Особенности формирования и функционирования ядрышкового аппарата в условиях пространственного разобщения хромосом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.11, кандидат биологических наук Мухарьямова, Кадрия Шамильевна

• Мухарьямова, Кадрия Шамильевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мухарьямова, Кадрия Шамильевна

I. ВВЕДЕНИЕ

П. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

Ш. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ультраструктура ядрышка

2. Белки ядрышка а) аргентофшьные белки б) фактор инициации транскрипции РНК полимеразы-1, \]ВР в) фибрилларин, маркер раннего процессинга рРНК г) белок В23, маркер сборки пре-рибосом

3. Нуклеологенез ядрышка

4. Микроядерные клетки 21 IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Объект исследования

2. Стандартные условия получения микроядер

3. Условия обработки клеток актиномицином Д

4. Условия обработки клеток 5,6-дихлоро-р-рибофуранозилбензимидазолом (ДРБ)

5. Выявление основных химических компонентов ядрышка а) выявление РНП-компонентов с помощью реакции Браше б) выявление Ag-фuлъныx белков ядрышка г) реакция Фелъгена д) иммуноцитохимическое изучение клеток

6. Определение транскрипционной активности ядрышек в микроядерных клетках а) радиоавтографический метод б) нерадиоавтографический подход к определению транскрипционной активности ядрышек с помощью БрУТФ

7. Электронная микроскопия

8. Морфометрические измерения 34 V. РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Динамика клеток с микроядрами

2. Общая характеристика и число ядрышек в клетках с микроядрами

3. Характеристика белковых компонентов ядрышка в клетках с микроядрами а) окрашивайте азотнокислым серебром б) выявление UBF в) окраска на фибрилларин г) окраска на В д) двойное окрашивание клеток антителами к фибрилларину и В е) двойное окрашивание клеток антителами к белку В23 и к ламину В 46 4.Определение транскрипционной активности в клетках с микроядрами а) радиоавтографический метод б) нерадиоавтографический метод с использованием бромированного уридинтрифосфата

5.Особенности ультраструктурной организации в клетках с микроядрами

6. Характеристика белковых компонентов ядрышка в нормальном митозе а) Ag-ЯOP белки б) Белок фактор инициации транскрипции ГЖР в) Фибрилларин г)БелокВ д) Окрашивание метафазных хромосом антителами к белкам В23 и фибрилларину в условиях гипотонического шока е) Ламин В ж) Включение БрУТФ в митотические клетки 56 VI. ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика клеток с микроядрами

2. Особенности макроорганизации ядрышек в клетках с микроядрами 61 1. Особенности химического состава микроядрышек на разные сроки их созревания

4. Особенности функционального состояния микроядрышек

5. Особенности функционирования и организации микроядрышек в зависимости от степени разобщения индивидуальных микроядер

6. Судьба основных ядрышковых белков в митозе и природа материала в микроядрышках

7. Внеядрышковые внутриядерные включения, содержащие основные ядрышковые белки

УЛ. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности формирования и функционирования ядрышкового аппарата в условиях пространственного разобщения хромосом»

Выяснение механизмов взаимодействия индивидуальных хромосом, приводящее к их кооперативному функционированию в составе клеточного ядра, является одной из ключевых проблем современной биологии. Одним из подходов к ее решению может быть анализ структурного и функционального состояния хромосом при их естественном или искусственном разделении на отдельные группы. В индуцированных условиях пространственное разобщение хромосом может быть достигнуто путем обработки митотических клеток статмокинетическими агентами (колхицином, колцемидом, нокодазолом) (Алов, 1972), или воздействием на хромосомы растворов низкой ионной силы (Zatsepina et al., 1982). Показано, что под действием перечисленных факторов митотические клетки выходят из блока, а отдельные хромосомы или группы хромосом деконденсируются и одеваются ядерной оболочкой. В результате в клетках формируются многочисленные мелкие ядра, которые получили название «микроядер» (Sekiguchi et al., 1978; Stubblefield, 1964; Phillips, Phillips, 1969). Известно, что микроядра обладают многими признаками нормальных одноядерных клеток: они способны к транскрипции РНК, репликации ДНК, содержат деконденсированный хроматин и ядрышко-подобные структуры. Это указывает на то, что микроядра способны проходить те же стадии дифференцировки, что и нормальные ядра. В связи с этим, микроядра являются не только удобной моделью для изучения взаимодействия отдельных хромосом в процессе активного функционирования генома. Изучение динамики формирования микроядер может оказаться полезным для выяснения закономерностей восстановления интегрированной структуры интерфазных ядер, которая исчезает при вступлении клеток в митоз и реформируются при восстановлении дочерних ядер в телофазе.

Одним из типов хромосом, структура и функционирование которых в составе микроядер доступны экспериментальной проверке, являются хромосомы, содержащие кластеры рибосомных генов, соответствующие ядрышкообразующим районам (ЯОР). Как известно, продуктом активности ядрышкообразующих хромосом являются ядрышки, обязательные структурные домены интерфазных ядер эукариотических клеток. В ядрышках происходит биогенез рибосом, то есть транскрипция рДНК, процессинг первичных рРНП-транскриптов и созревание пре-рибосомных частиц (Hadjiolov, 1985). В этих процессах участвуют несколько десятков специфических ядрышковых белков, которые условно могут быть разделены на белки, участвующие в транскрипции, в процессинге и сборке прерибосом (Shaw, Jordan, 1995). Присутствие этих белков указывает на то, что ядрышко является функционально активным, то есть продуцирует рибосомы. Общая морфология ядрышек также хорошо изучена. В многочисленных работах показано, что структура ядрышек является отражением их функционального состояния (Ченцов, Поляков, 1974; Hozak et al., 1986; Shaw, Jordan, 1995). Так, крупные размеры ядрышек и наличие в них многочисленных и мелких фибриллярных центров является показателем активного биогенеза рибосом. Поэтому, изучая структурные и иммуноцитохимические особенности ядрышек можно сделать вывод о том, насколько активно происходят транскрипция рибосомных генов и биогенез рибосом в целом.

Известно, что в состав ядрышка, помимо основной рибосомной ДНК, кодирующей 18S и 28S рРНК (рДНК) и белков входят также многочисленные малые ядрышковые РНК (мякРНК), а также 5S рРНК. В подавляющем большинстве клеточных типов гены, кодирующие различные классы рДНК, а также мякРНК и белки, не находятся в составе ядрышко-образующих хромосом. Так, в клетках человека основные рибосомные гены располагаются в 13, 14, 15, 21 и 22 хромосомах, тогда как гены, кодирующие 5S рРНК находятся в 1 хромосоме; а гены кодирующие основные ядрышковые белки могут быть «разбросаны» по многим хромосомам набора (Нафю1оу, 1985). Однако, клеточные механизмы обеспечивающие сбалансированный синтез индивидуальных компонентов ядрышка до сих пор остаются не выясненными. Одним из подходов к его решению является изучение функционирования ядрышек в микроядрах. По этому поводу опубликован ряд интересных работ (ЬаЫсй е1 а1., 1987 а,б; Оегаис! е1 а1., 1989; ЬаЫсН е1 а1., 1989; Киреев и др., 1988).

Кроме того, микроядра являются хорошей моделью для изучения механизмов сборки ядрышка на последних стадиях митоза. Изучение кинетики формирования ядрышек в условиях пространственного разобщения хромосом позволяет выявить закономерности взаимодействия отдельных компонентов ядрышка при их реконструкции в митозе и способствует выяснению природы факторов, обеспечивающих миграцию предшественников ядрышек из цитоплазмы в реформирующиеся ядра. В настоящее время сведения по данным вопросам в литературе отсутствуют.

Основная цель настоящей работы заключалась в изучении закономерностей сборки и функционирования ядрышкового аппарата в условиях пространственного разобщения хромосом.

В качестве условий для получения микроядер использовали гипотоническую обработку живых клеток СПЭВ растворами низкой ионной силы, что позволило получить большое число отдельных микроядер на разных стадиях их формирования (2а1зерша е1 а1., 1982; Киреев и др., 1986). Эта же методика позволила нам получать микроядра на разных стадиях формирования.

Цели и задачи работы.

Основная цель настоящей работы заключалась в изучении цитохимических, иммуноцитихимических и функциональных особенностей ядрышкового аппарата в клетках с микроядрами.

Конкретные задачи работы заключались в следующем.

1. Подобрать условия для максимального разобщения хромосом в составе микроядер формирующихся в клетках СПЭВ при их выходе из блока.

2. Проследить судьбу клеток с микроядрами и ответить на вопрос способны ли они вступать в митоз.

3. Описать динамику числа, размеров и морфологии ядрышек в клетках с микроядрами на разные сроки их формирования. Для этого:

A) методами цитохимии и иммунноцитохимии выяснить, содержат ли микроядрышки основные компоненты, характерные для функционирующих ядрышек одноядерных клеток, такие как РНК, А§-белки, фактор инициации транскрипции ЦВР, белок раннего процессинга фибрилларин и белок позднего процессинга В23.

Б) Описать особенности ультраструктурной организации ядрышек в клетках с микроядрами.

B) Изучить функциональную активность микроядер и ядрышек на разные сроки их формирования.

4. Описать динамику активации рибосомных генов и поведение основных ядрышковых компонентов (А£-белки, ИВБ, фибрилларин, В23) при формировании ядрышек в митозе.

5. Сопоставить кинетику нуклеологенеза в нормальном митозе с динамикой формирования ядрышек в клетках с микроядрами.

6. Выяснить, какие этапы биогенеза рибосом и ядрышек находятся в наибольшей зависимости от пространственного объединения хромосом.

Обзор литературы.

Ядрышко является обязательной органеллой для подавляющего большинства эукариотических клеток. Оно формируется в результате транскрипционной активности основных рибосомных генов, кодирующих 18S, 28S и 5,8S рРНК (рДНК). Эти гены собраны в один или несколько кластеров, располагающихся в специализированных участках хромосом, получивших название ядрышкообразующих районов (ЯОР) ( Busch, Smetana, 1970; Hernandez-Verdun,1983; Hadjiolov, 1985). В ядрышках происходит синтез и процессинг первичных рРНП-транскриптов (45S пре-рРНК) и образование зрелых 28S, 18S рРНК. По мере роста рРНП-транскрипта он связывается с различными специфическими ядрышковыми белками, такими как нуклеолин, фибрилларин, В23, а также белком зрелых рибосом SI (Hugle et al., 1985) и с 5S рРНК, которая транскрибируется вне ядрышка (Hadjiolov, 1985). Таким образом, в конечном участке транскрипции образуется рибонуклеопротеид с коэффициентом седиментации 80S (Olson, 1990). Кроме того, в состав ядрышек входят малые ядрышковые РНК (мякРНК), которые не содержатся в зрелых рибосомах. Эти мякРНК участвуют в раннем процессинге рРНК (Reeder, 1990; Paule, 1993), а также осуществляют регуляцию сборки прерибосомных частиц (Sollner-Webb et al., 1994). В состав большой прерибосомной частицы входит 5S рРНК, которая кодируется генами, не располагающимися внутри ядрышка. Таким образом, формирование рибосомных частиц требует кооперативного взаимодействия генопродуктов разных хромосом. Однако, механизмы взаимодействия хромосом, вовлеченных в биогенез рибосом, до сих пор остаются до конца не выясненными.

Одним из подходов к их решению является морфологический анализ ядрышек в различных экспериментальных условиях, поскольку известно, что структурная организация ядрышка является отражением его функциональной активности.

Ультраструктура ядрышка.

В составе ядрышек можно выделить три основных структурных компонента: фибриллярные центры (ФЦ), плотный фибриллярный компонент (ПФК) и гранулярный компонент (ГК).

Фибриллярные центры - это структуры, соответствующие ядрышкообразующим районам хромосом (Hadjiolov, 1985). Строение ФЦ в различных объектах довольно однообразно. Они представляют собой скопления рыхло уложенных фибрилл низкой электронной плотности толщиной 7-10 нм. На ультратонких срезах ФЦ обычно имеют форму сферы с четко выраженными границами. То, что ФЦ соответствуют ядрышкообразующим районам хромосом можно считать доказанным. Это подтверждается данными по гибридизации материала ФЦ in situ с рибосомной ДНК, по сродству в окрашивании ЯОР и ФЦ с помощью азотнокислого серебра и по сходству в их ультраструктуре (Hernandez-Verdun et al., 1980; Hadjiolov, 1985; Thiry, 1993; Vandelaer et al., 1993). Имеются многочисленные свидетельства изменчивости размеров и числа ФЦ в ядрышке в зависимости от типа клеток и функциональной активности ядрышка (Челидзе, 1985; Сабанеева, 1988; Zatsepina et al., 1988). Как правило, число ФЦ в клетке превышает число ЯОР митотических хромосом и оказывается пропорциональным транскрипционной активности клетки. При низкой активности число ФЦ согласуется с числом ЯОР, при высокой намного превышает его (Сабанеева, 1988).Эти данные позволяют заключить, что один ФЦ в высокоактивных ядрышках не идентичен одному ЯОР хромосомы, а является лишь его частью.

Плотно упакованные фибриллы диаметром 4-8 нм, окружающие ФЦ в виде сплошного слоя или образующие на их поверхности небольшие «шапочки», получили название плотного фибриллярного компонента (ПФК). Кроме того, ПФК формирует мостики», соединяющие отдельные ФЦ. Совокупность ФЦ, окруженных слоем плотного фибриллярного компонента в литературе принято называть фибриллярным комплексом (Гозак и др., 1983; Hozak et al., 1986; Zatsepina et al., 1988). По всей вероятности, один фибриллярный комплекс интерфазного ядрышка идентичен одному ЯОР митотической хромосомы, так как между числом тех и других структур наблюдается хорошее соответствие (Hozak et al., 1986; Zatsepina et al., 1988). Принято считать, что ПФК содержит новосинтезированную 45 S пре-рРНК, ассоциированную с белками ( Goessens, 1984; Fakan and Hernandez-Verdun, 1986; Jordan, 1991). Действительно, по данным радиоавтографии Н3-уридин включается в первую очередь в плотный фибриллярный компонент ядрышка (Mirre, Stahl, 1978; Jordan, 1991). Позднее была выдвинута гипотеза о том, что процесс транскрипции рДНК происходит на поверхности ФЦ или на границе между ФЦ и ПФК (Hadjiolov, 1985; Derenzini et al., 1990; Thiry et al., 1991). В работах Dundr, Raska (1993) и Hozak с соавторами (1994) эта гипотеза получила экспериментальное подтверждение. В данных работах активные рибосомные гены были локализованы на ультраструктурном уровне с помощью иммуноцитохимического метода выявления включившегося в ядрышко предшественника рРНК, БрУТФ. Эти данные показали, что транскрипция происходит на границе между фибриллярным центром и плотным фибриллярным компонентом. Несмотря на то, что в большинстве работ указывается на отсутствие РНЬС-полимеразы I в составе ПФК, было высказано предположение о том, что функционально активная форма РНК полимеразы I является недоступной для обнаружения ( Hernandez-Verdun, 1991; Jordan, 1991).

Гранулярный компонент ядрышка состоит из электронноплотных гранул размером 10-25 нм. Эти ядрышковые гранулы представляют собой РКП-частицы и соответствуют пре-рибосомам, находящимся на разных этапах созревания. (Челидзе, 1985; Hadjiolov, 1985

Jordan, 1991). С помощью метода гибридизации in situ продемонстрировано, что образующиеся в фибриллярной части ядрышка предшественники рибосом мигрируют в гранулярный компонент, где формируют РНП-гранулы, а затем, постепенно созревая, транспортируются в цитоплазму ( Hadjiolov, 1985; Fischer et al., 1991; Puvion-Dutilleul et al., 1992).

Кроме того, в ядрышке были обнаружены ядрышковые вакуоли и около- и внутриядрышковый хроматин (Jordan, 1984). Наряду с указанными структурами в ядрышке выявляют также ядрышковый матрикс, который представляет собой тонкофибриллярную сеть, сохраняющуюся на месте ядрышка после удаления из него нуклеиновых кислот и растворимых белков (Bouteille et al., 1983; Verheijen et al., 1988). Полагают, что некоторые из этих матричных белков участвуют в поддержании структурной организации ядрышка ( Franke et al., 1981; Schmidt- Zachmann et al., 1984; Hernandez-Verdun, 1991).

Белки ядрышка

Основным химическим компонентом ядрышка являются белки, на долю которых приходится до 70% сухого веса ядрышка. По оценкам некоторых авторов число ядрышковых белков составляет несколько сотен (Hernandez-Verdun, 1991). Помимо белков, ассоциированных с ядрышковым хроматином, в состав ядрышек входят белки рибосом и специфические ядрышковые белки, определяющие транскрипцию рибосомных генов и процессинг пре-рРНК, такие как, РНК-полимераза I, факторы транскрипции, топоизомеразы, метилазы, нуклеазы, протеинкиназы и фосфатазы. Некоторые ядрышковые белки имеют сродство к серебру, в связи с чем они были названы аргентофильными белками, а именно: РНК полимераза I (Masson et al., 1990 ), UBF, нуклеолин и В23 (Hozak et al., 1992; Roussel et al., 1992). Rassel и Hernandez-Verdun ( 1994) показали, что основные аргентофильные белки могут различаться в интерфазных и митотических клетках. Так, в интерфазе Ag-свойствами обладают В23 и нуклеолин, тогда как в митозе - РНК-полимераза I и UBF. Аргентофильные белки.

Исследования ядрышкового аппарата при помощи солей серебра получили широкое распространение после того, как был предложен метод окрашивания азотнокислым серебром активных ядрышковых организаторов ( Goodpasture, Bloom, 1975; Miller et al., 1976; Schwarzacher et al., 1978; Olert et al., 1979; Howell, Blak, 1980). Из многочисленных методик, предложенных для специфического окрашивания ядрышковых организаторов с помощью азотнокислого серебра наиболее стабильные результаты дает методика Хоуэлла и Блэка (1980), так как она предлагает использование желатины, в качестве стабилизирующего агента реакции, протекающей в слабокислой среде. Аргентофильными свойствами обладают белки, обогащенные сульфгидрильными, дисульфидными связями, которые в строго контролируемых условиях (высокая температура и низкий pH) связывают ионы серебра из раствора AgNC>3 и восстанавливают их до металлического серебра (Buys, Osinga, 1980; Сабанеева 1989). В результате импрегнации аргентофильный материал выявляется в виде черных гранул серебра, расположенных на бледно-желтом фоне ядер или хромосом (Goodpasture, Bloom, 1975).

