarro S, Pereira G, Rácz A, Schiebel E H.E. Yeast centrin Cdc31 is linked to the nuclear mRNA export machinery. // Nat. Cell Biol. 2004. Vol. 6, № 9. P. 840-848.

9. González-Aguilera C. et al. The THP1 - SAC3-SUS1-CDC31 complex works in transcription elongation-mRNA export preventing RNA-mediated genome instability // Mol. Biol. Cell. 2008. Vol. 19, № 10. P. 4310-4318.

10. Kurshakova M. et al. SAGA and a novel Drosophila export complex anchor efficient transcription and mRNA export to NPC. // EMBO J. 2007. Vol. 26, №

24. P. 4956-4965.

11. Lu Q, Tang X, Tian G, Wang F, Liu K, Nguyen V, Kohalmi S, Keller W, Tsang E, Harada J, Rothstein S C.Y. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. // Plant J. 2010. Vol. 61, № 2. P. 259-270.

12. Ellisdon A. et al. Structural basis for the assembly and nucleic acid binding of the TREX-2 transcription-export complex // Nat. Struct. Mol. Biol. 2012. Vol. 19, № 3. P. 328-336.

13. Jani D. et al. Functional and structural characterization of the mammalian TREX-2 complex that links transcription with nuclear messenger RNA export // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, № 10. P. 4562-4573.

14. Wickramasinghe V.O., Stewart M., Laskey R.A. GANP enhances the efficiency of mRNA nuclear export in mammalian cells. // Nucleus. United States, 2010. Vol. 1, № 5. P. 393-396.

15. Rodríguez-Navarro S. et al. Sus1, a Functional Component of the SAGA Histone Acetylase Complex and the Nuclear Pore-Associated mRNA Export Machinery // Cell. 2004. Vol. 116, № 1. P. 75-86.

16. Kopytova D.V. et al. Multifunctional factor ENY2 is associated with the THO complex and promotes its recruitment onto nascent mRNA // Genes Dev. 2010. Vol. 24, № 1. P. 86-96.

17. Faza M.B. et al. Semi is a functional component of the nuclear pore complex-associated messenger RNA export machinery // J. Cell Biol. 2009. Vol. 184, № 6. P. 833-846.

18. Wilmes G.M. et al. A Genetic Interaction Map of RNA Processing Factors Reveals Links Between Sem1/Dss1-Containing Complexes and mRNA Export and Splicing // Mol. Cell. 2009. Vol. 32, № 5. P. 735-746.

19. Nabirochkina E.N., Kopytova D. V. The Xmas-2 Homologues, the Main Component of the TREX-2 mRNA Export Complex // Dokl. Biochem. Biophys. 2020. Vol. 495, № 1. P. 325-328.

20. Kopytova D. V. et al. ENY2: Couple, triple...more? // Cell Cycle. 2010. Vol. 9,

№ 3. P. 479-481.

21. Farny N.G., Hurt J.A., Silver P.A. Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans // Genes Dev. 2008. Vol. 22, № 1. P. 6678.

22. Stewart M. Structure and Function of the TREX-2 Complex // Subcellular Biochemistry. Springer, 2019. Vol. 93. P. 461-470.

23. Nakaya T. et al. Critical role of Pcid2 in B cell survival through the regulation of MAD2 expression. // J. Immunol. 2010. Vol. 185, № 9. P. 5180-5187.

24. Yang H. et al. BRCA2 Function in DNA Binding and Recombination from a BRCA2-DSS1-ssDNA Structure // Science (80-. ). 2002. Vol. 297, № 5588. P. 1837-1848.

25. Fakan S., Puvion E., Spohr G. Localization and characterization of newly synthesized nuclear RNA in isolated rat hepatocytes // Exp. Cell Res. 1976. Vol. 99, № 1. P. 155-164.

26. Miller O.L., Beatty B.R. Visualization of nucleolar genes. // Science. 1969. Vol. 164, № 3882. P. 955-957.

27. Feuerbach F. et al. Nuclear architecture and spatial positioning help establish transcriptional states of telomeres in yeast. // Nat. Cell Biol. 2002. Vol. 4, № 3. P. 214-221.

28. Dreyfuss G. et al. Messenger-Rna-Binding Proteins and the Messages They Carry // Mol. CELL Biol. 2002. Vol. 3, № March.

