Иммуномолекулярные показатели при первичной открытоугольной глаукоме тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.07, кандидат наук Бен Режеб Амин

• Бен Режеб Амин
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Бен Режеб Амин

1.1 Патофизиологические аспекты глаукомной оптической нейропатии

1.2 Иммуномолекулярные аспекты глаукомы... 21 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика клинического материала

2.2 Офтальмологические методы исследования

2.3 Иммунологические методы исследований

2.4 Морфологические методы исследований

2.5 Методы статистического анализа

ГЛАВА 3. ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ НЕЙРОНАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ В ТКАНЯХ ГЛАЗ С ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМОЙ

3.1 Морфологические исследования с верификацией диагноза

3.2 Иммуногистохимическая оценка экспрессии основного белка миелина в тканях глаза

3.3 Иммуногистохимическая оценка экспрессии нейроспецифической энолазы

в тканях глаз с терминальной глаукомой

3.4 Результаты иммунного картирования сетчатки с тремя маркерами нейрональной дифференцировки

ГЛАВА 4. КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НАРУШЕНИЙ СИСТЕМНОЙ ПРОДУКЦИИ АНТИТЕЛ К НЕЙРОНАЛЬНЫМ БЕЛКАМ С МОРФОМЕТРИЧЕ-СКИМИ, ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ И ГИДРОДИНАМИЧЕСКИМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ ПРИ ПОУГ

4.1 Изучение характера нарушений системной продукции антител при ПОУГ

во взаимосвязи со стадией заболевания

4.2 Изучение корреляционной взаимосвязи системной продукции нейрональных антител с функциональными и морфометрическими показателями

4.3 Изучение нарушения системной продукции антител к основному белку миелина во взаимосвязи с гидродинамическими показателями

4.4 Системная продукция антител к МВР во взаимосвязи со зрительными дисфункциями

4.5 Изучение типов иммунных нарушений во взаимосвязи со зрительными дисфункциями

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АГ - антиген

АД - артериальное давление

АПК - антигенпрезентирующие клетки

АТ - антитело

АУЗ - аутоиммунное заболевание

аутоАТ - аутоантитела

аутоАГ - аутоантигены

ВГД - внутриглазное давление

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ГКС - ганглиозные клетки сетчатки

ГОБ - гематоофтальмический барьер

ГОН - глаукомная оптическая нейропатия

ГОБ - гематоофтальмический барьер

ДЗН - диск зрительного нерва

ДСС - диффузное снижение светочувствительности ЗН - зрительный нерв

ИГХ -иммуногистохимическиеисследования

ИС - иммунная система

КАР - канцер-ассоциированная ретинопатия

КБ - коэффициент Беккера

коэфф. корр. - коэффициент корреляции

МРТ - магнитно-резонансная томография

НРП - нейроретинальный поясок

НСБ - нейроспецифические белки

НТГ - нормотензивная глаукома

ОКТ - оптическая когерентная томография

ОН - оптическая нейропатия

ПНС - периферическая нервная система

ПОУГ - первичная открытоугольная глаукома

ППХА - перипапиллярная хориоретинальная атрофия

ПСД - первичная сосудистая дисрегуляция

СНВС - слой нервных волокон сетчатки

4

Ср. - средняя (ий)

САП- статическая автоматическая периметрия

СК - сыворотка крови

ТПА - тканевой активатор плазминогена

ТФР-В2 - трансформирующий фактор роста В2

УПК - угол передней камеры

ФНО - фактор некроза опухоли

ЦНС - центральная нервная система

Э/Д - отношение диаметра экскавации к диаметру диска

ЭКМ - экстраклеточный матрикс

Avg. Thick - средняя толщина слоя нервных волокон

С - коэффициент легкости оттока внутриглазной жидкости

C/D Horiz. Ratio - отношение диаметра экскавации к диаметру ДЗН по горизонтали C/DVert.Ratio - отношение диаметра экскавации к диаметру ДЗН по вертикали CupArea - площадь экскавации CupDiameter - диаметр экскавации

Cup/DiskAreaRatio - отношение диаметра экскавации к диаметру диска

CupVolumeTopo - объем экскавации

DiscArea - площадь диска

DiscDiameter - диаметр диска

ENO-1 - энолаза-1

EGS - Европейское глаукомное общество

F - минутный объем секреции внутриглазной жидкости

FM - минимальная толщина фовеа

FOV - средняя толщина сетчатки в фовеа

FOV1 - объем в фовеа

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа GDNF - глиальный нейротрофический фактор GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок Horiz. Integrated Rim Width Area - интегрированнаяширина HSP - белки теплового шока

IAVG - средняя толщина слоя нервных волокон сетчатки в нижнем отделе Ig - иммуноглобулин

IIM - средняя толщина сетчатки в нижне-внутренней зоне макулы IOM - средняя толщина сетчатки в нижне-наружной зоне макулы

5

MBP - основной белок миелина

MD - средне-группового отклонения дефекта от возрастной нормы MS - средне-групповая светочувствительность MYOC - миоциллин

NAVG - средняя толщина слоя нервных волокон сетчатки в носовом отделе NIM - средняя толщина сетчатки в назально-внутренней зоне макулы NMDA - N-methyl-D-aspartate - подтип ионотропных рецепторов NF - нейрофиламент

NOM - средняя толщина сетчатки в назально-наружной зоне макулы

NOS - синтаза окиси азота

NSE - нейрон-специфическая энолаза

OR - фракция наружной сетчатки

Ро - истинное внутриглазное давление

RimArea - площадь нейроретинального пояска

RimLength - протяженность нейроретинального пояска

RNFL Thickness - слой нервных волокон сетчатки

SAVG - средняя толщина слоя нервных волокон сетчатки в верхнем отделе SIM - средняя толщина сетчатки в верхне-внутренней зоне макулы SLV - корректированная вариабельность снижения светочувствительности SOM - средняя толщина сетчатки в верхне-наружной зоне макулы SY - синаптофизин

TAVG - средняя толщина слоя нервных волокон сетчатки в височном отделе Тр4 - тимозин-бета

TIM - средняя толщина сетчатки в височно-внутренней зоне макулы TOM - средняя толщина сетчатки в височно-наружной зоне макулы TV - общий макулярный объем

Vert. IntegratedRimAreaVol. - интегральный объем нейроретинального пояска

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы

Согласно определению заболевания Европейского Глаукомного общества (EGS, 2008) «Глаукома - это хронически прогрессирующая оптическая нейропатия, сопровождаемая характерными морфологическими изменениями в головке зрительного нерва и слое нервных волокон сетчатки при отсутствии другой глазной патологии и врожденных аномалий. Заболевание характеризуется прогрессирующей потерей ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и изменениями полей зрения, вызванными этой потерей.»

По данным Quigley Н. реальное число больных глаукомой на земном шаре достигает 80 млн человек, из них 50% в развитых странах и 90% - в развивающихся странах мира не знает о своем заболевании (Quigley Н., 2006).

Высокий процент недиагностированной глаукомы в развитых странах отчасти свидетельствует о несовершенстве диагностических технологий. Сегодня инструментальную диагностику глаукомы нельзя назвать ранней, даже с помощью комбинированных методов исследований структурных и функциональных изменений. Установлено, что далеко не всегда потеря 50% нервных волокон ГКС на периферии сетчатки проявляется изменениями полей зрения, а потеря 50% ГКС в центре или в радиусе 12° от центра фовеа снижает световую чувствительность на 5 дБ. Заметим, речь идет о половине нашего ресурса ГКС. В среднем до 25-35% ГКС погибают прежде, чем появляются первые статистически значимые отклонения в поле зрения (Курышева Н.И., 2015г, Kerrigan-BaumrindL.A., 2000; MedeirosF.A., 2012, HoodDC, 2014). Как правило, морфометрические изменения в сетчатке и ДЗН предшествуют функциональным (ArtesP.H, 2002;HoodD.C., 2007; LeungC.K., 2011;RazaAS,2011). Однако возможны и противоположные ситуации: функциональные нарушения выявляются раньше структурных (MigliorS.2005; QuigleyH.A., 2003, WuZ., 2017.).

Несмотря на постоянную модернизацию и совершенствование программного обеспечения приборов (ОКТ), их разрешающие возможности далеки от идеальных. Hood D.C показал, что среди больных глаукомой, верифицированных методом ОКТ, 89% имеют периметрическую, а 11% -препериметрическую стадию глаукомы, выявленную методом статической автоматизированной периметрии (САП). При этом средний ожидаемый процент потерь ГКС на периметрической стадии достигает 41%, а на препериметрической - 17%. (Курышева Н.И., 2015; HoodD.C., 2007). Между тем, выявление изменений в ДЗН и периметрических дефектов на этапе первичной диагностики повышает риск односторонней

слепоты до 54% и двусторонней - до 22% на протяжении 20 лет. В то время, как в отсутствие указанных изменений эти показатели составляют 14% и 4%. (Курышева Н.И., 2015).

Причиной слепоты является оптическая нейропатия (ГОН), морфологически проявляющаяся апоптозом ганглиозных клеток сетчатки, их аксонов и дендритов, истончением сетчатки и экскавацией ДЗН, а также потерей клеток в наружных коленчатых телах. При глаукоме пусковые механизмы апоптоза нейронов не известны. В качестве причинных факторов рассматривают ишемию и реперфузию, снижение уровня нейротрофических факторов или гипоэкспрессию рецепторов, чувствительных к ним, а также, нарушение поступления сигнальной информации к нейронам от других отделов зрительного анализатора. Апоптоз контролируется и запускается каскадом сигнальных молекул. В связи с этим, чрезвычайно актуальным является поиск универсальных иммуномолекулярных маркеров глаукомы. Такие маркеры раскрывают возможности доклинической диагностики заболевания и являются ключом к расшифровке молекулярных механизмов патогенеза и патогенетически ориентированных терапевтических стратегий.

Цель работы: изучить иммуномолекулярные показатели при первичной открытоугольной глаукоме.

При достижении цели решали следующие задачи :

1. Провести морфологические (иммуногистохимические) исследования сетчатки, зрительного нерва и цилиарного тела и верифицировать структуры, экспрессирующие нейроспецифические антигены - у-энолазу и основной белок миелина, обосновать их выбор в качестве маркеров первичной открытоугольной глаукомы.

2. Изучить распространенность и серологические показатели антител к а- и у-энолазе, основному белку миелина и родопсину у здоровых лиц и больных с различными стадиями первичной открытоугольной глаукомы.

3. Проанализировать зрительные нарушения у больных глаукомой во взаимосвязи с продукцией антител к а- и у-энолазе, основному белку миелина, родопсину.

4. Провести корреляционный анализ морфометрических параметров сетчатки и зрительного нерва с серологическими показателями антител к а- и у-энолазе, основному белку миелина и родопсину.

5. Изучить взаимосвязь гидродинамических нарушений (по данным тонографии) и системной продукции антител к основному белку миелина при глаукоме.