В нормальных интерфазных ядрах Ag-белки полностью отсутствуют в кариоплазме и лишь при явном перекрашивании препаратов могут быть визуализированы в интерхроматиновых районах (Зацепина, Сметана, 1985).

Доказательством того, что серебро выявляет в первую очередь именно ЯОР, послужили опыты по гибридизации in situ, которые показали, что сайты, связывающиеся с серебром идентичны местам расположения генов, кодирующих 28S и 18S рРНК (Hsu et al., 1975; Warburton, Henderson, 1979; Hernandez-Verdun, 1986). Кислые аргентофильные белки обнаруживаются также в составе фибриллярного компонента интерфазных ядрышек. Наличие Ag-белков в ЯОР митотических хромосом и фибриллярных центрах интерфазных ядрышек является одним из свидетельств в пользу идентичности этих структур (Сабанеева, 1989).

Локализация Ag-белков в интерфазных ядрах и их поведение в клеточном цикле описано в большом числе объектов как на уровне световой, так и электронной микроскопии (Ochs et al., 1985; Ploton et al., 1987). Показано, что число гранул серебра над ядрышками увеличивается по мере активации рабосомных генов и является хорошим маркером уровня синтеза рРНК (Hubbell, 1985). Число гранул серебра может удваиваться при переходе клеток от Gi к G2 периоду, сопровождающему активацию транскрипции и репликацию рДНК (Hubbell, 1985). Во время митоза аргентофильные белки выявляются в зоне вторичных перетяжек, соответствующих ядрышкообразующим районам хромосом, активным в интерфазе, предшествующей клеточному делению (Miller et al., 1976; Hubbell, 1985).

Таким образом, аргентофильные белки могут служить маркером активно функционирующих и потенциально активных рибосомных генов (Сабанеева, 1989; Olson, 1990; Hernandez-Verdun, 1991). Некоторые из аргентофильных белков охарактеризованы иммуноцитохимическими методами. Установлена аминокислотная последовательность нескольких Ag-белков, включая С23 (нуклеолин) (Ochs, Busch, 1984). Нуклеолин - это белок с молекулярной массой 100-110 кДа, который, по-видимому, участвует в разворачивании фибриллы рДНК до состояния, необходимого для осуществления транскрипции (Jordan, 1987).

К Ag-белкам относятся также: большая субъединица РНК полимеразы I, фактор транскрипции РНК полимеразы I-UBF (Sheer, Rose, 1984; Ochs et al., 1985), и белок B23 (Lischwe et al., 1979; Williams et al., 1982; Сабанеева 1989).

Фактор инициации транскрипции РНК полимеразы I, UBF.

Происходящая в ядрышке транскрипция рибосомных генов контролируется ферментом РНК-полимеразой I и по крайней мере двумя вспомогательными белковыми факторами инициации транскрипции, получившими название UBF и SL1 (Bell et al., 1988; Hisatake et al., 1991; Voit et al., 1992). Показано, что эти факторы необходимы для активации промотора рибосомных генов. При этом, сначала UBF узнает и связывается с коровым элементом промотора и с последовательностями нуклеотидов, расположенными в upstream области промотора, а затем SL1, связываясь с UBF, переводит ген в активное состояние и обеспечивает его узнавание РНК-полимеразой I (Bell et al., 1988, 1989).В настоящее время UBF является наиболее охарактеризованным ядрышковым фактором транскрипции (Bell et al., 1988; Pikaard et al., 1990; Hisatake et al., 1991;Voit et al., 1992). Показано, что UBF относится к семейству ядерных HMG белков и отличается высокой эволюционной консервативностью (Jantzen et al., 1990; Bachvarov, Moss, 1991; Voit et al., 1992). В клетках млекопитающих UBF образован дуплетом полипептидов, UBF1 и UBF2, с молекулярными массами 97 и 94 кДа соответственно, каждый из которых обладает способностью специфически взаимодействовать с рДНК (Jantzen et al., 1990). Согласно литературным данным, на ультраструктурном уровне фактор инициации транскрипции выявляется в фибриллярных центрах ядрышек (Zatsepina et al., 1993) и/или в плотном фибриллярном компоненте (Rendon et al., 1992; Rodrigo et al., 1992; Roussel et al., 1993). Было показано, что в контрольных интерфазных клетках HeLa и СПЭВ методом непрямой иммунофлюоресценции иВБ также как РНК полимераза I остается связанным с ядрышкообразующими районами хромосом. Анализ митотических клеток в культуре млекопитающих показал, что иВБ остается связанным с хромосомами на всех стадиях митоза. При1 этом число окрашенных участков соответствовало количеству аргентофильных ЯОР (Зацепина и др., 1995).

Фибрилларин, маркер раннего процессинга рРНК.

Фибрилларин - специфичный ядрышковый белок, имеющий молекулярную массу около 34 кДа. Этот белок впервые был выделен из РИугагит ро1усерЬа1ит и назван В36. Позднее, когда он был найден в плотном фибриллярном компоненте клеток млекопитающих, он был назван фибрилларином (ОсЬб еЬ а1., 1985). Фибрилларин обнаруживается в ядрышках интерфазных клеток самых разных объектов, включая простейших, растения и позвоночных. Этот белок характеризуется высокой эволюционной консервативностью (БсЫттапс! а1., 1989; Нег^иег еХ а1., 1990; Ьареуге е! а1., 1990; ТоНегуеу ег а1., 1993).

Методом иммуноцитохимии удалось обнаружить фибрилларин в составе макромолекулярного комплекса, осуществляющего процессинг пре-рРНК. Этот макромолекулярный комплекс идентифицируется на электронно-микроскопическом уровне в виде, так называемых, «терминальных гранул», располагающихся непосредственно на новообразующихся транскриптах рибосомных генов (Мо1щеу й а1., 1993а). В состав «терминальных гранул» входит также Ш РНК, которая, как известно, необходима для начального этапа процессинга пре-рРНК (Кавв е! а1., 1990; Мои§еу й а1., 1993Ь). Согласно литературным данным, транскрипция рибосомных генов происходит в проксимальной области плотного фибриллярного компонента или на поверхности фибриллярных центров, тогда как процессинг пре-рРНК осуществляется в плотном фибриллярном компоненте (Weisenberger, Scheer, 1995). Однако, существуют наблюдения о том, что, помимо ПФК, фибрилларин может локализоваться в гранулярной части ядрышка (Puvion-Dutilleul et al., 1992). Эти результаты согласуются с данными о присутствии U3, U8, и U13 мякРНП в этом ядрышковом компартменте (Azum-Gelade et al., 1994). На основании этих наблюдений было высказано предположение о том, что помимо участия в раннем процессинге рРНК фибрилларин также необходим для более поздних этапов сборки пре-рибосом (Matera et al, 1994).

Отдельные исследования указывают на присутствие фибрилларина в составе "ядрышкового матрикса" (Ochs, Smetana, 1991). Авторы предполагают, что существует несколько популяций фибрилларина, одна из которых выполняет определенную структурную функцию.

В течение митоза фибрилларин проявляет много общих свойств с белком гранулярного компонента В23. Так, подобно В23, фибрилларин теряет связь с ядрышком при инактивации рибосомных генов в профазе митоза, не проявляет признаков избирательного связывания с ядрышковыми организаторами в метафазе и переносится в дочерние клетки в составе перихромосомного слоя. Он также входит в состав проядрышек в телофазе митоза и, кроме того, выявляется в цитоплазме клеток (Ochs et al., 1983; Jimenez - Garcia et al., 1989; Jimenez - Garcia et al., 1994; Medina et al., 1995).

Белок B23, маркер сборки пре-рибосом.

Белок В23, имеющий молекулярный вес 37 кДа (Michalik et al., 1981) относится к семейству нуклеоплазминов, с которыми обнаруживает общие аминокислотные последовательности на N-конце (Schmidt-Zachmann et al., 1987; Olson, 1990). B23 был идентифицирован и назван несколькими исследователями независимо друг от друга как ньюматрин, нуклеофозмин и N038. Он был обнаружен в ядрышках клеток млекопитающих (Kang et al., 1974), в клетках амфибий (Schmidt-Zachmann & Franke, 1988). В 1985 году Hungle с соавторами установили, что белок В23 вовлечен в транспорт пре-рибосом, а позднее этот белок был обнаружен в составе ядерного матрикса (Feuerstein et al., 1988).

Воздействие на клетки агентов, ингибирующих различные стадии транскрипции и процессинга РНК показало, что белок В23 участвует в промежуточных и терминальных стадиях биогенеза рибосом (Olson, 1990). Тот факт, что белок В23 имеет в своей последовательности ядерный сигнал свидетельствует о его способности курсировать между ядрышком и цитоплазмой (Xue & Melese 1994).

В некоторых клетках существуют две различные изоформы белка - В23.1 и В23.2, которые, возможно, выполняют различные функции. Количественные соотношения между изоформами могут меняться в соответствии с уровнем пролиферации в тканях. Одна изоформа - В23.1, найдена преимущественно в ядрышках, другая -В23.2 -в цитоплазме, где очевидно, ассоциирована с цитоскелетом (Hernandez-Verdun, 1991). Было показано, что В23.1 является стимулятором для ДНК полимеразы a (Takemura et al., 1994), a также B23.1 может быть в составе белков, скрепляющих двойную нить ДНК (Ang et al., 1994).

При вступлении клеток в митоз уровень фосфорилирования белка В23 повышается (Peter et al., 1990). Деление клеток сопровождается распадом ядрышка и перераспределением ядрышкового В23 между несколькими клеточными компартментами. К ним относятся цитоплазма и поверхность хромосом в профазе, метафазе и анафазе; а также - цитоплазматические дериваты ядрышек и проядрышки в анафазе и телофазе митоза (Ochs et al., 1983; Hernandez-Verdun, Gautier, 1994; Zatsepina et al., 1997).

Нуклеологенез ядрышка.

Как известно, во время митотического деления клеток ядрышко претерпевает глубокие структурные перестройки (Ченцов, Поляков 1974). В профазе митоза по мере инактивации транскрипции исчезают гранулы, затем плотный фибриллярный компонент, число фибриллярных центров уменьшается и, в результате, в метафазных хромосомах из основных структурных компонентов ядрышка обычно выявляются лишь фибриллярные центры, соответствующие ЯОР (Goessens, Lepoint, 1974; Goessens, 1984; Hozak et al., 1986; Зацепина и др. 1988). Лишь в некоторых клетках на поверхности хромосом выявляется фибриллярно-гранулярный материал («перихроматиновый матрикс»), который по-видимому, соответствует остаткам материнского ядрышка (Ченцов, Поляков, 1974). Полагают, что перихроматиновый матрикс служит для переноса материала «материнского» ядрышка в дочерние клетки. Предполагают, что РНП-компоненты, синтезированные в предыдущей интерфазе, могут переноситься в дочерние клетки в виде матрикса митотических хромосом (Ченцов, 1984).

В средней телофазе наблюдается восстановление структуры ядрышка. По времени это совпадает с возобновлением синтеза рРНК (Lepoint, Goessens, 1978). На этой стадии митоза вокруг ФЦ происходит формирование ПФК и гранулярного компонента (Goessens, Lepoint, 1974; Hernandez-Verdun et al., 1980). В настоящее время принято считать, что восстановление ядрышек в телофазе митоза происходит не только за счет возобновления синтеза рРНК, но и за счет рРНП-материала синтезированного до начала митоза. Действительно, на стадии телофазы, появлению зрелых ядрышек предшествует формирование в ядрах дочерних клеток РНП - содержащих телец, которые получили название предъядрышек. Иммуноцитохимическими методами установлено, что предъядрышки содержат ряд белков, характерных для зрелых ядрышек, такие как фибрилларин, нуклеолин, В23. В них также выявляют малую ядерную РНК U3 (Ochs et al., 1985; Azum-Gelade et al., 1994; Sheer, Weisenberger, 1994). Так как предъядрышки удается обнаружить в телофазных клетках, в которых синтез рРНК подавлен с помощью актиномицина Д, предполагают, что они формируются из РНП-материала матрикса митотических хромосом (Ченцов, Андреев, 1966; Ченцов, Поляков, 1974). На основании прижизненных наблюдений за клетками был сделан вывод о том, что предъядрышки участвуют в реконструкции ядрышка в телофазе митоза сливаясь с ядрышкообразующими районами хромосом (Ченцов, 1984; Scheer et al., 1993). Ряд работ указывает на то, что слияние предъядрышек с ЯОР блокируется при подавлении синтеза рРНК. Это было продемонстрировано при инъекции в клетки антител к РНК полимеразе-I (Scheer, Benavente, 1990), а также при действии актиномицина Д (Ченцов, Андреев, 1966). Роста ядрышек в дочерних клетках в этих экспериментах не наблюдалось.

Вопрос о роли предъядрышек в процессе нуклеологенеза пока остается не выясненным до конца. В связи с этим интерес представляет работа Белла с соавторами (Bell et al., 1992), которые описали процесс сборки предъядрышек in vitro в экстрактах яиц Xenopus laevis. В данной работе было показано, что предъядрышки, полученные искусственным путем, содержат все компоненты, характерные для предъядрышек, формирующихся в ходе естественного нуклеологенеза. В работе Зацепиной и соавторов было показано присутствие в анафазных и телофазных клетках цитоплазматических дериватов ядрышка, содержащих белок В23 (Zatsepina et al., 1997). Это маленькие цитоплазматические тельца, имеющие сферическую форму. В большинстве клеток их появление совпадает с началом сегрегации хромосом, а также с деградацией комплекса p34cdc2/ циклин В и дефосфорилированием фосфопротеинов, которое происходит в конце митоза (Peter et al., 1990). По своей устойчивости к детергентам и РНК-азе А эти тельца похожи на предъядрышки. Предполагается, что они могут служить местом хранения белка В23. Эти дериваты ядрышек исчезают к концу телефазы до появления зрелых ядрышек. Кроме того, они содержат в своем составе рибосомный белок SI (Hungle et al., 1985) и ядерный белок митотин (Todorov et al., 1994). Некоторые из этих телец могут содержать также фибрилларин (Zatsepina et al., 1997).

Микроядерные клетки.

Одной из экспериментальных моделей, позволяющих решить ряд вопросов, связанных с механизмами формирования и функционирования ядрышек, являются клетки, в которых ядра образуются вокруг отдельных хромосом или их небольших групп. Такие ядра были названы микроядрами (Phillips, Phillips, 1969). В отличие от нормального интерфазного ядра, объединяющего все хромосомы вместе, в микроядерных клетках индивидуальные хромосомы друг от друга пространственно разобщены. Эта особенность генома в клетках с микроядрами может использоваться для изучения функционального и структурного состояния разных хромосом, включая хромосомы, несущие рибосомные гены.

Микроядра могут образовываться спонтанно или быть индуцированы в искусственных условиях. Впервые микроядра были получены при действии ультрафиолетового облучения и цитостатических агентов на интерфазные и митотические клетки, соответственно (Swift, 1969; Phillips, Phillips, 1969). Позднее была предложена методика получения микроядер с помощью гипотонического шока (Zatsepina et al., 1982). Было показано, что под действием гипотонического шока метафазные хромосомы увеличиваются в размерах и приходят в контакт с внутриклеточными мембранными пузырьками. После переноса клеток в среду нормального состава мембранные пузырьки прочно прикрепляются^/поверхности хромосом и развиваются в мембранные цистерны, позднее - в ядерную оболочку (Zatsepina et al., 1982). Было показано, что микроядра, индуцированные обработкой цитостатиками или формирующиеся под действием гипотонического шока, обладают целым рядом признаков нормальных интерфазных ядер. Они сохраняют способность к репликации ДНК и синтезу РНК (Phillips, Phillips, 1979; Киреев и др., 1988) . Однако, по сравнению с нормальными одноядерными интерфазными клетками синтез РНК в микроядрах несколько понижен (Labidi et al., 1987). Кроме того, различные микроядра в пределах одной клетки могут иметь разный уровень транскрипции (Geraud et al., 1989). На электронно-микроскопическом уровне была выявлена структурная гетерогенность микроядер, образующихся под действием цитостатиков. В части микроядер хроматин был конденсирован, в других - деконденсирован. Гетерогенность различных микроядер наблюдалась также в отношении распределения комплексов ядерных пор и наличия ядерной оболочки: в некоторых микроядрах наблюдались разрывы в двойных ядерных мембранах и отсутствие ламины (Geraud et al., 1989).

Методами электронной микроскопии и иммуноцитохимии в микроядерных клетках были выявлены структуры, соответствующие ядрышкам нормальных одноядерных интерфазных клеток. В составе микроядрышек выявляются ФЦ, ПФК и гранулярный компонент. Однако, в части микроядер вместо ядрышек обнаруживали ядрышкоподобные тельца, которые на электронно-микроскопическом уровне имели структуру ядрышек, обработанных актиномицином Д (Phillips, Phillips, 1979; Labidi et al., 1987; Geraud et al, 1989; Нетесова и др., 1985).

В кариоплазме микроядер описаны кроме того, включения, обладающие аргентофильными свойствами , число которых превышает число Ag-позитивных ЯОР в митозе ( Phillips, Phillips, 1979).

В связи с данными некоторых авторов о том, что в микроядрах число ядрышек может превышать число ядрышек в одноядерных интерфазных клетках, было высказано предположение о существовании «латентных» ядрышковых организаторов (Swift, 1969). В одноядерных клетках их активность подавлена за счет конкретных взаимодействий с более сильными ЯОР, однако, она может проявлятся при разобщении ядрышковых организаторов в составе микроядер. Но, по видимому эти наблюдения не являются общим правилом, так как отсутствие "латентных" ЯОР было показано на других типах клеток (Labidi et al., 1987).

Материалы и методы.

Объект исследования.

