Цитогенетический анализ эффекта положения мозаичного типа и эффекта Дубинина у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Демакова, Ольга Викторовна

• Демакова, Ольга Викторовна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Демакова, Ольга Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1.

ЭФФЕКТ ПОЛОЖЕНИЯ ГЕНА У DROSOPHILA MELANOGASTER (Обзор литературы)

1.1. Цитогенетическая и молекулярная организация гетерохроматина

1.1.1. Основные свойства и организация гетерохроматиновых районов хромосом

1.1.2. Гетерохроматин в политенных хромосомах

1.1.3. Белки, входящие в состав гетерохроматина

1.2. Эффект положения мозаичного типа

1.2.1. Общая характеристика свойств. Генетическая инактивация при эффекте положения мозаичного типа

1.2.2. Конденсация хроматина при эффекте положения мозаичного типа

1.2.3. Время установления мозаичной инактивации в онтогенезе

1.2.4. Модификация эффекта положения мозаичного типа. Средовые, генетические и химические модификаторы

1.2.5. Генетические модификаторы и их продукты

1.2.5.1. Общая характеристика генов-модификаторов мозаичного типа

1.2.5.2. Гапло-супрессоры, трипло-энхансеры

1.2.5.3. Гапло-супрессоры

1.2.5.4. Супрессоры, не проявляющие дозовой зависимости

1.2.5.5. Гены-энхансеры эффекта положения мозаичного типа

1.2.6. Модели

1.2.6.1. Эффект положения мозаичного типа и изменение

состояния хроматина

1.2.6.2. Эффект положения мозаичного типа и представленность последовательностей ДНК в политенных и диплоидных клетках

1.2.6.3. Эффект положения мозаичного типа и структура хроматина

1.2.6.4. Эффект положения мозаичного типа и внутриядерная организация

1.2.6.5. Эффект положения мозаичного типа и регуляция гомейозисных генов

1.3. Транс-чувствительные эффекты

1.3.1. Трансвекция

1.3.2. zeste-white взаимодействие

1.3.3. Транс-чувствительные эффекты и ген zeste+

1.3.4. Ген zeste+ и гены Polycomb-Group

1.4. Особые случаи эффекта положения гена

1.4.1. Эффект положения гетерохроматиновых генов

1.4.2. Эффект положения гена brown+

1.4.3. Эффект положения гена cubitus interrupted

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Генетические линии дрозофил. Ведение их культур

2.2. Приготовление давленых препаратов слюнных желез

2.3. Получение личинок самцов генотипов ХО и XYY для цитологического анализа

2.4. Гибридизация in situ на политенных препаратах слюнных желез

2.4.1. Приготовление давленых препаратов слюнных желез

для гибридизации in situ

2.4.2. Процедура гибридизации in situ

2.4.3. Мечение тритием клонов ДНК

2.4.4. Использованные зонды ДНК

2.5. Непрямое иммунофлюоресцентное окрашивание политенных хромосом

2.5.1. Приготовление растворов

2.5.2. Приготовление давленых препаратов слюнных желез для иммуноокрашивания

2.5.2.1. С помощью моноклонального антитела С1А9 на белок НР1

2.5.2.2. С помощью моноклонального антитела Mab LA9 на белок Modulo

2.5.3. Приготовление давленых препаратов питающих клеток ооцитов для иммуноокрашивания

2.5.4. Обезвоживание и хранение препаратов

2.5.5. Процедура иммуноокрашивания политенных хромосом

2.5.6. Использованные антитела

2.6. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. ИММУНОЛОКАЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ НР-1 И MODULO НА ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМАХ

3.1. Результаты

3.1.1. Иммунолокализация белка НР1 на политенных хромосомах

3.1.1.1. Локализация белка НР1 на политенных хромосомах слюнных желез в линии, несущей дупликацию Dp(l;l)pn2b

3.1.1.2. Распределение белка НР1 на Х- хромосоме в клетках

слюнных желез

3.1.1.3. Особенности распределения белка НР1 на политенных хромосомах псевдопитающих клеток

3.1.2. Цитологический анализ особенностей распределения белка

Modulo на политенных хромосомах

3.1.2.1. Локализация белка Modulo на политенных хромосомах

слюнных желез

3.1.2.2. Анализ распределения белка Modulo на политенных хромосомах слюнных желез в зависимости от дозы гена modulo

3.1.2.3. Окрашивание политенных хромосом слюнных желез личинок генотипа Df(3R)A4-4 L8/Df(3R)A4-4 L8антителами на белок НР1

3.1.2.4. Локализация белка Modulo на политенных хромосомах псевдопитающих клеток

3.2. Обсуждение

3.2.1. Белки НР1 и Modulo как компоненты конденсированного хроматина75

3.2.2. Гетерохроматиновые мультибелковые комплексы

3.2.3. Особенности распределения белков НР1 и Modulo в эухроматиновых районах хромосом

3.2.4. Модель участия ядрышка в регуляции эффекта положения мозаичного типа

ГЛАВА 4.

АНАЛИЗ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ ЭФФЕКТА ДУБИНИНА. 84 4.1. Результаты

4.1.1. Локализация гена с/в норме и в транслокациях с помощью гибридизации in situ

4.1.2. Морфология хромосомы 4 в норме и в транслокациях Т(1;4)пт25в'21, T(2;4)as? и Т(3;4)А2

4.1.2.1. Особенности морфологии хромосомы 4 в норме

4.1.2.2. Морфология транслоцированного гомолога 4Т в транслокациях Т(3;4)А2, T(1;4)W"258-21 и T(2;4)ast

4.1.3. Генетический анализ жизнеспособности и фенотипа гетерозигот по транслокациям, вызывающим эффект Дубинина, и мутантным аллелям гена ci

4.1.4. Цитологический анализ частоты соматического спаривания гомологов

хромосомы 4 в ряде транслокаций, вызывающих эффект Дубинина

4.2. Обсуждение

4.2.1. Особенности морфологии района 101 в норме и в транслокациях

4.2.2. В основе эффекта Дубинина лежат особые аллелоспецифические отношения

4.2.3. Эффект Дубинина зависит от соматического спаривания транслоцированного и нормального гомологов хромосомы 4

4.2.4. Природа эффекта Дубинина

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Цитогенетический анализ эффекта положения мозаичного типа и эффекта Дубинина у Drosophila melanogaster»

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность. Одной из важнейших особенностей регуляции экспрессии генов эукариот является сложный процесс активации и репрессии больших доменов хромосом. Механизм такой регуляции связан с изменениями в конденсации хроматина на высших уровнях его упаковки и, по-видимому, носит универсальный характер. Так, данные последних лет позволяют предполагать общность молекулярных механизмов таких генетических явлений, как "молчание" генов у дрожжей, инактивация Х-хромосомы у млекопитающих, а также регуляция гомейозисных генов, транс-чувствительные эффекты и эффект положения мозаичного типа (ЭПМ) у дрозофилы.

Эффект положения отражает зависимость экспрессии гена от его положения на хромосоме. Наибольшее число работ посвящено ЭПМ, при котором перенос эухроматинового гена к прицентромерному гетерохроматину вследствие хромосомной перестройки приводит к инактивации этого гена в части клеток. Такая инактивация обусловлена распространением плотной упаковки гетерохроматинового материала на перенесенный эухроматиновый участок хромосомы. Большое число генов-модификаторов ЭПМ кодирует белки, так или иначе влияющие на ком-пактизацию хроматина.

Необходимым направлением исследования таких белков является анализ их распределения на политенных хромосомах. Гигантские политенные хромосомы двукрылых, имеющие характерный дисковый рисунок, удобны для локализациии белков хроматина in vivo методом непрямого иммуноокрашивания хромосом, благодаря возможности достаточно точно соотносить распределение белка с определенными морфологическими структурами хромосом и ядра в целом. Такой подход позволяет судить о предполагаемых функциях белка в клетке как в норме, так и при ЭПМ.

К настоящему времени антитела получены лишь на некоторые из продуктов генов-модификаторов ЭПМ, в том числе на белки НР1 и Modulo. Эти продукты супрессоров ЭПМ, генов Su(var)205 и modulo предположительно являются струк-

турными компонентами гетерохроматина. Однако прямые подтверждения их участия в компактизации при ЭПМ до сих пор не получены.

ЭПМ значительно снижен в питающих клетках ооцитов у мутанта otu (псевдопитающих клетках), для политенных хромосом которых характерно более деконденсированное состояние гетерохроматиновых районов по сравнению с клетками слюнных желез. Логично предположить, что особенности организации гетерохроматина в двух типах клеток могут быть связаны с различиями как в наборе гетерохроматиновых белков, так и в характере их распределения на политенных хромосомах.

Помимо неспецифической гетерохроматиновой инактивации генов, у дрозофилы описан и другой тип эффекта положения, так называемые трансчувствительные эффекты. В основе этих эффектов, как полагают, лежит зависимость экспрессии ряда генов от соматического спаривания гомологичных хромосом. Интерес многих исследователей вызывает эффект положения гена cubitus in-terruptus+ (ci+), или эффект Дубинина. Несмотря на многолетнее изучение этого феномена, до сих пор неясна его природа. Своеобразие эффекта Дубинина связано с тем, что одни его проявляения типичны для ЭПМ, а другие - для трансчувствительных эффектов.

Изучение этих двух типов эффекта положения находится, таким образом, на разных уровнях, что обусловило и разные подходы к их исследованию, примененные в данной работе. Если природа ЭПМ уже во многом ясна и установлена ее связь со специфическими белками хроматина, то феномен эффекта Дубинина изучен явно недостаточно для того, чтобы объяснить многие его особенности. Анализ цитогенетических проявлений эффекта Дубинина, на наш взгляд, мог бы оказаться продуктивным для понимания как природы самого эффекта, так и основы общности свойств разных типов эффекта положения.

Цель работы. Целью данной работы является выяснение закономерностей проявления эффекта Дубинина, которые могут пролить свет на его природу, а также анализ распределения на политенных хромосомах гетерохроматиновых белков НР1 и

Modulo в связи с их возможной ролью в механизме эффекта положения мозаичного типа и эффекта Дубинина.

В связи с этим поставлены следующие конкретные задачи.

1) Проанализировать особенности локализации белка НР1 на политенных хромосомах слюнных желез в линии с Dp( 1; 1 )рп2Ь, вызывающей эффект положения мозаичного типа.

2) Исследовать характер распределения белка НР1 на политенных хромосомах псевдопитающих клеток.

3) Изучить возможность зависимости распределения белка Modulo на политенных хромосомах от дозы гена modulo и типа клеток.

4) Выяснить, сопровождается ли эффект Дубинина видимыми изменениями в ком-пактизации района 1 OID-102В в транслоцированном гомологе хромосомы 4.

5) Изучить жизнеспособность и фенотип гетерозигот по мутациям гена сг и транслокациям, вызывающим эффект Дубинина.

6) Выяснить, зависит ли супрессия эффекта Дубинина в проксимальных районах хромосом от частоты соматического спаривания нормального и транслоциро-ванного гомологов хромосомы 4 и влияет ли доза генов Su(var)205 и modulo на эту частоту.

Научная новизна. Показано наличие гетерохроматинового белка НР1 в эухромати-новых участках хромосом, компактизованных вследствие ЭПМ. Таким образом, впервые получены прямые доказательства участия структурного компонента гете-рохроматина в ЭПМ в качестве белка - компактизатора. Методом иммунолокали-зации на политенных хромосомах слюнных желез установлено, что белок Modulo является общим для двух ядерных структур: ядрышка и хромосом. Впервые проведенная иммунолокализация белков НР1 и Modulo на политенных хромосомах псевдопитающих клеток позволила выявить тканеспецифические различия в распределении этих белков. Показана зависимость локализации Modulo в районах конденсированного хроматина от дозы гена modulo в геноме. На основании полученных данных предложена модель влияния ядрышка на ЭПМ, которая предполагает, что в основе известного влияния рДНК на ЭПМ лежат конкурирующие от-

ношения между ядрышком и прицентромерным гетерохроматином за общие белки. Modulo является первым кандидатом на участие в таком механизме.

Проведен анализ цитогенетических аспектов эффекта Дубинина. Показано, что этот случай эффекта положения не связан с видимыми изменениями в компак-тизации протяженного участка хромосомы 4, несущей транслокацию. Эффект обусловлен не инактивацией локуса ci, а особыми аллелоспецифическими отношениями. Впервые установлено, что супрессия эффекта Дубинина в проксимальных районах аутосом коррелирует с высокой частотой восстановления соматического спаривания нормального и транслоцированного гомологов хромосомы 4. Показано, что гетерохроматиновые белки, по крайней мере, НР1, могут играть роль в проявлении эффекта Дубинина, влияя на эту частоту. Полученные данные свидетельствуют о том, что эффект Дубинина относится к транс-чувствительным эффектам, но не к ЭПМ.

Практическая ценность. Предложена модель влияния ядрышка на проявление ЭПМ за счет конкуренции за общие белки. Модель может иметь существенное значение для дальнейших исследований роли продуктов генов-модификаторов ЭПМ, влияющих на компактизацию хроматина.

Высокая частота контактов прицентромерного гетерохроматина и гетерохроматиновых участков, перемещенных в эухроматин, обнаруженная в проксимальных районах хромосом при эффекте Дубинина, может иметь общее значение для эффектов положения других гетерохроматиновых генов.

Благодарности. Автор благодарен Е.С. Беляевой, под руководством которой была выполнена эта работа, И.Ф. Жимулеву - за ценные советы по ходу выполнения работы, Н.И. Мальцевой, Е.С. Беляевой и Г.Х. Умбетовой за участие в работе, Е.И. Волковой и Д.Е. Корякову - за помощь в компьютерной обработке результатов, K.D. Tartof - за любезно предоставленные клоны ДНК, S.C.R. Elgin и J. Pradel - за любезно предоставленные антитела.

Автор также благодарен сотрудникам лаборатории молекулярной цитогене-тики за поддержку и обсуждение результатов.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 187 ссылок. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 3 таблицы.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Цитологический анализ иммуноокрашенных препаратов Dp(l;l)pn2b проводился совместно с Е.С. Беляевой и Г.Х. Умбетовой. Приготовление препаратов псевдопитающих клеток и их цитологический анализ проводились совместно с Н.И. Мальцевой.

Апробация работы. Основные результаты этой работы были представлены в докладе на Второй международной конференции по гетерохроматину Drosophila 1995 г. (Гонолулу, США), на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (1996) и в стендовом сообщении на XII Всероссийском симпозиуме по структуре и функции клеточного ядра (Санкт-Петербург, Россия, 1996).

Список сокращений:

ЭП - эффект положения

ЭПМ - эффект положения мозаичного типа

ТЧЭ - транс-чувствительный эффект

ЭД - эффект Дубинина

ГХ - гетерохроматин

ПГХ - прицентромерный гетерохроматин

п.н. - пар нуклеотидов

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

,N ~ л

4 - нормальный гомолог хромосомы 4 4Т - транслоцированный гомолог хромосомы 4 mod - modulo Mod - Modulo

ГЛАВА 1. ЭФФЕКТ ПОЛОЖЕНИЯ ГЕНА У DROSOPHILA MELANOGASTER

(Обзор литературы)

Изменение локализации гена в эукариотическом геноме может оказывать сильное влияние на его экспрессию. Это явление, впервые описанное Стертеван-том у Drosophila, известно под названием эффекта положения гена (Sturtevant, 1925; Lewis, 1950). Исследование ЭП во многом обусловило современный уровень понимания молекулярной основы регуляции экспрессии генов, структуры хромосом и взаимосвязи между ними (Reuter, Spierer, 1992; Weiler, Wakimoto, 1995; Elgin, 1996). Хотя большинство работ в этой области было выполнено на Drosophila, показано, что феномен ЭП свойствен и другим организмам, включая млекопитающих (Wu, 1993, Eissenberg, Elgin, 1991). Известно несколько типов ЭП, которые различаются как особенностями проявления, так и механизмами, лежащими в их основе. При так называемом стабильном ЭП внутригенные перестройки или встройки транспозонов приводят к тому, что ген оказывается под влиянием чужеродных цис-регуляторных районов (O'Kane, Gehring, 1987). В целом, как отмечал Льюис (Lewis, 1950), стабильный ЭП малоотличим от внутри-генных мутаций. В плане изучения зависимости экспрессии генов от их положения в геноме и ядре гораздо интереснее другие два типа ЭП: эффект положения мозаичного типа и транс-чувствительные эффекты. Классический ЭПМ связан с инактивацией эухроматиновых генов при их переносе к ПГХ в результате хромосомных перестроек. Транс-чувствительные эффекты объединяют случаи изменения экспрессии генов в зависимости от конъюгации гомологичных хромосом. Обзор литературы посвящен анализу этих двух типов ЭП у Drosophila melanogaster.

1.1. Цитогенетическая и молекулярная организация гетерохроматина.

1.1.1. Основные свойства и организация гетерохроматиновых районов хромосом.

Определение ГХ основывается полностью на морфологических критериях:

Хайц ввел этот термин для обозначения тех участков хромосом, которые выглядели сильно окрашенными и сохраняли компактность структуры в течение всего клеточного цикла (цит. по: Прокофьева-Бельговская, 1986). Остальная часть хроматина представлена деконденсированным в интерфазе эухроматином. ГХ локализован в основном в прицентромерных и теломерных участках хромосом. В диплоидной клетке D. melanogaster он составляет 30-35% хроматина, включая всю Y-хромосому, 40% Х-хромосомы, по 25% хромосом 2 и 3 и более половины хромосомы 4 (Gatti, Pimpinelli, 1992). Характерными свойствами ГХ являются поздняя репликация, недопредставленность в политенных хромосомах, отсутствие мейоти-ческой рекомбинации, повышенная частота хромосомных перестроек и обеднен-ность генами (Жимулев, 1993).

