Топология компонентов конденсинового комплекса в оогенезе шпорцевой лягушки Xenopus Laevis и морского ежа Paracentrotus Lividus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Картавенко, Татьяна Владимировна

• Картавенко, Татьяна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Картавенко, Татьяна Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структурная организация SMC-белков.

Функции SMC-белков:

SMC2/SMC4: конденсация митотических хромосом.

SMC1/SMC3: когезия сестринских хроматид.

SMC-белки: репарация и рекомбинация ДНК. 15 SMC-белки: регуляция генной экспрессии.

Компенсация дозы гена.

Ядрышко:

Структурно-функциональная организация ядрышка.

Белки ядрышка.

Кольчатые тельца.

Структура и динамика ядрышек ооцитов морского ежа

Paracentrotus lividus в оогенезе.

Особенности организации ооцитов шпорцевой лягушки

Xenopus laevis.

Хромосомы типа «ламповых щеток».

SMC-белки в мейозе.

Задачи работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

I. Объекты исследования

2. Выделение хромосом типа «ламповых щеток» из ооцитов X. laevis.

3. Воздействие актиномицина Д.

4. Иммуноцитохимическая окраска препаратов хромосом типа «ламповых щеток» X. laevis.

5. Получение фракции изолированных ооцитов морского ежа.

6. Получение фракций 2-4 бластомеров и поздней гаструлы P.lividus.

7. Диссоциация клеток гаструлы P. lividus.

8. Получение хромосомных препаратов из бластомеров.

9. Гибридизация in situ.

10. Электрофорез белков и иммуноблотинг.

11. Иммуноцитохимический анализ локализации конденсинов в клетках морского ежа.

12. Иммуноэлектрон/шя микроскопия ооцитов и клеток гаструлы морского ежа с применением метода серебряного усиления сигнала от наночастиц золота.

13. Выявления ядрышкового организатора по методу окрашивания AgN02.

14. Развитие морского ежа P.lividus в присутствие глутарового альдегида.

15. Выделение тотальной РНК и полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Топология компонентов конденсинового комплекса в оогенезе шпорцевой лягушки Xenopus Laevis и морского ежа Paracentrotus Lividus»

Хромосомы эукариотических организмов состоят из молекул ДНК, которые находятся в сложных межмолекулярных взаимодействиях с многочисленными белками. В процессе исследования этих взаимодействий был открыт новый класс пегистоновых белков, получивших название SMC-белки (Structural Maintenance of Chromosomes) (Strunnikov et al., 1993; Hirano and Mitchison, 1994). Показано, что SMC-белки существуют в виде гетеродимеров различного состава - SMC2/SMC4 и SMC1/SMC3. В клетках дрожжей, амфибий и млекопитающих гетеродимер SMC2/SMC4 участвует в митотической конденсации хромосом (Hirano and Mitchison, 1994; Saka et al., 1994), а гетеродимер SMC1/SMC3 - в когезии сестринских хроматид и в репарации ДНК (Jessberger et al., 1998).

Впервые SMC-белки были выделены в составе белкового комплекса из экстракта яиц шпорцевой лягушки Xenopus laevis, который назвали конденсиновым комплексом. 13S-конденсиновый комплекс состоит из двух субкомплексов: 8S (коровый) и 11S (регуляторный). SS-комплекс представлен двумя SMC-субъединицами (SMC2\XCAP-E и SMC4VXCAP-C), которые образуют димер. llS-комплекс представлен тремя белками, не относящимися к классу SMC-белков (XCAP-D2\Eg7, ХСАР-Н и XCAP-G) (Strunnikov et al., 1995; Hirano et al., 1997; Kimura et al., 1997; Losada et al., 1998).

138-копденсиновый комплекс локализуется в осевых районах сестринских хроматид митотических хромосом, и, по-видимому, принимает участие в поддержании их компактной структуры (Hirano and Mitchison, 1994).

В то же время, представления о функциональной роли конденсипов противоречивы.

Их участие в конденсации хромосом в митозе было показано в системе in vitro с использованием экстракта яиц Xenopus laevis и в делящихся клетках дрожжей (Hirano and

Mitchison, 1994; Saka et al., 1994; Strunnikov et al., 1995; Lavoie et al., 2000; 2002). Однако в некоторых организмах инактивация копденсинов не приводит к видимым нарушениям в структуре хромосом, что свидетельствует о возможном существовании альтернативных путей компактизации ДНК в митозе (Steffensen et al., 2001; Hangstrom et al., 2002; Hirota et al., 5

2004).

Также существует ряд работ, которые указывают на возможную ключевую роль коиденсинов в процессах конденсации хромосом в мейозе у дрожжей S. cerevisiae (Yu et al., 2003) и у X.laevis (Beenders et al., 2003). Таким образом, не смотря на имеющиеся данные, вопрос об участии конденсинового комплекса в компактизации как митотических, так и мейотических хромосом остается открытым.

Ситуация осложняется тем, что функции SMC-белков не исчерпываются их участием (косвенным или прямым) в конденсации хромосом и когезии сестринских хроматид. Недавно было показано, что субъединицы конденсинового комплекса полифункциональны. В частности, они могут играть роль в регуляции транскрипции, контролируя структурное состояние хроматина: комплекс, содержащий SMC-белки, специфически связывается с X-хромосомами нематоды C.elegans, что приводит к снижению уровня экспрессии генов (Chuang et al., 1994). Кроме этого, представители конденсинового комплекса обнаружены в составе ядрышек интерфазпых клеток (Cabello et al., 2001; Тимирбулатова и др., 2002; Beenders et al., 2003). В настоящее время существуют две основные гипотезы, объясняющие присутствие конденсинового комплекса в ядрышках иптерфазных клеток. По одной из гипотез конденсины участвуют в структурных модификациях хроматина, связанных с активацией генов, кодирующих рибосомную РНК (рРНК) (Cabello et al., 2001). Эта гипотеза согласуется с данными, полученными методом иммунопреципитации, по которым в клетках S.cerevisiae конденсины ассоциированы с рибосомальной ДНК (рДНК) (Freeman et al., 2000). Альтернативная гипотеза предполагает, что белок конденсинового комплекса, ХСАР-Е, рекрутируется в виде комплекса на частицах, содержащих малые ядерные РНК (мя РНК) в гранулярном компоненте ядрышка, для участия в одном из этапов процессинга рРНК (Тимирбулатова и др., 2002; Uzbekov et al., 2003). К сожалению, нет однозначного ответа на вопрос с какими биологическими молекулами (ДНК, РНК или белки) связан конденсиновый комплекс или отдельные субъединицы конденсинового комплекса в ядрышке интерфазных клеток.

Подводя итог краткому изложению данных о роли кондеисииов, можно заключить, что на сегодняшний день их функции, как в процессе конденсации митотических и мейотических хромосом, так и в интерфазных ядрах, остаются не выясненными.

В связи с вышесказанным, основной целью настоящей работы явилось исследование структурно-функциональной роли конденсинового комплекса в ядрышках и в мейотических хромосомах.

Обзор литературы.

Роль ДНК в составе как иптерфазных хромосом, так и митотических хромосом заключается в хранении и реализации генетической информации. Однако для выполнения этих функций в составе интерфазных ядер необходимо иметь четкую структурную основу, которая позволяла бы расположить огромные по длине молекулы ДНК в строгом порядке, чтобы с определенной временной последовательностью протекали процессы, как синтеза РНК, так и редупликация ДНК. В среднем па иптерфазпое ядро млекопитающих приходится около 2м ДНК. Это значит, что такая огромная масса ДНК должна быть уложена с коэффициентом упаковки lxlO3 — lxlO4. До сих пор остается невыясненным каким образом такая гигантская по длине молекула ДНК укладывается в хромосому.

В течение последних лет описаны и частично охарактеризованы различные структурные белки, которым приписывается решающая роль в специфической компактизации хроматина в составе митотических хромосом. К таким белкам относятся SMC-белки (Structural Maintenance of Chromosomes) (Strunnikov et al., 1993; Hirano and Mitchison, 1994). Было установлено, что хромосомная конденсация и когезия сестринских хроматид регулируется структурно сходными белковыми комплексами, в состав которых входят SMC-белки. Эти белковые комплексы были названы конденсинами и когезинами, соответственно (Hirano et al., 1994; Saka et al., 1994; Jessberger et al., 1996; Chuang et al., 1994, 1996).

Структурная организация SMC-белков.

Молекулярная масса SMC-белков колеблется в пределах от 110 до 170 кДа (Strunnikov et al., 1999). Первичная структура SMC-белков представлена пятью разными доменами. Два нуклеотид-связывающие мотива, Walker А и Walker В, локализуются в высококонсервативных глобулярных N- и С-концевых доменах и обладают АТФ-связывающей и гидролизирующей способностями, соответственно (Hirano et al., 2001). N- и С-концевые домены соединены длинным а-спиральным доменом, содержащим повторы, характерные для участков, способных образовывать так называемые «coiled-coil» структуры (Strunnikov , 1998; Jessberger et al., 1998).

Центральный a - спиральный домен разделен на два субдомена коротким шарнирным участком, присутствие которого позволяет молекуле SMC-белка изгибаться (Melby et al., 1998). Такая структурная организация SMC-белков способствует образованию гомо- и гетеродимеров (Strunnikov, 1998; Jessberger et al., 1998), имеющих V-образную форму (Melby et al., 1998; Anderson et al., 2002).

Схема №1. Общая схема строения SMC-белков.

ЛТР-связывание Димеризация DNA-связывание

N С

Coiled-coil Coiled-coil

200-450 ак шарнирный 200-450 ак участок

Предполагают две модели димеризации SMC-белков. Согласно первой модели, образование димера осуществляется за счет «coiled-coil» взаимодействий между двумя разными субъединицами (схема №2, В) (Melby et al., 1998) и согласно второй модели, две субъединицы димеризуются посредством взаимодействий шарнирных участков (схема №2, A) (Hirano et al., 2001). И в том, и в другом случаях, N- и С-концевые домены располагаются антипараллельно.