29. Dreyfuss G. et al. hnRNP Proteins and the Biogenesis of mRNA // Annu. Rev. Biochem. 1993. Vol. 62, № 1. P. 289-321.

30. Burd C.G., Dreyfuss G. Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins. // Science. 1994. Vol. 265, № 5172. P. 615-621.

31. Will C.L., Lührmann R. Spliceosomal UsnRNP biogenesis, structure and function // Current Opinion in Cell Biology. 2001. Vol. 13, № 3. P. 290-301.

32. Caceres J.F., Screaton G.R., Krainer A.R. A specific subset of SR proteins shuttles continuously between the nucleus and the cytoplasm // Genes Dev. 1998. Vol. 12, № 1. P. 55-66.

33. Giorgi C., Moore M.J. The nuclear nurture and cytoplasmic nature of localized mRNPs // Semin. Cell Dev. Biol. 2007. Vol. 18, № 2. P. 186-193.

34. Shyu A.-B., Wilkinson M.F. The Double Lives of Shuttling mRNA Binding Proteins // Cell. 2000. Vol. 102, № 2. P. 135-138.

35. Alzhanova-Ericsson A.T. et al. A protein of the SR family of splicing factors binds extensively to exonic Balbiani ring pre-mRNA and accompanies the RNA from the gene to the nuclear pore. // Genes Dev. 1996. Vol. 10, № 22. P. 28812893.

36. Sun X. et al. The hrp23 protein in the balbiani ring pre-mRNP particles is released just before or at the binding of the particles to the nuclear pore complex. // J. Cell Biol. 1998. Vol. 142, № 5. P. 1181-1193.

37. Zenklusen D. et al. The yeast hnRNP-Like proteins Yra1p and Yra2p participate in mRNA export through interaction with Mex67p. // Mol. Cell. Biol. 2001. Vol. 21, № 13. P. 4219-4232.

38. Monecke T., Dickmanns A., Ficner R. Allosteric control of the exportin CRM1 unraveled by crystal structure analysis // FEBS J. 2014. Vol. 281, № 18. P. 41794194.

39. Reed R., Hurt E. A conserved mRNA export machinery coupled to pre-mRNA splicing // Cell. 2002. Vol. 108, № 4. P. 523-531.

40. Zenklusen D. et al. Stable mRNP formation and export require cotranscriptional recruitment of the mRNA export factors Yra1p and Sub2p by Hpr1p. // Mol. Cell. Biol. 2002. Vol. 22, № 23. P. 8241-8253.

41. Aubourg S., Kreis M., Lecharny A. The DEAD box RNA helicase family in Arabidopsis thaliana. // Nucleic Acids Res. 1999. Vol. 27, № 2. P. 628-636.

42. Culjkovic-Kraljacic B., Borden K. Aiding and abetting cancer: mRNA export and the nuclear pore // Trends Cell Biol. 2013. Vol. 23, № 7. P. 328-335.

43. Brennan C.M., Gallouzi I.-E., Steitz J.A. Protein Ligands to Hur Modulate Its Interaction with Target Mrnas in Vivo // J. Cell Biol. 20 00. Vol. 151, № 1. P. 114.

44. Topisirovic I. et al. Molecular dissection of the eukaryotic initiation factor 4E

(eIF4E) export-competent RNP // EMBO J. 2009. Vol. 28, № 8. P. 1087-1098.

45. Yang J. et al. Two closely related human nuclear export factors utilize entirely distinct export pathways. // Mol. Cell. 2001. Vol. 8, № 2. P. 397-406.

46. Aitchison J.D., Rout M.P. The Yeast Nuclear Pore Complex and Transport Through It // Genetics. 2012. Vol. 190, № 3. P. 855-883.

47. Fornerod M. et al. The human homologue of yeast CRM1 is in a dynamic subcomplex with CAN/Nup214 and a novel nuclear pore component Nup88 // EMBO J. 1997. Vol. 16, № 4. P. 807-816.

48. Galy V. et al. Nuclear Retention of Unspliced mRNAs in Yeast Is Mediated by Perinuclear Mlp1 // Cell. 2004. Vol. 116, № 1. P. 63-73.

49. Strasser K. et al. TREX is a conserved complex coupling transcription with messenger RNA export. // Nature. 2002. Vol. 417, № 6886. P. 304-308.

50. Rehwinkel J. et al. Genome-wide analysis of mRNAs regulated by the THO complex in Drosophila melanogaster. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11, № 6. P. 558-566.