ГХ районы насыщены разнообразными повторенными последовательностями ДНК (Weiler, Wakimoto, 1995). Основную его часть составляют сателлиты -многократно тандемно повторенные последовательности с единицей повторенности от 5 до 360 п.н. 70-80% ГХ диплоидных клеток представлено одиннадцатью сателлитами (Lohe et al, 1993). Сателлиты организованы в блоки и обнаружены в различных районах центромерного ГХ метафазных хромосом (Pimpinelli et al., 1995).

Другая фракция ДНК ГХ включает среднеповторенные последовательности (умеренные повторы), как диспергированные, так и тандемно повторенные. Эти последовательности представлены в основном семействами мобильных элементов (Weiler, Wakimoto, 1995). В отличие от одиночных мобильных элементов, обнаруживаемых в эухроматине, различные семейства ГХ мобильных элементов собраны в кластеры и проявляют поразительную консервативность локализации в природных популяциях D. melanogaster (Pimpinelli et al., 1995). Таким образом, средне-повторенные последовательности ДНК являются, по-видимому, достаточно стабильными структурными компонентами ГХ.

Часть умеренных повторов ГХ соответствуют функционирующим генам. Так, у D. melanogaster повторенные гены рибосомной РНК (рДНК) образуют два локуса bobbed, составляющих ядрышковые организаторы, один из которых находится в ГХ Х-хромосомы, а второй -в коротком плече Y-хромосомы (Ritossa, Spiegelman, 1965). Каждый ядрышковый организатор включает примерно 200 копий повтора, причем число единиц повтора играет определяющую роль для нормального функционирования генов рРНК ( Ritossa, Spiegelman, 1965; Ritossa, 1968). Помимо генов рРНК, умеренные повторы ПГХ участвуют в образовании сложных генетических систем взаимодействия с определенными эухроматиновыми генами: crystal-Stellate, abo-Abo и Segregation distortion (Zhimulev, 1997).

Лишь незначительную часть ГХ составляют уникальные последовательности ДНК, которые обычно соответствуют функционирующим генам.

Недавно было показано, что ГХ построен из различных блоков сложной ДНК и сатДНК (Zhang, Spradling, 1994; Le et al., 1995;). Похоже, что блоки сложной ДНК («острова») состоят из умеренных повторов, а между ними вкраплены уникальные последовательности или сателлиты.

1.1.2. Гетерохроматин в политенных хромосомах

В политенных хромосомах слюнных желез дрозофил ГХ районы конъюги-

руют друг с другом, образуя единый хромоцентр. Хайц различал в хромоцентре два типа ГХ: более сильно окрашенный и плотный а-ГХ, глыбки которого окружены диффузным и менее окрашенным (3-ГХ. [3-ГХ соединяет эухроматиновые плечи хромосом с хромоцентром, причем граница между ними довольно условна. Это связано как с нарушениями морфологии проксимальных дисков, так и с различиями в числе четко видимых дисков на эу-гетерохроматиновой границе в разных ядрах (Жимулев, 1993).

Методом гибридизации in situ было установлено, что р-ГХ в основном состоит из сателлитов и по сравнению с другими последовательностями значительно недореплицирован в политенных хромосомах (Gall et al., 1971). По мнению Траверс и Пардью, (3-ГХ может быть сформирован последовательностями, которые разбросаны по всему ГХ и реплицируются в достаточно высокой степени. Они

образуют петли и соединяются друг с другом, формируя основной материал хро-моцентра (Traverse, Pardue, 1989). Эти последовательности включают умеренные повторы и уникальные последовательности ГХ Х-хромосомы и аутосом. По крайней мере, часть р-ГХ последовательностей активно транскрибируется в ядрах кле-

Зтт

ток слюнных желез, о чем свидетельствуют данные по включению Н-уридина и выявлению РНК, транскрибируемой специфическими уникальными последовательностями (Weiles, Wakimoto, 1995). Функциональное значение различной представленности последовательностей, составляющих а- и Р-ГХ неизвестно, но, возможно, сложная блочная организация ПГХ важна для регуляции ГХ генов и механизмов, лежащих в основе ЭПМ в политенных тканях.

Как известно, политенные хромосомы формируются не только в клетках слюнных желез, но и в других типах клеток, что поднимает вопрос о возможной тканеспецифичности организации и свойств ПГХ. Одним из эффектов мутации otu является формирование политенных хромосом в питающих клетках ооцитов (King, 1981). Функция последних заключается в синтезе практически всех РНК и белков, необходимых для созревания яйца и последующего раннего эмбриогенеза (King, 1970). Если для эухроматиновых районов выявлена почти полная идентичность дискового рисунка хромосом обоих типов, то для ГХ районов обнаружены значительные различия (Mal'ceva, Zhimulev, 1993). В политенных районах псевдопи-тающих клеток ослаблены все типичные свойства ГХ, включая недорепликацию, что приводит к образованию блоков политенизирующегося материала. На основе результатов цитологического анализа прицентромерных районов в двух типах клеток была предложена модель динамичной организации ГХ, которая согласуется с современными представлениями о его сложной блочной структуре (Коряков и др., 1997). Модель подразумевает, что ГХ политенных хромосом состоит из цепи дифференцированно политенизированных блоков. Одни и те же районы политенизи-руются по-разному в разных тканях. Степень политениии зависит от функциональной нагрузки данного района в определенной ткани в определенный период развития.

1.1.3. Белки, входящие в состав гетерохроматина.

Сложность и своеобразие организации ГХ отражает и его белковый состав.

Для ГХ характерны модифицированные варианты белков, общих для обоих типов хроматина. Например, у D. virilis в нуклеосомах, содержащих сателлитную ДНК, гистон HI фосфорилирован (Billings et al., 1979). В состав нуклеосом в ГХ входит также убиквитированный вариант Н2А (uH2A) (Levinger, 1985). Другую группу составляют негистоновые белки, причем часть из них встречается и в эухромати-новых, и в ГХ районах, а часть специфична только в ГХ. Известны белки, локализация которых коррелирует с распределением ДНК в хромосомах, что предполагает их возможную роль в организации хроматина (Silver, Elgin, 1978). Используя поликлональные антитела на различные ядерные белки, выделенные из культуры клеток, было показано, что одни фракции интенсивно связываются с хромоцен-тром и конденсированными участками политенных хромосом (дисками), а другие -с хромоцентром и деконденсированными участками (пуфами и междисками) (Saumweber et al., 1980). Хромоцентр, который проявляет некоторую транскрипционную активность, демонстрирует и слабое связывание с РНК-полимеразой II (Jamrich et al., 1977). Активатор транскрипции GAGA-фактор недавно был выявлен в ГХ районах, где он связывается с сателлитами AAGAG и AAGAGAG (Raff et al., 1994).

Ряд белков преимущественно специфичен для ГХ. Часть таких белков связана с определенными последовательностями, например, сателлитами. Так, белок D1 локализован практически только в хромоцентре, причем in vitro Dl специфически связывается с сателлитной ДНК, обогащенной АТ-повторами (Levinger, 1985). Некоторые белки являются продуктами ГХ генов и необходимы, по-видимому, для их функционирования (Doshi et al., 1991). Особую группу ГХ белков составляют продукты генов- модификаторов ЭПМ. Полагают, что они могут участвовать в установлении и поддержании высших уровней упаковки нуклепроте-идного комплекса, определяя тем самым компактизованное состояние ГХ районов. Более подробная характеристика этих белков дана в разделах 1.2.5.2. и 1.2.5.3.

1.2. Эффект положения мозаичного типа.

1.2.1. Общая характеристика свойств. Генетическая инактивация при эффекте положения мозаичного типа.

Под классическим ЭПМ понимают мозаичную экспрессию эухроматинового гена, которая является результатом его переноса с ПГХ вследствие хромосомной перестройки. Наиболее удобен для демонстрации ЭПМ ген white+, поскольку мо-заичность хорошо видна, если проявление гена автономно (ген экспрессируется в данной клетке) и если имеется большое количество однотипных клеток (Lewis, 1950). При ЭПМ ген w+ инактивируется в одних клетках и остается активным в других. Само решение, будет или нет инактивирован ген в данной клетке, носит, по-видимому, стохастический характер. Однако затем инактивированное состояние гена стабильно поддерживается в ряду клеточных поколений за счет эпигенетических факторов (Spofford, 1976). В результате у мух можно наблюдать мозаичную окраску глаз: фасетки белого цвета, где w+ инактивирован, и нормальные красные фасетки.

Инактивирующее влияние ПГХ носит всеобщий характер: фактически любой эухроматиновый ген может подвергнуться инактивации, попав в соседство с ПГХ. Мутантный фенотип проявляется, в первую очередь, у гетерозигот R(g+)/g, где R - хромосомная перестройка, a g - ген, перенесенный к ПГХ (Spofford, 1976). Инактивация наблюдается в перестроенной хромосоме, то есть при ЭПМ нормальный аллель гена теряет доминантность (Muller, 1930). Характерным свойством ЭПМ является распространение инактивации от точки разрыва хромосомной перестройки вдоль по хромосоме. В транслокации T(1 ;4)wm258'18, вызывающей ЭП генов white+ и roughest+ (Demerec, Slizynska, 1937) оба гена экспрессируются одновременно в одних и тех же клетках (омматидиях), что позволило четко продемонстрировать линейный характер распространения инактивации. Было показано, что в одних клетках инактивации более дистального гена w+ всегда сопутствовала инактивация более проксимального гена rst+, в то время как в других клетках инактивирован был только ген rst+. Таким образом, гены, расположенные ближе к

точке разрыва, инактивируются чаще. По мере удаления от точки разрыва частота инактивации генов постепенно уменьшается.

Генетическая инактивация может распространяться на большие участки хромосом, что обычно отмечают для наиболее удаленного от точки разрыва перестройки гена. Очень редко удается проследить распространение инактивации в районе, где расположен ряд генов, хорошо охарактеризованных генетически. Так, транслокация T(l;2)dorvar7 переносит район 1А-2В7-8 к ПГХ и вызывает ЭПМ ряда генов, включая несколько локусов, ответственных за экдизоновую индукцию (Zhimulev et al., 1986, Belyaeva et al., 1987). Генетический анализ жизнеспособности и морфологии гетерозигот по T(l;2)dorvar7 и многочисленным мутациям этих генов позволил продемонстрировать ряд характерных особенностей ЭПМ. 1). ЭПМ связан с инактивацией всего локуса, а не отдельных его аллелей. 2). Спектр му-тантных проявлений у мозаиков значительно шире, чем просто у мутантных аллелей того или иного гена. Например, мозаики по гену Br-С (или ecs) имели до 20 различных морфологических аномалий. Некоторые летальные гены на фоне инак-тивированного в части клеток нормального аллеля вызывали морфологические нарушения у мозаиков. 3). Инактивация распространяется непрерывно (Demakova et al., 1988). До сих пор описан лишь один случай прерывистой инактивации генов: в In(3R)ry54 более дистальный ген pic+ проявлял мозаичность, а более проксимальный ген snk+ - нет. (Clark, Chovnik, 1986).

Уже на ранних этапах изучения ЭПМ пришло понимание одной из важнейших его черт: при инактивации изменяется только состояние гена. В многочисленных работах было показано, что обратные хромосомные перестройки, возвращающие ген в эухроматиновое окружение, реактивируют ген, часто полностью супрессируя ЭПМ (см. Zhimulev, 1997).

Считается общепризнанным, что мозаичность при ЭПМ связана с инактивацией гена на уровне транскрипции. При сравнении rasv-специфических полиА+ РНК-транскриптов, представленных в экстрактах нормальных и мутантных генотипов, было показано отсутствие фракции РНК, считанной с R(g+) хромосомы (Rushlow et al., 1984). При ЭПМ гена Sgs4 количество специфического транскрип-

та в транслокации T(1 ;4)wm258'21 оказалось уменьшенным вдвое (Kornberg, Kauff-man, 1986). Снижение уровня транскрипции РНК было показано и при ЭПМ гена brown+ (Henikoff, Dreesen, 1989).

1.2.2. Конденсация хроматина при эффекте положения мозаичного типа.

Генетическая инактивация при ЭПМ является отражением распространения

особой упаковки ГХ материала на соседний эухроматиновый участок. Это открытие, принципиально важное для понимания природы ЭПМ, было сделано, благодаря цитологическому анализу хромосомных перестроек в политенных хромосомах слюнных желез. В эухроматиновом участке, перенесенном в ПГХ, часто наблюдается нарушение рисунка дисков, в результате чего весь участок напоминает по структуре сетчатый, диффузный материал ß-ГХ (Прокофьева-Бельговская, 1986). Потеря дисками окрашиваемости, четкости и целостности, названная Прокофье-вой-Бельговской гетерохроматизацией, может распространяться на большие расстояния.

Неоднократно отмечали полную гетерохроматизацию того или иного района, которая приводила к полной неразличимости проксимальных дисков в материале хромоцентра (Hartmann-Goldstein, 1967, Reuter et al., 1982). Приобретение эухроматиновыми районами плотной компактной структуры, при формировании которой в компактное состояние вовлекаются все более удаленные диски, было названо компактизацией (Zhimulev et al., 1986). Компактизованный эухроматиновый район приобретает не только цитологическое сходство с ПГХ, но и такие типичные для ГХ свойства, как разломы, эктопические контакты и поздняя репликация (Belyaeva, Zhimulev, 1991).

Распространение компактизации и гетерохроматизации участка хромосомы коррелирует с распространением инактивации генов, локализованных в этом участке. Так, в зависимости от влияния модификаторов ЭПМ (см. раздел 1.2.4.), инактивация в Т( 1 ;2)dorvar? затрагивает минимально 7-8 или максимально 10-11 локусов в районе 2В Х-хромосомы. В первом случае наблюдается компактизация района 2В1-2 -2В7-8 в 28% ядер, а во втором - компактные блоки обнаруживают-

ся в 58% ядер и включают материал не только района 2В, но и 1Е-Б (Оетакоуа, Ве1уаеуа, 1988).

Однако вопрос о связи проявлений ЭП с цитологическими изменениями в политенных хромосомах однозначно можно решить только в такой системе, где в одной и той же ткани можно наблюдать и компактизацию, и экспрессию гена. Это удалось сделать, используя в качестве модели ЭП локус Вг-С, отвечающий за формирование ряда экдистероновых пуфов (Ве1уаеуа ег а1., 1981). Инактивация локу-са Вг-С приводит к отсутствию этих пуфов, что легко соотнести с теми или иными цитологическими нарушениями структуры района 2В. Жимулев с коллегами показал, что в случае образования плотных блоков экдистероновые пуфы не развиваются (2Ыти1е\' еЬ а1., 1986). Компактизация наблюдается в части клеток, причем варьирует и степень ее выраженности. Такая картина прекрасно коррелирует с представлением о непрерывности и линейном характере инактивации генов при ЭПМ. Тем неожиданнее было открытие другого типа компактизации, когда в перенесенном к ПГХ эухроматиновом участке обнаруживается не одна, а несколько зон компактизации, разделенных районами с нормальной морфологией. Сравнение нескольких хромосомных перестроек показало неслучайность распределения таких зон: некоторые районы имели наибольшую или наименьшую частоту компактизации во всех исследованных случаях (Ве1уаеуа, 71шгш1еу, 1991).

1.2.3. Время установления мозаичной инактивации в онтогенезе

До сих пор не существует единого мнения в вопросе о том, когда происходит инактивация гена, а также о возможностях его реактивации. Принято считать, что инактивация должна происходить на тех стадиях онтогенеза, на которых сре-довые или генетические модификаторы могут изменить фенотип имаго. Таким показателем считается температуро-чувствительный период: исходя из этого критерия, была показана особая важность для генетической инактивации гена при ЭПМ первых часов эмбриогенеза, то есть стадии бластодермы - 4-6 часов (НагПпапп-Сок^ещ, 1967) или 3 час (гЫггнДеу е1 а1., 1988). В то же время фенотип «соль-перец» связывают с инактивацией гена на куколочной стадии развития (8ро1Тогс1, 1976). В отличие от дискретных температуро-чувствительных периодов, данные по

влиянию дозы ГХ белка НР1 (продукта супрессора ЭПМ Su(var)205) подразумевают возможность модифицировать мозаичность в период от бластодермы до позднего личиночного возраста (Eissenberg, Hartnett, 1993). Сходные результаты были получены при совместном действии температуры и энхансеров ЭПМ (Spofford, 1976). Используя конструкцию с репортерным геном w+, Jly с коллегами показали, что инактивация устанавливается в эмбриогенезе и поддерживается как в соматических клетках, так и в клетках зародышевого пути. В дифференцированных тканях имаго трансген проявлял мозаичную экспрессию, в то время как на личиночной стадии, в имагинальных дисках, содержащих клетки-предшественники для взрослых структур, наблюдали почти полную инактивацию гена (Lu et al., 1996). По-видимому, окончательная картина мозаичного фенотипа у имаго может отражать не только наложение результатов инактивации в разные периоды развития, но и реактивацию генов.

1.2.4. Модификация эффекта положения мозаичного типа. Средовые, генетические и химические модификаторы.

Одной из характерных особенностей ЭПМ является его сильно выраженная чувствительность к различным факторам. Типичным средовым фактором, влияющим на мозаичность, является температура. Обычно понижение температуры до усиливает мозаичность при ЭПМ, а повышение до напротив, ослаб-

ляет (Spofford, 1976).