Основные положения, выносимые на защиту диссертационной работы:

Первичная открытоугольная глаукома манифестирует на фоне синхронного снижения системной продукции антител к а- и у-энолазе (р<0,05, р<0,01), свидетельствующего о ранних нарушениях молекулярного гомеостаза в нейронах сетчатки, повышения системной продукции каталитических антител к основному белку миелина (р<0,05), свидетельствующего о нарушении ремиелинизации на уровне проводящих путей зрительного анализатора; дефицита антител к родопсину (р<0,001), свидетельствующего о фотострессе фоторецепторов и вовлечении их в патогенез заболевания, что в совокупности позволяет считать эти антитела маркерами глаукомы.

Иммуногистохимические доказательства экспрессии у-энолазы фоторецепторами, биполярами и ганглиозными клетками сетчатки - главными мишенями глаукомы, наличие обратной корреляции серологических показателей антител к у-энолазе с толщиной слоя нервных волокон сетчатки (р<0,05), параметрами нейроретинального пояска (р<0,01), корреляции с центральной остротой зрения (р<0,001) свидетельствуют о связи этих антител с клинико-функциональными проявлениями заболевания, что доказывает их статус «иммуномолекулярных маркеров» первичной открытоугольной глаукомы.

Экспрессия основного белка миелина беспигментным эпителием цилиарных отростков, гладкомышечными клетками и миелинизированными аксонами периферических нервов цилиарного тела, наличие обратной корреляции интенсивности экспрессии с продолжительностью заболевания, прямой корреляции системной продукции антител к основному белку миелина с гидродинамическими нарушениями глаза, в комплексе с деструкцией миелинизированных аксонов цилиарного тела и зрительного нерва на глазах с терминальной глаукомой свидетельствуют о нарушении миелинизации на уровне местной продукции белка, системной продукции антител к нему, а также о том, что наряду с аксонами зрительного нерва, в нейродегенеративные процессы при открытоугольной глаукоме вовлекаются аксоны периферической нервной системы.

Научная новизна работы

1. Впервые на глазах с терминальной глаукомой проведено ИГХ картирование сетчатки и зрительного нерва, а также цилиарного тела с верификацией в них клеточных структур, экспрессирующих нейроспецифические антигены - у-энолазу и основной белок миелина, подтверждающее их статус «иммуномолекулярных маркеров» ПОУГ.

2. Впервые выполнены комплексные серологические исследования с количественной оценкой антител к нейроспецифическим антигенам (а и у-энолазе, основному

белку миелина и родопсину) в группе больных ПОУГ, раскрывающие возможности их применения в лабораторной диагностике заболевания.

3. Впервые представлен анализ типов нарушений антителопродукции на уровне системного аутоиммунитета и подтверждена их взаимосвязь с ГОН.

4. Представлены иммуногистохимические и иммунологические доказательства нарушения миелинизации аксонов периферической и центральной нервной системы с участием каталитических аутоантител к основному белку миелина в механизмах развития и прогрессирования ПОУГ.

5. Подтверждено морфологически и иммунологически (антитела к родопсину) вовлечение фоторецепторов в патологические реакции при ГОН.

Теоретическая значимость работы заключается в расширении и углублении представлений о связи нарушений системного аутоиммунитета с клиническими, морфометрическими, гидродинамическими и периметрическими проявлениями глаукомы.

Практическая значимость работы заключается в идентификации и обосновании информативных иммуномолекулярных маркеров ПОУГ, с уточнением их диагностического потенциала.

Методология и методы исследования

Диссертация ориентирована на углубленный поиск и предоставление доказательств участия иммуномолекулярных механизмов в патогенезе ПОУГ. В работе применяли инновационные биотехнологии (иммуногистохимические исследования на основе моноклональных антител к нейроспецифическим белкам), позволяющие визуализировать зону иммунного конфликта в глазу и локализовать место экспрессии антигена. Иммуномолекулярные исследования периферической крови выполняли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Наряду с этим, в первичной диагностике ПОУГ использовали высокотехнологичные диагностические инструменты последнего поколения (оптическую когерентную томографию, статическую автоматическую компьютерную периметрию). Доказательность базы усиливали комплексным корреляционным анализом количественных показателей иммуномолекулярных маркеров с морфометрическими параметрами, данными тонографии, а также экспертными критериями периметрии.

Степень достоверности результатов

Степень достоверности результатов исследования основывается на адекватных и апробированных методах сбора клинического материала (82 пациента, 164 глаз), применении современных методов исследования, а также использовании современных методов обработки информации и статистического анализа, включая параметрические и непараметрические тесты.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуномолекулярные показатели при первичной открытоугольной глаукоме»

Внедрение работы

Теоретические и практические положения, разработанные в диссертационном исследовании, внедрены в научно-практическую и педагогическую деятельность кафедры глазных болезней Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Российский университет дружбы народов», кафедры офтальмологии ФМБА.

Апробация и публикация материалов исследования

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 3 и 4 международной научно-практической конференции «Современная парадигма научного знания: актуальность и перспективы.» (23 апреля 2015 г., Москва; 13 апреля 2016 г Москва), VIII Международной Научной конференции молодых ученых «8С1ЕКСЕ4НЕАЬТН 2017» в Российском Университете Дружбы Народов (13-15 апреля 2017г, г.Москва), Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии (8 апреля 2016 года, г Казань), на 51-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции «Год здравоохранения: перспективы развития отрасли» (19-20 мая 2016 г, Ульяновск). Диссертация апробирована на кафедре глазных болезней ФГАО УВО «Российский университет дружбы народов» (30.06.2017).

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, 7 из них - в журналах, входящих в перечень рецензируемых журналов и изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследований», двух глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений, списка литературы. Работа иллюстрирована 29 рисунком, 26 таблицами. Список литературы содержит 299 источника, из них 84 отечественных и 215 зарубежных.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ И ИММУНОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АСПЕКТАХ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ

ГЛАУКОМЫ.

«Глаукома - это неуклонно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, основным проявлением которого является глаукомная оптическая нейропатия (ГОН). Глаукома признана второй по значимости причиной необратимой слепоты. (WorldHealthOrganizationFactsheet 282, Nov. 2004. www. who.int/mediacentre/factsheets).

1.1 Патофизиологические аспекты глаукомной оптической нейропатии

Глаукома относится к мультифакториальным заболеваниям с пороговым эффектом и развивается в тех случаях, когда совокупность неблагоприятных факторов превысит некоторый порог, необходимый для включения патофизиологических механизмов болезни. Эксперты полагают, что несколько патогенных механизмов (факторов), действующих на аксоны и тела ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) одновременно или в разной последовательности, могут привести к их гибели. Условно эти механизмы подразделены на первичные и вторичные. К первичным патогенным механизмам относят офтальмогипертензию, нарушения микроциркуляции в зрительном нерве на уровне преламинарной пластины и нарушения аксоплазматического тока, морфоперестройку ламинарной нейроглии и соединительной ткани. К вторичным патогенным механизмам относят эксайтотоксичность глутамата, выпущенного поврежденными нейронами, окислительный стресс, вызванный избытком оксида азота (N0) и другими активными формами кислорода. Суммарный результат комплексного воздействия этих факторов приводит к смерти ГКС и необратимой слепоте (KaushikS, 2003).

Офтальмогипертензия - как патогенный фактор глаукомы Сравнительно недавно повышение ВГД считали главным виновником гибели ГКС. На экспериментальной модели глаукомы офтальмогипертензионного типа у крыс доказана прямая связь между объемом потерь ГКС и их аксонов с одной стороны, и уровнем ВГД, его флуктуацией (LiG , 2005; MorrisonJC, 1997; ChauhanBC, 2002; Levkovitch-VerbinH., 2002;), продолжительностью офтальмогипертензии, с другой стороны (ChauhanBC, 2002; Levkovitch-VerbinH, 2002; MittagTW., 2000). В течение первых 3-х месяцев офтальмогипертензии гибнут 50% ГКС (MittagTW, 2000; WoldeMussieE, 2001; NaskarR, 2002). Триггерная роль офтальмогипертензии в запуске апоптоза ГКС (JohnsonEC, 1996; PeaseME. 2000; WoldeMussieE, 2001; Garcia-ValenzuelaE. 1992) и двухфазность патологического процесса подтверждены экспериментально. Продолжительность первой фазы составляет 3 недели, а второй - месяцы. Еженедельный объем потерь на 1 фазе достигает 12% ГСК. Гибель нейронов во второй фазе

протекает медленно ^оМеМш81еЕ, 2001). Основным механизмом гибели нейронов в 1 фазу признан апоптоз, индуцированный офтальмогипертензией (А§агА, 2000). Потеря нейронов на втором этапе обусловлена токсическим действием продуктов гибели нейронов, вызванной офтальмогипертензией (ЬеукоуйсЬ^егЫпН, 2002). Вполне очевидно, что офтальмогипертензия играет важную роль в повреждении ГКС при глаукоме. Снижение офтальмогипертензии замедляет прогрессирование ГОН. Признание этого факта положено в основу всех хирургических и фармакологических стратегий лечения глаукомы. Однако контроль ВГД не всегда обеспечивает стабилизацию зрительных функций и остановку прогрессирования заболевания (Яо88ей1Ь, 1993; СЬаиЬапВС, 1995^оМеМш81еЕ., 2001). Кроме того, только 3050% больных ПОУГ имеют офтальмогипертензию на начальных этапах заболевания (Оир1аК 2007; К1етВЕ 1992; Т1е^сЫМ, 1991), а остальные 50% страдают нормотензивной глаукомой (НТГ) (НепёпскхКН, 1994). Приведенные факты свидетельствуют, что офтальмогипертензия -не единственная причина ГОН.

Сосудистая недостаточность - как патогенный фактор глаукомы

Доказана связь глаукомы с мигренью ^ап§Л, 1997; Сигее1ГепС, 2000;0'ВпепС,1997; Сигее1ГепС., 2000;)и периферическими сосудистыми нарушениями (ОаББА, 1997; 0'ВпепС, 1999). Это предполагает нарушение контроля регуляции мозгового и периферического кровотока. Ответственность за дисрегуляцию возлагают на эндотелин-1, повышающий чувствительность к вазоконстрикции. Роль этого вазоконстриктора в патогенезе ГОН косвенно подтверждает его высокая концентрация в камерной влаге и крови больных ПОУГ (СеШшМ, 1997; Те2еЮ, 1997; NoskeW, 1997; Но11оО 1998;Оа8вА, Е1ашшег1,1997). На положительную связь ПОУГ с сосудистыми нарушениями указывает распространенность в популяции больных ПОУГ панцеребральной ишемии, верифицированной томографически (МРТ) (81хошапОА, 1995) и эхографически (СеШшМ, 1997), и высокая частота инфарктов мозга (0п§К, 1995). Косвенно роль сосудистых нарушений подтверждает их общий с ПОУГ фактор риска - пожилой возраст. С увеличением возраста снижается церебральная и глазная перфузия в тандеме с ростом заболеваемости ПОУГ (На^А, 2000). Указанные факты легли в основу гипотезы, согласно которой повреждение нейронов при глаукоме представляет собой хроническую ишемическую переднюю оптическую нейропатию. Ее основателем был С.Н.Федоров (С.Н.Федоров, 2000).

