Исследование компонентов соматических ядер инфузорий: ультраструктура и пространственная организация тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Леонова, Ольга Геннадьевна

• Леонова, Ольга Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Леонова, Ольга Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Структурные механизмы регуляции экспрессии генома.

II. Петельный уровень организации хроматина.

П. 1. Радиально-петельная модель организации митотических хромосом.

П. 2. Хромомерно-хромонемная модель.

Щ. Соматические ядра инфузорий как модель для изучения структуры хроматина и внутриядерных органелл.

Ш. 1. Особенности структурной организации макронуклеуса Bursaria truncatella.

Ш. 2. Особенности структурной организации макронуклеуса Didinium nasutum.

Ш. 3. Особенности структурной организации макронуклеуса Paramecia caudatum.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. АНАЛИЗ ПОДХОДОВ И ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА КАЧЕСТВО

И ТОЧНОСТЬ ТРЁХМЕРНЫХ МОДЕЛЕЙ.

1.1. Основные подходы для трехмерного моделирования в электронной микроскопии.^.

L 2. Выравнивание двумерных растровых изображений относительно друг друга.

1.3. Трассировка (векторизация) изображений.

I. 4. Построение трехмерных моделей.

I. 5. Трехмерная реконструкция ядрышка P. caudatum.

П. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МАКРОНУКЛЕУСОВ ИНФУЗОРИЙ-.

П. 1. Структурная организация макронуклеуса инфузории В.truncatella.

П. 1.1. Световая микроскопия макронуклеуса В. truncatella в цистах, интерфазных "сытых" и "голодающих" клетках.

П. 1. 2. Ультраструктурная организация макронуклеуса В. truncatella в сытых и голодных интерфазных клетках.

П. 1.3. Ультраструктурная организация макронуклеуса В. truncatella в цистах.

П. 1. 4. Реконструкция трехмерной структуры хроматина В. truncatella в макронуклеусе цист.

П. 2. Реконструкция трёхмерной структуры хроматина в макронуклеусе Didinium nasutum.

П. 3. Структурная организация макронуклеуса инфузории

Paramecium caudaum.

П. 3.1. Структура хроматина в макронуклеусах инфузории

P. caudatum.

П. 3.2. Ультраструктура ядрышек P. caudatum.

П. 3.3. Трёхмерная реконструкция пространства макронуклеуса P. caudatum.

ГП. ДИНАМИКА И ОБРАТИМОСТЬ СТРУКТУРНЫХ ПЕРЕХОДОВ МЕЖДУ

ВЫСШИМИ УРОВНЯМИ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМАТИНА В МАКРОНУКЛЕУСАХ

Bursaria truncatella И Paramecium caudatum.

Ш. 1. Воздействие гипотонических условий на ультраструкгуру компонентов макронуклеуса Paramecium caudatum.

Ш. 2. Воздействие гипотонических условий на ультраструктуру компонентов макронуклеуса Bursaria truncatella.

Ш. 3. Формирование хромонемоподобных фибрилл в макронуклеусах инфузорий под действием ионов магния.

Ш. 4. Трёхмерная реконструкция хромонемоподобных фибрилл, образующихся in vitro.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование компонентов соматических ядер инфузорий: ультраструктура и пространственная организация»

Одной из важных фундаментальных проблем современной молекулярной и клеточной биологии является определение структурных механизмов функционирования генома и выяснение функциональных особенностей компартментализации ядер в клетках эукариот.

Структурные механизмы играют важную роль в обеспечении функционирования ДНК в клетке. В настоящее время общепризнано, что даже в интерфазном ядре гены расположены стратегически упорядоченно и иерархически сегрегированы в пространстве ядра (Manuelidis, 1990; Cremer et al., 1993; Visser et al., 1998). ДНК из разных хромосом занимают разные, непересекающиеся между собой «хромосомные территории» в ядре. Во многих работах было показано, что существует корреляция между активностью гена и его расположением в «хромосомной территории» (Mahy et al., 2002; Dietzel et al., 1999; Chevret et al., 2000).

Для экспрессии одиночных или небольших групп генов определяющее значение имеют низшие уровни компактизации ДНК в хроматине и хромосомах (нуклеосомные фибриллы - фибриллы толщиной 20-30 нм) и структурные переходы между ними. С другой стороны, структуры высших уровней организации (хромомеры - хромонемы - хромосомы (Ченцов, Бураков, 2005)) и их пространственное расположение в ядре играют важную роль в упорядочении транскрипции и репликации больших групп генов, влияющих на фенотипическую экспрессию (Manuelidis, 1990; Visser et al., 1998). Более того, дискретные структуры петельного уровня организации - хромомеры - рассматриваются некоторыми авторами как основной структурный мотив, определяющий как функционирование хроматина в интерфазных ядрах, так и структуру хромосом (Поляков и др., 2006; Ченцов, 1995; Cook, 1995).

Таким образом, для решения поставленной выше фундаментальной проблемы необходимо комплексное изучение структуры хроматина и пространственной организации клеточного ядра с учетом взаимного расположения ДНК-, РНК-содержащих, белковых и др. компонентов ядра.

Особый интерес для изучения структурных аспектов функционирования генома и выяснения функциональных особенностей компартментализации ядер представляют макронуклеусы - соматические ядра инфузорий. Они широко используются в качестве модельных объектов для изучения взаимодействия гистонов с ДНК в составе хроматина, структурных перестроек нуклеосомного уровня хроматина при его активации и т.п. Компактные хроматиновые тельца, обнаруживаемые в макронуклеусе, способны образовывать толстые фибриллы типа хромонем. В то же время макронуклеусы имеют ряд уникальных отличий от ядер высших эукариот. Размер молекул ДНК в них гораздо меньше, чем в ядрах высших эукариот, при делении макронуклеусов хроматин не образует структуры типа метафазных хромосом, нет веретена деления, а само деление происходит путем так называемого амитоза.

На светоогггическом уровне в макронуклеусе некоторых инфузорий, в том числе и Bursaria truncatella (Ruthmann, Heckmann, 1964), были описаны зоны с разной плотностью хроматина (так называемые "зоны конденсации хроматина"), причем распределение таких зон в макронуклеусе имеет характерный паттерн для разных стадий клеточного цикла. Возможно, что такие зоны являются аналогами "хромосомных территорий" в ядрах эукариот. В связи с этим важно выяснить, как организованы высшие уровни хроматина в макронуклеусах, и как особенности соматических ядер разных инфузорий отражаются на организации хроматина в пространстве макронуклеуса и на динамике переходов между структурами разных уровней.

В нашей работе мы исследовали организацию хроматина в соматических ядрах инфузорий Bursaria truncatella, Paramecium caudatum и Didinium nasutum на разных стадиях клеточного цикла и в разных функциональных состояниях.

Исследования по пространственной организации хроматина в ядре сейчас чаще всего проводятся с использованием конфокальной лазерной микроскопии и флуоресцентных меток. Несмотря на впечатляющие возможности такого подхода, он имеет определенные недостатки. Процедуры гибридизации in situ очень жесткие, что может приводить к искажениям в распределении ядерного материала, а разрешение конфокального микроскопа значительно меньше, чем в электронной микроскопии. Поэтому в данной работе анализ ядерных структур базировался на данных электронной микроскопии. В связи с тем, что одиночные срезы не дают полного представления о пространственной организации изучаемых объектов, мы использовали трехмерное моделирование на основе серийных срезов.

Следует отметить, что электронномикроскопический подход уже использовался ранее для трехмерной реконструкции изучаемых объектов. Однако из-за технических ограничений такие работы были посвящены в основном или реконструкции относительно малых объектов типа рибосом, белковых комплексов и т.п., или крупных одиночных органелл вне связи с соседними структурами (Belmont, Agard, 1987; Horowitz, Agard, Sedat, 1994). Большинство доступных стандартных математических программ недостаточно хорошо приспособлены для реконструкции сложных объектов в большом пространстве ядра. Поэтому важным направлением исследований была разработка программного обеспечения и анализ условий, позволяющих получить трехмерные модели структур хроматина с наибольшей точностью.

Таким образом, методической особенностью данной работы является комплексный подход, сочетающий (1) электронную микроскопию, обеспечивающую высокое разрешение получаемых изображений; (2) дифференцировку различных структур на ультратонких срезах цитохимическими методами; (3) трехмерную реконструкцию объектов на основе серийных срезов с помощью современных компьютерных методов.

Это позволило изучить пространственную организации компонентов соматического ядра инфузорий во взаимосвязи с их функциональным состоянием, а также динамику структурных переходов высших уровней организации хроматина макронуклеусов. Полученные закономерности были проверены в модельных экспериментах in vitro, в которых структуры макронуклеусов подвергались искусственной конденсации в присутствии бивалентных катионов и деконденсации в гипотонических условиях.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью представленной работы было изучение пространственной организации компонентов соматического ядра инфузорий во взаимосвязи с их функциональным состоянием, а также структуры хроматина высших уровней в них путём трёхмерной реконструкции на основе серийных срезов. В ходе исследования необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. Определить параметры культивирования и стадии клеточного цикла инфузории В. truncatella, на которых картина распределения структур хроматина в макронуклеусе имеет стабильный воспроизводимый характер, сравнить структуру хроматина в разных участках макронуклеуса.

2. Разработать алгоритм для трехмерной реконструкции сложных структур на основе серийных ультратонких срезов; выяснить влияние различных параметров на точность получаемых трехмерных моделей.

3. Исследовать пространственную организацию хроматина в разных зонах макронуклеуса В. truncatella. Построить трехмерные модели структур хроматина в разных зонах макронуклеуса,

4. Сравнить организацию хроматина в макронуклеусах разных видов инфузорий с субхромосомным размером молекул ДНК: В. truncatella, P.caudatum и D. nasutum.

5. Изучить динамику декомпактизации хроматиновых телец при гипотонии и процесса формирования хромонемоподобных фибрилл в присутствии катионов Mg++ in vitro в макронуклеусах В. truncatella, P.caudatum и D. nasutum.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Структурные механизмы регуляции экспрессии генома

Основные функции клеточного ядра - хранение и реализация генетической информации - осуществляются благодаря наличию сложной упорядоченной организации структурных компонентов ядра в пространстве. Интерфазное ядро эукариот содержит несколько хорошо выявляемых доменов (Spector, 2001; Gonzales-Melendi et al, 2000; Cremer T. et al, 2000). Основными доменами, выделяемыми многими авторами, являются: ядерная оболочка, хроматин со сложной структурой, интерхромосомный домен и ядрышко. Они являются динамичными структурами. Часто между отдельными доменами происходит белковый обмен (Misteli, 2001).

Основной объём интерфазного ядра занимает хроматин. Он представляет собой ДНК в комплексе с белками, определённым образом упакованную в пространстве ядра.

В течение клеточного цикла структуры хроматина подвергаются процессам компактизации-декомпактизации, и в метафазных хромосомах линейная степень компактизации ДНК составляет ~ 10 000 раз. В настоящее время общепризнано, что такая высокая степень упаковки ДНК достигается за счет наличия нескольких уровней организации хроматина. Не вызывающими разногласий в большинстве моделей организации хроматина в ядре являются нуклеосомы и 20-30 нм фибриллы. Радиально-петельная модель рассматривает 20-30 нм фибриллу в качестве последнего уровня упаковки хроматина перед образованием хромосомы. Но существуют и модели, постулирующие существование высших уровней организации хроматина, промежуточных между 20-30 нм фибриллами и целой хромосомой с максимальной степенью компактизации ДНК.

Нуклеосомные фибриллы соответствуют первому уровню организации хроматина. Нуклеосомы представляют собой частицы, состоящие из октамера гистонов, составляющих нуклеосомное ядро с навитой на него ДНК. В состав нуклеосомного ядра входят по два гистона Н2А и Н2В, характеризующихся высоким содержанием лизина, и по два гистона НЗ и Н4, богатых аргинином. В минимальной нуклеосоме ДНК, длиной 146 п.н. наматывается на октамер, делая 1.75 витка. Нуклеосомная фибрилла состоит из нуклеосом и межнуклеосомной линкерной ДНК, длина которой различается в клетках разных типов и составляет ~ 60 п.н. С линкерной ДНК связан ещё один гистон - HI. При формировании нуклеосомной фибриллы ДНК компактизуется в 7 раз.

Эксперименты показывают, что для осуществления транскрипции и репликации необходимо декомпактизованное состояние хроматина в соответствующих участках. В дрожжах частичное удаление нуклеосомной структуры хроматина путём нарушения нормального синтеза гистонов приводит к постоянной экспрессии генов даже в отсутствие специфических активаторов, требующихся для работы этих генов в нормальных условиях (Giunstein, 1990). По данным Приора (Prior et al., 1983), нуклеосомы транскрипционно-акгивного хроматина представляют собой частично развёрнутые структуры. Факт частичного разворачивания нуклеосомного ядра, содержащего активно транскрибируемую ДНК, был продемонстрирован как на миксомицетах (Prior et al., 1983), так и на млекопитающих (Alegra et al, 1987). Исследования организации хроматина методом "белковых теней" (Karpov et al., 1984) показало, что продвижение РНК-полимеразы обеспечивается структурным переходом в нуклеосомах: временно из них удаляются димеры Н2А-Н2В, а контакт гистонового тетрамера (Н3)2-(Н4)2 с ДНК сохраняется. Полимераза свободно проходит сквозь такую нуклеосому, после чего ее структура быстро восстанавливается. Эти данные соответствуют современным представлениям об организации нуклеосомы, согласно которым димер Н2А-Н2В в определенных условиях может диссоциировать (Adelman, Lis, 2002).