Значительно больший модифицирующий эффект вызывает изменение количества ГХ в ядре, например, за счет варьирования дозы Y-хромосомы (Lewis, 1950; Pizano, Dimitri, 1984). Чаще всего добавление в геном дополнительной Y-хромосомы ослабляет мозаичность эухроматиновых генов, а уменьшение числа Y-хромосом - усиливает ее (Lewis, 1950, Grell, 1958). Исключения так редки, что этот модифицирующий эффект обычно рассматривают как один из критериев, определяющих данный тип ЭП (Zhimulev, 1997). ГХ других хромосом обладает аналогичными модифицирующими свойствами, причем ГХ Х-хромосомы вызывает супрессирующий эффект, вполне сравнимый с эффектом Y- хромосомы (Spofford, 1976).

Интересны факты влияния родительских генотипов на мозаичность у потомства, или родительские эффекты. Проявление ЭПМ может быть различным в зависимости от родительского источника хромосомной перестройки. Чаще обнаруживается материнский эффект, который подразумевает более сильную мозаичность гена в случае получения перестройки через яйцеклетку (Hessler, 1961, Spof-ford, 1976). Эффект объясняют тем, что активность материнских генов, кодирующих структурные компоненты ГХ или модифицирующие их факторы, могла бы влиять на конденсацию хроматина у раннего эмбриона и, следовательно, на мозаичность. У ряда генов-модификаторов ЭПМ действительно был обнаружен материнский эффект (Reuter et al., 1990, James and Elgin, 1986, Krejci et al., 1989).

Усиление ЭПМ за счет отцовского источника перестройки встречается редко (Spofford, 1976). Например, при изучении родительского влияния на ЭПМ в транслокации T(l;2)dorva,? было показано, что при всех температурных условиях проявление мозаичности было значительно сильнее в случае отцовского источника перестройки (Demakova, Belyaeva, 1988). Отцовский эффект связывают с явлением импринтинга («отпечатывания»), молекулярный механизм которого в Drosophila малоизучен. В общем случае импринтинг подразумевает физическое изменение структуры хроматина (у млекопитающих, например, за счет метилирования ДНК), которое происходит в клетках зародышевого пути у отца. Такие изменения могут затрагивать один ген, участки и даже целые хромосомы и обусловливать функциональные различия отцовской и материнской копий в развивающемся эмбрионе (Singh, 1994).

Различные химические соединения, имеющие значение для тех или иных биологических процессов, могут влиять на проявление ЭПМ (Spofford, 1976; Жи-мулев, 1993). Важным результатом считают супрессию ЭПМ при обработке п-бутиратом, который ингибирует деацетилирование гистонов (Birren et al., 1978, Spofford, 1976). Исходя из того, что ацетилированные гистоны присутствуют преимущественно в активных районах хромосом, можно думать, что бутират через ингибирование деацетилаз обеспечивает накопление ацетилированных форм гистонов, что и супрессирует ЭПМ (Mottus et al., 1980). Не только n-бутират и пропио-

нат, модифицирующие гистоны, могут влиять на мозаичность, но и делеции гисто-новых генов также супрессируют ЭПМ (Moore et al., 1981).

1.2.5. Генетические модификаторы и их продукты.

1.2.5.1. Общая характеристика генов-модификаторов мозаичного типа.

Накопление данных о влиянии генетического фона на степень мозаичности

привело к пониманию того, что в геноме могут быть гены, модифицирующие ЭПМ. Интенсивное использование разных методов мутагенеза позволило получить сотни мутаций, усиливающих (энхансеры) или ослабляющих (супрессоры) ЭПМ. Эти E(var)- и 5м(у0г)-мутации затрагивают примерно 40 генов (Reuter, Wolf, 1981). Большинство модификаторов локализовано в хромосомах 2 и 3 (Spofford, 1976, Reuter et al., 1986). Общее число генов, модифицирующих ЭПМ, предположительно составляет 50-150 генов (Zhimulev, 1997).

Многие известные супрессоры ЭПМ являются рецессивными леталями с материнским или отцовским эффектами (Reuter et al., 1986, Reuter, Spierer, 1992). Согласно современным представлениям, мутации генов, которые кодируют структурные компоненты хроматина, а также регуляторные белки, контролирующие сборку хроматина и его конденсацию, должны влиять на ЭПМ. И, следовательно, Su(var)- и E(var)- гены, скорее всего, кодируют белки хроматина (Reuter, Wolf, 1981, James, Elgin, 1986, Reuter, Spierer, 1992). Супрессоры ЭПМ кодируют предположительно продукты, необходимые для образования и поддержания закрытой конформации хроматина, а энхансеры - наоборот, продукты, требующиеся для активного состояния хроматина. Кроме того, часть модификаторов ЭПМ могли бы кодировать белки, которые участвуют в процессах транскрипции и репликации.

Особый интерес представляют модификаторы, которые проявляют гапло-дозовую зависимость (Locke et al., 1988). Хроматин, по всей видимости, особенно чувствителен к дозе нормальных продуктов этих генов. Некоторые локусы в трех дозах проявляют эффект, противоположный тому, который они проявляли в одной дозе (Wustmann et al., 1989). Полагают, что именно такие модификаторы кодируют структурные компоненты ГХ или эухроматина (Locke et al., 1988). Существующие данные по генетическому и молекулярному анализу генов-модификаторов ЭПМ

согласуются с представлением о том, что их продукты участвуют в упаковке хроматина.

1.2.5.2. Гапло-супрессоры, трипло-энхансеры.

К настоящему моменту наиболее полно охарактеризован доминантный гап-

ло-супрессор / трипло-энхансер Su(var)205, кодирующий белок НР1. Известные мутации этого гена, расположенного в районе 29А хромосомы 2L, являются рецессивными деталями (Eissenberg et al., 1990). Локализация белка НР1 на политенных хромосомах слюнных желез позволяет предполагать, что он является структурным компонентом ГХ: белок преимущественно связан с ПГХ и хромосомой 4, а также с теломерными районами и несколькими минорными сайтами в эухроматине (James, Elgin, 1986, James et al., 1989). HP1 не способен связываться с ДНК, и его связывание с хроматином обусловлено белок-белковыми взаимодействиями. НР1 имеет два консервативных домена (Clark, Elgin, 1992), один из которых, хромодо-мен, гомологичен домену белка Polycomb. Хромодомен необходим для связывания репрессора гомейозисных генов белка Polycomb с хроматином. Что касается НР1, то его специфическое связывание с ГХ обусловлено двумя участками - хромодоме-ном и теневым хромодоменом. Важно отметить, что хромодомен нужен для функции инактивирования генов для обоих белков (Platero et al., 1995).

В раннем эмбриогенезе ГХ неразличим вплоть до 14 деления дробления (Kellum et al., 1995). Белок НР1 впервые обнаруживают на стадии 10 цикла. Максимально он представлен на стадии 14 цикла, и в это же время - максимально фосфорилирован (Eissenberg et al., 1994). Как оказалось, НР1 важен и для расхождения хромосом в митозе, так как при его недостатке у эмбрионов удлинняется профаза, нарушается морфология и процесс расхождения хромосом, что обусловлено, по всей видимости, нарушением конденсации митотических хромосом (Kellum, Albert, 1995). Анализ митотических хромосом показал, что НР1 не все время связан с конденсированным хроматином: в течение метафазы и анафазы значительная его часть распределена по митотическому веретену, а в телофазе он снова оказывается связан с хромосомами (Kellum et al., 1995). Гомологи белка были обнаружены у D. virilis, червеца, мыши и человека (цит. по Zhimulev, 1997).

К группе доминантных гапло-супрессоров / трипло-энхансеров относятся также гены Su(var)3-9 и Su(var)3-7. Молекулярный анализ гена Su(var)3-9 позволил определить транскрипт в 2.4 т.п.н., которому соответствует белок длиной 635 а.к. Как и продукты генов Su(var)205 и Polycomb, он содержит хромодомен. На С-конце белка выявлен также район, гомологичный продуктам генов Enhancer of zeste и trithorax, которые известны как антагонистические регуляторы гомейозис-ных генов (Tschiersh et al., 1994).

Важной особенностью продукта гена Su(var)3-7 является его способность связываться с ДНК. Семь доменов «цинковых пальцев» этого гена имеют специфическую организацию: они разделены большими промежутками и каждому из них предшествует триптофановый бокс (Cleard et al., 1995).

1.2.5.3. Гапло-супрессоры.

Ген modulo (mod), локализованный в районе 100F хромосомы 3R, также

относят к классу доминантных гапло-супрессоров. Наиболее активно ген экспрес-сируется на ранних стадиях эмбриогенеза, в меньшей степени - на стадии куколки и у имаго (Garzino et al., 1992). Продукт гена, белок Modulo (Mod), содержит домены связывания с ДНК и, по предварительным неопубликованным данным, обнаруживается в хромоцентре и множестве эухроматиновых районов (>100) политен-ных хромосом слюнных желез (Krejci, 1989, Garzino et al., 1992). Функция белка пока не известна. Учитывая характер экспрессии Mod в ходе эмбриогенеза, плейо-тропные эффекты у мутантов и особенности распределения белка на политенных хромосомах, было высказано предположение, что этот белок может играть координирующую роль в регуляции генов, необходимых для морфогенеза некоторых тканей (Graba et al., 1994).

Предполагают, что в процессах регуляции компактизации хроматина в интерфазном ядре может иметь большое значение фосфорилирование белков (Dombradi, Cohen, 1992). В связи с этим представляет интерес обнаружение су-прессирующих ЭПМ свойств у гапло-супрессора Su(var)3-6, кодирующего фосфа-тазу 1 типа (Baksa et al., 1993).

1.2.5.4. Супрессоры, не проявляющие дозовоп зависимости.

Среди супрессоров ЭПМ известны гены, которые не проявляют дозовой

зависимости. Два гена, Su(var)2-1 и Su(var)2-10, мутации которых оказались чувствительны к бутирату, приводят в гомозиготе к летальности и к стерильности самок. У мутанта Su(var)2-101 обнаружено гиперацетилирование гистона Н4 (Dorn et. al., 1986, Reuter et. al., 1986). Функциональное значение продуктов некоторых супрессоров ЭПМ для компактизации хроматина понять пока трудно. Так, ослабляют ЭПМ мутации гена mus-209, который кодирует гомолог фактора, входящего в репликативный комплекс, так называемый ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) (Henderson et al., 1994). Аналогичен эффект мутаций гена Su(z)2, кодирующего S-аденосульметионин синтетазу (Larson et al., 1996).

1.2.5.5. Гены-энхансеры эффекта положения мозаичного типа.

Класс энхансеров, описанных к настоящему моменту, значительно меньше,

чем класс супрессоров, что может, по мнению некоторых авторов, отражать истинное соотношение в геноме этих двух типов модификаторов ЭПМ (Zhimulev, 1997). Единственным известным гапло-энхансером / трипло-супрессором является ген E(var)3-93D, который кодирует белки, имеющие общий домен с транскрипционными факторами Tramtrack и BR-C (Dorn et al., 1993). Мутации этого гена чувствительны к бутирату и вызывают импринтинг-подобный эффект на Y-хромосому, что определяет их устойчивый отцовский эффект. На политенных хромосомах белок обнаружен в ПГХ и многочисленных сайтах эухроматина, в основном в междисках. В то же время белок выявлен и в некоторых районах интеркалярного ГХ, где локализованы гены В Х-С, ANTC и white. Мутации гена вызывают гомейо-зисные трансформации. В целом, предполагается, что продукт E(var)3-93D вовлечен в образование и/или поддержание открытой конформации хроматина.

Ген trithorax-like, гапло-энхансер ЭПМ, известен как активатор гомейозис-ных генов (Dorn et al., 1995, Farkas et al., 1994). Он кодирует транскрипционный фактор GAGA, который связывается с (GA)n богатыми сайтами промоторных участков ряда эухроматиновых генов, вызывая изменения структуры хроматина и расположения нуклеосом в промоторном участке. По-видимому, GAGA может взаи-

модействовать и с более отдаленными регуляторными участками (Strutt et al., 1997). Очень вероятно участие этого белка в определении и/или поддержании открытой конформации хроматина. В то же время GAGA фактор обнаружен в ГХ диплоидных клеток, где он связан с блоками сателлитов AAGAG, AAGAGAG (Raff et al., 1994). Пока неясно, имеет ли этот факт функциональное значение для формирования ГХ.

Энхансерами ЭПМ оказались мутации гена mod(mdg4), кодирующего белок, который является компонентом хроматинового инсулятора (Gerasimova et al., 1995). Нуль-аллели гена zeste вызывают рецессивный усиливающий эффект на мозаичность (Judd, 1995). Продукт этого гена, связывающийся с ДНК, является транскрипционным фактором и важен для ряда ТЧЭ (Tartof, Henikoff, 1991).

Таким образом, к настоящему времени охарактеризована лишь небольшая часть генов, влияющих на ЭПМ. Важными чертами генов-модификаторов можно считать: 1). дозовую зависимость, 2) плейотропность проявления у мутантов, 3) кодирование белков двух типов: структурных белков хроматина и белков, которые регулируют транскрипцию ряда генов, опосредованно влияющих на ЭПМ, 4) «перекрывание» функций ГХ белков и белков-регуляторов активности гомейозис-ных генов.

Несмотря на очевидную недостаточность информации о генах-модификаторах и функциях их продуктов, полученные данные, безусловно, пролили свет на эту проблему и внесли огромный вклад в разработку оригинальных моделей механизма ЭПМ.

1.2.6. Модели.

1.2.6.1. Эффект положения мозаичного типа и изменение состояния хроматина.

Анализ цитологических аспектов ЭПМ в политенных хромосомах привел к

пониманию того, что в основе репрессии генов при ЭПМ лежат компактизация эухроматина и инактивация транскрипции. Компактизованный участок хромосомы приобретает целый ряд свойств ПГХ. Модели ЭПМ должны, следовательно, объяснять с какими молекулярными структурами связано новое состояние эухроматина и каким образом оно может распространяться на большие расстояния.

1). Цукеркендль предложил модель «молекул-запирателей» (Zuckerkandl, 1974). Он постулировал наличие в ГХ особых макромолекул, которые компактизуют хроматин и присутствуют в ядре в ограниченном количестве. При ЭПМ эу-гетерохроматиновый разрыв делает возможным взаимодействие «запирателей» с эухроматином, переходящим вследствие этого в неактивное компактное состояние. Роль «запирателей» могут играть гистоны, ферменты, модифицирующие гистоны, и негистоновые белки. Баланс между ГХ и эухроматином в ядре определяется не только спецификой последовательностей ДНК, но и концентрацией этих белков. Концентрации белков зависят от конформационных изменений по закону действия масс, что, по-видимому, и объясняет влияние на ЭПМ количества ГХ в ядре.

2). «Пограничная» модель (Tartof et al., 1984) предполагает, что ГХ организован в домены, в пределах которых ДНК компактизована. Компактизация начинается с сайтов инициации, с которыми связываются структурные белки ГХ, образуя муль-тимерный комплекс. Распространение гетерохроматизации идет по принципу кооперативного связывания вплоть до границы домена, которую определяют термина-торные сайты. Степень распространения компактизации зависит от расположения этих сайтов. Изучение генетических модификаторов ЭПМ привело к тому, что «пограничная» модель была усилена представлением об эффекте действия масс. Если каждый ГХ белок присутствует в клетке в двух формах (как часть мульти-мерного комплекса и в свободном виде), то изменение концентрации каждого из этих белков, по закону действия масс, может влиять на степень сборки ГХ и распространение компактизации (Lock et al., 1988).

Имея много общего, эти две модели принципиально различаются в вопросе об организации ГХ. «Пограничная» модель постулирует существование особых сайтов инициации и терминации. Модель «запирателей» не накладывает таких ограничений, предполагая наличие множественных сайтов компактизации и опираясь, по сути, только на повторенную природу последовательностей ГХ.

«Пограничная» модель поставила заманчивую цель - выявить последовательности ГХ, ответственные за компактизацию. Изучение роли ближайшего ГХ в перестройках, вызывающих ЭПМ, не привело к окончательному решению этой

задачи. Так, анализ более 50 ревертантов, полученных из исходной инверсии In(l;l)wm4, показал, что сохранение некоторого количества «соседнего» ГХ достаточно для инактивации w+ ревертантов (Reuter et al., 1985). Другая серия ревертантов была получена на основе транслокации T(l;2)dorvar7 (Pokholkova et al., 1993). Методом Саузерн-блот гибридизации было установлено, что во всех линиях сохранен ГХ участок длиной в 17 т.п.н., примыкающий к точке разрыва. Тем не менее ревертанты сильно различались по степени проявления ЭПМ, что предполагает неспособность «соседнего» ГХ самостоятельно индуцировать мозаичность. Недавно проведенный анализ семи транслокаций, которые вызывали ЭПМ в трансгене w+ и различались только размером примыкающего к разрыву ГХ блока, показал, что размер ГХ блока не влияет на степень проявления мозаичности w+ (Howe et al., 1995). С одной стороны, эти различия можно объяснить либо влиянием разных для каждой транслокации сайтов инициации, либо разным расстоянием гена w+ от ближайшего сайта. С другой стороны, степень мозаичности может быть связана с различной стабильностью и типом конформационных структур высшего порядка, которые обусловлены, предположительно, различными повторенными последовательностями ДНК. Однако с позиций этих двух моделей остаются труднообъяснимыми две особенности ЭПМ: распространение компактизации на большие расстояния и прерывистая компактизация.

