Иммуноцитохимическое исследование белков, ассоциированных с ядерной оболочкой, в интерфазе и митозе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Курчашова, Светлана Юрьевна

• Курчашова, Светлана Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Курчашова, Светлана Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

1. Выделение ядер

2. Выделение комплекса ядерных оболочек с периферическим хроматином

3. Получение хроматина, не связанного с ядерной оболочкой

4. Получение кислоторастворимых белков

5. Подготовка проб к электрофорезу

6. Определение белка

7. Электрофорез белков

8. Электроперенос

9. Получение и очистка антител

10. Иммуноблоттинг

11. Культура клеток

12. Получение микроядер и почек

13. Иммуноцитохимическое выявление белков, участвующих в формировании ядерной оболочки

14. Иммуноцитохимическое выявление бромдезоксиуридина

15. Получение хромосомных препаратов

16. Электронная микроскопия

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Динамика белков, участвующих в сборке ядерной оболочки, в клеточном цикле.

1. Иммунолокализация л аминов А/С в клеточном цикле

2. Иммунолокализация ламинов В в клеточном цикле

3. Иммунолокализация LAP2a в клеточном цикле

2. Эффект гипотонического шока на внутриклеточную локализацию и динамику белков ядерной оболочки.

Ламины А/С

Ламины В

LAP2a

3. Исследование взаимодействия белков, участвующих в сборке ядерной оболочки, с хромосомами в условиях пространственного разобщения хромосом.

Ламины А/С

Ламины В

LAP2a

4. Локализация белков, участвующих в сборке ядерной оболочки, в клетках с микроядрами.

5. Особенности организации ядерной оболочки в клетках с почками 1. Ультраструктурный анализ клеток с почками

2. Особенности организации ламины в клетках с почками

3. Индукция образования почек происходит в клетках, находящихся в S - фазе клеточного цикла.

6. Динамика белка р 68, полученного из фракции ядерных оболочек с анкоросомами, в клеточном цикле.

1. Выделение и ультраструктурный анализ фракции ядерных оболочек с анкоросомами

2. Белковый состав фракции ядерных оболочек с анкоросомами

3. Иммуноцитохимический анализ сыворотки в интерфазных ядрах гепатоцитов

4. Иммунофлуоресцентный анализ пролиферирующих клеток СПЭВ

5. Иммунологические характеристики афинно - очищенной сыворотки

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика реконструкции ядерной оболочки при формировании микроядер.

2. Изучение взаимодействия между ядерной оболочкой и хроматином в клетках с почками

3. Иммуноцитохимическое исследование белка фракции ядерных оболочек с анкоросомами в клеточном цикле.

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуноцитохимическое исследование белков, ассоциированных с ядерной оболочкой, в интерфазе и митозе»

На сегодняшний день не вызывает сомнения тот факт, что хромосомы внутри ядра расположены неслучайным образом (Lamond and Earnshaw, 1998; Cremer et al., 1993; Ferreira et al., 1997). На этом основании неоднократно высказывались гипотезы о том, что упорядоченное расположение хромосом играет существенную роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов и репликации ДНК (Lamond and Earnshow, 1998). Одним из возможных механизмов позиционирования хромосом в интерфазном ядре служит их взаимодействие с ядерной оболочкой (ЯО), которая представляет собой сложную комплексную структуру, включающую липидные мембраны и специальный белковый слой - ламину. В настоящее время идентифицирован целый ряд белков, которые входят в состав ЯО- LAPs (lamina associated proteins), LBR (lamin В receptor), MAN - антиген, эмерин (Chaudhary and Courvalin, 1993; Foisner, 1993; Chu et al., 1998; Fairley and Ellis., 1999). Предполагается, что ключевая роль в обеспечении контактов интерфазных хромосом с ЯО принадлежит ламинам (Paddy et al., 1990). Ламина, которая прежде рассматривалась исключительно как статичный механический каркас, поддерживающий форму ядра, в настоящий момент считается также важным компонентом надмолекулярной системы репликации ДНК (Newport et al., 1989; Hutchison et al., 1994; Moir et al, 1994; Belmont et al., 1998). Однако, эта функция ламины до сих пор остается мало изученной.

Практически не решенным остается также вопрос о том, какую роль в установлении контактов с ЯО играют компоненты интерфазных хромосом. Имеются данные, согласно которым структурная связь хромосом с ЯО 5 осуществляется в специализированных участках, по некоторым параметрам отличающихся от тотального хроматина. Как показали электронномикроскопические наблюдения, контакт хромосом с ЯО опосредован сплошным слоем так называемого «гранулярного периферического хроматина» (Онищенко, Ченцов, 1974). Биохимический анализ показал, что гранулы периферического хроматина, или «анкоросомы», отличаются от тотального хроматина по белковому составу, уровню метилирования ДНК и устойчивости к экстрагирующим воздействиям (Прусов и др., 1989; Fais et al., 1989). Это согласуется с данными, по которым в обеспечении контактов хромосом с ЯО помимо ламины участвуют также некоторые белки хроматина (Wilson, Newport, 1988). Однако остается неясным, сохраняются ли анкоросомы на протяжении всего клеточного цикла или они формируются только в интерфазе, после образования ЯО. Вопрос о том, имеют ли хромосомы детерминированные специализированные участки контакта или любой участок хроматина потенциально способен взаимодействовать с ЯО, остается невыясненным.

Еще одна до сих пор нерешенная проблема - механизмы «разборки» и «самосборки» макромолекулярных компонентов ЯО в митозе. Известно, что во время деления клеток ядерная оболочка перестает существовать как целостная структура. У высших растений и животных можно выделить три основных этапа поведения ЯО в митозе: распад в профазе, полная дезорганизация в метафазе и реконструкций на завершающих стадиях митоза. (Зацепина и др., 1982). Иммуноцитохимически показано, что в ходе конденсации хромосом в ранней профазе и прометафазе они перестают окрашиваться антителами к LAP, LBR, MAN - антигену, эмерину и ламинам (Chaudhary and Courvalin, 1993; Foisner, 1993; Chu et al., 1998; Fairley end Ellis., 1999). 6

Особенно противоречивы современные представления о динамике реконструкции ядерной оболочки.

В настоящее время предложено три альтернативных гипотезы реконструкции ядерной оболочки в конце митоза (Hutchison et al., 1994).

Согласно первой, ключевым фактором, инициирующим сборку ядерной оболочки, служит иммобилизация на поверхности хромосом свободных цитоплазматических ламинов А-типа. По второй гипотезе, мембранные везикулы - предшественники ядерной оболочки - связываются с поверхностью деконденсирующихся хромосом независимо от растворимых ламинов. В дальнейшем эти везикулы сливаются и формируется двуслойная ядерная мембрана. Только после этого растворимые ламины мигрируют в ядро и объединяются в ламину. Согласно третьей гипотезе, не существует такой жесткой последовательности событий. Везикулы, ассоциированные с ламинами и предшественники ядерной оболочки, не имеющие в своем составе ламинов, связываются с поверхностью деконденсирующихся хромосом кооперативно. После сборки ЯО растворимые ламины транспортируются в ядро, где объединяются в дефинитивную ламину.

Необходимо отметить, что имеющийся на сегодняшний день экспериментальный материал не дает возможности сделать окончательный выбор между перечисленными выше гипотезами.

Существенными трудностями которые возникают при анализе реконструкции ЯО иммуноцитохимическими методами являются, во-первых, близкое расположение хромосом в составе хромосомной пластинки, и, во-вторых, очень короткое время, за KOTopoeL происходит реконструкция ЯО. В связи с этим, большое значение имеет поиск экспериментальных моделей, в 7 которых процесс сборки ЯО был бы значительно растянут во времени. Одной из таких моделей являются клетки с микроядрами, образование которых индуцируется гипотоническим шоком (Мухарьямова и др., 1993; Владимирская и др., 1999). Исследование сборки ЯО в процессе формирования микроядер позволяет более детально проследить характер взаимодействия белков, участвующих в формировании ЯО, с хромосомами.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

1. Исследовать локализацию ламинов А/С и В в делящихся клетках СПЭВ и HeLa.

2. Исследовать особенности взаимодействия белков, участвующих в сборке ЯО (ламинов А/С и В и LAP2a), и хромосом в условиях искусственной декомпактизации хроматина, вызванной гипотоническим воздействием.

3. Исследовать динамику реконструкции ядерной оболочки, индуцированную гипотоническим воздействием, при формировании микроядер.

4. Исследовать динамику взаимодействия между ядерной оболочкой и реплицирующимся хроматином в клетках, дефектных по стабильности ядерной оболочки.

5. Получить антитела к белкам фракции ядерных оболочек с периферическим хроматином и изучить динамику этих белков в клеточном цикле. 8

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Общий план строения ядерной оболочки.

Ядерная оболочка представляет собой комплексную структуру, которая отделяет нуклеоплазму от цитоплазмы, участвует в транспорте веществ между этими компартментами и играет важную роль в структурной организации хроматина. Важнейшими компонентами ядерной оболочки являются внутренняя и внешняя ядерная мембраны, перинуклеарное пространство, комплекс пор и ядерная ламина. Внешняя ядерная мембрана контактирует с полисомами и отдельными рибосомами и структурно связана с эндоплазматическим ретикулумом (Burke, Gerace, 1986). Фиброзный слой внутренней ядерной мембраны (ламина) контактирует с гранулярным слоем периферического хроматина. В настоящее время тонкая организация ядерной оболочки изучена довольно подробно.

2. Ядерная ламина.

Происходящие в ядре процессы, такие как репликация и транскрипция ДНК, процессинг РНК, транспорт макромолекул в ядро или из ядра, организованы в пространственном и временном отношении. Способы, при помощи которых поддерживается такая компартментализация, изучены недостаточно, однако полимеризация макромолекул может рассматриваться как механизм, облегчающий такую регуляцию. Были охарактеризованы несколько самополимеризующихся белков, в числе которых были и ламины. 9

Впервые ламины были охарактеризованы при помощи биохимических методов, как главные структурные белки ядра (Aaronson and Blobel, 1975). Используя антитела, Gerace et al. (1978) показали, что ламины локализованы на ядерной оболочке, с нуклеоплазматической стороны внутренней ядерной мембраны. В составе ядерной оболочки ламины организованы в виде сети, содержащей ортогонально ориентированные филаменты (Aebi et al., 1986). В большинстве клеток млекопитающих ламина имеет толщину 10 нм и состоит из трех важнейших полипептидов: ламинов А (70 кД), В (68 кД) и С (60 кД), которые присутствуют в эквивалентном количестве в интерфазном ядре (Gerace, Blobel, 1980).