Схема №2. Модели образования димеров SMC-белков.

В настоящий момент идентифицировано три типа димеров, отличающихся составом SMC-субъединиц - SMC1/SMC3, SMC2/SMC4 и SMC5/SMC6. Эти гетеродимеры связываются с другими не-SMC белками, образуя белковые комплексы, которые выполняют разные функции в клетках различных организмов. Связь с другими белками, не относящимися к классу SMC, осуществляется за счет структурных мотивов у данных белков, так называемых, НЕАТ-повторов (Neuwald and Hirano; 2000). НЕАТ-повторы представляют собой тандемные повторы а - хеликазной структурной единицы, которая способна узнавать белок соленойдной формы (Kobe and Kajava, 2000).

Функции SMC-белков.

В клетках дрожжей и млекопитающих SMC1/SMC3 содержащий белковый комплекс участвует в когезии сестринских хроматид и в репарации ДНК (Jessberger et al., 1998). Гетеродимер SMC2/SMC4 - участвует в митотической конденсации хромосом (Hirano, Mitchison, 1994; Saka et al., 1994), a SMC5/SMC6 гетеродимер принимает участие в репарации ДНК дрожжей (Taylor et al., 2001; Hirano, 2002).

SMC2/SMC4: конденсация митотических хромосом.

В экстракте яиц X.laevis ИБ-конденсиновый комплекс связывается с хромосомами в митозе и необходим для установления и поддержания конденсированного состояния митотических хромосом. При этом ни SMC-гетеродимер, ни другие субъединицы кондеисинового комплекса независимо друг от друга не способны вызывать конденсацию хромосом в клеточном экстракте, что свидетельствует о функциональной взаимосвязи всех пяти субъединиц 138-конденсина (Kimura and Hirano, 2000). В экстракте яиц X.laevis конденсины связываются с хромосомами и участвуют в поддержании компактного состояния хромосом в митозе (Hirano and Mitchison, 1994; Hirano et al., 1997). Генетические исследования показали, что мутации в генах, кодирующих SMC2 субъединицы конденсина, вызывают нарушения в сегрегации хромосом в анафазе и в конденсации хромосом (Koshland and Strunnikov, 1996; Hirano 2000; Lavoie et al., 2000; Wignall et al., 2003). Так, в экстракте яиц X. laevis при связывании кондеисинового комплекса со специфическими антителами происходит нарушение конденсации хромосом в системе in vitro, а их добавление приводит к восстановлению нормальной структуры хромосом (Hirano and Mitchison, 1994; Hirano et al., 1997; Cubizolles et al., 1998; Wignall et al., 2003).

He смотря на то, что до сих пор неясно, как фибриллы хроматина организуются в хроматиды (Swedlow and Hirano, 2003), многочисленные цитологические исследования подтверждают, что финальные стадии конденсации митотических хромосом могут включать сматывание, скручивание профазных хроматиновых фибрилл (Dietzel and Belmont, 2001). В клетках позвоночных был идентифицирован второй конденсиновый комплекс, конденсин II (Ono et al., 2003). Конденсин II состоит из двух SMC-субъединиц, входящих в состав канонического ПБ-конденсинового комплекса (конденсин I), но содержит другой набор дополнительных не-SMC субъединиц (CAP-D3, -G2 и-Н2). Показано, что два конденсиновых комплекса по-разному располагаются в осевых районах хромосом, и мутации генов, кодирующих конденсины I и II, вызывают разные изменения в структуре метафазных хромосом (Ono et al., 2003).

Предполагается, что конденсины I и II участвуют в различных преобразованиях хромосом в течение клеточного цикла. Конденсин II связан с интерфазным хроматином, в то время как конденсин I ассоциируется с хромосомами только в прометафазе. В данном случае конденсин I является первостепенным организатором фибрилл хроматина, а конденсин II

11 играет дополнительную роль и участвует в поддержании конечной архитектуры метафазных хромосом (Ono et al., 2003; Ono and Hirano, 2004).

Фосфорилирование и регуляция копденсинов: Работа конденсинов в клеточном цикле S. pombe регулируется за счет cdc2-3aBHCHMoro фосфорилирования (Sutani et al., 1999; Freeman et al., 2000). Для высших эукариот механизм регуляции остается окончательно невыясненным. Известно, что в экстракте яиц X.laevis все субъединицы 11S субкомплексов конденсинов фосфорилируются cdc2/cdkl. В таком состоянии конденсиновый комплекс взаимодействует с хроматином и способствует конденсации митотических хромосом (Hirano et al., 1997; Kimura et al., 1998). Таким образом, фосфорилирование конденсинового комплекса является необходимым условием для регуляции активности конденсинов в клеточном цикле.

SMC1/SMC3: когезия сестринских хроматид.

Впервые когезины были обнаружены у дрожжей S. cerevisiae. Когезипы поддерживают когезию сестринских хроматид с начала S-фазы до метафазы (Guacci et al., 1997; Michaelis, С. et al., 1997), связываясь с хромосомами в позднем G1 периоде, и диссоциируют в начале анафазы (Toth A. et al., 1999). Когезиновый комплекс состоит из гетеродимера SMC1\SMC3 и 2-х других субъединиц, не относящихся к классу SMC-белков. У высших эукариот когезин состоит из SMC1\SMC3 и Scc3 (SA), Sccl (Rad 21\Mcdl). See 1 относится к новому семейству белков, названных Кляйзинами, которое включает также САР-Н и САР-Н2 (Schleiffer et al., 2003).

Когезиновый комплекс образует кольцеобразную структуру (Anderson et al., 2002;

Gruber et al., 2003; Weitzer et al., 2003). Диаметр этого кольца составляет приблизительно 50 нм, что достаточно для поддержания двух сестринских нитей ДНК вместе. Когезиновое кольцо состоит из гибких «coiled-coil» субъединиц SMC1 и SMC3, связанных друг с другом по типу ориентации - «голова к голове и хвост к хвосту». Субъединицы Sccl и Scc3 ассоциируются с 8МС-«головами» (Haering et al., 2002). При этом Sccl способен стабилизировать взаимодействие двух "голов" SMC1 и SMC3, что важно для гидролиза АТФ

12 и взаимодействия SMC1 и SMC3 в процессе когезии (Weitzer et al., 2003; Arumugam et al.,

Модель когезинового кольца (Wetzer et al., 2003).

На стадии анафазы после активации анафаза-промотирующего комплекса/или циклосомы (АРС\С) происходит отделение белка Sccl от когезинового комплекса, вследствие чего когезия нарушается (Uhlmann et al., 1999; Waizenegger et al., 2000; Weitzer et al., 2003; Gimenez-Abian et al., 2004).

Сайты связывания когезинов с хромосомами были картированы у S.cerevisiae методом иммунопреципитации хроматина. Показано, что когезины связываются со специфическими районами вблизи центромер и вдоль плечей хромосом, богатыми А-Т последовательностями (Blat and Kleckner, 1999).

В экстракте яиц X.laevis когезины связываются с хроматином в интерфазе, но большинство из них (около 95%) остаются диссоциированными до вступления в митоз (Losada et al., 1998). Небольшая часть когезинов остается связанной с метафазными хромосомами и таким образом удерживает сестринские хроматиды вместе перед началом анафазы (Losada et al., 2000). В клеточных экстрактах X.laevis удаление когезинов в интерфазе ингибирует последовательность митотической когезии сестринских хроматид (Schmiesing et al., 2000).

Также получены данные, по которым когезины связываются с ДНК и индуцируют формирование больших ДНК-содержащих белковых агрегатов. В присутствии топоизомеразы II когезины способствуют межмолекулярному связыванию кольцевых молекул ДНК. Предполагается, что когезины функционируют как межмолекулярные ДНК-кросслинкеры (Losada and Hirano, 2001).

Таким образом, SMC-белки входят в состав конденсинового и когезинового комплексов. Способ связывания когезина с молекулой ДНК сходен со способом ДНКсвязывания конденсина (Hirano, 2002). Конденсины, также как и когезины, состоят из двух

13 heads (Н coi ed coil

ЗгпсЗ Ч\,

Зпс1 hinge

SMC-белки: репарация и рекомбинация ДНК.

Гетеродимер SMC1/3 был идентифицирован как составная часть рекомбипантного комплекса-1 (RC-1). RC-1 был выделен из тимуса быка и из других соматических клеток (Jessberger et al., 1998). Данный SMC-содержащий комплекс катализирует репарацию двунитевых разрывов и делеций in vitro. RC-1 комплекс состоит из ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы, связанных с белками bSMCl и bSMC3. Наиболее специфической рекомбинантной реакцией является образование D-петли, в которой указанные белки опосредуют объединение однонитевой и двунитевой молекул ДНК. Показано, что комплекс RC-1 и гетеродимер SMC1/3 способны влиять на образование D-петли в реакции, для которой требуется наличие гомологичных последовательностей и суперспирализованиость присоединенного дуплекса ДНК (Jessberger et al., 1998).

Другой гетеродимер SMC5/SMC6 был выделен и охарактеризован у S.cerevisiae, Arabidopsis thaliana и в клетках млекопитающих. Белок SMC6 обнаружен в S.pombe, продукт гена radl8, мутация которого вызывает гиперчувствительность клеток к ультрафиолетовым и у - излучениям (Lehmann et al., 1995). Комплекс SMC5/SMC6 необходим для осуществления контроля клеточного деления в случае повреждения ДНК (Verkade et al., 1999).

Также SMC5/SMC6 гетеродимер принимает участие в хромосомной организации высших уровней, независимо от процессов конденсации и когезии. В клетках животных белки SMC5 и SMC6 образуются в большом количестве в половых железах и связываются с X-Y хромосомной парой на поздних стадиях профазы мейоза. Подобные наблюдения могут означать наличие дополнительной функции у гетеродимера SMC5/SMC6 в мейозе, но какой именно остается неясно (Taylor et al., 2001).

SMC-белки: регуляции генной экспрессии

Компенсация дозы гена.