3). Разрешить эти трудности пытается «статистическая» модель (Баласов, Маку-нин, 1994), которая разделяет представления об образовании белками-компактизаторами мультимерных комплексов, распространении их за счет кооперативного связывания и существовании особых центров инициации компактизации. Авторы предполагают, что центры инициации присутствуют не только в ГХ, но и в эухроматине. Молекулы белков-компактизаторов стохастически связываются с этими центрами, причем два близко расположенных друг к другу центра могут связать больше белков, чем каждый в отдельности. Когда число связанных молекул белков достигает некоторого критического значения, происходит необратимая компактизация. Неравномерность распределения центров инициации в эухроматине может объяснить как непрерывную, так и прерывистую компактизацию.

1.2.6.2. Эффект положения мозаичного типа и представленность последовательностей ДНК в политенных и диплоидных клетках.

Идея о том, что уменьшение числа копий гена может играть роль в ЭПМ была высказана давно. Особую привлекательность она имеет для объяснения ЭПМ в политенных тканях, где ДНК ГХ сильно недопредставлена (Gall et al., 1971). Однако исследование этого предположения дает противоречивые результаты. Так, с помощью метода гибридизации in situ было показано отсутствие значимого уменьшения мечения района пуфа теплового шока 87С, который переносится транслокацией к ГХ Y-хромосомы (Henikoff, 1981). Хайаши с соавторами также не обнаружил уменьшения количества ДНК гена w+ ни в политенных, ни в диплоидных ядрах в In(l;l)wm4 (Hayashi et al., 1990). В то же время мозаичность гена Sgs4 в слюнных железах сопровождается 50% снижением числа копий, что вполне могло бы объяснить 30% снижение количества мРНК этого гена (Kornberg, Kauffman, 1986). В некоторых работах была выявлена зависимость степени недо-представленности ДНК от удаленности от точки разрыва (Karpen, Spradling, 1990; Umbetova et al., 1991).

Р-элемент опосредованный мутагенез Dp(l;f)1187 позволил сравнить в двух участках минихромосомы самцов ХО число копий ДНК, отстоящих друг от друга примерно на 200 т.п.н. Субтеломерный ГХ домен вызывал сильную инактивацию экпрессии гена rosy+ в составе конструкции, причем генетическая инактивация не сопровождалась значимым снижением числа копий ДНК. В то же время ЭПМ гена yellow+ вблизи ПГХ минихромосомы был связан с сильной недопредставленностью ДНК по сравнению с тем же районом в нормальной хромосоме (Karpen, Spradling, 1992).

Возможно, указанные выше противоречия связаны с гетерогенностью ГХ. Предполагается, что нормальное количество копий ДНК при ЭПМ может быть связано с разрывами Р-ГХ в районах сложных последовательнстей ДНК, так называемых «островов», а недопредставленность ДНК - с разрывами в а-ГХ, а также в блоках сателлитной ДНК (Karpen, 1994; Elgin, 1996).

Причины различной представленности ДНК в политенных хромосомах до сих пор неясны. Это может быть недорепликация ДНК, которая возникает вслед-

ствие поздней репликации ДНК ГХ в политенных ядрах, возможно, за счет упаковки ДНК в инактивированную хромосомную структуру. Еще одной причиной может быть элиминация ДНК (Schultz, 1936, цит. по: Жимулев, 1993), которую в последнее время связывают с существованием мобильных элеменов: при перемещении они могут захватывать соседние последовательности ДНК, в результате чего образуются микроделеции (Karpen, Spradling, 1992).

В диплоидных соматических клетках недопредставленность ДНК при ЭПМ - событие, по-видимому, маловероятное. В некоторых работах проводили сравнение степени представленности ДНК при ЭПМ в разных тканях. Уменьшение числа копий ДНК было продемонстрировано в политенных тканях, причем большая степень политенизации коррелировала с большей степенью недопредставленности ДНК. В диплоидных клетках количество ДНК не изменялось (Umbetova et al., 1990, Wallrath et al., 1996).

Таким образом, уменьшение числа копий гена может иметь значение для генетической инактивации в политенных тканях, но вряд ли является необходимым компонентом в механизме ЭПМ.

1.2.6.3. Эффект положения мозаичного типа и структура хроматина.

Косвенным свидетельством того, что мозаичность может включать изменение структуры хроматина является чувствительность ЭПМ к условиям, которые влияют на пистоны, например: делении гистоновых генов или обработка п-бутиратом. Это же соединение вызывает гибель мух, гомозиготных по гену Su(var)2-101, который связан с рецессивным гиперацетилированием гистона Н4 (Dorn et al., 1986).

При сравнении ЭПМ гена w+ в условиях усиления или супрессии мозаично-сти, чувствительность хроматина к ДНКазе-1 практически не различалась (Hyashi et al., 1990). Не были обнаружены значимые различия и при обработке хроматина w+ эндонуклеазами (Henikoff, 1996). Трансгены, кодирующие белок теплового шока (hsp26), были встроены в ПГХ, а также ГХ теломеры и хромосомы 4 (Wallrath, Elgin, 1995). Промоторы hsp стали проявлять относительную устойчивость к обработке эндонуклеазами и большую упорядоченность нуклеосомной организации, что

свойственно ГХ в целом. Эти данные принципиально важны, поскольку являются прямым свидетельством значения структуры хроматина для компактизированного состояния хроматина (Grigliatti, 1991). ЭПМ вызван структурными изменениями хроматина на эу-гетерохроматиновой границе и далее. Связываясь с эухроматином, мультибелковые комплексы ГХ формируют компактную структуру, недоступную транкрипционному комплексу.

1.2.6.4. Эффект положения мозаичного типа и внутриядерная организация.

Оригинальная «петельная» модель, предложенная недавно Хеникоффом, как

и модель «запирателей», опирается на повторенную организацию ГХ. Умеренные повторы, блоки которых составляют основу (3-ГХ, разбросаны также и по всему эухроматину. Предполагается, что эухроматиновые умеренные повторы (в основном мобильные элементы) конъюгируют с гомологичными умеренными повторами ГХ (Sabl, Henikoff, 1996). Вследствие этого хромосомные перестройки, которые переносят эухроматиновые повторенные элементы в непосредственное соседство с ГХ элементами, могут формировать спаренные вторичные структуры, а эухромати-новый участок между ними при этом выпетливается. Притягиваясь таким образом в ГХ область ядра, гены оказываются лишены возможности связываться с многочисленными факторами, необходимыми для их экспрессии, и, напротив, испытывают влияние компактизующих ГХ белковых комплексов. Подразумевая неравномерность распределения повторов и «петельный» принцип распространения ком-пактизации, эта модель способна объяснить как непрерывную, так и прерывистую компактизацию.

Идея «петельной» модели возникла как следствие поразительного открытия, сделанного Хеникоффом с коллегами. Они показали на двух экспериментальных моделях, что повторенность элементов как таковая может быть достаточным условием для формирования ГХ структуры. Три и более тандемно повторенные копии трансгена мини-white+ приводили к типично мозаичному фенотипу, который был чувствителен к влиянию модификаторов ЭПМ (Dorer, Henikoff, 1994). Сходные результаты были получены и при изучении ЭПМ с использованием трансгена P(bw+) (Sabl, Henikoff, 1996). Авторы полагают, что фактором, инициирующим

формирование ГХ, может быть образование «складчатых» вторичных структур за счет конъюгации тандемных повторов.

Интерфазное ядро, как известно, имеет определенную организацию: центромеры и теломеры собраны в кластеры и соединены с ядерной оболочкой на противоположных полюсах ядра (Hochstrasser et al., 1986). В последнее время все более популярной становится идея о том, что для нормальной экспрессии генов важно не только их положение внутри эу- или гетерохроматиновых районов, но и внутри ядра в целом. Модель Хеникоффа придает большое значение идее компарт-ментализации ядра, то есть существования функциональных особенностей разных частей ядра. Она полностью согласуется с представлениями о том, что силы соматического спаривания участвуют в обеспечении внутриядерной организации и регулируют эффект хромосомных перестроек на активность генов (Devlin et al., 1990).

1.2.6.5. Эффект положения мозаичного типа и регуляция гомейозисных генов.

Гены Poly comb-Group (Pc-G) отвечают за передачу детерминированного

состояния инактивации гомейозисных генов в ряду клеточных поколений. Полагают, что репрессия гомейозисных генов и неспецифическая репрессия генов при ЭПМ имеют много общего. В обоих случаях репрессию обеспечивают большие группы генов, продукты которых, похоже, взаимодействуют между собой, образуя мультимерные комплексы (Franke et al., 1992). Белковые комплексы, обеспечивающие гетерохроматизацию, способны распространяться вдоль хромосомы, по-видимому, благодаря кооперативному связыванию. Похоже, и белки Pc-G, связывающиеся с особыми участками ДНК (Polycomb response elements - PRE) (Eissenberg et al., 1995), обладают сходными свойствами. Используя трансген, содержащий репортерный ген lacZ и один из известных PRE, было показано, что этот регуляторный элемент может вызывать мозаичность экспрессии, причем не только lacZ, но и расположенного на некотором расстоянии от него гена white*. Эти данные интерпретируют как способность белковых комплексов Pc-G вызывать протяженную инактивацию, подобную spreading-эффекту (распространению ком-пактизации и генетической инактивации вдоль по хромосоме) при ЭПМ

(Fauvarque, Dura, 1993). Кооперативными взаимодействиями объясняют и такие особенности репрессии Pc-G, как ее зависимость от соматического спаривания.

Группа генов trithorax (tri-G) выполняет антагонистическую функцию поддержания активного состояния гомейозисных генов ( Kennison, Singh, 1993).

Было обнаружено, что некоторые гены являются как модификаторами ЭПМ, так и регуляторами активности гомейозисных генов. О возможной взаимосвязи этих двух наборов генов свидетельствуют и некоторые общие черты их молекулярной организации. Так, ГХ белок НР-1 и белок Рс имеют общий хромодо-мен, а продукт Su(var)3-9, помимо хромодомена, еще и мотив, гомологичный продуктам генов trithorax и E(z), одного из членов группы Polycomb.

Таким образом, вполне обоснованной представляется гипотеза об общности молекулярных механизмов, лежащих в основе Pc-G репрессии и ЭПМ (Paro, 1990).

За последние годы были выделены особые инсуляторные и пограничные последовательности ДНК, способные, связываясь с определенными белками, инак-тивировать взаимодействие «инородных» энхансеров с промотором (Gerasimova, Corees, 1996). В конструкциях, содержащих инсуляторные последовательности ДНК, репортерный ген mhhh-w+ защищен от ЭП окружающего эухроматина и частично ПГХ (Roseman et al., 1993). Это свидетельствует о способностях инсулято-ров блокировать эффекты различных регуляторных элементов и хроматиновых структур высшего порядка. Важно отметить, что инсулятор, помещенный между PRE и транс-геном white*, способен блокировать и инактивирующее действие PRE на транскрипцию w+ (Sigrist, Pirrotta, 1997). Предполагается, что инсуляторы блокируют взаимодействие промотора с соотвествующим энхансером, изменяя локально структуру хроматина (Gerasimova, Corees, 1996). Белковые компоненты gypsy-инсулятора, продукты su(Hw) и mod(mdg4), также способны вызывать мозаичность в трансгенных конструкциях, a mod(mdg4) к тому же является энхансером ЭПМ (Gerasimova et al., 1995). Кроме того, показано, что два элемента PRE из регуля-торной области локуса ВХ-С, MCP и FAB могут выполнять также функцию пограничных элементов (Karsh et al., 1994).

Все эти факты свидетельствуют о сложных взаимодействиях различных систем регуляции экспрессии генов, одним из универсальных инструментов которой, похоже, является модуляция высших уровней упаковки хроматина в ядре. Опираясь на поразительное открытие общности функций регуляторов экспрессии гомей-озисных генов и модификаторов ЭПМ, Элгин выдвинула идею о существовании своеобразного соревнования между установлением стабильного активного состояния генов, которое потенциально включает мультибелковый транскрипционный комплекс, и установлением стабильно инактивированного состояния генов, обусловленного мультимерным комплексом белков-компактизаторов (Elgin, 1996).

1.3. Транс-чувствительные эффекты.

Гомологичные хромосомы тесно конъюгируют в соматических клетках насекомых в течение всей интерфазы, что наиболее наглядно видно в политенных хромосомах Drosophila и других двукрылых. Это явление называют синапсисом, соматической конъюгацией, или соматическим спариванием. Основная масса данных указывает на то, что соматическое спаривание не является необходимым условием для нормального функционирования большинства генов. Тем не менее, известны случаи ЭП, при которых изменение экспрессии гена явно связано с нарушением тесной взаимосвязи двух его копий вследствие асинапсиса. Эта общая черта послужила основанием для объединения ряда сложных генетических феноменов в единую группу транс-чувствительых эффектов (ТЧЭ). В отличие от ЭПМ, эти эффекты гораздо более разнообразны по своим свойствам (Tartof, Henikoff, 1991).

1.3.1. Трансвекция.

Впервые подобное явление было обнаружено как генетическое взаимодействие между определенными аллелями гомейозисного генного комплекса ВХ-С, которое получило название трансвекции (Lewis, 1954). Комплементация между некоторыми парами аллелей, такими как Ьх34е и Ubx или СЬх и Ubx, нарушается хромосомными перестройками, приводящими к асинапсису района 89Е 3R хромосомы (места локализации гена ВХ-С). Болыпиство нарушающих трансвекцию перестроек, полученных для ВХ-С, имеют две особенности: 1) один разрыв локализо-

ван в «критическом» районе между геном и центромерой, 2) перестройки переносят ген на другую хромосому. Трансвекция в ВХ-С требует нормальной функции гена zeste+ (Kaufman et al., 1973), кодирующего белок, продукт которого способен связываться со множеством сайтов в геноме Drosophila (Pirrotta et al., 1988).

Сходные свойства присущи транс-взаимодействиям ряда аллельных комбинаций в генах decapentaplegic, yellow и eyes absent (Gelbart, 1982, Geyer et al.,1990, Leiserson et al.,1994).

Для объяснения трансвекции предлагали различные модели, но лишь одна из них была в дальнейшем экспериментально подтверждена. Полагают, что в основе трансвекции лежит способность цис-регуляторных энхансерных элементов одной копии гена к транс-взаимодействию с промотором второй копии путем выпет-ливания ДНК, находящейся между ними (Pirrotta et al., 1985, Ptashue, 1986). Для такого взаимодействия необходима физическая приближенность копий гена, что и достигается при соматическом спаривании. Детальная молекулярная характеристика трансвектирующих аллельных комбинаций в гене yellow показала,что все изученные аллели дефектны по цис-регуляторным элементам, причем трансвекция наблюдается, когда один аллель дефектен по энхансеру, а другой - по промотору (Geyer et al., 1990).

1.3.2. zeste-white взаимодействие.

Рецессивная мутация zeste1 оказывает значительное влияние на экспрессию

гена white+ (Pirrotta, 1991; Chen, 1993). Самки генотипа z w+ /z! vv+ имеют глаза лимонного цвета, в отличие от самцов z/Y, имеющих глаза дикого типа. У самцов мутантный фенотип можно наблюдать только в случае тандемной дупликации по w+ . Таким образом, для проявления влияния мутации z требуются две тесно контактирующие друг с другом копии гена w+ (Gans, 1953, Jack, Judd, 1979). Хромосомные перестройки могут нарушать описанное выше взаимодействие генов. Были обнаружены явные отличия z-w взаимодействия от трансвекции: 1) нарушение соматического спаривания в z-w районе приближает фенотип мух к дикому типу, 2) z-w взаимодействие не зависит от z+ функции, и 3) эффективны лишь те перестройки, которые имеют разрыв непосредственно проксимальнее гена w+, в районе

ЗС Х-хромосомы (Smolik-Utlaut et al., 1987). По мнению авторов, этот район содержит некоторые последовательности, необходимые либо для z-w эффекта, либо для соматического спаривания (Smolik-Utlaut et al., 1987).

Всего к настоящему времени описано 11 случаев ТЧЭ, к которым ряд авторов относит и такие сложные генетические явления, как транс-инактивация гена brown*, ЭП генов lighten cubitus interruptus*, рассмотренные подробнее в разделе 1.4.

Нужно отметить, что, несмотря на разнообразие проявлений ТЧЭ, они все имеют общие, принципиально важные черты. Во-первых, такие эффекты всегда являются результатом взаимодействия между определенными аллелями. По мнению Джадда, именно это обстоятельство определяет редкость явления. Кроме того, природа этих аллельных комбинаций предполагает, что в основе механизма трансвзаимодействия лежат регуляторные процессы, действующие в норме в цис-направлении (Judd, 1988). Во-вторых, считается общепризнанным, что цис- и транс-взаимодействия определяются локальным конформационным изменением хроматина, которые позволяют взаимодействовать разным участкам регуляторной зоны гена друг с другом (Judd, 1988, Tartof, Henikoff, 1991, Geyer, 1990). B-третьих, ТЧЭ подразумевают участие особых белков в установлении конформаци-онных изменений хроматина. Эти белки являются продуктами генов, модифицирующих ТЧЭ (Judd,1988, Pirrotta, Rostelli, 1994, Judd, 1995).

1.3.3. Транс-чувствительные эффекты и ген zeste+.