На биохимическом уровне в клетках позвоночных были охарактеризованы два типа ламинов - А и В - согласно их аминокислотной последовательности, характеру экспрессии, биохимическим свойствам и локализации в клетке во время митоза (Gerace and Burke, 1988; Nigg, 1989, Peter et al, 1989). Ламины A - типа экспрессируются в дифференцированных клетках, имеют нейтральную изоэлектрическую точку и не связаны с мембранными везикулами во время митоза (так называемые "растворимые " ламины). Ламины В - типа имеют кислую изоэлектрическую точку, экспрессируются во всех клетках и входят в состав одного из типов мембранных везикул, на которые разбирается ядерная оболочка во время митоза (Gerace and Burke, 1988).

Геном позвоночных содержит два гена, ответственных за синтез ламинов В - типа (В1 и В2) и один ген, отвечающий за синтез ламинов А. Эти три гена ответственны за синтез по крайней мере семи различных полипептидов -ламинов А, А дельта 10, С и С2 (синтезирующихся в результате альтернативного сплайсинга гена ламина А) и ламинов Bl, В2 и ВЗ. Ламин ВЗ

10 синтезируется в результате альтернативного сплайсинга гена В2 (Furukawa and Hotta, 1993; Furukawa et al., 1994).

Ламины ВЗ и C2 являются специфичными для зародышевых клеток (Furukawa and Hotta, 1993; Furukawa et al., 1994). Синтез ламина B2 осуществляется практически во всех типах клеток на постоянном уровне. Экспрессия ламина В1 коррелирует с пролиферативным статусом клетки (Broers et al., 1997). Особый интерес представляет характер экспрессии ламинов А - типа. Ламины А и С синтезируются в дифференцирующихся и дифференцированных клетках . (Gerace and Burke, 1988). Однако существуют клетки (например, гемопоэтические) в которых ламины А - типа не синтезируются вообще (Guilly et al, 1990; Rober et al., 1990). Экспрессия ламинов A - типа сама по себе не влияет на дифференцировку клеток и не может ее индуцировать (СоHard and Raymond, 1990; Peter and Nigg, 1991; Stuurman et al., in press). С другой стороны, мыши с нокаутом гена ламина А жизнеспособны только в течение 4-8 недель. На таких мышах и на клеточных линиях, полученных из этих мышей, было показано, что отсутствие ламина А влияет на распределение других белков ядерной оболочки. В частности, ламин В и LAP2P остаются в составе внутренней ядерной мембраны, но часто отсутствуют на одном из полюсов ядра. Ядерные поры в таких клетках собраны в кластеры, а эмерин практически полностью локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (Harel et al., 1998; Lenz et al., 1997, Ostlund et al., 1999; Soullam and Worman, 1993). Изложенные выше факты позволяют предположить, что, по крайней мере, в тех клетках, где ламины А синтезируются, эти ламины играют существенную роль в поддержании

11 упорядоченного расположения целой группы белков внутренней ядерной мембраны.

Секвенирование кДНК ламинов показало, что они принадлежат к семейству промежуточных филаментов (McKeon et al., 1986). Они обладают общей первичной структурой: содержат центральный домен, представленный тремя альфа-спиральными участками, а также аминоконцевой и карбоксиконцевой глобулярные домены (Gerace, Blobel, 1980). Карбоксиконцевой домен играет важную роль в транспорте ламинов в ядро (Loewinger and McKeon, 1988) и в локализации ламинов на ядерной оболочке, так как содержит NLS (Kitten and Nigg, 1991, Krohne et all, 1989). Ламины А, В и С содержат последовательность СааХ (с - цистеин, а - алифатическая аминокислота, X - любая аминокислота) на карбоксильном конце. Эта последовательность содержит сайты изопрениляции (Beck et all, 1998) и метилирования (Chelsky et all, 1987). СааХ - последовательность в ламине С вырезается при помощи протеаз (Fisher et all, 1986). Изопрениляция СааХ -последовательности в ламинах В1 - 3 играет существенную роль в иммобилизации ламинов на ядерной оболочке, так как фарнезильные остатки, которые включаются в эту последовательность, могут непосредственно связываться с внутренней ядерной мембраной (Hutchison et all., 1994). Протеолитическое удаление фарнезилированных и метилированных остатков в ламинах А и А дельта 10 или их отсутствие в ламинах С1 и С2 может служить причиной того, что ламины А - типа не входят в состав мембранных везикул, образующихся при разборке ядерной оболочки в митозе. Ламины В - типа, в которых фарнезилированная последовательность не отщепляется, остаются

12 связанными с мембранными везикулами на протяжении всего митоза (Gerace and Blobel, 1980; Meier and Georgatos, 1994).

В интерфазном ядре сборка ламины осуществляется за счет ассоциации мономеров в гомодимеры, которые затем полимеризуются по принципу "голова к хвосту" и образуют сеть (Aebi et al, 1986; Moir et al, 1991).

Рядом с каждым из концов альфа - спирального участка расположены фосфорно - акцепторные сайты. Специфическое фосфорилирование сериновых (или треониновых) остатков во время митоза приводит к деполимеризации ламинов, и, как следствие, к распаду ламины. Cdc2 - киназа, ответственная за это фосфорилирование, не влияет на распад димеров на мономеры, однако препятствует полимеризации "голова к хвосту" (Peter et al., 1991; Nigg, 1992). Этот эффект достигается за счет фосфорилирования аминотерминального (но не карбокситерминального) фосфоакцепторного сайта (Peter et al., 1991). Таким образом, cdc2 - киназа может непосредственно контролировать процесс полимеризации ламинов.

Другие киназы также могут фосфорилировать ламины в специфических сайтах и, таким образом, контролировать их полимеризацию или деполимеризацию (Peter et al., 1992). В частности, фосфорилирование серина, расположенного рядом с фосфоакцепторным сайтом в аминоконцевом домене, также ингибирует ассоциацию ламинов "голова к хвосту", как и cdc2 - киназа (Stuurman, 1997). Протеинкиназа С, которая фосфорилирует сайты в С -концевом домене, также может быть ответственна за деполимеризацию ламинов в некоторых типах клеток (Goss et al., 1994; Thompson and Fields, 1996; Collas et al., 1997). Изложенные выше факты позволяют предположить, что многочисленные сериновые и треониновые остатки, окружающие центральный

13 домен ламинов, могут быть фосфорилированы при помощи различных киназ и что это фосфорилирование может служить причиной разборки ламины. Разные типы клеток могут использовать различные фосфорноакцепторные сайты и различные киназы для регуляции полимеризации и деполимеризации ламинов.

Ядерная оболочка не является единственным местом локализации ламинов. Были описаны два различных способа локализации ламинов внутри ядра: в виде внутренних фокусов (Goldman et aL, 1992; Bridger et al.,1993; Moir et al., 1994), которые содержали ламины либо А, либо В - типа, или ламины, распределенные диффузно внутри ядра (Hozak et al., 1995). Hozak et al. (1995) обнаружили, что экстракция хроматина из клеток HeLa до иммуномечения позволяет обнаружить ламины А и С, но не В, диффузно распределенные внутри ядра. При помощи иммуноэлектронной микроскопии было установлено, что ламины А и С в ядре локализованы в узлах нуклеоскелета. Эти данные позволяют предположить, что ламины формируют сеть также и внутри ядра.

Содержащие ламины "фокусы" возникают и исчезают на разных стадиях клеточного цикла. При помощи микроинъекций человеческого ламина А в цитоплазму клеток ЗТЗ было показано, что экзогенный ламин импортируется в ядро, где сначала накапливался в дискретных "фокусах" глубоко внутри ядра (Goldman et al., 1992). Только спустя несколько часов меченный ламин А постепенно включается в состав эндогенной ядерной ламины. Эти эксперименты показывают, что эндогенная сеть ламинов может включать экзогенные ламины. Bridger et al. (1993) наблюдали сходные "фокусы" ламинов и филаментозные структуры в культивируемых человеческих клетках, используя моноклональные антитела против эндогенных ламинов А - типа. Эти внутренние "фокусы" ламинов были наиболее заметны в G1 фазе клеточного

14 цикла и располагались в областях около конденсированного хроматина. На основе приведенных наблюдений было высказано предположение, что "фокусы" представляют собой пул новосинтезированных ламинов, которые необходимы для роста ядра в дочерних клетках. Кроме того, внутриядерные "фокусы" могут представлять собой сайты, где происходит промежуточная сборка ламинов, прежде чем они войдут в состав периферической ламины. Возможно, что такие пост-трансляционные модификации, как изопрениляция, фосфорилирование, метилирование и протеолитическая обработка вновь синтезируемых ламинов также имеют место в этих "фокусах" до их сборки и включения в периферическую ламиновую сеть (Goldman et al., 1992; 1992; Bridger et al, 1993).

Внутренние "фокусы" существуют и для ламина В (Moir et al., 1994). "Фокусы" ламина В выявляются, в основном, в средней и поздней S - фазе и не ко локализуются с фокусами ламинов А/С. "Фокусы" ламина В ко локализуются с сайтами репликации ДНК (Moir et al., 1994). Эта ко локализация наиболее значима в свете сообщений о зависимости репликации ДНК от ядерных ламинов, собранных в системе in vitro (Hutchison et al., 1994).

Обнаружение таких внутриядерных "фокусов" поставило вопрос, не связаны ли они с ядерной оболочкой. .Ядра многих клеток содержат инвагинации ядерной мембраны (Fricker et al., 1997). Эти инвагинации подстилает ядерная ламина и они содержат комплексы пор. Однако внутриядерные "фокусы" ламинов А и В не колокализованы с мембранами (Bridger et al., 1993) и не содержат комплексов пор (Moir et al., 1994), из чего можно сделать вывод, что они не связаны с ядерной оболочкой. Функции "фокусов" ламинов А и В остаются неизвестными.

3.Ассоциированные с ламинами интегральные белки внутренней ядерной мембраны.

Общим признаком, характерным для данной группы белков, является присутствие в молекуле белка ламин - связывающего участка. Одним из наиболее охарактеризованных белков этой группы является LBR - (lamin В receptor) - белок, с которым специфически связывается ламин В. Куринный LBR содержит 637 аминокислотных остатков, N - терминальная часть которого уложена в 2 глобулярных домена, разделенных неглобулярной частью Нуклеоплазматическая часть представлена восемью трансмембранными сегментами и гидрофильным С - терминальным концом. Изолированный неглобулярный участок LBR способен связываться с двухцепочечной ДНК in vitro. Однако интактный белок LBR не способен связываться с чистой ДНК, так что значение такого взаимодействия остается неясным. Связывание LBR с хроматином, опосредованное белком гетерохроматина НР1, оказывается физиологически устойчивым. Кроме того, было показано, что N -терминальный фрагмент второго глобулярного домена LBR связывается с chromo shadow domain белка НР1 (Chu et al, 1998).