51. Li Y. et al. Human hHpr1/p84/Thoc1 regulates transcriptional elongation and physically links RNA polymerase II and RNA processing factors. // Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25, № 10. P. 4023-4033.

52. Guo S. et al. Linking transcriptional elongation and messenger RNA export to metastatic breast cancers // Cancer Res. 2005. Vol. 65, № 8. P. 3011-3016.

53. Reed R., Cheng H. TREX, SR proteins and export of mRNA // Curr. Opin. Cell Biol. 2005. Vol. 17, № 3. P. 269-273.

54. Rodrigues J.P. et al. REF proteins mediate the export of spliced and unspliced mRNAs from the nucleus. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. Vol. 98, № 3. P. 1030-1035.

55. Abruzzi K.C., Lacadie S., Rosbash M. Biochemical analysis of TREX complex recruitment to intronless and intron-containing yeast genes. // EMBO J. 2004. Vol. 23, № 13. P. 2620-2631.

56. Niwa M., Rose S.D., Berget S.M. In vitro polyadenylation is stimulated by the presence of an upstream intron // Genes Dev. 1990. Vol. 4, № 9. P. 1552-1559.

57. Huertas P. et al. An hpr1 point mutation that impairs transcription and mRNP biogenesis without increasing recombination. // Mol. Cell. Biol. 2006. Vol. 26, № 20. P. 7451-7465.

58. Jimeno S. et al. The yeast THO complex and mRNA export factors link RNA metabolism with transcription and genome instability // EMBO J. 2002. Vol. 21, № 13. P. 3526-3535.

59. Huertas P., Aguilera A. Cotranscriptionally formed DNA:RNA hybrids mediate transcription elongation impairment and transcription-associated recombination // Mol. Cell. 2003. Vol. 12, № 3. P. 711-721.

60. Lei E.P. et al. Sac3 is an mRNA export factor that localizes to cytoplasmic fibrils of nuclear pore complex. // Mol. Biol. Cell. 2003. Vol. 14, № 3. P. 836-847.

61. Blobel G. Gene gating: a hypothesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985. Vol. 82, № 24. P. 8527-8529.

62. Wickramasinghe V.O. et al. mRNA Export from Mammalian Cell Nuclei Is Dependent on GANP // Curr. Biol. 2010. Vol. 20, № 1. P. 25-31.

63. Vinciguerra P., Stutz F. mRNA export: An assembly line from genes to nuclear pores // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. Vol. 16, № 3. P. 285-292.

64. Stewart M. Nuclear export of mRNA // Trends Biochem. Sci. 2010. Vol. 35, № 11. P. 609-617.

65. Pascual-García P. et al. Sus1 is recruited to coding regions and functions during transcription elongation in association with SAGA and TREX2 // Genes Dev. 2008. Vol. 22, № 20. P. 2811-2822.

66. Kurshakova M. et al. Evolutionarily conserved E(y)2/Sus1 protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila. // Mol. Cell. United States, 2007. Vol. 27, № 2. P. 332-338.

67. Pascual-García P., Rodríguez-Navarro S. A tale of coupling, Sus1 function in transcription and mRNA export. // RNA Biol. 2009. Vol. 6, № 2. P. 141-144.

68. Chekanova J.A. et al. Sus1, Sac3, and Thp1 mediate post-transcriptional tethering of active genes to the nuclear rim as well as to non-nascent mRNP // RNA. 2008. Vol. 14, № 1. P. 66-77.

69. Fischer T. et al. The mRNA export machinery requires the novel Sac3p-Thp1p complex to dock at the nucleoplasmic entrance of the nuclear pores // EMBO J.

2002. Vol. 21, № 21.

70. Gallardo M. et al. Nab2p and the Thp1p-Sac3p complex functionally interact at the interface between transcription and mRNA metabolism // J. Biol. Chem.

2003. Vol. 278, № 26. P. 24225-24232.

71. Hofmann K., Bucher P. The PCI domain: A common theme in three multiprotein complexes // Trends Biochem. Sci. 1998. Vol. 23, № 6. P. 204-205.

72. Ellisdon A.M., Stewart M. Structural biology of the PCI-protein fold // Bioarchitecture. United States, 2012. Vol. 2, № 4. P. 118-123.

73. Gajiwala K.S., Burley S.K. Winged helix proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. Vol. 10, № 1. P. 110-116.