Приток крови к сетчатке и зрительному нерву необходим для удовлетворения их высоких метаболических потребностей. Постоянство объема кровотока в глазу обеспечивает эффективный механизм ауторегуляции, действующий в артериях, артериолах и капиллярах в границах физиологических колебаний глазного перфузионного давления. Этот механизм зависит не только от системного артериального давления, но и ВГД (ВША, 1990). С возрастом

механизмы ауторегуляции ослабевают. В эксперименте у молодых крыс в ответ на индуцированную офтальмогипертензию развивалась гиперперфузия хориоидеи, в то время как у старых особей прироста хориоидальной перфузии не происходило (MatsuuraK, 1998). Таким образом, дефекты ауторегуляции, приводящие в пожилом возрасте к ишемии, способствуют к нарушению кровотока в головке ЗН и сетчатке (GrunwaldJE., 1999) и, как следствию, - развитию ГОН (MichelsonG, 1998). ПОУГ и НТГ ассоциируются с хронической ишемией сетчатки и зрительного нерва (MichelsonG, 1998; ChungHS,1999,BonomiL. 2000), особенно у людей с низким уровнем артериального давления, приводящего к снижению глазного перфузионного давления (GrunwaldJE., 1999; BonomiL 2000). Снижение диастолического и перфузионного давления признано важным фактором риска развития ПОУГ (BonomiL 2000).

Доподлинно неизвестно, что служит триггером апоптоза ГКС: офтальмогипертензия / сосудистый фактор/ перестройка ЭКМ/ другие события.. Сосудистые нарушения и офтальмогипертензия влекут за собой каскад сходных реакций. Оба фактора обладают собственным независимым патогенным потенциалом. Доказана их прямая связь с индукцией апоптоза ГКС. Однако молекулярные механизы, ведущие к гибели ГКС по причине сосудистой дисрегуляции мало изучены. Выявлены лишь некоторые молекулы, «сцепленные» с ишемией. Например, с вазоспастической НТГ связывают повышение уровня и активности ММП-9 в циркулирующих лейкоцитах (GolubnitschajaO, 2000), в тандеме с ММП-9 растет и уровень ММП-2 в слезе (Леванова О., 2012, 2013, 2014, Сколов В.А., 2013,2014, 2016) и тканях глаз с ПОУГ. Заметим, очередность вступления молекул в «сценарий» патогенеза глаукомы доподлинно не известна. Активность ММП может повышаться в ответ на ишемию или гиперэкспрессию эндотелина-1 и фактора некроза альфа (ФНО а) (NakazawaT, 2006; YuanL, 2001). Полагают, что ММП способствует нарушению гематоофтальмического барьера (ГОБ), разрежению экстраклеточного матрикса (ЭКМ) в хориоидее и сетчатке (ZhangX., 2004; AgapovaOA, 2001), и запуску апоптоза ГКС через утрату межнейрональных контактов, (Garcia-Valenzuela 1995; GolubnitschajaO, 2004, Agarwal B 2009SIBalendra, 2015). Заметим, в этом случае не ясно, перестройка ЭКМ - первичное событие или эпифеномен по отношению к апоптозу? С одной стороны, ЭКМ отвечает за обеспечение сигнальной связи и выживаемость нейронов (WerbZ. 1997). Соответственно, разрежение ЭКМ может прервать межклеточное взаимодействие и привести к апоптозу. Но тогда, перестройка ЭКМ трабекулярной сети, сетчатки и ДЗН должна предшествовать развитию ГОН. Однако факты указывают, что электрофизиологические признаки ГОН могут предшествовать морфометрическим, то есть перестройке ЭКМ (Маслова Е.В., 2017). С другой стороны, если апоптоз вызван офтальмогипертензией, то перестройка ЭКМ трабекулярной сети и сетчатки должны развиваться синхронно или до офтальмогипертензии. В этом случае всплеск активности ММП

14

должен предшествовать обоим феноменам. Заметим, офтальмогипертензия отражает гидродинамические нарушения на уровне оттока в трабекулярной сети. Морфологически в культуре туНгв она сопровождается изменением трабекулярного эндотелия (С1агкАБ, 1995) и плотности его монослоя (А1уагаёо1, 1984; Опегеоп!, 1987), 1т>1ув - изменением организации ЭКМ (Ьифп-БгесоИЕ, 1986; КперрегРА, 1986; Ьи^еп-БгесоИЕ, 1996).

Показано, что в глаукоматозных глазах нарушена экспрессия коллагена I и IV, трансформирующего фактора роста В2 (ТФР-В2), ММП-1, отвечающих за состояние ЭКМ (■ГоЬ^опЕС, 1996; РепаГО, 1999; Согёе1гоМБ, 2002). По мнению ЬЮ., повышение активности ММП-9 в апоптотирующих нейронах, наряду со снижением экспрессии ламинина в слое ГКС, свидетельствует о том, что деградация ЭКМ сетчатки развивается в ответ на офтальмогипертензию (ЬЮ, 2005). Ламинин является важной составляющей ЭКМ, обеспечивающей выживание клеток. Распад и потеря ламинина на фоне гиперэкспрессии ММП-9 приводит к утрате межклеточных контактов (WerbZ., 1997) и нарушению взаимодействия клеток с ЭКМ, и как следствие - запуску апоптоза (GrossmannJ. 2002). Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что секреция ММП-9 повышается в ответ на офтальмогипертензию, приводя к апоптозу ГКС.

По другой версии гиперэкспрессия ММП при офтальмогипертензии развивается под влиянием нейротрансмиттера глутамата. Рецепция и активность рецепторов глутамата в клетках сетчатки прямо коррелирует с экспрессией ММП-9 (СЬаиЬапВС. 1995). Первыми активируются астроциты сетчатки (УапХ, 2000), высвобождая молекулы ММП и запуская ремоделирование ЭКМ (А§ароуа0А, 2001). Как бы то ни было в реалиях, гибель ГКС ассоциируется с гиперэкспрессией ММП-1 и ММП-9, нарушением ЭКМ, что позволяет выдвинуть эти молекулы в качестве потенциальных маркеров ранней диагностики ПОУГ.

Кроме того, не исключена версия механического повреждения аксонов в области головки зрительного нерва (Волков В.В., 2000). Механический фактор проявляется деформацией решетчатой пластинки склеры с ущемлением пучков нервных волокон, питающих их сосудов и нейроглии, в ее канальцах. Согласно биомеханической концепции профессора В.В. Волкова это может происходить как при офтальмогипертензии, так и на фоне нормотензии. Деформация решетчатой пластинки склеры при нормальном ВГД развивается на фоне снижения ликворного и тканевого давления в ретробульбарном отделе зрительного нерва, вследствии этого увеличивается градиент давления на пластинку, и она прогибается (Волков В.В., 2000).

И, наконец, установлено, что офтальмогипертензия нарушает аксональный ток, блокируя поступление в ткани глаза факторов роста, обеспечивающих выживание нейронов в условиях

шокового и окислительного стресса, а также фотостресса, снижая их чувствительность к проапоптогенным механизмам. Установлено, что факторы роста и их рецепторы в тканях глаза контролируют и регулируют функциональную активность клеток, организацию их цитоскелета и компонентов ЭКМ. Клетки трабекулярной сети, астроциты зрительного нерва и клетки решетчатой пластины экспрессируют рецепторы к ряду факторов роста, таких как нейротрофный фактор мозга (BDNF) и ТФР ß2. Эти факторы роста играют важную роль в функционировании клеток трабекулярной сети и сетчатки. Транспортный ретроградный аксональный блок сетчатки, развившийся вследствие офтальмогипертензии, приводит к дефициту поступления из мозга BDNF - жизненно важного регулятора метаболизма и фактора выживаемости нейронов, повышая их уязвимость к триггерным механизмам апоптоза и способствуя завершению апоптоза в ходу (NickellsW. 1996). Апоптоз усиливается в условиях гиперэкспрессии ТФРß2 астроцитами, активированными офтальмогипертензией (PenaJD, 1999). Экспериментально доказано, что повышение ВГД активирует микроглию, приводит к потере олигодендроцитов зрительным нервом. Эти события предшествуют гибели ГКС (Nakazawa, 2006). Активированные астроциты зрительного нерва также гиперэкспрессируют проапоптогенный ФНО-а, который усиливает объем потерь нейронов, оказывая на аксоны ГКС прямое воздействие, и опосредованное - через индукцию синтазы окиси азота (NOS)-2 астроцитами (YuanL, 2000).

Роль глутамата в сетчатке ганглиозных гибели клеток

И, наконец, апоптоз ГКС может быть вызван токсичностью самого глутамата. В условиях гипоксии сетчатки, как известно, идет чрезмерное высвобождение глутамата (NealMJ, 1994). Аминокислота глутамат является важнейшим нейромедиатором ЦНС и сетчатки. В то же время, избыток глутамата нейротоксичен, степень этой токсичности зависит от концентрации и продолжительности действия. Острая токсичность высоких концентраций глутамата хорошо известна и описана Lucas DR в 1957 году. Автор наблюдал выраженную деструкцию ГКС после одной подкожной инъекции глутамата молодым мышам (LucasDR, 1957; NealMJ, 1994). В 1969 году OlneyJW описала «выраженное поражение сетчатки, развившееся при воздействии избыточного уровня возбуждающих (эксайтотоксичных) нейромедиаторов (OlneyJW. 1969). VorwerkCK показала, что небольшое, но хроническое повышение глутамата также токсично для ГКС (VorwerkCK, 2000).

Глутамат-индуцированная эксайтотоксичность опосредуются подтипом ионотропных NMDA -рецепторов (ChoiDW, 1987; NovelliA, 1988) Активация NMDA -рецепторов приводит к открытию ионных каналов, и поступлению внеклеточного Са2+ и Na+ в нейроны. Приток внеклеточного Са+, действуя в качестве вторичного мессенджера, активирует нисходящие

сигнальные пути, приводя к гибели клеток (ChoiDW., 1987; NovelliA., 1988; ManevH., 1989;

16

SucherNJ, 1997). Экзогенное введение антагонистов рецепторов NMDA в эксперименте предотвращало глутамат-индуцированную эксайтотоксичность (LiGuo, 2006).

Наряду с этим, NMDA-опосредованной эксайтотоксичности способствует тканевой активатор плазминогена (ТПА), присутствующий в нейронах сетчатки (KumadaM, 2005;).