Из вышеизложенного следует, что на нуклеосомном уровне происходит регуляция транскрипционной активности генов.

Гистоны в составе нуклеосомной фибриллы подвергаются многочисленным модификациям. Среди них можно отметить метилирование, фосфорилирование, ацетилирование, поли-АДР-рибозилирование и присоединение белка убиквитина (Jenuwein, Allis, 2001). Наиболее исследованы ацетилирование и метилирование ги стонов. В настоящее время большинство исследователей считает, что ацетилирование является характерной чертой активно транскрибируемых генов (Turner, O'Neill, 1995; Steger, Workman, 1996). В лаборатории Олфри была выделена фракция хроматина с частично развёрнутыми нуклеосомами, обогащенная транскрибируемыми последовательностями и содержащая большую часть гистонов Н2В, НЗ и Н4 в гиперацетшгарованной форме (Alegra et al, 1987).

Для Tetrahymem thermophila показано, что гистоны в транскрипционно-активных соматических ядрах (макронуклеусах) гиперацетилированы, а в обычно неактивном микронуклеусе аналогичные ацетилированные формы практически отсутствуют.

Метилирование гистонов изучено хуже, чем ацетилирование. Метилированию могут подвергаться как остатки лизина, так и аргинина. Считается, что в то время как ацетилирование гистонов - процесс обратимый, метилирование носит постоянный характер.

Наиболее разработанная модель, объясняющая роль гистонов в регуляции -модель «гистонового кода». Под этим подразумевается разнообразный набор модификаций гистонов, определяющий функциональное состояние гена. Спектр модификаций можно целенаправленно менять, передавать по наследству, иными словами, управлять считыванием генетической информации.

Следующий уровень компактизации ДНК - фибриллы хроматина толщиной 20-30 нм. Они были описаны на ЭМ уровне в работах на разнообразных объектах (обзоры Pederson et al., 1986; Бавыкин, 1988; van Holde et al., 1995; Cook 1995). Хотя нет единого мнения о том, как организованы нуклеосомы в таких фибриллах, очевидно, что важную роль в поддержании их структуры играет гистон HI, который связывается с линкерной ДНК в присутствии бивалентных катионов. В 20-30 нм фибриллах степень компактизации ДНК увеличивается еще в 6 раз.

Структурные переходы между описанными выше первыми двумя уровнями компактизации хроматина играют важную роль в активации отдельных генов.

В пространстве ядра гены расположены упорядоченно. В работах последних лет с помощью различных методов и в первую очередь флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) было показано, что ДНК разных хромосом занимает в ядре строго определенную хромосомную территорию (Сгетег Т. et al, 2000; Сгетег М. et al, 2001; Tanabe et al, 2002). Более того, даже в пределах одной хромосомной территории каждый хромосомный домен занимает свое, отдельное место (Lengauer et al, 1991; Zink et al, 1999; Verschure et al, 1999). В ряде работ показано, что существует корреляция между расположением гена внутри хромосомной территории и его активностью (Mahy et al, 2002; Dietzel, 1999; Chevret et al., 2000). Активные локусы находятся на поверхности (или вблизи) компактных субхромосомных доменов, при этом активный деконденсированный хроматин выпетливается в интерхроматиновое пространство, где находится новосинтезированная РНК и факторы транскрипции (Verschure et al, 1999; Visser, 2000). Эти и некоторые другие данные позволили предложить модель функциональной компартментализации клеточного ядра. В этой модели, созданной в 1993 году и позднее усовершенствованной (Cremer et al., 1993; 2000), постулируется существование в интерфазном ядре трёх основных компартментов. 1. "Открытый" хроматиновый компартмент с хроматиновыми доменами, содержащими активные гены. 2. "Закрытый" хроматиновый компартмент, включающий неактивные гены. 3. Интерхроматиновый домен, который содержит макромолекулярные комплексы для транскрипции, сплайсинга, репликации и репарации ДНК.

Хроматиновые домены, которые составляют "открытый" хроматиновый компартмент, организованы таким образом, чтобы был возможен контакт активных генов с транскрипционными комплексами и контакт новосинтезированной РНК с факторами транскрипции. Напротив, хроматиновые домены, принадлежащие "закрытому" компартменту, топологически построены (компакгизованы) так, что бы предотвращать доступ к генам транскрипционных комплексов.

Таким образом, структурная организация ядра по принципу хромосомных территорий дает принципиальную возможность влиять на активность больших групп генов, обеспечивая регуляцию фенотипической экспрессии (Manuelidis 1990).

Реализация этих структурных механизмов тесно связана с организацией высших уровней хроматина и их пространственным расположением в ядре.

П. Петельный уровень организации хроматина

К высшим уровням организации хроматина мы относим крупные упорядоченные структуры, которые образуются при компакгизации нуклеосомных фибрилл и фибрилл толщиной 20-30 нм. Все современные модели организации хромосом и хроматина, несмотря на их значительные различия, предполагают, что такие структуры организованы по петельному принципу.

Еще в 60-70-х годах в ряде работ (Comings, Okada, 1968; Cook, Brazell, 1975; 1984) было биохимически и электронномикроскопически показано существование петель хроматина в ядрах эукариот. В 1978 г Лэммли с соавторами (Laemmli, 1978) показал, что что на электронномикроскопических препаратах депротеинизированных распластанных хромосом можно было видеть электронноплотные осевые структуры, по форме напоминающих хромосомы (скэффолды), от которых отходят петли фибрилл ДНК. Хотя депротеинизация хромосом проводилась в жестких условиях и, как было показано в более поздних работах, с этим было связано образование скэффолда в виде ригидной структуры, именно эти работы легли в основу наиболее популярной сейчас модели организации хромосом, которая постулирует, что ДНК в ядрах эукариот организована в топологически замкнутые петлевые домены, размер которых составляет 10-200 т.п.н., и которые фиксированы своими основаниями на скелетных структурах ядра.

Данные в пользу петельного принципа организации хроматиновых фибрилл были получены и при ультраструктурном изучении набухших хромосом in vivo (Киреев и др., 1988; Zatsepina et al., 1989) и in vitro (Marsden, Laemmli, 1979; Adolph, 1980a; Zatsepina et al., 1983).

Для картирования участков ДНК, лежащих в основаниях петлевых доменов ядерной ДНК, были предложены два разных подхода, а определяемые этими методами участки ДНК получили название SAR (Mirkovitch et al, 1984) и MAR (Cockerill, Garrard, 1986a,b). Вскоре выяснилось, что эти участки совпадают. По данным Леммли с сотрудниками (Izaurralde et al., 1988), SAR/MARs располагаются около генов, транскрибирующихся РНК-полимеразой П. Петли могут содержать одну или несколько транскрипционных единиц. По результатам разных авторов размеры петлевых доменов могут сильно различаться. В кластере гистоновых генов дрозофиллы домены имеют размер около 5 т.п.н. (Mirkovitch et al., 1984; Gasser,

Laemmli, 1986), в области генов rosy и Асе - от 26 до 112 т.п.н. (Mirkovitch et al., 1984), петельный домен гена лизоцима цыплёнка равен 19 т.п.н.

Также было показано, что на начальных стадиях апоптоза ДНК расщепляется до фрагментов размером от 50 до нескольких сотен т.п.н. Эта ' фрагментация происходит посредством вырезания хроматиновых петель и их олигомеров (Filipski et al., 1990).

Основные свойства SAR/MAR последовательностей описаны во многих обзорах (Van der Velden et al., 1984; Cockerill, Garrard, 1986; Razin et al., 1986, Adachi et al., 1989; Gasser et al., 1989; Boulikas, 1995; Глазков, 1995): 1) SAR/MARs обогащены АТ-парами; 2) содержат много последовательностей, которые узнаются топоизомеразой П; 3) обратимо связываются с матриксами интерфазных ядер и скэффолдами метофазных хромосом; 4) локализуются в некодирующих областях генома, в основном в нетранскрибирующихся участках, но иногда в интронах; 5) часто локализованы вблизи последовательностей, вовлечённых в регуляцию транскрипции; 6) являются потенциальными сайтами инициации репликации и др.

Предполагается, что SAR/MARs, расположенные в 5'- и З'-фланкирующих областях, выполняют функцию разграничения хроматиновых доменов. Тогда SAR/MARs, локализованные в интронах транскрипционно неактивных генов, могут участвовать в компактизации хроматиновых доменов (Gasser, Laemmli, 1987; Phi-Van et al., 1990; Sperry et al., 1989), а пространственная организация ДНК поддерживается благодаря конститутивному (основному) и факультативному (зависящему от транскрипционной активности гена) взаимодействию ДНК с ядерным матриксом (Iarovaia et al. 2005).

Электронномикроскопические данные показывают, что хромосомная ДНК связана с тремя компонентами ядерного матрикса: с ядерной ламиной, с фибриллярно-глобулярной сетью и остаточным ядрышком (Глазков, 1988), но до сих пор мало известно о том, какие белки вовлечены в организацию петель ДНК в интерфазном ядре. Наиболее вероятно, что в основаниях петель находятся белки ламины (Gerace, Burke, 1988) и/или топоизомераза П (Gasser et al., 1989; Berrios et al., 1985; Laemmli et al., 1992). Возможно, что ДНК-топоизомераза осуществляет регуляцию топологического состояния петельных доменов (Cockerill, Garrard, 1986), что имеет важное значение для функционирования генома (Gasser, Laemmli, 1987).

При использовании подхода для изучения организации хромосомной ДНК в петли, предложенного Разиным с сотрудниками, было показано, что при расщеплении ДНК топоизомеразой П, локализованной в ядерном матриксе, ДНК расщеплялась до фрагментов размером 50-150 т. п. н. (Razin et al., 1991). Авторы полагают, что разрывы вносятся в основания петель ДНК. При этом меньшая часть SAR/MARs локализуются в участках закрепления петель ДНК на ядерном матриксе, тогда как большая часть находится на петлях ДНК. Они, скорее всего, представляют собой потенциальные участки прикрепления ДНК к матриксу.

Помимо SAR/MARs хромосомная ДНК прикреплена к матриксу своими теломерными участками. Это было показано на клетках самых разных организмов, от дрожжей и до человека, хотя природа этих взаимодействий и поведение теломерных последовательностей в течение клеточного цикла изучена слабо (de Lange, 1992; de Lara et al., 1993; Luderus et al., 1996; Croft et al., 1999; Laroche et al., 2000).

В макронуклеусах брюхоресничной инфузории Stylonyhia lemnae прикрепление теломеров к матриксу обеспечивает пространственную организацию минихромосомной ДНК соматического ядра. Теломеры каждой минихромосомы прикреплены к ядерному матриксу посредством теломерсвязывающего белка (ТеВР) (Postberg et al., 2001; Jonsson et al., 2002). В результате получаются розетко-подобные структуры, которые ранее были обнаружены на электронномикроскопических препаратах (Murti, Prescott, 2002).

П. 1. Радиально-петельная модель организации митотических хромосом

Радиально-петельная модель предполагает, что конечным структурным уровнем упаковки хроматина перед образованием хромосомы является 20-30 нм фибрилла. Дальнейшая компактизация сводится к различным способам укладки этой фибриллы в теле хромосомы. В основе этой модели лежит идея о наличии осевых структур (скэффолдов) в хромосомах, к которым прикреплены петли фибрилл хроматина. Такие структуры впервые были обнаружены на препаратах распластанных на поверхности гипофазы хромосом после жесткой депротеинизации гепарином и декстрансульфатом (Paulson, Laemmli, 1977; Adolph et al., 1977). Полного разрушения хромосом не происходило, их компактность обеспечивалась наличием наличием негистоновых белков. Электронная микроскопия показала, что негистоновые белки образуют рыхлую сеть тонких филаментов, имеющую вид метафазной хромосомы (Paulson, Laemmli, 1977). От всей поверхности скэффолда отходят нити депротеинизированной ДНК, образующие петли. К скэффолду петли прикрепляются с помощью SAR/MARs. В петлях фибриллы хроматина упакованы по принципу суперспирализации. Каждый последующий уровень компактизации ДНК в структуре хромосомы образуется путём спиральной укладки фибрилл предыдущего уровня.

Заметная роль в конденсации хромосом принадлежит топоизомеразе П. В митотических хромосомах белок локализуется в осевых районах хромосом (Gasser et al., 1986; Meyer et al., 1997). Участие ДНК-топоизомеразы П в конденсации хромосом (Adachi et al., 1989) может осуществляться через способность данного фермента изменять топологическое состояние хромосомной ДНК, а не через его структурную функцию как белка, непосредственно связанного с ДНК.

В конденсации митотических хромосом участвуют также белки конденсинового комплекса (SMC-белки). Белки корового субкомплекса конденсинового комплекса SMC2 и SMC4, существующие в виде гетеродимера, локализуются в осевых районах сестринских хроматид митотических хромосом и, по-видимому, принимают участие в поддержании их компактной структуры (Hirano, Mitchison, 1994). Отсутствие белка SMC4 у дрожжей приводит к нарушению конденсации и сегрегации хромосом (Saka et al., 1994). Однако в некоторых организмах инактивация конденсинов не приводит к видимым нарушениям в структуре хромосом, что свидетельствует о возможном существовании альтернативных путей компактизации ДНК в митозе (Steffensen et al., 2001; Hangstrom et al., 2002).