74. Gallardo M., Aguilera A. A new hyperrecombination mutation identifies a novel yeast gene, THP1, connecting transcription elongation with mitotic recombination. // Genetics. 2001. Vol. 157, № 1. P. 79-89.

75. Vilmos P. et al. Live imaging reveals that the Drosophila actin-binding ERM protein, moesin, co-localizes with the mitotic spindle // Eur. J. Cell Biol. Urban & Fischer, 2009. Vol. 88, № 10. P. 609-619.

76. Fehon R.G., McClatchey A.I., Bretscher A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010 114. Nature Publishing Group, 2010. Vol. 11, № 4. P. 276-287.

77. Kristo I. et al. The actin binding cytoskeletal protein Moesin is involved in nuclear mRNA export // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. Elsevier B.V., 2017. Vol. 1864, № 10. P. 1589-1604.

78. Bosanquet D.C. et al. FERM family proteins and their importance in cellular movements and wound healing (Review) // Int. J. Mol. Med. Spandidos Publications, 2014. Vol. 34, № 1. P. 3-12.

79. Bhatia V. et al. BRCA2 prevents R-loop accumulation and associates with TREX-2 mRNA export factor PCID2. // Nature. England, 2014. Vol. 511, № 7509. P. 362-365.

80. Cunningham C.N. et al. Human TREX2 components PCID2 and centrin 2, but not ENY2, have distinct functions in protein export and co-localize to the centrosome | Elsevier Enhanced Reader // Exp. Cell Res. 2014. Vol. 320, № 2. P. 209-218.

81. Rabut G., Lénart P., Ellenberg J. Dynamics of nuclear pore complex organization through the cell cycle. // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. Vol. 16, № 3. P. 314-321.

82. Alber F. et al. The molecular architecture of the nuclear pore complex // Nature. 2007. Vol. 450, № 7170. P. 695-701.

83. Kiseleva E. et al. Yeast nuclear pore complexes have a cytoplasmic ring and internal filaments. // J. Struct. Biol. 2004. Vol. 145, № 3. P. 272-288.

84. Terry L.J., Wente S.R. Flexible gates: Dynamic topologies and functions for FG nucleoporins in nucleocytoplasmic transport // Eukaryot. Cell. 2009. Vol. 8, № 12. P. 1814-1827.

85. von Appen A. et al. In situ structural analysis of the human nuclear pore complex // Nature. 2015. Vol. 526, № 7571. P. 140-143.

86. Rout M.P. et al. The Yeast Nuclear Pore Complex // J. Cell Biol. 2000. Vol. 148, № 4. P. 635-652.

87. Rout M.P. et al. Virtual gating and nuclear transport: the hole picture. // Trends Cell Biol. 2003. Vol. 13, № 12. P. 622-628.

88. Patel S.S. et al. Natively Unfolded Nucleoporins Gate Protein Diffusion across the Nuclear Pore Complex // Cell. 2007. Vol. 129, № 1. P. 83-96.

89. Fahrenkrog B. et al. Molecular Architecture of the Yeast Nuclear Pore Complex: Localization of Nsp1p Subcomplexes // J. Cell Biol. 1998. Vol. 143, № 3. P. 577588.

90. Siebrasse J.P., Kaminski T., Kubitscheck U. Nuclear export of single native mRNA molecules observed by light sheet fluorescence microscopy // Proc. Natl. Acad. Sci. 2012. Vol. 109, № 24. P. 9426-9431.

91. Kiseleva E. et al. Active nuclear pore complexes in Chironomus: visualization of transporter configurations related to mRNP export. // J. Cell Sci. 1998. Vol. 111 ( Pt 2. P. 223-236.

92. Englmeier L. et al. RanBP3 influences interactions between CRM1 and its nuclear protein export substrates. // EMBO Rep. 2001. Vol. 2, № 10. P. 926-932.

93. Strambio-de-Castillia C., Blobel G., Rout M.P. Proteins connecting the nuclear pore complex with the nuclear interior // J. Cell Biol. 1999. Vol. 144, № 5. P. 839-855.

94. Kosova B. et al. Mlp2p, a component of nuclear pore attached intranuclear filaments, associates with Nic96p // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 1. P. 343350.

95. Daneholt B. Assembly and transport of a premessenger RNP particle. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. Vol. 98, № 13. P. 7012-7017.

