Динамика ядрышка в клеточном цикле диплоидных и полиплоидных клеток различных тканей пшеницы Triticum aestivum L тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.11, кандидат биологических наук Лазарева, Елена Михайловна

• Лазарева, Елена Михайловна
• кандидат биологических наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лазарева, Елена Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структурно-функциональная характеристика локусов организатора ядрышка

2. Структурная организация ядрышка

3. Молекулярная композиция доменов ядрышка

3.1. Локализация ДНК

3.2. Белки ядрышка и га локализация

4. Динамика ядрышка в клеточном цикле

4.1. Белки, ассоциированные с районом ядрышкового организатора

4.2. Белки периферического слоя хромосом. Структурно-функциональная характеристика периферического хромосомного материала (матрикса), как специфического домена ми-тотических хромосом

4.3. Белки ядрышка, мигрирующие во время митоза в цитоплазму

5. Нуклеологенез 40 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Клетки апикальной меристемы корня

1.1. Приготовление препаратов хромосом

1.2. Выявление аргентофилъных белков в клетках корневой меристемы

1.3. Визуализация ядрышек на различных стадиях клеточного цикла

2. Клетки эндосперма

2.1. Изоляция эндосперма

2.2. Выявление аргентофилъных белков в клетках эндосперма

2.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание

2.4. Окрашивание ядер клеток эндосперма по методу Фелъгена

3. Определение молекулярной массы аргентофилъных белков

4. Определение молекулярной массы белков ядрышка -антигенов к аутоиммунным сывороткам

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Локализация аргентофильных белков ядра в интерфазных и митотических клетках апикальной меристемы корня и эндосперма пшеницы

1.1. Выявление аргентофильных белков клеток апикальной меристемы корня

1.2. Локализация аргентофильных белков в интерфазных и делящихся клетках эндосперма

1.3. Обсуждение

2. Иммуноцитохимическое изучение локализации некоторых белков ядрышка в интерфазных и митотических клетках эндосперма

2.1. Определение молекулярной массы белков ядрышка, являющихся антигенами к аутоиммунным сывороткам Р-127 и К

2.2. Иммуноцитохимическое выявление полипептида с мол массой 34 кД (сыворотка К

2.3. Иммуноцитохимическое выявление белка с мол массой кД (сыворотка Р-127)

2.4. Обсуждение

3. Динамика структурно-функциональной ассоциации яд-рышкообразующих хромосом в клеточном цикле и в связи с полиплоидизацией генома

3.1. Количество хромосом с ядрышкообразующими районами в митотических клетках меристемы корня

3.2. Количество ядрышек в ядрах диплоидных и эндополиплоид-ных клеток меристемы корня на различных стадиях клеточного цикла

3.3. Количество ядрышек в клетках антипод с политенными хромосомами

3.4. Количество ядрышек в триплоидных клетках эндосперма на различных стадиях клеточного цикла

3.5. Ранние этапы нуклеологенеза в постмитотических клетках эндосперма

3.6. Обсуждение 81 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89 »МИОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Динамика ядрышка в клеточном цикле диплоидных и полиплоидных клеток различных тканей пшеницы Triticum aestivum L»

Ядрышко представляет собой дискретный домен интерфазного ядра эукариот, в котором осуществляется интенсивная транскрипция рибосомной РНК и ее процессинг (Scheer, Benavente, 1990).

Интерфазное ядрышко включает три основных структурных компонента: фибриллярные центры (ФЦ), плотный фибриллярный компонент (ПФК) и гранулярный компонент (ГК) (Goessens, 1984). По современным представлениям, в ФЦ локализованы гены рРНК и некоторые белки, необходимые для транскрипции РНК - РНК полимераза I, транскрипционный фактор UBF и топоизомераза I. ПФК является сайтом транскрипции рРНК и содержит такие белки, как нуклеолин; в ГК локализованы процессирующиеся молекулы РНК и предшественники рибосом и белки, участвующие в транспорте и созревании рибосом - нуклеолин, В23, и Р52 (Scheer, Benavente, 1990; Hernandez-Verdun, 1991; Shaw, Jordan, 1995; Gautier et al., 1994).