В качестве объекта исследования использовали монослойную культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ, Султанова и др. ,1968). Выбор этого объекта объясняется тем, что клетки СПЭВ обладают сравнительно небольшим количеством ядрышковых организаторов (2 ЯОР на гаплоидный набор) и имеют стабильный кариотип (Султанова и др. 1968). Кроме того, известно, что эти клетки устойчивы к воздействию гипотонических растворов и в них могут формироваться микроядра (Зацепина и др., 1982). Клетки высаживали на покровные стекла в концентрации 100 - 150 тыс. кл/мл и использовали в экспериментах через 1.5-2 суток после пересева. Клетки СПЭВ выращивали в пластиковых чашках Петри на покровных стеклах при 37° С на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллин и стрептомицин ) в концентрации 100 ед/мл каждого.

Стандартные условия получения микроядер.

В качестве гипотонического раствора использовали раствор Хэнкса, разведенный дистиллированной водой до концентраций 15% и 30%. Покровные стекла с клетками обрабатывали одним из этих раствором в течение одного часа при температуре 37° С. Затем клетки переносили в свежую порцию культуральной среды и инкубировали в течение 1, 3, 6, 24 часов. После этого клетки фиксировали для световой и электронной микроскопии. После просмотра препаратов в световом микроскопе мы обнаружили, что микроядра, полученные из клеток, обработанных 30%-ным раствором Хэнкса имели большие размеры, чем микроядра, полученные в результате воздействия 15%-ного раствора Хэнкса и их количество было меньшим, то есть после обработки митотических клеток 30%-ным гипотоническим раствором достигалось более слабое разобщение генома. Таким образом, в дальнейших экспериментах мы использовали 15%-ный раствор Хэнкса.

Условия обработки теток актиномицином Д (АМД).

Актиномицин Д подавляет процесс транскрипции в клетках, вызывая своеобразную перестройку ядрышка, известную под названием "сегрегация ядрышковых компонентов". На светооптическом уровне только истинные ядрышки способны к сегрегации. Для того, чтобы отличить истинные ядрышки от ядрышко-подобных телец мы применяли раствор АМД на 96%-ном этаноле в конечных концентрациях 0,05 и 0,5 мкг/мл. Ранее показано, что низкая ( 0,05 мкг/мл) концентрация АМД избирательно блокирует синтез ядрышковой РНК, а более высокая (0,5 мкг/мл) полностью подавляет транскрипцию РНК в клетках СПЭВ (Нетесова, 1985). Клетки, обработанные в течение одного часа гипотоничным раствором и затем перенесенные в изотонию фиксировали 10%-ным нейтральным формалином или 70° этанолом через 1 и 3 часа после добавления АМД. Затем клетки окрашивали метиловым -зеленым пиронином и заключали в канадский бальзам.

Условия обработки клеток 5,6-дихлоро-/З-рибофуранозилбензимидазолом (ДРБ)

В отличие от актиномицина Д, ДРБ вызывает эффект «разворачивания» ядрышкового хроматина на отдельные рибосомные цистроны. С тем, чтобы сравнить реакцию на ДРБ нормальных ядрышек и микроядрышек стекла с культурой обработанной в течение часа гипотоничным раствором переносили в свежую порцию культуральной среды и добавляли туда раствор ДРБ в этаноле в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 6-12 часов (Scheer et al., 1984). Затем клетки фиксировали 3%-ным раствором параформальдегида (ПФА) на физиологическом фосфатном буфере (ФСБ) 20 минут при комнатной температуре, обрабатывали 1%-ным раствором Тритона - X 100 в течение 4 минут и красили антителами к белку фактору инициации транскрипции (Р 419) (Zatsepina et al., 1993). Далее клетки окрашивали вторыми антителами к иммуноглобулинам человека, докрашивали раствором Хехста (Hoechst 33258) на ФСБ в конечной концентрации 0.1 мг/мл и заключали в Мовиол (Calbiochem).

Выявление основных химических компонентов ядрышка. Выявление РНП-компонентов с помощью реакции Брате.

Стекла с культурой фиксировали 70%-ным этанолом или 10%-ным нейтральным формалином, отмывали 3 раза по 10-15 минут дистиллированной водой, слегка подсушивали фильтровальной бумагой и окрашивали в течение 24 часов метиловым-зеленым пиронином. После окрашивания клетки в течение нескольких секунд споласкивали дистилированной водой, так как при этом вымывается пиронин. Затем стекла на несколько секунд помещали в абсолютный ацетон, потом в смесь ацетон/ксилол в соотношении 1/1. Далее стекла опускали в 10%-ный раствор ацетона в ксилоле и потом просветляли в двух порциях чистого ксилола и заключали в бальзам. РНП-материал окрашивался пиронином в малиновый цвет, а хроматин метиловым зеленым - в бледнозеленый. Препараты просматривали и фотографировали в микроскопе "Оптон - 3" при увеличении объектива ЮОх и окуляра 10х.

Выявление Ag- фильных белков ядрышек.

Для выявления Ag-белков в клетках СПЭВ на светооптическом уровне использовали методику Хоуэлла и Блэка (Howell, Black, 1980) с небольшими модификациями. Клетки фиксировали холодной смесью метанола и ледяной уксусной кислоты ( 3:1) в течение 30 минут. Далее клетки отмывали последовательно (по 3 смены): 50%, 30% этанолом, проточной, дистиллированной водой, высушивали на воздухе. Для окрашивания препаратов готовили два раствора: первый включал 2% желатины и 1% (w/w) муравьиной кислоты на бидистиллированной воде; второй - 50% AgNOs на бидистиллированной воде. На чистое предметное стекло наносили одну каплю раствора желатины и две капли раствора нитрата серебра. На каплю помещали покровное стекло клетками вниз. Окрашивание проводили во влажной камере, в термостате при 60° С. Время окраски варьировало от 4 до 11 минут. Контроль за интенсивностью окрашивания проводился визуально, с помощью оптического микроскопа МБИ-3 (объектив 10х, окуляр 10х). Окрашенные стекла промывали дистиллированной водой до тех пор, пока вода не становилась прозрачной. Затем для того, чтобы избежать обесцвечивания препаратов с течением времени, стекла с клетками помещали на 30 секунд в 5%-ный раствор гипосульфита натрия. Затем стекла промывали водой, обезвоживали в спиртах и заключали в канадский бальзам. Полученные препараты изучали и фотографировали в световом микроскопе "Оптон-3".

Реакция Фельгена.

Для определения количества ДНК в клетках с микроядрами клетки фиксировали смесью Карнуа 10 минут, обрабатывали 5Н HCl при 37°С в течение 7 минут. Далее стекла промывали холодной дистиллированной водой и помещали в реактив Шиффа на 30 минут. Затем препараты последовательно промывали сернистой водой 3 раза по 5 минут и дистиллированной водой. Потом препараты высушивали на воздухе при комнатной температуре и заключали в бальзам.

Иммуноцитохимическое изучение клеток.

Для иммунолокализации ядрышковых белков клетки фиксировали 3%-ным ПФА, разведенным на ФСБ pH 7,2-7,4 в течение 20 минут, промывали ФСБ и обрабатывали 1%-ным раствором Тритона X -100 (на ФСБ) в течение 4 минут. Затем, после отмывки ФСБ, клетки инкубировали со специфическими первыми антителами к ядрышковым белкам. Далее клетки отмывали от первых антител с помощью ФСБ и инкубировали со вторыми антителами, конъюгированными с ФИТЦ или ТРИТЦ (Sigma). Затем клетки докрашивали раствором Хехста (на ФСБ) в конечной концентрации 1мкг/мл, отмывали трижды по 10 минут в ФСБ и заключали в Мовиол.

Для выявления белка В23 клетки последовательно инкубировали с моноклональными мышиными антителами, охарактеризованными ранее (Ochs et al., 1983) в течение 40 минут при 37°С, а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, разведенными на ФСБ (1:50) в течение 20 минут при комнатной температуре.

Для выявления белка фибрилларина использовали сыворотку крови аутоиммунных больных (Sigma), содержащую антитела к фибрилларину (Ochs et al., 1985). Клетки инкубировали с данной сывороткой, разведенной на ФСБ (1:50) в течение 40 минут при 37°С. После отмывки ФСБ клетки инкубировали с антителами к иммуноглобулинам человека, разведенными на ФСБ (1:50) в течение 20 минут при комнатной температуре.

Локализацию белка - фактора инициации транскрипции РНК-полимеразы I изучали, окрашивая клетки сывороткой (Р419), полученной от больных ревматоидным артритом, содержащей, как было описано ранее ( Zatsepina et al ., 1993), антитела к данному фактору инициации транскрипции. Клетки обрабатывали сывороткой Р419, разведенной на ФСБ (1:100) в течение 40 минут при 37°С. Со вторыми антителами к иммуноглобулинам человека разведенными на ФСБ (1:50) клетки инкубировали 20 минут при комнатной температуре.

Для выявления белка ламина В клетки инкубировали с поликлональной кроличьей сывороткой, содержащей антитела к ламину В. Сыворотку разводили ФСБ в соотношении 1:50 и окрашивали клетки в течение 40 минут при температуре 37°С. Далее клетки отмывали ФСБ от первых антител и инкубировали со вторыми антителами, конъюгированными с ФИТЦ или ТРИТЦ (Sigma) в течение 20 минут при комнатной температуре.

В случае двойного окрашивания препаратов на белок позднего процессинга -фибрилларин и белок сборки пре-рибосом В23 клетки последовательно инкубировали с сывороткой, содержащей антитела к фибрилларину, с ТРИТЦ-мечеными антителами к иммуноглобулинам человека, затем с антителами к В23 и с ФИТЦ-мечеными антителами к иммуноглобулинам мыши.

В случае двойного окрашивания клеток на белок гранулярного компонента В23 и ламин В, клетки инкубировали в смеси первых антител, разведенных как описано выше и затем в смеси вторых антител к иммуноглобулинам мыши, мечеными ФИТЦ и антител к иммуноглобулинам кролика, мечеными ТРИТЦ. Условия инкубации и разведения были такими как описано выше. В контроле вместо первых или вторых антител использовали ФСБ. Полученные препараты докрашивали раствором Хехста, заключали в Мовиол и просматривали в микроскопе "Оптон - 3".

Определение транскрипционной активности ядрышек в микроядерных клетках. Радиоавтографический метод.

Во всех экспериментах был использован Н3-уридин (конечная активность 370 кБк/мл; удельная активность 814 ГБк/моль). Изотоп вводили в конечной концентрации 10 мкК/мл среды на 20 минут. После окончания инкубации с изотопом клетки трижды промывали средой 199 без сыворотки, фиксировали смесью спирта и уксусной кислоты -3/1 в течение 20 минут и сушили на воздухе. Сухие препараты приклеивали бальзамом к предметным стеклам клетками вверх. После высыхания их обрабатывали 5%-ной ТХУ кислотой в течение 10 минут при 4°С для удаления невключившихся предшественников, промывали 1-2 часа в проточной воде и высушивали на воздухе. Препараты покрывали эмульсией фирмы " Merk" при помощи проволочной петли. Экспозицию проводили в течение 4-7 дней в холодильнике, проявляли в амидоловом проявителе 2 минуты и фиксировали 10 минут (Епифанова и др., 1977). Препараты после промывания в проточной воде окрашивали гематоксилином Караччи 10 минут и просматривали в микроскопе "Оптоп-3".На каждом препарате количество зерен серебра подсчитывали в 50 клетках.

Нерадиоавтографический подход к определению транскрипционной активности ядрышек с помощью BrUTP.

Для повышения чувствительности и разрешающей способности локализации транскрибирующихся генов, мы использовали метод выявления эндогенной активности РНК-полимеразы I в фиксированных клетках (Moore et al., 1973;1974). Методика была модифицирована применительно к условиям работы с клетками культуры СПЭВ. Клетки быстро фиксировали метанолом (-20° С) и ацетоном (5-10 маканий), затем промывали холодным (-4°С) физиологическим буфером ( ФБ: 100 мМ КС2СООН, ЗОмМ KCl, 10 мМ Na2HP04, 1мМ MgCl2, 1мМ dl-DTT, 2мкг/мл aprotinine, 500 мкМ PMSF, pH 7.2, 10 мкг/мл а-amanitin) и инкубировали с инициирующим буфером (ИБ). 50 -100 мкл ИБ содержат: 250 мкМ ATP, GTP,CTP и BrUTP, 125 мкМ MgCl2. 100 U/мл ингибитора РНК-азы (Boehringer).

На стекло помещали 50 мкл инициирующего буфера и инкубировали клетки во влажной камере от 5 минут до одного часа при температуре 33°С. Затем клетки промывали ФБ и постфиксировали 2%-ным ПФА на ФСБ в течение 20 минут, затем обрабатывали клетки 1%-ным Тритон X - 100 в течение 4 минут и промывали ФСБ три раза по 3 минуты, далее клетки окрашивали антителами к BrUTP, разведенными ФСБ в 50 раз в течение 40 минут при 37°С, промывали ФСБ трижды по 3 минуты и окрашивали вторыми антителами ( антитела IgG мыши), конъюгированными с ФИТЦ и разведенными ФСБ в соотношении 1:50. Окраску проводили во влажной камере в темноте 20 минут при комнатной температуре. Перед заключением в Мовиол препараты докрашивали раствором Хехста Полученные препараты изучали в микроскопе "Оптон - 3".

Электронная микроскопия.

В работе использовалась стандартная процедура подготовки образцов для электронно-микроскопического исследования (Уикли,1975 с некоторыми модификациями). Клетки фиксировали 2.5%-ным глутаровым альдегидом (рН 7.2-7.4), разведенным на 0.1М фосфатном буфере Зеренсена. Фиксированные клетки промывали 10 минут в двух сменах буфера, на которых был приготовлен фиксатор и дофиксировали 1%-ным раствором 0S04 в течение 1 -2 часов при комнатной температуре. Далее клетки обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне (контрастирование образцов 2%-ным раствором уранилацетата Na осуществляли одновременно с обезвоживанием в 70%-ном этаноле): 50%-ный этанол - 3 смены по 15 минут 70%-ный этанол (с 2% уранилацетата Na) 80%-ный этанол - 3 смены по 15 минут 96%-ный этанол - 30 минут 100%-ный ацетон - 3 смены по 15 минут.

Далее проводили пропитку образцов в смесях ацетона с эпоном и заливку в смесь Эпон 812 (Serva). Для этого использовали смесь следующего состава: 9 частей Эпон 812 6 частей DDSA 4 части MNA

В смесь перед использованием добавляли 0.1% катализатора полимеризации DMP-30 (пропитку образцов осуществляли в нескольких смесях 100%-ного ацетона и Эпона (v/v): 3:1 2 часа

1:1 2 часа

1:3 18 часов чистый Эпон 24 часа

После пропитки образцы помещали в свежую заливочную смесь в лунки тефлоновых пластинок. Полимеризацию смолы проводили двое суток при 37° С и сутки при 60° С.

После окончания полимеризации смолы стекла удаляли с помощью жидкого азота и горячей воды, предварительно очистив поверхность стекла от Эпона и просматривали заливки в фазовом контрасте. Нужную клетку отмечали при помощи металлического метчика, надетого на объектив микроскопа, затачивали на эту клетку блок и резали на ультратонкие срезы (толщиной 600-800 А) на ультратоме фирмы LKB - III. Срезы вылавливали на бленды, покрытые подложкой из формвара и контрастировали цитратом свинца (Reynolds, 1963). Срезы просматривали и фотографировали в электронном микроскопе HU - 11В или HU -12 (ускоряющее напряжение 75 кВ)г

Морфометрические измерения.

Морфометрический анализ включал:

2. Определение числа гранул серебра, выявляемых на 1,3,6,24 часа инкубации в изотоничной среде после А§-окраски в одноядерных интерфазных клетках и клетках с микроядрами. На каждый срок инкубации было проанализировано по 20 клеток.

3. Сравнительный анализ уровня мечения Н3 - уридином микроядер и одноядерных интерфазных клеток, расположенных на том же стекле. Для этого изучали клетки не инкубированные и инкубированные с АМД. На каждую точку было проанализировано по 50 клеток.

Результаты.

Динамика клеток с микроядрами.

Общая схема получения микроядер и некоторые их свойства были описаны ранее в клетках культуры ткани СПЭВ (Киреев и др., 1986; Зацепина и др., 1982). В частности было показано, что клетки с микроядрами появляются в культуре после 1-часового воздействия гипотонического шока и последующей их инкубации в изотонической среде в течение 2-3 часов. Но в этих работах не была прослежена в деталях судьба клеток с микроядрами. С тем, чтобы описать динамику микроядерных клеток в процессе их инкубации в изотонической среде, покровные стекла с клетками, обработанными в течение часа 15% раствором Хэнкса, помещали в свежую порцию культуральной среды и инкубировали в ней от 1 до 24 часов. После окраски препаратов гематоксилином Каррачи было видно, что структура хроматина изменяется в зависимости от времени инкубации в изотонии. Через один час после возвращения клеток в изотоничную среду в них преобладают микроядра, содержащие конденсированный хроматин и частично повторяющие форму хромосом. Микроядра, как правило, имели расширенное перинуклеарное пространство и не содержали ядрышек (рис.1 А). Такие микроядра мы условно назвали "незрелыми". Через 3 - 6 часов пребывания клеток в изотоничной среде в подавляющем большинстве микроядер хроматин был полностью деконденсирован, так что по своей морфологии они напоминали ядра одноядерных клеток. В таких микроядрах выявлялись отчетливые ядрышки (рис. 1 Б). Этот тип микроядер мы условно определили как "зрелые". Количество "зрелых" микроядер в клетках варьировало от 10 до 40 штук, размер "зрелых" микроядер составлял приблизительно 3 мкм. Кроме того, на 6-ти часовых препаратах выявляются клетки, ядра которых имеют сложную лопастную форму, что отличает их от типичных интерфазных ядер, имеющих сглаженные контуры. По своим размерам они также отличались от микроядер. Подобно "зрелым" микроядрам, лопастные ядра содержали деконденсированный хроматин и ядрышки. Эту группу клеток мы условно обозначили как клетки с "лопастными" ядрами. Через 24 часа инкубации в изотоничной среде на препаратах данные группы клеток преобладают (рис. 1 В). Появление клеток с лопастными ядрами сопровождается уменьшением среднего числа микроядер на клетку. Доля клеток с лопастными ядрами среди общего числа клеток с микроядрами от 6 до 14 часов составляет около 80%. Начиная с 14-18 часов доля клеток с лопастными ядрами прогрессивно уменьшается, также как и доля клеток со зрелыми микроядрами (график 1). Эта динамика косвенно свидетельствует о том, что лопастные ядра происходят из микроядер в результате слияния последних. Еще одно свидетельство в пользу того, что микроядра могут сливаться было получено после использования антител к белку ламину В (рис.2). На ранних сроках инкубации клеток в изотонии антитела к белку ламину В окрашивают поверхность микроядер, включая те, которые располагаются в непосредственной близости друг от друга (рис. 2 А - Г). На более поздних сроках инкубации клеток в изотоничной среде слой ламины между соседними микроядрами не выявляется, что говорит об объединении (слиянии) отдельных микроядер (рис. 2 Д,Е). Предположение о слиянии отдельных микроядер непосредственно было подтверждено прижизненными наблюдениями за клетками (рис 3 А,Б). На рисунке ЗА можно видеть, что через 2 часа пребывания в изотоничной среде в клетке присутствует около 20 отдельных микроядер, тогда как через 10 часов инкубации клеток в изотоничной среде микроядра несколько увеличиваются в размерах, а количество их сокращается за счет того, что часть микроядер сливаясь друг с другом, образует ядра лопастной формы (рис. ЗБ).