В эритроцитах курицы рецептор к ламину В входит в состав крупного белкового комплекса, локализованного на внутренней ядерной мембране; этот комплекс содержит различные компоненты, включая LBR киназу, ламин В и небольшой интегральный белок ядерной мембраны р18. In vitro р 18 связывается непосредственно с LBR и ламинами В, причем связывание этого

16 белка с ламином В слабее, чем с LBR. Белок р 18, который в эквивалентном количестве распределен и во внешней и во внутренней мембране эритроцита, в большом количестве обнаружен именно в ядерной мембране эритроцита. В остальных тканях он либо присутствует в очень небольших количествах, либо отсутствует. Возможно, что данный белок играет роль в тканеспецифичном модулировании взаимодействия хроматина и ядерной оболочки (Chu et al., 1998; Wormanetal., 1998).

В настоящее время охарактеризована группа ассоциированных с ламинами белков (LAPs - lamin associated proteins). За исключением LAP2a эти белки относятся ко второму типу интегральных белков внутренней ядерной мембраны с единственным трансмембранным доменом, располагающимся в С-концевой области молекулы. В результате альтернативного сплайсинга одного гена образуются три различные изоформы LAP1: LAP1A, LAP1B, LAP 1С. Способность связываться с хроматином была продемонстрирована для всех трех изоформ in vitro ; однако такое взаимодействие требует дополнительных линкерных белков (Foisner, Gerace, 1993). In vitro, LAP1A и -В способны связываться с ламинами А, С и В1, причем LAP1A имеет наибольшую ламин-связывающую активность. Однако, LAP 1С в этих экспериментах с ламинами не взаимодействует (Foisner, Gerace, 1993). Тем не менее, как компонент крупного белкового комплекса in vivo LAP 1С связан с протеинкиназой и ламинами В., хотя непосредственного взаимодействия LAP 1С с ламинами В не показано. (Simos and Georgatos, 1996). Содержащие LAP1 комплексы отличны от содержащих LAP2P и LBR. Chu et all (1998) предполагают, что различные комплексы занимают различные територии во внутренней ядерной мембране.

17

Экспрессия различных изоформ LAP1, так же, как и ламинов, меняется в процессе дифференцировки. LAP 1С присутствует как в дифференцированных, так и в недиферринцированных клетках, тогда как LAP1A и -В экспрессируются только в дифференцированных клетках (Martin and Gerace, 1995). Такая контролируемая экспрессия может служить одним из способов модуляции организации ядра в процессе эмбрионального развития.

В клетках млекопитающих были охарактеризованы белки LAP1 и LAP2. LAP2P представляет собой 53 кД интегральный белок внутренней ядерной мембраны, который способен связываться непосредственно с ламинами и хромосомами. Анализ кДНК этого белка установил, что в нем содержится 452 аминокислотных остатка и в нем представлены крупный нуклеоплазматический домен и небольшой трансмембранный участок, локализованный на уровне 410433 аминокислотного остатка (Furukawa et al, 1995). Хромосомо-связывающий сайт LAP2j3 был картирован в области 1-85 аминокислотных остатка, причем он отличается от ДНК-связывающего домена (244-296 аминокислотные остатки) этого белка. Furukawa (1999) идентифицировал один из белков, возможно, опросредующих взаимодействие LAP2P и хромосом. Белок, названный им LAP2 binding protein 1 (BAF - barrier to autointegration factor), обладает способностью специфически связываться с LAP2j3. В интерфазных клетках LAP2 binding protein 1 диффузно распределен по всему объему ядра, однако, начиная с профазы митоза и до конца анафазы, данный белок выявляется на поверхности хромосом.

Ламин-связывающий домен LAP2(5 располагается в области 298-373 аминокислотных остатков, и этот же участок необходим для стабильного включения белка в состав ядерной оболочки. (Furukawa et al., 1997). При

18 помощи микроинъекций клеток различными фрагментами LAP2(3 и, в особенности ламин-связывающим фрагментом, показана роль этого белка в обеспечении увеличения объема ядра, которое происходит от G1 к S и G2 клеточного цикла. (Yang ang Gerace, 1997).

В результате альтернативного сплайсинга гена, кодирующего LAP 2 в клетках млекопитающих образуются по крайней мере три разных белка -: тимопоэтин р (который в человеческих клетках на 91% гомологичен LAP2, найденному в печени крысы по аминокислотной последовательности), тимопоэтин а и тимопоэтин j (Harris et al, 1995). Тимопоэтин а представляет собой белок из 673 аминокислотных остатков. Он идентичен LAP2 только по первым 187 аминокислотным остаткам , не содержит трансмембранного домена и локализуется внутри ядра (Harris et al., 1995). Тимопоэтин у полностью гомологичен LAP2 , но содержит делецию по 221-328 аминокислотным остаткам в нуклеоплазматическом домене белка (Harris et al., 1995).

Следует отметить, что варианты альтернативного сплайсинга не были обнаружены в эквивалентных количествах в исследуемых объектах. Все три варианта к ДНК из LAP2 -гена были выделены из мыши, печени и некоторых культивируемых клеток крысы. В культивируемых клетках экспрессируется, в основном, тимопоэтин Р (Furukawa et al., 1997). Таким образом, взаимодействие хроматина с ядерной оболочкой может регулироваться на уровне транскрипции генов, кодирующих белки внутренней ядерной мембраны. Foisner and Gerace (1993) представили данные об интерфазном фосфорилировании LAP 2, которое также может изменять какие-то свойства этого белка.

Manilal and Morris (1996) охарактеризовали еще один белок семейства LAP, названный ими эмерином. Белок содержит две неперекрывающиеся

19 последовательности, необходимые для стабильного включения в состав ядерной оболочки. Сходство эмерина и LAP 2 ограничивается 39 аминокислотными остатками в N-концевом домене и последними 34 аминокислотными остатками на С-конце молекулы (Ellis and Kendrick-Jones, 1998). Мутации в этом 34 кД белке приводят к дистрофии (Emery-Dreifuss muscular distrophy - EDMD) -болезни, симптомами которой являются чахлые мышцы и кардиомиопатия (Small and Warren, 1997). Хотя эмерин экспрессируется в различных тканях, болезнь прежде всего затрагивает скелетные и сердечную мышцы. (Small and Warren, 1997). Эмерин был найден также в десмосомах, что позволило предположить участие этого белка в специфических для сердечной мышцы межклеточных контактах (Cartengnis and Tonioto,1997). Роль эмерина в ядре остается неясной. Однако его локализация на ядерной оболочке и колокализация с ламинами А и В-типа в дискретных фокусах внутри ядра позволяет предположить, что белок взаимодействует с ламинами. (Manilal and Morris 1998).

Дополнительные белки семейства LAP 2, возможно, будут идентифицированы. Используя человеческие аутоимунные антитела, Paulin-Levasseur and Rouleau (1996) охарактеризовали несколько белков, связанных с ядерной оболочкой и ламиной. Антитела преципитировали белки LAP 2 а, (3, у, и новый белок, который авторы назвали MAN 1. В трансфецированных клетках MAN 1 был обнаружен в составе ядерной оболочки. Этот белок является еще одним кандидатом в семейство белков, взаимодействующих с ламинами и хроматином (Paulin-Levasseur and Worman, personal communication).

В клетках Drosophila был охарактеризован белок, названный отефином, с молекулярной массой 45 кД и проявляющий подвижность 53 кД в SDS

20 полиакриламидном геле. В интерфазном ядре белок локализован на нуклеоплазматической стороне внутренней ядерной мембраны и колокализован с ламином DO (гомолог ламинов В млекопитающих). Белок содержит сайты фосфорилирования для с<1с2-киназы и протеинкиназы А. Анализ процесса сборки ядерной оболочки в экстрактах, полученных из эмбрионов Drosophila, показал, что удаление отефина из экстракта при помощи антител препятствует формированию ядерной оболочки. (Ashery-Padan et all, 1997).

Таким образом, как показывает анализ цитируемой литературы, различные белки, локализованные во внутренней ядерной мембране, вовлечены во взаимодействие ядерной ламины и хроматина. Регуляция такого взаимодействия может осуществляться на различных уровнях. Для LAPs-белков показана экспрессия различных изоформ в процессе дифференцировки. Фосфорилирование LAPs и LBR также является одним из способов модуляции взаимодействия этих белков с ламинами и хроматином

Как компоненты крупных белковых комплексов, LAPs и LBR могут генерировать образование субдоменов во внутренней ядерной мембране, причем эти субдомены различны по своей афинности к ламинам и хроматину (Chu et al, 1998).

4. Белки хроматина, связанные с периферией ядра.

Было показано, что в интерфазном ядре хроматин и ядерная оболочка прочно связаны между собой. При ультрацентрифугировании в гипотоническом растворе Хенкса (0.04 М по NaCl) при 220000g, когда тотальный хроматин

21 смещается в направлении центрифугирования, периферический хроматин сохраняет свое положение неизменным у внутренней ядерной мембраны. От него вниз тянутся обрывки ДНП. Разрыв, если он и происходит, проходит по самой фибрилле ДНП, а не в месте контакта ядерной оболочки с пристеночным хроматином. По данным электронной микроскопии, нити хроматина прикреплены к внутренней ядерной мембране с помощью особых гранул диаметром 25 нм. (Оншценко, Ченцов, 1974). Эти гранулы были названы анкоросомами (Прусов, Файс, 1989).

Гранулы выстилают всю поверхность ядерной оболочки, прерываясь только в области пор. При обработке нуклеазами в растворах низкой ионной силы происходит деконденсация и фрагментирование внутриядерного хроматина, тогда как связанный с ядерной оболочкой хроматин сохраняет свою структуру и из ядра не вымывается (Прусов и др., 1989). Таким образом, гранулярный слой периферического хроматина представляет собой фракцию хроматина, которую можно изолировать и изучить при помощи биохимических методов (Прусов и др., 1989). Гранулярный слой периферического хроматина представляет собой особую фракцию хроматина (Прусов и др., 1980). Эта фракция содержит около 2% от тотальной ядерной ДНК и характеризуется набором специфических кислоторастворимых белков. Методом ультрафиолетовых сшивок показано, что они находятся в непосредственном контакте с ДНК (Прусов и др., 1989). Исследование ДНК анкоросом показало, что она слабо отличается от тотальной по молекулярной гетерогенности (кинетике реассоциации) (Прусов и др., 1983). Доля сателлитных последовательностей не превышает 15% от всей длины ДНК во фракции ядерных оболочек, в то время как в тотальном хроматине она составляет 10%

22

Zentgraf, 1975; Franke, 1973). Возможно, что помимо повторяющихся последовательностей, с ядерной оболочкой могут также связываться уникальные последовательности (Прусов, 1983).