В соматическом ядре инфузории Tetrahymena termophila, которое делится амитотически, без видимой конденсации хроматина, отсутствие белка SMC4 приводит к нарушению распределения ДНК по дочерним клеткам (Cervantes et al., 2006). Следовательно 8МС4-белок участвует в сегрегации хроматина без предварительной компактизации.

Хотя много данных свидетельствуют в пользу радиально-петельной модели организации хромосом, дальнейшая упаковка 20-30 нм фибрилл внутри митотической хромосомы остаётся неясной. В то же время целый ряд морфологических наблюдений свидетельствует о наличии уровней организации хроматина, промежуточных между 20-30 нм фибриллой и митотической хромосомой.

П. 2. Хромомерно-хромонемная модель

В течение двух веков накапливались светооптические данные о существовании структур, расположенных вдоль тела хромосомы по её периферии в виде особых спиралей. Впервые эти структуры обнаружил Баранецкий (Baranetzky, 1880) в материнских клетках пыльцы Tradeskantia. Позднее они были названы "хромонемами" (Veidovsky, 1912). Подобные структуры бьши описаны многими авторами. В дальнейшем при изучении митотических хромосом Tradeskantia в ходе их естественной конденсации и деконденсации в митозе было обнаружено, что тела хромосом образованы обособленными фибриллярными структурами 0.2-0.3 мкм толщиной (Sparvoli et al., 1965). Для обозначения описанных хромосомных субструктур был использован термин "хромонема". Существование в эукариотических хромосомах хромомерных элементов было подтверждено на светооптическом уровне и при изучении ультратонких срезов клеток растений и животных как во время естественной декомпактизации в митозе (Zatsepina et al., 1983, Зацепина и др., 1985), так и при использовании различных экспериментальных воздействий. Инкубация корешков Crepis capillaris в растворах солей кобальта приводила к деконденсации хромосом (Поляков, Ченцов, 1968). При этом происходило расхождение хромонемных элементов. Хромонемные элементы выявляются в составе метафазных хромосом в клетках, пермеабилизованных в растворах, содержащих высокие концентрации бивалентных катионов (Фролова и др., 1989; Киреев и др., 1990) и затем инкубированных в растворах с понижающейся концентрацией этих ионов (Зацепина и др., 1983; Зацепина и др., 1985). При инкубации клеток СПЭВ в гипотоническом растворе происходит быстрая деконденсация хромосом (Ченцов, Поляков, 1974; Киреев и др., 1988). Затем клетки адаптируются и хромосомы в них постепенно компактизуются. На определённом этапе компактизации в хромосомах выявляются хромонемы. Хромонемы выявляются также в хромосомах клеток, перенесённых из гипотонического раствора в изотонический (Киреев и др., 1988). Сканирующая электронная микроскопия позволила выявить хромонемы на тотальных препаратах митотических хромосом (Iwano et al., 1997). Всё вышеизложенное позволяет считать хромонемный уровень промежуточным этапом формирования митотической хромосомы (Ченцов, Поляков, 1974; Zatsepina et al., 1983; Нао et al., 1990, Hao et al., 1994).

Относительно формирования хромонемы из 20-30 нм фибриллы не существует единого мнения. С одной стороны некоторые данные свидетельствуют о том, что хромонема формируется при нерегулярном сворачивании 20-3 Онм фибриллы (Marsden, Laemmli, 1979; Widom, 1986; Davie, 1995; Belmont, Bruce, 1994). С другой стороны ещё в 1881 году было описано строение хромосом, состоящих из отдельных зёрнышек, расположенных тандемно (Pfitzner, 1881). Позднее эти образования получили название "хромомеры" и были описаны многими авторами (Левитский, 1931; Вильсон, 1936; Данжар, 1950). С помощью метода дифферециальной деконденсации, суть которого состоит в изоляции ядер в буфере с высокой концентрацией ионов Са++ и Mg++, сохраняющем хроматин в конденсированном состоянии, и последующей деконденсации хроматина в растворах с понижающейся концентрацией бивалентных катионов, было подтверждено, что хромонема состоит из цепочки глобул - хромомеров. Хромомерная организация хромосом подтверждается данными по изучению профазных мейотических и полигенных хромосом эукариот (Lima-de-Faria, 1975). Размер ДНК, которая компактизуется в одном хромомере, составляет около 50 т.п.н. (Кирьянов и др., 1981), что соответствует размеру ДНК, входящему в состав петельных доменов (Paulson, Laemmli, 1977; Разин и др., 1980). Каждый петельный домен может представлять собой полностью развёрнутый хромомер. Существует целый ряд работ, сделанных как на интерфазных ядрах (Sonnenbichler, 1969а,b; Prusov et al., 1983; Ascoli et al., 1988), так и на миготических хромосомах (Comings, Ocada, 1976; Ocada, Comings, 1979), в которых выявляли "розетковидные структуры" в хроматине эукариот при его деконденсации. Суммарная длина ДНК в полностью деконденсированной розетке составляет 15-30 мкм (Sonnenbichler, 1969a,b), что соответствует длине ДНК, входящей в состав одного петлевого домена (21.4мкм) (Pienta, Caffey, 1984), а значит и длине ДНК в составе одного хромомера. Это позволяет рассматривать данные структуры в качестве деконденсированных хромомеров. Однако проблема внутренней организации хромомера ещё далека от решения.

Суммируя имеющиеся литературные данные, можно выделить основные свойства хромомеров: 1) размер хромомеров составляет 100-200 нм; 2) хромомеры декомпактизуются в растворах с низкой ионной силой; 3) образуют хромонему при естественной компактизации хроматина во время митоза и при добавлении в раствор бивалентных катионов; 4) имеют центр структурной организации.

Остаётся открытым вопрос относительно универсальности хромомерного уровня организации хроматина. В миготических хромосомах ДНК в области G-сегментов, содержащих позднереплицирующийся гетерохроматин, упакована в виде хромомеров, тогда как в R-сегментах, состоящих из раннереплицирующегося эухроматина, хромомеры обнаружить не удалось (Comings, 1978; Comings 1980,). С точки зрения Камингса и Окады, которые считали, что хромомеры не являются универсальными структурами, R-сегменты не имеют хромомерной организации (Comings, 1977; Comings, 1978; Okada, Comings, 1979). Однако при детальном изучении динамики деконденсации хромосом обнаружилось, что G-сегменты декомпактизуются гораздо медленнее (Зацепина и др., 1985) и, по-видимому, чувствительность хромомеров к деконденсирующему действию растворов в Rсегментах намного выше, чем в G-сегментах. Возможно, что воздействие гипотонии приводит к расхождению хромомерных элементов в G-сегментах, тогда как в R-сегментах воздействие гипотонии приводит к деконденсации хромомеров и что, возмоно, хромомерная организация хроматина характерна как для G-, так и для R-сегментов (Зацепина и др., 1985). На оптическом уровне хроматин, составляющий как G-, так и R-сегменты в митотических хромосомах, в интерфазных ядрах формирует обособленные домены, имеющие размер -300 нм и являющиеся репликационными единицами (Ferreira 1997, Zink 1998, Zink 1999). Возможно, эти домены являются интерфазными аналогами митотических хромомеров. Иногда отдельные домены сливаются, образуя нитчатые структуры (Verschure 1999; Visser 1999).

Существование хромонемных и хромомерных структур в интерфазных ядрах животных было показано как на интактных клетках, так и на клетках, подвергнутых искусственной декомпактизации при понижающихся концентрациях ионов Са (Zatsepina et al. 1983). В интактных клетках обнаружены фрагменты фибрилл толщиной около 120 нм. Иногда было видно, что фибрилла состоит из тесно сближенных глобулярных структур - хромомеров. Розетковидные хромомерные элементы в большом количестве выявлялись и в ядрах клеток, подвергнутых воздействию деконденсирующих растворов. В интерфазных ядрах культивируемых клеток млекопитающих (Hela), пермеабилизованных в присутствии высоких концентраций органических поликатионов (спермин, спермидин) обнаруживаются хромонемы, имеющие толщину 100-300 нм (Belmont et al., 1989; Belmont, Bruce, 1994). В интерфазных ядрах растений некоторых видов хроматин организован в виде толстых анастомозирующих тяжей (Sparvoli et al., 1965; Ченцов, Поляков, 1974). Существование подобных хромонем характерно для ядер растений с большим геномом (Patankar et al., 1985).

Поскольку хромомерные и хромонемные структуры обнаруживаются не только на всех стадиях митоза, но и в интерфазных ядрах, они могут считаться такой же универсальной формой компактизации ДНП, как и 25-30 нм фибриллы.

Трёхмерную реконструкцию высших уровней организации хроматина в ядрах высших эукариот затрудняет отсутствие объектов, в которых эти структуры были достаточно различимы. В отличие от ядер высших эукариот хроматин инфузорий состоит из обособленных элекгронноплотных телец, которые легко идентифицируются на ультратонких срезах, что позволяет реконструировать их структуру. В данной работе в качестве объектов были выбраны инфузории Я truncatella, P. caudatum и D. nasutum.

Ш. Соматические ядра инфузорий как модель для изучения структуры хроматина и внутриядерных органелл.

Макронуклеусы являются высокополиплоидными соматическими ядрами инфузорий, в которых происходят основные процессы транскрипции (Raikov, 1995; Gorovsky, 1980; Prescott, 1994; Хаусман, 1988) в отличие от метаболически малоактивных микронуклеусов - генеративных ядер инфузорий.

Макронуклеус Микронуклеус

Репликация ДНК Gl, S, G2 S

Механизм деления амитоз митоз

Хроматин хроматиновые тельца или фибриллы фибриллы хроматина

Ядрышки есть нет

РНП-частицы есть нет

Содержание РНК высокое нет или очень мало

Уровень синтеза РНК высокий нет или очень мал

Таблица 1. Сравнение некоторых свойств макро- и микронуклеусов в вегетативных клетках инфузорий (по Райков, 1978)

Макронуклеусы определяют фенотип клетки и существуют внутри неё до следующего полового процесса. Новый макронуклеус образуется из продуктов деления диплоидного микронухлеуса после конъюгации. При этом старые макронуклеусы партнёров разрушаются (Mpoke, Wolfe, 1996). При развитии зачатка макронуклеуса микронуклеарные хромосомы сначала политенизируются (Райков, 1992; Prescott, 1994). Затем происходит эксцизия внутренних элиминируемых последовательностей и деградация части генетического материала. Дальнейшая фрагментация также сопровождается потерей части хроматина. Размер молекул ДНК, образующихся в новом макронуклеусе, различен у разных видов инфузорий. Это могут быть отрезки длиной 0.4-20 т.п.н. - "мини-", или "нанохромосомы" (Hypotrichida). У других видов ДНК не так сильно фрагментирована и образует "субхромосомы", размер которых достигает 1000 т.п.н. {Tetrahymena, Paramedian) (Райков, 1992; Prescott, 1994).

Вид Q (Ma)/Q (Mi) ДНК в Ma (пг) Размер ДНК, тпн Размер рДНК, тпн

Tetrahymena thermo+phila 21-25 9-10 24-1100 19.4-20.8

Paramecium aurelia 430-540 -70 330-480 8.2х(2-13)

Oxytricha nova 90 (на 2 Ma) 116 0.4-20 7.5 М

Styionichia Iemnae 32 788 0.5-23 7.5 М

Euplotes aediculatus 200 380 0.4-23 7.5 М

Bursaria truncatella 2620 38000 20-360

Таблица 2. ДНК макронуклеусов некоторых инфузорий (по Райков, 1992)

На концах образованных в результате фрагментации молекул ДНК происходит синтез теломеров, стабилизирующих концы молекул ДНК. Затем эти молекулы амплифицируются, причём одни молекулы амплифицируются в большей степени, чем другие. В результате всех этих изменений образуется новый макронуклеус, который сохраняется до следующей коньюгации. Хотя эти процессы характерны для формирования генома макронуклеуса всех инфузорий, доля исходного генома микронуклеуса, сохраняющаяся в макронуклеусе, может различаться у разных представителей класса Ciliata на несколько порядков. В результате всех преобразований появляется уникальная система, которая наряду со свойствами ядер, характерными для высших эукариот, имеет также и особенности. Подобно ядрам высших эукариот, макронуклеус инфузорий способен делиться. Но в отличие от них и от микронуклеусов, которые делятся путём митоза, макронуклеусы делятся амитотически. В отличие от хроматина высших эукариот, хроматин большинства инфузорий упакован в многочисленные дискретные хроматиновые тельца, размером 70-200 нм (например, у Tetrahymena, Paramecium (Raikov, 1982), Stentor (Kawakami, 1994), Euplotes eurystomus (Lin, Prescott, 1986)). Однако в макронуклеусах некоторых инфузорий хроматин образует непрерывную сеть толстых фибрилл конденсированного хроматина (Homalozoon (Leipe, Hausmann, 1992), Climacostomum (Hufschmid, 1983), Euplotes rariseta (Dallai et al., 1985), Styx (Lin, Prescott, 1986)).