Недавно было выяснено, что субъединицы конденсинового комплекса могут выполнять больше, чем одну функцию в клетке. Явным примером полифункциопальности субъединиц комплекса является белок MIX-1, который гомологичен SMC2 белку.

15

Компенсацию дозы гена нематоды C.elegans регулирует комплекс (DCC), содержащий 4 белка: 2 DPY-26, DPY-27 (принадлежит классу 8МС4-белков), MIX-1 (принадлежит классу 8МС2-белков) (Chuang et al., 1994; Jessberger, 1998). Данный комплекс специфически связывается с Х-хромосомами и ослабляет уровень экспрессии генов. Во время митоза MIX-1 также участвует в хромосомной компактизации посредством взаимодействия с еще не - идентифицированными SMC-белками (Chuang et al., 1994).

Другой пример участия конденсинов в контроле генной экспрессии это Drosophila. В клетках Drosophila конденсины необходимы для репрессии транскрипции в центромериом проксимальном гетерохроматине (Dej et al., 2004). Генетические исследования показали, что Barren белок (аналог белка САР-Н) необходим для сайлепсинга генов (Lupo et al., 2001).

Каким образом осуществляется генная репрессия остается неизвестным, но наличие данной не митотической функции у субъединиц конденсинов позволяет высказать мнение о непосредственном участии субъедипиц конденсинового комплекса в регуляции активности генома. Так, на пример, белок hCAP-Н накапливается в ядрышке клеток человека, ассоциирован с рДНК, играет роль фактора, модулирующего ее структурное и функциональное состояние (Cabello et al., 2001). Эти данные согласуются с результатами, полученными методом иммунопреципитации, согласно которым в клетках дрожжей S.cerevisiae конденсины связаны с рДНК (Freeman et al., 2000).

Иммунолокализация субъединиц конденсинового комплекса ХСАР-Е и pEg7 (ХСАР-D2) в клетках X.laevis показала локализацию белков в гранулярном компоненте ядрышка. При подавлении транскрипции и процессинга рРНК субъединицы конденсина остаются в гранулярном компоненте. Как предполагает автор, это может свидетельствовать о связи белков с процессирующейся 45S рРНК, или же о связи с другими компонентами ядрышка даже в отсутствии активности рибосомных генов (Uzbekov et al., 2003; Тимирбулатова и др., 2002).

В подтверждение гипотезы о связи конденсинов с рРНК свидетельствует работы, в которых была показана локализация белков XCAP-D2 и ХСАР-Е в тельцах Кахаля ооцитов

X.laevis (Beenders et al., 2003). В ряде экспериментов показано существование прямой связи

16 между ядрышком и тельцами Кахаля. Так, после инъекции флуоресцентно меченных малых ядерных РНК (мяРНК) в ооциты X.laevis они сначала накапливаются в тельцах Кахаля, а затем мигрируют в ядрышки (Narayan et al., 1999). Аналогичная динамика описана для белка Nopp 140 (Snaar et al., 2000) и для маркерного белка телец Кахаля коилипа р80 (Sleeman et al., 1998). В связи с этим можно высказать предположение о существовании аналогичной «обратной связи» между локализацией белка ХСАР-Е в тельцах Кахаля и активностью ядрышка

Таким образом, локализация субъедипиц кондеисинового комплекса в ядрышках может отражать их направленное и специфическое взаимодействие с рибосомными генами (рДНК) в интерфазе. По-видимому, конденсиновые комплексы могут компактизовать рДНК, влияя на транскрипционную активность рибосомных генов.

Ядрышко.

Структурно-функциональная организация ядрышек.

В связи с тем, что существует ряд наблюдений о локализации конденсинов в ядрышках эукариотических клеток (Cabello et al., 2001; Тимирбулатова и др., 2002; Beenders et al., 2003; Uzbekov et al., 2003) рассмотрим более подробно данную клеточную органеллу и ее функции.

Ядрышко представляет собой специализированную структуру ядра эукариот, основная роль которого состоит в синтезе рибосомной РНК и сборке рибосомных частиц (Hadjilov, 1985; Scheer and Benavente, 1990; Spector, 1993; Olson et al., 2000). Ha ультраструктурном уровне в составе ядрышка выделяют следующие основные компоненты: фибриллярные центры (ФЦ), плотный фибриллярный компонент (ПФК), гранулярный компонент (ГК), ядрышковые вакуоли, а также, ассоциированный с ядрышком, хроматин (Jordan, 1987).

ФЦ представляют собой структуры, образованные рыхло уложенными фибриллами толщиной 7-10 нм. Фибриллярные центры, как полагают, представляют собой интерфазный эквивалент ядрышковых организаторов. Однако существуют примеры, когда прямой

17 взаимосвязи между числом ядрышковых организаторов и числом фибриллярных центров не обнаруживается (Mirre and Knibiehler, 1982). Ядрышковые организаторы содержат гены, кодирующие 28S и 18S рибосомальные РНК (рРНК). Электрономикроскопический анализ рибосомных генов показал, что гены состоят из нетранскрибируемой последовательности ДНК-спейсера и транскрипционной единицы. В состав транскрипционной единицы входят участки, соответствующие 28S, 18S и 5,8S рРНК, разделенные участками, которые вырезаются при процессинге 45S РНК (Miller, 1981). Что же касается 5S рРНК, то 5S рРНК синтезируется па отдельных генах, локализованных не в зонах ядрышковых организаторов, а других хромосомах (Hadjalov et al., 1985). У X.laevis гены 5S рРНК расположены в теломерных участках большинства хромосом. Гены 5S рРНК множественные, также собраны в кластеры, но их число выше, чем у остальных генов рРНК (Rawlings et al., 1996).

Число ФЦ отражает в первую очередь уровень функциональной активности ядрышка. Показано, что количество и размер фибриллярных центров зависит от степени клеточной дифференцировки и от интенсивности синтеза рРНК. Если экспериментальным путем блокировать синтез рРНК, то количество ФЦ в ядре уменьшается, а размер увеличивается (Зацепина и др., 1989). У клеток, в которых отсутствует синтез рРНК или наблюдается иизкий уровень активности рДНК, чаще всего наблюдаются сферические небольшие ядрышки. Они состоят из РНП-фибрилл, ФЦ в таких ядрышках обнаружить не удается. При прекращении синтеза рРНК происходит сегрегация ядрышек. Сегрегация компонентов ядрышка вызывают различные иигибиторы синтеза рРНК, такие, как актиномицин Д и гипотоническая обработка (Дудник и Зацепина, 1995).

Одиночные фибриллярные центры или их группы, окружены общим плотным фибриллярным компонентом (Mirre and Stahl, 1981; Hozak et al., 1986). Плотный фибриллярный компонент (ПФК) представлен компактно упакованными фибриллами толщиной 4-8 пм (Jordan, 1991). Одиночные ФЦ или их группы, окруженные общим слоем ПФК, которые в литературе предложено называть фибриллярными комплексами (Зацепина и др., 1989).

Гранулярный компонент (ГК) ядрышек образован гранулами 15-20 нм в диаметре, представляющими собой рибосомы на разных этапах созревания (Ashraf and Godward, 1980; Meier and Blobel, 1992), па долю которых в быстрорастущих клетках приходится до 60% объема ядрышка (Hadjiolov, 1985).

Кроме перечисленных выше основных структурных элементов, в ядрышке часто обнаруживаются вакуоли, материал которых по структуре не отличается от содержимого нуклеоплазмы (Челидзе, Зацепина, 1988). Помимо вакуолей, вокруг ядрышка выявляются хроматиновые блоки, формируя зоны конденсации ДНК (Jordan, 1987).

На основании иммуноцитохимических и биохимических данных был сделан вывод о том, что транскрипция рибосомных генов происходит па поверхности или внутри фибриллярных центров (Thiry et al., 1991; Scheer and Hock, 1999; Olson et al., 2000). Позднее появились данные, свидетельствующие, что синтез рРНК происходит в фибриллярном центре (Thiry et al., 2000; Mais, Scheer, 2001) или на границе между фибриллярным центром и плотным фибриллярным компонентом (Mosgoller et al., 1998). До сих пор вопрос о локализации транскрипции рибосомных генов остается открытым.

Образованные транскрипты по мере созревания перемещаются от ПФК к ГК, где проходят последние стадии сборки прерибосомных частиц (Olson et al., 2000). Движение прерибосомных субъединиц от ГК в цитоплазму осуществляться специальными транспортными белками. К одному их таких белков относится белок Nopp 140. Nopp 140 осуществляет импорт рибосомных белков и экспорт прерибосомных субчастиц (Meier and Blobel, 1992).

Белки ядрышка.

В настоящее время известно, что в ядрышке присутствует большое количество различных типов белков, некоторые из которых прямо не связаны с основной функцией ядрышка - синтезом рибосомных частиц. В ранних работах проводился детальный анализ так называемых аргентофильных белков ядрышка, способных при определенных условиях восстанавливать азотнокислое серебро. Этот класс кислых пегистоновых белков, связанных с

19 рДНК, является, маркером транскрипционно-активных ядрышковых организаторов (Goodpasture and Bloom, 1975). Считается, что степень интенсивности окрашивания AgNCh коррелирует с уровнем транскрипции рДНК (Hernandez-Verdun, 1991; Chudinova et al., 1999).

На световом уровне после окраски серебром аргентофильные белки выявляются в интерфазе только в ядрышках, а во время митоза в районе ядрышкового организатора митотических хромосом (Goodpasture and Bloom, 1975) и в перихромосомном материале (Hernandez-Verdun and Gartier, 1994). На электронно-микроскопическом уровне эти белки обнаруживаются в фибриллярных центрах и плотном фибриллярном компоненте, по никогда в гранулярном. На препаратах диспергированных ядрышек для них характерна локализация на транскрибируемой части матрицы ДНК и на отходящих от нее РНП-фибриллах, и отсутствие в районах нетранскрибируемых спейсеров. Такое специфическое распределение белков связано, по-видимому, с их участием в транскрипции рибосомных генов.