Эксперименты с многократной экстракцией ядерных оболочек растворами NaCl, гепарина и додецилсульфата натрия подтверждают, что небольшая часть ДНК периферического хроматина сохраняет связь с ядерной ламиной в присутствии этих агентов. Эти результаты говорят о том, что связь ДНК с ламиной осуществляется не только благодаря ионным или гидрофобным взаимодействиям. Возможно, она является ковалентной. Эта связь является специфической, о чем говорят данные биохимического анализа ДНК и белков анкоросом (Прусов и др., 1980). Особый интерес представляют данные об остаточной ДНК с высокой молекулярной массой. Тот факт, что ее высокая молекулярная масса сохраняется после обработки ядер ДНКазой 1 говорит о возможной ее защите белками периферического хроматина. Резистентность этой ДНК не связана с устойчивостью ее последовательностей к ДНКазе, так как после экстракции белков 2 М NaCl эта ДНК расщепляется ДНКазой 1. Разрушение анкоросом под действием проназы также говорит о важности белковых взаимодействий в этом комплексе (Онищенко, Ченцов, 1974).

5.Поведение ядерной оболочки в митозе.

Известно, что во время деления клеток ядерная оболочка перестает существовать как целостная, непрерывная структура. В делящихся клетках высших растений и животных можно выделить три основных момента: распад,

23 который происходит в профазе и прометафазе, состояние в метафазе и реконструкцию, происходящую на завершающих стадиях митоза.

В процессе конденсации хромосом число контактов хроматина и ядерной оболочки уменьшается и анкоросомы обнаруживаются лишь в тех местах, где контакты еще существуют. В поздней профазе даже в этих местах анкоросомы более не обнаруживаются (Zatsepina et al., 1982).

В профазе многие белки фосфорилируются. Фосфорилирование ядерных ламинов происходит во многих участках полипептидной цепи и поэтому приводит к их деполимеризации и, как следствие, распаду ядерной ламины. Растворимые ламины А - типа локализованы в цитоплазме, начиная с поздней профазы. Начиная с прометафазы, в цитоплазме обнаруживаются и связанные с мембранными везикулами ламины В-типа (Chaudhary and Courvalin, 1993). На этой стадии также исчезают все поровые комплексы. Происходит фрагментация ядерной оболочки (Zatsepina et al., 1982).

Изучение серийных срезов метафазных клеток не показало наличия контактов между мембранными элементами и хромосомами (Zatsepina et al., 1982). Расположение ламинов, LAPs - белков и нуклеопоринов также остается цитоплазматическим (Chaudhary and Courvalin, 1993, Foisner and Gerace, 1993).

В анафазе ламины и белки ядерных пор также выявляются в цитоплазме (Chaudhary and Courvalin, 1993). Однако LAPs - белки уже начинают связываться с поверхностью деконденсирующихся хромосом (Foisner and Gerace, 1993).

Реконструкция ядерной оболочки происходит, в, основном, в течение поздней телофазы. Ламины А и В типов объединяются в ядерную ламину в течение поздней телофазы и цитокинеза (Chaudhary and Courvalin,

24

1993). Со стадии телофазы в составе ядерной оболочки обнаруживается и дефинитивный комплекс пор. Полный гранулярный слой периферического хроматина (анкоросом) также обнаружен со стадии поздней телофазы. До этого он присутствует только в тех областях ядерной оболочки, которая связана с поверхностью хромосом (Zatsepina et al., 1982).

За последнее время появились сообщения о белках, которые, возможно, включаются во взаимодействие периферического хроматина с ядерной оболочкой. Chaly et all, (1989) охарактеризовали белок периферии, локализованный на нуклеоплазматической поверхности ядерной оболочки и отходящий в цитоплазму параллельно с белками ядерной ламины. Предполагается, что этот белок взаимодействует с ламинами и другими белками ядра и участвует в прикреплении хроматина к ядерной ламине. McKeon et all (1984) описали белок с молекулярной массой 33 кД, названный ими перихромином, локализованный на периферии ядра в интерфазе, окружающий хромосомы во время митоза и обладающий способностью связываться с ДНК.

6. Гипотезы реконструкции контактов ядерной оболочки и хромосом.

По этому вопросу не накоплен достаточный фактический материал, чтобы охарактеризовать конкретные механизмы образования контактов между внутренней мембраной ядерной оболочки и хроматином. Newport and Dunply (1992) показали, что это взаимодействие специфично: обработка либо мембранных везикул, либо хроматина в бесклеточном экстракте яиц Xenopus трипсином препятствует образованию контактов. Кроме того, существуют

25 данные о том, что при формировании микроядер, образующихся вокруг отдельных хромосом, когда увеличивается площадь поверхности ядерной оболочки, не вся ее поверхность занята анкоросомами (Киреев и др., 1988).

Формирование ядерной оболочки в конце митоза энергозависимо: хотя первые стадии реконструкции в экстракте яиц Xenopus (деконденсация хроматина и связывание с деконденсирующимся хроматином мембранных везикул) идут без затраты АТФ, для слияния везикул на поверхности хроматина необходима энергия ГТФ (Newport and Dunply, 1992).

Hutchison et al. (1994) предложили три альтернативных гипотезы реконструкции ядерной оболочки в конце митоза. Согласно первой, ведущая роль в формировании ядерной оболочки принадлежит не связанным с мембранными элементами ламинам А-типа. Они связываются с поверхностью хроматина. Затем с таким модифицированным хроматином могут связаться мембранные везикулы, в состав которых входит ламин В. Такое связывание и служит фактором, инициирующим сборку ядерной оболочки. В пользу данной гипотезы говорит тот факт, что в системе in vitro ламины способны связываться с поверхностью митотических хромосом. (Glass et al., 1990). Кроме того, сборка ядерной оболочки ингибируется на 61% при добавлении антител к растворимым ламинам А и С и на 34% при добавлении антител к связанному с митотическими мембранными везикулами ламину В (Burke, Gerace, 1986). Dabauvalle et al (1991) также сообщили об ингибировании сборки ядерной оболочки вокруг ДНК бактериофага при использовании антител к ламину L3.

Согласно второй гипотезе, мембранные везикулы - предшественники ядерной оболочки связываются с поверхностью деконденсирующегося хроматина независимо от растворимых ламинов. В дальнейшем эти везикулы

26 сливаются и формируется двуслойная ядерная мембрана. Только после этого растворимые ламины мигрируют в ядро и объединяются в ламину. С этой гипотезой согласуется эксперимент Dabauvalle et al. (1990). Антитела против нуклеопоринов не препятствуют сборке ядерной оболочки, но ядро при этом оказывается обедненным ламинами. Кроме того, обнаружен целый ряд белков, которые связываются с деконденсирующимися хромосомами раньше, чем это делают ламины. LAPs - белки, LBR, MAN - антиген, эмерин начинают связываться с поверхностью хромосом уже в анафазе, тогда как ламины -только с поздней телофазы. (Chaudhary and Courvaline, 1993; Foisner, 1993; Chu et al., 1998).

Согласно третьей модели, не существует такой жесткой последовательности событий. Везикулы, ассоциированные с ламинами и предшественники ядерной оболочки, не имеющие в своем составе ламинов, связываются с поверхностью деконденсирующихся хромосом кооперативно и позволяют ядерной оболочке собираться с оптимальной скоростью. Как только ядерная оболочка собралась и в ней присутствуют ядерные поры, растворимые ламинов устремляется в ядро, где они объединяются в ламину из-за высокой концентрации димеров и тетрамеров. Удаление из системы реконструирующего экстракта какого-либо компонента может не препятствовать сборке ядерной оболочки, однако формирующееся ядро будет отличаться от нормального. Если в митотические клетки PtK микроинъецироватъ антитела к ламинам, то, не смотря на то, что ядерная оболочка образуется, и клетка завершает цитокинез, хроматин преимущественно остается в конденсированном состоянии. Формирования интерфазных ядрышек не происходит. Контуры ядерной оболочки в таких клетках более нерегулярны, чем в клетках, в которые не были

27 микроинъецированы антитела. Сходным действием обладают антитела к нуклеороринам, блокирующие транспорт кариофильных белков, в частности ламинов (Benavente et all., 1989). Антитела против LAP2(3, микроинъедированные в метафазные клетки HeLa, также не вызывают заметных изменений в формировании ядерной оболочки или телофазной деконденсации хроматина, однако дальнейший рост объема ядра при переходе от G1 к S и G2 не происходит (Yang and Gerace, 1997). Таким же эффектом обладает при микроинъецировании в метафазные клетки и ламин-связывающий фрагмент LAP2P -несмотря на то, что хроматин в сформированных в таких клетках ядрах деконденсируется и распределение ламинов А и В, а также ассоциированного с ламинами белка 1 не отличается от такого в нормальных клетках, увеличение объема ядер не происходит (Yang and Gerace, 1997). Если же в метафазные клетки микроинъецировать хроматин-связывающий фрагмент LAP2P, то такого ингибирования ядерного роста не происходит. Таким образом, можно предположить, что данный белок необходим не для обеспечения специфического взаимодействия между хроматином и ядерной оболочкой, а для последующей реорганизации ядра уже после формирования ядерной оболочки; а его связывание с хромосомами необходимо для включения в состав формирующегося ядра. С этой гипотезой согласуется тот факт, что для стабильного включения LAP20 в состав ядерной оболочки требуется ламин В (Furukawa et al., 1997), а также факт что в системе in vitro этот белок связывается с одинаковой интенсивностью со всей поверхностью хромосом (Foisher and Gerace ,1993). Таким образом, ни исследование бесклеточных экстрактов, ни даже исследование временной последовательности связывания с хромосомами везикул, содержащих интегральные белки внутренней ядерной

28 мембраны, не позволяет провести однозначный выбор между предложенными гипотезами.

Со стороны цитоплазмы по-крайней мере несколько «растворимых» (т.е. не ассоциированных с мембранами) белков участвуют в регуляции сборки ядерной оболочки. Boman and Wilson (1992), изучая в бесклеточных экстрактах ингибирование сборки ядерной оболочки под действием негидролизуемых аналогов ГТФ, предсказали существование в цитоплазматической фракции белка-регулятора, который в присутствии ГТФ связывается с мембранной фракцией. Последующий гидролиз ГТФ требуется для слияния мембранных везикул. Удаление этого белка из экстракта не приводит к ингибированию сборки ядерной оболочки, что подтверждает его регуляторную роль. Newport and Dunply (1992) показали, что локализованный в цитоплазме нуклеоплазмин участвует в процессе деконденсации хроматина. Необходимость деконденсации хроматина для последующего формирования ядерной оболочки показана в работах Zatsepina et al. (1977). В остановленных на стадии метафазы воздействием колцемида клетках культуры эмбриона кенгуровой крысы ядерная оболочка формируется только после частичной деконденсации хромосом. Ингибиторы топоизомеразы , участвующей в процессах конденсации и деконденсации хроматина, также препятствуют сборке ядерной оболочки (Newport, 1987). Newport объясняет необходимость такой деконденсации тем, что определенные рецепторы митотической хромосомы не экспонированы на поверхность. Однако природа этих рецепторов также остается неизученной - в бесклеточном экстракте яиц Xenopus ядерная оболочка собирается даже вокруг ДНК фага лямбда. (Newport et all, 1987).