Количество и размеры ядрышек в различных типах клеток коррелирует с числом активных ядрышковых организаторов (ЯО) (Schwarzachen Wachtier, 1983). В то же время, количество ядрышек в ядре может быть меньше, чем число активных ЯО (Jordan et al, 1982; Wachtier et al, 1986; Rawlins, Shaw, 1990). Этот феномен авторы объясняют специфической ассоциацией ядрышкообразующих хромосом в области ЯО, которая может сохраняться в метафазе (Avivi, Feldman, 1980; Rawlins, Shaw, 1990; Wachtier et al, 1986; Hadlaczky et al, 1986; Haaf et al, 1990; Haaf, Schmid, 1991). Причины, определяющие формирование такой ассоциации, ее динамика в клеточном цикле и в связи с полиплоидизацией генома, так же, как функциональное значение феномена слияния ядрышек остаются неизвестными.

Структурно-функциональная композиция ядрышка и динамика его поведения в клеточном цикле зависят от уровня экспрессии генов рДНК (Hadjiolov, 1985). В профазе митоза, на фоне общего ингибирования синтеза РНК, ядрышки диссоциируют. С локусами ЯО остаются ассоциированными такие компоненты, как РНК-полимераза1 (Weisenberger, Scheer, 1995), топоизомераза I (Guldner et al., 1986), транскрипционный фактор UBF (Roussel et al, 1993; Zatsepina et al, 1993) и белки, участвующие в транскрипции рРНК (Dundr et al, 1997). Некоторые другие белки ядрышка и РНП частично выходят в цитозоль, или ассоциируют с митотическими хромосомами, формируя слой периферического хромосомного материала (Hernandez-Verdun, Gautier, 1994; Medina et al, 1995). Слой нехроматинового материала, на периферии хромосом был описан в ранних цитологических работах как хромосомный матрикс (Sharp, 1929; Nebel, 1932; Dangeard, 1937). Впервые, матрикс хромосом на электронномикроскопическом уровне был изучен в работах Ю.С.Ченцова и В.Ю.Полякова (1968; 1969). Авторы предположили, что матрикс включает некоторые компоненты ядрышка, в том числе, РНП, которые переносятся на хромосомах для ' быстрой реорганизации аппарата синтеза рРНК в телофазе.

Реорганизация ядрышка в телофазе происходит в два этапа: сначала специфические ядрышковые белки накапливаются в кариоплазме дочерних ядер, а затем конденсируются в зоне активирующегося организатора (Benavente, 1991). Промежуточной фазой формирования дефинитивного ядрышка является компактизация белков в многочисленные компактные структуры, т. наз. «предъядрышки» (см. Zatsepina et al., 1997). Существование «предъядрышек» (prenuclear bodies) убедительно показано для многих клеток животных. В них с помощью иммуноцитохимических методов обнаружены ядрышковые белки, такие как В23 (Ochs et al., 1985), нуклеолин (Ochs et al., 1983), фибрилларин (Azum-Gelade et al., 1995; Medina et al., 1995) и ряд других. Во многих работах показано, что предъядрышки обладают аргентофилией (Ochs et al., 1985; Jimenez-Garcia et al., 1989). На основании данных, полученных методом гибридизации in situ, в «предъядрышках» выявлена низкомолекулярная РНК (U1-U3,U14) (Jimenez-Garcia et al., 1994; Azum-Gelade et al., 1995; Beven et al., 1996). В клетках лука этим же методом в «предъядрышках» обнаружили молекулы предшественников рРНК (Medina et al., 1994). В то же время, вопрос о наличии «предъядрышек» в телофазных ядрах растений вызывает определенные сомнения. В. работе Lafontaine, Chouinard (1963), в которой с помощью электронномикроскопической техники был детально прослежен процесс реорганизации телофазных ядер в клетках конских бобов Vicia faba, не обнаружено структур, соответствующих фибриллярным предъядрышкам животных объектов.

Процессы деструкции ядрышек в профазе и их реорганизации в телофазе детально описаны в синхронизированных клетках культуры ткани животных объектов (Sommerville, 1986; Hernandez-Verdun, Gautier., 1994; Dundr et al., ,1997; Suja et al., 1997). Данные о цикле различных молекулярных компонентов ядрышка в клетках растений гораздо более фрагментарны (Vaughan, 1987; Medina et al., 1997). В особенности, мало изучены начальные этапы миграции белков ядрышка на стадии ранней профазы и динамика реконструкции ядрышка в телофазе. Отчасти, это связано с чисто методическими трудностями. Во-первых, в растительных объектах сложно подробно "реконструировать" последовательность митоза, т.к. приходится иметь дело с единичными срезами ткани или отдельными диссоциированными клетками. Во-вторых, для клеток растений не удается в полной мере адаптировать те цитохимические методики, которые используются для клеток культуры ткани.