Аргентофильными свойствами обладают такие белки, как нуклеолип, В23, большая субъединица РНК-полимеразы I и UBF. Нуклеолин (С23) - один из самых больших фосфопротеидов ядрышка (Shaw and Jordan, 1995; Scheer and Hock, 1999). Он обнаружен в клетках всех эукариот, и его молекулярный вес колеблется у разных видов от 92 до 105 кД. Нуклеолин - полифункционалный белок, участвующий в регуляции транскрипции и контролирующий формирование вторичной структуры рРНК при сборке прерибосомпых частиц. Предполагается, что он играет роль шапероиа, обеспечивая правильность взаимодействия белков с рРНК (Shaw and Jordan, 1995).

Другой мажорный аргептофильпый белок - В23 (N038), нуматрип, или нуклеофозмин, является основным РНК-связывающим фосфопротеидом ядрышка. Одна из главных функций В23 - участие в заключительных стадиях сборки прерибосом (Shaw and Jordan, 1995; Zatsepina et al., 1999). Кроме того, B23 специфически взаимодействует с минус-концами микротрубочек. Возможно, присутствие В23 на полюсах необходимо для формирования и стабилизации веретена деления (Zatsepina et al, 1999).

Используя моноклопальные антитела к нуклеолину и В23, была установлена их локализация на разных стадиях клеточного цикла. В иптерфазе оба белка выявляются в

20 ядрышке. В профазе, во время распада ядрышка, нуклеолин большей частью остается связанным с ядрышком, в то время как В23 переходит в нуклеоплазму. В метафазе и анафазе В23 выявляется на периферии хромосом, нуклеолин в связи с хромосомами не обнаруживается. Когда в телофазе ядрышко начинает реконструироваться, нуклеолин появляется в «предъядрышках», а затем и в ядрышке, тогда как В23 отсутствует в ядрышке до G1 -периода (Ochs et al., 1983; Dundr et al., 2000).

Подробно изученным белком интерфазпого ядрышка является фибрилларин, который не обладает свойством аргентофилыюсти, высоко консервативен по аминокислотной последовательности, структуре и функции. Этот белок участвует в большинстве посттранскрипционпых процессов, например, в процессипге пре-рРНК, метилировании пре-рРНК и сборке рибосом (Tollervey et al., 1993).

Кольчатые тельца.

Кроме ядрышка, в ядре клеток многих организмов локализуются тельца Кахаля или кольчатые тельца (КТ). КТ впервые были обнаружены в 1903 году Рамоном Кахалем (Hebert and Matera, 2000). В ядрах (герминальпых везикулах) средних и больших ооцитов содержится около 50-100 КТ, которые состоят из сферического коилинсодержащего матрикса (Bellini, 2000; Gall, 2000), и различные сферические тельца, В-сиурпосомы, ассоциированные с поверхностью КТ (Gall, 2001).

Тельца Кахаля высококонсервативны в клетках всех высших эукариот, что подтверждает их важность для жизнедеятельности клеток (Beven et al.,1995; Gall et al., 1999). КТ представляют собой структуры диаметром 0.2-1.5 мкм, но встречаются и гигаитские КТ диаметром 15-20 мкм, как на пример у тритона Notophthalmus. КТ содержат белок р80 коилип, который является основным маркером этих телец (Andrade et al., 1991; Raska et al., 1991). Помимо коилина КТ содержат белки: Nopp 140, NAP 57, фибрилларин, В23, а также различные транскрипционные факторы и малые ядерные РНК (Lafontaine et al., 1998; Liu et al., 2000).

Взаимосвязь между ядрышком и КТ подтверждают наблюдения, по которым в кольчатых тельцах были обнаружены РНК-полимеразы I, II, П1 необходимые для транскрипции и процессинга трех классов ядерных транскриптов: мРНК, рРНК и полимеразы III транскриптов. На основании имеющихся данных была предложена гипотеза, по которой в КТ организуются транскрипционные и процессирующие «машины» и далее происходит их присоединение к соответствующим сайтам на хромосомах (Gall et al., 1999).

Как правило, терминальные везикулы содержат несколько тысяч В-сиурпосом, которые не ассоциированы с тельцами Кахаля. Белковый состав В-снурпосом представлен полимеразой II (Gall et al., 1999), основным транскрипционным фактором TFIIF (RAP74), SR-белком и набором РНК (Bregman et al., 1995;). Многие В-снурпосомы находятся в свободном виде в нуклеоплазме, но некоторые связаны со специфическими локусами хромосом типа «ламповых щеток» в ооцитах X.laevis. Такие морфологические связи прямо подтверждают взаимосвязь между тельцами Кахаля, В-снурпосомами и хромосомами. Понимание природы данной связи является важным аспектом для установления функциональной роли телец Кахаля (Gall, 2000).

Структура и динамика ядрышек ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus в оогенезе.

Часть работы была проведена на ооцитах морского ежа P.lividus, в связи с этим следует более подробно остановиться на особенностях организации ооцитов морского ежа P. lividus.

В оогенезе морских ежей можно выделить следующие стадии развития женских половых клеток: а) вторичный оогоний, б) ооцит, находящийся на стадии превителлогенеза, и в) ооцит, находящийся на стадии вителлогенеза.

К вторичным оогониям относятся клетки, приступающие к профазе I деления мейоза. Вторичные оогонии достигают в диаметре 10-20 мкм, для них характерно наличие одного округлого ядрышка (0.5 - 2 мкм в диаметре), смещенное к ядерной оболочке.

На стадии превителлогеиеза диаметр ооцита постепенно увеличивается до 50 мкм. Ядро почти всегда сферическое и достигает размера 35 мкм в диаметре, содержит хромосомы типа «ламповых щеток», радиалыю сходящиеся к ядрышку, размер которого на данной стадии составляет 2-6 мкм. В процессе вителлогенеза ооцит достигает размера 90 мкм, ядро увеличивается до 45 мкм, а диаметр ядрышка варьирует в пределах 6-10 мкм (Verney and Moyer, 1967; Millonig et al., 1968).

Ооциты морского ежа P.lividus относятся к клеточным системам, в ядрышках которых отсутствуют фибриллярные центры и плотный фибриллярный компонент, характерные для ядрышек большинства эукариотических клеток (Amikura et al., 1987; Chudinova et al., 1996). На всех стадиях созревания ооциты P.lividus содержат единственное гигантское ядрышко, состоящее из сепарированных друг от друга плотной периферической и центральной фибриллярной областей. Фибриллярные центры и плотный фибриллярный компонент, характерные для типичных ядрышек, не обнаруживаются после фиксации in situ (Chudinova et al., 1999), вследствие чего подобные ядрышки назвали «неканоническими».

Такая 2-х компонентная структура ядрышка формируется на ранних этапах оогенеза морского ежа путем отделения фиброграиулярного компонента и миграции его на периферию ядрышка. Периферическая область (ПО) ядрышка состоит из плотноупакованных фибрилл и гранул диаметром 5-20 нм, в ней содержатся вакуоли, которые не занимают весь объем и не открываются в ЦЗ. В отличие от ПО, которая остается стабильной структурой в течение оогенеза, центральная область (ЦО) подвергается структурным перестройкам. В ядрышке вторичного оогония и превителлогенетических ооцитах, ЦО имеет нечеткие границы и состоит из гетерогенных компонентов, представленных рыхло упакованным фибриллярным материалом и небольшими плотными зонами компактных фибрилл. В вителлогенетических ооцитах фибриллярный материал ЦО приобретает ретикулярную структуру.

В процессе созревания ооцитов происходит заметное увеличение размеров ооцитов, в основном за счет накопления желтка, возрастания количества рибосом, митохондрий и т.д.

Большая часть синтезированной рРНК входит в состав рибосом. У морских ежей не мене

23

95% тотальной РНК представлено молекулами 28S и 18S рРНК (Giudice, 1973). На раниих этапах оогенеза происходит преимущественно синтез транспортной 4S РНК и рибосомной 5S рРНК. В период большого роста в ооцитах начинается синтез рибосомных РНК (Sconzo et al., 1972). В это время образуется только одна десятая часть всей рРНК, характерной для зрелого ооцита (Нейфах, Тимофеева, 1977).

При ингибировании синтеза рРНК актиномиципом Д было показано, что транскрипция и начальные этапы процессинга рРНК осуществляются в ЦО, поздние этапы процессинга происходят в ПО. При этом, для нормального синтеза и процессинга рРНК присутствие таких структурных субдоменов, как ФЦ и ПФК, не является обязательным (Chudinova et al., 1999; Sheval et al., 2001).

По окончанию вителлогенеза ооцит завершает мейотическое деление и превращается в зрелую яйцеклетку, которая покоится в интерфазе. Превращение ооцита в яйцеклетку сопровождается выходом ядрышка в цитоплазму, где оно дезорганизуется. Перед исчезновением ядрышки морского ежа уплотняются и теряют характерную двухкомпонентную структуру. Выход ядрышка в цитоплазму (экструзия) описан в ооцитах других видов живых организмов (Jaworska and Limade-Faria, 1963; Kessel and Beams, 1963).

Таким образом, наблюдается общая тенденция преобразования ядрышек в зависимости от активности рибосомных генов, не смотря на структурное отличие ядрышек ооцитов от типичных ядрышек.

В дробящихся эмбрионах P.lividus синтез рРНК не выявляется вплоть до стадии поздней гаструлы (Gross et al., 1965; Sconzo and Giudice, 1971; Greco et al., 1977). Методом выявления аргентофильных белков была показана высокая степень синтеза рРНК в ядрышках гаструлы (Karasaki, 1967; Chudinova et al., 1999),что свидетельствует о возобновление синтеза рРНК в раннем эмбриогенезе на стадии гаструлы.

Таким образом, ооциты морского ежа являются удобной экспериментальной моделью для исследования структурно-функционального состояния ядрышка в оогенезе, так как именно на стадиях созревания и дальнейшего эмбрионального развития активность рибосомных генов естественным образом ингибируется и возобновляется заново, только на

24 стадии средней/поздней гаструлы. Наличие и характер синтеза рРНК отражается на структурном уровне организации клеточного ядра в целом, что легко регистрировать цитологическими методами.