96. Visa N. et al. A nuclear cap-binding complex binds Balbiani ring pre-mRNA cotranscriptionally and accompanies the ribonucleoprotein particle during nuclear export // J. Cell Biol. 1996. Vol. 133, № 1. P. 5-14.

97. Vale R.D., Reese T.S., Sheetz M.P. Identification of a novel force-generating protein, kinesin, involved in microtubule-based motility. // Cell. 1985. Vol. 42, № 1. P. 39-50.

98. Carson JH1, Worboys K, Ainger K B.E. Translocation of myelin basic protein mRNA in oligodendrocytes requires microtubules and kinesin. // Cell Motil Cytoskelet. 1997. Vol. 38(4). P. 318-328.

99. Kanai Y., Dohmae N., Hirokawa N. Kinesin transports RNA: isolation and characterization of an RNA-transporting granule. // Neuron. 2004. Vol. 43, № 4. P. 513-525.

100. Vuppalanchi D., Willis D.E., Twiss J.L. Regulation of mRNA Transport and Translation in Axons // Results Probl. Cell Differ. 2009. Vol. 48. P. 293-304.

101. Sossin W.S., DesGroseillers L. Intracellular Trafficking of RNA in Neurons // Traffic. 2006. Vol. 7, № 12. P. 1581-1589.

102. Holt C.E., Bullock S.L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. // Science. 2009. Vol. 326, № 5957. P. 1212-1216.

103. Falley K. et al. Shank1 mRNA: dendritic transport by kinesin and translational control by the 5'untranslated region // Traffic. 2009. Vol. 10, № 7.

104. Ephrussi A., Dickinson L.K., Lehmann R. Oskar organizes the germ plasm and directs localization of the posterior determinant nanos. // Cell. 1991. Vol. 66, № 1. P. 37-50.

105. Babour A., Dargemont C., Stutz F. Ubiquitin and assembly of export competent mRNP // Biochim. Biophys. Acta - Gene Regul. Mech. 2012. Vol. 1819, № 6. P. 521-530.

106. Saleh A. et al. TOM1p, a yeast hect-domain protein which mediates transcriptional regulation through the ADA/SAGA coactivator complexes. // J. Mol. Biol. 1998. Vol. 282, № 5. P. 933-946.

107. Iglesias N. et al. Ubiquitin-mediated mRNP dynamics and surveillance prior to budding yeast mRNA export // Genes Dev. 2010. Vol. 24, № 17. P. 1927-1938.

108. Monod I.J. et al. The HECT ubiquitin ligase Rsp5p is required for proper nuclear export of mRNA in Saccharomyces cerevisiae. // Traffic. 2003. Vol. 4, № 8. P. 566-575.

109. Gwizdek C. et al. The mRNA nuclear export factor Hpr1 is regulated by Rsp5-mediated ubiquitylation // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, № 14. P. 13401-13405.

110. Gwizdek C. et al. Ubiquitin-associated domain of Mex67 synchronizes recruitment of the mRNA export machinery with transcription. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 44. P. 16376-16381.

111. Lewis A., Felberbaum R., Hochstrasser M. A nuclear envelope protein linking nuclear pore basket assembly, SUMO protease regulation, and mRNA surveillance // J. Cell Biol. 2007. Vol. 178, № 5. P. 813-827.

112. Gilbert W., Guthrie C. The Glc7p Nuclear Phosphatase Promotes mRNA Export by Facilitating Association of Mex67p with mRNA // Mol. Cell. 2004. Vol. 13, № 2. P. 201-212.

113. Izaurralde E. Directing mRNA export. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11, № 3. P. 210-212.

114. Gilbert W., Siebel C.W., Guthrie C. Phosphorylation by Sky1p promotes Npl3p shuttling and mRNA dissociation. // RNA. 2001. Vol. 7, № 2. P. 302-313.

115. Dostie J., Dreyfuss G. Translation is required to remove Y14 from mRNAs in the

cytoplasm // Curr. Biol. 2002. Vol. 12, № 13. P. 1060-1067.

116. Fundakowski J., Hermesh O., Jansen R.-P.P. Localization of a subset of yeast mRNAs depends on inheritance of endoplasmic reticulum // Traffic. 2012. Vol. 13, № 12. P. 1642-1652.

117. Nott A., Le Hir H., Moore M.J. Splicing enhances translation in mammalian cells: An additional function of the exon junction complex // Genes Dev. 2004. Vol. 18, № 2. P. 210-222.