Трансвекция в ряде локусов, таких как ВХ-С, yellow, eyes absent, decapenta-

glegic, зависит от нормальной функции гена z ■ z-w взаимодействие требует определенной мутации гена zeste - z1. В некоторых случаях зависимость ТЧЭ от гена г+ не обнаружена, например, для транс-инактивации гена brown или трансвекции в гене Sex combs reduced. Можно думать, что продукт гена zeste+, который связывается с ДНК и известен как транскрипционный фактор, является не единственным белком, регулирующих ТЧЭ (Tartof, Henikoff, 1991). Продукт гена zeste+ связывается in vitro с регуляторными районами многих генов, причем, в локусах w+, Ubx+, dpp+ сайты собраны в кластеры как вблизи промоторной зоны, так и в более отда-

ленных регуляторных участках (Benson, Pirrotta, 1988). Значение продукта гена zeste+ для экспрессии генов в норме до конца неясно, однако, его сайты связывания, локализованные рядом с промотором, обеспечивают усиление транскрипции (Biggin et al.,1988). Предполагают, что при связывании этого белка с дистальными регуляторными элементами происходит выпетливание ДНК и сближение этих регуляторных участков с промоторным комплексом. Первостепенное значение для z-зависимых ТЧЭ имеет способность продукта гена z+ образовывать самоагрегаты, а в случае мутации z1 - гиперагрегаты (Rastelli et al., 1993).

1.3.4. Ген zeste+ и гены Polycomb-Group.

Мутации в ряде генов способны усиливать или ослаблять zeste-

обусловленную репрессию гена white*, причем, по-крайней мере, три из них, Psc, E(z)/pco и Su(z)302/Scm относятся к генам Pc-G. Еще один модификатор гена zeste - Su(var)2, хоть и не относится к генам этой группы, но функционально с ними связан (Adler et al., 1989, Wu et al., 1989). На политенных хромосомах продукты этих генов имеют множество общих мест локализации, что предполагает формирование мультимерных комплексов. Похоже, что сборка или стабильность таких комплексов зависят от функции E(z)+ (Rastelli et al., 1993). Авторы полагают, что разные модификаторы гена zeste+ могут влиять на z-w взаимодействие разными способами: регулируя экспрессию самого гена z+ или изменяя структуру хроматина в районе гена w+.

Известно, что, некоторые белки группы Pc-G связываются с особыми регуляторными последовательностями - PRE. Ряд особенностей функционирования PRE в локусе ВХ-С позволяют связать регуляцию его экспрессии и трансзависимую межаллельную комплементацию. PRE элемент из ВХ-С репрессирует парасегментальные энхансеры, расположенные между ним и промотором (Pirrotta, Rastelli, 1994). Когда такой PRE включен в состав Р-элементной конструкции, он одновременно репрессирует и ген мини-и/, входящий в состав транспозона. Такая репрессия проявляется в мозаичном фенотипе глаз. Удивительной чертой PRE является зависимость репрессии, которую они вызывают, от соматического спаривания. PRE имеют тенденцию, будучи в составе конструкций, встраиваться в те мес-

та хромосомы, где уже локализован другой PRE-участок. Похоже, соматическое спаривание необходимо для сборки и стабильности Pc-G белковых комплексов (Pirrotta, Rastelli, 1994).

Зависимость функции от соматического спаривания и модификация рядом генов Pc-G z-w-взаимодействия поднимают вопрос о возможности участия гена zeste+ в их функционировании. Было показано, что зависимость PRE от соматического спаривания не связана с функцией гена zeste+ и является особенностью самих PRE последовательностей (Kassis et al., 1991). В случае ВХ-С PRE и набор сайтов связывания продукта гена zeste+ локализованы довольно близко. Если транспозон содержит все эти последовательности, то функция приводит к усилению транскрипции гена w+, а потеря z+ функции - к ее репрессии. При повреждении или утрате PRE, zeste не оказывает влияния на ген w+ (Pirrotta, Rastelli, 1994).

Ряд сходных черт между функционированием PRE и z-w-взаимодействием привел к гипотезе, по которой этот ТЧЭ также связан с наличием PRE-подобных последовательностей в районе ЗС, которые репрессируют ген и>+. Роль продукта zeste в норме может заключаться в том, чтобы противостоять этот репрессии, но гиперагрегаты мутантного продукта z вызывают противоположный результат, усиливая PRE-репрессию (Pirrotta, Rastelli, 1994).

Существуют разные точки зрения на природу ТЧЭ. Чаще эти эффекты рассматривают как отражение важности соматического спаривания для регуляции некоторых генов в норме (Judd, 1988). По мнению Хеникоффа, соматическое спаривание имеет значение, главным образом, для упаковки хромосом в интерфазе. В таком случае, ТЧЭ, возможно, выявляют мутации, которые, приводя к взаимосвязи гомологичных участков хромосом, нарушают нормальные условия («хромосомный контекст») экспрессии генов (Henikoff, 1993). Данные об особых свойствах PRE и их роль в регуляции ряда генов, говорят, скорее, в пользу первой гипотезы. Нельзя исключить возможность того, что PRE могут выполнять и более общие функции в ядре. Кажется привлекательным предположение о том, что Pc-G белки, связываясь с PRE участками, возможно, участвуют в поддержании соматического спаривания

хромосом, подобно тому, как белки ГХ участвуют в формировании хромоцентра (Pirrotta, Rastelli, 1994).

1.4. Особые случаи эффекта положения гена.

1.4.1. Эффект положения гетерохроматиновых генов.

Районы ПГХ, хотя и обеднены генами, все же не являются полностью генетически инертными. В настоящее время описано примерно 40 генов, нормально экспрессирующихся в ГХ окружении (Gatti et al., 1992). Некоторые из них, включая тандемно организованные 18S+28S рДНК и районы ABO и DAL, которые взаимодействуют с определенными эухроматиновыми генами, представлены повторами. 30 генов было локализовано благодаря мутациям, нарушающим фертиль-ность, жизнеспособность или морфологию.

Первым из генов, кодирующих белки, был проклонирован ген light* (It*), необходимый для нормальной жизнеспособности. Он локализован в ПГХ хромосомы 2L и экспрессируется во многих типах клеток. It* значительно отличается по своей молекулярной организации от эухроматиновых генов. Экзоны в нем представлены уникльными последовательностями, а самые крупные интроны и фланкирующие ген районы содержат умеренные повторы, которые сходны с умеренными повторами, локализованными в других районах ß-ГХ. Эти особенности молекулярной организации характерны и для таких ГХ генов, как rolled, concertina, kl-5 (см. обзор Elgin, 1996).

Наличие функционирующих генов в ПГХ поднимает вопрос о возможном влиянии ГХ окружения на их экспрессию. Данные, подтвреждающие эту гипотезу, были получены еще в 30-е годы, когда Шульц обнаружил, что инверсии, переносящие ген It* в новое эухроматиновое окружение, вызывают мозаичность фенотипа у гетерозигот R(lt*)/lt (Schultz, Dobzhansky, 1934). По-крайней мере еще 5 соседних с It* генов демонстрируют в перестройках мозаичную экспрессию (Wakimoto, Hearn, 1990). Зависимость экспрессии от ГХ окружения свойственна, по-видимому, не всем генам. Так, кодирующая единица 18S+28S рДНК, встраиваясь в составе транспозон-содержащих конструкций в различные участки эухроматина, активно

транскрибировалась и формировала мини-ядрышки в ядрах слюнных желез (Karpen, Spradling, 1990). Как и ЭПМ эухроматиновых генов, ЭП ГХ генов может быть модифицирован средовыми и генетическими факторами, однако, действие модификаторов, как правило, вызывает противоположный эффект. Мозаичность гетерозигот R(lt+)/lt увеличивается при введении в геном дополнительной Y-хромосомы (Baker, Rein, 1962). Сравнительный анализ влияния 12 генов модификаторов показал, что супрессоры ЭПМ эухроматиновых генов усиливают мозаичность по lt+ , а энхансеры, напротив, ослабляют (Hearn et al., 1991).

Однако ЭПМ гена lt+ нельзя считать реципрокным по отношению к ЭПМ эухроматиновых генов (Hilliker, 1980; Weiler, Wakimoto, 1995). Важное различие между ними было обнаружено в первых же исследованиях ЭП гена lt+: мозаичность гена может быть вызвана только переносом гена в дистальные районы эухроматиновых плеч (Hessler, 1958, Wakimoto, Hearn, 1990). Поскольку такие перестройки «захватывают» с собой и участки проксимального ПГХ (иногда почти весь ГХ 2Ь-плеча), то была высказана идея о том, что для ЭП гена if , возможно, важен не столько перенос гена в эухроматиновое окружение, сколько удаление его от центромеры (Hilliker, Sharp, 1988).

В дальнейшем было показано, что мозаичность ГХ гена rolled, локализованного в ПГХ хромосомы 2R, может быть вызвана удалением значительного количества окружающего его ГХ (Eberl et al., 1993). Более того, активность гена восстанавливалась второй перестройкой, помещавшей его в другой ГХ блок. Таким образом, можно думать, что ГХ гены требуют для нормального функционирования соседства не столько центромеры, сколько блоков ГХ, причем, похоже, что разные участки ПГХ могут по-разному влиять в цис-положении на экспрессию ГХ генов (Howe et al., 1995).

В настоящее время наибольшее признание получила модель ЭП ГХ генов, предложенная Вакимото и Херн (Wakimoto, Hearn, 1990). Предполагается, что для нормальной экспрессии ГХ генов требуется критическая концентрация ГХ белков, количество которых в ядре, возможно, лимитировано. Повторенные последовательности, окружающие ГХ гены, могут служить для повышения локальной

, ИЮСйЙСКАЯ

"^Чблио-ТЕХА

концентрации этих белков. Хромосомные перестройки, перемещая ГХ гены, возможно, ослабляют способность эффективно конкурировать за необходимые белки. Большое значение в данной модели придается ограничению ЭП ГХ генов дисталь-ными эухроматиновыми районами. Во-первых, такая неравномерность эффективных эухроматиновых разрывов свидетельствует о вероятном влиянии межхромосомных взаимодействий на конкурирование за нужные белки. Во-вторых, она подразумевает некоторую общность ЭП ГХ генов с ТЧЭ: ЭП ГХ генов может быть чувствителен к соматическому спариванию (Weiler, Wakimoto, 1995). Компартмен-тализация и трехмерная организация политенных хромосом, в целом, могут играть важную роль в регуляции экспрессии генов.

Таким образом, ЭП ГХ генов имеет свои уникальные особенности, и, делая упор на том или ином его аспекте, разные авторы рассматривают ЭП ГХ генов либо как особый случай ЭПМ (Spofford, 1976), либо как ТЧЭ (Tartof, Henikoff, 1991).

1.4.2. Эффект положения гена brown+.

ЭП гена brown+ (bw+), локализованного в районе 59D4-E1 хромосомы 2R,

представляет собой по сути сочетание двух типов ЭП. С одной стороны, хромосомные перестройки, переносящие ген в соседство ПГХ, вызывают цис-инактивацию, которая проявляется у гетерозигот в мозаичности по красным и коричневым фасеткам глаз (Slatis, 1955). Для трех перестроек In(2R)bwVDel, In(2R)bwVDe2, bwD была продемонстрирована типичная гетерохроматизация в районе 59D-E, проксимальнее их эухроматиновых разрывов (Belyaeva et al., 1996). Таким образом, при ЭП гена bw+ наблюдается рецессивная цис-инактивация гена на перестроенном гомологе, свойственная ЭПМ подавляющего большинства эухроматиновых генов. С другой стороны, эу-гетерохроматиновые перестройки могут вызывать и редкое явление доминантного ЭП, который обнаруживается в мозаичности фенотипа глаз у гетерозигот R(bw+)/bw+ (Muller, 1930). У таких мух не выявляется РНК с обоих гомологов и, следовательно, перестройка инактивирует и цис-, и транс-копию гена (Henikoff, Dreesen, 1989). В связи с этим доминантный ЭП гена bw+ называют транс-инактивацией.

Транс-инактивация имеет некоторые черты сходства и с ЭПМ эухроматино-вых генов, и с ТЧЭ. Так, модификаторы ЭПМ оказывают одинаковое влияние как на цис-, так и на транс-инактивацию (Brossean, 1959; Hayashi et al., 1990; Жиму-лев, 1993). С другой стороны, транс-инактивация возможна только при соматическом спаривании гомологов. Показано, что у гетерозигот по двум разным перестройкам она значительно слабее, чем у гомозигот по одной из них (Henikoff, Dreesen, 1989).

Можно выделить три условия, необходимые для транс-инактивации гена bw+: (1) ГХ разрыв вблизи гена bw+, способный вызвать цис-инактивацию (Henikoff, Dreesen, 1989), (2) соматическое спаривание гомологичных копий гена и непосредственно примыкающего к кодирующей зоне участка 5'-области, (3) особый участок ДНК, также в непосредственной близости к гену, но только на транскопии (Dreesen et al., 1991). Все эти особенности транс-инактивации объясняет модель, предложенная группой авторов (Dreesen et al., 1991, Henikoff et al., 1993, Henikoff, 1994). Модель подразумевает взаимодействие между белком, связывающимся со специфическими последовательностями ДНК на транс-копии гена bw+, и белком, входящим в состав ГХ белкового комплекса, который отвечает за цис-инактивацию. Соматическое спаривание обеспечивает физическую возможность контакта этих белков, и этот контакт инактивирует экспрессию транс-копии. Нарушение соматического спаривания, снижая частоту контакта белков, уменьшает и возможность передачи репрессированного состояния с цис-копии на транс-копию.

1.4.3. Эффект положения гена cubitus interrupting.

Ген cubitus interruptus+ (ci+) локализован в районе 101F-102A (Locke, Tar-

tof, 1994), на границе между ß-ГХ 101 и эухроматиновым 102 районами хромосомы 4. Рецессивная мутация ci1 приводит в гомозиготе к прерывистости кубиталь-ной жилки L4 у части мух (Tiniakov, Terentieva, 1933). ЭП этого гена, известный в литературе как эффект Дубинина (ЭД), заключается в следующем: если в результате хромосомных перестроек (R) ген ci+ попадает в эухроматиновые районы, то часть гетерозигот R(ci+)/ci] имеет мутантный фенотип (Dubinin, Sidorov, 1934).

Распределение эффективных для ЭД разрывов хромосом имеет свои особенности. Обычно ЭД наблюдали у гетерозигот R(ci+)/ci], но в некоторых работах

j

хромосомные перестройки индуцировали в гомологе, несущем мутацию ci , и ЭД проявлялся в усилении или ослаблении сг-фенотипа у R(ci+)/ci', по сравнению с гомозиготами c^/ci1 (Stern, Heidenthal, 1944, Altorf er, 1967). Показали, что для возникновения ЭД обоих типов необходим разрыв между центромерой и геном ci+ (Spofford, 1972), но в то же время описаны транслокации, которые имеют разрывы дистальнее, в районе 102А-102В, и вызывают ЭД (Stern, Kodani, 1955, Altor-fer, 1967). Таким образом, выявляется парадоксальная ситуация: ЭД не всегда связан с ЭП гена ci+. Такие перестройки обычно вызывают слабый ЭД, который практически затухает, если разрывы в хромосоме 4 локализованы дистальнее района 102В1-2 (Stern, Kodani, 1955, Altorfer, 1967).

B.B. Хвостова обнаружила, что перенос гена ci+ в проксимальные районы аутосом практически не нарушает его экспрессию, то есть эффективны только дистальные эухроматиновые разрывы (Khvostova, 1939). В дальнейшем было показано, что такая закономерность характерна и для ЭПМ некоторых других ГХ генов: light+, rolled+ у D. melanogaster и гена peach+ D. virilis (Spofford, 1976). Причины супрессии ЭД в проксимальных районах аутосом пока неясны.

Количество ГХ Y-хромосомы в геноме может влиять на проявление ci-фенотипа у гетерозигот R(ci+)/ci]. Принято считать, что ЭД отличается от известных случаев ЭПМ ГХ генов характером влияния на него Y-хромосомы (Spofford, 1976, Lock, Tartof, 1994): добавление в геном дополнительной Y-хромосомы ослабляет мутантный фенотип, а удаление Y-хромосомы (самцы ХО), напротив, его усиливает (Grell, 1959, Altorfer, 1967). Однако не для всех ГХ генов характерно усиление мозаичности при добавлении ГХ в геном (Schneider, 1962). Кроме того, в некоторых работах не было обнаружено влияние Y-хромосомы на ЭД или оно имело тот же характер, что и для ГХ гена lt+ (Хвостова, 1939; Altorfer, 1967, Benner, 1971).

Особенности d-эффекта так своеобразны, что до сих пор не предложена модель, объясняющая полностью это явление. Исторически сложился двойствен-

ный взгляд на его природу. Ряд авторов рассматривали ЭД в терминах ЭПМ (Lewis, 1950, Spofford, 1976, Altorfer, 1967). Основанием для этого служили эу-ГХ характер перестроек, вызывающих ЭД, влияние Y-хромосомы и супрессия ЭД в проксимальных районах, что характерно для ЭПМ ряда ГХ генов.

Другая точка зрения на природу ЭД фокусирует внимание не на общности некоторых его свойств с ЭПМ, а на их различии. При ЭПМ перенос гена к ПГХ приводит к инактивации гена в результате компактизации соответствующего эу-хроматинового участка в части клеток. Гемизиготы по перестройке обычно обнаруживают инактивацию гена: например, мухи генотипа In(l;l)wm4/0 имеют мозаичную окраску глаз. Напротив, гомозиготы R;(ci+)/R](ci+) и гемизиготы Rj(ci+)/0 (где 0 - делеция или утрата хромосомы 4) обычно неотличимы от мух дикого типа (Dubinin, Sidorov, 1934). Таким образом, для возникновения cz-эффекта одного переноса гена в эухроматиновое окружение недостаточно. Для объяснения этой особенности была предложена гипотеза о зависимости ЭД от соматического спаривания (Ephrussi, Sutton, 1944). Общим моментом обеих точек зрения на природу ЭД можно считать представление о гипоморфности мутации ci1 и снижении доминантности нормального аллеля при ЭД либо в результате структурных изменений в Ri(ci+), либо в результате нарушения соматического спаривания.