Сходные процессы инактивации/реактивации синтетической деятельности ядрышек характерны для оогенеза шпорцевой лягушки X.laevis.

Особенности организации ооцитов шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

Терминальный везикул ооцита шпорцевой лягушки X.laevis является гигантским ядром, который содержит 18 мейотических хромосом (Morgan, 2002; Gall et al., 2004), 1500 экстрахромосомных ядрышек, 50-100 телец Кахаля и несколько тысяч В-снурпосом (Gall et al., 2004).

В результате амплификации рибосомных генов в оогенезе амфибий происходит образование многочисленных экстрахромосомных ядрышек. В ооцитах X.laevis рибосомные гены (рДНК) селективно амплифицируются в течение поздней зиготены и ранней пахитены в профазе мейоза I, образуя около 30 pg экстрахромосомной рДНК на ядро (Gall, 1969; Macgregor, 1972; Scheer and Dabauvalle, 1985). Амплифицированная рДНК распределяется приблизительно в 1000-1500 экстрахромосомных ядрышках диаметром 10-15 мкм (Van Gansen and Schram, 1972; Gallan 1986; Wu and Gall, 1997).

В процессе исследования начальных стадий формирования многочисленных ядрышек в ооцитах X.laevis было выявлено, что 2-4 кластера малой рДНК связываются с поверхностью «предъядрышковых» белковых телец на поздней стадии I/ранней стадии II ооцитов. При чем, их объединение происходит, в основном, в отсутствии транскрипции рибосомных генов. На стадии II в ооцитах "внешняя" рДНК переносится внутрь «предъядрышковых» телец. Подобный перенос взаимосвязан с декондепсацией рибосомной ДНК и началом транскрипции рДНК (Spring et al., 1996). Молекулярный механизм образования многочисленных амплифицированпых ядрышек в оогенезе X.laevis остается слабо изученным.

Созревание ооцитов в мейозе коррелирует с распадом ядерной оболочки вследствие фосфорилирования ламинов (Heald and McKeon, 1990; Peter et al., 1990b) и с распадом амплифицированных ядрышек. Что происходит с рДНК после распада ядрышек остается невыясненным. Было показано, что начальный этап распада ядрышек включает фрагментацию ядрышка на отдельные части и последующий выход ядрышковых белков, нуклеолипа и фибрилларина, в цитоплазму. Фибриллярные центры ядрышек остаются интактными после распада плотного фибриллярного и гранулярного компонентов (Shah et al., 1996).

Подобный феномен образования и существования многочисленных экстрахромосомпых ядрышек в оогенезе X.laevis также встречается и в оогепезе других организмов. Так, например, амплифицироваппая рДНК есть у некоторых видов насекомых, у моллюска, Spisula solidissima, у креветок Artemia salina, а также у некоторых видов костистых рыб (Kloc et al., 1995; Kubrakiewicz and Bili'nski, 1995; Tobler, 1975).

Хромосомы типа «ламповых щеток».

Одной из особенностей оогенеза многих живых организмов является формирование своеобразных гигантских мейотических хромосом в ядрах ооцитов, так называемых, хромосом типа «ламповых щеток».

Более чем 100 лет тому назад Флеммингом (1882) были описаны гигантские хромосомы в ядрах ооцитов или в терминальных везикулах (ГВ) у саламандры Ambystoma mexicanum. После этого наблюдения последовал ряд работ о подобных хромосомах в ГВ многих животных. В 1982 году Рукерт назвал такие структуры хромосомами типа «ламповых щеток» из-за их сходства со щетками, которые используют для чистки керосиновых ламп.

Хромосомы типа «ламповых щеток» свойственны профазе первого редукционного мейотического деления. Каждая хромосома представляет собой два гомолога, взаимодействующих друг с другом при помощи одной или несколько хиазм. Каждый гомолог имеет ось хромомеров (многочисленные сильно конденсированные хроматиновые гранулы), которые соответствуют транскрипционно неактивным районам, где сестринские хроматиды плотно контактируют друг с другом (Morgan, 2002).

Строение хромосомы типа «ламповых щеток».

БП

I/O v м; \~jC4T

Г f\

ТелП ч А

А) БП - боковые петли, отходящие от конденсированных участков хромомеров (Хм); ТелП - теломерные петли на конце хромосомы; ДвП - двойные петли.

Б) Хм - хромомер, Акс - аксиальная часть латеральных петель, РНП - рибонуклеопротеидный матрикс.

РНП От хромомеров латерально отходят многочисленные петли, состоящие из деконденсированных хроматиновых осей, связанных с (м РНК-полимеразой II (Gall et al., 1999), при этом сестринские хроматиды независимы друг от друга. Между радиусом петель и хромомеров наблюдается обратная зависимость - с увеличением размера петель размер хромомеров уменьшается (Callan and Lloyd, Б i960).

На световом уровне петли неоднородны, состоят из одной и более тонких, толстых областей, которые соответствуют транскрипционным единицам. Петли окружены плотным рибонуклеопротеидным матриксом, который построен из насцентных транскриптов РНК-полимеразы II и связанных с ними белков (Leon and Kezer, 1990). Транскрипция начинается на тонком участке транскрипционной единицы, где транскрипты короткие, и, постепенно, к концу, длина транскриптов увеличивается. Подобная ассиметричная организация

27 транскрипции отражает ее направление (Diaz and Gall, 1985; Callan and Lloyd, 1960). С помощью электронного микроскопа было показано, что подобная морфология является результатом роста длины насцентных рибопуклеопротеидных фибрилл (РНП) вдоль транскрипционной единицы в направлении хода транскрипции (Cellan, 1986).

Электронная и световая микроскопия мейотических хромосом Pleurodeles waltl показали разнообразие типов организации боковых петель: D-петли (Lacroix, 1968а), нормальные петли, Р-петли с 45 нм РНП-частицами, плотные гранулярные и глобулярные петли (Pyne et al., 1989; Morgan, 2002).

Хромосомы типа «ламповых щеток» по существу сходны с политенпыми хромосомами. Петли соответствуют пуфам политенных хромосом, активно включают РНК-предшественники и накапливают РНК (Gall, 1954; Gall and Callan, 1962).

Известно, что миогие транскрипты окрашиваются антителами против гетерогенных ядерных рибонуклеопротеидов. В петлях также локализуются различные малые ядерные РНК и фактор сплайсинга SC35 (Fu and Maniatis, 1990).

На стадии поздней диплотены I происходит ретракция (редукция) петель, которая сопровождается полной конденсацией бивалентов, уменьшением плотности РНК-транскриптов и увеличением частоты нуклеосом между удаленными транскриптами (Scheer, 1978). На хромосомах Triturus cristatus carnifex показано, что ретракция петель осуществляется за счет складывания (сворачивания) петель, при этом транскрипция продолжается (Flannery and Hill, 1987). Молекулярный механизм процесса ретракции петель неизвестен. Так, при ингибировапии синтеза РНК воздействием актиномицина Д происходит полная ретракция латеральных петель, длина петель уменьшается, и они приобретают нуклеосомное строение, а осевая часть хромосомы приобретает более компактную форму (Izawa et al., 1963; Gall and Murphy, 1998). Подобный эффект вызывает также тепловой шок, при этом степень конденсации хромосом зависит от силы и продолжительности теплового шока (Flannery and Hill, 1988).

Хромосомы типа «ламповых щеток» занимают промежуточное положение между транскрипционно активными интерфазными хромосомами и транскрипционпо неактивными

28 митотическими хромосомами: хромомеры соответствуют участкам митотических хромосом, а боковые петли - участкам активных интерфазных хромосомных районов. Таким образом, мейотические хромосомы представляют собой уникальную модель для изучения транскрипции и процессинга РНК, а также для исследования организации мейотических хромосом стандартными цитологическими методами.

SMC-белки в мейозе.

Принцип структурной организации митотических и мейотических хромосом сходен, поэтому логично предположить, что конденсины могут опосредовать конденсацию и мейотических хромосом. Так, например, иммуноцитохимическое изучение белка MIX-1 (гомолог SMC2) и SMC4 в С. elegans показало, что эти белки необходимы для прохождения мейоза II, но не для мейоза I (Hagstrom et al., 2002).Аналогичное наблюдение было сделано при добавлении антител конденсина в экстракте яиц X.laevis (Watrin et al., 2003). В подтверждение возможной роли конденсинов в конденсации мейотических хромосом можно привести работу на дрожжах S. cerevisiae, где конденсины связывались с аксиальной частью хромосом, при этом данная ассоциация конденсинов с хромосомами была динамичной. Наблюдаемая аксиальная локализация конденсинов подтверждает возможную роль конденсинов в компактизации мейотических хромосом (Yu and Koshland, 2003). В клетках С. elegans, наоборот, субъединицы конденсина связываются с хромосомами только после выхода из пахитепы, и организуют их для последующих мейотических делений (Chan et al., 2004).

В клетках S.cerevisiae был обнаружен белок когезинового комплекса SMC3p необходимый для когезии и рекомбинации мейотических хромосом (Eijpe et al., 2000). Гетеродимер SMC1/SMC3 располагался вдоль аксиальных элементов синаптонемного комплекса в пахитенных и диплотенных хромосомах. Также SMC1/SMC3 гетеродимер обнаруживается на хроматиновых петлях в периферических частях мейотических хромосом.

На основании вышеописанных данных было высказано мнение о возможном участии

SMC-белков в событиях мейоза и предложена модель участия SMC1/SMC3 гетеродимера в

29 организации структуры мейотических хромосом млекопитающих. Согласно этой модели один или несколько 8МС1/8МСЗ-гетеродимеров связываются с 2-мя хромосомными петлями и с аксиальными элементами синаптонемного комплекса (Eijpe et al., 2000).