Изменение кол-ва клеток с течением времени

120

100 I* га ш ■

С о Ф 3

Ю О н о т о 1и к ц о С[ Лопастные ядра ■"Незрелые" микроядра -"Зрелые" микроядра

20

Время, мае.

Как уже говорилось выше, с течением времени происходит уменьшение общего количества клеток с микроядрами и с лопастными ядрами (график 1). Этот процесс сопровождается появлением метафазных пластинок с октаплоидным содержанием ДНК (гистограмма 1), которые практически отсутствуют в контрольной культуре. Это указывает на то, что клетки с микроядрами способны вступать в митоз. Эти наблюдения хорошо соответствуют ранее опубликованным данным Киреева и соавторов (1988), которые показывают, что клетки с микроядрами способны реплицировать ДНК. Таким образом, наши наблюдения показывают, что воздействие гипотонического шока на митотические клетки СПЭВ приводит к пространственному разобщению хромосом на отдельные микроядра, число которых в отдельных клетках сопоставимо с числом хромосом, характерным для клеток культуры СПЭВ и во всех случаях превышает количество ядрышковых организаторов (2 ЯОР на гаплоидный набор хромосом. 4 ЯО-хромосомы на тетраплоидную клетку). Отдельные микроядра имеют тенденцию сливаться друг с другом, а клетки с микроядрами и лопастными ядрами могут вступать в митоз. Это говорит о том, что гипотоническое воздействие, использованное в настоящей работе, является физиологически обратимым.

Общая характеристика и число ядрышек в клетках с микроядрами.

В более ранних работах ( Зацепина и др., 1982; 7а1верта й а1. 1982) было показано, что в клетках с микроядрами могут формироваться ядрышки, содержащие фибриллярные центры (ФЦ), плотный фибриллярный компонент (ПФК) и гранулярный компонент ( ГК). Однако динамика числа и размеров ядрышка описаны не были. В настоящей работе мы изучили этот вопрос, используя различные подходы, а именно: окраску ядрышек

Распределение метафазных клеток по содержанию ДНК метиловым зеленым-пиронином, обработку ядрышек актиномицином Д и окраску клеток азотнокислым серебром.

Данные световой микроскопии по изучению контрольных препаратов, окрашенных по методу Браше метиловым зеленым-пиронином показывают, что в интерфазных одноядерных клетках метиловым зеленым выкрашивается хроматин ядра. Пиронином в бледно-розовый цвет окрашивается РНК цитоплазмы и в темно-розовый - ядрышек. Никаких других структур, окрашивающихся пиронином, в кариоплазме интерфазных клеток выявлено не было (рис. 4 А). В большинстве интерфазных клеток СПЭВ количество ядрышек на клетку составляет 1-3. Приблизительно в 10%-тах клеток имеется 4 ядрышка. Среднее число ядрышек на клетку составляет 2,3 ±0,12. Размеры ядрышек колеблются от 1,2x1,2 мкм до 4,8x1,6 мкм. Средний размер составляет 2,7 - 3,0 мкм. В световом микроскопе ядрышки интерфазных клеток СПЭВ, окрашенные пиронином, имеют гомогенную структуру и высокую оптическую плотность. Они разнообразны по форме. В культуре встречаются клетки с ядрышками сферической формы, а также клетки, которые содержат овальные, вытянутые в одном направлении, неправильной формы, с неровными краями ядрышки. Аналогичные результаты были также получены при изучении одноядерных интерфазных клеток, расположенных на тех же препаратах, что и клетки с микроядрами.

На ранних сроках инкубации в изотонии (1-3 часа) преобладают клетки с микроядрами не содержащими пиронинофильных ядрышек и гранул. Ядра в них равномерно окрашиваются в бледно-зеленый цвет (рис. 4 Б). По всей вероятности, это "незрелые" микроядра, содержащие конденсированный хроматин и не имеющие ядрышка (рис.4Б). Очевидно, эта стадия формирования микроядер соответствует телофазе (ранней Ох) нормального митоза (Ченцов, Поляков, 1974). В клетках со «зрелыми» микроядрами через 3 -6 часов инкубации в изотонии пиронинофильные ядрышки хорошо видны. Их число составляет 3-7 (гистограмма 2), в среднем 5,3±0,25 (рис. 4 В). Размеры ядрышек варьируют в пределах от 0,1x1,0 до 2,4x3,2 мкм. Средний размер составляет 1,8 мкм, что несколько меньше среднего размера ядрышка в интерфазных клетках. Кроме того, в кариоплазме клеток с микроядрами обнаруживаются пиронинофильные гранулы, размеры которых колеблются от 0,8x0,8 до 1,6x3 мкм.

С тем, чтобы отличить пиронинофильные гранулы от истинных ядрышек, клетки СПЭВ инкубировали с актиномицином Д. В эксперименте были использованы две концентрации актиномицина Д (АМД) - 0,05 мкг/мл и 0,5 мкг/мл, которые подавляли синтез рибосомной и тотальной РНК, соответственно. Результаты экспериментов показали, что обе концентрации АМД оказывают одинаковый эффект на поведение ядрышек как в одноядерных, так и в многоядерных клетках. В интерфазных одноядерных клетках, обработанных АМД и окрашенных по методу Браше, количество ядрышек соответствует таковому в контрольных препаратах. Средний размер ядрышек составляет 1,1 мкм в диаметре, что значительно меньше среднего размера ядрышек в контрольных препаратах. В обеих концентрациях актиномицин Д вызывает отчетливую сегрегацию ядрышек. Сегрегированные ядрышки интерфазных клеток выглядят как округлые тельца имеющие высокую оптическую плотность. Часть ядрышка имеет вид "светлой" шапочки, которая прилежит к более темной части ядрышка. Из литературных источников известно, что "светлые" шапочки сегрегированных ядрышек соответствуют фибриллярным центрам, а плотная часть - гранулярному компоненту (Челидзе, 1982; Нетесова, 1985). По внешнему краю "светлой" шапочки имеется тонкая полоска хроматина.

В клетках со «зрелыми» микроядрами и лопастными ядрами лишь часть пиронинофильных гранул была способна к сегрегации. Только те гранулы, которые

Количество ядрышек в клетках

ИВ клетках с микроядрами ВИВ одноядерных контрольных клетках проявляли признаки сегрегации, характерные для нормальных ядрышек, мы принимали за истинные ядрышки. Количество ядрышек в микроядрах составляет 1-6, в среднем 4,0±0,3 на клетку. Размер ядрышек в микроядрах варьирует от 0,4x0,4 мкм до 0,8х0,8мкм. Их средний диаметр составляет 0,65 мкм. Структура ядрышек в микроядрах после действия актиномицина Д соответствует структуре ядрышек в одноядерных клетках, обработанных актиномицином Д (рис 5 Б). В отличие от истинных ядрышек кариоплазматические пиронинофильные гранулы не способны к сегрегации. После обработки актиномицином Д в клетках с "незрелыми" микроядрами хроматин находится в конденсированном состоянии и, как правило, не выявляются ядрышки (рис. 5 А). Таким образом, наши наблюдения за клетками, обработанными актиномицином Д показывают, что среднее число ядрышек в клетках с микроядрами оказывается больше, чем в контроле.

Характеристика белковых компонентов ядрышка в клетках с микроядрами. Окрашивание азотнокислым серебром.

Окрашивание ядрышек в клетках с микроядрами метиловым зеленым-пиронином показывает, что подобно ядрышкам интерфазных клеток они содержат РНК. Вопрос о том, содержат ли микроядрышки белки, характерные для нормальных ядрышек, мы анализировали с помощью окрашивания клеток азотнокислым серебром и антителами к основным ядрышковым белкам.

При наблюдении препаратов в световой микроскоп было обнаружено, что в интерфазных клетках СПЭВ как в контроле, так и после действия гипотонии гранулы серебра выявляются только над ядрышками. В цитоплазме интерфазных клеток серебро не обнаруживается (рис.6 А). Количество зерен серебра над ядрышками составляет 20 - 32 штуки, что полностью соответствует литературным данным (2а1зерта ег а1.,1990).

Напротив, в клетках с микроядрами, которые формируются на ранние сроки инкубации в изотонии ( "незрелые" микроядра) выявляется почти вдвое больше А§-зерен (табл.1) (рис. 6 Б). Существенно, что зерна серебра были обнаружены в составе всех микроядер независимо от их размера и положения в клетке. Кроме того, встречаются клетки, где зерна серебра в небольшом количестве (1-10 зерен) располагаются над цитоплазмой; количество таких клеток составляет не более 5% от общего числа клеток с микроядрами.

С увеличением срока инкубации клеток в изотонии происходит концентрация метки над ядрышками; и из кариоплазмы зерна серебра исчезают. В лопастных ядрах зерна серебра располагаются в основном над ядрышками (рис.6 Г). В целом, их А§-окраска соответствует таковой в одноядерных интерфазных клетках.

Выявление С1ВР.

Белок иВБ, или фактор инициации транскрипции, контролирует транскрипцию рибосомных генов и локализован в фибриллярных центрах. Для выявления иВБ в интерфазных клетках, а также в клетках с микроядрами мы использовали сыворотку от больного ревматоидным артритом (Р419) (2а1зерта е! а1., 1993). После окрашивания интерфазных одноядерных клеток данной сывороткой можно наблюдать следующую картину. В контрольных, не обработанных гипотоническим раствором клетках, гранулы ЦВБ выявляются в целом исключительно над ядрышками, их число составляет 20-40 штук на ядро. В интерфазных клетках, подвергнутых воздействию гипотонии, выявляется в целом 20 - 40 гранул, которые располагаются исключительно над ядрышком. Кариоплазма окрашивается на уровне фона, цитоплазма не флюоресцирует. иВБ-положительные гранулы располагаются преимущественно над ядрышками, однако, одиночные светящиеся гранулы можно выявить также над нуклеоплазмой. По-видимому, эти зерна являются

Время инкубации клеток в изотонии Среднее количество зерен серебра на клетку с микроядрами Среднее количество зерен серебра на одноядерную клетку

1 час 50-80 31 -35

6 часов 70-80 •30-35

24 часа 30-40 27 - 38 результатом гипотонического воздействия, так как никогда не выявляются в необработанных ядрах. В клетках с микроядрами UBF выявляется в виде ярко флуоресцирующих гранул, начиная с ранних (1час) сроков инкубации в изотонии. Флуоресцирующие гранулы располагаются только в микроядрах, хотя не все микроядра оказываются окрашенными. В "незрелых" микроядрах число этих гранул не превышает 10 -13 штук. "Зрелые" микроядра могут содержать до 20 флюоресцирующих гранул. Таким образом, количество этих гранул оказывается меньше, чем в интерфазных клетках, но превышает число ядрышковых организаторов характерное для митоза (рис.7 Á-E). В лопастных ядрах наблюдаемых через 6-24 часа инкубации в изотонии, помимо одиночных гранул UBF выявляются кластеры гранул, располагающиеся над ядрышками. В целом, характер их флуоресценции соответствует таковому в одноядерных интерфазных клетках и соответствует числу ядрышек в многоядерных клетках (рис.7Ж-К).

До сих пор нет прямых данных о том, сколько фибриллярных центров может быть образовано одним ядрышковым организатором и в чем состоят функциональные различия между разными ядрышкообразующими районами хромосом на стадии интерфазы. Клетки с микроядрами являются удобной моделью для ответа на эти вопросы, поскольку ядрышковые организаторы в них пространственно разобщены и потому могут быть визуализованы более однозначно, чем в контрольных ядрах. Можно было ожидать, что воздействие ДРБ, реагента, вызывающего разрыхление ядрышкового хроматина, выявит эти различия. В соответствии с литературными данными, обработка клеток ДРБ привела к разрыхлению упаковки UBF-позитивных гранул в нормальных ядрышках. В них флуоресцирующие UBF-позитивные гранулы располагались в виде протяженных цепочек, где каждая из бусин, как полагают, представляет собой одиночный работающий ген (Scheer et al., 1984) (рис. 8 А). При воздействии ДРБ на "незрелые" микроядра явного эффекта m f ч> и разворачивания ядрышек мы не наблюдали (рис. 8 В-Е). Феномен разрыхления ядрышек в клетках с микроядрами проявлялся наиболее отчетливо через 6 часов инкубации в изотоничной среде. В этих условиях хорошо видны ядрышки, которые резко различаются по интенсивности окраски и количеству UBF-позитивных гранул (рис. 8 В-К). Вариабельность составляет от 5 до 15 гранул на ядрышко. Эти наблюдения впервые показали, что в составе индивидуальных ЯОР на стадии интерфазы имеется разное число работающих генов.

Окраска на фибрилларин

Белок плотного фибриллярного компонента - фибрилларин в интерфазных клетках СПЭВ выявляется в ядрышках в виде крупных светящихся гранул размером около 0,5 мкм. Во многих клетках он образует скопления тяжеобразной формы, повторяющей форму ядрышек (рис. 9А,Б). Слабое свечение нуклеоплазмы, видимое в некоторых ядрах, соответствует слабому свечению нуклеоплазмы на препаратах, служащих в качестве контроля ко вторым антителам. Флуоресценция цитоплазмы на всех препаратах, окрашенных антителами к фибрилларину, отсутствует. Окраска интерфазных клеток, обработанных гипотоничным раствором и инкубированных затем в изотоничной среде полностью соответствует окраске интерфазных клеток на контрольных препаратах, не подвергнутых обработке гипотоническим раствором.

В клетках с микроядрами после 1-6 часов инкубации в изотонии фибрилларин выявляется в виде многочисленных яркосветящихся пятен над каждым микроядром . Нуклеоплазма в клетках с микроядрами флуоресцирует на уровне фона, а цитоплама не окрашивается антителами к фибрилларину (рис.9 В,Г). В лопастных ядрах фибрилларин

17

ЧЩ0' * 1 * • » w f •

• • V Л « » » * • É # - « # #

• ' w * л ■ . * выявляется исключительно над ядрышками, подобно интерфазным одноядерным клеткам клетках (рис.9 Д,Е).

Окраска на В23.

Белок В23 является основным белком гранулярного компонента ядрышек, участвующим в созревании прерибосом. При окрашивании антителами к белку В23 интерфазных клеток, расположенных на тех же препаратах, что и клетки с микроядрами, нам не удалось обнаружить признаков, отличающих их от контрольных, не обработанных гипотонией клеток. На стадии интерфазы наиболее интенсивно окрашиваются ядрышки, слабо и гомогенно флуоресцирует кариоплазма, свечение полностью отсутствует в цитоплазме (рис.10 А,Б). Во многих клетках наиболее ярко окрашивается периферия ядрышек. После окрашивания клеток с микроядрами антителами к белку В23 было обнаружено, что микроядра окрашиваются по-разному. На ранних сроках инкубации клеток в изотоничной среде (1 и 3 часа) "незрелые" микроядра не окрашиваются антителами к В23, в то время как цитоплазма клеток ярко и однородно флуоресцирует (рис.10 В,Г и рис. 12 А,Б). Кроме того, в цитоплазме клеток с "незрелыми" микроядрами располагаются одиночные ярко флуоресцирующие гранулы, число которых может доходить до 10 на клетку (рис.10 В,Г). На более поздних сроках инкубации клеток в изотонии по мере деконденсации хроматина и формирования ядрышек (6 часов) характер окрашивания клеток меняется. В этих условиях отчетливо выделяются две популяции клеток. В одной из них антителами к В23 окрашивается только кариоплазма микроядер (рис. 12 Д), тогда как в другой отчетливо выявляется окраска микроядрышек (рис. 10 Д,Е). В обоих типах клеток полностью отсутствует флуоресценция цитоплазмы, (рис.10 Д,Е). Характер флуоресценции ядрышек полностью идентичен таковому в контроле (рис.10 Д,Е). В клетках с лопастными ядрами отчетливо выявляется флуоресценция ядрышек, хотя встречаются флуоресцирующие гранулы явно не ядрышкового происхождения (рис 10 Ж,3).

Двойное окрашивание клеток антителами к фибрилларину и В23.

Изучение митотических клеток (см. ниже) показало, что на стадии телофазы фибрилларин мигрирует в ядрышки раньше, чем белок В23. С тем, чтобы сравнить локализацию и поведение белков фибрилларина и В23 в клетках с микроядрами их инкубировали с антителами к В23 и сывороткой к фибрилларину. В контрольных интерфазных клетках оба белка располагаются в ядрышке, однако площадь занятая В23 визуально превышает таковую для фибрилларина. В "незрелых" микроядрах (1-3 часа инкубации в изотоничной среде) антителами можно выявить только фибрилларин, в то время как белок В23 в микроядрах на данный срок отсутствует (рис. 11А,Б). Начиная с 6 часов инкубации в изотонии можно видеть в микроядерных клетках наличие обоих белков. Причем фибрилларин выявляется над каждым микроядром независимо от наличия ядрышек, а белок В23 окрашивает различные микроядра в пределах одной клетки по-разному. Окраска тех микроядер, в которых присутствуют ядрышки, как правило, оказывается менее сильной, чем в тех микроядрах где ядрышек нет . В лопастных ядрах, как описывалось выше, оба белка выявляются над ядрышками как и в интерфазных клетках.