118. Tange T. et al. Biochemical analysis of the EJC reveals two new factors and a stable tetrameric protein core. // RNA. 2005. Vol. 11, № 12. P. 1869-1883.

119. Langdon E.M., Gladfelter A.S. A New Lens for RNA Localization: LiquidLiquid Phase Separation // Annual Review of Microbiology. 2018. Vol. 72, № 1. P. 255-271.

120. Banani S.F. et al. Biomolecular condensates: Organizers of cellular biochemistry // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2017. Vol. 18, № 5. P. 285-298.

121. Hyman A.A., Weber C.A., Jülicher F. Liquid-liquid phase separation in biology // Annual review of cell and developmental biology. 2014. Vol. 30. P. 39-58.

122. Buchan J.R., Parker R. Eukaryotic Stress Granules: The Ins and Outs of Translation // Molecular Cell. 2009. Vol. 36, № 6. P. 932-941.

123. Singer-Krüger B., Jansen R.-P. Here, there, everywhere. mRNA localization in budding yeast. // RNA Biol. 2014. Vol. 11, № 8. P. 1031-1039.

124. Hirokawa N. mRNA transport in dendrites: RNA granules, motors, and tracks. // J. Neurosci. 2006. Vol. 26, № 27. P. 7139-7142.

125. Kardon J.R., Vale R.D. Regulators of the cytoplasmic dynein motor // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. Vol. 10, № 12. P. 854-865.

126. Schroer T.A. Dynactin // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004. Vol. 20, № 1. P. 759779.

127. Ephrussi A., Lehmann R. Induction of germ cell formation by oskar // Nature. 1992. Vol. 358, № 6385. P. 387-392.

128. Lehmann R., Nusslein-Volhard C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in

drosophila // Cell. 1986. Vol. 47, № 1. P. 141-152.

129. Evans T.C., Hunter C.P. Translational control of maternal RNAs. // WormBook. 2005. P. 1-11.

130. Kloc M. et al. RNA localization and germ cell determination in Xenopus. // Int. Rev. Cytol. 2001. Vol. 203. P. 63-91.

131. Medioni C., Mowry K., Besse F. Principles and roles of mRNA localization in animal development // Development. 2012. Vol. 139, № 18. P. 3263-3276.

132. Palacios I.M., St Johnston D. Kinesin light chain-independent function of the Kinesin heavy chain in cytoplasmic streaming and posterior localisation in the Drosophila oocyte. // Development. 2002. Vol. 129, № 23. P. 5473-5485.

133. Loiseau P. et al. Drosophila PAT1 is required for Kinesin-1 to transport cargo and to maximize its motility // Development. 2010. Vol. 137, № 16. P. 2763-2772.

134. Messitt T.J. et al. Multiple Kinesin Motors Coordinate Cytoplasmic RNA Transport on a Subpopulation of Microtubules in Xenopus Oocytes // Dev. Cell. 2008. Vol. 15, № 3. P. 426-436.

135. Bullock S.L., Ish-Horowicz D. Conserved signals and machinery for RNA transport in Drosophila oogenesis and embryogenesis. // Nature. 2001. Vol. 414, № 6864. P. 611-616.

136. Wilkie G.S., Davis I. Drosophila wingless and pair-rule transcripts localize apically by dynein-mediated transport of RNA particles. // Cell. 2001. Vol. 105, № 2. P. 209-219.

137. Minakhina S., Steward R. Axes formation and RNA localization // Current Opinion in Genetics and Development. 2005. Vol. 15, № 4. P. 416-421.

138. Duncan J.E., Warrior R. The cytoplasmic dynein and kinesin motors have interdependent roles in patterning the Drosophila oocyte // Curr. Biol. 2002. Vol. 12, № 23. P. 1982-1991.

139. Dienstbier M. et al. Egalitarian is a selective RNA-binding protein linking mRNA localization signals to the dynein motor. // Genes Dev. 2009. Vol. 23, № 13. P. 1546-1558.

140. Krendel M., Mooseker M.S. Myosins: Tails (and Heads) of Functional Diversity

// Physiology. 2005. Vol. 20, № 4. P. 239-251.

141. Rayment I., Holden H.M. The three-dimensional structure of a molecular motor. // Trends Biochem. Sci. 1994. Vol. 19, № 3. P. 129-134.

142. Gonsalvez G.B., Urbinati C.R., Long R.M. RNA localization in yeast: moving towards a mechanism // Biol. Cell. 2005. Vol. 97. P. 75-86.