Все эти результаты свидетельствует о возможной роли копденсинов в компактизации хроматина на более поздних стадиях мейоза I. Вероятно, аналогично когезинам, конденсины могут использовать свои субъединицы для выполнения специализированных функций в мейозе. Но пока мейозо-специфические субъединицы конденсинов не идентифицированы. В связи с вышесказанным, основной целью настоящей работы явилось исследование структурно-функциональной роли конденсинового комплекса в ядрышках и в мейотических хромосомах.

В связи с этим, в работе поставлены следующие задачи:

1. Подробный иммуноцитохимический анализ локализации белков конденсинового комплекса, ХСАР-Е и XCAP-D2 (Eg7), в ооцитах шпорцевой лягушки X.laevis в профазе мейоза I

2. Исследовать поведение белка ХСАР-Е в процессе ингибирования транскрипции рибосомных генов в ооцитах X. laevis.

3. Изучить локализацию белка конденсинового комплекса ХСАР-Е в оогенезе и в раннем эмбриогенезе морского ежа P.lividus.

4. Исследовать топологию аргентофильных белков в оогенезе и в раннем эмбриогенезе морского ежа P.lividus.

Материалы и методы.

Список сокращений: ФСБ - фосфатно-солевой буфер, БСА - бычий сывороточный альбумин, DAPI - 4'6-диамидино-2'-фенилиндол, MilliQ — деионизованный бидистиллят, раствор №1 - форсфатиый буфер (рН 8.0), содержащий 1% NaCl и 2.5% сахарозы; ПАБ -парааминобензойная кислота.

1. Объекты исследования.

В качестве объектов исследований использовали ооциты шпорцевой лягушки Xenopus laevis, ооциты и эмбрионы морского ежа Paracentrotus lividus (Палермо, Средиземное море).

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Картавенко, Татьяна Владимировна

Выводы:

1. Наличие белка XCAP-D2 в аксиальных районах хромосом типа «ламповых щеток» свидетельствует о его возможной роли в поддержании компактного состояния транскрипционно неактивного хроматина в профазе мейоза I Xenopus laevis.

2. Сборка кондеисинового комплекса, включающего оба белка (ХСАР-Е и XCAP-D2), осуществляется непосредственно на хромосомах типа «ламповых щеток» X.laevis па стадии ретракции боковых петель. Таким образом, полученные данные показывают, что для компактизации хромосом типа «ламповых щеток» необходимо наличие полного кондеисинового комплекса.

3. Наблюдаемые различия в локализации белков ХСАР-Е и XCAP-D2 в различных доменах ядер ооцитов X.laevis (хромосомах, амплифицированных ядрышках и тельцах Кахаля) свидетельствует о функциональном разобщении субъедипиц кондеисинового комплекса.

4. Наличие белка, гомологичного ХСАР-Е, в центральной зоне неканонических ядрышек морского ежа P.lividus подтверждает его роль в процессинге рРНК.

5. Кластеризация белка ХСАР-Е в клетках гаструлы связана с активацией транскрипции рибосомных генов в раннем эмбриональном развитии морского ежа P.lividus.

6. Нарушение сегрегации генома и изменение параметров клеточного цикла под действием глутарового альдегида на ранних стадиях дробления P.lividus приводит к увеличению ядра и формированию "ядрышкоподобных структур", аккумулирующих белок ХСАР-Е.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Картавенко, Татьяна Владимировна, 2006 год

1. Дудник О.А., Зацепина О.В. (1995). Поведение некоторых ядрышковых белков в условиях обратимого пространственного разобщения структурных компонентов ядрышка. Цитология. Т.37. С. 126-132.

2. Зацепина О.В., Челидзе П.В., Ченцов Ю.С. (1989). Изменение числа и размеров фибриллярных центров при анактивации ядрышек в процессе эритропоэза. Онтогенез. Т.20. С.40-46.

3. Нейфах А.Н., Тимофеева М.В. (1977). Молекулярная биология процессов развития. М.: Наука, С. 91-124.

4. Челидзе П.В., Зацепина О.В.(1988). Морфофункциональная классификация ядрышек. Успехи совр. биологии. Т. 105. С. 252-268.

5. Amchenkova АА, Buzhurina IM, Gorgidze LA, Kireyev IV, Panov MA, Polyakov VJ.(1998) The role of Ca ions in restoration of the structure of interphase and mitotic chromosomes in PK living cells after hypotonic stress. Cell Biol /и^.;22(7-8):509-15.

6. Amikura RM, Yamada H, Hirai S, Nagano H. (1987) Intracellular localization of argyrophilic proteins in the maturing oocyte, fertilized egg, and spermatozoa of the starfish, Asterina pectinifera. Gamete Res.; 16(4):291-301.

7. Anderson DE, Losada A, Erickson HP, Hirano T. (2002). Condensin and cogesin display different arm conformations with characteristic hinge angles. J. Cell Biol. 156, 419-424.

8. Andrade LE, Chan EK, Raska I, Peebles CL, Roos G, Tan EM. (1991) Human autoantibody to a novel protein of the nuclear coiled body: immunological characterization and cDNA cloning of p80-coilin. J Exp Med.; 173(6): 1407-19.

9. Andrade LE, Chan EK, Raska I, Peebles CL, Roos G, Tan EM. (1991) Immunological and ultrastructural studies of the nuclear coiled body with autoimmune antibodies. Exp Cell Res.; 195(l):27-37.

10. Arumugam P, Gruber S, Tanaka K, Haering CH, Mechtler K, Nasmyth K. (2003) ATP hydrolysis is required forcohesin's association with chromosomes. Curr Biol.-, 13 (22):1941-53.

11. Ashraf M, Godward MB. (1980) The nucleolus in telophase, interphase and prophase. J Cell Sci.; 41:321-9.

12. Bazett-Jones, D.P., Kimura, K., and Hirano, T. (2002) Efficient supercoiling of DNA by a single condensin complex as revealed by electron spectroscopic imaging. Mol. Cell 9: 1183-1190.

13. Beenders B, Watrin E, Legagneux V, Kireev I, Bellini M. (2003) Distribution of XCAP-E and XCAP-D2 in the Xenopus oocyte nucleus. Chromosome Res.; ll(6):549-64.

14. Bellini M, Gall JG (1998) Coilin can form a complex with the U7 small nuclear ribonucleoprotein. Mol Biol Cell 9: 2987-3001.

15. Bellini M. (2000) Coilin, more than a molecular marker of the cajal (coiled) body. Bioessays.; 22(9):861-7.

16. Beven AF, Simpson GG, Brown JW, Shaw PJ. (1995) The organization of spliceosomal components in the nuclei of higher plants. J Cell Sci.; 108 (Pt 2):509-18.

17. Bhalla, N., Biggins, S., and Murray, A.W. (2002) Mutation of YCS4, a budding yeast condensin subunit, affects mitotic and nonmitotic chromosome behavior. Mol. Biol. Cell 13: 632645.

18. Blat Y, Kleckner N. (1999) Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell.; 98(2):249-59.

19. Bregman DB, Du L, Van der Zee S, Warren SL. (1995) Transcription-dependent redistribution of the large subunit of RNA polymerase II to discrete nuclear domains. J Cell Biol.; 129(2):287-98.

20. Cabello O.A et al. (2001) Cell cycle-dependent expression and nucleolar localization of hCAP-H. Mol Biol Cell 12: 3527-3537.

21. Callan HG. (1986) Lampbrush chromosomes. Mol Biol Biochem Biophys.; 36:1-252.

22. Chan, R.C., Severson, A.F., and Meyer, B.J. (2004) Condensin restructures chromosomes in preparation for meiotic divisions. J. Cell Biol. 167: 613-625.

23. Chuang P.-T., Albertson D.G., Meyer B.J. (1994) DPY-27: condensation protein homolog that regulates C. elegans dosage compensation through association with the X-chromosome. Cell, 79: 459-474.

24. Chuang PT, Lieb JD, Meyer BJ.(1996) Sex-specific assembly of a dosage compensation complex on the nematode X chromosome. Science. Dec 6;274(5293): 1736-9.

25. Chudinova E. M., Zatzepina O.V., Fais D., Guidice G., Polyakov V.Yu. (1999) DNA localisation in the nucleoli of Sea Urchin Paracentrotus lividus oocytes. Membr. Cell biology, 12: 817-827.

26. Coelho, P., Queiroz-Mechado, J., and Sunkel, C.E. (2003) Condensin-dependent localisation of topoisomerase II to an axial chromosomal structure is required for sister chromatid resolution during mitosis. J. Cell Sci. 116: 4763-4776.

27. Cubizolles F, Legagneux V, Le Guellec R et al. (1998) pEg7, a new Xenopus protein required for mitotic chromosome condensation in egg extracts. J Cell Biol 143: 1437-1446.

28. Dej KJ, Ahn C, Orr-Weaver TL. (2004) Mutations in the Drosophila condensin subunit dCAP-G: defining the role of condensin for chromosome condensation in mitosis and gene expression in interphase. Genetics.1,168(2):895-906.

29. Diaz MO, Gall JG. (1985) Giant readthrough transcription units at the histone loci on lampbrush chromosomes of the newt Notophthalmus. Chromosoma:, 92(4):243-53.

30. Dietzel S, Belmont AS. (2001) Reproducible but dynamic positioning of DNA in chromosomes during mitosis. Nat Cell Biol:, 3(8):767-70.

31. Dudnik OA, Zatsepina OV. (1995) The behavior of nucleolar proteins under the conditions of the reversible three-dimensional separation of the structural components of the nucleolus. Tsitologiia; 37(1-2): 126-32.

32. Dumont JN. (1972) Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. JMorphol.; 136(2):153-79.

33. Eijpe M, Heyting C, Gross B, Jessberger R. (2000) Association of mammalian SMC1 and SMC3 proteins with meiotic chromosomes and synaptonemal complexes. J Cell Sci.; 113 ( Pt 4):673-82.

34. Eijpe, M., Offenberg, H., Jessberger, R., Revenkova, E., and Heyting, C. (2003) Meiotic cohesin REC8 marks the axial elements of rat synaptonemal complexes before cohesions SMC1 and SMC3. J. Cell Biol. 160: 657-670.