Эти наблюдения говорят о том, что как и в нормальном митозе, фибрилларин мигрирует в ядрышки до белка В23.

Двойное окрашивание клеток антителами к белку В23 и к ламину В.

Известно, что во время нормального нуклеологенеза белок В23 появляется в ядрышках после восстановления ядерной оболочки и слоя ламины. С тем, чтобы выяснить А сохраняется ли эта динамика при формировании микроядрышек, мы провели одновременное окрашивание клеток антителами к белку ядерной оболочки ламину В и белку гранулярного компонента ядрышек В23. Полученные результаты показали, что на более ранних сроках развития (рис.12 А,Б) (1-3 часа инкубации в изотонии) белок В23 содержится в цитоплазме многоядерных клеток в виде ярко флуоресцирующих пятен, но не выявляется в нуклеоплазме и в ядрышках. В этих же клетках белок ламин В выявляется по периферии большинства микроядер, подобно тому, что наблюдалось при одиночном окрашивании на ламин В (рис. 12 В). На более поздних сроках инкубации клеток в изотонии (6 часов) в клетках со зрелыми микроядрами окраска на ламин В становилась более отчетливой, чем на ранние сроки. В этих условиях В23 выявляется в составе всех ядер, но не виден в составе ядрышек (рис. 12 Г,Д,Е). Эти наблюдения говорят о том, что подобно нормальному митозу в микроядерных клетках В23 также мигрирует в ядра после формирования ламины и ядерной оболочки.

Определение транскрипционной активности ядрышек в клетках с микроядрами.

Радиоавтографический метод.

Для выяснения способности микроядер к транскрипции мы провели эксперименты по включению в микроядра радиоактивного предшественника РНК - Н3-уридина, и радиоавтографического способа определения активности in situ. Наши результаты показали, что 20 минутная инкубации клеток с изотопом оказывается достаточной для интенсивного мечения интерфазных ядер и ядрышек в контроле. В полном соответствии с литературными данными (Дудник и др., 1993) примерно половина всех зерен серебра

Г/ в располагалась в контрольных клетках над ядрышками, тогда как метафазные клетки были транскрипционно неактивными.

Мечение клеток, подвергнутых гипотоническому шоку показало, что на ранние сроки после переноса клеток в изотонию включения предшественника в клетки с микроядрами не происходит (рис.13 А). Первые признаки включения предшественника проявляются через 3-6 часов инкубации клеток в изотонии. При этом обращает на себя внимание тот факт, что активация транскрипции в отдельных микроядрах происходит асинхронно. Значительная часть ранних микроядер остается немеченой (рис.13 Б). По мере деконденсации хроматина и "созревания" микроядер количество метки над микроядрами увеличивается, хотя прямой зависимости между размером микроядер и их способностью включать предшественник не наблюдалось (рис.13 В). Наибольшая активность проявляется в клетках с лопастными ядрами (рис.13 Г). Если принять средний уровень мечения одноядерных интерфазных клеток за 100%, то уровень мечения лопастных клеток примерно составит 120% - 150%.

Инкубация клеток с микроядрами, обработанными актиномицином Д в среде с радиоактивным предшественником РНК Н 3-уридином в течение 20 минут показала, что после трехчасового действия актиномицина Д в концентрации 0,05 мкг/мл уровень включения метки в микроядра снижается примерно на 35% по сравнению с контрольными препаратами. После трехчасового действия актиномицина Д в концентрации 0,5 мкг/мл метка перестает включаться и в микроядра, и в окружающие одноядерные клетки (не иллюстрировано). Таким образом, эти результаты говорят о том, что в клетках с микроядрами транскрибируются как рибосомные, так и не рибосомные гены. При этом на долю рибосомного синтеза РНК приходится примерно половина всей метки.

Нерадиоавтографический метод с использованием бромированного уридинтрифосфата.

Одним из современных методов определения транскрипционной активности рибосомных генов является метод с использованием бромированного уридинтрифосфата. Этот метод основан на определении эндогенной активности РНК полимеразы I, которая сохраняется в фиксированных клетках. Сайты включения БрУТФ могут быть выявлены с помощью антител к бромдезоксиуридинтрифосфату, которые специфически узнают также БрУТФ. Использование БрУТФ показало, что в клетках СПЭВ рДНК экспрессируется в течение всей интерфазы. В интерфазных клетках включение БрУТФ проявляется в виде скоплений флуоресцирующих гранул, расположенных над зоной ядрышка. Число этих гранул варьирует в разных клетках составляя 20 - 40 гранул на ядро. Во внеядрышковых зонах ядер включения БрУТФ отсутствуют (рис.14 А,Б).

Для того, чтобы выяснить будет ли происходить реактивация рДНК, если ядрышкообразующие хромосомы окажутся пространственно разобщенными, мы изучили характер включения БрУТФ в клетки с микроядрами. Из полученных результатов видно, что БрУТФ включается в клетки с микроядрами, в которых отчетливо проявляется деконденсация хроматина, хотя степень его декомпактизации оказывается ниже, чем в контроле. На рисунке 14 А,Б,В,Г над микроядрами видны участки включения БрУТФ. Их количество, как правило, составляет 3-4 пары, что соответствует числу ядрышковых организаторов в митозе. На более поздних сроках инкубации клеток в изотонии (3 - 24 часа) включения БрУТФ выявляются, в виде скоплений флуоресцирующих гранул, располагающихся над зоной ядрышка. Эти скопления флуоресцирующих гранул различаются по размерам и увеличиваются по мере "созревания" микроядер (рис.14 Д,Е, Ж,3). Обращает на себя внимание тот факт, что индивидуальные ядрышки включают БрУТФ с разной интенсивностью (рис. 14 Ж,3).

Особенности ультраструктурной организации ядрышек в клетках с микроядрами

В полном соответствии с данными других авторов (Гозак и др., 1983; ХгЛверта. а1., 1989; Зацепина и др., 1989), наши наблюдения также показали, что в интерфазных ядрышках клеток СПЭВ отчетливо выявляются все основные структурные компоненты ядрышкового аппарата: фибриллярные центры (ФЦ), плотный фибриллярный компонент и гранулы (рис. 15). Во всех случаях ФЦ пространственно связаны с плотным фибриллярным компонентом. В дополнение, на серийных ультратонких срезах также хорошо видно, что ядрышки контактируют с ядерной оболочкой или ее инвагинациями внутрь ядра (рис. 15 А).

В клетках с "незрелыми" микроядрами обращает на себя внимание компактная упаковка хроматина (рис. 16). Вытянутая конфигурация некоторых микроядер повторяет форму митотических хромосом (рис. 16 А). Для "незрелых" микроядер характерно отсутствие типичных ядрышек. Вместо них в клетках присутствуют ФЦ, лишенные плотного фибриллярного материала и гранул (рис. 16 Б, В). На этой стадии развития клеток с микроядрами в цитоплазме наблюдаются множественные скопления гранулярных частиц, по размеру соответствующих рибосомам (рис. 16 А). В отличие от нормальных интерфазных клеток, в клетках с "незрелыми" микроядрами ядерная оболочка утолщена за счет расширения перинуклеарного пространства, и обеднена порами (рис. 16 А-В).

В клетках со "зрелыми" микроядрами хроматин находится в деконденсированном состоянии (рис. 17). Блоки компактного хроматина видны только в контакте с ядерной оболочкой (рис. 17 Б-Г). В составе некоторых микроядер видны ядрышки (рис. 17 Б). Подобно ядрышкам одноядерных интерфазных клеток, они содержат фибриллярные центры, плотный фибриллярный компонент и гранулярную часть (рис. 17 Б). Однако ультраструктура ядрышек в разных микроядрах различается. Наряду с характерными ядрышками, в микроядрах выявляются также микроядрышки с признаками структурной сегрегации фибриллярных центров от плотного фибриллярного материала (рис. 17 В). Помимо ядрышек, в микроядрах присутствуют также многочисленные тельца, образованные фибриллярно-гранулярным материалом, которые меньше по размерам, чем истинные ядрышки (рис. 17 А, В, Г). Плотность упаковки материала в этих тельцах может варьировать от однородной до ячеисто-подобной (рис. 17 В). Обращает на себя внимание также тот факт, что микроядрышки пространственно контактируют с ядерной оболочкой, что особенно хорошо видно на серийных ультратонких срезах (рис. 18 А, Б).

В клетках с "лопастнами ядрами" ядрышки сильно увеличены в размерах по сравнению с микроядрышками в "зрелых" клетках (рис. 19 А-В). В таких ядрышках хорошо видны многочисленные мелкие фибриллярные центры, ассоциированные с плотным фибриллярным компонентом. Хорошо развита гранулярная часть ядрышка (рис. 19 Б, В). Подобно нормальным ядрышкам в одноядерных интерфазных клетках, ядрышки в клетках с лопастными ядрами также оказываются ассоциированными с ядерной оболочкой или ее инвагинациями внутрь ядра (рис. 19 Б, В). Однако, существенным отличием ядрышек в лопастных клетках от нормальных ядрышек, является присутствие скоплений конденсированного хроматина внутри ядрышек (рис. 19 Б, В).

Характеристика белковых компонентов ядрышка в нормальном митозе.

Из литературных данных известно, что структурные преобразования хромосом сопровождающие появление микроядер в значительной степени напоминают процессы, происходящие в телофазе нормального митоза ( Зацепина и др., 1982; 7а1зерта е1 а1., 1982; Киреев и др., 1988). В обоих случаях формирование ядер сопровождается деконденсацией хромосом, формированием ядерной оболочки и восстановлением ядрышек.

Накопленная на сегодняшний день обширная информация о поведении основных компонентов ядрышка в нормальном митозе лишь частично описывает митотическую динамику ядрышек в клетках культуры СПЭВ, которые были использованы в настоящей работе для получения микроядер. Чтобы заполнить этот пробел, мы описали поведение основных ядрышковых белков во время митоза.

Ag-ЯOP белки.

В митотических клетках, не обработанных гипотонией, на различных стадиях митоза выявляется постоянное количество зерен серебра, составляющее 3-4 пары на клетку. В 72% клеток выявляются 3 ядрышкообразующие хромосомы, что соответствует 6 ядрышковым организаторам. Для оставшихся клеток характерно 4 ядрышкообразующие хромосомы, т.е.8 ЯОР (рис. 20). Наши результаты (рис.21 А,Б) показывают, что воздействие гипотонии на клетки в интервале от 1 минуты до 1 часа не изменяет среднего числа аргентофильных ЯОР хромосом на клетку, по сравнению с контролем и составляет 3-4 пары. хр] t, xp:

Белок фактор инициации транскрипции, ЦБР.

В результате наблюдения за митотическими клетками культуры ткани СПЭВ после их инкубации с сывороткой Р419 было выяснено, что фактор инициации транскрипции (иВБ) остается связанным с хромосомами в течение всего митотического цикла (рис.22). иВБ начинает собираться в областях ЯОР в профазе митоза одновременно с распадом ядрышка (рис. 22 А,Б). В прометафазных и метафазных хромосомах отчетливо выявляются одиночные и парные точки, общее количество которых соответствует количеству аргентофильных зон ЯОР (3 - 4). Причем, в большинстве метафазных клеток одна пара точек крупнее других (рис.22 В,Г). В анафазных клетках окрашенный материал распределяется поровну между разошедшимися хромосомами и до середины телофазы остается равным числу аргентофильных организаторов ядрышка (рис.22 В,Г). Примерно к середине телофазы, когда начинается активация рибосомных генов антителами к иВБ выявляются не одиночные флуоресцирующие гранулы, а кластеры светящихся гранул, соответствующие ядрышкам (рис.22 Ж,3). В цитоплазме митотических клеток ИВБ не выявляется.

Фибрилларин.

Анализ большого числа митотических клеток, проведенный при помощи метода непрямой иммунофлуоресценции с антителами к фибрилларину показал, что первые изменения в характере окрашивания ядрышек проявляются в профазе, когда начинается распад ядрышка и в ядрах становятся хорошо видны конденсированные хромосомы (рис. 23 А,Б) На этой стадии вместо дискретных гранул, характерных для интерфазных ядрышек, проявляется однородная окраска ядрышка. Кроме того, в профазе наблюдается слабое гомогенное свечение нуклеоплазмы, но тела хромосом оказываются неокрашенными. В прометафазных клетках, после распада ядерной оболочки начинает проявлятся слабая и гомогенная флуоресценция цитоплазмы. Однако более высокие локальные концентрации фибрилларина выявляются по периферии хромосом, в составе, так называемого, перихромосомного слоя (рис.23 В,Г) В отдельных клетках ярко флуоресцируют также остатки ядрышка, сохраняющие связь с хромосомами. На стадии метафазы, характеризующейся формированием правильной хромосомной пластинки, фибрилларин сохраняется в контакте с хромосомами и частично равномерно распределяется по цитоплазме (не иллюстрировано). В анафазе флюоресценция поверхности хромосом и цитоплазмы сохраняется (рис.23 Д,Е). Кроме того, на этой стадии в цитоплазме появляются многочисленные светящиеся гранулы размером не более 1 мкм. Их количество может варьировать в разных клетках составляя обычно 20 -30 гранул на клетку. Характер окрашивания антителами к фибрилларину телофазных клеток СПЭВ соответствует таковому на стадии интерфазы по преимущественному мечению ядрышек и отсутствию флуоресценции в цитоплазме. Однако, в отличие от интерфазы, в ядрах выявляются меньшее число светящихся зон, или проядрышек (рис.23 Ж,3). Количество проядрышек прогрессивно уменьшается в процессе телофазы и к концу митоза они исчезают полностью.

Белок В23.

В профазе, когда начинается конденсация хромосом и разрушение ядрышка белок гранулярного компонента ядрышек В23 частично остается связанным с остатками ядрышка, а частично выходит в нуклеоплазму, однако, в цитоплазме этот белок не выявляется. В метафазных клетках В23 располагается в основном в цитоплазме с более высокой концентрацией в зоне митотического аппарата (рис.24 А,Б) В анафазных клетках, когда начинается расхождение хромосом, белок В23 сохраняется в цитоплазме и выявляется на поверхности хромосом. В цитоплазме анафазных клеток этот белок выявляется в виде многочисленных мелких пятен. На стадии ранней телофазы, когда происходит постмитотическое восстановление ядрышка в ядрах начинает выявляться проядрышки, содержащие белок В23 (рис.24 В,Г). Далее, в поздней телофазе этот белок собирается в ядрышках дочерних клеток и некоторое количество его остается в проядрышках (рис.24 Д,Е)

Окрашивание метафазных хромосом антителами к белкам В23 и фибрилларину в условиях гипотонического шока.

Одновременное окрашивание клеток с микроядрами антителами к белку гранулярного компонента В23 и белку плотного фибриллярного компонента - фибрилларину показало, что по сравнению с белком В23 фибрилларин проникает в микроядра раньше (рис. 11). Исходя из того, что микроядерные клетки образуются из метафазных хромосом, нас интересовал вопрос, сохраняется ли фибрилларин на хромосомах, находящихся в растворе низкой ионной силы. Результаты экспериментов показывают, что после 10 минут, 30 минут и 1 часа пребывания клеток в гипотоничной среде метафазные хромосомы оказываются окрашенными антителами к фибрилларину (рис. 25 А,Б). Напротив, антитела к белку В23 не окрашивают хромосомы после их пребывания в гипотонии в течение 10, 30 минут, а также 1 часа (рис.25 В,Г).

Ламин В.

В полном соответствии с литературными данными после окрашивания митотических клеток антителами к ламину В можно обнаружить, что на стадии метафазы белок выявляется в цитоплазме клеток, в то время как хромосомы остаются неокрашенными (рис.26 А,Б). После сегрегации хромосом к полюсам митотического веретена ламин В начинает концентрироваться на периферии хромосом. Некоторое количество белка присутствует в цитоплазме (рис.26 В,Г) Начиная с поздней телофазы (01) белок ламин В выявляется вокруг дочерних клеток в виде непрерывного слоя подобно тому, что имеет место в интерфазных клетках (рис.26 Д,Е).

Включение БрУТФ в митотические клетки.

Делящиеся клетки СПЭВ включают БрУТФ в зависимости от стадии митоза. В профазных клетках, когда происходит конденсация хромосом, но оболочка ядра остается интактной, наблюдается снижение активности РНК полимеразы I. Транскрипция рибосомных генов в митотических клетках по нашим наблюдениям прекращается незадолго до разрушения ядерной оболочки или вскоре после начала прометафазы, то есть на тех стадиях митоза, когда в ядрышках еще сохраняется значительное количество гранулярного компонента (Ногак е1 а1., 1986). Клетки находящиеся на стадиях прометафазы, метафазы и анафазы не включают предшественник, несмотря на то, что все интерфазные ядра, расположенные в том же поле зрения активно включают предшественник (рис.27 А-3). Ядра дочерних клеток начинают вновь активно включать БрУТФ в ранней телофазе, когда начинается цитокинез (рис.27 И,К), причем включение БрУТФ происходит в оба дочерние ядра практически одновременно. Характер мечения телофазных клеток антителами к БрУТФ меняется по мере завершения митоза и реактивации ядрышек. Так, в конце телофазы над каждым ЯОР располагаются не одиночные гранулы, а скопления двух-трех или более гранул (рис. 27 Л,М). Число этих скоплений соответствует числу ядрышек. Таким образом, судьба ядрышковых белков, участвующих в транскрипции рибосомных генов (ИВБ), раннем процессинге (фибрилларин), и сборке пре-рибосомных частиц (В23) в нормальном митозе оказывается различной. В телофазе активация транскрипции рДНК происходит во всех ЯОР одновременно.