Метаботропные не-NMDA-рецепторы активируются в качестве защитного механизма от NMDA-опосредованной токсичности глутамата в первичной культуре нейронов мозжечка (MontoliuC, 1997). Доказано invitro на культуре ГКС, что низкие концентрации глутамата активируют AMPA-KA рецепторы, проницаемые для Са2+, приводя к увеличению Са2+ в нейронах и снижению выживаемости ГКС (OtoriY, 1998). Рецепторы KA не являются синаптическими и обладают уникальными возможностями взаимодействия без синаптического глутамата. При низких концентрациях каината (1-5 мкм) уровень цитоплазматического Са2+ возрастает без деполяризации. Низкая концентрация каината провоцирует гибель ГКС, которая может быть ингибирована специфическими антагонистами KA-рецепторов. Каинат-ассоциированная токсичность, является следствием избыточного поступления Са2+ в клетку и может быть устранена полиаминами и фосфатазами кальция, подавляющими приток кальция. Таким образом, активация ионотропных глутаматных рецепторов может вызвать нейротоксический эффект вкупе с нейровозбуждением (NichollsD, 1990).

Активация рецепторов I группы mGluR также повышает возбуждение нейронов, тогда как группа II и III снижает синаптическую передачу. Поэтому антагонисты группы I mGluR, агонисты II и III группы mGluR в потенциале должны оказывать нейропротекторное действие (NicolettiF, 1996)

Для поддержания физиологической концентрации глутамата и защиты ГКС от эксайтотоксичной гибели, этот нейротрансмиттер должен быть выведен из синапсов. Глиальные клетки, особенно Мюллеровские клетки и астроциты, окружающие синапсы, экспрессируют глутаматный транспортер, способствующий очистке экстраклеточного пространства от глутамата путем ретранспортировки его внутрь глиальных клеток. Внутри глиальных клеток в присутствии глутамин-синтетазы глутамат преобразуется в глютамин. Глютамин нетоксичен, выделяется глиальными клетками, и может быть вновь поглощен нейронами, где он снова преобразуется в глутамат в присутствии глютаминазы. Таким образом, пополняется запас нейромедиаторов и предотвращается токсичность глутамата в норме (MorenoMC, 2005).

В экспериментальных моделях глаукомы у крыс, протекающей с офтальмогипертензией, глутамат/глутаминовый цикл нарушается. Захват глутамата снижается, уменьшается активность глутаминсинтетазы, повышается поглощение глутамина, увеличивается выброс и повышается активность глютаминазы (Moreno, 2005; NaskarR, 2000). ИГХ-исследования глаз больных

17

глаукомой выявили уменьшение уровней транспортера глутамата, возбудителя транспортера аминокислоты (EAAT)-1, а также рецептора подтипа NMDAR1. Полагают, что потери EAAT-1 при ПОУГ объясняются повышенным уровнем глутамата в стекловидном теле и могут привести к компенсаторному подавлению рецепторов NMDAR-1 (RobertKP, 2006). В том же исследовании было отмечено, что интравитреальное введение глиального нейротрофического фактора (GDNF) крысам приводит к повышению уровня как EAAT-1, так и NMDAR-1 (RobertKP, 2006). Вариабельность экспрессии глутаматного транспортера GLT-1 наблюдали в ГКС людей и крыс. В норме GLT-1 экспрессируется только в фоторецепторах. Индукция экспрессии GLT-1 в ГКС с целью защиты от токсичных уровней глутамата указывает на важную роль нарушений глутаматного гомеостаза в гибели при глаукоме (ChristianM, 2003). Кроме того, изменения уровня транспортера глутамата на уровне м-РНК в острой и хронической модели сублетальных повреждений глаз, свидетельствуют о том, что эти изменения, вероятно, являются физиологической реакцией, регулируемой на транскрипционном уровне (ShenW, 2002). Вместе с тем, есть данные, как подтверждающие, так и опровергающие этот факт. Повышенные уровни глутамата наблюдали при экспериментальной глаукоме у перепела (DkhissiO, 1999) и обезьяны (DreyerEB, 1996), при задней ишемии зрительного нерва у крысы (KimTW, 2001), окклюзии ретинальной артерии с острой ишемией сетчатки (WakabayashiY, 2006). По другим данным, существенных различий в концентрации глутамата в стекловидном теле на глазах с экспериментальной глаукомой крыс и глаукомой человека не выявлено (Carter-DawsonL, 2002). Несмотря на спорные вопросы, эксайтотоксичность глутамата, потенциально может играть важную роль в нейродегенеративных изменениях при глаукоме. Однако только предстоит выяснить, являются ли эксайтотоксичность глутамата первоначальным ответом на повышенное давление и ишемию, или же это вторичной ответ ГКС.

Роль оксида азота при глаукоме

Наряду с глутаматом, эксайтотоксический эффект оказывают высокие концентрации оксида азота. Этот свободный радикал умеренной реактивности, войдя в клетку и объединяясь с супероксидом, производит высокореактивные свободные радикалы, способные вызывать массовые повреждения клеточных органелл и макромолекул (LiptonSA, 1993). Физиологические концентрации оксида азота - NOS необходимы для нормальной жизнедеятельности глаза. NOS приписывают функции межклеточного посредника взаимодействия астроцитов между собой и их взаимодействия с аксонами ГКС. Избыточная продукция NOS ассоциируется с разнообразными неврологическими заболеваниями и ПОУГ (MoncadaS, 1993).

Изучены три его изоформы. NOS-1 присутствует в блуждающих астроцитах, разбросанных по всему ДЗН, указывая на конститутивный статус фермента в глиальных клеточных элементах глаза. На глазах с ПОУГ NOS-1 экспрессируют клетки на поверхности стекловидного тела, а также глиальные клетки решетчатой пластинки и ДЗН ( LiuJ., 1999, 2001). Гиперэкспрессия мРНК NOS-1 в генах и синтез его denovo обнаружены в астроцитах решетчатой пластинки (NeufeldAH, 1999).

Уровень NOS-2 повышается в водянистой влаге глаз с ПОУГ (TsaiDC 2004). Доказана сцепленная связь NOS-2 с ПОУГ на генетическом уровне (MotallebipaurM, 2005). NOS-2 -форма фермента, продуцирующая наибольшое количество NO в условиях его стимуляции и индукции (GarthwaiteJ, 1995). Молекулярные механизмы этого процесса изучены в эксперименте. В культуре человеческих астроцитов уровень NOS-2 повышался в условиях высокого гидростатического давления, подтверждая связь офтальмогипертензии с уровнем продукции NO (SiuAW, 2002). Кроме офтальмогипертензии, важную роль в индукции и стимуляции NOS-2 играют цитокины (LiuJ, Zhao 1996): ФНОа запускает (YuanL, 2002), а ИФНу и ИЛ-ip усиливают продукцию NOS-2 (LiuB, 2000). При ПОУГ эти цитокины экспрессируются в астроцитах ДЗН, также, как и NOS-2 (LiuB, 2000; YuanL., 2001). Уровень NO повышается в сетчатке крыс через 35 дней после лазерного лечения (MotallebipaurM., 2005; SiuAW., 2002), что ассоциируется с вторичной офтальмогипертензией и гибелью ГКС, подчеркивая токсичность высоких концентрации NO (NathansonJA, 1995). Прямая нейротоксичность NO на ГКС подтверждена методом исключения в экспериментальной модели глаукомы офтальмогипертензионного типа на крысах. Введение ингибитора NOS - аминогуанидина -оказывало нейропротекторный эффект и отменяло нейротоксичность NO (NeufeldAH, 2004). Таким образом, доказан факт развития ГОН в условиях избытка NO2 и возможность нейропротекции с помощью ингибиторов NOS (GarthwaiteJ., 1995)

NOS-3 экспрессируется эндотелием сосудов преламинарной области и в астроцитах головки ЗН. Полагают, что NOS-3 оказывает нейропротекторное действие, расширяя сосуды и увеличивая кровоток на глазах с глаукомой. Роль его в астроцитах головки зрительного нерва не известна (NeufeldAH., 1999).

Оксидативный стресс и глаукома

В тканях глаза функционируют эффективные механизмы антиоксидантной защиты, в их состав входит восстановленный глутатион, супероксид дисмутаза и система СОД-каталаза. Защитную роль играет аскорбиновая кислота, присутствующая в высоких концентрациях в стекловидном теле (Hanashima, 1999), водянистой влаге (GiblinFJ, 1984), слезной жидкости (DreyerR, 1993) и роговице (RingvoldA, 2000).

Избыток свободных радикалов и оксидативный стресс признаны одним из этиопатогенетических факторов глаукомы (ChenJZ, 2003). При глаукоме антиоксидантная защита снижена (FerreiraSM, 2004). Аргументами в пользу этого утверждения служат избыток в крови антител к глутатион^-трансферазе (YangJ, TezelG, 2001) и продуктов перекисного окисления липидов (YildirimO, 2005) на фоне дефицита глутатиона (GherghelD, 2004, 2005).

Полагают, что отчасти окислительный стресс вызван сосудистой дисрегуляцией, приводящей к ишемии и реперфузии (FlammerJ, 1999) и изменениям уровня продукции эндотелина-1 и N0 (TammER, 1996). Эндотелин-1 регулирует тонус трабекулярного и сосудистого эндотелия, сужая просвет сосудов и трабекулярной сети (OrgulS, 1996). Его показатели при ПОУГ в водянистой влаге выше контроля (HolloG, 1998). Как видно из представленных данных, к повреждениям, вызванным окислительным, ишемическим стрессом и фотострессом, при ПОУГ, добавляется нейротоксичность N0 и глутамата, который реагируя с супероксид анионом, образует радикал пероксинитрит. В комплексе с сосудистой дисрегуляцией скопление свободных радикалов окислительного стресса или аэробного метаболизма повреждает ДНК клеток трабекулярной сети (IzzottiA, 2003). Нарушается плотность межклеточного контакта в трабекуле, меняется состав белков ЕСМ, происходит перестройка цитоскелета. При этом повышается сопротивление оттоку и развивается офтальмогипертензия (ZhouL, 1999; Sacca SC, 2005). Доказана эффективность антиоксидантов в лечении ГОН. Местное введение ингибиторов свободных радикалов крысам с экспериментальной моделью глаукомы на 29,6% снижало ВГД. Одновременное интравитреальное введение КМОА и ингибиторов КМОА сокращало потери ГКС еще больше (HosseiniA, 2006). BDNF в сочетании с неспецифическим «мусорщиком» свободных радикалов продемонстрировал степень риска гибели клеток ГКС на глазах крыс с офтальмогипертензией (КоМЬ, 2000). Результаты подтверждают роль окислительного стресса в развитии глаукомы и эффективность антиоксидантов в лечении ГОН.