35. Fan H, Penman S. (1971). Regulation of synthesis and processing of nucleolar components in metaphase-arrested cells. JMolBiol. Jul 14;59(l):27-42.

36. Favaloro J, Treisman R, Kamen R. (1980) Transcription maps of polyoma virus-specific RNA: analysis by two-dimensional nuclease SI gel mapping. Methods Enzymol.\ 65(l):718-49.

37. Flannery AV, Hill RS. (1988) The effect of heat shock on the morphology of amphibian lampbrush chromosomes. Exp Cell Res.; 177(1):9-18.

38. Freeman L., Aragon-Alcaide L., Strunnikov A. (2000) The condensin complex governs chromosome condensation and mitotic transmission of rDNA. Cell biology, 4: 811-824.

39. Fu XD, Maniatis T. (1990) Factor required for mammalian spliceosome assembly is localized to discrete regions in the nucleus. Nature-, 343(6257):437-41.

40. Gall JG (2000) Cajal bodies: the first 100 years. Annu Rev Cell Dev Biol 16: 273-300.

41. Gall JG (2001). A role for Cajal bodies in assembly of the nuclear transcription machinery. FEBSLett. 498: 164-167.

42. Gall JG, Bellini M, Wu Z, Murphy С (1999). Assembly of the nuclear transcription and processing machinery: Cajal bodies (coiled bodies) and transcriptosomes. Mol Biol Cell 10: 43854402.

43. Gall JG, Callan HG. (1962) H3 uridine incorporation in lampbrush chromosomes. Proc Natl Acad Sci US A.; 48:562-70.

44. Gall JG, Macgregor HC, Kidston ME. (1969) Gene amplification in the oocytes of Dytiscid water beetles. Chromosoma; 26(2):169-87.

45. Gall JG, Murphy С (1998). Assembly of lampbrush chromosomes from sperm chromatin. Mol Biol Cell 9: 733-747.

46. Gall JG, Wu Z, Murphy C, Gao H. (2004) Structure in the amphibian germinal vesicle. Exp Cell Res.', 296(l):28-34.

47. Gall JG. (1954) Observations on the nuclear membrane with the electron microscope. Exp Cell Res.; 7(l):197-200.

48. Gimenez-Abian JF, Sumara I, Hirota T, Hauf S, Gerlich D, de la Torre C, Ellenberg J, Peters JM. (2004) Regulation of sister chromatid cohesion between chromosome arms. Curr Biol.; 14(13):1187-93.

49. Giudice G, Pirrone AM, Roccheri M, Trapani M. (1973) Maturational cleavage of nucleolar ribosomal RNA precursor can be catalyzed by non-specific endonuclease. Biochim Biophys Acta.; 319(l):72-80.

50. Goessens G. (1984) Nucleolar structure. Int Rev Cytol. ;87:107-58.

51. Goodpasture C, Bloom SE. (1975) Visualization of nucleolar organizer regions im mammalian chromosomes using silver staining. Chromosoma; 3(l):37-50.

52. Granick D. (1975b) Nucleolar necklaces in chick embryo fibroblast cells. II. Microscope observations of the effect of adenosine analogues on nucleolar necklace formation. J Cell Biol. May;65(2):418-27.

53. Gross PR, Malkin LI, Hubbard M. (1965) Synthesis of RNA during oogenesis in the sea urchin. J Mol Biol.; 13(2):463-81.

54. Guacci V, Koshland D, Strunnikov A. (1997) A direct link between sister chromatid cohesion and chromosome condensation revealed through the analysis of MCD1 in S. cerevisiae. Cell. ; 91(l):47-57.

55. Hadjiolov AA (1985) The Nucleolus and Ribosome Biogenesis. Vienna: Springer Verlag.103

56. Haering, C.H., Lowe, J., Hochwagen, A., and Nasmyth, K. (2002) Molecular architecture of SMC proteins and the yeast cohesion complex. Mol. Cell 9: 773-788.

57. Hagstrom KA, Holmes VF, Cozzarelli NR, Meyer BJ. (2002) C. elegans condensin promotes mitotic chromosome architecture, centromere organization, and sister chromatid segregation during mitosis and meiosis. Genes Dev.-, 16(6):729-42.

58. Heald R, McKeon F. (1990) Mutations of phosphorylation sites in lamin A that prevent nuclear lamina disassembly in mitosis. Cell.; 61(4):579-89.

59. Hebert MD, Matera AG. (2000) Self-association of coilin reveals a common theme in nuclear body localization. Mol Biol Cell.; 11(12):4159-71.

60. Hernandez-Verdun D (1991) The nucleolus today. J Cell Biol. 99: 465-471.

61. Hernandez-Verdun D, Gautier T. (1994) The chromosome periphery during mitosis. Bioessays.; 16(3): 179-85. Review.

62. Hirano T. SMC protein complexes and higher-order chromosome dynamics. (1998) Curr. op. in cell biology, 10: 317-322.

63. Hirano Т., Kobayashi R., Hirano M. (1997) Condensins chromosome condensation protein complexes containing XCAP-C, XCAP-E and a Xnepus homolog of the Drosophila Barren protein. Cell, 16: 511-521.

64. Hirano Т., Mitchison. (1994) A heterodimeric coiled-coil protein for chromosome condensation iv vivo. Cell, 4: 449-458.

65. Hirano, M. and Hirano, T. (2002) Hinge-mediated dimerization of SMC protein is essential for its dynamic interaction with DNA. EMBOJ. 21: 5733-5744.

66. Hirano, M., Anderson, D.E., Erickson, H.P., and Hirano, T. (2001) Bimodal activation of SMC ATPase by intra- and intermolecular interactions. EMBOJ. 20: 3238-3250.

67. Hirano, T. (2000) Chromosome cohesion, condensation and separation. Annu. Rev. Biochem. 69:115-144.

68. Hirano, T. (2002) The ABCs of SMC proteins: Two-armed ATPases for chromosome condensation, cohesion and repair. Genes & Dev. 16: 399-414.

69. Hirano, Т. (2004) Positive and negative regulation of SMC-DNA interactions by ATP and accessory proteins. EMBOJ. 23: 2664-2673.

70. Hirano, T. (2005) Condensins: Organizing and segregating the genome. Curr. Biol. 15: R265-R275.

71. Hirota T, Gerlich D, Koch B, Ellenberg J, Peters JM.(2004). Distinct functions of condensin I and II in mitotic chromosome assembly. J Cell Sci. ;117(Pt 26):6435-45. Epub 2004 Nov 30.

72. Howell FM, Frese W. (1982) Early transition into adult roles: some antecedents and some outcomes. Am Educ Res У;19(1):51-73.

73. J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. CSH Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. "Molecular cloning" a laboratory manual/ second editionj

74. Jessberger R, Riwar B, Baechtold H, Akhmedov AT. (1996). SMC proteins constitute two subunits of the mammalian recombination complex RC-1 .EMBOJ. ;15(15):4061-8.

75. Jesberger R., Christ F., Gasser S.M. (1998) Chromosome dynamics : the SMC protein family. Curr. op. in genetics & development, 8: 254-259.

76. Jordan EG. (1991) Interpretating nucleolar structure: where are the transcribing genes? J. Cell Science 98: 437-442.

77. Karasaki S. (1967) An electron microscope study on the crystalline structure of the yolk platelets of the lamprey egg. J Ultrastruct Res.; 18(3):377-90.

78. Kessel RG, Beams HW. (1963) Nucleolar extrusion in oocytes of Thyone Briareus. Exp Cell Res.; 32:612-615.

79. Kimura K., Rubenkov V., Crisona N.J., Hirano Т., Cozzarelli N. R. (1999) 13S condensing actively reconfigures DNA by introducing global positive writhe: implications for chromosome condensation. Cell, 23: 239-248.

80. Kimura, К. and Hirano, Т. (1997) ATP-dependent positive supercoiling of DNA by 13S condensin: A biochemical implication for chromosome condensation. Cell 90: 625-634.

81. Kimura, K. and Hirano, T.(2000) Dual roles of the 11S regulatory subcomplex in condensing functions. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 11972-11977.

82. Kimura, K., Hirano, M., Kobayashi, R., and Hirano, T. (1998) Phosphorylation and activation of 13S condensin by Cdc2 in vitro. Science 282: 487-490.

83. Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, Т., and Belmont, A.S. (2004) Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. J. Cell Biol. 166: 775-785.

84. Kloc M, Etkin LD. (1995) Two distinct pathways for the localization of RNAs at the vegetal cortex in Xenopus oocytes. Development.', 121(2):287-97.

85. Kloc M, Matuszewski B, Nurkowska J. (1995) Ribosomal gene amplification in the oocytes of Creophilus maxillosus (Staphylinidae, Coleoptera-polyphaga)~an insect with telotrophic ovaries. Folia Histochem Cytobiol.;33(4):267-76.

86. Kobe B, Kajava AV.(2000). When protein folding is simplified to protein coiling: the continuum of solenoid protein structures. Trends Biochem Sci. ;25(10):509-15.

87. Knibiehler B, Mirre C, Rosset R. (1982) Nucleolar organizer structure and activity in a nucleolus without fibrillar centres: the nucleolus in an established Drosophila cell line. J Cell Sci.; 57:351-64.

88. Macgregor HC. (1972) The nucleolus and its genes in amphibian oogenesis. Biol Rev Camb Philos Soc.; 47(2): 177-210.

89. Mais С, Scheer U. (2001) Molecular architecture of the amplified nucleoli of Xenopus oocytes. J Cell Sci.; 114(Pt 4):709-l 8.

90. Meier UT, Blobel G. (1992) Noppl40 shuttles on tracks between nucleolus and cytoplasm. Cell.\ 70(l):127-38.

91. Melby ТЕ, Ciampaglio CN, Briscoe G, Erickson HP.(1998). The symmetrical structure of structural maintenance of chromosomes (SMC) and MukB proteins: long, antiparallel coiled coils, folded at a flexible hinge. J Cell Biol. ;142(6): 1595-604.