ОБСУЖДЕНИЕ

В конце прошлого столетия Раблем было высказано предположение, что в интерфазных ядрах хромосомы расположены упорядоченным образом, причем этот порядок сохраняется в ряду клеточных циклов (Alberts et al., 1995). В последние годы эта гипотеза получила новое развитие на основании результатов мечения хромосомных территорий в разных клетках животных и растений с помощью специфических зондов. Эти наблюдения говорят о том, что индивидуальные хромосомы занимают строго фиксированное положение внутри ядра, которое, по-видимому, объясняется прикреплением их теломерных и центромерных участков к ядерной оболочке. Было высказано предположение, что упорядоченное расположение хромосом необходимо для их координированного взаимодействия, однако, окончательное значение этого феномена до сих пор остается невыясненным. Неясно, каким образом пространственная организация ядра влияет на функционирование отдельных генов, которые должны транскрибироваться кооперативно. Одним из подходов для экспериментального изучения этой проблемы является изучение транскрипции генов в условиях пространственного разобщения индивидуальных хромосом в микроядрах. Объектом исследования в настоящей работе служили ЯОР хромосом, продуктом экспрессии которых в интерфазе являются ядрышки -зоны активного биогенеза рибосом.

Как известно, существует два основных способа получения микроядер: путем длительной инкубации клеток с цитостатиками (Алов, 1972) и путем воздействия растворов низкой ионной силы на делящиеся клетки (Зацепина и др., 1982). Последний метод обладает значительными преимуществами, поскольку позволяет получить большое количество микроядер на клетку, т. е. добиться реального пространственного разобщения индивидульных хромосом. Так, в клетках культуры СПЭВ, которые были использованы в настоящей работе, среднее число хромосом равно 39 (Гозак и др., 1983). При обработке культуры СПЭВ гипотоничным раствором в клетках образуются микроядра, количество которых может равняться 35 (настоящая работа; Киреев и др., 1988). Это говорит о том, что большая часть микроядер может образовываться из отдельных хромосом и не содержать ЯОР, число которых в СПЭВ равно 3-4 парам. Кроме того, получение микроядер с помощью гипотонического воздействия позволяет описать поведение хромосом на последовательных стадиях их трансформации в микроядра, т. е. воспроизвести процессы, обычно имеющие место в телофазе митоза в составе единой группы хромосом. На сегодняшний день сведения о том, каким образом происходит формирование ядрышкового аппарата в условиях пространственного разобщения хромосом, в литературе отсутствуют.

Динамика микроядерных клеток.

В хорошем соответствии с ранее полученными результатами (Зацепина и др., 1982; Киреев и др., 1986), в нашей работе максимальное количество клеток с микроядрами отмечалось после 1-часового воздействия 15% раствора Хенкса и последующей инкубацией в изотоничной среде в течение 3-6 часов. Однако, анализ динамики клеток с микроядрами показал, что на препаратах обычно встречается три основные типа микроядер, которые отражают основные этапы их формированя. Они были условно обозначены как "незрелые", микроядра "зрелые" микроядра и лопастные ядра. "Незрелые" микроядра встречались на препаратах, исключительно, на ранние сроки прекращения действия гипотонического шока (до 1 часа инкубации в изотонии). Для "незрелых" микроядер характерны относительно небольшие размеры, компактное состояние хроматина и отсутствие ядрышек или ядрышко-подобных структур и функциональная инертность. "Зрелые" микроядра - это микроядра, которые преобладают на препаратах, полученных в интервале от 1-2 до 16-20 час после окончания действия гипотонии; они содержат деконденсированный хроматин, отчетливые ядрышки и способны к синтезу РНК. Существенным признаком "зрелых" и "незрелых" микроядер является их относительно большое число (до 20-35 на клетку). Отдельные клетки с лопастными (микро)ядрами наблюдались в культуре через 1-2 час после прекращения действия гипотонического шока; однако их наибольшее число (до 100% от общего числа клеток с микроядрами) было характерно для 16-24 час инкубации культуры в изотонической среде. Так же, как и "зрелые" микроядра, лопастные ядра содержали деконденсированный хроматин, ядрышки и были функционально активны. Их основным морфологическим отличием от типичных "зрелых" мироядер было небольшое число (1-5 на клетку). От нормальных интерфазных ядер, лопастные ядра отличали неправильные контуры и большие размеры. Важно, что на необработанных гипотонией препаратах, также как и в культуре на 48 час после реверсии из гипототического шока ни один из перечисленных типов ядер не встречался. Это позволяет заключить, что появление всех типов "аномальных" клеток является результатом гипотонического воздействия, и что между ними существует четкая преемственность в развитии: с течением времени "незрелые" микроядра трансформируются в "зрелые", которые в свою очередь формируют лопастные ядра. Помимо перечисленных выше фактов, в пользу этого утверждения говорят также прижизненные наблюдения за клетками, которые однозначно показывают, что отдельные микроядра способны сливаться друг с другом (рис. 2). Клетки с микроядрами и лопастными ядрами способны вступать в митоз. Действительно, исчезновение микроядерных клеток сопровождается появлением митозов, содержащих октоплоидное, а не тетраплоидное, как в контроле, количество ДНК. Способность клеток с микроядрами к репликации ДНК была показана ранее (Киреев и др., 1986). Существенно, что октаплоидные интерфазные клетки в культуре отсутствуют. Таким образом, эти наблюдения однозначно указывают на то, что клетки с микроядрами не являются терминальной стадией развития клеток, вызываемой гипотоническим шоком.

Особенности макроорганизации ядрышек в клетках с микроядрами.

Окраска одноядерных клеток СПЭВ метиловым зеленым-пиронином или антителами на специфические ядрышковые белки в контроле показала, что среднее количество ядрышек в них составляло 2,3±0,12. Такое же количество ядрышек сохранялось в одноядерных клетках, обработанных гипотонией. В то же время, в клетках с микроядрами среднее количество ядрышек составляло 5,3±0,3.

Это говорит о том, что разобщение хромосом в составе микроядер сопровождается увеличением среднего числа ядрышек по сравнению с одноядерными интерфазными клетками. Ранее аналогичные данные об увеличении числа ядрышек в микроядрах были получены также Свифтом (Swift, 1969) и Лабиди с соавторами (Labidi et al., 1987). Некоторые из этих авторов полагали, что этот феномен связан с активацией латентных ядрышковых организаторов, которые в одноядерных клетках оказываются ингибированными (Swift, 1959; Phillips, Phillips, 1969).

Действительно, в клетках шпорцевой лягушки количество ядрышек в микроядрах, посчитанное на световом уровне, превышало число митотических ЯОР (Phillips, Phillips, 1969). Но, когда клетки с микроядрами гибридизировали in situ с меченой рДНК, оказалось, что число истинных ядрышек, т.е. структур, содержащих рибосомные гены, не превышало числа ЯОР. Электронная микроскопия вскрыла тонкое строение дополнительных "ядрышек": они представляли собой скопления плотноупакованных фибрилл РНП с немногочисленными гранулами и не содержали рДНК. На этом основании авторами был сделан вывод о том, что в микроядрах активации латентных ядрышковых организаторов не происходит (Phillips, Phillips, 1979).

В другой работе, решая вопрос о существовании латентных ядрышковых организаторов, авторы определяли количество ядрышек в клетках, подвергнутых длительному воздействию цитостатиков, на серийных ультратонких срезах. За ядрышки принимали только те структуры, которые содержали гранулярный и фибриллярный компоненты и фибриллярные центры. На основании сопоставления числа ядрышек с числом ядрышкообразующих хромосом, авторы также пришли к выводу об отсутствии латентных ЯОР (Hernandez-Verdun et al., 1979).

Полученные нами результаты также не позволяют сделать вывод о том, что формирование микроядер приводит к активации дополнительных ядрышковых организаторов. Во-первых, среднее число ядрышек, определяемое разными способами (как правило, 5), не превышало число Ag-ЯОР (6-8). Во-вторых, удалось установить, что в клетках СПЭВ латентные ЯОР отсутствуют, и в митозе число рДНК-содержащих ЯОР соответствует числу Ag-позитивных (т.е. активных) ядрышковых организаторов (Zatsepina et al., 1996). Таким образом, увеличение числа ядрышек в микроядерных клетках связано с пространственным разобщением индивидуальных хромосомных ЯОР, а не с активацией дополнительных ядрышковых организаторов. На наш взгляд существуют два основных пути, которые могут приводить к разобщению ЯОР и к увеличению числа ядрышек по сравнению с контролем. Во-первых, это может достигаться в результате индуцированного гипотонией разобщения хроматид, образующих метафазные (прометафазные) хромосомы. В результате этого ЯОР сестринских хроматид попадают в разные микроядра, где образуют самостоятельные ядрышки. Однако, этот путь представляется маловероятным, поскольку на стадиях, непосредственно предшествующих переносу клеток из гипотонии в изотонию метафазные хромосомы состоят из двух хроматид (рис.16). Более вероятно, что микроядерные клетки с большим, чем 4 числом ядрышек возникают из анафазных или телофазных хромосом, в которых разобщение ЯОР произошло естественным путем. Гипернормальное число ядрышек сохранялось в клетках с микроядрами на всех сроках их развития, свидетельствуя о том, что слияние ядрышек, которое обычно происходит в интерфазных ядрах, не является необходимым условием для их нормального функционирования (\Vachtler е! а1., 1980).

Особенности химического состава микроядрышек на разные сроки их созревания.

Выше уже указывалось, что простраственное разобщение генома в "зрелых" микроядрах и лопастных ядрах не препятствовало формированию ядрышек, интенсивно окрашивающихся пиронином и, следовательно, содержащих РНК. С тем, чтобы ответить на вопрос, способны ли микроядрышки к накоплению белков, характерных для активных ядрышек нормальных одноядерных клеток, препараты окрашивали азотнокислым серебром на А§-белки (маркеры активных рибосомных генов), а также, антителами к фактору инициации транскрипции ИВБ (маркер транкрибирующихся рибосомных генов), фибрилларину (маркер раннего процессинга рРНК) и белку В23 (маркер позднего процессинга рРНК и сборки прерибосом). Полученные результаты показали, что, несмотря на пространственное разобщение, ядрышковые организаторы были способны аккумулировать все из перечисленных белковых маркеров. При этом, характер окрашивания «зрелых» микроядрышек соответствовал таковому в нормальных одноядерных клетках. Аргентофильные белки и иВБ образовывали кластеры сравнительно мелких гранул (рис. 6 и рис.7), фибрилларин - кластеры более крупных гранул (рис. 9), а антитела к В23 окрашивали микроядрышки равномерно или в виде характерного "ободка" на поверхности (рис. 10). Эти наблюдения косвенно указывали на то, что в микроядрышках могут проистекать процессы, характерные для нормального биогенеза рибосом, включая транскрипцию рибосомных генов, процессинг пре-рРНК и созревание прерибосомных частиц. Поскольку перечисленные белки являются, кроме того, маркерами основных структурных компартментов ядрышка, таких как фибриллярные центры (Ag-белки и UBF; Masson et al., 1990; Hozak et al., 1992; Roussel et al., 1992), плотный фибриллярный компонент (фибрилларин; Ochs et al., 1985; Schimmand et al., 1989; Tollervey et al., 1993) и pars granulosa (B23; Michalik et al., 1981; Schmidt-Zachmann et al., 1987; Olson, 1990), эти наблюдения также говорили о том, что ультраструктурная организация микроядрышек, полученных с помощью гипотонического шока, соответствует таковой в нормальных ядрышках. Использование ультратонких срезов микроядрышек полностью подтвердило это предположение. Наши наблюдения, суммированные на рис. 23 - 27, показывают, что в микроядрышках могут формироваться фибриллярные центры, плотный фибриллярный компонент и гранулы. Более того, подобно нормальным ядрышкам, микроядрышки также сохраняли связь с ЯО. Таким образом, суммируя наблюдения об особенностях биохимического состава и ультраструктуры микроядрышек, полученных из митотических клеток под действием гипотонического шока, можно сделать вывод о том, что, по крайней мере, на продвинутых стадиях развития микроядерных клеток, в них могут формироваться ядрышки характерной морфологии и состава. Основным отличием микроядрышек от нормальных ядрышек являются их более мелкие размеры (от 0,1х 1,0 до 2,4хЗ,2мкм). Однако, общая площадь ядрышек на клетку, которую можно оценить исходя из среднего размера (1,8 мкм) и числа микроядрышек оказывается близкой таковой в контроле (2,3х3мкм), то есть около 9 мкм 2 и 7 мкм 2, соответственно. Если принять, что размер ядрышек является косвенным показателем их активности, то можно сделать вывод о том, что в клетках с микроядрами не происходит дополнительная активация генов.

Особенности функционального состояния микроядрышек

Присутствие в составе микроядрышек основных биохимических и структурных компонентов, характерных для активно функционирующих ядрышек нормальных одноядерных клеток, является сильным аргументом в пользу того, что микроядрышки являются местом активного синтеза прерибосом, а не пассивно накапливают белки, характерные для активных ядрышек. С тем, чтобы проверить это утверждение экспериментально, использовали два основные подхода. Традиционный подход включал инкубацию живых клеток с ЗН-уридином; второй подход был основан на способности эндогенной РНК-полимеразы I сохранять активность и элонгировать рРНК после фиксации клеток, как это было показано Муром и др. Однако, оригинальная методика Мура с соавторами предполагала использование ЗН-тимидина в качестве предшественника синтеза рРНК, что, подобно классическому радиоавтографическому методу определения активности ядрышек, обладает низкой разрешающей способностью. Поэтому, в настоящей работе перед нами встала задача адаптировать методику Мура и др. таким образом, чтобы в качестве предшественника можно было использовать бромированный уридинтрифосфат (БрУТФ), места включения которого идентифицируются с помощью антител к бромодезоксиуридину с высокими разрешением и специфичностью (Moore et al., 1974).

Использование этих подходов показало, что в клетках с микроядрами гены начинают активироваться одновременно с деконденсацией хроматина и переходом "незрелой" формы микроядер в "зрелую". Эти наблюдения хорошо соответствуют данным электронной микроскопии, которые также показывают, что появление плотного фибриллярного компонента отражающего начало транскрипции рДНК происходит одновременно с деконденсацией хроматина. При этом, характер мечения микроядер указывает на активацию как рибосомных, так и нерибосомных генов. Включение предшественников было чувствительным как к низким, так и к высоким дозам актиномицина Д, которые ингибируют синтез рибосомной и тотальной РНК, соответственно (0,05 мг/мл и 0,5 мг/мл). Это также говорит о том, что микроядра способны к синтезу как ядрышковой, так и не ядрышковой РНК.

Таким образом, на основании иммуноцитохимического, структурного и функционального анализа микроядрышек, можно сделать вывод о том, что, несмотря на пространственное разобщение, ядрышки, образованные вокруг индивидуальных ЯОР способны к транскрипции рДНК и продукции рибосом.

Особенности функционирования и организации микроядрышек в зависимости от степени разобщения индивидуальных микроядер.

Как уже указывалось, количество микроядер на клетку может варьировать от 1-5 до 25-30 на клетку (рис. 1). Уменьшение числа микроядер происходит, главным образом, за счет слияния отдельных микроядер в процессе пост-шокового культивирования клеток в изотоничной среде. В отдельных случаях это явление может наблюдаться в результате недостаточного разброса хромосом при действии гипотонии (см. также Зацепина и др., 1982). Клетки с небольшим количеством микроядер были названы в настоящей работе клетками с лопастными ядрами. Как правило, их ядрышки имели более крупные размеры и по визульным оценкам содержали больше ядрышковых белков. Кроме того, микроядрышки в лопастных ядрах более активно включали предшественники синтеза рРНК, что особенно хорошо было видно после использования БрУТФ (рис. 14 Ж,3). Так, в клетках с лопастными ядрами выявлялось до 4 сайтов включения БрУТФ, тогда как в "зрелых" микроядрах около 10-12. Аналогичные выводы были сделаны также при использовании непрямых методов определения активности рибосомных генов, таких как выявление Ag-ЯOP белков и сайтов связывания ИВБ и ультраструктуры ядрышек в составе «зрелых» микроядер и лопастных ядер (рис. 6 и рис. 7). Таким образом, наши наблюдения говорят о том, что пространственное разобщение хромосом не является препятствием для начальной активации рибосомных генов, однако, формирование полноценных в структурном и функциональном отношении ядрышек происходит только в том случае, если степень разобщенности хромосом оказывается не слишком высокой. Говоря другими словами, формирование полноценного ядрышка возможно только в том случае, если хромосомы набора оказываются внутри общей ядерной территории.

Способность рибосомных генов активизироваться одновременно сразу в нескольких мокроядрах указывает на то, что этот процесс не требует кооперативного взаимодействия хромосом и, возможно, вызывается каким-то физическим фактором, например, изменением внутриклеточного рН. В отличие от транскрипции рибосомных генов, процессинг РНК и сборка рибосом оказываются зависимыми от пространственного взаимодействия хромосом. Наиболее вероятным объяснением этой закономерности является тот факт, что для формирования пре-рибосом помимо рРНК-транскриптов, требуется также наличие других макромолекул, включая мякРНК и белки, которые кодируются неядрышко-образующими хромосомами. Можно полагать, что эти молекулы, например, мякРНК не могут беспрепятственно найти свою «мишень» и, таким образом, обеспечить процесс нормальной сборки пре-рибосом.

Известно, что в клетках млекопитающих в обычных условиях работает только около половины всех рибосомных генов (Hadjiolov, 1985). Остальные гены являются латентными, но могут быть активированы в некоторых экстремальных условиях, например, при компенсаторной активации ядрышка, вызываемого микрооблучением (Zatsepina et al., 1989). Существенно, что пространственное разобщение хромосом, по-видимому, не является стимулом для активации новых рибосомных генов. Действительно, ни один из признаков функционального состояния р-генов, таких как число UBF-сайтов над ядрышками, размер ядрышек, включение БрУТФ в микроядрах не указывает на заметное (по сравнению с интерфазой) усиление их активности. Некоторое увеличение суммарных размеров ядрышка и более активное включение предшественника Н -уридина в клетки с микроядрами могут быть объяснены тем, что для сравнения с тетраплоидными микроядерными клетками были использованы интерфазные клетки меньшей плоидности.

Судьба основных ядрышковых белков в митозе и природа материала в микроядрышках

На сегодняшний день накоплен обширный материал о поведении ядрышковых белков в митозе (Ochs et al., 1985; Hungle et al., 1985; Azum-Gelade et al., 1994; Sheer,Weisenberger, 1994; Todorov et al., 1994; Zatsepina et al., 1997). Однако, большая часть этих работ была выполнена не на клетках свиньи, которые использовали в настоящей работе для получения микроядер. Поэтому, в настоящей работе динамика белков, которые были использованы для характеристики микроядер, была проведена дополнительно.