Ряд данных свидетельствует о том, что хроматиновые тельца макронуклеусов инфузорий являются аналогами хромомеров ядер высших эукариот. В частности, на препаратах выделенного хроматина было показано, что хроматиновые тельца организованы по радиально-петельному принципу (Мартынкина и др., 1984, Тихоненко и др., 1985) и могут быть декомпактизованы в растворах с низкой ионной силой (Мартынкина и др., 1984, Тихоненко и др., 1985). В тельцах были выявлены центры структурной организации (Новикова, Попенко, 1998). В отличие от хромомеров высших эукариот, которые становятся видны только на определённых стадиях деконденсации митотических хромосом, хроматиновые тельца инфузорий легко обнаруживаются в большом количестве в икгерфазном ядре, что делает макронуклеус удобной моделью для изучения высших уровней организации хроматина. В ядрах высших эукариот хромомеры входят в состав хромонем - фибрилл хроматина, толщиной 100 нм, образующих тело митотической хромосомы (Зацепина и др., 1983). Подобные хромонемные элементы обнаруживаются на определённых стадиях жизненного цикла в макронуклеусах некоторых инфузорий (Seshachar, 1964; Inaba, Sotokawa, 1968, Попенко и др., 1998).

E0L 1. Особенности структурной организации макронуклеуса В. truncatella

В. truncatella представляет собой крупный одноклеточный организм размером ~ 1 мм. Как и другие инфузории, В. truncatella имеет два типа ядер большой (до двух миллиметров в длину) макронуклеус - соматическое ядро, обеспечивающее синтез белков, необходимых для функционирования В. truncatella', и многочисленные микронуклеусы - метаболически малоактивные ядра. Окраска на ДНК на светоогггическом уровне обнаружила существование внутри макронуклеуса участков, окрашенных с разной интенсивностью (Полянский 1934, Ruthmann 1968). Был сделан вывод, что в разных участках макронуклеуса хроматин имеет разную степень компактизации. Интенсивно окрашенные участки были названы "центрами конденсации хроматина".

Интерфазный хроматин макронуклеуса В. truncatella по структурной организации является типичным хроматином эукариот. Была описана упаковка ДНК макронуклеуса в нуклеосомные структуры (Сергеева, 1977; Мартынкина и др., 1983), фибриллы толщиной 20-30 нм и хромомеры, а также прослежены переходы между фибриллами хроматина разных уровней организации (Мартынкина и др., 1984). На ультратонких срезах (Сергеева, 1977) и на выделенных препаратах (Vengerov et al., 1983; Мартынкина, 1984) макронуклеуса хроматин имеет вид компактных хроматиновых телец. Такие тельца соответствуют неактивному хроматину (Vengerov et al., 1983). При инкубации в растворе с низкой ионной силой они декомпактизуются с образованием ореола из фибрилл хроматина, что свидетельствует о радиально-петельной организации хроматина в них (Мартынкина и др. 1984). При естественной декомпактизации хроматиновых телец в процессе эксцистирования на препаратах, приготовленных по методу Миллера (Тихоненко и др., 1984), было показано, что от центральной, более плотной части хроматиновых телец, отходят петли фибрилл хроматина, на которых и происходит транскрипция.

При обработке комплексами РНКаза-Au ультратонких срезов макронуклеуса В. truncatella метка обнаруживается на периферии хроматиновых телец, что свидетельствует о происходящих там процессах транскрипции (Попенко и др., 1991). То есть транскрипция в макронуклеусе может происходить на петлях фибрилл хроматина в не полностью декомпактизованных тельцах.

На ультратонких срезах макронуклеуса В. truncatella обнаруживаются пространственно обособленные зоны,хроматиновые тельца внутри которых имеют разный размер; 18-66 нм и 31-112 нм (Попенко и др., 1988; Попенко и др., 1998; Сергеева и др., 1995). Вероятно, что мелкие хроматиновые тельца, находящиеся на периферии макронуклеуса, соответствуют транскрипционно-активным, но не до конца деконденсированным хроматиновым тельцам. Это предполагает наличие механизма избирательной активации генов в определённых участках макронуклеуса. С другой стороны, фрагментация ДНК при образовании нового макронуклеуса происходит неслучайным образом (Mpoke, Wolfe, 1996). Следовательно, в зонах макронуклеуса, содержащих хроматиновые тельца определённого размера, могут избирательно сосредотачиваться гены с определёнными функциями

На стадии цисты покоя - функционально неактивной стадии жизненного цикла В. truncatella - размер хроматиновых телец увеличивается примерно вдвое и составляет 62-121 нм и 117- 295 нм в разных зонах макронуклеуса (Попенко и др., 1996; Попенко и др., 1998; Черни и др., 1995). На ультратонких срезах цист нередко можно наблюдать образование разветвлённых хромонемных фибрилл из тесно сближенных между собой хроматиновых телец.

Таким образом, несмотря на то, что хроматин В. truncatella представлен короткими молекулами ДНК (20-360 т.п.н.), на определённых стадиях жизненного цикла хроматин В. truncatella способен формировать фибриллы, подобные хромонемам в ядрах высших эукариот.

В макронуклеусе инфузорий помимо хроматина хорошо идентифицируются ядрышки. Структура и пространственное расположение ядрышек в макронуклеусе инфузорий напрямую зависит от структуры и пространственного расположения хроматина в ядре.

Ядрышки на ультратонких срезах макронуклеуса взрослой вегетативной клетки В. truncatella имеют размер 0.7-2.0 мкм и часто собираются группами. Центральная часть ядрышка имеет фибриллярное строение, по периферии фибриллярной зоны находится более электронноплотная гранулярная часть (Попенко и др., 1988). Рядом с ядрышками на срезах обычно обнаруживаются структуры в виде мелких телец размером 100-200 нм, в которых хорошо различимы отдельные гранулы диаметром 15-20 нм. По структуре тельца похожи на материал гранулярной зоны ядрышка. По мере удаления от ядрышек гранулярные тельца встречаются всё реже. При использовании метода преимущественного контрастирования ДНК-содержащих структур вольфраматом натрия хроматиновые тельца становятся электронноплотными, в то время как мелкие гранулярные тельца, подобно ядрышкам, контрастируются значительно слабее, что свидетельствует о наличии в них РНК (Попенко и др., 1988). При обработке ультратонких срезов макронуклеуса В. truncatella комплексами РНКазы с золотом также обнаружено, что гранулярные тельца интенсивно метятся и это подтверждает их РНП-природу.

HL 2. Особенности структурной организации макронуклеуса Р. nasutum

D. nasutum значительно меньше В. truncatella и имеет размер от 60 до 200 мкм. Ядерный аппарат D. nasutum состоит из двух микронуклеусов и одного подковообразного макронуклеуса. На оптическом уровне он окрашен равномерно. Зоны конденсации не выявляются.

Как и В. truncatella, D. nasutum в неблагоприятных условиях способны образовывать цисты.

На электронномикроскопических препаратах хроматин макронуклеуса представлен в виде множества дискретных электронноплотных телец, имеющих неправильную форму и более или менее равномерно распределённых в пространстве макронуклеуса (Rieder, 1971; Karadzan, Raikov, 1977). Хроматиновые тельца имеют размер 100-200 нм и соединены друг с другом одной или несколькими тонкими фибриллами (Караджан, Попенко, 1995). При большом увеличении видно, что каждое хроматиновое тельце состоит из плотно упакованных ДНП-фибрилл (Karadzan, Raikov, 1977). На препаратах, приготовленных по методу Миллера, они декомпактизуются с образованием фибрилл нуклеосомного строения (Караджан, Попенко, 1995).

Ядрышки интерфазного макронуклеуса D. nasutum большие, имеют сложную форму, равномерно распределены по всему макронуклеусу (Karadzan, Raikov, 1977). Их фибриллярный компонент, представленный плотными трабекулами -100 нм толщиной и состоящий из 8 нм фибрилл, располагается на периферии ядрышка. Гранулярный компонент состоит из прерибосомальных гранул размером -20 нм и расположен в центральной части ядрышка. Тельца внутриядрышкового хроматина лежат либо внутри ядрышка, либо на его периферии, но обязательно в контакте с фибриллярным компонентом (Karadzan, Raikov, 1977).

Ш. 3. Особенности структурной организации макронуклеуса P. caudatum

Ядерный аппарат P. caudatum состоит из одного микронуклеуса и одного макронуклеуса (Осипов, 1981). Макронуклеус P. caudatum овальный и имеет размер 30-35 на 10-15 мкм (Ehret et al., 1955; Jurand, Selman, 1969; Sonnebom, 1953; Sandararaman, Cummings, 1976).Он гораздо меньше, чем макронуклеус В. truncatella и на оптическом уровне в нем не было описано зон разной интенсивности окраски. Макронуклеус P. caudatum делится амитотически непосредственно перед делением клетки (Krawchynska et al., 1978; Райков, 1978).

Хроматин P. caudatum организован в многочисленные дискретные тельца, размером 100-200 нм, равномерно распределённые по макронуклеусу.

Кроме того, макронуклеус содержит ядрышки, которых нет в микронуклеусе (Cameron et al., 1966; Kimball, 1953; Nanney et al., 1960; Stevenson, Lloyd, 1971; Swift et al., 1964). Форма и размер ядрышек значительно варьирует на различных стадиях клеточного цикла и в разных условиях окружающей среды (Jurand et al., 1964; Krawchinska et al., 1980). Ещё в 1964 году было описано, что ядрышки парамеций состоят из РНК-содержащего кортекса и ДНК-содержащего ядра (Jurand et al., 1964). В более поздних работах описывались три основных типа ядрышек в макронуклеусах родственных инфузорий P. putrinum, которые наблюдались в зависимости от условий культивирования инфузорий: малые компактные (менее 0.2 мкм), большие "сложные" и электронноплотные вакуолизированные ядрышки. Малые компактные и электронноплотные встречаются редко, в основном в погибающих культурах. Большие сложные ядрышки состоят из различного числа отдельных структур, диаметром примерно 0.75 мкм, которые были названы "ядрышковыми единицами". Среднего размера ядрышко может содержать до четырнадцати "ядрышковых единиц". "Ддрышковая единица" представляет собой кольцо плотного фибро-гранулярного материала с тельцем внутриядрышкового хроматина в центре. Ддрышковые единицы окружены фибро-гранулярным компонентом, состоящим из нитей, которые имеют толщину около 15 нм (Sabaneeva 1997). Подобные сложные ядрышки были обнаружены в макронуклеусах P. bursaria и в более ранних работах, но детально их структура не была описана (Schwartz, 1978).

Методом дифференциального окрашивания по Бернару в вегетативных макро нуклеусах парамеций бьши локализованы разнообразные РНП-структуры. РНП-материал обнаруживается на периферии ядрышек, причём РНП-фибриллы проникают внутрь ядрышка. К ядрышку примыкают многочисленные РНП-гранулы. Гетерохроматин остаётся неокрашенным, но по периферии хроматиновых телец также отмечено наличие РНК. В нуклеоплазме обнаружены как перихроматиновые, так и интерхроматиновые гранулы (Krawchinska et al., 1980).

Все описанные выше ультраструктурные данные были получены при изучении ультратонких срезов макронуклеусов инфузорий, которые дают лишь двумерное изображение. Окраска по Бернару позволяет визуализировать относительное пространственное распределение РНП-структур и хроматина в плоскости среза, но полную картину взаимоотношений компонентов в ядре и функциональной организации хроматина может дать может дать только объёмное изображение пространства ядра. Чтобы выяснить, каково взаимное расположение хроматиновых телец в неразрушенном макронуклеусе, Камингс в 1978 году изучал макронуклеус парамеции в сканирующем микроскопе. При изучении поверхности ядер, лишённых мембран, он выяснил, что хроматиновые тельца лежат близко друг к другу (на расстоянии меньшем, чем диаметр хроматинового тельца) и соединены между собой ДНП-фибриллами (Cummings, 1978). В этой же работе был подтверждён размер хроматиновых телец, полученный при изучении ультратонких срезов. Однако с помощью сканирующего электронного микроскопа возможно изучение только поверхности макронуклеуса, тогда как организация внутренней структуры ядра остаётся неизвестной.

В данной работе для выяснения пространственной архитектуры высших уровней организации хроматина в пространстве ядра был использован метод трёхмерной реконструкции объектов на основе ультратонких серийных срезов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Инфузории P.caudatum и В.truncatella были выловлены в пруду Ботанического сада Российской Академии Наук (г. Москва).

D .nasutum был любезно предоставлен Б. Караджан (Институт Цитологии

РАН)

Инфузории P. caudatum культивировали на салатной среде (Хаусман, 1988), в качестве корма использовали бактерии Aerobacter sp. Инфузории В. truncatella культивировали на кипяченой водопроводной воде, в качестве корма использовали инфузорий P. caudatum. Инфузории D .nasutum культивировали на салатной среде, в качестве корма использовали инфузорий Tetrahymena pyriformis, которых культивировали отдельно.

Цисты В. truncatella и D .nasutum получали, подвергая инфузорий голоданию в течение нескольких суток. В настоящей работе исследовали цисты покоя В. truncatella; в возрасте 3 суток. У D .nasutum были изучены цисты на стадии ротации.

Оптическая микроскопия

Клетки фиксировали на стёклах 6% раствором параформальдегида (PFA) на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.8) 3 ч при комнатной температуре.

Для окрашивания ДНК по Фёльгену клетки, наклеенные на стёкла подвергали гидролизу в 1 N НС1 в течение 10 мин при 60°С, затем помещали в реактив Шиффа на 40 мин в темноте и промывали свежеприготовленной сернистой водой, как описано (Луппа, 1980). Затем стёкла промывали проточной водой и просматривали в микроскопе Jenaval.

Электронная микроскопия.