143. Böhl F. et al. She2p, a novel RNA-binding protein tethers ASH1 mRNA to the Myo4p myosin motor via She3p. // EMBO J. 2000. Vol. 19, № 20. P. 5514-5524.

144. Jansen R.P. et al. Mother cell-specific HO expression in budding yeast depends on the unconventional myosin myo4p and other cytoplasmic proteins. // Cell. 1996. Vol. 84, № 5. P. 687-697.

145. Long R.M. et al. She2p is a novel RNA-binding protein that recruits the Myo4p-She3p complex to ASH1 mRNA. // EMBO J. 2000. Vol. 19, № 23. P. 65926601.

146. Long R.M. et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. // Science. 1997. Vol. 277, № 5324. P. 383-387.

147. Latham V.M. et al. A Rho-dependent signaling pathway operating through myosin localizes beta-actin mRNA in fibroblasts. // Curr. Biol. 2001. Vol. 11, № 13. P. 1010-1016.

148. Krauss J. et al. Myosin-V Regulates oskar mRNA Localization in the Drosophila Oocyte // Curr. Biol. 2009. Vol. 19, № 12. P. 1058-1063.

149. Ally S. et al. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. // J. Cell Biol. 2009. Vol. 187, № 7. P. 1071-1082.

150. Deacon S.W. et al. Dynactin is required for bidirectional organelle transport // J. Cell Biol. 2003. Vol. 160, № 3. P. 297-301.

151. Uchida A., Alami N.H., Brown A. Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments. // Mol. Biol. Cell. 2009. Vol. 20, № 23. P. 4997-5006.

152. Gross S.P., Vershinin M., Shubeita G.T. Cargo transport: two motors are sometimes better than one. // Curr. Biol. 2007. Vol. 17, № 12. P. R478-86.

153. Welte M.A., Gross S.P. Molecular motors: a traffic cop within? // HFSP J. 2008.

Vol. 2, № 4. P. 178-182.

154. St Johnston D. Moving messages: the intracellular localization of mRNAs. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. Vol. 6, № 5. P. 363-375.

155. Delanoue R., Davis I. Dynein anchors its mRNA cargo after apical transport in the Drosophila blastoderm embryo. // Cell. 2005. Vol. 122, № 1. P. 97-106.

156. Georgieva S.G. et al. A review of resources of the Internet site "Practical Molecular Biology" // Mol. Biol. (Mosk). 2001. Vol. 35, № 6. P. 1116-1119.

157. Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nat. Methods. United States, 2012. Vol. 9, № 7. P. 671-675.

158. Попова В.В., Глухова А.А., Георгиева С.Г., Георгиев Г.П. К.Д.В. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСА TREX-2 С мРНП-ЧАСТИЦЕЙ ГЕНА в-ТУБУЛИНА 56D // Молекулярная биология клетки. 2016. Vol. 50, № 6. P. 1030-1038.

159. Callis J. The Ubiquitination Machinery of the Ubiquitin System // Arabidopsis Book. 2014. Vol. 12. P. e0174.

160. A Ciechanover, H Heller, S Elias, A L Haas A.H. ATP-dependent conjugation of reticulocyte proteins with the polypeptide required for protein degradation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Proc Natl Acad Sci U S A, 1980. Vol. 77, № 3. P. 13651368.

161. Fu Q. et al. Emerging roles of NudC family: from molecular regulation to clinical implications. // Sci. China. Life Sci. China, 2016. Vol. 59, № 5. P. 455-462.

162. Dix C.I. et al. Lissencephaly-1 promotes the recruitment of dynein and dynactin to transported mRNAs. // J. Cell Biol. 2013. Vol. 202, № 3. P. 479-494.

163. Yamada M. et al. MNUDC is required for plus-end-directed transport of cytoplasmic dynein and dynactins by kinesin-1 // EMBO J. 2010. Vol. 29, № 3. P. 517-531.

164. Umlauf D. et al. The human TREX-2 complex is stably associated with the nuclear pore basket // J. Cell Sci. 2013. Vol. 126, № 12. P. 2656-2667.

165. Zhu X.-J. et al. The L279P mutation of nuclear distribution gene C (NudC) influences its chaperone activity and lissencephaly protein 1 (LIS1) stability. // J.

Biol. Chem. United States, 2010. Vol. 285, № 39. P. 29903-29910.