29

Определенная роль в сборке ядерной оболочки принадлежит цитоскелету. Мембранные везикулы, ассоциированные с рецептором к ламину В, связываются с хромосомами в областях с более низкой плотностью расположения микротрубочек. Вначале (анафаза А) мембранные везикулы покрывают только небольшую область латеральной поверхности хромосом. Области хромосом, обращенные друг к другу (то есть регионы около центра митотического аппарата), и области дочерних хромосом вблизи полюсов окрашиваются только в поздней телофазе и раннем цитокинезе (Chaudary and Courvalin, 1993). Maison et all (1993) предоставили данные о взаимодействии виментиновых филаментов с ламин-В ассоциированными везикулами в клетках СНО в течении митоза, когда и ламины В и виментин гиперфосфорилированы. Дефосфорилирование обоих белков ослабляет такое взаимодействие.

7. Изучение формирования ядерной оболочки при формировании микроядер.

На сегодняшний день не вызывает сомнения тот факт, что хромосомы и их индивидуальные районы располагаются внутри ядра неслучайным образом (Haaf and Schmid, 1991; Cremer et al., 1993; Ferreira et al., 1997). Этот порядок изменяется в зависимости от физиологического состояния клетки и уровня ее метаболической активности (Ferguson and Ward, 1992). На этом основании неоднократно высказывались предположения о том, что компартментализация клеточного ядра играет существенную роль в регуляции экспрессии индивидуальных генов и репликации ДНК в целом (Carmo - Fonseca et al., 1996;

Хроматин

LBR

Ламин В

Ламины А/С внутренняя ядерная мембрана

LAP2a

LAP2P отебин

30

Lamond and Earnshaw, 1998). Однако механизмы, обеспечивающие кооперативное взаимодействие хромосом в составе единой территории, до сих пор остаются невыясненными. Одним из подходов к решению этой проблемы является анализ структурного и функционального состояния хромосом при их искусственном пространственном разобщении на отдельные группы. В индуцированных условиях пространственное разобщение хромосом может быть достигнуто путем длительной инкубации митотических клеток в присутствии цитостатиков (колцемида, колхицина, колхамина, нокодазола —Алов, 1972; Зацепина, 1977; Hernandez - Verdun, 1989) или путем воздействия на клетки гипотоническими растворами (Zatsepina et al., 1982). Показано, что под действием перечисленных факторов метафазные клетки проявляют способность спонтанно завершать митоз, а индивидуальные хромосомы или группы хромосом деконденсируются и одеваются ядерной оболочкой подобно тому, что происходит в телофазе нормального митоза. В результате, в клетках вместо одного ядра формируются многочисленные мелкие ядра, получившие название "микроядер" ( Sekiguchi et al., 1978).

Одним из критериев нативности применяемого воздействия может служить восстановление структурных и функциональных параметров хромосом после их искусственной деконденсации. Было показано, что микроядра, полученные либо воздействием на клетки цитостатиков (Phillips and Phillips, 1979; Hernandez - Verdun, 1979) либо при помощи гипотонического шока и последующего переноса в среду культивирования (Зацепина и др., 1982; Мухарьямова и др., 1993; Владимирская и др., 1999) обладают многими свойствами ядер в нормальных одноядерных клетках. В частности, микроядра, полученные при двух типах воздействия, способны к транскрипции и

31 репликации ДНК, содержат деконденсированный хроматин и ядрышко -подобные структуры. В связи с этим микроядра являются удобной моделью для изучения механизмов пространственного взаимодействия отдельных хромосом.

Микроядра, полученные в результате гипотонического (15 % раствор Хенкса) и последующего изотонического (возврат в среду культивирования) воздействия, представляют собой удобную модель для детального изучения реконструкции ядерной оболочки вокруг индивидуальных хромосом и формирования контактов между хромосомами и мембранными везикулами. Процесс сборки ядерной оболочки был исследован на световом и ультраструктурном уровне. Было показано, что замещение нормальной культуральной среды на 15% раствор Хенкса приводит к быстрой и значительной деконденсации хромосом. В течение 1-5 минут плотность хромосом резко уменьшается, они увеличиваются в размерах и перестают выявляться в фазово - контрастный микроскоп как обособленные структуры. Однако через 30 - 40 минут начинается реконденсация хромосом и они вновь становятся хорошо видны. При этом метафазная пластинка не восстанавливается и анафазное движение хромосом к полюсам не наступает. Хромосомы остаются разбросанными по клетке. При переносе клеток в культуральную среду через 1 час после начала гипотонического воздействия (то есть на стадии реконденсации) в течение 1 минуты наблюдается резкое сжатие клеток и быстрая конденсация хромосом (Киреев и др., 1988).

Через 10-15 минут начинается постепенное набухание клеток и их возврат к исходному состоянию. Одновременно начинается вторичная деконденсация митотических хромосом. Через 30 минут после возврата в полную среду культивирования хромосомы приобретают поперечную

32 исчерченность. Через 1.5-2 часа процесс деконденсации завершается, и в подавляющем большинстве клеток, находящихся в метафазе на момент гипотонического воздействия, возникают многочисленные микроядра (Киреев и др., 1988).

Стадии формирования ядерной оболочки вокруг индивидуальных хромосом были изучены на ультраструктурном уровне. В первые минуты после возврата клеток в среду культивирования происходит резкая компактизация хромосом. Через 1-2 минуты после переноса клеток в изотоничную среду хромосомы представляют собой плотные структуры с четким контуром. В составе хромосом отчетливо выявляются хромонемные элементы толщиной около 100 нм, которые уложены равномерно во всем объеме хроматиды, как по ее длине, так и в поперечнике. На поверхности хромосом хромонемные элементы образуют петли (Киреев и др., 1988).

При дальнейшей инкубации митотических клеток в изотонической среде метафазные хромосомы начинают деконденсироваться. Деконденсация происходит неравномерно по длине хромосом. Через 30 минут после переноса в изотоничную среду микроядра, все еще сохраняя удлиненную форму, приобретают поперечную исчерченность. На этом этапе завершается замыкание ядерной оболочки вокруг отдельных хромосом или их небольших групп. Микроядра интерфазного типа наблюдаются уже через 2-3 часа после возврата в среду культивирования. К этому времени большинство микроядер принимает сферическую форму. Основная масса хроматина образовавшихся микроядер находится в деконденсированном состоянии. Такую же структуру принимают и ядра клеток, находившихся в интерфазе во время действия гипотонии. Однако наблюдаются некоторые отличия в структуре микроядер, которые касаются

33 организации ядерной оболочки. Оболочка микроядер значительно обеднена ядерными порами, периферический слой гетерохроматина занимает в них только 79 + 2.7% от общей поверхности микроядер. В то же время в контрольных клетках контакты периферического слоя гетерохроматина с ядерной оболочкой занимают всю поверхность ядра. Это может быть связано с увеличением суммарной поверхности микроядер, которая в клетках с числом микроядер около 30 увеличивается по сравнению с площадью поверхности интерфазного ядра в G2 периоде в одноядерной клетке в 4.2 раза. В то же время поверхность ядерной оболочки, контактирующая с периферическим гетерохроматином, увеличивается в 3.2 раза (Зацепина и др., 1982; Кирев и др., 1988; Владимирская и др., 1998).

В целом, по своей ультраструктуре микроядра, возникающие в клетках СПЭВ в результате гипотонического воздействия, практически не отличаются от нормальных интерфазных ядер. На этом основании можно предположить, что произошла полная структурная реконструкция ядерной оболочки вокруг отдельных хромосом (Киреев, 1988). Сходные данные получены и для клеток HeLa (Филимоненко, Гозак, неопублик. данные).

8. Перемещение участков хромосом во время интерфазы.

В последнее время исследователи все больше обращаются к вопросам надмолекулярной организации интерфазного ядра. В отличие от прежних лет, когда ядро рассматривалось в его статическом состоянии, сейчас особый интерес концентрируется на исследовании динамических изменений ядерной организации в связи с функционированием генома. В настоящее время

34 показано, что локусы хромосом способны изменять свою локализацию в интерфазном ядре. По данным Ferguson and Ward (1992) хромосома, в зависимости от стадии клеточного цикла может по-разному располагаться в интерфазном ядре и, как следствие, образовывать контакты с ядерной оболочкой различными участками. В частности, хромосома 8 Т - лимфоцитов человека в G1 периоде ассоциирована с ядерной оболочкой центромерным районом, а ее плечи обращены внутрь ядра. При переходе клеток в G2 наблюдается переориентация хромосомы так, что центромера располагается внутрь ядра.

Belmont et al. (1998) изучили динамику искусственно встроенного участка гетерохроматина HSR (homogeneously staining region) в клеточном цикле. В работе была получена культура, содержащая тандемный повтор lac -операторов, а также экспрессирующая GFP (green fluorescent protein) - lac repressor - NLS (nuclear localization signal) белок. Данная система позволяет визуализовать локализацию тандемного HSR повтора в живых клетках. Было показано, что в процессе телофазы - G1 изначально конденсированный участок хроматина, локализованный вблизи ядерной оболочки, деконденсируется. Такая деконденсация сопровождается изменением локализации HSR - после деконденсации больший фрагмент HSR располагается внутри ядра. В позднем G1 HSR вновь конденсируется и обнаруживается вблизи ядерной оболочки. Такое состояние сохраняется до средней S - фазы, во время которой HSR вновь деконденсируется. В это время HSR визуализуется внутри ядра и включает бромдезоксиуридин. В дальнейшем HSR вновь реконденсируется и локализуется вблизи ядерной оболочки до начала конденсации хромосом в

35 профазе. Таким образом, показано, что блоки гетерохроматина способны изменять свое расположение в ядре, например, в связи с репликацией.

Изменение локализации хромосом может быть связано с изменением физиологического состояния клетки. В кортикальных нейронах Х-хромосома располагается вблизи ядерной оболочки, однако в районах повышенной физиологической активности, связанных с эпилепсией, в 45% клеток X -хромосома занимает центральное положение в ядре (Ferguson and Ward, 1992).

Brown et al. (1999) показали, что дифференцировка также может сопровождаться изменением локализации хромосомных локусов. В процессе митогенной стимуляции В - лимфоцитов наблюдаются перемещения лямбда 5, CD8 и Rag - генов (которые экспрессируются в нестимулированных лимфоцитах) к центромерам. Такая релокализация сопровождается экспрессией, накоплением в ядре и накоплением в центромерных районах белка Ikaros.

Таким образом, перемещение участков хроматина внутри ядра сопровождает различные внутриклеточные и внутриядерные процессы: изменения в физиологической активности клетки, репликацию и дифференцировку. Представленные данные позволяют предположить и существование определенных белков, принимающих участие в подобной релокализации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Список сокращений: DAPI - 4', 6 - Diamidino - 2' - phenylindole; DTT -dithiotreitol; EDTA - ethylenediaminetetraacetate; PBS - phosphate buffer solution; PMSF - phenylmethylsulfonyl fluoride; TEA - triethanolamine; TBS - tris buffer solution

1.Выделение ядер.