Интактные клетки P. caudatum, D. nasutum и В. truncatella фиксировали 2.5% раствором глутаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.5) (раствор А) 1 ч при комнатной температуре. Для фиксации выделенных ядер использовался 2.5% раствор глутаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.5) с добавлением 1 мМ MgCh (раствор Б) 1 ч при комнатной температуре.

Для фиксации целых клеток P. caudatum -600 клеток осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин и фиксировали раствором А.

Вьщеление макронуклеусов из В. truncatella проводили под бинокуляром, как описано ранее (Сергеева, 1977), в 2 мМ К-фосфатном буфере, рН 7.5, содержащем 1 мМ MgCfo (раствор В) с добавлением 0.1% NP-40. Критериями для выбора условий выделения макронуклеусов были: 1. максимальная сохранность их общей морфологии и структуры хроматина на оптическом и ультраструктурном уровнях; 2. стабильность выделенных макронуклеусов в растворе для выделения в течение, по крайней мере, нескольких часов.

Для выделения макронуклеусов из P. caudatum в 200 мкл раствора В с добавлением 0.1% NP-40 помещали ~ 600 клеток и процесс их лизиса контролировали под оптическим микроскопом. Затем макронуклеусы осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин и фиксировали 2.5% глутаральдегидом на растворе В.

Целые клетки и выделенные ядра В. truncatella и D .nasutum фиксировали раствором В поодиночке под бинокуляром.

Затем отдельные клетки и выделенные макронуклеусы В. truncatella и D.nasutum, а также осадки клеток и выделенных ядер P. caudatum дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в смолу эпон-аралдит по стандартной методике.

Срезы толщиной 50-80 нм получали на ультратоме LKB III (Уппсала, Швеция), окрашивание уранил ацетатом и цитратом свинца проводили по стандартной методике. Препараты изучали в электронном микроскопе JEM-100CX (JEOL, Токио, Япония) при 80 кВ.

Для регрессивной окраски по методу Бернара (Bernhard, 1969) ультратонкие срезы помещали в водный раствор 4.5% уранил ацетата, затем срезы промывали дистиллированной водой, обрабатывали 0.2 М раствором ЭДТА в течение 30 мин и после промывки дистиллированной водой срезы окрашивали цитратом свинца в течение 15 мин.

Фотографии (конечное увеличение 33200 - 500ООх) и негативы (8300х -20000х) сканировали с конечным разрешением 480 пикселей на 1 мкм среза. Измерения проводили с помощью программы ImageJ.

Гипотоническая обработка.

Около 100 клеток P. caudatum переносили в раствор, содержащий 2 мМ К2НР04, 0.05 мМ MgCl2 (рН 7.5) (раствор Г), добавляли 0.1 % NP-40, затем центрифугировали 3 мин при 3000 об/мин и фиксировали в растворе Г, содержащем 2.5% глутаральдегид, 1 ч при комнатной температуре.

В случае В. truncatella раствором Г обрабатывали выделенные макронуклеусы. Обработку проводили поодиночке под бинокуляром.

Общее время нахождения P. caudatum в растворе с низкой ионной силой (до добавления фиксатора) составляло 0, 4, б или 10 мин, а В. truncatella 0, 5, 10 и 15 мин. Обезвоживание и заливку в эпон-араддит проводили по стандартной методике.

Обработка бивалентными катионами

Влияние ионов Mg^ на компактизацию хроматина выделенных макронуклеусов В. truncatella, D .nasutum и P. caudatum изучали, инкубируя выделенные ядра в растворе Г, содержащем 3 мМ MgCh, в течение 15 мин.

Для изучения рекомпактизации хроматина после его искусственной декомпактизации макронуклеусы, подвергнутые воздействию гипотонических растворов в течение разного времени, помещали в раствор Г, содержащий 3 мМ MgCb. Через 15 минут инкубации ядра переносили в раствор А, содержащий 3 мМ MgCl2. Обезвоживание и заливку в эпон-аралдит проводили, как описано выше.

Трёхмерная реконструкция

Для трёхмерной реконструкции использовали серию электронномикроскопических срезов (15-30 штук). После оцифровки негативов и предварительной обработки изображений в программе Adobe Photoshop полученные bmp-файлы обрабатывали в программе Sterm для создания моделей пространственной организации участков макронуклеусов инфузорий P. caudatum и В. truncatella. Подробнее процесс реконструкции будет описан в главе I Результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Т. АНАЛИЗ ПОДХОДОВ И ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА КАЧЕСТВО И ТОЧНОСТЬ ТРЁХМЕРНЫХ МОДЕЛЕЙ

Трехмерные модели, по сравнению с двумерными изображениями, получаемыми в стандартных микроскопических техниках, дают более полное представление о пространственной организации биологических структур. Современные компьютерные технологии в сочетании с электронно-микроскопическими подходами в принципе позволяют с достаточно высокой точностью реконструировать расположение хроматина в пространстве клеточного ядра. Однако работ, посвященных моделированию сложных структур хроматина, очень немного, т.к. есть ряд принципиальных проблем в реконструкции таких структур. В этой главе будут подробно рассмотрены основные этапы построения трехмерных моделей клеточных структур, проанализированы возможные причины ошибок и описаны методы их предупреждения, которые мы использовали при разработке и работе с программой STERM.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Леонова, Ольга Геннадьевна

выводы

1. Определены факторы, влияющие на точность построения трехмерных моделей на основе серийных ультратонких срезов. Разработано программное обеспечение для реконструкции сложных структур в больших объемах клеточного ядра, которое может быть использовано для построения математических моделей функционирования клеточного ядра. Проведена трехмерная реконструкция участков макронуклеусов инфузорий В. truncatella, D. nasutum и P. caudatum с учетом структур размером 50 нм и более.

2. С помощью трехмерной реконструкции впервые показано, что в макронуклеусах инфузорий, геном которых состоит из коротких (до нескольких сотен тысяч п.н.) молекул ДНК, существуют фибриллы хроматина толщиной 100300 нм, соответствующие хромонемам в хромосомах высших эукариот. Длина таких фибрилл у разных видов инфузорий различна, что связано с размерами и особенностями организации их макронуклеусов.

3. Основной формой организации хроматина в макро нуклеусах исследованных инфузорий на стадии интерфазы являются хроматиновые тельца размером 50-200 нм. Ассоциация хроматиновых телец в хромонемоподобные фибриллы происходит при снижении активности макронуклеуса, при переходе к стадии цисты. Показано, что этот процесс происходит избирательно и кооперативно в определенных участках макронуклеуса.

4. На ультратонких срезах изучена динамика декомпактизации хроматиновых телец и ядрышек В. truncatella и P. caudatum в условиях гипотонии. Исследована обратимость этого процесса. Показано, что переход хроматиновых телец от компактного состояния до полностью расправленного происходит кооперативно. Полученные данные показывают, что хроматиновые тельца в макронуклеусах инфузорий с субхромосомным размером молекул ДНК по структурной организации и динамике функционирования соответствуют хромомерам в ядрах высших эукариот.

5. С помощью трехмерной реконструкции впервые показано, что в выделенных макронуклеусах в условиях in vitro при обработке катионами Mg^" образуются хромонемоподобные фибриллы толщиной 100-300 нм. Сделан вывод о наличии в соматических ядрах инфузорий дополнительных факторов, обеспечивающих избирательную компактизацию хроматиновых телец в определенных участках ядра.

В заключение я хотела бы выразить глубокую благодарность своему научному руководителю, доктору биологических наук Владимиру Ивановичу Попенко за поддержку и внимание к моей работе.

Я хотела бы выразить свою благодарность Юлии Львовне Ивановой, в соавторстве с которой была получены многие из представленных здесь результатов.

Выражаю искреннюю благодарность Юрию Фёдоровичу Ивлеву за его энтузиазм в работе над программой.

Я глубоко признательна инженеру рГеннадию Вениаминовичу Сердюкову|, благодаря которому я смогла получить электронномикроскопические данные.

Я очень благодарна [Сергею Сергеевичу Вакару) за искреннее желание помочь в и постоянную моральную поддержку.

Хочу поблагодарить моих родных за огромное терпение все эти долгие годы.

Я очень признательна моим друзьям, благодаря поддержке которых я смогла довести до конца свою работу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В макронуклеусах инфузорий размер молекул ДНК значительно меньше, чем у высших эукариот, и в них не формируются метафазные хромосомы, характерные для клеток млекопитающих. Тем не менее полученные нами данные показывают, что хроматин макронуклеусов инфузорий с субхромосомным размером ДНК организован в хроматиновые тельца по принципу хромомеров -дискретных петлевых структур хроматина, выявляемых электронно-микроскопически в клетках млекопитающих и растений. На трехмерных моделях впервые доказано, что при снижении активности макронуклеусов в условиях голодания или при переходе к стадии цист покоя хроматиновые тельца в определенных участках ядра укрупняются, сближаются и формируют толстые 100300 нм фибриллы типа хромонем, описанных в хромосомах высших эукариот.

Процессы компактизации - декомпактизации хроматина происходят кооперативно в определенных участках макронуклеуса. Наиболее отчетливо и очевидно это проявляется у инфузорий с крупным макронуклеусом {B.truncatella), где зоны конденсированного хроматина видны даже на светооптическом уровне. В парамециях, где размер и плоидность макронуклеуса гораздо меньше, подобные большие очевидные зоны в макронуклеусе отсутствуют. Однако и в макронуклеусах парамеций нам на электронно-микроскопическом уровне удалось обнаружить зоны (в области ядрышковых агрегатов) где хорошо видно, что процессы агрегации хроматиновых телец в 100-300 нм фибриллы происходят избирательно и кооперативно. Отличия в динамике декомпактизации хроматиновых телец, расположенных в разных зонах макронуклеуса были выявлены и в экспериментах по действию гипотонической обработки на структуры макронуклеусов.

Таким образом, представленные данные показывают, что соматические ядра инфузорий имеют строго упорядоченную пространственную структуру, а структурные механизмы функционирования генома на уровнях нуклеосом, нуклеомеров, хромомеров и хромонем сходны даже в эволюционно отдаленных видах с разной организацией генома. Избирательность компактизации хроматина в разных участках макронуклеуса хорошо соответствует идее хромосомных территорий в ядрах высших эукариот.

Структурные переходы от хроматинов ых телец (хромомеров) к хромонемоподобным фибриллам можно смоделировать в условиях in vitro в присутствии ионов магния. Однако в этом случае избирательность формирования 100-300 нм фибрилл в определенных участках макронуклеуса теряется, и хромонемоподобные фибриллы образуются во всем пространстве макронуклеуса.

Полученные нами результаты показывают возможность проведения реконструкции пространственной организации структур в большом объеме клеточного ядра. В данной работе при проведении трехмерной реконструкции учитывались структуры размером ~ 50 нм и более. Можно надеяться, что появление в последние годы моделей электронных микроскопов с автоматическим определением трехмерного расположения структур в объеме одного среза на основании серии съемок среза под разными углами в сочетании с описанными подходами даст возможность еще более увеличить разрешение трехмерных моделей и приблизиться к решению вопроса математического моделирования функционирования клетки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Леонова, Ольга Геннадьевна, 2007 год

1. Бавыкин С.Г. Динамика структуры хроматина // Итоги науки и техники. Молекулярная биология. 1988. Т.26. С. 5-121

2. Борхсениус С.Н., Сергеева Г.И. Характеристика ДНК вегетативных особей инфузории Bursaria truncatella// Цитология. 1979. Т.21. С.327-333.

3. Борхсениус О.Н., Беляева Н.Н., Осипов Д.В. 1988. Структура хроматина соматического-ядра инфузории Spirostomum ambiguumll Цитология. 30: 762-769.

4. Вильсон Э. Клетка и ее роль в развитии и наследственности. // М.; Л.: Биомедгиз, 1936.

5. Георгиев Г. П., Бакаев В. В. 1978. Три уровня структурной организации хромосом у эукариот.//Молек. биол. 12, 6: 12051230.

6. Глазков М.В. Структурно-функциональная организация ДНК в интерфазном ядре. Структурный аспект//Молекуляр. биология. 1988. Т. 22. С. 16-30.

7. Глазков М.В. Петельно-доменная организация генов в эукариотических хромосомах // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 965-982.

8. Громова Е. Н. Влияние внешних факторов на структуру макронуклеуса Paramecium caudatum. //Зоол. журн. ,1941, т. 20, с. 187-197.

9. Данжар П. 1950. Цитология растений и общая цитология. М., ИЛ. С.488.

10. Дёмин С.Ю., Стефанова В.Н. Исследование структуры хроматина и хромосом на препаратах дериватов интерфазных ядер, полученных путём удаления оболочек ядер. IV. // Цитология 2000. Т. 42, № 5. С. 486-500.

11. Зацепина О. В., Поляков В. Ю., Ченцов Ю. С. Электронно-микроскопическое изучение хромонемы и хромомеров в миготических и интерфазных хромосомах // Цитология.1983. Т. 25, №2. С. 123129.

12. Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Различия в структурной организации G- и R-сегментов, выявляемые в процессе дифференциальной деконденсации хромосом.

13. Цитология. 1985, Т. 27. С. 865-871.

14. Караджан Б.П., Попенко В.И. Электронно-микроскопическое исследование структуры неактивного хроматина интерфазного макронуклеуса инфузории Didinium nasutum.ll Цитология. 1995. Т. 37. № 5/6. С. 519-524.

15. Киреев И. И., Зацепина О. В., Поляков В. 10., Ченцов Ю. С. Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ при их обратимой искусственной деконденсации in vivo //Цитология. 1988. Т. 30, № 8. С. 926932.

16. Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Динамика структурной реконструкции митотических хромосом после их искусственной деконденсации in vitro. II Цитология. 1990. Т. 32. Стр. 449-543.

17. Кирьянов Г. И., Смирнова Т. А., Поляков В. Ю. 1981. Нуклеомерная организация хроматина. Биохимия, 46, П: 1923 1937.

18. Левитский Г.А. 1931. Цит. по Левитский Г.А. Морфология хромосом (История. Методика. Факты. Теория.) в сб. "Цитология растений" // М.: Наука, 1976. 350 с.

19. Луппа X. Основы гистохимии. М.: Мир. 1980. с. 101

20. Новикова Е.Г., Попенко В.И. Визуализация организующих центров в хроматине макронуклеуса инфузории Bursaria truncatella //Молекуляр. биология. 1998. V.37.P.567 575.

21. Осипов Д.В. Проблемы гетероморфизма ядер у одноклеточных организмов. Л. .Наука, 1981. С. 167.

22. Поляков В.Ю., Зацепина О.В., Киреев И.И., Прусов А.Н., Фаис Д., Шеваль Е.В.,

23. Коблякова Ю.В., Голышев С.А., Ченцов Ю.С. Структурно-функциональная модель митотической хромосомы II Биохимия. 2006. Т. 71 (1). Стр. 6-16.

24. Попенко В.И., Черни Н.Е., Яковлева М.Г. Сравнительный анализ распределения РНК в инфузориях Bursaria truncatella на разных стадиях жизненного цикла с помощью комплексов РНКаза-коллоидное золото //Молекулярная биология. 1991. V.25. Р.472- 482.

25. Попенко В.И., Черни Н.Е., Яковлева М.Г. Изучение цист покоя инфузории Bursariatruncatella на ультратонких срезах. П. Ультраструктура ядрышек, генеративного и соматического ядер. //Цитология. 1996. V.38 (8). Р.822-828.

26. Попенко В.И., Новикова Е.Г., Чуриков Н.А., Викторова JI.C., Черни Н.Е. Размер ДНК и структурная организация хроматина макро нуклеуса инфузории Bursaria truncatella.// Молекуляр. биология. 1998. V.32(2). Р. 323-331.

27. Потехин А.А., Раугиан М.С., Бригге Т. Геном инфузории Paramecium caudatum: анализ методом пульс-электрофореза. // Генетика. 1999. Т. 35. С. 1413-1420.

28. Разин С.В., Мангьева B.JL, Георгиев Г.П. Выделение и сравнительная характеристика участков ДНК, прилегающих к структурам остова ин-терфазного ядра и митотическойхромосомы//Молекулярная биология. 1980. Т. 14. С. 223-233.

29. Райков И.Б. Ядро простейших. Л.: Наука, 1978.

30. Райков И.Б. Ядерная дифференцировка и гетероморфизм ядер у простейших // Цитология. 1992. Т. 4, N 7. С. 3-16.

31. Сергеева Г.И. О структуре хроматина макронуклеуса инфузории Bursaria truncatella // Цитология. 1977. Т. 19, N 10. С. 1146-1154.

32. Сергеева Г.И., Бобылёва НН., Ибрагимов Р.Х. Структурная организация хроматина соматического ядра на разных стадиях инцистирования инфузорий Bursaria truncatella

33. Цитология. 1987, т. 29, с. 5-11.

34. Сергеева Г.И., Ливолан Ф., Консейкао М.Д., Самошкин А.А., Большакова Н.Н., Райков И.Б. Инфузории рода Bursaria в состоянии криптобиоза // Цитология. 1995. Т. 37. С. 1189-1206.

35. Фролова Е.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Особенности структурной организации прицентромерного гетерохроматина мыши, выявляемые в процессе дифференциальной деконденсации хромосом. //Цитология. 1989. Т. 31. Стр. 380-385.

36. Хаусман К. Протозоология. М: Мир, 1988. С. 334.

37. Челидзе ПВ., Зацепина О.В. Морфо-функциональная классификация ядрышек. // . Успехи современной биологии. 1988. Т. 105 С. 252-268.

38. Ченцов Ю.С. Общая цитология. Издательство МГУ. 1995. С.384, С148.

39. Ченцов Ю.С., Бураков В.В. Хромонема забытый уровень укладки хроматина вмитотических хромосомах.//Биологические мембраны. 2005. Т. 22 (3). Стр. 178-187.

40. Черни Н.Е., Иванова Ю.Л., Яковлева М.Г., Попенко В.И. Ультраструктура макронуклеуса и распределение РНК-содержащих структур в цистах покоя инфузории Bursaria truncatella//Молекулярная биология. 1995. V.29(2). Р.383-397.

41. Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. 2002. Иммуноцитохимическое изучение распределения PCNA в ядрах со стабилизированным и нестабилизированным ядерным матриксом// Биол. мембраны, том 19, стр. 237-242.

42. Яровая О.В., Разин С.В. Новые подходы к изучению структурно-функциональной организации эукариотического генома//Молекуляр. биология. 1998. Т.32. С.43-53.

43. Adachi Y., Kas Е., Laemmli U.K. Preferential, cooperative binding of DNA topoisomerase II to scaffold-associated regions // EMBO J. 1989. V. 8. P. 3997-4006.

44. Adelman K., Lis J.T. //Molecular Cell. 2002. V.9. P.451-457.

45. Adolph K. W., Cheng S.M., Paulson J.R., Laemmli U.K. Isolation of a protein scaffold from mitotic HeLa cell chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 4937-4941.

46. Adolph K.W. Organization of chromosomes in mitotic HeLa cells. // Exp. Cell Res. 1980a.1. Vol. 125. P. 95-103.

47. AlegraP., Sterner R, Clayton D.F., Allfrey V.C. //J.Mol. Biol. 1987. V. 196. P.379-388.

48. Alexandrova O, Solovei I, Cremer T, David CN. Replication labeling patterns andchromosome territories typical of mammalian nuclei are conserved in the early metazoan Hydra. // Chromosoma. 2003 Dec;l 12(4): 190-200. Epub 2003 Nov 13.

49. Ascoli C.A., Link M.R., Venturo N., Kuchler R.J., Mandeles S. Identification of a rosetteenriched chromatin fraction from mouse fibroblast nuclei. // Archives of biochememistry . and biophysics. 1988. Vol. 263. P. 334-348.

50. Baranetzky J. Die Kernteilung in den pollen Mutterzellen einiger Tradescantien. /'/ Bot. Zeit.1880. 38. 281-295.

51. Belmont A. S., Sedat J. W., Agard D. A. A three-dimensional approach to mitoticchromosome structure: evidenso for a complex hierarchical organization // J. Cell Biol. 1987. Vol. 105. P. 77-92.

52. Belmont, A. S., M. B. Braunfeld, J. W. Sedat and D. A. Agard . Large-scale chromatinstructural domains within mitotic and interphase chromosomes in vivo and in vitro.// Chromosoma 1989. 98(2): 129-143.

53. Belmont, A S. and K. Bruce. Visualization of G1 chromosomes: a folded, twisted,supercoiled chromonema model of interphase chromatid structure. // J Cell Biol 1994. 127(2): 287-302.

54. Belyakin S. N., Christophides G. K., Alekseyenko A. A., Kriventseva E. V., Belyaeva E. S.,

55. Nanayev R. A, Makunin I. V., Kafatos F. S., Zhimulev I. F. Genomic analysis of Drozophila chromosome underreplication reveals a link between replication control and transcriptional territories. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2005. 102(23): 8269-74.

56. Bernhard W. A new staining procedure for electron microscopical cytology.// J Ultrastruct

57. Res. 1969 May;27(3):250-65.

58. Berrios M., Osheroff N., Fisher P. A. In situ localization of DNA topoisomerase П, a majorpolypeptide component of the Drosophila nuclear matrix fraction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V.82. P. 4142-4146.

59. Boulikas T. Chromatin domains and prediction of MAR sequences // Intern. Rev. Cytology.1995. V. 162A. P. 279-388.

60. Busch H., Smetana K. The Nucleolus. // Academic Press. New York 1972.

61. Cameron I.L., Padilla G.M., Miller O.L. Macronuclear Cytology of synchronized Tetrahymena pyriformis. //J. Protozool. 1966 Vol. 13. P. 336-341.

62. Chentsov Y.S., Burakov V.V., Kosykh M.I. Nuclear matrix proteins are carried withinperipheral material of mitotic chromosomes. // Membr Cell Biol. 2000 Vol. 13(6). P. 799810.

63. Chevret, E., E. V. Volpi, et al. Mini review: form and function in the human interphasechromosome.// Cytogenet Cell Genet. 2000. 90(1-2): 13-21.

64. Cockerill P.N., Garrard W.T. Chromosomal loop anchorage sites appear to be evolutionarilyconserved//FEBS Lett. 1986a. V. 204. P. 5-7.

65. Cockerill P.N., Garrard W.T. Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglobulingene occurs next to the enhancer in a region containing topoisomerase II sites // Cell. 19866. V. 44. P. 273-282.

66. Cockerill P.N., Yuen M.-H., Garrard W.T. The enhancer of the immunoglobulin heavy chainlocus is flanked by presumptive chromosomal loop anchorage elements // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 5394-5397.

67. Comings D. E., Okada T. A. 1976. Nuclear proteins. Ш. The fibrillar nature of nuclearmatrix // Exper. Cell Res., 103 : 341-360.

68. Comings D. E. Mammalian chromosome structure. // Chromosomes Today, 1977, vol. 6, p.19.26.

69. Comings D. E. Mechanism of chromosome banding and implication for chromosomestructure. //Ann. Rev. Genet., 1978, vol. 12, p. 25-46.

70. Comings, D. E. Arrangement of chromatin in the nucleus.// Hum Genet 1980. 53(2): 131143.

71. Cook P.R, Brazell I.A. Supercoils in human DNA. // J. Cell Sci. 1975. Vol.19. P. 261-279.

72. Cook P. A general method for isolating intact nuclear DNA // EMBO J. 1984. V. 3. P. 18371842.

73. Cook P.R. A chromomeric model for nuclear and chromosome structure. // J. Cell Sci. 1995.1. Vol. 108. P. 2927-2935.

74. Cremer, Т., A. Kurz, et al. Role of chromosome territories in the functional compartmentalization of the cell nucleus.// Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1993. 58: 777-92.

75. Cremer, M., J. von Hase, et al. Non-random radial higher-order chromatin arrangements innuclei of diploid human cells.// Chromosome Res 2001. 9(7): 541-67.

76. Croft JA, Bridger JM, Boyle S, Perry P, Teague P, Bickmore WA. Differences in thelocalization and morphology of chromosomes in the human nucleus.// J Cell Biol 1999. 145:1119-1131.

77. Cummings.D. J., Kotasek W. E. Three-dimensional structure of macronuclei from Paramecium determined by scanning electron Microscopy. // J. Protozool. 1978. 25(3). P. 334-337.

78. Dallai R., Luporini P., Miceli C. Macronuclear inclusions in the ciliated protozoon Euplotes

79. Trans.Amer.Microsc.Soc. 1985. V. 104. P.64-69.

80. Dietzel, S., R. Eils, K. Satzler, H. Bornfleth, A. Jauch, C. Cremer and T. Cremer. Evidenceagainst a looped structure of the inactive human X-chromosome territory.// Exp Cell Res 1998. 240(2): 187-196.

81. Dietzel, S., K. Schiebel, et al. The 3D positioning of ANT2 and ANT3 genes within female

82. X chromosome territories correlates with gene activity.// Exp Cell Res. 1999. 252(2): 36375.

83. Earnshaw W.C., Halligan В., Cooke C.A., Heck M.M.S., Liu L.F. Topoisomerase П is astructural component of mitotic chromosome scaffold. // J. Cell Biol. 1985. Vol. 100. P. 1706-1715.

84. Egelhaaf A. Cytologisch-entwicklungs-physiologische Untersuchungen zur Konjugation von

85. Paramecium bursaria.ll Arch. Protistenk., 1955, Bd. 100, S. 447-514.

86. Eckert WA, Franke WW, Scheer U. Nucleocytoplasmic translocation of RNA in Tetrahymena pyriformis and its inhibition by actinomycin D and cycloheximide. Exp Cell Res. 1975 Aug;94(l):31-46.

87. Ehret C.F., Powers E.l. Macronucleus and nucleolar development in Paramecium bursaria. И

88. Exp. Sell Res. 1955. V. 9. P.241-257.

89. Ferreira, J., G. Paolella, et al. Spatial organization of large-scale chromatin domains in thenucleus: a magnified view of single chromosome territories.// J Cell Biol. 1997. 139(7): 1597-610.

90. Gasser SM, Laemmli UK. Cohabitation of scaffold binding regions with upstream/enhancerelements of three developmentally regulated genes of D. melanogaster. Cell. 1986 Aug 15;46(4):521-30.

91. Gasser SM, Laemmli UK. The organisation of chromatin loops: characterization of a scaffoldattachment site. EMBO J. 1986 Mar;5(3):511-518.

92. Gasser SM, Laroche T, Falquet J, Boy de la Tour E, Laemmli UK. Metaphase chromosomestructure. Involvement of topoisomerase П. J Mol Biol. 1986 Apr 20; 188(4):613-29.