Дальнейший прогресс в изучении ЭД связан с работами по молекулярному клонированию гена ci+ и анализу регуляции его экспрессии.

До недавнего времени считалось, что в районе 101F-102B расположены три отдельных гена со сходными крыловыми дефектами у некоторых мутантов: ciD, Cell и ci (Hochman, 1976, Orenic et al., 1987). Исследования молекулярно-генетической организации ci+ района показали, что все известныее мутации по этим генам локализованы на участке длиной в 13.7 т.п.н., соотвествующем 5'-области или месту старта транскрипции единственного выявленного в этом районе транскрипта (Lock, Tartof, 1994, Slusarski et al., Schwartz et al.,1995). Все мутации вызывают нарушения экспрессии этого транскрипта (Eaton, Kornberg, 1990, Slusarski et al., 1994, Schwartz et al., 1995).

Генетический анализ подтвердил предположение о том, что ciD, ci+ и Cell представляют собой единый генный комплекс (Lock, Tartof, 1994). По фенотипу и межаллельной комплементации все мутации можно разделить на классы, ci1 класс объединяет жизнеспособные в гомозиготе мутации, вызывающие прерывистость жилок крыла L4 и L5: рецессивные мутации ci1, ci57g, ci361 и доминантную - ciw. Два аллеля, ciD и ciCe являются рецессивными леталями и, кроме того, вызывают доминантные множественные крыловые дефекты. ciD не комплементирует ни с ciCe, ни с двумя другими рецессивными леталями - 1(4)13, 1(4)17. В то же время 1(4)13 комплементирует с 1(4)17 и ciCe, что позволяет выделить ci° и ciCe классы мутаций. Особое положение занимает мутация ciw\ жизнеспособная в гомозиготе, она ведет себя как рецессивная полулеталь в гетерозиготе с ciD, ciCe и с 1(4)17. Во всех, случаях летальность связана со значительными нарушениями сегментации эмбрионов.

Ген ci+ относится к группе генов раннего эмбриогенеза, которые контролируют формирование полярности сегментов эмбриона (Nusslein-Volhard, Wieschaus, 1980). Его продукт содержит 5 доменов «цинковых пальцев» и является транскрипционным фактором (Orenic et al., 1990). Белок Ci имеет гомологию с регу-ляторными белками группы Gli у позвоночных и с фактором определения пола Тга-1 у нематоды С. elegans (Slusarski et al., 1994). Ci активен в норме только в передних отделах эмбриональных сегментов и имагинальных дисков (Eaton, Kornberg, 1990). Ген ci+ участвует в регуляции таких генов, как wingless+ и patched*, которые, как и ci+, относятся к генам сегментальной полярности, специфичным для клеток передних отделов (Baker, 1988, Hooper, Scott, 1989).

В регуляции самого гена ci+ большую роль играет ген engrailed+ (еп+), который также относится к генам сегментальной полярности и кодирует транскрипционный фактор, содержащий гомеодомен (Fjose et al., 1985, Poole et al., 1985). en экспрессируется только в задних отделах эмбриональных сегментов и имагинальных дисков (Eaton, Kornberg, 1990).

Анализ регуляторной области гена ci+ с использованием lac-Z конструкций позволил выделить два кластера регуляторных элементов, один из которых репрес-

сирует ci+ транскрипт и Ci в эпидермальных клетках задних отделов эмбриональных сегментов и имагинальных дисков. Белок En, способный связываться с ДНК in vivo и in vitro, связывается с определенными последовательностями в пределах этого участка (Schwartz et al., 1995), подтверждая гипотезу о том, что еп+ негативно регулирует ci+ в задних отделах сегментов и имагинальных дисков (Eaton, Kornberg, 1990). Некоторые мутации гена ci+, включая и ci1, по-видимому, нарушают взаимодействие белка En с этими регуляторными последовательностями, так как у таких мутантов ci+ транскрипт и Ci распределены по всему крыловому има-гинальному диску (Slusarski et al, 1994, Schwartz et al., 1995). Жилки крыла L4 и L5 развиваются из клеток задних отделов крыловых имагинальных дисков, и таким образом, сг-фенотип связан не со снижением ci+ функции, а с ее сверхфункцией в этих отделах.

Локк и Тартоф первыми указали на то, что мутация ci+, вероятно, не является гипоморфной (Lock, Tartof, 1994). Нормальный фенотип гемизигот R(ci+)/0 или R(ci+)/Df они объяснили не сохранением нормальной ci+ функции в пере-строеном гомологе, а отсутствием мутации ci1, нарушающей механизм негативной регуляции ci+ экспрессии. Разделяя мнение о том, что En может регулировать ci+ экспрессию как с цис-, так и в транс-направлении, они предположили, что ЭД является следствием нарушения транс-зависимой негативной регуляции ci+ экспрессии в расконъюгированных гомологах хромосомы 4.

Полученные к настоящему времени данные со всей очевидностью демонстрируют необычность ЭД: одни его свойства типичны для ЭПМ, другие - для ТЧЭ. Таким образом, несмотря на многолетнее изучение особенностей ЭД, целый ряд вопросов остается открытым и, в первую очередь, сама природа этого явления.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Данные, представленные в обзоре, свидетельствуют о том, что природа и

молекулярные механизмы, лежащие в основе разных типов ЭП у D. melanogaster, сложны и требуют дальнейшего всестороннего изучения. На сегодняшний день существует несколько моделей механизма ЭПМ, которые, на наш взгляд, не противоречат друг другу, а скорее фокусируют внимание на разных аспектах этого феномена. При этом все модели подразумевают, что особо важные функции в ЭПМ выполняют белки хроматина.

Интересную проблему представляет собой изучение таких белков, которые в норме являются структурными компонентами ГХ. Предполагают, что именно они, формируя мультимерные комплексы, играют основную роль в организации ГХ и компактизации эухроматиновых участков при ЭПМ. Белки НР1 и Modulo, как полагают, могут быть структурными компонентами ПГХ, в связи с чем актуален вопрос об их участии в компактизации эухроматиновых участков политенных хромосом разных типов клеток. Эти белки входят в число тех нескольких продуктов генов-модификаторов ЭПМ, на которые удалось уже получить антитела. Таким образом, имеется возможность использовать для изучения их свойств широко применяемый в современных исследованиях метод непрямого иммунофлюоресцентно-го окрашивания политенных хромосом. Этот метод основан на использовании специфических (моноклональных) немеченых антител на данный белок с последующей посадкой на них вторых антител, специфических к первым антителам и меченных флюоресцирующим красителем. Высокоспецифичный метод иммуноо-крашивания дает возможность локализовать белок ш vivo, соотнося его распределение с определенными морфологическими структурами политенных хромосом. Такой подход вносит вклад в обсуждение возможных функций ГХ белков в норме и при ЭПМ.

В последнее время становится популярной идея об универсальности механизмов регуляции экспрессии генов, основанных на модуляции высших уровней упаковки хроматина. В связи с этим возрос интерес к исследованию природы и механизмов разных типов ЭП, а также возможности влияния общих факторов на

их проявление. Особое место среди активно обсуждаемых случаев ЭП занимает ЭД, связанный с нарушением экспрессии гена ci+ при переносе его хромосомными перестройками в дистальные районы эухроматина. Своеобразие ЭД заключается в том, что разные его свойства типичны для разных типов ЭП. Вследствие этого сложен и далек от окончательного решения вопрос о самой природе этого явления. Прояснить эту проблему могло бы сравнение цитогенетических характеристик ЭД с описанными ранее признаками разных типов ЭП.

Целью данной работы было исследование цитогенетических аспектов эффекта Дубинина, а также возможной роли гетерохроматиновых белков НР1 и Modulo как в эффекте положения мозаичного типа, так и в эффекте Дубинина.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1) Проанализировать особенности локализации белка НР1 на политенных хромосомах слюнных желез в линии с Dp(l;l)pn2b, вызывающей эффект положения мозаичного типа.

2) Исследовать характер распределения белка НР1 на политенных хромосомах псевдопитающих клеток.

3) Изучить возможность зависимости распределения белка Modulo на политенных хромосомах от дозы гена modulo и типа клеток.

4) Выяснить, сопровождается ли эффект Дубинина видимыми изменениями в ком-пактизации района 101D-102B в транслоцированном гомологе хромосомы 4.

5) Провести сравнительный цитологический анализ морфологии района 101D-102B в норме и в транслокациях, вызывающих эффект Дубинина.

6) Изучить жизнеспособность и фенотип гетерозигот по мутациям гена ci+ и транслокациям, вызывающим эффект Дубинина.

7) Выяснить, зависит ли супрессия эффекта Дубинина в проксимальных районах хромосом от частоты соматического спаривания нормального и транслоциро-ванного гомологов хромосомы 4 и влияют ли дозы белков НР1 и Modulo на эту частоту.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Демакова, Ольга Викторовна

Выводы.

1. Получено прямое доказательство участия белка НР1 в компактизации эухрома-тинового участка при ЭПМ. Впервые показано, что в основе spreading-эффекта лежит распространение структурного компонента ГХ на эухроматиновый район хромосомы.

2. Показано, что белок Modulo является общим компонентом ядрышка и районов конденсированного хроматина (ПГХ и дисков эухроматиновых плеч хромосом). Наличие Modulo в районах конденсированного хроматина зависит от дозы гена modulo+ в геноме.

3. Показано, что НР1 демонстрирует типичную картину локализации на политен-ных хромосомах слюнных желез в отсутствие гена modulo+ в геноме. Белки НР1 и Modulo, таким образом, не входят, по всей видимости, в единый комплекс.

4. Сравнительный анализ иммунолокализации НР1 и Modulo на политенных хромосомах слюнных желез и исевдопитающих клеток показал, что функциональные особенности этих двух типов клеток влияют на характер распределения обоих белков.

5. Предложена модель влияния ядрышка на ЭПМ, согласно которой ядрышко и ПГХ имеют общие белки (Modulo) и конкурируют за них.

6. Выявлены следующие цитогенетические особенности эффекта Дубинина, позволяющие рассматривать его как пример транс-чувствительных эффектов, но не эффекта положения мозаичного типа: а), эффект не связан с видимыми изменениями в компактизации хромосомы 4, перенесенной транслокацией в эухроматиновые районы, б), эффект обусловлен не инактивацией гена ci+, а особыми аллелоспецифиче-скими взаимодействиями, в), супрессия ЭД в проксимальных районах аутосом коррелирует с высокой частотой восстановления соматического спаривания нормального и транслоци-рованного гомологов хромосомы 4. ГХ белки, по крайней мере, НР1, играют роль в ЭД, влияя на эту частоту.

Таким образом, ЭД следует рассматривать как пример трансчувствительных эффектов, но не эффекта положения мозаичного типа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Многочисленные исследования ГХ у дрозофилы показали сложность и гетерогенность его организации на разных уровнях. ГХ отличается от эухроматина не только организацией последовательностей ДНК, но и белковым составом. Многообразие белков, участвующих в формировании, поддержании и модуляциях хроматина могут быть очень значительными.

ЭПМ является удобной моделью для изучения не только ГХ и его влияния на экспрессию генов, но и роли различных белков в компактизации хроматина. Одни продукты генов-модификаторов ЭПМ опознают ГХ последовательности или различные белковые компоненты ГХ, как, например, НР1. Другие, подобно белку Modulo, являются общими для ГХ и эухроматина и, возможно, выполняют какие-то общие функции в организации структуры хроматина. Многим белкам хроматина, похоже, свойственна полифункциональность. Так, белок НР1 важен как для организации ГХ и инактивации генов при ЭПМ, так и для сегрегации хромосом. Одни и те же белки могут влиять на ЭПМ, регуляцию гомейозисных генов, а также ТЧЭ. Полифункциональность белков находит свое отражение и в сложности их молекулярной организации, когда белки имеют несколько функциональных доменов. Например, Modulo способен связываться с ДНК, РНК и белками. На поли-тенных хромосомах он присутствует как в районах конденсированного хроматина, так и в ядрышке.

Можно думать, что разные свои функции белки хроматина осуществляют за счет разных механизмов. Так или иначе, участие ряда белков в различных процессах функционирования клетки подразумевает конкуренцию за них между различными структурами хромосом и ядра. Изменения в одной из них могут приводить к сдвигу баланса тех или иных белков и, как следствие, влиять на функции, связанные с другими структурами. Так, изменение количества ГХ в ядре влияет на степень компактизации эухроматиновых районов при ЭПМ. Сложная система конкуренции за общие белки включает в себя, по-всей видимости, и отношения между хромосомами и ядрышком, что может обусловливать влияние ядрышка на ЭПМ.

Полифункциональность белков хроматина может быть тем связующим звеном, которое объединяет такие, казалось бы, различные типы эффекта положения, как ЭПМ и ТЧЭ.

Молекулярный механизм соматической и эктопической конъюгации у Drosophila пока неясен. Наиболее правдоподобным можно считать предположение о том, что в основе этих контактов лежат взаимодействия особых белков. Полагают, что участие в поддержании соматического спаривания и эктопических контактов могут принимать белки как ГХ, так и группы Polycomb (Pirrotta, Rastelli, 1994, Eissenberg et al., 1995, Henikoff, 1996). Работы последних лет показали, что зависимость ТЧЭ от соматического спаривания обусловлена, скорее всего, аффинностью PRE-Pc-G комплексов к гомологичным комплексам, а также к таким, которые расположены в разных местах хромосом, что указывает на распространенность PRE-подобных последовательностей в геноме. Даже действие инсулятора не препятствует транс-взаимодействиям этих комплексов (Sigrist, Pirrotta, 1997), имеющих множественные сайты связывания на политенных хромосомах. Характерно, что ДНК-белковый комплекс, определяющий тканеспецифическую регуляцию et экспрессии, напоминает по ряду свойств функционирование PRE-Pc-G комплексов.

ГХ белки также имеют значение для эктопической и соматической конъюгации политенных хромосом. Показано, что количество ГХ в ядре может влиять на частоту асинапсиса, который происходит в части ядер в норме (Жимулев, Вага-пова, 1991). ГХ белки влияют и на эффективность эктопических контактов ПГХ с ГХ участками, перенесенными в эухроматиновое окружение, и, как следствие, на проявление ряда ТЧЭ. Кроме того, можно полагать, что белок НР1 принимает участие в поддержании соматического спаривания хромосомы 4.

Взаимосвязь ГХ и ТЧЭ, похоже, этим не ограничивается. С одной стороны, компоненты ГХ белковых комплексов могут быть важны непосредственно для механизма некоторых транс-взаимодействий, например, при транс-инактивации гена bw+. Не исключено, что и для механизма транс-зависимой негативной регуляции ci+ экспрессии при ЭД небезразлично состояние ГХ участка 101D-F, так как в этом механизме какую-то роль играет GAGA-фактор, компонент ГХ. С другой стороны, кажутся перспективными идеи о роли соматического спаривания в механизме ЭПМ, развиваемые Хеникоффом с коллегами. Прежде всего отметим, что само образование хромоцентра связывают с конъюгацией гомологичных умеренных повторов, расположенных в ГХ районах как одной и той же, так и разных хромосом. Кроме того, получены прямые доказательства того, что повторенные последовательности способны индуцировать формирование ГХ организации, предположительно, за счет образования ими спаренных структур. Эктопическая конъюгация умеренных повторов, локализованных в ПГХ и эухроматине, согласно модели Хе-никоффа, может приводить к образованию петель, приближающих физически эу-хроматинвые гены в область действия ГХ белков и облегчающих распространение компактизации вдоль по эухроматиновым районам. Белки, подобные Mod, распределение которых в конденсированном хроматине в большой степени определяется их связью с мобильными элементами, могут быть кандидатами на участие в таком механизме.

Таким образом, ЭП у Drosophila отражает сложный и во многом еще неясный механизм взаимодействия таких различных доменов хромосом, как ГХ и эу-хроматин. Необходимо дальнейшее изучение его молекулярных основ, включая исследования роли белков хроматина, чтобы понять все особенности многоуровневой системы регуляции экспрессии генов эукариот.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Демакова, Ольга Викторовна, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Жимулев И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена// Новосибирск. Наука. 1993. С. 1-490.

2. Жимулев И.Ф., Вагапова Р.В. Влияние модификаторов эффекта положения на состояние синапсиса политенных хромосом у Drosophila melanogasterll ДАН. 1991. Т. 321. С. 398-401.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование// М.: Мир. 1984. С. 1-479.

4. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом// М: Наука. 1986.

5. Adler P.N., Charlton J., Brunk В. Genetic interactions of the Suppressor 2 of zeste region genes// Dev. Genet. 1989. V. 10. P. 249—260.

6. Altorfer N. Effect of the absence of the Y chromosome on the expression of the cubitus interruptus phenotype in various translocations in Drosophila melanogasterll Genetics. 1967. V. 55. P. 755-767.

7. Ashburner M. Drosophila: a laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1989.

8. Baker W.K. Position effect variegation// Adv. Genet. 1968. V. 14. P. 133-169.

9. Baker W.K., and Rein A. The dichotomous action of Y chromosomes on the expression of position-effect variegation// Genetics. 1962. V. 47. P. 1399-1407.

10. Baksa K., Morawietz H., Dombradi V., Axton M., Taubert H., Szabo G., Torok I., Udvardy A., Gyurkovics H., Szoor В., Glover D., Reuter G. and Gausz J. Mutations in the protein phosphatase 1 gene at 87B can differentially affect suppression of position-effect variegation and mitosis in Drosophila melanogasterll Genetics. 1993. V. 135. P. 117-125.