92. Michaelis C, Ciosk R, Nasmyth K. (1997) Cohesins: chromosomal proteins that prevent premature separation of sister chromatids. Cell. 91(l):35-45.

93. Taylor EM, Moghraby JS, Lees JH, Smit B, Moens PB, Lehmann AR. (2001). Characterization of a novel human SMC heterodimer homologous to the Schizosaccharomyces pombe Radl8/Sprl8 complex. Mol Biol Cell. ;12(6): 1583-94.

94. Tollervey D, Lehtonen H, Jansen R, Kern H, Hurt EC. (1993). Temperature-sensitive mutations demonstrate roles for yeast fibrillarin in pre-rRNA processing, pre-rRNA methylation, and ribosome assembly. Cell. ;72(3):443-57.

95. Toth A, Ciosk R, Uhlmann F, Galova M, Schleiffer A, Nasmyth K. (1999) Yeast cohesin complex requires a conserved protein, Ecolp(Ctf7), to establish cohesion between sister chromatids during DNA replication. Genes Dev. 13(3):320-33.

96. Miller OL Jr (1981) The nucleolus, chromosomes and visualization of genetic activity. J Cell Biol. 91: 15s-27s.

97. Millonig G, Bosco M, Giambertone L. (1968) Fine structure analysis of oogenesis in sea urchins. J Exp Zool.; 169(3):293-313.

98. Morgan GT (2002). Lampbrush chromosomes and associated bodies: new insights into principles of nuclear structure and function. Chromosome Res 10: 177-200.

99. Neuwald, A.F. and Hirano, T. (2000) HEAT repeats associated with condensins, cohesins and other chromosome-related complexes. Genome Res. 10: 1445-1452.

100. Olson M. O.J., Dundr M., Szebeki A. (2000) The nucleolus an old factory with unexpected capabilitis. Cell biology, 70:

101. Опо, Т., Fang, Y., Spector, D., and Hirano, T. (2004). Spatial and temporal regulation of condensins I and II in mitotic chromosome assembly in human cells. Mol. Biol. Cell. 15: 32963308.

102. Опо, Т., Losada, A., Hirano, M., Myers, M.P., Neuwald, A.F., and Hirano, T. (2003) Differential contributions of condensing I and condensin II to mitotic chromosome architecture in vertebrate cells. Cell 115: 109-121.

103. Peter M, Nakagawa J, Doree M, Labbe JC, Nigg EA. (1990). In vitro disassembly of the nuclear lamina and M phase-specific phosphorylation of lamins by cdc2 kinase. Cel.; 61(4):591-602.

104. Phillips SG. (1972) Repopulation of the postmitotic nucleolus by preformed RNA. J Cell Biol. 53: 611-623.

105. Rawlings SL, Matt GD, Huber PW. (1996) Analysis of the binding of Xenopus transcription factor IIIA to oocyte 5S rRNA and to the 5 S rRNA gene. J Biol Chem.; 271(2):868-77.

106. Revenkova, E., Eijpe, M., Heyting, C., Hodges, C.A., Hunt, P.A., Liebe, В., Scherthan, H., and Jessberger, R. (2004) Cohesin SMC1 is required for meiotic chromosome dynamics, sister chromatid cohesion and DNA recombination. Nat. Cell Biol. 6: 555-562.

107. Saka Y, Sutani T, Yamashita Y, Saitoh S, Takeuchi M, Nakaseko Y, Yanagida M. (1994). Fission yeast cut3 and cutl4, members of a ubiquitous protein family, are required for chromosome condensation and segregation in mitosis. EMBOJ. ;13(20):4938-52.

108. Saitoh, N. Goldberg, I.G., Wood, E.R., and Earnshaw, W.C. (1994). Sell: an abundant chromosome scaffold protein is a member of a family of putative ATPases with an unusual predicted tertiary structure. J. Cell Biol. 127, 303-318.

109. Scheer U, Benavente R. (1990) Functional and dynamic aspects of the mammalian nucleolus. Bioessays.; 12(1):14-21. Review.

110. Scheer U, Dabauvalle MC. (1985) Functional organization of the amphibian oocyte nucleus. Dev Biol; 1:385-430.

111. Scheer U, Hock R. (1999) Structure and function of the nucleolus. Curr Opin Cell Biol.; ll(3):385-90. Review.

112. Sheval' EV, Gulak PV, Kireev II, Chudinova EM, Fais D, Dzhangutstsa F, Poliakov VI. (2001) Characteristics of Actinomycin D-induced segregation of a "noncanonical" nucleolus of the sea urchin Paracentrotus lividus. Ontogenez.; 32(5):377-83.

113. Sleeman J, Lyon CE, Platani M, Kreivi JP, Lamond Al. (1998) Dynamic interactions between splicing snRNPs, coiled bodies and nucleoli revealed using snRNP protein fusions to the green fluorescent protein. Exp Cell Res.; 243(2):290-304.

114. Snaar S, Wiesmeijer K, Jochemsen AG, Tanke HJ, Dirks RW. (2000) Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol.; 151(3):653-62.

115. Spector DL, Lark G, Huang S. (1992) Differences in snRNP localization between transformed and nontransformed cells. Mol Biol Cell, 3:555-569.

116. Steffensen S, Coelho OA, Cobbe N et al. (2001) A role for Drosophila SMC4 in the resolution of sister chromatids in mitosis. Curr Biol 11: 295-307.

117. Strunnikov AV, Larionov VL, Koshland D. (1993) SMC1: an essential yeast gene encoding a putative head-rod-tail protein is required for nuclear division and defines a new ubiquitous protein family. J Cell Biol., 123(6 Pt 2): 1635-48.

118. Strunnikov AV, Hogan E, Koshland D.(1995) SMC2, a Saccharomyces cerevisiae gene essential for chromosome segregation and condensation, defines a subgroup within the SMC family. Genes Dev.Mar l;9(5):587-99.

119. Strunnikov A. V. (1998) SMC proteins and chromosome structure. Cell biology, 8: 454-459.

120. Strunnikov AV, Jessberger R. (1999) Structural maintenance of chromosomes (SMC) proteins: conserved molecular properties for multiple biological functions. Eur J Biochem. Jul; 263(1):6-13.

121. Sutani T, Yuasa T, Tomonaga T, Dohmae N, Takio K, Yanagida M (1999) Fission yeast condensin complex: essential roles of non-SMC subunits for condensation and Cdc2 phosphorylation of Cut3/SMC4. Genes Dev 13: 2271-2283.

122. Swedlow JR, Hirano T. (2003) The making of the mitotic chromosome: modern insights into classicalquestions. Mol Cell. Mar, ll(3):557-69. Review.

123. Taylor EM, Moghraby JS, Lees JH, Smit B, Moens PB, Lehmann AR. (2001) Characterization of a novel human SMC heterodimer homologous to the Schizosaccharomyces pombe Radl8/Sprl8 complex. Mol Biol Cell. Jun; 12(6):1583-94.

124. Thiry M, Cheutin T, O'Donohue MF, Kaplan H, Ploton D. (2000) Dynamics and three-dimensional localization of ribosomal RNA within the nucleolus. RNA.; 6(12):1750-61.

125. Thiry M, Thiry-Blaise L. (1991) Locating transcribed and non-transcribed rDNA spacer sequences within the nucleolus by in situ hybridization and immunoelectron microscopy. Nucleic Acids Res.-, 19(l):ll-5.

126. Tobler JE. (1975) Dosage compensation and ontogenic expression of suppressed and transformed Vermilion flies in Drosophila. Biochem Genet/, 13(l-2):29-43.

127. Tollervey D, Lehtonen H, Jansen R, Kern H, Hurt EC. (1993) Temperature-sensitive mutations demonstrate roles for yeast fibrillarin in pre-rRNA processing, pre-rRNA methylation, and ribosome assembly. Cell.; 72(3):443-57.

128. Uhlmann F, Lottspeich F, Nasmyth K. (1999). Sister-chromatid separation at anaphase onset is promoted by cleavage of the cohesin subunit Sccl .Nature. ;400(6739):37-42.

129. Uzbekov R, Timirbulatova E, Watrin E et al. (2003) Nucleolar association of pEg7 and XCAP-E, two members of Xenopus laevis condensin complex in interphase cells. J Cell Sci 116: 1667-1678.

130. Van Gansen P, Schram A. (1972) Evolution of the nucleoli during oogenesis in Xenopus laevis studied by electron microscopy. J Cell Sci.; 10(2):339-67.

131. Verkade HM, Bugg SJ, Lindsay HD, Carr AM, O'Connell MJ. (1999) Radl8 is required for DNA repair and checkpoint responses in fission yeast. Mol Biol Cell.; 10(9):2905-18.

132. Waizenegger 1С, Hauf S, Meinke A, Peters JM. (2000) Two distinct pathways remove mammalian cohesin from chromosome arms in prophase and from centromeres in anaphase. Cell. ; 103 (3):399-410.

133. Watrin E, Cubizolles F, Osborne HB, Le Guellec K, Legagneux V. (2003) Expression and functional dynamics of the XCAP-D2 condensin subunit in Xenopus laevis oocytes. J Biol Chem.; 278(28):25708-15. Epub 2003 May 2.

134. Wignall, S.M., Deehan, R., Maresca, T.J., and Heald, R. (2003) The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 161: 1041-1051.

135. Wu Z, Gall JG. (1997) "Micronucleoli" in the Xenopus germinal vesicle. Chromosoma; 105(7-8) :43 8-43.

136. Yu, H.-G. and Koshland, D.E. (2003) Meiotic condensin is required for proper chromosome compaction, SC assembly, and resolution of recombination-dependent chromosome linkages. J. Cell Biol. 163: 937-947.

137. Zatsepina OV, Rousselet A, Chan PK, Olson MO, Jordan EG, Bomens M. (1999) The nucleolar phosphoprotein B23 redistributes in part to the spindle poles during mitosis. J Cell Sci.; 112 (Pt 4):455-66.1. БЛАГОДАРНОСТИ.t/d (J4 * "TXV1. С/ a . tfwг/ (У/с/о