93. Gasser S.M., Laemmli U.K. A glimpse at chromosomal order// Trends in Genetics. 1987.1. V. 3.P. 16-22.

94. Gasser S.M., Amati B.B., Cardenas M.E., Hofman J.F.-X. Studies on scaffold attachmentsites and their relation to genome functions // Int. Rev. Cytology. 1989. V. 119. P. 57-96.

95. Gerace L., Burke B. Functional organization of the nuclear envelope // Annu. Rev. Cell Biol.1988. V. 4. P. 335-374.

96. Ghosh S, Paweletz N. Nucleolar organization as revealed in cell spreads.// Cell Biol Int.1996 Jul;20(7):465-70.

97. Gonzalez-Melendi, P., A. Beven, K. Boudonck, R. Abranches, B. Wells, L. Dolan and P.

98. Shaw. The nucleus: a highly organized but dynamic structure.// J Microsc 2000. 198(Pt 3): 199-207.

99. Gorovsky M. Genome organization and reorganization in Tetrahymena // Ann.Rev.Genet.1980. V.14. P.203-239.

100. Grunstein M. Histone function in ranscription // Annu. Rev. Cell Biol. 1990. V. 6. P. 643678.

101. Hagstrom KA, Holmes VF, Cozzarelli NR, Meyer BJ. C. elegans condensin promotes mitoticchromosome architecture, centromere organization, and sister chromatid segregation during mitosis and meiosis.// Genes Dev. 2002 Mar 15;16(6):729-42.

102. Hao S., Jiao M., Huang B. Chromosome organization revealed upon the decondensation oftelophase chromosomes mAllium.// Chromosoma. 1990. Vol. 99. P. 371-378.

103. Hao, S., M. Jiao, J. Zhao, M. Xing and B. Huang . Reorganization and condensation of chromatin in mitotic prophase nuclei of Allium сера.// Chromosoma 1994. 103(6): 432440.

104. Hernandez-Verdun D. The nucleolus today. J Cell Sci. 1991 Jul;99 (Pt 3):465-71.

105. Hirano Т., Mitchison T.J. A heterodimeric coiled-coil protein required for mitotic chromosome condensation in vitro // Cell. 1994. V. 79. P. 449-458.

106. Horowitz R.A., Agard D.A., Sedat J.W., Woodcock C.L. The three-dimensional architecture of chromatin in situ: electron tomography reveals fibers composed of a continuously variable zig-zag nucleosomal ribbon // J. Cell Biol. 1994. V. 125. P. 1-10.

107. Hozak, P., O. Zatsepina, et al. An electron microscopic study of nucleolus-organizing regions at some stages of the cell cycle (GO period, G2 period, mitosis).// Biol Cell. 1986. 57(3): 197-205.

108. Hozak, P., О. V. Zatsepina, et al. In situ separation of nucleolar components by hypotonic treatment of cells.//Biol Cell. 1990. 68(2): 167-70.

109. Hozak, P., G. Geraud, et al. Revealing nucleolar architecture by low ionic strength treatment.//Exp Cell Res. 1992. 203(1): 128-33.

110. Hozak, P., A. B. Hassan, et al. 1993. Visualization of replication factories attached to nucleoskeleton. //Cell 73(2): 361-73.

111. Hufschmid J.-D. Etude de l'appareil nucleaire du Cilie heterotriche Climacostomum virens // Rev.Suisse Zool. 1983. V.90. P.817-828.

112. Icardo, J. M., J. L. Ojeda, et al. (2002). "Cleared extrachromosomal domain (CED): a nuclear domain enriched in nuclear matrix filaments is a common structure in sturgeon podocytes." Histochem Cell Biol 118(5): 389-97.

113. Inaba, F. & Sotokawa, Y. (1968). Electron microscopic observations on macronuclear division in Blepharisma toardsi. J. Protozool. 15 (suppl. 28, no. 100)

114. Iwano, M., K. Fukui, S. Takaichi and A. Isogai. Globular and fibrous structure in barley chromosomes revealed by high-resolution scanning electron microscopy.// Chromosome Res 1997. 5(5): 341-349.

115. Izaurralde E., Mirkovitch J., Laemmli U.K. Interaction of DNA with nuclear scaffolds in vitro // J. Mol. Biol. 1988. V. 200. P. 111-125.

116. Jackson D.A., Cook P.R. Transcription occur at a nucleoskeleton // EMBO J. 1985. V. 4. P. 919-925.

117. Jenuwein T, Allis CD. Translating the histone code.// Science. 2001 Aug 10;293(5532):1074-80.

118. Jimenez-Garcia LF, Segura-Valdez ML, Ochs RL, Echeverria OM, Vazquez-Nin GH, Busch H. Electron microscopic localization of ribosomal DNA in rat liver nucleoli by nonisotopic in situ hybridization.//Exp Cell Res. 1993 Aug;207(2):220-5.

119. Jonsson F, Postberg J, Schaffitzel C, Lipps HJ. Organization of the macronuclear gene-sized pieces of stichotrichous ciliates into a higher order structure via telomere-matrix interactions.// Chromosome Res. 2002;10(6):445-53.

120. Jontes, J. D. and R. A. Milligan. Brush border myosin-I structure and ADP-dependent conformational changes revealed by cryoelectron microscopy and image analysis.// J Cell Biol. 1997. 139(3): 683-93.

121. Jordan EG. Nucleolar nomenclature. J Cell Sci. 1984 Apr;67:217-20.

122. Jordan EG. Interpreting nucleolar structure: where are the transcribing genes? // J Cell Sci. 1991 Apr;98 (Pt 4):437-42.

123. Junera, H. R., C. Masson, G. Geraud and D. Hernandez-Verdun . The three-dimensional organization of ribosomal genes and the architecture of the nucleoli vary with Gl, S and G2 phases.// J Cell Sci 1995. 108(Pt 11): 3427-3441.

124. Jurand, A., G. H. Beale and M. R. Young . Studies on the Macronucleus of Paramecium Aurelia. Ii. Development of Macronuclear Anlagen.// J Protozool 1964. II: 491-497.

125. Jurand A., Selman G. G. The anatomy of Paramecium aurelia. II Mammalian and st. Martins Press. 1969. London.

126. Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Mirzabekov A.D. // Cell. 1984. V.36. P.423-431.

127. Karadzhan BP, Raikov IB 1977. Fine structure of the nuclear apparatus of Didinium nasutum (Ciliophora, Gymnostata) in interphase and during binary fussion.// Protistologica 13: 15-29

128. Karajan B.P., Popenko V.I., Raikov I.B. 1995. Organization of transcriptionally inactive chromatin of interphase macronucleus of the ciliate Didinium nasutum. Acta Protozool. 34:135-141.

129. Karadzhan B.P., Raikov I.B. Fine structure of the nuclear apparatus of Didinium nasutum in interphase and during binary fission. //Protistologica 1997. Т. XII fasc. 1. p. 15-29.

130. Kawakami H. Ultrastructural study of an endosymbiotic alga and its host ciliate Stenter niger H J.Protozool. 1984. V.31.P.247-253.

131. Kimball R.F. The structure of the macronucleus of Paramecium aurelia. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1953. V. 39. P. 345-347.

132. Klein, J. L., J. G. Hoff, et al. A quantitative evaluation of the three dimensional reconstruction of patients' coronary arteries.// Int J Card Imaging. 1998. 14(2): 75-87.

133. Kosak, S. T. and M. Groudine. The undiscovered country: chromosome territories and the organization of transcription.// Dev Cell. 2002. 2(6): 690-2.

134. Kovaleva V.G., Raikov I.B. 1988. Peculiarities of the ultrastructure of paradiploid macronuclei during conjugation in the lower ciliate Tracheloraphis totevi. 1988 : 305-315.

135. Krawczynska, W., J. Rowinski and A. Przelecka. Morphometric analysis of macronuclei and macronuclear fragments in autogamous cultures of Paramecium aurelia.// Acta Histochem 1978. 63(2): 153-161.

136. Krawczynska, W., J. Localization of Ribonucleoproteins in the Macronucleus of Paramecium aurelia. II Acta Protozoologica 1980. V. 19. P. 253-260.

137. Laemmli U.K., Cheng S.M., Adolph K.W., Paulson JR., Brown J.A., Baumbach W.R. Metaphase chromosome structure: the role of nonhistone proteins.// Cold Spring Harb.Symp. Quant.Biol. 1978,42:351-360

138. Laemmli U.K., Kas E., Poljak L., Adachi Y. Scaffold-associated regions: cis-acting determinants of chromatin structural loops and functional domains II Current Opinion Genet, and Develop. 1992. V. 2. P. 275-285.

139. Lafarga M, Berciano MT, Garcia-Segura LM, Andres MA, Carmo-Fonseca M. Acute osmotic/stress stimuli induce a transient decrease of transcriptional activity in the neurosecretory neurons of supraoptic nuclei. JNeurocytol. 1998 Apr;27(4):205-17.

140. Lamond, A. I. and W. C. Earnshaw. Structure and function in the nucleus.// Science 1998. 280(5363): 547-553.

141. Laroche T, Martin SG, Tsai-PJugfelder M, Gasser SM The dynamics of yeast telomeres and silencing proteins through the cell cycle.//J Struct Biol. 2000 129: 159-174.

142. Leick V. Formation of subribosomal particles in the macronuclei of Tetrahymena pyriformis. Eur J Biochem. 1969 Mar;8(2):221-8.

143. Leick V. Effect of actinomycin D and DL-p-fluorophenylalanine on ribosome formation in Tetrahymena pyriformis. Eur J Biochem. 1969 Mar;8(2):215-20.

144. Leipe D.D. and Hausmann K. The nuclear apparatus of the ditransversal ciliate Homalozoon vermiculare (Ciliophora, Rhabdophora) during interphase and division. I. The macronucleus // J.Protozool. 1992. V.39 P.27-39.

145. Lima-de-Faria A 1975. The relation between chromomeres replicons, operons, transcription units, genes, viruses and palindromes. //Hereditas, 81 249284.

146. Lin M. and Prescott D.M. Fine structure of the macronuclei and micronuclei in five hypotrichs//Arch. Protistenkd. 1986. V.131. P.33-43.

147. Luderus M.E.E., de Graaf A., Mattia E., den Blaauwen J.L., Grande M.A., de Jong L., van Driel R. Binding of matrix attachment regions to lamin B1 // Cell. 1992. V. 70. P. 949959.

148. Mahy, N. L., P. E. Perry, et al. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.// J Cell Biol 2002. 157(4): 579-89.

149. Manuelidis L., Borden J. // Chromosoma. 1988. V. 96. P. 397-411.

150. Manuelidis L., A view of interphase chromosomes // Science. 1990. V. 250. P. 1533-1540.

151. Marsden M. P. F., Laemmli U. K. Metaphase chromosome structure: evidence for a radial loop model. //Cell. 1979. V. 17. P. 849-858.

152. Meyer K.N., Kjeldsen E., Straub Т., Knudsen B.R., Hickson I.D., Kikuchi A., Kreipe H., Boege F. Cell cycle-coupled relocation of types I and П topoisomerases and modulation of catalytic enzyme activities. // J. Cell Biol. 1997. Vol. 136. P. 775-788.

153. Mirkovitch J, Mirault ME, Laemmli UK. Organization of the higher-order chromatin loop: specific DNA attachment sites on nuclear scaffold. Cell. 1984 Nov;39(l):223-32.

154. Mironov, A. A., R. S. Polishchuk, et al. Visualizing membrane traffic in vivo by combined video fluorescence and 3D electron microscopy.// Trends Cell Biol. 2000. 10(8): 349-53.

155. Misteli, T. The concept of self-organization in cellular architecture.// J Cell Biol 2001. 155(2): 181-185.

156. Monneron A, Bernhard W. Fine structural organization of the interphase nucleus in some mammalian cells.// J Ultrastruct Res. 1969 May;27(3):266-88.

157. Mpoke S., Wolfe J. DNA digestion and chromatin condensation during nuclear death in Tetrahymena // Exp.Cell Res. 1996. V.225. P.357-365.

158. Murti KG, Prescott DM. Topological organization of DNA molecules in the macronucleus ofhypotrichous ciliated protozoa.// Chromosome Res. 2002; 10(2): 165-73.

159. Nanney D.L., Rudzinska M. Protozoa, in Brachet J., Mirsky A.E., eds.,// The Cell. Academic Press 1960. New York. V. 4. P. 109-150.

160. Nilsson, J. R. and V. Leick. Nucleolar organization and ribosome formation in Tetrahymena pyriformis GL.// Exp Cell Res. 1970. 60(3): 361-72.

161. Nilsson Ж. Reversible inhibition of RNA synthesis in Tetrahymena pyriforms GL by dimethyl sulphoxide: an electron microscope autoradiographic study. Trans Am Microsc Soc. 1976 Jul;95(3):403-14.

162. Nilsson JR. Effects of dimethyl sulfoxide on Tetrahymena pyriformis GL. Fine structural changes and their reversibility. JProtozool. 1977 May;24(2):275-83.

163. Okada, T. A. and D. E. Comings. Higher order structure of chromosomes.// Chromosoma 1979. 72(1): 1-14.

164. Okada, T. A. The structure of chromosome; is the scaffold an artifact?.// Tanpakushitsu Kakusan Koso 1985. 30(2): 81-102.

165. Olins A.L., Olins D.E. Identification of 10 nm non-chromatin filaments of Euplotes eurystomus // Chromosoma. 1990. V.99.P.205-211.