11. Balasov M.L., and Makunin I.V. Model of continuous and discontinuous chromatin compaction, resulting from position effect variegation// Biol. Zent. bl. 1996. V. 115. P. 16-23.

12. Belyaeva E.S., and Zhimulev I.F. First international meeting "Heterochromatin of Drosophila" (Alberobello, Italy, May 9-13, 1990// Genetica. 1991. V. 27, N2, 375-378.

13. Belyaeva E.S., Koryakov D.E., Pokholkova G.V., Demakova O.V., Zhimulev I.F. Cytological study of the brown dominant position effect// Chromosoma. 1997. 106. PP. 124-132.

14. Belyaeva E.S., Protopopov M.O., Baricheva E.M., Semeshin V.F., Izquierdo M.L., and Zhimulev I.F. Cytogenetic analysis of region 2B3-4 - 2B11 of the X-chromosome of Drosophila melanogaster. VI. Molecular and cytological mapping of the ecs locus and the 2B puff// Chromosoma 1987. V. 95. P. 295310.

15. Belyaeva E.S., Vlassova I.E., Biyasheva Z.M., Kakpakov V.T., Richards G. and Zhimulev I.F. Cytogenetic analysis of the 2B3-4, - 2B11 region of the X chromosome of Drosophila melanogaster. II Changes in 20-OH ecdysone puffing caused by genetic defects of puff 2B5// Chromosoma. 1981. V. 84. P. 207-219.

16. Benner D.B. Some evidence against the presence of suppressors of variegation on the Y chromosome// Dros. Inform. Serv. 1971. V. 47. P. 72.

17. Benson M., Pirrotta V. The Drosophila zeste protein binds cooperatively to sites in many gene regulatory regions: implications for transvection and gene regulation// EMBO J. 1988. V. 7. P. 3907—3915.

18. Biggin M.D., Bicke, S., Benson M., Pirrotta V., Tjian R. zeste encodes a sequence-specific transcription factor that activates the Ultrabithorax promoter in vitro// Cell. 1988. V. 53. P. 713—722.

19. Billings P.C., Orf J.W., Palmer D.K., Talmage D.A., Pan C.G. and Blumenfeld M. Anomalous electrophoretic mobility of Drosophila phosphorylated HI histone: is it related to the compaction of satellite DNA into heterochromatin?// Nucl. Acids Res. 1979. V. 6. P. 2151-2164.

20. Birney E., Kumar S. and Krainer A.R. Analysis of the RNA recognition motif and RS and RGG domains: conservation in metasoan pre-mRNA splicing factors// Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. P. 5803-5816.

21. Birren B.W., Taplitz S.J. and Herschman H.R. Butyrate-induced changes in nuclease sensitivity of chromatin cannot be corrlated with transcriptional activation// Mol. Cell Biol. 1987. V. 7. P. 3863-3870.

22. Brosseau G.E., Jr. Further evidence that bwD is a position effect// Dros. Inform. Serv. 1959. V. 33. P. 123.

23. Chen J.D., and Pirrotta V. Stepwise assembly of hyperaggregated forms of Drosophila zeste mutant protein suppresses white gene expression in vivo// The EMBO J. 1993. V. 12. P. 2061-2073.

24. Clark R.F., and Elgin S.C. Heterochromatin protein 1: a known suppressor of position effect variegation, is highly conserved in Drosophilall Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 6067-6074.

25. Clark S.H., and Chovnick A. Studies of normal and position- affected expression of rosy region genes in Drosophila melanogasterll Genetics. 1986. V. 114. P. 819-840.

26. Cleard F., Delattre M., Spierer P. SU(VAR)3-7, a Drosophila heterochromatin-associated protein and companion of HP1 in the genomic silencing of position-effect variegation// EMBO J. 1997. V. 16. P. 5280—5288.

27. Cleard F., Matsarskaia M, and Spierer P. The modifier of position effect variegation SU(VAR)3-7 of Drosophila: there are two alternative transcripts and seven scattered zinc fingers, each preceded by a triptophan box// Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 796-802.

28. Csink A.K. and Henikoff S. Genetic modification of heterochromatic association and nuclear organization in Drosophila melanogasterll Nature. 1996. V. 381. P. 529-531.

29. Demakova O.V., and Belyaeva E.S. Effect of mating direction on the position effect variegation of T(l;2)dorm'7 in Drosophila melanogasterll Dros. Inform. Serv. 1988. V. 67. P. 19-20.

30. Demakova O.V., Belyaeva E.S. and Zhimulev I.F. Genetical characteristics of loci in the 2B-region of Drosophila melanogaster X-chromosome under position effect variegation in T(l;2)dorvar7ll Dros. Inform. Serv. 1988.V. 67. P. 21-27.

258 18

31. Demerec M. and Slizynska H. Mottled white ' of Drosophila melanogasterll Genetics. 1937. V. 22. P. 641-649.

32. Devlin R.H., Bingham B. and Wakimoto B.T. The organization and expression of the light gene, a heterochromatic gene of Drosophila melanogasterll Genetics. 1990. V. 125. P. 129-140.

33. Dombradi V. and Cohen P.T.W. Protein phosphorylation is involved in the regulation of chromatin condensation during interphase// FEBBS Lett. 1992. V. 312. P. 21-26.

34. Dorer D.R. and Henikoff S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila!I Cell. 1994. V. 77. P. 993-1002.

35. Dorn R., Hyemann S., Lindigkeit R. and Reuter G. Suppressor mutation of position effect variegation in Drosophila melanogaster affecting chromatin properties// Chromosoma. 1986. V. 93. P. 398-403.

36. Dora R., Krauss V., Reuter G., and Saumweber H. The enchancer of position effect variegation of Drosophila, E(var)3-93D, codes for a chromatin protein containing a conserved domain common to several transcriptional regulators// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. V. 90. P. 11376-11380.

37. Dorn R., Krauss V., Reuter G., Saumweber H. The enhancer of position-effect variegation of Drosophila, E(var)3-93D, codes for a chromatin protein containing a conserved domain common to several transcriptional regulators// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 11376—11380.

38. Doshi P., Kaushal S., Benyajati C. and Wu C.-I. Molecular analysis of the Responder satellite DNA in Drosophila melanogaster. bending, nucleosome structure, and Rsp-binding proteins// Mol. Biol. Evol.. 1991. V. 8. P. 721-741.

39. Dreesen T.D., Henikoff S. and Loughney K. A pairing- sensitive element that mediates trans-inactivation is associated with Drosophila brown gene// Gens. Devel. 1991. V. 5. P. 331-340.

40. Dubinin N.P. and Sidorov B.N. Relation between the effect of a gene and its position in the system// Amer. Natur. 1934. V. 68. P. 377-381.

41. Eaton S. and Kornberg T.B. Repression of ciD in posterior compartments of Drosophila by engrailed// Genes Dev. 1990. V. 4. P. 1068-1077.

42. Eberl D.F., Duyf B.J. and Hilliker A.J. The role of heterochromatin in the expression of a heterochromatic gene, the rolled locus of Drosophila melanogasterll Genetics. 1993. V. 134. P. 277-292.

43. Eissenberg J.C., and Hartnett T. A heat shock-activated cDNA rescues the recessive lethality of mutations in the heterochromatin-associated protein HP1 of Drosophila melanogasterll Mol. Gen. Genet. 1993. V. 240. P. 333-338.

44. Eissenberg J.C., Elgin S.C.R. Boundary functions in the control of gene expression// Trends Genet. 1991. V. 7. P.335—340.

45. Eissenberg J.C., Elgin S.C.R. and Paro R. Epigenetic regulation in Drosophila: a conspiracy of silence. In "Chromatin structure and gene expression" 1995. (Elgin, S.C.R., ed.). P. 147-171, IRL Press, Oxford.

46. Eissenberg J.C., Ge Y.-W. and Hartnett T. Increased phosphorylation of HP1, a heterochromatin-associated protein of Drosophila, is correlated with heterochromatin assembly// J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 21315-21321.

47. Eissenberg J.C., James T.C., Foster-Hartnett D.M., Hartnett T., Ngan V. and Elgin S.C.R. Mutation in a heterochromatin-specific chromosomal protein is associated with suppression of position effect variegation in Drosophila melanogasterll Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. V. 87. P. 9923-9927.

48. Eissenberg J.C., Morris G.D., Reuter G. and Hartnett T. The heterochromatin -associated protein HP-1 is an essential protein in Drosophila with dosage-dependent effects of position effect variegation// Genetics. 1992. V. 131. P. 345352.

49. Elgin S.C.R. Heterochromatin and gene regulation in Drosophilall Curr. Opin. Genet. Developm. 1996. V. 6. P. 193-202.

50. Ephrussi B., and Sutton E. A reconsideration of the mechanism of position effect// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1944. V. 30. P. 183-197.

51. Farkas G., Gausz J., Galloni M., Reuter G., Gyurkovics H., Karch F. The Trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor// Nature. 1994. V. 371. P. 806—808.

52. Fauvarque M.-O. and Dura J.-M. Polyhomeotic regulatory sequences induce developmental regulator-dependent varigation and targeted P element insertion in Drosophila// Genes Devel. 1993. V. 7. P. 1508-1520.

53. Franke A., de Camillis M.A., Zink D„ Cheng N.. Brock H.W., Paro R. Polycomb and polyhomeotic are constituents of a multimeric protein complex in chromatin of Drosophila melanogaster!/ EMBO J. 1992. V. 11. P. 2941—2950.

54. Gall J.G., Cohen E.H., and Polan M.L. Repetitive DNA sequence in Drosophila// Chromosoma. 1971. V. 33. P. 319-344.

55. Gans M. Etude genetique et physiologique du mutant z de Drosophila melanogaster/7 Bull. Biol. France Belg. 1953. 38 (suppl.), 1-90.

56. Garzino V., Pereira A., Laurenti P., Graba Y., Levis R.W., Le Parco Y. and Pradel J. Cell lineage-specific expression of modulo, a dosage-dependent modifier of variegation in Drosophila// The EMBO J.1992. V. 11. P. 4471-4479.

57. Gatti M. and Pimpinelli S. Functional elements in Drosophila melanogaster heterochromatin// Annual Rev. Genet. 1992. V. 26. P. 239-275.

58. Gelbart W.M. Synapsis-dependent allelic complementation at the decapentaplegic gene complex in Drosophila melanogaster/7 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982 V. 79. P. 2636—2640.

59. Gerasimova T.I., Corces V.G. Boundary and insulator elements in chromosomes// Cur. Opin. in Genet. & Develop. 1996. V. 6. P. 185-192.

60. Gerasimova T.I., Gdula D.A., Gerasimov D.V., Simonova O. and Corces V.G. A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position effect variegation// Cell 1995. V. 82. P. 587-597.

61. Geyer P.K., Green M.M., Corces V.G. Tissue-specific transcriptional enhancers may act in trans on the gene located in the homologous chromosome: the molecular basis of transvection in Drosophila// EMBO J. 1990. V. 9. P. 2247— 2256.

62. Graba Y., Laurenti P., Perrin L., Aragnol L., Pradel J. The modifier of variegation modulo gene acts downstream of dorsoventral and HOM-C genes and is required for morphogenesis in Drosophila// Dev. Biol. 1994. V. 166. P. 704— 715.

63. Grell R.F. The Dubinin effect and the Y chromosome// Genetics 1959. V. 44. P. 911-922.

64. Grell R.F. The effect of X chromosome loss on variegation// Dros. Inform. Serv. 1958. V. 32. P. 124.

65. Grigliatti T. Position-effect variegation - an assay for nonhistone chromosomal proteins and chromatin assembly and modifying factors. In "Functional organization of the nucleus: a laboratory guide. Methods in Cell Biology" 1991. (B.A. Hamkalo, and S.C.R. Elgin, eds.), V. 35. P. 588-625. Academic Press, San Diego.

66. Hammond M.P.and Laird C.D. Chromosome structure and DNA replication in nurse and follicle cells of Drosophila melanogaster// Chromosoma. 1985. V. 91. P. 267-278.

67. Hartmann-Goldstein I. On the relationship between heterochromatization and variegation in Drosophila, with special reference to temperature sensitive periods// Genet. Res. Camb. 1967. V. 10. P. 143-159.

68. Hayashi S., Ruddell A., Sinclair D. and Grigliatti T. Chromosomal structure is altered by mutations that suppress or enhance position effect variegation// Chromosoma. 1990. V. 99. P. 391-400.

69. Hearn M.G., Hedrick A., Grigliatti T.A. and Wakimoto B.T. The effect of modifiers of position-effect variegation on the variegation of heterochromatic genes of Drosophila melanogaster!I Genetics. 1991. V. 128. P. 785-797.

70. Henderson D.S., Banga S.S., Grigliatti T. and Boud J.B. Mutagen sensitivity and suppression of position-effect variegation result from mutations in mus 209, the Drosophila gene encoding PCNA// The EMBO J. 1994. V. 13. P. 1450-1459.

71. Henikoff S. A reconsideration of the mechanism of position effect// Genetics. 1994. V. 138. P. 1-5.

72. Henikoff S. Position effect variegation in Drosophila: recent progress. In "Epigenetic mechanisms of gene regulation"// 1996. P. 319-334. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

73. Henikoff S. Position-effect variegation and chromosome structure of a heat shock puff in Drosophila// Chromosoma. 1981. V. 83.P. 381-393.

74. Henikoff S. and Dreesen T.D. Trans-inactivation of the Drosophila brown gene: evidence for transcriptional repression and somatic pairing dependence// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989. V. 86. P. 6704-6708.

75. Henikoff S., Loughney K. and Dreesen T.D. The enigma of dominant position effect variegation in Drosophila. In "The chromosome" (Heslop-Harrison, J.S., Flavell, R.B., eds.) 1993. P. 183-196. BIOS Scientic Publishing, Oxford.

76. Hessler A.Y. A study of parental modification of variegated position effect// Genetics. 1961. V. 46. P. 463-484.

77. Hessler A.Y. V-type position effect at the light locus in Drosophila melanogaster// Genetics. 1958. V. 43. P. 395-403.

78. Hilliker A.J. Variegation of a heterochromatic gene in Drosophila melanogaster -the light locus// Genetics. 1980. V. 94, N 4(2). P. 44.

79. Hilliker A.J. and Appels R. Pleiotropic effects associated with the deletion of heterochromatin surrounding rDNA on the X chromosome of Drosophila// Chromosoma. 1982. V. 86. P. 469-490.

80. Hilliker A.J. and Sharp C.B. New perspectives on the genetic and molecular biology of constitutive heterochromatin. In "Chromosome structure and function" (J.P. Gustafson, R. Appels, R. Kaufman, eds.), 1988. P. 91-115. Plenum Publishing Corp., New York.

81. Hochman B. The fourth chromosome of Drosophila melanogaster// In: Ashburner M, Novitski E. (eds.) The genetics and biology of Drosophila. 1976. V. lb. Acad. Press. New York. P. 903-928.

82. Hochstrasser M., Mathog D., Gruenbaum Y., Saumweber H. and Sedat J.W. Spatial organization of chromosomes in the salivary gland nuclei of Drosophila melanogaster// J. Cell. Biol. 1986. V. 102. P. 112-123.

83. Hooper J.E. and Scott M.P. The Drosophila patched gene encodes a putative membrane protein required for segmental patterning// Cell. 1989. V. 59. P. 751— 765.

84. Howe M., Dimitri P., Berloco M. and Wakimoto B.T. Cis-effects of heterochromatin on heterochromatic and euchromatic gene activity in Drosophila melanogaster// Genetics. 1995. V. 140. P. 1033-1045.

85. Jack J.W. and Judd B.H. Allelic pairing and gene regulation: a model for the zeste-white interaction in Drosophila melanogaster!I Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1979. V. 76. P. 1368-1372.

86. James T.C. and Elgin S.C.R. Identification of a nonhistone chromosomal protein associated with heterochromatin in Drosophila melanogaster and its gene// Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 3862-3872.

87. James T.C., Eissenberg J.C., Craig C., Dietrich V., Hobson A. and Elgin S.C.R. Distribution patterns of HP1, a heterochromatin-associated nonhistone chromosomal protein of Drosophilall Europ. J. Cell. Biol. 1989. V. 50. P. 170180.

88. Jamrich M., Greenleaf A.L. and Bautz E.K.F. Localization of RNA-polymerase in Drosophila melanogaster polytene chromosomes// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977a. V. 74. P. 2079-2083.

89. Judd B.H. Mutations of zeste that mediate transvection are recessive enhancers of position effect variegation in Drosophila melanogaster!! Genetics. 1995. V. 141. P. 245-253.

90. Judd B.H. Transvection: allelic cross talkI! Cell. 1988. V. 53. P. 841-843.

91. Kapoun A.M., Kaufman T.C. Regulatory regions of the homeotic gene probosci-pedia are sensitive to chromosomal pairing// Genetics. 1995. V. 140. P. 643— 658.

92. Karch F., Galloni M., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H. and Schedl P. Mcp and Fab-7: molecular analysis of putative boundaries if ds-regulatoty domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster!'/ Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. P. 3138-3146.

93. Karpen G.H. Position effect variegation and the new biology of heterochromatin// Curr. Opin. Genet. Devel. 1994. V. 4. P. 281-291.

94. Karpen G.H., and Spradling A.C. Analysis of subtelomeric heterochromatin in a Drosophila microchromosome Dpi 187 by single P element insertional mutagenesis// Genetics 1992. V. 132. P. 737-753.

95. Karpen G.H. and Spradling A.C. Reduced DNA polytenization of a minichromosome region undergoing position effect variegation in Drosophilall Cell. 1990. V. 63. P. 97-107.