Ядра, ядерные оболочки с анкоросомами и внутриядерный хроматин получали по стандартной методике Прусова и др. (1982).

В экспериментах использовали белых нелинейных крыс весом 200 - 250 граммов. При выделении ядер использовались следующие растворы: Раствор А: 20 мМ TEA, 80 мМ КС1, 20 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 8% сахароза, 0,2 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF Раствор В: 20 мМ TEA, 80 мМ КС1, 20 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 2,3 М сахароза, 0,2 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF

Все операции проводили при +4*С. Печень разрушали и освобождали от соединительной ткани. Разрушенную ткань разводили пятью объемами раствора А и гомогенизировали в гомогенизаторе из нержавеющей стали с тефлоновым пестиком при скорости вращения пестика 1500 об/мин. Гомогенат центрифугировали при 1000g в течении 10 минут. Супернатант сливали, а осадок смешивали с четырьмя объемами раствора В. Суспензию

37 центрифугировали при 20000g в течение 50 минут. После центрифугирования флотировавший материал отбрасывали, стенки промывали дистиллированной водой с помощью стеклянной палочки, а осадок промывали в растворе 20 мМ TEA, 2 mM MgCb.

Суспензию затем осаждали при 1000g в течение 10 минут.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Курчашова, Светлана Юрьевна

ВЫВОДЫ:

1. Гипотоническое воздействие на митотические клетки индуцирует взаимодействие белков, участвующих в сборке ядерной оболочки, с хромосомами.

2. Изучение динамики формирования ядерной оболочки вокруг индивидуальных хромосом позволило установить, что белки ядерной оболочки взаимодействуют с хромосомами в следующей последовательности: сначала ламины А/С и LAP2a, затем ламины В.

3. При искусственной деконденсации хромосом различные белки ядерной оболочки приобретают аффинитет к разным участкам хромосом. Ламины взаимодействуют с областями на поверхности хромосом, тогда как LAP2a локализуется в дискретных сайтах, локализованных по всему объему хромосомы. Таким образом, связывание LAP2a с хромосомами не является достаточным условием для индукции ассоциации с хромосомами белков ламины.

4. Гипотоническое и последующее изотоническое воздействия на живые клетки индуцируют образование локальных выростов ядерной оболочки -«ядерных почек» в клетках, находящихся в S-фазе клеточного цикла. Образование почек связано с локальными изменениями в организации ламины, которые возникают в связи с дефицитом ламина В. Обнаружен феномен направленной миграции хроматина в область почки. На этом основании предложена гипотеза о связи состояния ядерной ламины с пострепликативной организацией хроматина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Курчашова, Светлана Юрьевна, 2001 год

1. Алов И. А. «Цитофизиология и патология митоза.» 1972. Москва, «Медицина».

2. Дудник О. А. Зацепина О. В., Ченцов Ю. С. 1993. Влияние растворов низкой ионной силы на структуру и функцию ядрышек в живых клетках СПЭВ.// Цитология. Том 35 (5), стр 10-15.

3. Зацепина О. В. , Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. 1982. Образование ядерной оболочки вокруг метафазных хромосом под действием гипотонии. // Цитология., том 24 (1), стр. 5-9.

4. Зацепина О. В., канд. диссертация, 1977.

5. Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю. , Ченцов Ю.С. 1988. Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ при их обратимой искусственной деконденсации in vivo. // Цитология, том 30 (8), стр. 926 -932.

6. Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю. , Ченцов Ю.С. 1990. Динамика структурной реконструкции митотических хромосом после их искусственной деконденсации in vivo. // Цитология, том 32 (5), стр. 449 -453

7. Онищенко Г. Е., Ченцов Ю.С. 1974. Гранулярный слой периферического хроматина интерфазного ядра. 1. Ультраструктура. // Цитология. Т. 16. стр. 675-678.90

8. Онищенко Г. Е., Ченцов Ю.С. 1974. Гранулярный слой периферического хроматина интерфазного ядра. 2.Цитохимические особенности и свойства. // Цитология. 1974. Т.16. стр. 931-935.

9. Прусов А. Н., Файс Д., Поляков В.Ю., Ванюшин Б.Ф. 1982. Характеристика связанного с ядерной оболочкой хроматина из клеток печени крысы.// Биохимия. Т.47. вып.З. стр. 502-510.

10. Прусов А. Н., Файс Д., Поляков В. Ю. 1989. Исследование периферических гранул хроматина анкоросом.//Биохимия. Т.54. вып.11. стр. 1838-1846.

11. Мухарьямова К.Ш., Зацепина О.В. 1993. Структурные и иммуноцитохимические особенности ядрышек, формирующихся в условиях пространственного разобщения ядрышкообразующих хромосом. Цитология. Т. 35. N5. стр. 3-9.

12. Мухарьямова К.Ш., канд. диссертация. 1999.

13. Aaronson, R. P., and Blobel, G. 1975. Isolation of nuclear pore complexes in association with a lamina. // Proc. Natl Acad. Sci USA v.72, p. 1007-1011

14. Aebi, U., Coch J., Buhle I., Gerace L., 1986. The nuclear lamina is a meshwork of intermediate type filaments. // Nature, v. 302, p.676-681.

15. Beck, L. A., Hosick, T. J., and Sinensky, M. 1990. Isoprenylation is required for the processing of the lamin A precursor. // J. Cell Biol. V. 110, p. 1489-1499.

16. Belmont A. S., Y. Zhai and A. Thilenius. 1993. Lamin В distribution and association with peripheral chromatin revealed by optical sectioning and electron microscope tomography. J. Cell Biol. v. 123, p. 1671-1685.

17. Benavente R., Krohne G. 1986. Involvement of nuclear lamins in postmitotic reorganization of chromatin as demonstrate by microinjection on lamina antibodies. // J. Cell Biol. V. 103, p. 1847-1854.

18. Benavente R., Scheer U. and Chaly N. 1989. Nucleoplasmatic sorting of macromolecules following mitosis. Fate of nuclear constituent after inhibition of nuclear pore complex formation. // Eur. J. Cell Biol. V. 50, p.210-219.

19. Boman A. L., Taylon Т. C., Melancon P., Wilson K. L. 1992. A role for ADP -rybosylation factor in nuclear vesicle dynamics. // Nature. V. 358. N 6386, p. 512 -514.

20. Bridger, J.M., Kill I.R., O'Farell, M., and Hutchison, C.J. 1993. Internal lamin structures within G1 nuclei of human dermal fibroblasts. // J. Cell Sci. V. 104, p.297-306.

21. Brinkley B. R., Cox S. M., Pepper P. A. 1980. Structure of mitotic apparatus and chromosomes after hypotonic treatment of mammalian cells in vitro. // Cytogenet. Cell Genet. V. 180. N 26 (2 4), p. 165 -174.

22. Broers, J.L., Machiels B.M., Kuijers, H.J. Smedts F., van den Kieboom R., Raymond Y., and Ramaekers, F. C. 1997. A- and B- type lamins are differentially expressed in normal human tissues. // Histochem. Cell. Biol., V. 107., p. 505-517.

23. Brown К. E., Baxter J., Graf D., Merkenschlager M., and Fisher A. 1999. Dynamic Repositioning of Genes in the Nucleus of Lymphocytes Preparing for Cell Division. // Molecular Cell. V. 3, N 207-217.92

24. Burke В., Gerace I. 1986. A cell free system to study reassembly of the nuclear envelope at the end of mitosis. // Cell. v. 44, p. 639-652.

25. Carmo Fonseca M., Cunha C., Custodio N., Carvalho C., Jordan P., Ferreira J., Parreira L. 1996. The topology of chromosomes and genes in the nucleus. // Exp. Cell Res. V. 229. Pt 2, p. 247 - 252.

26. Chaly N., Bladon Т., Setterfield G., Little G.E., Kaplan G.E. 1989. Ultrastrustural localisation of nuclear antigens during interphase in mouse 3T3 fibroblasts. //J. Cell Biol. V. 63.,p.661-671.

27. Chaudhary N. And Courvalin J.C. 1993. Stepwise reassembly of the nuclear envelope at the end of mitosis.// J. Cell Biol. V. 122. N2. P. 295-306.

28. Chelsky, D., Olson, J. F., and Koshland, D. J. 1987. Cell cycle dependent methyl esterification of lamin В. И J. Biol. Chem. V. 262, p. 4303-4309.

29. Chu A., Rassadi R., Stochaj U. 1988. Yelcro in the nuclear envelope: LBR and LAPs. // FEBS Letters. V. 441, p. 165 169.

30. Co lias, P., Courvalin, J. C., and Poccia, D. 1996. Targeting of membranes to sea urchin sperm chromatin is mediated by a Lamin В receptor-like integral membrane protein. // J. Cell BioL V.135, p. 1715-1725.

31. Collas P., Thompson L., Fields A. P., Poccia D. L. and Courvalin J. C. 1997. Protein kinase С mediated interphase lamin В phosphorilation and solubilisation. // J. Biol. Chem., V. 272., p. 21274-21280.

32. Collard, J. F., and Raymond, Y. 1990. Transfection of human lamins A and С into mouse embryonal carcinoma cells possessing only lamin Bl. // Exp. Cell Res. V. 186, p. 182-187.

33. Dabauvalle M. C., Look K., Scheer U. 1990. Identification of a soluble precursor complex essential for nuclear pore assembly in vitro. // Chromosoma. V. 100. N 1, p. 56 66.

34. Dabauvalle M. G., Look K., Merker H., Scheer U. 1991. Spontaneous assembly of pore complex containing membranes ("annulae lamellae") in Xenopus eggs extract in the absence of chromatin. // J. Cell Biol. V. 112, p. 1073 - 1082.

35. De Boni U., Mintz A. N. 1986. Curvilinear, three dimensional motion of chromatin domains and nucleoli in neuronal interphase nuclei. // Science. V. 234 N4778, p. 863-866.

36. Ellis J. A., Graxton M., Yales J. R.W. and Kendrick-Jones J. 1998. Aberrant intracellular targeting and cell cycle dependent phosphorylation of emerin contribute to the EMD phenotype. // J. Cell Sci. V. 111. P.781-792.

37. Fais D., Prusov A.N. and Polyakov V. Yu. 1989. The anchorosome, a special chromatin granule for the anchorage of the interphase chromosome to the nuclear envelope. // Cell Biol. Intern. Rep. V. 13. N9 P.747-758.

38. Ferreira P., Paoletta G., Gamos G., Lamond A. I. 1997. Spatial organization of large scale chromosome domains in the nucleus: a mugnified view of single chromosome territories. // J. Cell Biol. V. 130., p. 1597 - 1610.

39. Fisher, D, Z., Chaudhary, N., and Blobel, G. 1986. CDNA sequencing of nuclear lamins A and С reveals primary and secondary structural homology to intermediate filament proteins. // Proc. Natl Acad. Sci USA , V. 83, p. 64506454.