Наиболее существенный вывод, полученный в этой части работы, состоит в том, что различные ядрышковые белки проявляют различную кинетику во время митоза. Белки, которые, участвуют в транскрипции рибосомных генов (UBF и Ag-белки) переносятся на хромосомах в дочерние клетки. При этом связь этих белков с ЯОР оказывает удивительно прочной, и они не теряются даже после длительной (1 час) инкубации клеток в гипотонической среде (рис. 15,16,17). Белок раннего процессинга рРЕОК (фибрилларин) на стадии метафазы располагается на поверхности хромосом и частично выходит в цитоплазму (рис. 18). Белок позднего процессинга рРНК и сборки прерибосом,В23, преимущественно выходит в цитоплазму (рис. 19). Оба белка, В23 и фибрилларин, входят в состав проядрышек на стадии телофазы (рис. 18 Ж,3 и рис. 19 Д,Е).

Однако, кинетика миграции фибрилларина и В23 в ядрышки в пост-митозе оказывается различной: фибрилларин мигрирует в ядрышки раньше В23. Это наблюдение находится в хорошем соответствии с наблюдениями о том, что фибриллярный компонент в реформирующихся ядрышках появляется до гранулярного (Ооевзеш апс! ЬеропИ:, 1974). Более того, В23 появляется в ядрышках только после восстановления ядерной оболочки, которое можно было наблюдать с помощью антител к ламину В (рис. 12).

Использование аналогичных подходов к окрашиванию микроядер показало, что при формировании микроядрышек фибрилларин и В23 проявляют ту же последовательность: сначала в микроядрышках появляется фибрилларин, а затем В23 (рис. 11). Так же как и в нормальном митозе, миграция В23 в микроядра происходила только после восстановления непрерывного слоя ламины (рис. 12). Эти наблюдения говорят о том, что последовательность миграции белков в ядрышки не зависит от того, в разобщенном или интегрированном состоянии, находятся хромосомы.

Пожалуй, наиболее удивительным оказался тот факт, что появление различных ядрышковых белков в микроядрах не зависело от присутствия в них ядрышковых организаторов. В наибольшей степени это относилось к белку В23, который появлялся во всех микроядрах практически одновременно с его исчезновением из цитоплазмы.

Остальные белки выявлялись в микроядрах, начиная с ранних сроков их формирования. Причины этого явления, по нашему мнению, связаны со свойствами белков и характером их взаимодействия с хромосомами. Белки, которые после гипотонического воздействия сохраняли связь с хромосомами (фибрилларин, Ag-белки и UBF) обнаруживались в составе микроядер раньше В23, который под действием гипотонического шока полностью транслоцировался в цитоплазму. Можно полагать, что эти свойства белков являются отражением их функционального значения для биогенеза рибосом, так что, белки, которые необходимы для терминальных стадий сборки рибосом, должны быть "востребованы" позже остальных, а потому мигрируют в ядра с "задержкой". Очевидно, что способность В23 мигрировать во все микроядра одновременно контролируется каким-то внутриклеточным стимулом и обеспечивается наличием в составе этого белка NLS (nucleus localization signal) последовательностей .

Внеядрышковые внутриядерные включения, содержащие основные ядрышковые белки

На всех стадиях развития микроядер, помимо ядрышек, часть ядрышковых белков, таких как Ag-ЯОР белки, фибрилларин и, в меньшей степени, В23 выявлялись не только в ядрышках, но и вне ядрышка, в кариоплазме. При этом отмечено значительное увеличение количества аргентофильных зон в клетках с микроядрами по сравнению с митозами и одноядерными интерфазными клетками. Так, если в метафазе выявляется 6-8 зерен серебра, в телофазе - 6 - 8, а в одноядерных интерфазных клетках - 20-32 (рис. 6), то в клетках с микроядрами обнаруживается от 37+6 до 84±8 зерен серебра. По данным большинства авторов, гранулы серебра в основном обнаруживаются над фибриллярным центром и плотным фибриллярным компонентом зрелых ядрышек (Goessens, Lepoint, 1985; Зацепина, Сметана, 1985; Dimova et al., 1982; Thiri et al., 1985). В связи с этим, можно было бы ожидать, что серебриться будут только те микроядра, которые содержат зрелые ядрышки. Однако, нами было обнаружено, что Ag-белки выявляются в составе всех микроядер с самых ранних сроков их формирования вплоть до момента слияния микроядер.

Вопрос о происхождении и функциональном значении внеядрышкового аргентофильного материала остается не ясным. Можно было бы предположить, что его появление происходит в результате длительного гипотонического воздействия на метафазные хромосомы, предшествующие образованию микроядер. Однако, против этой гипотезы говорит тот факт, что микроядра, формирующиеся в присутствие цитостатика колхицина, также содержали внеядрышковый аргентофильный материал (Hernandez-Verdun et al., 1979). К тому же, в нашей работе показано, что общее количество гранул серебра над митотическими хромосомами не увеличивается при инкубации клеток в гипотонии и соответствует контрольным значениям Ag-позитивных ЯОР.

Наибольшее сродство к серебру имеют следующие ядрышковые белки: С23, В23 (Lischwe et al., 1979), Ag-NOR-белок (Hubbel et al., 1979), большая субъединица PHK-полимеразы I (Williams et al, 1982) и UBF (Sheer, Rose, 1984; Ochs et al., 1985). Известно, что в интерфазе основными аргентофильными свойствами обладают РНК В23 и С23, тогда как в митозе - РНК-полимераза I и UBF (Roussel, Hernandez-Verdun 1994). Иммуноцитохимический анализ белков в микроядрах показал, что отчасти аргенотофильные свойства микроядер могут объясняться присутствием в нуклеоплазме свободного UBF. Очевидно также то, что на ранних сроках формирования микроядер, внеядрышковые аргентофильные свойства не определяются белком В23, который на эти сроки формирования микроядер в нуклеоплазме отсутствует. К сожалению, наши возможности не позволили нам использовать антитела к РНК полимеразе I и С23. Поэтому можно допустить, что часть А§-гранул содержит именно эти белки. Однако, мы не можем исключить, что часть А§-белков, которые выявляются после воздействия гипотонии, не являются аргентофильными белками в нормотонических условиях.

Таким образом, наши результаты показывают, что аргентофильный материал появляется в микроядрах с начальных этапов их формирования и по времени совпадает с деконденсацией хромосом и формированием ядрышек. В этом отношении накопление аргентофильного материала в микроядрах соответствует аналогичному процессу в телофазе нормального митоза. Показано, что при формировании дочерних ядер в кариоплазме появляются многочисленные зерна внеядрышкового серебра, соответствующие проядрышкам (РЫоп е1 а1., 1987). Присутствие А§-материала во всех без исключения- микроядрах говорит о том, что его наличие не связано с ядрышкообразующими хромосомами. По-видимому, А§-белки входят в состав фибриллярных скоплений, наблюдаемых на ультратонких срезах. Согласно общепринятой точке зрения, это материал может использоваться для построения новых ядрышек (Р1о1;оп й а1., 1987; Бипёг й а1., 1995). выводы

1. Пространственное разобщение хромосом под действием гипотонического шока не препятствует активации рибосомных генов и ассоциации ЯОР с основными ядрышковыми белками, включая А§-ЯОР-белки, фактор инициации транскрипции иВБ, фибрилларин и В23.

2. Полноценные в структурном, иммуноцитохимическом и функциональном отношении ядрышки могут формироваться только в условиях пространственного объединения хромосом, которое достигается, например, при спонтанном слиянии микроядер.

3. Во время митоза различные ядрышковые белки следуют различной кинетике: белки, участвующие в транскрипции рДНК, оказываются прочно связанными с ЯОР (А§-белки, ПВР), белки раннего процессинга входят в состав перихромосомного слоя (фибрилларин), белки позднего процессинга (В23), главным образом, выходят в цитоплазму.

4. Накопление в микроядрах таких белков ядрышка, как фибрилларин, В23 и Ад-белки, происходит вне зависимости от присутствия в них ядрышковых организаторов.

5. Порядок связывания ЯОР с основными ядрышковыми белками при формировании микроядрышек в целом повторяет аналогичный процесс при сборке ядрышек во время нормального митоза.

6. В физиологическом смысле клетки с микроядрами являются жизнеспособными, они способны к синтезу РНК, репликации ДНК и вступлению в митоз.

Список литературы.

1. Алов И. А. Цитофизиология и патология митоза. 1972. Москва. «Медицина» 264 С.

2. Гозак П., Зацепина О.В., Ченцов Ю.С. 1983. Ультраструктура, форма и число фибриллярных центров в клетках Go-периода культуры ткани почки эмбриона свиньи. Цитология. Т. 25, № 11, С. 1236-1242

3. Дудник О.А., Зацепина О.В., Ченцов Ю.С. 1993. Влияние растворов низкой ионной силы на структуру и функцию ядрышек в живых клетках СПЭВ. Цитология. Т. 35, № 5, С. 10-17

4. Епифанова О.И., Терских В.В., Захаров А.Ф. 1977. Авторадиография, Москва. «Высшая школа», 246 С.

5. Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. 1982. Образование ядерной оболочки вокруг метафазных хромосом под действием гипотонии. Цитология. Т. 24, № 1, стр. 5-9

6. Зацепина О.В., Сметана К. 1985. Электронно-микроскопическое исследование локализации Ag-белков в ядрышках лимфоцитов человека. Цитология. Т. 27, С. 12281233.

7. Зацепина, Прусов А.Н., Семенов М.В. 1995. Иммунолокализация фактора инициации транскрипции рибосомных генов UBF в интерфазе и митозе. Цитология. Т. 37, С. 137144

8. Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. 1986. Динамика структурной реконструкции митотических хромосом после их искусственной деконденсации in vivo. Цитология. Т. 32, №5, С. 449-453

9. Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. 1988.Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ при их обратимой искусственной деконденсации in vivo. Цитология. Т.30, №8, С. 928-932

Ю.Кудрявцева И.С., Зацепина О.В. 1993. Структура центромерного района и поведение хромосом в анафазе после инкубации клеток мыши с флуорохромом хехстом 33258. Цитология. Т. 35, № 1. С. 30-35

11. Нетесова М.А., Шорникова М.В., Ченцов Ю.С. 1985. Изучение действия актиномицина Д на функцию и ультраструктуру ядрышек клеток культуры СПЭВ. Биологические науки, №5, С. 55-61

12. Сабанеева Е.В. 1988.Соотношение ядрышкового организатора и фибриллярного центра ядрышка. Цитология. Т.ЗО, № 12, С. 1395-1440

13. Сабанеева Е.В. 1989. Специфичность окрашивания ядрышковых организаторов азотнокислым серебром. Цитология. Т. 31, № 1, С. 5-13

14. Султанова 3.Д., Куликова К.С., Гурвич Э.Б. 1968. Морфологическая, вирусологическая и иммунологическая характеристика перевиваемых линий клеток. Вопросы вирусологии, Т.З. С. 291-298

15. Уикли Б. 1975. Электронная микроскопия для начинающих. М. «Наука» 324С.

16. Челидзе П.В. 1982. Фибриллярные центры в ядрышках клеток культуры СПЭВ после действия актиномицина Д. Цитология, Т. 24, № 2, С. 137-143

17. Челидзе П.В. 1985. Ультраструктура и функции ядрышка интерфазной клетки. Тбилиси: Мецниереба, С. 118

18. Ченцов Ю.С., Андреев В.В. 1966. Подавление роста ядрышек в разделившихся клетках культуры ткани при действии низких доз актиномицина. Прижизненные наблюдения. Журнал общей биологии, Т. 27, № 5, С. 615-619

19. Ченцов Ю.С., Поляков В.Ю. 1974. Ультраструктура клеточного ядра. Москва. «Наука», С. 232

20. Ченцов Ю.С. 1984. Общая цитология. М. Издательство Московского университета. С. 349

21. Alberts В., Brey D., Lewis J., Raff М., Roberts К., Watson J.D. 1994. Molecular Biology of the Cell. 3rd, Garland Publishing, Inc. New York London

22. Ang D.R, Baumann A., Szebeni A., Olson MOJ. 1994. The nucleic acid binding activity of nucleolar protein B23.1 resides in its carboxyl-terminal end. J. Biol. Chem. V. 269, P. 30994-98

23. Azum-Gelade M.C., Noaillac-Depeyre J., Caizergues-Ferrer M., Gas N. 1994. Cell-cycle redistribution of U3 snRNA and fibrillarin- presence in the cytoplasmic nucleolus remnant and in the pre-nucleolar bodies et telophase. J. Cell Sci. V.107, P. 463-75

24. Bachvarov D., Moss T. 1991. The RNA-polymerase I transcription factor xUBF contains five tandemly repeated HNG homology boxes. Nucleic Acids Res. V. 19, P. 2331-35

25. Bell S.P., Learned R.M., Jantzen H.-M., Tjian R. 1988. Functional cooperativity between transcription factors UBF 1 and SL1 mediates human ribosomal RNA synthesis. Science. V. 241. P. 1192-97

26. Bell S.P., Pikaard S.C., Reeder R.H. Tjian R. 1989. Molecular mechanisms governing species-specific transcription of ribosomal RNA. Cell, V.59. P. 489-497

27. Bell S.P. Dabauvalle M.-Ch., Sheer U. 1992. In vitro assembly of prenucleolar bodies in Xenopus egg extract. J. Cell Biol. V. 118, P. 1297-1304

28. Bouteille M., Bouvier D., Seve A.P. 1983. Heterogeneity and territorial organization of the nuclear matrix and related structures. Int. Rev. Cytol. V.83, P. 135-182

29. Busch H., Smetana K., 1970. The nucleolus. New-York: Academic. 626 pp

30. Buys C.H., Osinga J. 1980. Abundance of protein-bound sulfhydryl and disulfide groups at cromosomal nucleolus organizing regions. Chromosoma. V.77, P. 1-11

31. Derenzini M., Thiry M. Goessens G. 1990. Utrastructural cytochemisty of the mammalian cell nycleolus. J. Histochem. Cytohem. V.38, P. 1237-1256

32. Dimova R.N., Markov D.V., Gajdardjieva K.S., Dabeva M.D., Hadjiolov A. A. 1982. Electron-microscopic localization of silver staining NOR-proteins in rat liver nucleoli upon D-galactosamine block of transcription. Europ. J. Cell Biol., V.28, P.272-277

33. Dundr M., Raska I. 1993. Nonisotopic ultrastructural mapping of transcription sites within the nucleolus. Exp. Cell Res. V. 208, P.275-281

34. Dundr M., Leno G. H., Hammarskjold M.L., Rekosh D., Helga-Maria C. End Olson M.O. 1995. The roles of nucleolar structure and function in the subcellular location of the HIV-1 Rev protein. J. Cell Sci. V. 108, P 2811-2823

35. Fakan S., Hernandez-Verdun D. The nucleolus and the nucleolar organizer regions. 1986. Biol Cell. V.56, P. 189-206

36. Feuerstein N., Spiegel S., Mond J.J. 1988. The nuclear matrix protein, numatrin (B23), is associated with growth factor-induced mitogenesis in Swiss 3T3 fibroblasts and with T lymphocyte proliferation stimulated by lectins and anti-T cell antigen receptor antibody. J. Cell Biol. V. 107. P. 1629-42

37. Fisher D., Weisenberger D., Scheer U. 1991. Assigning functions to nucleolar structures. Chromosoma (Berl.). V.101, P.133-140

38. Franke W., Scheer U., Krohne G., Jarasch E. 1981. The nuclear envelope and the architecture of the nuclesr periphery. J. Cell Biol. V. 91. P. 39s-50s.

39. Geraud G., Laquerriere F., Masson C., Arnoult J., Labidi B., Hernengez-Verdun D. 1989. Three-dimensional organization of micronuclei induced by colchicine in PtKl cells. Exp. Cell Res. V. 181. P. 27-39

40. Goessens G., Lipoint A. 1974. The nucleolus-organizing regions (NOR s): recent data and hypotheses. Biol. Cell. V. 35. P. 211-220.

41. Goessens G. 1984. Nucleolar structure. IntRev Cytol. V. 87. P. 107-158.

42. Goessens G., Lepoint A. 1985. Localization of Ag-NOR-proteins in Ehrich tumour cell nucleoli. Biol Cell. V. 43. P. 139-142.

43. Goodpasture C., Bloom S.E. 1975. Visualization of nucleolar organizer regions in mammalisn chromosomes using silver staining. Chromosoma. V.53, P.37-50

44. Hadjiolov A.A. 1985. The nucleolus and ribosome biogenesis. Cell Biol. Monographs. V. 12.

45. Henriquez R, Blobel G., Aris J.P. 1990. Isolation and sequencing of NOP1. A yeast gene encoding a nucleolar protein homologous to a human autoimmune antigen. J. Biol. Chem. V. 256. P.2209-15

46. Hernandez-Verdun D., Bouteille M., Ege T., Ringertz N.R. 1979. Fine structure of nucleoli in micronucleated cells. Exp. Cell Res. V.124, P.223-235

47. Hernandez-Verdun D., Hubert J., Bourgeois C., Bouteille M. 1980. Ultrastructural localization of Ag-NOR stained proteins in the nucleolus during the cell cycle and in other nucleolar structures. Chromosoma. V.79, P.349

48. Hernandez-Verdun D., Derenzini M., Bouteille M. 1983. The morphological relationship in electron microscopy between NOR-silver proteins and intranucleolar chromatin. Chromosoma. V. 85. P. 461-473.

49. Hernandez-Verdun D. 1986. Structural organization of the nucleolus in mammalian cells. Methods and Achievements in Experimental Pathology. V. 12. P. 26-62.