Объектом, позволяющим преодолеть перечисленные трудности, является созревающий эндосперм некоторых представителей покрытосеменных растений (Петрова, 1970). Изолированный на нуклеарной стадии развития, эндосперм представляет собой тонкую пленчатую структуру, содержащую один слой клеток. Характерной особенностью эндосперма является синхронное деление клеток, связанное со сменой митотических стадий, которые волнообразно распространяются по ткани (Поддубная-Арнольди, 1976). Это позволяет надежно идентифицировать последовательные стадии митоза, начиная от ранней профазы и кончая поздней телофазой. В настоящей работе в качестве основного объекта исследований использовались клетки эндосперма пшеницы Triticum aestivum.

Пшеница является излюбленным цитогенетическим объектом, который достаточно полно охарактеризован по следующим параметрам: (1) все хромосомы пщеницы четко идентифицированы методом N- и С-окрашивания и на основании этого создана цитогенетическая номенклатура ее хромосом (Seal, 1981; Бадаева и др., 1982; Lakadena et al., 1984; Лазарева, Айзатулина, 1985); (2) методом гибридизации in situ в геноме 'пшеницы выявлены шесть хромосом (1А, 5А, 1В, 6В, 5Д, 7Д), в которых имеются кластеры рибосомных генов (Cermeño et al., 1984; Miller et al., 1985; Jiang, Gill,

1994); (3) показано, что в интерфазных клетках активно транскрибируются ядрышковые организаторы хромосом 1В и 6В, ядрышковые организаторы хромосом 1А и 5Д являются латентными в отношении транскрипции, а кластер рибосомных генов в хромосоме 5А всегда репрессирован и никогда не формирует ядрышко (Cermeño et al., 1984; Lacadena et al., 1984); (4) разработан метод изоляции зародышевого мешка с триплоидным эндоспермом и гаплоидными клетками антипод, содержащими гигантские политенные хромосомы (Петрова, 1970).

Таким образом, используя различные ткани пшеницы, можно провести комплексное исследование динамики ядрышка и его компонгентов как в клеточном цикле, так и в клетках, в которых полиплоидизация генома происходит различными способами.

В работе были поставлены следующие задачи: На ткани изолированного эндосперма провести скриннинг аутоиммунных сывороток, которые преципитируют с ядрышками клеток животных. Определить молекулярные массы белков, являющихся антигенами к сывороткам, избирательно окрашивающим ядрышки клеток пшеницы.

2. Используя отобранные сыворотки в качестве маркеров, изучить динамику белков ядрышка в делящихся клетках эндосперма.

3. Изучить характер распределения аргентофильных белков в интерфазных и делящихся клетках эндосперма и в клетках меристемы корня.

4. Методом Вестерн-блота определить молекулярные массы аргентофильных белков ядер клеток пшеницы.

5. Изучить феномен ассоциации ядрышек на всех стадиях клеточного цикла в диплоидных и полиплоидных клетках меристемы, в триплоидных клетках эндосперма и в политенных клетках антипод зародыша.

6. С помощью иммуноцитохимических методов и Ag-NOR окрашивания детально изучить динамику формирования ядрышек на ранних этапах нуклеологенеза в телофазных клетках эндосперма.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время установлено, что ядрышко представляет собой активный локус специальных ядрышкообразующих хромосом, в котором с помощью фермента РНК-полимеразы I транскрибируются гены рибосомной ДНК. Эти гены кодируют три из четырех типов рРНК - 18S, 5,8S и 28S РНК. Кроме того, в ядрышке происходит процессинг рРНК и осуществляются основные этапы биогенеза больших и малых субъединиц рибосом.

Заключение диссертации по теме «Эмбриология, гистология и цитология», Лазарева, Елена Михайловна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Полученные результаты вместе с известными данными литературы позволяют предложить следующую схему динамики ядрышка в жизненном цикле клеток пшеницы. В интерфазе ядрышки пшеницы, как и других изученных объектов растительного и животного происхождения, формируются в результате активности специфического локуса хромосом, называемого организатором ядрышка. Для клеток пшеницы характерно присутствие хромосом с латентными не транскрибирующимися организаторами (Miller et all., 1983), которые способны к спонтанной активации в некоторых клетках меристемы (Cermeño et all., 1984) или при искусственном «разобщении» генома в системе микроядер (Crosby, 1957).