40. Foisner R. Gerace L. 1993. Integral Membrane Proteins of the Nuclear Envelope Interact with Lamins and Chromosomes and Binding is Modulated by Mitotic Phosphorilation. // Cell. V.73. P. 1267-1279.

41. Ferguson M., Ward D.C. 1992. Cell cycle dependent chromosomal movement in pre-mitotic human T-lymphocyte nuclei.// Chromosoma. V. 101. N9. P. 557-565.

42. Franke W. W., Deumling В., Zentgraf H., Falk H., Rae P. M. 1973. Nuclear membrane from mammalian liver: characterization of the membrane attached DNA. Exp. Cell Res. V. 81, p. 365 - 392.

43. Fricker M., Hollinshead M., White N and Vaux D. 1997. Interphase nuclei of many mammalian cell types contain deep, dynamic tubular membrane bound invaginations of the nuclear envelope. J. Cell Sci. V. 136, p. 531 - 544.95

44. Furukawa К and Hotta Y. 1993. CDNA clonning of a germ specific lamin B3 from mouse spermatocytes and analysis of its functions by ectopic expression in somatic cells. // EMBO J., V. 12, p. 97 106.

45. Furukawa K., Inagaki H. And Hotta Y. 1994. Identification and cloning of an mRNA coding for a germ cell specific A type lamin in mice. // Exp. Cell Res., V. 112, p. 426-430.

46. Furukawa K., Pante N., Aebi U., Gerace L. 1995. Cloning of cDNA for lamina-associated polypeptide 2 (LAP2) and identification of regions that specify targeting to the nuclear envelope.// EMBO J. V. 14. N8. P. 1626-1636.

47. Furukawa K., Glass C., Kondo T. 1997. Characterization of the chromatin binding activity of lamina-associated polypeptide (LAP2). // Biochem. Biophys. Res. Com. V.238. N1. P.240-246.

48. Furukawa K. 1999. LAP 2 binding protein 1 (L2BP1/BAF) is a candidate mediator of LAP2-chromatin interaction. // J. Cell Sci. V.l 12. N15. p. 2485-2492.

49. Gant T.M. Wilson K.L. 1997. Nuclear assembly. // Annu Rev. Cell Dev. Biol. V.l7, p.669-695.

50. Gerace L., Blum A. And Blobel G. 1978. Immunocytochemical localization of the major polypeptids of the nuclear pore complex lamina fraction: Interphase and mitotic distribution. // J. Cell Biol., v.79, p.546 - 566.

51. Gerace L., Burke B. 1988. Functional organization of the nuclear envelope. // Annu. Rev. Cell Biol., v.4 p 335-374.96

52. Gerage L., , Blobel G. 1990. The nuclear envelope lamina is reversibly depolymerized during mitosis. // Cell, v. 19, p. 277-288.

53. Geraud G., Laquerriere F., Masson C., Arnoult J., Labidi В., Hernandez Verdun D. 1989. Three- dimensional organization of micronuclei induced by colchicine in PtKl cells. // Exp. Cell. Res, V. 181, N1, p. 27-39.

54. Goldman A. E. Moir R. D., Montag L. M., Stewart M and Goldman R. D. 1992. Pathway of incorporation of microinjected lamin A into the nuclear envelope. // J. Cell Biol., V. 119, p. 725-735.

55. Glass J.R. and Gerace L. 1990. Lamin A and С Bind and Assemble at the surface of mitotic Chromosomes. // The Journal of Cell. Biol. 1990. V.lll. P.1047-1053.

56. Goldberg M., Harel A, Gruenbaum Y. 1999. The nuclear lamina: molecular organization and interaction with chromatin. // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. V. 9. P.285-293.

57. Goldberg, M., Lu, H., Ashery-Padan, R., Weiss, A. M., Stuurman, N., Fisher, P. A., Gruenbaum, Y., and Wolfiier, M. F. 1998. Interactions among Drosophila nuclear envelope proteins: lamins, otefin and Ya. // Submitted for publication.

58. Goldman, A. E., Moir, R. D., Montag, L. M., Stewart, M., and Goldman, R. D. 1990. Pathway of incorporation of microinjected lamin A into the nuclear envelope. // J. Cell Biol. V.l 19, p.725-735.

59. Goss, V L., Hocevar, В -A., Thompson, L. J., Stratton, C. A., Burns, D. J., and Fields, A. P. 1994. Identification of nuclear protein kinase С as a mitotic lamin kinase. //J.Biol. Chem. V. 269, p. 19074-19080

60. Guilly, M. N., Kolb, J. P., Gosti, F., Godeau, F., and Courvalin, J. C. 1990. Lamins A and С are not expressed at early stages of human lymphocyte differentiation.//Exp. Cell Res. V. 189,p.l45-147.97

61. Haaf Т., Schmid M. 1991. Chromosome topology in interphase nuclei. // Exp. Cell Res. V. 192., p. 325-332.

62. Heitlinger, E., Peter, M., Hdner, M., Lustig, A., Aebi, U., and Nigg E. A. 1991. Expression of chicken lamin B2 in Escherichia coli: Characterization of its structure, assembly, and molecular interactions. // J. Cell Biol. V.113, p .485495.

63. Hernandez Verdun D., Bouteille M., Ege Т., Ringertz N. R. 1979. Fine structure of nucleoli in micronucleated cells. // Exp. Cell Res. V. 124. N 2, p. 223 - 235

64. Hozak, P., Sasseville, A. M. J., Raymond, Y., and Cook, P. R. 1995. Lamin proteins form an internal nucleoskeleton as well as a peripheral lamina in human cells.// J. Cell Sci. V.108, p. 635-644.

65. Hutchison C.J., Bridger J.M., Cox L.S. and Kill I. R. 1994. Weaving a pattern from disparate threads: lamin function in nuclear assembly and DNA replication. // J. Cell Sci. V. 107, p. 3259-3269.

66. Jessen F., Hoffman E. K. 1992. Activation of the Na+/ K+/C1- cotransport system by reorganization of actin filaments in Ehrlich tumor cells. // Biochim Biophis. Acta. V. 1110. N2, p. 199-201.

67. Jost E. And Johnson R. T. 1981. Nuclear lamina assembly, synthesis and disaggregation during the cell cycle in synchronized HeLa cells. // J. Cell Sci. V. 47, p. 25-53.

68. Karpen G.H. 1994. Position effect variegation and the new biology of heterochromatin. // Curr. Opin. Genet. Dev. V.4. N2. P. 281 -291.

69. Kill I. R., Hutchison C.J. 1995. S phase phosphorilation of lamin B. // FEBS Letters, V.377, p.26-30.

70. Kitten, G. Т., and Nigg, E. A. 1991. The CaaX motif is required for isoprenylation, carboxyl methylation, and nuclear membrane association of lamin B2. // J. Cell BioL V. 113, p. 13-23.

71. Krohne G., Waizenegger J. and Hoger T.N. 1989. The conserved carboxy-terminal cysteine of nuclear lamins is essential for lamin association with the nuclear envelope. //J. Cell Biol., V. 109, p. 2003-2011.

72. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4. // Nature. V. 227, p. 680-685.

73. Lamond A. I. And Earnshaw W. C. 1998. Structure and function in the nucleus. // Science. Y. 280 (5363), p. 547 553.

74. Loewinger, L., and McKeon, F. 1998. Mutations in the nuclear lamin proteins resulting in their aberrant assembly in the cytoplasm. // EMBO J. V.7, p. 23012309.

75. Luderus M.E.E., Graaf A., Mattia E., Blaauwen J.L., Grande M.A., Jong L. And Van Driel R. 1992. Binding of Matrix Attachment Regions to lamin B. // Cell, V.70, p.949-959.

76. Luderus M. E., den Blaauwen J. L., de Smit O.J., Compton D.A. , van Driel R. 1994. Binding of matrix attachment regions to lamin polymers involves single -stranded regions and the minor groove. // Mol. Cell Biol. V.14, N9, p.6297-6305.

77. Manila!, S., Nguyen, Т. M., Sewry, C. A., and Morris, G. E. 1996. The Emery-Dreifuss muscular dystrophy protein, emerin, is a nuclear membrane protein. // Hum. Mol. Genet. V. 5, p. 801-808.

78. Martin, L., Crimaudo, C., and Gerace, L. 1995. CDNA cloning and characterization of lamina-associated polypeptide 1С (LAP1C), an integral protein of the inner nuclear membrane. //J. Biol Chem. V. 270, p. 8822-8828.

79. McKeon F.D., Tuffaneli D.L., Kobaiashi S., Kirschner M.W. 1984. The redistribution of a conserved nuclear protein during the cell cycle suggest a parthway for chromosome condensation. // Cell. V. 36, p. 83-92.

80. McKeon F. D., Kirshner M. W. And Caput D. 1986. Homologies in both primary and secondary structure between nuclear envelope and intermediate filaments assembly. // J. Biol. Chem., V. 269, p. 18679 18685.

81. McKeon F. 1991. Nuclear lamin proteins: domains required for nuclear targeting , assembly, and cell cycle-regulated dynamics. // Curr. Opin. Cell Biol. V.3. Pt 1., p. 82-86.

82. Meier, J., Campbell, К. H., Ford, С. C., Stick, R., and Hutchison, C. J. 1991. The role of lamin LIII in nuclear assembly and DNA replication, in cell-free extracts оfXenopus eggs. II J. Cell Sci. 1991. V. 98, p. 271-279.

83. Meier J., Georgatos S. D. 1994. Type В lamins remain associated with the integral nuclear envelope protein p58 during mitosis: implication for nuclear reassembly. // EMBO J., V. 15. N 13. Pt. 8, p. 1888-1898.

84. Moir, R. D., Donaldson, A. D., and Stewart, M. 1991. Expression in Escherichia coli of human lamins A and C: Influence of head and tail domains on assembly properties and paracrystal formation. // J. Cell Sci. V.99, p. 363-372.

85. Moir, R. D., Montaglowy, M., and Goldman, R. D. 1994. Dynamic properties of nuclear lamins: Lamin В is associated with sites of DNA replication. // J. Cell Biol. V.125, p. 1201-1212.

86. Moir R. D., Spann T.P., Goldman R.D. 1995. The dynamic properties and possible functions of nuclear lamins. // Int. Rev. Cytol. V.162B, p.141-182.

87. Newport, J. 1987. Nuclear reconstitution in vitro: stages of assembly around protein-free DNA. // Cell. V. 48, p. 205-217.

88. Newport, J. W, Wilson, K. L., and Dunphy, W G. 1990. A lamin-independent pathway for nuclear envelope assembly. // J. Cell BioL V. 111, p. 2247-2259.101

89. Newport, J. W, and Dunphy, W. G. 1992. Characterization of memrane binding and fusion events during nuclear envelope assembly at the using of purified components. // J. Cell Biol. V. 116, p. 295-306.