Установлено, что ГКС на человеческом глазу с глаукомой и в экспериментальных моделях глаукомы у животных гибнут путем апоптоза (QuigleyHA, 1995; PeaseME, 2000). Апоптоз - генетически программированный процесс клеточной смерти, который протекает в отсутствие воспаления, характеризуется фрагментацией хромосомной ДНК и клетки с сохранением клеточной мембраны (FarkasRH, 2001). Аптоптоз контролирует гомеостаз популяции ГКС и астроглии в норме (LevinLA., 1997).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бен Режеб Амин, 2018 год

р - - -

Нижне-височный 0-5° г - - 0,28007 -

р - - 0,0443 -

5-10° г - - 0,35966 -

р - - 0,0088 -

10-20° г - - 0,34154 -

р - - 0,0132 -

20-30° г - - 0,31282 -

р - - 0,0239 -

г - - 0,2771 -

р - - 0,0467 -

5-10° г - - - -

р - - - -

10-20° г - - 0,28043 -

р - - 0,044 -

20-30° г - - 0,34641 -

р - - 0,0119 -

Дугообразные скотомы г 0,28475 - - -

р 0,0261 - - -

Назальная ступенька г 0,32235 - - -

р 0,0113 - - -

Парацентральные скотомы (в/височный сектор) г 0,48275 - - -

р 0,0056 - - -

Периферическое сужение поля зрения г 0,29595 - - -

р 0,021 - - -

Таблица 9. Корреляционный анализ серологических показателей антител с морфометрическими и функциональными

параметрами больных ПОУГ

Морфометрические и клинико-функциональные параметры АТ к ENO АТ к NSE АТ к MBP АТ к родопсину

Острота зрения центральная с коррекцией r - -0,43647 - -0,1836

Р - p < 0,001 - 0,0255

Средняя толщина сетчатки в фовеа (Fovea) r 0,4793 - - -

Р <0,05 - - -

Общий объем фовеа r 0,47139 - - -

p <0,05 - - -

Общий макулярный объем (Totalmaculavolum) r - -0,36928 - -

p - p < 0,05 - -

Объем в височно-внутренней зоне макулы r - -0,36326 - -

p - p < 0,05 - -

Объем в верхне-внутренней зоне макулы r - -0,3743 - -

p - p < 0,05 - -

Объем в назально-внутренней зоне макулы r - -0,33981 - -

p - p < 0,05 - -

Объем в назально-внутренней зоне макулы r - -0,37305 - -

p - p < 0,05 - -

Объем в височно-наружней зоне макулы r - -0,33684 - -

p - p < 0,05 - -

Объем в верхне-наружней зоне макулы r - -0,33065 - -

p - p < 0,05 - -

Объем в назально-наружней зоне макулы r - -0,39817 - -

p - p < 0,01 - -

Средняя толщина сетчатки в височно-внутренней зоне макулы r - -0,40392 - -

p - p <0,05 - -

Средняя толщина сетчатки в верхне-внутренней зона макулы r - -0,35508 - -

p - p < 0,05 - -

Средняя толщина сетчатки в назально-внутренней зоне макулы r - -0,34369 - -

p - p < 0,05 - -

Средняя толщина сетчатки в нижне-внутренней зоне макулы r - -0,39455 - -

p - p < 0,01 - -

Средняя толщина сетчатки в верхне-наружней зоне макулы r - -0,36315 - -

p - p < 0,05 - -

Средняя толщина сетчатки в назально-наружней зоне макулы r - -0,39957 - -

p - p < 0,01 - -

Истончение СНВС в теморальном отедле r - 0,27862 0,34765 -

p - p < 0,05 p < 0,05 -

Средняя толщина СНВС в верхнем отделе (Savg) r - -0,31517 - -

p - p < 0,05 - -

ОтношениеЭ/Д (Cup/Disk Area Ratio) r - 0,4232 -0,36154 0,33209

p - p < 0,001 p < 0,01 0,0013

Истончение НРП в верхне-височном отделе r - - - 0,28212

p - - 0,0055

Истончение НРП в височном отделе r -0,32439 0,29238 - 0,30273

p p < 0,05 p < 0,05 - 0,0059

Истончение НРП в носовом отделе r - 0,30553 - 0,22598

p - p < 0,05 - 0,0283

Истончение НРП в нижне-височном отделе r - 0,26753 - 0,22231

p - p < 0,05 - 0,0432

В свою очередь, морфометрическая перестройка (ремоделирование) сетчатки и ДЗН отражались на зрительных функциях. Так, диффузное снижение светочувствительности (ДСС) более чем на 47% от нормы прямо коррелировало с отношением экскавации к ДЗН (г=0,21367, р<0,05), с площадью экскавации (г=0,18448, р <0,05) и обратно коррелировало с площадью нейроретинального пояска (г= - 0,20618, р <0,05). Слабая прямая связь снижения ДСС начинала проявляться со средней толщиной сетчатки в соответствующих квадрантах макулы уже при достижении уровня 22%. После 47% снижения ДСС связь обретала устойчивый отрицательный/обратный характер, варьируясь в пределах от г= - 0,48455 (р <0,001 - с толщиной сетчатки в височно-внутреннем отделе макулы ) до г= - 0,60638 (р<0,001, ср. толщина сетчатки в назально-наружном отделе макулы).

Фокальные скотомы 3 степени (снижение светочувствительности > более чем на 87%) в поле зрения обратно коррелировало с толщиной слоя нервных волокон в соответствующем его отделе, характер сопряженности связи варьировался от г= -0,38483 (р<0,001) до г= - 0,4843 (р<0,001).

Фокальные дефекты центрального (0-30°) поля зрения также прямо коррелировали со средней толщиной сетчатки в соответствующих отделах макулы (г= 0,23661, р<0,05), с параметрами экскавации или отношением Э/ ДЗН, обратно коррелируя с площадью НРП (г= - 0,2709, р <0,001).

В целом представленные корреляции серологических показателей АТ к КББ с морфометрическими параметрами НРП, сетчатки и толщиной СНВС, подтверждали топографию распределения КББ в структурах сетчатки. Его экспрессия верифицирована в 1, 2 и 3 нейроне, наружном и внутреннем плексиформных слоях, СНВС и зрительном нерве. Выявленные корреляции подтверждали обоснованность выбора его в качестве маркера диагностики ПОУГ на этапе морфометрической перестройки.

4.3 Изучение нарушения системной продукции антител к основному белку миелина во взаимосвязи с гидродинамическими показателями

В ходе исследования было установлено, что выброс антител к МВР, обладающих

каталитическими функциями, имел место на этапе манифестации ПОУГ, когда в клинике

доминировала офтальмогипертензия (см выше в главе 4). Второй пик имел место на

третьей стадии. Этот факт лег в основу нашей гипотезы, что первоначальной

аутоиммунной агрессии этих антител подверглись миелинизированные аксоны

периферической нервной системы, регулирующие секрецию внутриглазной жидкости

отростками цилиарного тела и тонус трабекулярной сети. На третьей стадии выброс этих

73

антител совпал с падением центральной остроты зрения, что, по-видимому, можно объяснить деструкцией миелинизированных аксонов зрительного нерва. В связи с чем, представлял научно-практический интерес анализ количественных показателей АТ к МВР во взаимосвязи с гидродинамическими показателями.

Учитывая большую пропорцию больных с офтальмогипертензией в группе ПОУГ, мы были вынуждены набрать дополнительно группу больных НТГ. Характеристика этой группы представлена в главе 2.

В обеих группах больных с глаукомой присутствовали все стадии заболевания; распределение больных по стадиям представлено в таблице 10. Стадия глаукомы при корреляционном анализе системной продукции с клинико-инструментальными данными была выставлена по худшему глазу.

У больных с ПОУГ среднегрупповой уровень (Мср=М±м) системной продукции антител оказался ниже уровня контроля: 0,41±0,05 против 0,49±0,06 усл. ед. в контроле при коридоре вариабельности 0,22-0,94 против 0,34-0,91 усл. ед. в контроле. Недостоверность различий (р=0,08290, р<0,1) объясняется малочисленностью группы. В целом по группе ПОУГ у 46,3% больных уровень АТ выходил за нижнюю границу референтных значений нормы.

В группе НТГ среднегрупповые показатели составляли 0,40±0,16 усл. ед., коридор вариабельности значений был шире - 0,22-0,94 усл. ед., имело место как повышение (п=8, 12,9%), так и снижение (п=24, 38,7%) антителопродукции.

ПОУГ манифестировала на фоне некоторого повышения (на 22,4%) среднегрупповых показателей АТ к МВР по сравнению с среднегрупповыми показателями группы контроля. При этом серологический уровень АТ к МВР на I стадии превышал показатели II (р=0,000103, р<0,01) и IV (р=0,000009, р<0,001) стадии заболевания. На IV стадии заболевания, среднегрупповой уровень АТ к МВР оказался достоверно ниже нормы (на 34,7%) (р=0,00031, р<0,001). Частота выявления больных с уровнем АТ, выходящим за нижнюю границу референтных значений нормы, на II и IV стадии достигала 68,8% и 79,4% соответственно. То есть, практически 2/3 группе ПОУГ на этих стадиях имели показатели, выходящие за нижнюю границу нормы. При этом, случаев выхода концентрации АТ к МВР при ПОУГ за верхнюю границу нормы не было.

Серологический уровень АТ к МВР на разных стадиях заболевания

Показатель АТ к МВР в сыворотке ПОУГ (п=82) НТГ (п=62) Контроль (п=25)

1стадия (и=15) II стадия (и=16) III стадия (п=17) IV стадия (п=34) I стадия (п=25) II стадия (п=14) III стадия (п=16) IV стадия (п=7)

Размах вариации 0,24-0,94 0,22-0,82 0,42-0,62 0,26-0,44 0,24-0,94 0,24-0,57 0,22-0,43 0,28-0,43 0,34-0,91

М±т 0,60±0,21 0,42±0,08# 0,52±0,35 0,31±0,01*, # # 0,44±0,02 0,39±0,02* 0,37±0,03** 0,35±0,08** 0,49±0,20

% ниже нормы 0,0 68,8 0,0 79,4 52,0 28,6 25,0 42,8 -

% выше нормы 0,0 0,0 0,0 0,0 16 0 0 0 -

Примечание. Достоверность различий по сравнению с данными контроля: * - р<0,05, ** - р<0,01; достоверность различий по сравнению с показателями I стадии: #- р<0,05, # # - р < 0,001.

Нарушение системной продукции антител на разных стадиях ПОУГ

30

га 20

?

о.

о

н 10

о

0)

X X 0

0)

к

о К -10

н

о

н

X 0) -20

а

о

а. с -30

-40

22.4

-

6 щ

ПОУ 1 -10 НТГ 28.5

-14.3

-22.4 24.5

. стадия{п-15) ! стадия {п-16) I стадия {п-17) Стадия{п-34)

-ва.7

Рисунок 24Примечание: по горизонтали - стадии заболевания (отражены цветом, цвет легенды представлен на рисунке). По вертикали - отклонение среднегруппового уровня антител на соответствующей стадии (в процентах от среднестатистического уровня здорового контроля, выставлен по нулевой отметке).

Рисунок 24 наглядно отражает антителопродукцию к МВР во взаимосвязи со стадиями ПОУГ и НТГ.

НТГ манифестировала иначе. Среднегрупповые значения антителообразования практически не отличались от среднестатистических показателей контроля: 0,44±0,23 против 0,49±0,20 усл. ед. (н/д). По сравнению с данными групп ПОУГ и контроля диапазон значений АТ к МВР при НТГ был шире и варьировал между 0,24 и 0,94 усл. ед. Имели место случаи как снижения (52,0% больных), так и повышения (16% пациентов) уровня АТ. Переход от I стадии к последующим стадиям заболевания характеризовался постепенным снижением среднегруппового содержания АТ в среднем на 5-7% (от 2,1 до 12,4%) от исходных значений.