96. Karpen G.H., Schaefer J.E. and Laird C.D. A Drosophila rRNA gene located in euchromatin is active in transcription and nucleolus formation// Genes and Development. 1988. V. 2. P. 1745-1763.

97. Kassis J.A., Van Sickle E.P. and Sensabaugh S.M. A fragment if engrailed regulatory DNA can mediate transvectin of the white gene in Drosophila// The EMBO J. 1991. V. 12. P.435-442.

98. Kaufman T.C., Tasaka S.E., Suzuki D.T. The interaction of two complex loci zeste and bithorax in Drosophila melanogaster// Genetics. 1973. V. 75. P. 299— 321.

99. Kellum R. and Alberts B.M. Heterochromatin protein 1 is required for correct chromosomes segregation in Drosophila embryos// J. Cell. Sci. 1995. V. 108. P. 1419-1431.

100. Kellum R., Raff J.W. and Alberts B.M. Heterochromatin protein 1 distribution during development and during the cell cycle in Drosophila embryos// J.Cell. Sci. 1995. V. 108. P. 1407-1418.

101. Kennison J.A. Transcriptional activation of Drosophila homeotic genes from distant regulatory elements// Trends Genet. 1993. V. 9. P. 75—79.

102. Khvostova V.V. Role of the inert parts of chromosomes in the position effect of the cubitus interruptus gene in Drosophila melanogaster!I Izvestia AN SSSR, 1939. ser. biol nauk. N4, 541-574. [In Russian].

103. King R.C., Riley S.F., Cassidy J.D. et al., Giant polytene chromosomes from the ovaries of a Drosophila mutant// Science. 1981. V. 212. P. 441-443.

104. Klug W.S., King R.C., Wattiaux J.M. Oogenesis in suppressor2 of Hairy-wing mutant of Drosophila melanogaster. II. Nucleolar morphology and in vitro studies of RNA protein synthesis// J. Exptl. Zool. 1970. V. 174. P. 125—140.

105. Kornher J.S. and Kauffman S. Variegated expression of the Sgs-4 locus in Drosophila melanogaster!I Chromosoma. 1986. V. 94. P. 205-216.

106. Koryakov D.E., Belyaeva E.S., Alekseyenko A.A. and Zhimulev I.F. Alpha- and beta-heterochromatin in polytene chromosome 2 of Drosophila melanogaster!! Chromosoma. 1996. V. 105. P. 310-319.

107. Krejci E., Garzino V., Mary C., Bennani N. and Pradel J. Modulo, a new maternally expressed Drosophila gene encodes a DNA binding protein with distinct acidic and basic regionsII Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 8101-8115.

108. Larsson J., Zhang J. and Rasmuson-Lestander A. Mutations in the Drosophila melanogaster gene encoding S-adenosylmethilionine suppress position-effect variegation// Genetics. 1996. V. 143. P. 887-896.

109. Le M.H., Duricka D. Karpen G.H. Islands of complex DNA are widespread in Drosophila centric heterochromatin// Genetics. 1995. V. 141. P. 283-303.

110. Leiserson W.M., Bonini N.M., Benzer S. Transvection at the eyes absent gene of Drosophila/! Genetics. 1994. V. 138. P. 1171—1179.

111. Levinger L. Nucleosomal structure of two Drosophila melanogaster simple satellites//J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 11799-11804.

112. Lewis E.B. The phenomenon of position effect// Advances in genetics// 1950. V. 3. P. 73-115.

113. Lewis E.B. The theory and application of a new method of detecting chromosomal rearrangements in Drosophila melanogaster!7 Amer. Natur. 1954. V. 88. P. 225-239.

114. Lindsley D.L. and Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster!7 Academic Press, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto. 1992.

115. Locke J. and Tartof K.D. Molecular analysis of cubitus interruptus (ci) mutations suggests an explanation for the unusual ci position effects// Mol. Gen. Genet. 1994. V. 243. P. 234-243.

116. Locke J., Kotarski M.A. and Tartof K.D. Dosage-dependent modifiers of position effect variegation in Drosophila and a mass action model that explains their effect. Genetics. 1988. V. 120. P. 181-198.

117. Lohe A.R., Hilliker A.J. and Roberts P.A. Mapping simple repeated DNA sequences in heterochromatin of Drosophila melanogasterll Genetics. 1993. V. 134. P. 1149-1174.

118. Lu B.Y., Bishop C.P., Eissenberg J.C. Developmental timing and tissue specificity of heterochromatin-mediated silencing// The EMBO J. 1996. V. 15. P. 1323—1332.

119. Mal'ceva N.I., and Zhimulev I.F. Extent of polyteny in the pericentric heterochromatin of polytene chromosomes of peudonurse cells of otu (ovarian tumor) mutants of Drosophila melanogasterll Mol. Gen. Genet. 1993. V. 240. P. 273-276.

120. Mal'ceva N.I., Belyaeva E.S., King R.C. and Zhimulev I.F. Nurse cell polytene chromosomes of Drosophila melanogaster otu mutants: morphological changes under interallelic complementation and position effect variegation// Dev. Genet. 1997. V. 20. P. 163-174.

121. Moore G.D., Sinclair D.A. and Grigliatti T.A. Effect of histone gene multiplicity on position effect variegation in Drosophila!I Genetics. 1981. V. 97. P. 75-76.

122. Mottus R., Reeves R. and Grigliatti T.A. Butyrate suppression of position-effect variegation in Drosophila melanogasterll Mol. Gen. Genet. 1980. V. 178. P. 465-469.

123. Muller H.J. Types of visible variations induced by X-rays in Drosophila!I J. Genet. 1930. V. 22. P. 299-334.

124. Nusslein-Volhard C. and Wieschaus E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila!! Nature. 1980. V. 287. P. 795-801.

125. O'Kane C.J. and Gehring W.J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila!/ Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987. V. 84. P. 9123-9127.

126. Orenic T.V., Slusarski D.C., Kroll K.L. and Holmgren R.A. Cloning and characterization of the segment polarity gene cubitus interruptus Dominant of Drosophila// Genes Devel. 1990. V. 4. P. 1053-1067.

127. Orlando V., Paro R. Chromatin multiprotein complexes involved in the maintenance of transcription patterns// Curr. Opin. Genet. Dev. 1995. V. 5. P. 174— 179.

128. Paro R. Imprinting a determined state into the chromatin of Drosophila!I Trends in Genet. 1990. V. 6. P. 416-421.

129. Pimpinelli S., Berloco M., Dimitri P., Bonaccorsi S., Marchetti E., Caizzi R., Caggese C. and Gatti M. Transposable elements are stable structural components of Drosophila melanogaster heterochromatin// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. V. 92. P. 3804-3808.

130. Pirrotta V. The genetics and molecular biology of zeste in Drosophila melanogaster// Adv. Genet. 1991. V. 29. P. 301-348.

131. Pirrotta V., Bickel S., Mariani C. Developmental expression of the Drosophila zeste gene and localization of zeste protein on polytene chromosomes// Genes Dev. 1988. V. 2. P. 1839—1850.

132. Pirrotta V., Rastelli L. white gene expression, repressive chromatin domains and homeotic gene regulation in Drosophila// BioEssays. 1994. V. 16. P. 549—556.

133. Pirrotta V., Steller H. and Bozzetti M.P. Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene// The EMBO J. 1985. V. 4. P. 3501—3508.

134. Pisano C. and Dimitri P. Suppression of position effect variegation by the Y chromosome heterochromatin in Drosophila melanogaster/'/ Atti. Assoc. Genet. Ital. 1984. V. 30. P. 181-182.

135. Platero J.S., Hartnett T. and Eissenberg J.C. Functional analysis of the chromo domain of HP1 // The EMBO J. 1995. V. 14. P. 3977-3986.

136. Pokholkova G.V., Makunin I.V., Belyaeva E.S. and Zhimulev I.F. Observations on the induction of position effect variegation of euchromatic genes in Drosophila melanogaster!/ Genetics. 1993. 134, 231-242.

137. Poole S.J., Kauvar L.M., Drees B., Kornberg T.B. The engrailed locus of Dro-sophila: structural analysis of an embryonic transcript// Cell. 1985. V. 40. P. 3743.

138. Raff J.W., Kellum R. and Alberts B. The Drosophila GAGA transcription factor is associated with specific regions of heterochromatin throughout the cell cycle// The EMBO J. 1994. V. 13. P. 5977-5983.

139. Rastelli L., Chan C.S. and Pirrotta V. Related chromosome binding sites for zeste, suppressors of zeste and Polycomb group proteins in Drosophila and their dependence on Enhancer of zeste function// The EMBO J. 1993. V. 12. P. 1513—1522.

140. Reuter G., and Spierer P. Position effect variegation and chromatin proteins// BioEssays. 1992. V. 14. P. 605-612.

141. Reuter G., and Wolff I. Isolation of dominant suppressor mutations for position-effect variegation in Drosophila melanogaster// Mol. Gen. Genet. 1981. V. 182. P. 516-519.

142. Reuter G., Dorn R., Wustmann G., Friede B. and Rauh G. Third chromosome suppressor of position-effect variegation loci in Drosophila melanogaster!I Mol. Gen. Genet. 1986. V. 202. P. 481-487.

143. Reuter G., Giarre M., Farah J., Gausz J., Spierer A. and Spierer P. Dependence of position-effect variegation in Drosophila on dose of a gene encoding an unusual zinc-finger protein// Nature. 1990. V. 344. P. 219-223.

144. Reuter G., Werner W., and Hoffmann H.J. Mutants affecting position-effect heterochromatinization in Drosophila melanogaster!! Chromosoma. 1982. V. 85. P. 539-551.

145. Reuter G., Wolff I. and Friede B. Functional properties of the heterochromatic sequences inducing wm4 position-effect variegation in Drosophila melanogaster!! Chromosoma. 1985. V. 93. P. 132-139.

146. Ritossa F.M. Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1968. V. 60. P. 509-516.

147. Ritossa F.M. and Spiegelman S. Localization of DNA complementary to ribosomal RNA in the nucleolus organizer region of Drosophila melanogasterll Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1965. V. 53. P. 737-744.

148. Roberts P.A. A possible case of position effect on DNA replication in Drosophila melanogasterll Genetics 1972. V. 72. P. 607-614.

149. Roseman R.R., Pirrotta V., Geyer P.K. The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects// EMBO J. 1993. V. 12. P. 435—442.

150. Rushlow C.A., Bender W. and Chovnick A. Studies on the mechanism of heterochromatic position effect at the rosy locus of Drosophila melanogasterll Genetics. 1984. V. 108. P. 603-615.

151. Sabl J. and Henikoff S. Copy number and orientation determine the susceptibility of a gene to silencing by nearby heterochromatin in Drosophilall Genetics. 1996. V. 142. P. 447-458.

152. Saumweber H., Symmons P., Kabisch R., Will H. and Bonhoeffer F. Monoclonal antibodies against chromosomal proteins of Drosophila melanogaster. Establishment of antibody producing cell lines and partial characterization of corresponding antigens// Chromosoma. 1980. V. 80. P. 253-275.

153. Schneider I. Modification of V-type position effects in Drosophila virilisll Genetics. 1962. V. 47. P. 25-44.

154. Schultz J. and Dobzhansky Th. The relation of a dominant eye color in Drosophila melanogaster to the associated chromosome rearrangement// Genetics. 1934. V. 19. P. 344-364.

155. Schwartz C., Kornberg T.B. Getting from A to P in imaginal discs: reconstructing a transcriptional switch// A. Conf. Dros. Res. 38. 1997. P. 157B.

156. Schwartz C., Locke J., Nishida C. and Kornberg T.B. Analysis of cubitus interruptus regulation in Drosophila embryos and imaginal disks// Dev. V. 1995. 121. P. 1625-1635.

157. Sigrist C.J., Pirrotta V. Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) but allow trans

interactions between PREs on different chromosomes// Genetics. 1997. V. 147. P. 209—221.

158. Silver L. and Elgin S.C.R. Immunological analysis of protein distribution in Drosophila polytene chromosomes// Cell nucleus. 1978. V. 5. P. 215-262.

159. Singh P.B. Molecular mechanisms of cellular determination: their relation to chromatin structure and parental imprinting// J. Cell Sci. 1994. V. 107. P. 26532668.

160. Slatis H.M. Position effects at the brown locus in Drosophila melanogasterll Genetics. 1955. V. 40. P. 5-23.

161. Slusarski D.C., Motzny C.K. and Holmgren R. Mutations that alter the timing and pattern of cubitus interruptus gene expression in Drosophila melanogasterll Genetics. 1995. V. 139. P. 229-240.

162. Smolik-Utlaut S.M., Gelbart W.M. The effects of chromosomal rearrangements on the zeste-white interaction in Drosophila melanogasterll Genetics. 1987. V. 116. P. 285—298.

163. Spofford J.B. Position-effect variegation in Drosophila!I In "The genetics and biology of Drosophila" (M. Ashburner, E. Novitski, eds.). 1976. V. lc. P. 9551018. Academ. Press, London, New York, San Francisco.

164. Spofford J.B. and DeSalle R. Nucleolus organizer-suppressed position-effect variegation in Drosophila melanogasterll Genet. Res. 1991. V. 57. P. 245-255.

165. Stern C. and Heidenthal G. Materials for the study of the position effect of normal and mutant genes// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1944. V. 30. P. 197205.

166. Stern C., Kodani M. Studies on the position effect the cubitus interruptus locus of Drosophila melanogaster// Genetics. 1955. Vol. 40. P. 343-373.

167. Strutt H., Cavalli G. and Paro R. Co-localization of polycomb protein and GAGA factor on regulatory elements responsible for the maintenance of homeotic gene expression// EMBO J. 1997. V. 16. P. 3621—3632.

168. Talbert P.B., LeCiel C.D.S. and Henikoff S. Modification of the Drosophila het-erochromatic mutation brownDominant by linkage alterations// Genetics. 1994. V. 136. P. 559-571.

169. Tartof K.D., Hobbs C., and Jones M. A structural basis for varigating position effects// Cell. 1984. Vol. 34. P. 869-878.

170. Tiniakov G.G. and Terentieva E.L. Cubitus interruptus, a new genovariation of the fourth chromosome of Drosophila melanogasterII Genetics. 1933. V. 18. P. 117-120.

171. Traverse K.L. and Pardue M.L. Studies of He-T DNA sequences in the pericentric regions of Drosophila chromosomes// Chromosoma. 1989. V. 97. P. 261-271.

172. Tschiersch B., Hofmann A., Krauss V., Dorn R., Korge G. and Reuter G. The protein encoded by the Drosophila position-effect variegation suppressor gene Su(var)3-9 combines domains of antagonistic regulators of homeotic gene complexes// EMBO J. 1994. V. 13. P. 3822—3831.

173. Umbetova G.H., Belyaeva E.S. and Zhimulev I.F. Incomplete polytenization of a chromosome region under position effect variegation in Drosophila melanogaster!I Doklady AN SSSR 1990. 313, N 2, 462-465. [In Russian],

174. Umbetova G.H., Belyaeva E.S., Baricheva E.M. and Zhimulev I.F. Cytogenetic and molecular aspects of position effect variegation in Drosophila melanogaster. IV. Underreplication of chromosomal material as a result of gene inactivation// Chromosoma. 1991. V. 101. P. 55-61.

175. Wakimoto B. and Hearn M. The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster!I Genetics. 1990. V. 125. P. 141-151.

176. Wallrath L.L. and Elgin S.C.R. Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure// Genes Devel. 1995. V. 9. P. 1263-1277.

177. Wallrath L.L., Guntur V.P., Rosman L.E. and Elgin S.C.R. DNA representation of variegating heterochromatic P-element inserts in diploid and polytene tissues of Drosophila melanogaster// Chromosoma 1996. V. 104. P. 519-527.

178. Weiler K.S. and Wakimoto B.T. Heterochromatin and gene expression in DrosophilaII Annu. Rev. Genet. 1995. V. 29. P. 577-605.

179. Wu C.-I., True J.R. and Johnson N. Fitness reduction associated with the deletion of a satellite DNA array// Nature. 1989. V. 341. P. 248-251.

180. Wu C.T. Transvection, nuclear structure, and chromatin proteins// J. Cell Biol. 1993. V. 120. P. 587-590.

181. Wustmann G., Szidonya J., Taubert H. and Reuter G. The genetics of position-effect variegation modifying loci in Drosophila melanogaster!I Mol. Gen. Genet. 1989. V. 217. P. 520-527.

182. Zhang P. and Spradling A.C. Insertional mutagenesis of Drosophila heterochromatin with single P elements// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 3539-3543.

183. Zhimulev I.F. Polytene chromosomes, heterochromatin and position effect variegation// Adv. in Genet. 1997. V. 34. P. 1184. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Bgatov A.V., Baricheva E.M. and Vlassova I.E.

Cytogenetic and molecular aspects of position effect variegation in Drosophila melanogaster. II. Peculiarities of morphology and genetic activity of the 2B region in the T(l;2)dormr? chromosome in males// Chromosoma. 1988. V. 96. P. 255-261.

185. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Fomina O.V., Protopopov M.O. and Bolshakov V.N. Cytogenetic and molecular aspects of position effect variegation in Drosophila melanogaster. I. Morphology and genetic activity of the 2AB region in chromosome rearrangement T( 1 ;2)dorvar?.// Chromosoma. 1986. V. 94. P. 492-504.

186. Zucherkandl E. A possible role of "inert" heterochromatin in cell differentiation. Action of and competition for locking molecules// Biochimie. 1974. V. 56. P. 937-954.

187. Zucherkandl E. and Hennig W. Tracking heterochromatin// Chromosoma. 1995. V. 104. P. 75-83.