166. Parada, L. and T. Misteli. Chromosome positioning in the interphase nucleus.// Trends Cell Biol. 2002. 12(9): 425.

167. Park, P. C. and U. De Boni. A specific conformation of the territory of chromosome 17 locates ERBB-2 sequences to a DNase-hypersensitive domain at the nuclear periphery.// Chromosoma. 1998. 107(2): 87-95.

168. Paulson J.R., Laemmli U.K. The structure of histone-depleted metaphase chromosomes // Cell. 1977. V. 12. P. 817-828.

169. Pederson, D. S., K. Shupe, et al. Changes in chromatin structure accompany modulation of the rate of transcription of 5S ribosomal genes in Tetrahymena.// Nucleic Acids Res 1984. 12(22): 8489-507.

170. Pederson D.S., Thomas F., Simpson R.T. Chromatin structure and gene transcription // Ann. Rev. Cell Biol. 1986. V.2. P.l 17-147.

171. Pfitzner W. Uber den feineren Bau der bei der Zellteilung auftretenden fadenformingen Differenzierungen des Zellkerns. // Morphol. Jahrb. 1881. 7. 289-311

172. Phan H.L., Forney J., Blackburn E.H. Analysis of Paramecium macronuclear DNA using pulsed gel electrophoresis//J.Protozool. 1989. V.36. C.402-408.

173. Phi-Van L.,Stratling W.H. Association of DNA with nuclear matrix // Prog. Mol. Subcell. Biol. 1990. V. II P. 1-11.

174. Phi-Van L., Stratling W.H. The matrix attachment regions of the chi cken lysozyme gene co-map with the boundaries of the chromatin domain // EMBO J. 1988. V. 7. P. 655-664.

175. Pienta K.J., Coffey D.S. A structural analysis of the role of the nuclear matrix and DNA loops in the organization of the nucleus and chromosome // J.Cell. Sci. Suppll. 1984. V.l. P. 123-135.

176. Ploton D, Bendayan M, Adnet JJ. Ultrastructural localization of Ag-NOR proteins and nucleic acids in reticulated nucleoli. Biol Cell. 1983;49(l):29-34.

177. Poljanski Yu. I. Geschlechtsprozesse bei Bursaria truncatella O.F.M. // Arch.Protistenkd. 1934. V.81. P.420-546.

178. Popenko V.I., Cherny N.E., Ivanova J.L., Yakovleva M.G. Ultrastructure of macronucleus in the resting cysts of the ciliate Bursaria truncatella //Europ. J. Protistol. 1998. V.34. P. 1828.

179. Popenko VI, Novikova EG, Churikov NA, et al. DNA size and chromatin structural organization in the macronucleus of a ciliate Bursaria truncatella. //Mol Biol. 1998. 32 (2): 285-292.

180. Prescott, D. M. The DNA of ciliated protozoa.//Microbiol Rev 1994. 58(2): 233-267.

181. Prior CP, Cantor CR, Johnson EM, Littau VC, Allfrey VG. Reversible changes in nucleosome structure and histone H3 accessibility in transcriptionally active and inactive states of rDNA chromatin.//Cell. 1983 Oct;34(3): 1033-42.

182. Raikov, I. B. 1982 The Protozoan Nucleus: Morphology and Evolution. // Springer-Verlag, Vienna and New York.

183. Raikov, I.B. 1989. Nuclear Genome of the Protozoa. // In: Patterson, D,J, & Corliss, J.O. eds, Progress in Protistology 3, 21-86.

184. Raikov, I.B., Karadzhan, B.P., КаигД., Mignot,J.P., 1989, Nuclear fine structure at interphase and during encystment in two forms of the testacean Arcella vulgaris: //European Journal of Protistology, v. 24, pp. 369-380.

185. Raikov I.B. Structure and genetic organization of the polyploid macronucleus of ciliates: a comparative review // Acta Protozool. 1995. T.34. C.151-171

186. Razin S.V., Kekelidze M.G., Lukanidin E.M., Scherrer K, Georgiev G.P. Replication origins are attached to the nuclear skeleton. // Nucl. Acids Res. 1986. Vol. 14. P. 81898207.

187. Rieder N. Electronenoptische untersuchungen an Didinium nasutum O.F. Muller (Ciliata, Gymnostomata) in interphase und Teilung.// Forma et Functio 1971. 4. 46-86.

188. Ruthmann A. and Heckmann K. Rormwechsel und Struktur des Makronukleus von Bursaria truncatella //Arch.Protistenkd. 1961. V.105. P.313-340.

189. Sabaneeva E. Extrachromosomal Nukleolar Apparatus in the Macronucleus of the Ciliate Paramecium putrinum : LM, ME and Confocal Microscopy Studies // Arch. Protistenkd. 1997. V 148. P. 365-373.

190. Sadoni, N., S. Langer, et al. Nuclear organization of mammalian genomes. Polar chromosome territories build up functionally distinct higher order compartments.// J Cell Biol. 1999. 146(6): 1211-26.

191. Sadoni, N., K. F. Sullivan, et al. Large-scale chromatin fibers of living cells display a discontinuous functional organization.// Chromosoma. 2001. 110(1): 39-51.

192. Saitoh Y., Laemmli U.K. Metaphase chromosome structure: bands arise from a differential folding path of the highly AT-rich scaffold // Cell. 1994. V.76. P.609-622.

193. Samuel C., Mackie J., Sommerville J. // Chromosoma. 1981. V. 83. P. 481-492.

194. Sandararaman V., Cummings D.J. Morfological changes in aging cell lines of Paramecium aurelia. Macronuclear alterations. //Mech. Ageing Dev. V. 5. P. 325-338.

195. Satir B, Dirksen ER. Nucleolar aging in Tetrahymena during the cultural growth cycle. J Cell Biol. 1971 Jan;48(l): 143-54.

196. Scherthan, H., R. Eils, et al. Aspects of three-dimensional chromosome reorganization during the onset of human male meiotic prophase.// J Cell Sci. 1998. 11 l(Pt 16): 2337-51.

197. Schwartz V. Struktur und Entwicklung des Makronucleus von Paramecium bursaria. И Arch. Protistenk. 1978. V. 120. P. 255-277.

198. Seshachar B. R. Observation on the fine structure of the nuclear apparatus of Blepharisma intermedium.!I JProtozool., 1964, v. 11, p. 402-409.

199. Sonneborn T.M. Electron mycrographs of ultra thin section of the nuclei of Paramecium aurelia. // Microb. Genet. Bull. V. 7. P. 24.

200. Sonnenbichler J. Nucleoprotein complexes: possible subunits of chromosomes. // Hoppe-Seyler's Zeitschrift fur Physiologische Chemie. 1969a. Vol. 350. P. 761-766.

201. Sonnenbichler J. Substructures of chromosomes. //Nature. 1969b. Vol. 223. P. 205-206.

202. Sparvoli E., Oay H., Kaufmann B. P. 1965. Number and pattern of association of Tradescantia. // Chromosoma, 16 : 415435.

203. Spector, D. L. Macromolecular domains within the cell nucleus.// Annu Rev Cell 1993. Biol 9: 265-315.

204. Spector, D. L. Nuclear organization of pre-mRNA processing.// Curr Opin Cell Biol 1993. 5(3): 442-447.

205. Spector, D. L. Nuclear domains.//J Cell Sci 2001. 114(Pt 16): 2891-2893.

206. Sperry A.O., Blasquez V.C., Garrard W.T. Dysfunction of chromosomal loop attachment sites: illegitimate recombination linked to matrix asso-ciation regions and topoisomerase П // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1989. V. 86. P. 5497-5501.

207. Steffensen S, Coelho PA, Cobbe N, Vass S, Costa M, Hassan B, Prokopenko SN, Bellen H, Heck MM, Sunkel CE. A role for Drosophila SMC4 in the resolution of sister chromatids in mitosis.// Curr Biol. 2001 Mar 6;11(5):295-307.

208. Steger D.J., Workman J.L. Remodeling chromatin strustures for transcription: what happens to the histones? // BioEssays. 1996. V.18. P. 875-884

209. Stevenson, I. and F. P. Lloyd. Ultrastructure of nuclear division in Paramecium aurelia. П. Amitosis of the macronucleus.// Aust J Biol Sci 1971. 24(5): 977-987.

210. Swift H., Adams B.T., Larsen K. Electron microscope cytochemistry of nucleic acids in Drosofila salivary gland and Tetrachymena. // J. R Microsc. Soc. V. 83. P. 161-167.

211. Tanabe, H., F. A. Habermann, et al. Non-random radial arrangements of interphase chromosome territories: evolutionary considerations and functional implications.// Mutat Res. 2002. 504(1-2): 37-45.

212. Thiry, M., U. Scheer, et al. Localization of nucleolar chromatin by immunocytochemistry and in situ hybridization at the electron microscopic level.// Electron Microsc Rev. 1991. 4(1): 85-110.

213. Thuman-Commike, P. A. Single particle macromolecular structure determination via electron microscopy.// FEBS Lett. 2001. 505(2): 199-205.

214. Tikhonenko AS., Bespalova I.A., Martinkina L.P., Popenko V.I., Sergejeva G.I. Structural organization of macronuclear chromatin of the ciliate Bursaria truncatella in resting cysts and at excysting. //Eur. J. Cell Biol. 1984. Vol. 33 P. 37-42.

215. Turner BM, O'Neill LP. Histone acetylation in chromatin and chromosomes. //Semin Cell Biol. 1995 Aug;6(4):229-36. Review.

216. Vandelaer M, Thiry M, Goessens G. Ultrastructural distribution of DNA within the ring-shaped nucleolus of human resting T lymphocytes. Exp Cell Res. 1993 Apr;205(2):430-2.

217. Veidovsky F. Zum Problem der Vererbungstrager. // Prag., Bohmische Ges. Wissenschaften. 1912.

218. Verschure, P. J., I. van Der Kraan, et al. Spatial relationship between transcription sites and chromosome territories.//J Cell Biol. 1999. 147(1): 13-24.

219. Verschure, P. J., I. Van Der Kraan, et al. Large-scale chromatin organization and the localization of proteins involved in gene expression in human cells.// J Histochem Cytochem. 2002. 50(10): 1303-12.

220. Visser, A. E., R. Eils, et al. Spatial distributions of early and late replicating chromatin in interphase chromosome territories.// Exp Cell Res. 1998. 243(2): 398-407.

221. Visser, A. E. and J. A. Aten 1999. Chromosomes as well as chromosomal subdomains constitute distinct units in interphase nuclei.// J Cell Sci 112(Pt 19): 3353-60.

222. Visser, A. E,, F. Jaunin, S. Fakan and J. A. Aten High resolution analysis of interphase chromosome domains.// J Cell Sci. 2000. 113(Pt 14): 2585-2593.

223. Vivier E. Cycle nucleolaire en rapport aves lalimentation chez Paramecium caudatum.il C. r. Acad. sci. Paris, 1960a, 1250, p. 205-207.

224. Vivier E. Etude au microscope electronique des nucleoles dans le macronucleus de Paramecium caudatum.I I Progress in protozoology. Praque, Publ. House of CSAV, 1963b, p. 421.

225. Wachtler F, Mosgoller W, Schwarzacher HG. Electron microscopic in situ hybridization and autoradiography: localization and transcription of rDNA in human lymphocyte nucleoli.// Exp Cell Res. 1990 Apr; 187(2):346-8.

226. Weierich С, Brero A, Stein S, von Hase J, Cremer C, Cremer T, Solovei I. Three-dimensional arrangements of centromeres and telomeres in nuclei of human and murine lymphocytes. Chromosome Res. 2003;ll(5):485-502.

227. Widom J. Phisicochemical studies of the folding of the 100 A nucleosome filament into the 300 A filament. Ill Mol. Biol. 1986. Vol. 190. P. 411-424.

228. Wolfe J. Structural aspects of amitosis: a light and electron microscope study of the isolated macronuclei of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis // Chromosoma. 1967. V.23. P.59-79.

229. Zatsepina O.V., Polyakov V.Yu. and Chentsov Yu.S. Chromonema and chromomeres. Structural units of mitotic and interphase chromosomes //Chromosoma. 1983. V.88. P.91-97.

230. Zatsepina OV, Polyakov VY, Chentsov YS. Differential decondensation of mitotic chromosomes during hypotonic treatment of living cells as a possible cause of G-banding: an ultrastructural study.// Chromosoma. 1989 Aug;98(2): 109-116.

231. Zatsepina OV. The localization of DNA in the nucleoli of mammalian cells.// Tsitologiia. 1992;34(5):34-9.

232. Zatsepina, О. V., O. A. Dudnic, et al. Reassembly of functional nucleoli following in situ unraveling by low-ionic-strength treatment of cultured mammalian cells.// Exp Cell Res. 1997.233(1): 155-68.

233. Zelenin, M. G., A. F. Zakharov, et al. Reversible differential decondensation of unfixed Chinese hamster chromosomes induced by change in calcium ion concentration of the medium.// Chromosoma. 1982. 84(5): 729-36.

234. Zink D, Cremer T. Cell nucleus: chromosome dynamics in nuclei of living cells.// Curr Biol. 1998 Apr 23;8(9):R321-4.

235. Zink, D., H. Bornfleth, A. Visser, C. Cremer and T. Cremer. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.// Exp Cell Res 1999. 247(1): 176-188.

236. Zirbel R.M., Mathieu U.R., Kurz A., Cremer Т., Lichter P. Evidence for a nuclear compartment of transcription and splicing located at chromosome domain boundaries // Chromosome Res. 1993. V. 1. P. 92-106.