Как известно, принципиальным отличием НТГ от ПОУГ является наличие офтальмогипертензии, которая оказывает дополнительное патогенное влияние, ускоряя гибель ганглиозных клеток сетчатки. Ввиду этого мы проанализировали характер связи между экспертными показателями офтальмотонуса/гидродинамики, с одной стороны, и системным уровнем антителообразования к МВР - с другой. Для этого разделили больных с глаукомой на 4 подгруппы по максимальным (таблица 11) и минимальным показателям ВГД на глазах (144глаза).

Серологический уровень АТ к МВР у больных с глаукомой взависимости от максимальных и минимальных показателей ВГД

Серологический показатель АТ к MBP ВГД, мм рт. ст.

Максимальный показатель

1-я подгруппа (<18 мм рт. ст. n =27) 2-я подгруппа (>18-<21 мм рт. ст. n=20) 3-я подгруппа (21,1-24,9 мм рт. ст. n =41) 4-я подгруппа (>25 мм рт. ст. n=56)

Размах вариации 0,34-0,60 0,24-0,94 0,22-0,94 0,22-0,82

M±m 0,47±0,18 0,45±0,31 0,45±0,16 0,36±0,11*

% ниже нормы 0,0% 60,0% 48,7% 67,8%

% выше нормы 0,0% 19,5% 9,8% 0%

Минимальный показатель

1-я подгруппа (n=25) 2-я подгруппа (n=64) 3-я подгруппа (n =34) 4-я подгруппа (n=21)

Размах вариации 0,25-0,94 0,22-0,57 0,22-0,42 0,26-0,82

M±m 0,49±0,21 0,37±0,02*, * 0,29±0,02**,** 0,42±0,07

% ниже нормы 28,0 35,9 78,6 61,9

% выше нормы 32,0 0 0 0

Примечание. Достоверность различий по сравнению с данными контроля: * - р<0,05, ** - р < 0,01; достоверность различий по сравнению с показателями 1-й подгруппы: * - р<0,05, ** - р < 0,001.

Несмотря на имеющиеся случаи снижения и повышения уровня АТ во 2-й и 3-й подгруппах, их среднегрупповые показатели практически не отличались от таковых у здоровых лиц и 1-й подгруппы, в которую вошел основной массив глаз с НТГ, чего нельзя сказать о 4-й подгруппе с офтальмогипертензией (см. Таблицу. 11). У 53,2% пациентов 4-й подгруппы серологические уровни выходили за нижнюю границу нормы, что отразилось на среднегрупповых показателях: они оказались достоверно ниже и контроля и 1 -й группы: Мср=0,36±0,02 против 0,47±0,13 /0,49±0,20(р<0,01).Кроме того, нижняя и верхняя границы диапазона вариабельности показателей опустились.

Наибольшая (78,6%) пропорция лиц со сниженными серологическими показателями АТ к МВР вошла в 3-ю подгруппу, где минимальные показатели ВГД находились в диапазоне 21,1-24,9 мм рт. ст. Низкий среднегрупповой серологический уровень АТ к МВР и большая пропорция (65,0%) лиц со сниженным уровнем антителообразования (таблица 12) ассоциировались с большим размахом суточных колебаний ВГД - выше 8 мм рт. ст.

Серологический уровень АТ к МВР у больных с глаукомой в зависимости от

суточного размаха ВГД

Серологический показатель АТ к MBP Суточный размах офтальмотонуса, мм рт. ст.

1-я подгруппа (<4 мм рт. ст., п=32) 2-я подгруппа (> 4 до 8 мм рт. ст., п=52) 3-я подгруппа (> 8 мм рт. ст., п=60)

Размах вариации 0,22-0,94 0,22-0,94 0,22-0,38

М±т 0,40±0,05 0,40±0,02 0,32±0,02*,*

% ниже нормы 31,3 40,4 65,0

% выше нормы 21,9 1,9 0,0

Примечание. Достоверность различий по сравнению с данными контроля: * - р < 0,001; достоверность различий по сравнению с показателями 1-й подгруппы: ^ - р<0,05, ^ - р < 0,001.

Снижение серологического уровня АТ к МВР обратно коррелировало с истинным офтальмотонусом - Ро: коэффициент корреляции по Спирману г= - 0,7746, р=0,0833; р<0,1). В связи с чем, был проведен углубленный анализ между уровнем антител и экспертными показателями гидродинамики. Низкий уровень антителопродукции ассоциировался с низким Ро (1 подгруппа). Практически у каждого второго пациента 1 подгруппы уровень АТ к MBP выходил за нижнюю границу нормы (таблица 13 ).

Низкий уровень антителопродукции ассоциировался с повышенным коэффициентом Беккера или разобщением контроля регуляции гидродинамики. Практически у каждого второго пациента 1-й подгруппы уровень АТ к MBP выходил за нижнюю границу нормы (таблица 13). При распределении больных по подгруппам по принципу снижения оттока (1 -я подгруппа) и нормального оттока (2-я подгруппа) межгрупповые различия в серологическом уровне АТ к MBP не выявлены, однако пропорция лиц с низким уровнем антителопродукции была достоверно выше (р<0,05) в подгруппе со сниженным коэффициентом легкости оттока и низким объемом секреции водянистой влаги.

Достоверна разница между средне-групповыми показателями АТ к MBP у больных 1 подгруппы с КБ>200 и уровнями антител пациентов 3 подгруппы с КБ <100 (р < 0,001).

Серологический уровень АТ к МВР у больных с ПОУГ и НТГ в зависимости от экспертных тонографических показателей

Серологический показатель АТ к МВР Тонографический показатель ВГД: Ро, мм рт. ст.

1-я подгруппа (10-18 мм рт. ст., п=27) 2-я подгруппа (18,1-21 мм рт. ст., п=21) 3-я подгруппа (21,1-24,9 мм рт. ст., п =40) 4-я подгруппа (>25 мм рт. ст., п=56)

Размах вариации 0,22-0,57 0,25-0,94 0,22-0,49 0,22-0,52

М±т 0,35±0,02* 0,45±0,06 0,39±0,02 0,38±0,02

% ниже нормы 48,15 42,86 17,65 22,27

% выше нормы 0 14,29 0 0

Продукция водянистой влаги F, мм3/мин

1-я подгруппа (<1,5 мл3, N=36) 2-я подгруппа (1,5-3,0 мл3, N=70) 3-я подгруппа (>3,0 мл3, N=38)

Размах вариации 0,22-0,94 0,22-0,94 0,24-0,50

М±т 0,36±0,02* 0,41±0,03 0,42±0,004

% ниже нормы 77,7* 58,5 28,9

% выше нормы 19,5 1,4 0

Коэффициент Беккера

1-я подгруппа (КБ >200, п=54) 2-я подгруппа (КБ <200-100, п =73) 3-я подгруппа (КБ <100, п =17)

Размах вариации 0,22-0,57 0,22-0,94 0,24-0,94

М±т 0,30±0,03*** 0,37±0,03 0,40±0,14[0,03]

% ниже нормы 55,6 45,2 41,2

% выше нормы 0 9,6 5,9

Коэффициент легкости оттока С, мм3/(мм рт. ст.) мин

1-я подгруппа (С < 0,15, п=70) 2-я подгруппа (С >0,15, п=74)

Размах вариации 0,22-0,57 0,22-0,94

М±т 0,35±0,02* 0,39±0,02

% ниже нормы 62,9* 28,95

% выше нормы 0 10,8

Примечание. Достоверность межгрупповых различий с показателями 2/3 группы : * - р < 0,05; ** -р < 0,01; *** - р < 0,001.

4.4 Системная продукция антител к МВР во взаимосвязи со зрительными

дисфункциями

Известно, что выброс в кровоток повышенного количества антител к МВР при оптическом неврите, ассоциированном с рассеянным склерозом, сопровождается снижением остроты зрения, сужением периферического зрения и появлением скотом (Карлова И.З, 1997). При ПОУГ с офтальмогипертензией мы не наблюдали достоверного избыточного антителообразования, скорее следует говорить о дефиците продукции. Вместе с тем, на первой и третьей стадии ПОУГ имело место умеренное повышение среднегрупповых показателей. В связи с чем, для уточнения значения дефицита АТ к МВР, мы дополнили группу ПОУГ группой НТГ, где случаи избыточной антителопродукции имели место (см таблицу 14).

Таблица 14. Серологические показатели АТ к МВР у больных глаукомой с офтальмогипертензией и нормотензией в зависимости от остроты зрения

Параметр антител к МВР Центральная острота зрения с коррекцией

0,7 - 1,0 (n=40) 0,7-0,4 (n=30) 0,4 -0,1 (n=33) ниже 0,1 (n=41)

Размах вариации 0,24-0,82 0,22-0,82 0,22-0,94 0,26-0,94

M±m 0,39±0,02 0,38±0,04 0,41±0,06 0,39±0,08

% ниже нормы 40% 46,6% 27,3% 65,8%

% выше нормы 0% 0% 3,0% 17,1%

Как видно из данных, представленных в таблице 14, в смешанной популяции больных глаукомой (ПОУГ+ НТГ) не прослеживалась связь между остротой зрения и средне-групповыми показателями АТ к МВР. Вместе с тем, обращал на себя внимание тот факт, что в группу слабовидящих вошла максимальная пропорция больных со сниженными уровнями АТ и практически все лица с избыточным антителообразованием. Факт позволял думать, что одинаково плохо сказывается на зрительных функциях и повышенное количество АТ к МВР и их дефицит. Однако для окончательного вывода, мы провели аналогичный статистический анализ в группе только ПОУГ. Аналогичным образом были сформированы 4 сопоставимые подгруппы, различающихся остротой зрения, (см. таблицу 15) из больных ПОУГ, протекающей с офтальмогипертензией.

Серологические показатели АТ к МВР у больных глаукомой с ПОУГ с офтальмогипертензией в зависимости от остроты зрения

Антитела к МВР Центральная острота зрения с коррекцией у больных ПОУГ

0,7 - 1,0 (n=15) 0,7-0,4 (n=16) 0,4 -0,1 (n=17) Менее 0,1 (n=34)

M±m 0,52±0,01 0,43±0,10* 0,33±0,03** 0,31±0,01**

Примечание: достоверность межгрупповых различий от 1подгруппы : * - р < 0,05; ** - р < 0,001.

Как видно из диаграммы, представленной на рисунке 25, снижение антителопродукции к МВР ассоциировалось со зрительными дисфункциями. Иными словами, среднегрупповые показатели 2-4 группы достоверно отличались от аналогичных показателей 1 группы. Учитывая, что в группе больных ПОУГ в принципе не выявлялись случаи повышения АТ выше верхней границы нормы, можно говорить о том, что снижение уровня системной продукции отрицательно сказывается на зрительных функциях.