50. Hernandez-Verdun D. 1991a. The Nucleolus Today. J. Cell. Sci. V. 99. P 465-471

51. Hernandez-Verdun D., Robert-Nicoud M., Geraud G., Masson C. 1991b. The behaviour of nucleolar proteins in nuclei lacking ribosomal genes-a stydy by confocal laser scanning microscopy. J. Cell. Sci. V.98. P. 99-105

52. Hernandez-Verdun D., Gautier T. 1994. The chromosomes periphery during mitosis. BioEssays. V.16, P. 179-185.

53. Hisatake K., Nishimura T., Maeda Y., Hanada K., Song C.Z., Muramatsu M. 1991. Cloning and structural analysis of cDNA and the gene for mouse transcription factor UBF. Nucleic Acids Res. V. 19. P.4631-4637

54. Howell M., Black D.A. 1980. Controlled silverstaining of nucleolus organiser regions with a protective colloidal developer. A 1-step method. Experientia. V.36, P. 1014-1015

55. Hozak P., Zatsepina O.V., Vasilyeva I., Chentsov Yu. 1986. An electron microscopic study of nucleolus-organizinf regions at some stages of the cell cycle (GO period, G2 period, mitosis. Biol.Cell, v. 57, p. 197-206.

56. Hozak P., Geraund G., Hernandez-Verdun D. 1992a. Revealing nucleolar architecture by low ionic strength treatment. Exp. Cell Res. V. 203. P. 128-133.

57. Hozak P., Roussel P., Hernandez-Verdun D. 1992b. Procedures for specific detection of silver-stained nucleolar proteins on western blots. J. Histochem. Cytochem. V. 40. P. 1089-1096.

58. Hozak P., Cook P.R., Schofer C., Mosgoller W., Wachtler F. Site of trsnscription of ribosomal-RNA and intranucleolar structure in HeLa cell. 1994. J. Cell Sci. V. 107. P. 639-648.

59. Hsu T.S., Spirito S.E., Pardue M L. 1975. Distribution of 18S-28S ribosomal genes in mammalian genomes. Chromosoma (Berlin). V. 53. P. 25-36.

60. Hubbell H.R., Rothblum L.I., Hsu T.C. 1979. Identification of a silver binding protein associated with the cytological silver staining of actively transcribing nucleolar regions. Cell Biol. Int. Rep., V.3, P. 615-630.

61. Hubbell H.R. 1985. Silver staining as an indicator of active ribosomal genes. Stain. Technol. V. 60. P. 285-294.

62. Hugle B., Scheer U., Franke W.W. 1985. Ribocharin-a nuclear Mr 40,000 protein specific to precursor particles of the large ribosomal subunit. Cell. V. 41. P. 615-627.

63. Jantzen H.-M., Armon A., Bell., Tjian R. 1990. Nucleolar transcription factor hUBF contains a DNA-binding motif with homology to HMG proteins. Nature. V. 344. P. 830-836.

64. Jimenez-Garcia L.F., Rothblum L.I., Busch H., Ochs R.L. 1989. Nucleologenesis: use of non-isotopic in situ hybridization and immunocitochemisty to compare the localization of rDNA and nukleolar proteins during mitosis. Biol Cell. V.65, P.239-246

65. Jimenez-Garcia L.F., Segura-Valdez M.de L., Ochs R.L., Rothblum L.I.,Ross H., Spector D.L. 1994. Nucleologenesis: U3 snRNA-containing prenucleolar bodies move to sites of active pre-rRNA transcriptoin after mitosis. Mol Biol Cell. V.5, P. 955-966

66. Jordan E.G. 1984. Nucleolar nomenclature. J. Cell Sci. V. 67. P.217-220

67. Jordan E.G. 1987. At the heart of the nucleolus. Nature (Lond.). V. 329. P. 489-490.

68. Jordan E.G. 1991. Interpreting nucleolar structure; where are the transcribing genes. J. Cell Sci. V. 98, P.437-449

69. Kass S. 1990. The U3 small nucleolar ribonucleoprotein functions in the first step of preribosomal RNA processing. Cell. V. 60, P.897-908

70. Kang Y., Olson M., Busch H. 1974. Phosphorylation of acid-soluble nucleolar proteins in isolated nucleoli of novikoff hepatoma ascites cells. Effects of divalent cations. J. Biol. Chem. V. 249. P. 5580-5585.

71. Labidi B., Frackowiak S., Hernandez-Verdun D., Bouteille M. 1987. Exp. Cell Res. 169. 233.

72. Labidi B., Broders F., Meyer J.-L., Hernandez-Verdun D. 1989. Distribution of rDNA and 28S, 18S and 5S RNA in micronuclei containing a single chromosome. Biochem. Cell Biol. V. 68. P. 957-964.

73. Lapeyre B., Meriottini P., Mathieu C., Ferrer P., Amaldi A., Amalric F., Caizergues-Ferrer M. 1990. Molecular cloning of Xenopus fibrillarin, a conserved U3 small nuclear ribonucleoprotein recognized by antisera from humans with autoimmune disease. Mol. Cell. Biol. V. 10. P. 430434.

74. Lepoint A., Goessens G. 1978. Nukleologenesis in Ehrlich tumour cells. Exp. Cell Res. V. 117, P.89-94

75. Lischwe M.A., Smetana K., Olson M.O., Busch H. 1979. Protein C23 and B23 are the major nucleolar silver staining proteins. Life Sci. V. 25. P. 701-708.

76. Masson C., Andre C., Arnoult J., Geraud G., Hernendez-Verdun D. 1990. Nucleolar antigen specific for the fibrillar component of nucleoli. J. Cell Sci. V. 95. P. 371-381.

77. Matera A.G., Tycowski K.T., Steitz J.A., Ward D.C. 1994. Organization of small ribonucleoproteins (sno RNPs) by fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry. Mol Biol Cell. V. 5. P. 1289-1299.

78. Medina F.J., Cerdido A., Fernandez-Gomez M.E. 1995. Components of the nucleonar processing complex (pre-rRNA, fibrillarin and nucleolin) colocalize during mitosis and are incorporated to daughter cell nucleoli. Exp Cell Res. V.221, P. 111-125

79. Michalik J., Yeoman L.S., Busch H. 1981. Nucleolar localization of protein B23 (37/5.1) by immunocytochemical techniques. Life Sci. V. 28. P. 1371-1379.

80. Miller D. A., Dev V.G., Tantravahi R., Miller O.J. 1976. Suppression of human nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells. Exp. Cell Res., v. 101, p. 235-243.

81. Mirre C., Stahl A. 1978. Peripheral RNA synthesis of fibrilar center in nucleoli of Japanese quail oocytes and somatic cells. J. Ultrastruct. Res. V. 64. P. 377-387.

82. Moore G.P.M., Ringertz N.R. 1973. Localization of DNA-dependent RNA polymerase activities in fixed human fibroblasts by autoradiography. Exp. Cell Res. V.76, P.223-228

83. Moore G.P.M., Lintern-Moore S., Peters H., Faber M. 1974. RNA synthesis in the mouse oocyte. J. Cell Biol. V.60, P.416-422

84. Mougey E.B., O Reilly M., Osheim Y., Miller O.L., Beyer A., Sollner-Webb B. 1993a. The terminal balls characteristic of eukaryotic rRNA transcription units in chromatin spreads are rRNA processing complexes. Genes&Dev. V. 7. P. 1609-1619.

85. Mougey E.B., Pape L.K., Sollner-Webb B. 1993b. A U3 nuclear ribonucleoprotein-requiring processing event in the 5 e[ternal transcribed spaser of Xenopus precursor rRNA. Mol. Cell. Biol. V. 13. P. 5990-5998.

86. Ochs R., Lischwe M., O'Leary P., Busch H. 1983. Localization of nucleolar phosphoproteins B23 and C23 during mitosis. Exp. Cell Res. V.146, P. 139-149

87. Ochs R.L., Busch H. 1984. Further evidence that rhosphorotein C23 (110 kD\pl 5.1) is the nucleolar silver staining protein. Exp. Cell Res. v. 152, p.260-265.

88. Ochs R., Lischwe M., Spohn W.H., Busch H. 1985. Fibrillarin: a new protein of the nucleolus identified by autoimmune sera. Biol. Cell. V.54. P. 123-133

89. Ochs R.L., Smetana K. 1991. Detection of fibrillarin in nucleolar remnants and the nucleolar matrix. Exp. Cell Res. V. 197. P. 183-190.

90. Olert J., Sawatzki G., Kling H., Gebauer J. 1979. Cytological and hisrochemical studies on the mechanism of the selective silver staining of nucleolar organizer regions. Histochemistry. V. 60. P. 90-99.

91. Olson M.O.J. 1990. The role of proteins in Nucleolar Structure and function. In the eukariotic nucleus. Molecular biochemistry and macromolecular assemblies. V.2. Edited by Strauss P.R., Wilson S,H. Caldwell: The Telford Press. P. 519-559

92. Paule M. 1993. Transcription of ribosomal RNA by eukaryotic RNA polymerase I. Conaway and J.W. Conway, editors. Raven Press, N.Y. P. 83-106.

93. Peter M., Nakagawa J., DoreeM., Labbe J.C., Nigg E. 1990. In vitro disassembly of the nuclear lamina and M-phase specific phosphorylation of lamins by cdc2 kinase. Cell. V.61, P.591-602

94. Phillips S.G., Phillips D.M. 1979. Nucleolus-like bodies in micronuclei of cultured Xenopus cells. Exp. Cell Res. V.120, P.295-306

95. Pikaard C.S., Smith S.D., Reeder R.H., Rothblum L. 1990. RUBF, an RNA poll transcription factor from rats, produces Dnase I footprints identical to those produced by UBF, its homolog from frogs. Mol. Cell. Biol. V. 10. P. 3810-3812.

96. Ploton D., Thiry M., Menager M., Lepoint A., Adnet J.-J., Goessens G. 1987. Behaviour of nucleolus during mitosis. Chromosoma (Berl.). V. 95. P. 95-107.

97. Puvion-Dutilleul f., Mazan S., Nicoloso M., Pichard E., Bachellerie J.-P., Puvion E. 1992. Alterations of Nucleolar Ultrastructure and ribosome Biogeneis by actinomycin D. Implication for U3 snRNP function. Eur. J. Cell. Biol. V. 58, P. 149-162

98. Reeder R H. 1990. rRNA synthesis in the nucleolus. Trends Genet. V. 6. P. 390-395.

99. Rendon M.C., Rodrigo R.M., Goenechea L.G., Garcia-Herdugo G., Valdivia M.M., Moreno F.J. 1992. Characterization and immunolocalization of a nucleolar antigen with anti-NOR serum in HeLa cells. Exp. Cell Res. V.200, P.393-403

100. Reynolds E.S. 1963. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol. V.17, P.208-212

101. Rodrigo R.M., Rendon M.C., Torreblanca J., Garcia-Herdugo G., Moreno F.J. 1992. Characterization and immunolocalization of RNA polimerase-I transcription factor UBF with anti-NOR serum in protozoa, higher plant, and vertebrate cells. J. Cell Sci. V. 103. P. 10531063.

102. Roussel P., Belenguer P., Amalric F., Hernandes-Verdun D. 1992. Nucleolin is an Ag-NOR protein; this property is determined by its aminoterminal domain independently of phosphorylation state. Exp. Cell Res. V.203, P.259-269

103. Roussel P., Andre C., Masson C., Geraud G., Hernandez-Verdun D. 1993. Localization of RNA polymerase I transcription factor hUBF during the cell cycle. J. Cell Sci. V.104, P.327-337

104. Roussel P., Hernandes-Verdun D. 1994. Identification of Ag-NOR proteins, markers of proliferation related to ribosomal gene activity. Exp. Cell Res. V.214, P.465-472

105. Scheer U., Benavente R. Functional and dynamic aspects of the mammalian nucleolus. 1990. BioEssays. V.12, P. 14-21

106. Scheer U., Hugle B., Hazan R., Rose K.M. 1984. Drug-induced dispersal of transcribed rRNA genes and transcriptional products: immunolocalization and silver staining of different nucleolar components in rat cells treated with 5,6,-dichloro-P-d-ribofuranosylbenzimidazole. J. Cell Biol. № 99, P.672-679

107. Scheer U., Rose K.M. 1984. Lokalization of RNA polimerase I in interphase cells and mitotic chromosomes by light and electron microscopic immunocytochemistry. Proc Natl Acad Sci USA. V.81, P.1431-1435

108. Scheer U., Thiry M., Goessens G. 1993. Structure, function and assembly of the nucleolus. Trends Cell Biol. V.3, P.236-241

109. Scheer U., Weisenberger D., 1994. The nucleolus. Curr Opin Cell Biol. V.6, P.354-359

110. Schimmang T., Tollervey D., Kern H., Frank R., Hurt E.C. 1989. A yeast nucleolar protein related to mammalian fibrillarin is associated with small nucleolar RNA and is essential for viability. EMBO J. V. 8. P. 4015-4024.

111. Schmidt-Zachmann M.S., Hugle B., Scheer U., Franke WW. 1984. Identification and localization of a novel nucleolar protein of high molecular weight by monoclonical antibody. Exp. Cell Res. V. 153. P.327-346

112. Schmidt-Zachmann M.S., Yugle-Dorr B., Franke W. 1987. A constitutive nucleolar protein identified as a member of the nucleoplasmin family. EMBO J. V. 6. P. 1881-1890.

113. Schwarzacher H.G., Mikelsaar A.-V., Schnedal W. 1978. The nature of the Ag-staining of nucleolus organizer regions. Cytogenet. Cell Genet. V. 20. P. 24-39.

114. Sekiguchi T., Shelton K, Ringertz N.S. 1978. DNA content of microcells prepared from rat kangaroo and mouse cells. Exp. Cell Res. V. 113. P. 247-258.

115. Shaw P. J., Jordan E.G. 1995. The nucleolus. Cell Dev. Biol. V. 11, p. 93-121.

116. Sollner-Webb B., Mougey E. 1994. News from the nucleolus: rRNA gene expression. Trends Biochem. Sci. V. 16. P. 58-62.

117. Swift H. 1969. Studies on nucleolar function: Proc. Symp. On molecular biology. Chicago: Univ. P. 266-267.

118. Takemura M., Ohta N., Furuichi Y., Takahashi T., Yoshida S., Olson M.O.J., Umekawa H. 1994. Stimulation of calf thymus DNA polimerase activity by nucleolar protein B23. Biochem. Biopiys. Res. Commun. V.199, P.46-51

119. Thiry M., Lepoint A., Goessens G. 1985. Re-evaluation of the site of transcription in Erlich tumour cell nucleoli. Biol. Cell. V. 54, p. 57-64.

120. Thiry M., Scheer U., Goessens G. 1991. Localization of nucleolar chromatine by immunocytochemistry and in situ hubridization at the electron microscopic level. Electronic Microsc. Rev. V. 4. P. 85-110/

121. Todorov IT., Pepperkok R, Philipova R.N., Kearsey S.E., Ansorge W., Werner D. 1994. A human nuclear protein with sequence homologi to a family of early S phase proteins is reguired for entry into S phase and for cell division. J. Cell Sci. №.107, P.253-265

122. Tollervey D., Lehtonen H., Jansen R, Kern H, Hurt E. 1993. Temperature-sensitive mutation demonstrate roles for yeast fibillarin in pre-ribosomal RNA processing, pre-ribosomal RNA methylation, and ribosomal assembly. Cell. V. 72. P. 443-457.

123. Vandelaer M., Thiri M., Goessens G. 1993. Ultrastructural distribution of DNA within the Ring-Shaped nucleolus of human resting T lymphocytes. Exp. Cell Res. V. 205. P. 430-432

124. Verheijen R, Van Venrooij W., Ramaekers F. 1988. The nuclear matrix: structure and composition. Journal of Cell Sci. V. 90. P. 11-36

125. Voit R., Schnapp A. Kuhn A., Rosenbauer H., Hirschmann R , 1992. The nucleolar transcription factor mUBF is phosphorylated by casein kinase-II in the C-terminal hyperacidic tail which is essential for transactivation. EMBO J. V. 11. P. 2211-2218.

126. Warburton D., Henderson A.S. 1979. Sequential silver staining and hybridization in situ on nucleolus organizing regions in human cells. Cytogent. Cell Genet. V. 24. P. 168-175.

127. Wachtler F., Ellinger A., Schwarzacher H. 1980. Nucleolar changes in human phytohaemagglutinin-stimulated lymphocytes. Cell Tissue Res. V. 213. P. 351-360

128. Weisenberger D., Scheer U. 1995. A possible mechanism for the inhibition of ribosomal RNA gene transcription during mitosis. J. Cell Biol. № 129, P.561-575

129. Williams M.A., Kleinschmidt J.A., Kronne G., Franke W.W. 1982. Agryrophilic nuclear and nucleolar proteins of Xsenopus laevis oocytes identified by gel electrophoresis. Exp. Cell Res. v.137, p.341-351.

130. Xue Z., Melese T. 1994. Nucleolar proteins that bind NLSs: a role in nuclear import or ribosome biogenesis. Trends Cell Biol. V. 4. P. 414-417.

131. Zatsepina O.V., Polyakov V.Yu., Chentsov Yu.S., 1982. Belozersky AN. Laboratory of Molecular Biology and Bioorganic Chemistry. European Journal of Cell Biology. V.26, P.277-283

132. Zatsepina O. V., Hozak P., Babadjanyan D., Chentsov Y. 1988. Quantitative ultrastructural stydy of nucleolus-organizing regions at some stages of the cell cycle (GO period, G2 period, mitosis). Biol. Cell. V. 62. P. 211-218.

133. Zatsepina O.V., Voronkova Z.N., Sakharov V.N. Chentsov Yu. S. 1989 a. Ultrastructural changes in nucleoli and fibrillar centres under the effect of local ultraviolet microbean irradiation of interphase culture cells. Exp. Cell Res. V.181, P. 94-104

134. Zatsepina O.V., Polyakov V.Yu., Chentsov Yu. S. 1989 b. Differential decondensation of mitotic chromosomes during hypotonic treatment of living cells as a possible cause of G-banding: an ultrastructural study. Chromosoma. V.98, P. 109-116

135. Zatsepina O.V., Voit R., Grummt I., Spring H., Semenov M.V., Trendelenburg M.F. 1993.The RNA polymerase I-specific transcription initiation factor UBF is associated with transcriptionally active and inactive ribosomal genes. Chromosoma (Berl.). V.102, P.599-611.

136. Zatsepina O.V., Dudnic O.A., Todorov I. T., Thiry M., Spring H. 1997. Experimental induction of prenucleolar bodies (PNBs) in interphase cells: interphase PNBs show similar characteristics as those typically observed at telophase in untreated cell. Chromosoma, V. 105. P. 418-430