В настоящей работе на примере клеток пшеницы впервые показано, что в клетках высших растений активация латентных организаторов может индуцироваться такими перестройками генома, как эндополиплоидизация.

Количественный анализ числа ядрышек на различных стадиях клеточного цикла показал, что в небольшой части клеточной популяции организаторы ядрышка функционируют независимо и в . этом случае максимальное количество ядрышек в ядре соответствует числу активированных организаторов. В большинстве клеток количество ядрышек меньше числа активных организаторов, что можно объяснить структурно - функциональным взаимодействием ядрышкообразующих хромосом. Четко выраженная тенденция к структурному слиянию ядрышек наблюдается в ходе клеточного цикла в клетках различных тканей пшеницы, независимо от их плоидности.

Известно, что в профазе митоза ядрышко разбирается и белки, участвующие в синтезе и процессинге рРНК высвобождаются из ядрышка по мере его деструкции. Судьба ядрышковых белков в митотических клетках различна. Некоторые белки, такие, как РНКполимераза1, транскрипционный факторЦВР и т.д., остаются в ассоциации с рибосомной ДНК в локусе организатора ядрышка. Часть белков выходит в цитоплазму по мере разрушения ядерной оболочки. И, наконец, значительная доля белков ядрышка мигрирует на поверхность митотических хромосом, формируя слой периферического хромосомного материала (ПХМ). Детальный анализ ПХМ, проведенный в настоящей работе, вместе с известными литературными данными показывает, что существует структурная и биохимическая общность ПХМ в клетках животных и растительных объектов. В то же время, ПХМ в клетках эндосперма пшеницы выражен гораздо более сильно по сравнению с клетками животных. Это может быть связано с тем, что эндосперм представляет собой триплоидную ткань, в которой резко увеличена «доза» генов рРНК за счет активности 3-х пар ядрышкообразующих хромосом. Четко показанный с помощью электронномикроскопической техники перенос в составе ПХМ гранулярного компонента ядрышка (Бураков и др., 1994) является другой особенностью эндосперма. Наличие в ' ПХМ некоторых типов низкомолекулярных РНК, участвующих в процессинге рРНК и структурных элементов гранулярного компонента ядрышка, показанное для клеток животных и некоторых растений, может указывать на функциональное значение ПХМ, как субстрата, необходимого для быстрой реорганизации аппарата синтеза рРНК по окончании митоза (Ченцов, Поляков, 1968; Hernandez-Verdun, Gautier, 1994). На примере клеток эндосперма пшеницы можно утверждать, что в ранней телофазе ядрышки формируются за счет миграции белков и РНП предсуществовавшего ядрышка из цитоплазмы и ПХМ непосредственно в зоны активированных организаторов, так как количество ядрышек на этой стадии митоза соответствует числу активированных к экспрессии организаторов. Детальный анализ последовательных стадий митоза на синхронизированных клетках эндосперма позволил показать, что процесс формирования дифинитивного ядрышка в митотических клетках пшеницы проходит без стадии «предъядрышек» (prenuclear bodies), которая характерна для клеток многих животных объектов (Zatsepina et al., 1997). Это хорошо согласуется с данными электронномикроскопической работы, посвященной описанию постмитотической реорганизации ядра у Vicia faba, где на стадии телофазы так же не обнаружено структур, соответствующих дискретным предъядрышкам (Lafontaine, Chouinard, 1963). Можно предположить, что "предъядрышки", описанные у некотрых растительных объектов с помощью светооптической техники, представляют собой фрагменты ПХМ, аггрегированные под влиянием кислых фиксаторов. В дальнейшем, на стадии поздней телофазы и в ранней Gl-фазе начинается активный рост ядрышек, ' который в большинстве клеток сопровождается их слиянием. Сформировавшаяся таким образом структурно-функциональная ассоциация ядрышек лабильна, разрушается в ходе митоза и не может служить основой для формирования истиной сателлитной ассоциации ядрышкообразующих хромосом. По-видимому, истинная сателлитная ассоциация ЯОХ является геномной мутацией, которая возникает только в ограниченном числе клеток и может передаваться через митоз в ряду клеточных поколений.