Средне-групповые серологические показатели АТ к МВР (в у.е.) у больных глаукомой в зависимости от остроты зрения (vis)

AT к МВР

0,6

0,4

0,2 0

п 0,43 ±0,1( **

П 0,33 ±0,03 ** 0,31 ±0,01

п Г1

АТк МВР

Острота зрения

vis 0,7-1,0 vis <0,7-0,4 vis <0,4-0,1 vis <0,1 (n=15) (n=16) (n=17) (n=34)

Рисунок 25.

Роль количественных показателей АТ к МВР уточняли, сравнивая функциональные и морфометрические экспертные показатели подгруппбольных глаукомой (НТГ+ ПОУГ). В 1 группу вошли 65 пациентов с уровнем АТ<0,34 у.е. (ниже нормы), во 2 группу - 71

пациент с уровнем АТ (0,34-0,91), укладывающимся в коридор референтных значений нормы, в 3 группу - 8 человек с повышенным уровнем АТ к МВР (>0,91). Выявлена достоверная межгрупповая разница по МО, БЬУ и ОКТ-параметрам НРП (площадь и объем) в группах с крайними значениями серологических показателей (таблица 16).

Наиболее глубокие средние отклонения показателя МО, а также морфометрических показателей НРП ассоциировались с физиологическим коридором значений антител к МВР, а минимальные - с повышением их уровня (таблица 16 ).

Аналогичный анализ мы провели с другими морфометрическими показателями сетчатки. Достоверна межгрупповая разница в толщине сетчатки в височно-наружном и височно-внутреннем отделах макулы. В подгруппе с повышенными показателями АТ (р<0,05) сетчатка толще по сравнению с подгруппой «нормальных» уровней. Заметим, несмотря на более тонкую сетчатку в подгруппе с дефицитом антител (р<0,05), отличающимся офтальмогипертензией (см выше), общий макулярный объем в этой подгруппе оказался выше (р<0,001).

Прямо противоположная связь обнаружена в этих же подгруппах с коэффициентом Беккера и коэффициентом легкости оттока С водянистой влаги из глаза. Наибольшие нарушения присутствовали в подгруппе с дефицитом антител к МВР.

Представленные корреляции свидетельствуют о том, что одинаково плохо сказываются на тканевом гомеостазе сетчатки и ее зрительных функциях как избыточная системная продукция АТ к МВР, так и ее дефицит.

Периметрические индексы и морфометрические параметры у больных глаукомой (ПОУГ+ НТГ) в зависимости от

серологического уровня антител к MBP

Содержание АТ к МВР в КБ С MD SLV ПлощадьНРП Объем НРП

сыворотке (у.е.) M±m M±m M±m M±m M±m M±m

<0,34 (п=65) 177,32±23,51* 0,13±0,07* 7,23±1,54 5,12±0,63 0,93±0,11 0,24±0,06

От 0,34 до 0,91(п=71) 123,12±21,3 0,19±0,02 9,24±1,62* 5,2±0,56 0,81±0,11* 0,15±0,07*

>0,91 (п=8) 109,13±15,4* 0,18±0,02 4,1±0,51 4,2±0,52* 1,12±0,13 0,29±0,07

Сокращения в таблице: КБ - коэффициент Беккера, С - легкость оттока, МО - средние отклонения светочувствительности от возрастной нормы в каждой точке тестирования, НРП - нейроретинальный поясок . Примечание:* - достоверность межгрупповых отличий *р<0,001

Таблица 17

Морфометрические параметры сетчатки у больных глаукомой в зависимости от уровня антител к МВР

Уровень АТ в сыворотке (уе) Ср. толщина сетчатки в височно-внутреннем отделе макулы: M±m Ср. толщина сетчатки в височно-наружном отделе макулы Общий макулярный объем Ср. толщина сетчатки в фовеа

<0,34 (п=65) 258,31±5,01 217,75±3,79* 6,70±0,09** 203,19±3,81*

От 0,34 до 0,91 (п=71) 252,68±5,74 210,16±4,56 6,59±0,12 212,44±6,91

>0,91 (п=8) 263,00±7,12* 227,00±5,13* 6,67±0,08* 225,00±4,54*

Примечание:* - достоверность межгрупповых отличий *р<0,05, ** р<0,001

4.5 Изучение типов иммунных нарушений во взаимосвязи со зрительными

дисфункциями

Согласно одной из научных версий, тип зрительных дисфункций (центральные/периферические), глубина (скотомы 1,2,3) и площадь скотом определяются вертикальной и горизонтальной топографией зоны иммунного конфликта. Иными словами, дефекты зрения определяются выбором нейронов сетчатки и структур зрительного нерва, ставших мишенью аутоиммунной агрессии. При этом следует понимать, что орудием разрушения иммунная система выбрала антитела. Именно их мы можем распознать в сыворотке крови и проанализировать во взаимосвязи с клиническими и функциональными проявлениями ПОУГ, в частности, экспертными критериями периметрии. Целью настоящего фрагмента работы стал анализ таких корреляций.

В группе больных ПОУГ было диагностировано большое количество различных типов иммунных нарушений. Их можно было классифицировать как:

I. Монодефекты с нарушением (выше нормы/ниже нормы) продукции АТ только

одного типа: АТ к БКО/ АТ к ШБ/ АТ к родопсину / АТ МВР;

II. Комбинаторные нарушения антителопродукции, развивающиеся по четырем

различным типам:

• со снижением продукции всех АТ, с повышением продукции всех АТ, сочетанием повышения уровня 1-2 АТ и нормальной концентрацией других/другого,

• со снижением 1-2 АТ и повышением других/другого;

• со снижением уровня продукции 1 -2 типов АТ и нормальной концентрацией другого/других.

Примерно треть нарушений (31,8%) была представлена монодефектами. Среди больных ПОУГ, имевших нормальные серологические показатели АТ к МВР, КББ и родопсину, в 15,8% случаев имели дефицит АТ к БКО, в 2,7% случаев, напротив, был дефицит АТ к МВР на фоне нормальных показателей АТ к БКО, КББ и родопсину; еще в 2,7% случаев дефицит АТ к КББ сочетался с нормальными показателями 3-х других антител; в 10,5% имелся дефицит АТ к родопсину.

В группе ПОУГ в 21,1% случаев имели место нарушения продукции двух типов АТ на фоне нормальных показателей других АТ: дефицит АТ к БКО и МВР на фоне нормы АТ к родопсину и КББ (2,7%) , дефицит АТ к КББ и БКО на фоне нормы АТ к МВР и

родопсину (7,9%); дефицит АТ к £N0 и родопсину на фоне нормы АТ к МВР и КББ (5,3%), и, наконец, дефицит АТ к МВР и родопсину, на фоне нормы АТ к £N0 (5,3%).

Дефицит трех типов нейрональных АТ на фоне нормальных показателей четвертого имел место в 21,2% случаев. Из них, случаев дефицита АТ к NSE, £N0 и МВР на фоне нормальных показателей АТ к родопсину было 7,9%, дефицита АТ к №Е, £N0 и родопсину на фоне нормы АТ к МВР - 7,9%, случаев дефицита АТ к £N0, родопсину и МВР - на фоне нормы АТ к - 2,7%. В 2,7 % случаях дефицит АТ к МВР, и родопсина развился на фоне нормального уровня АТ к £N0. В 2,7%

случаев дефицит трех типов АТ NSE, £N0 и МВР сочетался с избыточной продукцией АТ к родопсину.

Дефицит АТ ко всем исследуемым четырем видам АТ к №£, £N0, МВБ и родопсину - 7,9%.

Наряду с этим, в небольшом проценте случаев (15,3%) присутствовали различные комбинации, при которых: дефицит двух типов АТ сочетался с избыточным уровнем третьего АТ на фоне нормальных показателей антител к четвертому антигену (5,2%). В 7,7% случаев дефицит одного антитела сочетался с избыточным уровнем второго АТ и нормальными показателями 3-4. Избыток двух АТ сочетался с дефицитом 3-его и нормой четвертого АТ (2,4%).

Наибольший для нас научно-практический интерес представляли монодефекты, поскольку именно по ним можно было проследить особенности дисфункций в корреляции с конкретным антителом, если бы таковые имели место в реалиях. Для достижения цели мы попытались выделить специфические особенности периметрических дефектов поля зрения во взаимосвязи с типом иммунных нарушений. Использовали программные особенности прибора для периметрии 0с1орш и собственную методику, адаптированную к ним. При обработке данных выделяли 5 групп дефектов поля зрения: от 23-46% -диффузное снижение светочувствительности (ДСС), 47-58% - скотому 1, 59-82% -скотому 2, 83-100% - скотому 3. Методика подсчета пикселей позволяла детально проследить локализацию, глубину зрительных дефектов на разных стадиях заболевания, оценить занимаемую площадь дефекта в % от общей площади анализируемого сектора поля зрения, изучить топографию распространения зрительных дефектов поля зрения от случая к случаю. Для этого в круге поля зрения от 0 до 30° выделяли 5 секторов: 0-5°, 510°, 10-20°, 20-30°, оценивали частоту (в %) выявления того или иного дефекта в каждом секторе поля зрения (ДСС, скотома 1, 2, 3) на начальной, развитой и поздних стадиях заболевания. (см главу 2). Результаты представлены ниже.

I. Избирательный дефицит системной продукции антител (монодефект) к ENO.

При избирательном дефиците системной продукции антител (монодефект) к ENO (уровень АТ к NSE, MBH и родопсину в норме) наиболее часто наблюдали диффузное снижение светочувствительности на 23-46% от нормы практически по всему центру поля зрения в секторах 0-30°, реже развивались фокальные дефекты - скотомы 1 (47-58% ) и 2 (59-82%) - более периферично - в секторе 15-30° верхней/ или нижней половины поля зрения. При этом типе иммунных нарушений мы не встречали глубокие фокальные дефекты - скотомы 3 (83%-100%) (таблица 18).

Таблица 18. Распределение скотом в различных отделах поля зрения по данным периметрии у больных сизбирательным дефицитом антител к ENO

Отдел поля зрения Снижение светочувствительности в процентах от нормы (%)

83%-100% 59%-82% 47%-58% 23%-46%

в/височный 0,00% 3,36% 10,84% 51,40%

в/носовой 0,00% 2,08% 5,75% 44.70%

н/височный 0,00% 0,79% 2,29% 22,14%

н/носовой 0,08% 1,73% 2,05% 20,82%

Рисунок 26. Площадь фокальных дефектов (в процентах от общей площади сектора) в различных секторах поля зрения при избирательном дефиците антител к БКО.

Таблица 19. Типичные дефекты поля зрения больных ПОУГ с избирательным дефицитом антител к ENO (уровень АТ к NSE, MBH и родопсину в норме)

Фокальные дефекты достигали наибольшей площади в верхне-височном и верхненосовом (10,8% и 5,8% от площади сектора, соответственно) секторе поля зрения (рисунок 26).