90. Nigg, E. A. 1989. The nuclear envelope.//Curr. Opin. Cell Biol. V.l, p. 435-440.

91. Nigg E.A. 1992. Assembly and cell cycle dynamics of the nuclear lamina. // Semin Cell Biol. V.3. N4. p. 245-53.

92. Nigg, E. A., Kitten, G. Т., and Vorburger, K. 1992. Targeting lamin proteins to the nuclear envelope: The role of CaaX box modifications. // Biochem. Soc. Trans. V. 20, p. 500-504.

93. Osman, M., Paz, M., Landesman, Y., Fainsod, A., and Gruenbaum, Y. 1990. Molecular analysis of the Drosophila nuclear lamin gene. // Genomics. V. 8, p. 217-224.

94. Ottavio Y., Gerage L. 1995. Phosphorilation of the nuclear lamins during interphase and mitosis. // J. Biol. Chem. V. 260. N 1, p. 624 632.

95. Paddy M.R., Belmont A.S., SaumWeber H., Adard D.A. and Sedat J.W. 1990. Interphase nuclear envelope lamins form a discontinuous network that interacts with only a fraction of the chromatin in the nuclear periphery. // Cell. V.62, p. 89-106.

96. Paullin-Levaseur M., Deboraux L., Blake M.G., Rouleau L. 1996. The MAN antigens are not lamin constituent of the nuclear lamina in vertebrate cells. // Chromosoma, V. 104, p. 367-379.

97. Peter, M., Nakagawa, J., Doree, M., Labbe, J. C., and Nigg, E. A. 1990. In vitro disassembly of the nuclear lamina and M phase-specific phosphorylation of lamins by cdc2 kinase.//Cell. V.61, p. 591-602.

98. Peter, M., and Nigg, E. A. 1991. Ectopic expression of an A-type lamin does not interfere with differentiation of lamin A-negative embryonal carcinoma cells. // J. Cell Sci. V.100, p. 589-598.

99. Peter, M., Sanghera, J. S., Pelech, S. L., and Nigg, E. A. 1992. Mitogen-activated protein kinases phosphorylate nuclear lamins and display sequence specificity overlapping that of mitotic protein kinase p34cdc2. // Eur. J. Biochem V.205, p. 287-294.

100. Phillips S. G., Phillips D. M., 1979. Nucleolus like bodies in micronuclei of cultured Xenopus Cells. // Exp. Cell Res., V. 120., p. 295 - 306.

101. Powell L. and Burke B. 1990. Internuclear exchange of an inner nuclear membrane protein p55 in heterokaryons: In vivo evidence for the interaction of p55 with the nuclear lamina. J. Cell. Biol. V. 111, p. 2225 2234.

102. Pyrpasopolou A., Meier J., Maison C., Simos G and Georgatos S. D. 1996. The lamin В receptor (LBR) provides essential chromatin docking sites at the nuclear envelope. // EMBO. V. 15 N. 24., p. 7108 7119.

103. Rober, R. A., Weber, K., and Osborn, M. 1989. Differential timing phosphorylates of nuclear lamin A/C expression in the various organs of the mouse embryo and the young animal: A developmental study. // Development V. 105, p. 365-378.

104. Rober, R. A., Sauter, H., Weber, K., and Osborn, M. 1990. Cells of the cellular immune and hemopoietic system of the mouse lack lamins A/C: Distinction versus other somatic cells. // J. Cell Sci V. 95, p. 587-598.

105. Ronne M. 1989. Chromosome preparation and high resolution banding techniques. // J. Dairy Sci. V. 72. N 5, p. 1363 1377.

106. Schaffner W. And Weismann C. 1973. A rapid sensitive and specific method for the determination of proteins in dilute solution. // Analytical Biochemistry. V.56, p. 502-514.

107. Sekiguchi Т., Shelton K., Ringertz N. S. 1978. DNA content of microcells prepared from rat kangoroo and mouse cells. // Exp. Cell Res. V. 113, p.247 -258.

108. Senior A., Gerace L. 1998. Integral membrane proteins specific to the inner nuclear membrane and accosiated with nuclear lamina. // J. Cell Biol. V.107. N6 Ptl, p. 2029-2036.

109. Sharakhov I.V., Bogachev S.S., Fisher P.A. 1997. Chromosomal localization of M/SAR from DNA of the clone lambda 20P1.4 in Drosophila melanogaster salivary glands.//Genetica. V.33.N2, p. 277-280.

110. Shimizu N. Itoh N., Utiyama H., Wahl G.M. 1998. Selective Entrapment of Extrachromosomaly Amplified DNA by Nuclear Budding and Micronucleation during S Phase.//J. Cell Biol., V. 140, N6, p. 1307-1320.

111. Simos, G., Maison, C., and Georgatos, S. D. 1996. Characterization of pl8, a component of the lamin В receptor complex new integral membrane protein of the avian erythrocyte nuclear envelope. // J. Biol. Chem V.271, p. 12617-12625.

112. Small K., Jber J., Warren S. T. 1997. Emerin deletion reveals a common X -chromosome inversion mediated by inverted repeats. // Nat. Genet. V. 16. N 1, p. 96-99.

113. Soderqvist H., Jiang W.Q. Ringerts N., Hallberg E. 1996. Formation of nuclear bodies in cells, overexpressing the nuclear pore protein POM 121. // Exp. Cell Res. V.225. N1. p. 75-84.

114. Soullam, В., and Warman, H. J. 1995. Signals and structural features involved in integral membrane protein targeting to inner nuclear membrane. // J. Cell Biol. 1995. V. 130, p. 15-27.

115. Spann, T. P., Moir, R. D., Goldman, A. E., Stick, R., and Goldman, R. D. 1997. Disruption of nuclear lamin organization alters the distribution of replication factors and inhibits DNA synthesis. // J. Cell Biol. V. 136, p. 12011212.

116. Spector D. L. Macromolecular domains within cell nucleus. 1993. // Annu. Rev. Cell Biol. V.9, p. 265-315.

117. StuurmanN. Heins S., Aebi U. 1998. Nuclear lamins: their structure, assembly and interactions. // J. Struct. Biol. V.122, p .42-66.

118. Taniura H., Glass C., Gearce L. 1995. A chromatin binding site in the tail domain of nuclear lamins that interacts with core histones. // J. Cell. Biol. V.131. N1. P.33-44.

119. Thompson, L. J., and Fields, A. P. 1996. Beta2 protein kinase С is required for the G2/M phase transition of cell cycle. // J. Biol Chem. V. 271, p. 1504515053.

120. Ulitzur N., Harel A., Feistein N., Gruenbaum Y. 1992. Lamin activity is essential for nuclear envelope assemblyin a Drosophila embryo cell-free extract. // J. Cell. Biol. V. 119.N1, p. 17-25.

121. Vladimirskaya E.A., Kireyev I.I., Prusov A.N. and Fais D. 1999. Spatial Localization of Chromosome-nuclear envelope Interaction Sites. .// Membr. Cell Biol. V. 12. N6, p. 857-869.

122. Vlcek S., Hervig J., Dechat T. And Foisner R. 1999. Functional diversity of LAP2a and LAP2f3 in postmitotic chromosome association is caused by an a-specific nuclear taggeting domain.// EMBO. V. 18. N22, p.6370-6384.

123. Wreggett K.A., Hill F., James P.S., Hutchings A., Butcher G.W. and Singh P.V. 1994. A mammalian homologue of Drosophila Heterochromatin 1 (HP1) is a component of constitutive geterochromatin. //Cytogenet. Cell.Cenet.V.66, p. 99103

124. Worman HJ, Yuan J., Blobel G., Georgatos SD. 1998. A lamin В receptor in the nuclear envelope. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.85. N22, p.8531-8534.

125. Yang L., Guan T and Gerace L. 1997. Lamin binding fragment of LAP2 inhibits increase in nuclear volume during the cell cycle and progression into S - phase. // J. Cell. Biol. V. 139, p. 1077 -1087.

126. Ye Q. and Worman HJ. 1994. Primary Structure Analysis and Lamin В and DNA Binding of human LBR, an Integral Protein of the nuclear Envelope Inner Membrane.// The Journal of Biol. Chem. V.269. N15, p. 11306-11311.

127. Ye Q., Worman HJ. 1996. Interaction between an integral protein of the nuclear envelope inner membrane and human chromodomain proteins homologous to Drosophila HP1. // J. Biol. Chem. V. 271. N25, p. 14653-14656.

128. Ye Q., Callebaut I., Pezhman A., Courvalin J.C. and Worman H.J. 1997. Domain specific Interactions of human HP1 type Chromodomain Protein and Inner Nuclear Membrane Protein LBR.//JBC. V.272. N.23, p.14983-14989.

129. Zatsepina O.V., Polyakov V. Yu., Chentsov Yu. S. 1982. Nuclear envelope formation around metaphase chromosomes: chromosome decondensation and nuclear envelope reconstitution during mitosis. // European Journal of Cell. Biol. V.26, p. 277-283.

130. Zatsepina O.V., Dudnik O.A., Chentsov Y.S., Thiry M., Spring H., Trendelenburg F. 1997. Reassembly of Functional Nucleoli Following in sity Unraveling by Low-Ionic-Strength Treatment of Cultured Mammalian Cells. // Exp. Cell Res., V. 233, p. 155-168.

131. Zelenin M. G., Zakharov A. F. 1982. Morphological changes in isolated metaphase chromosomes depending on the pH and ionic strengch of the solution. // Tsitologia. V. 24. N 4, p.469 472.

132. Zentgraf H., Falk H., Frank W.W. 1975. Nuclear membrane and plasma membrane of hen eritrocytes. Characterization of nuclear membrane, attached DNA. // Cytobiologie. V.ll., Ptl, p. 10-29.

133. Zhao K., Harel A., Stuurman N., Guedalia D., Gruenbaum Y. 1996. Binding of matrix attachment regions to nuclear lamin is mediated by the rod domain and depends on the lamina polymerization state. // FEBS Letters, V. 380, p. 161 164.107

134. Zink D., Bornfleth H., Visser A., Cremer C., Cremer T. 1999. "Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. // Exp. Cell Res. V. 247 Pt.l, p. 176- 188.108

135. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

136. Kourtchachova S. 1998. The relationship between lamina reformation and replication in cell nuclei. // Nuclear Architecture Meeting, Kefermarkt, Austria.

137. Vladimirskaya E.A., Kourtchachova S.Yu. Gulak P.V., Kireyev I.I, Hozak P., Polyakov V.Yu. 1999. Dynamics of lamina assembly during hypotonic shock-induced formation of micronuclei. // EMBO Workshop, Prague, Czech Republic.

138. Korneva E.P., Kourtchachova S.Yu, Gulak P.V., Kireyev I.I., Hozak P., Polyakov V. Yu. 1999. Chromatin-lamina interaction and lamina organization in S-phase nuclei. //16 International Workshop of the Cell Nucleus, Prague, Czech Republic.