В таблице 19 представлены реальные поля зрения шести пациентов, наглядно демонстрирующие однотипность проявлений дефектов поля зрения Сектор 0-15° от точки фиксации оказался свободным от скотом, хотя и имело место диффузное снижение светочувствительности.

II. Избирательный дефицит системной продукции антител (монодефект) к ^Е.

Избирательный системный дефицит антител к КББ (уровень АТ к БКО, МВР родопсину в норме) на функциональном уровне проявлялся глубокими и обширными фокальными дефектами в поле зрения. У таких больных ПОУГ (п=2, 4 глаза) развились наиболее глубокие скотомы 3 (83-100%), занимающие 83,80% верхне-носового и 53,55% площади нижне-носового сектора поля зрения (рисунок 27) и скотомы 2 (47%-82%), на большей протяженности развившиеся в нижне-носовом (24,54%) и верхне-височном секторах (20,97%). Это наглядно демонстрирует рисунок 27.

Таблица 20

Распределение скотом в различных отделах поля зрения по данным периметрии у больных сизбирательным дефицитом антител к К8Е

Отдел поля зрения Снижение светочувствительности в процентах от нормы (%)

83%-100% 59%-82% 47%-58% 23%-46%

в/височный 32,24% 20,97% 11,56% 29,76%

в/носовой 83,80% 9,94% 3,64% 2,63%

н/височный 4,85% 19,63% 16,66% 23,82%

н/носовой 53,55% 24,54% 9,05% 10,51%

Рисунок 27. Площадьфокальных дефектов (в процентах от общей площади сектора) в различных секторах поля зрения у больных ПОУГ с избирательным дефицитом антител к ШБ.

Таблица 21. Типичные дефекты поля зрения больных ПОУГ с избирательным дефицитом антител к NSE (уровень АТ к ENO, MBH и родопсину в норме)

При этом зрительные дисфункции мало распространялись на центральные и парацентральные отделы - (0-5° от точки фиксации), за исключением верхне-носового отдела, и совсем не затрагивали область слепого пятна. Вместе с тем, сверху и снизу от горизонтального шва вокруг слепого пятна располагались дугообразные скотомы 1 порядка.

III. Избирательный дефицит системной продукции антител (монодефект) к

родопсину

Анализ данных периметрии у больных ПОУГ с избирательным дефицитом системной продукции антител (монодефект) к родопсину продемонстрировал глубокие фокальные дефекты со снижением светочувствительности на 59-100% от нормы, наиболее обширные по площади и занимающие в общей сложности 58,7% (25,8%+3,9%+14,0+15,0%) носового отдела поля зрения (см таблицу22 и рисунок 28).

Таблица 22

Распределение скотом в различных отделах поля зрения по данным периметрии у больных сизбирательным дефицитом антител к родопсину

Отдел поля зрения Снижение светочувствительности в процентах от нормы (%)

83%-100% 59%-82% 47%-58% 23%-46%

в/височный 0,17% 4,01% 2,75% 19,95%

в/носовой 25,79% 14,04% 4,00% 4,92%

н/височный 0,99% 3,91% 2,51% 8,56%

н/носовой 3,85% 15,02% 10,26% 17,52%

Рисунок 28 Площадьфокальных дефектов в различных отделах поля зрения в % от площади сектора при избирательном дефиците антител к родопсину.

Таблица 23. Наиболее типичные дефекты поля зрения больных ПОУГ с избирательным дефицитом антител к родопсину (уровень АТ к ENO, MBH и NSE в

норме)

Как демонстрирует нам поле зрения пациентки К., избирательный дефицит АТ к родопсину изначально проявляется диффузным снижением светочувствительности, распространяющимся от периферии к центру поля зрения. На фоне ДСС в носовой половине или нижне-носовом секторе поля зрения (см. поле зрения пациентки Ж. справа) развиваются фокальные дефекты 1 степени, которые углубляясь в центре дефекта, превращаются в скотомы 2 и 3, также распространяясь от периферии к центру. Заметим, дефект имеет типичную для глаукомы форму - дуговой скотомы. Поле зрения пациентки Ж. подтверждает преимущественную локализацию скотом 2 и 3 в нижненосовом секторе поля зрения. Заметим, и у этой пациентки имеет место типичная для ПОУГ форма скотомы в виде нижней назальной ступеньки.

IV. Избирательный дефицит системной продукции антител(монодефект)к

основному белку миелина

Избирательный дефицит системной продукции антител (монодефект) к основному белку миелина обоих больных ПОУГ ( 4 глаза) проявлялся периметрически диффузным снижением светочувствительности глубиной от 23% до 46%, лишь в единичных участках поля зрения (менее 1,6% от общей площади поля зрения) достигая 58%.

Таблица 24

Распределение ДСС и скотом в различных отделах поля зрения по данным периметрии у больных сизбирательным дефицитом антител к МВР

Нарушение периферического зрения у больных сизбирательным дефицитом антител к основному белку миелина (АТ к ENO, NSE и родопсину в норме)

Отдел поля зрения Снижение светочувствительности в процентах от нормы (%)

83%-100% 59%-82% 47%-58% 23%-46%

в/височный 0,00% 0,00% 0,77% 68,02%

в/носовой 0,00% 0,00% 0,00% 61,45%

н/височный 0,00% 0,00% 0,83% 88,75%

н/носовой 0,00% 0,00% 0,00% 62,49%

Рисунок 29. Площадь распространения ДСС в % от площади всего сектора при избирательном дефиците антител к МВР.

Типичные дефекты поля зрения больных ПОУГ с избирательным дефицитом антител к основному белку миелина (уровень АТ к £N0, ^Е и родопсину в норме)

Для наглядного представления и понимания горизонтальной топографии зоны иммунного конфликта на глазном дне, поля зрения всех пациентов с однотипным нарушением были совмещены путем наложения друг на друга их дефектов в поле зрения. Наружные и внутренние границы дефектов очерчены соответствующими дефектам цветами. Полученные таким образом рисунки схемы были представлены в таблице 25. Рисунки-схемы подтвердили закономерность, уже выявленную статистически. При избирательном дефиците АТ к £N0 фокальные дефекты поля зрения располагались в верхних отделах поля зрения, при дефиците АТ к ^Е - во внутренней половине поля зрения, что наглядно демонстрирует суммарный дефект поля зрения всех больных с этим типом иммунных нарушений.

Таким образом, наиболее легким, с точки зрения зрительных дисфункций, оказался избирательный монодефицит антител к МВР, а наиболее тяжелым (по глубине скотом )-дефицит антител к ^Е и родопсину.

Наиболее распространенные по площади фокальные дефекты поля зрения ассоциировались с дефицитом АТ к ^Е и родопсину.

При этом, дуговые скотомы, назальные ступени , наиболее характерные для ПОУГ, ассоциировались с комплексными нарушениями антителопродукции (дефицитом АТ к ^Е, £N0 и родопсину ).

В совокупности , представленные данные позволяли прийти к выводу о том, что выбранные антитела могли служить в качестве иммуномолекулярных маркеров диагностики и мониторингга ПОУГ.

З А К Л Ю Ч Е Н И Е

Увеличение объема информации о глаукоме привел к замене одной парадигмы на другую. В прошлом веке главным экспертным признаком ПОУГ считали офтальмогипертензию и нарушение трабекулярного оттока (Нестеров А.П., 1968, 1974, 2008г). В связи с чем, изучали патоморфологические и патофизиологические аспекты гидродинамических нарушений глаза при ПОУГ (Нестеров А.В. 1984, 2002; AlvaradoJ, 1984; GriersonI. 1986; Lutjen-DrecollE., 1986, 1996). В начале этого века акцент в диагностике и мониторинге ПОУГ сместился на оптическуюнейропатию (EGS, 2008) с ремоделированием сетчатки ДЗН.

Сегодня морфометрические и функциональные изменения внутреннего слоя сетчатки с гибелью ГКС и их аксонов,экскавацией ДЗН при глаукоме не вызывают сомнений. Однако ракурс исследований вновь изменился. Представлены электрофизиологические доказательства вовлечения в патологический процесс среднего и наружного слоев сетчатки при ПОУГ. Так, установлен факт замедления (более чем на 50%) скорости проведения возбуждения от наружных отделов сетчатки к внутренним, что указывает на раннее вовлечение средних слоев сетчатки. Как известно, в среднем слое сетчатки за это отвечают биполярные, горизонтальные и амакриновые клетки.Заметим, их вовлечение предшествующее вовлечению ГКС. Двукратное снижение коэффициента Ардена на электроокулограмме у больных с начальной стадией глаукомы свидетельствует о вовлечении наружного слоя сетчатки, в частности, пигментного эпителия и фоторецепторов. Раннее вовлечение в патогенез глаукомы темновых off каналов колбочковой системы подтверждено исследованиями В.В. Страхова с соавт. (2011), Куроедова А.В. (2011), Казарян А.А. (2014). Обнаружено угнетение функциональной активности палочковых структур при прогрессировании ПОУГ (Бобр Т.В., 2011, Страхов В.В., 2011, 2014).Электрофизиологические показатели, отражающие функциональное состояние наружных слоев сетчатки, ухудшаются параллельно с периферическим зрением (Страхов, 2014). Маслова Е.В. (2016г) обнаружила на ранней стадии ПОУГ снижение амплитуды и увеличение показателей зрительных вызванных потенциалов P100 и N135 на крупный и мелкий паттерн, что указывало на раннее вовлечение зрительного нерва.

Данные ЭФИ подтверждены гистологически. Выявлены дистрофические изменения при ПОУГ ретинального пигментного эпителия в виде разрежения и уплощения клеток, дезинтеграции и миграции их в нейросенсорный слой, распространяющиеся от центра к экватору и приводящие к истончению слоя. О дистрофических процессах в фоторецепторах писала в своей работе Соломатина М.В. (2016).

Снижение плотности, толщины и высоты РПЭ, в комплексе с нарушением дифференцировки между слоем фоторецепторов и РПЭ верифицированы морфометрически методом ОКТ.Дистрофия РПЭ отчасти объясняет нарушение функции фоторецепторов и истончение макулы при глаукоме (Страхов 2009, 2015). Доказана прямая связь между морфометрическими параметрами макулы, ГКС и оптической плотностью макулярного пигмента, а также, связь плотности макулярного пигмента с периметрическим показателем MD (Эскина Э.Н, 2014; Спэлтон Д.Дж., 2007; WeFongSiah, 2014).Как видно из представленных данных, практически все структуры зрительного анализатора так или иначе вовлечены в патологический процесс.

Дискутируется вопрос первичности поражения структур при ГОН. Одни авторы на первое место выносят гибель ГКС, подтверждая версию экспериментально (GlovinskyY., 1991; 1993), другие - поражение аксонов на уровне решетчатой мембраны ДЗН (Кански, 2009, Нестеров А.П,2008; KerriganBaumrindL., 2000;JamesEM, 2000; QuigleyHA1998;), третьи считают, что главная сцена патологических реакций - проводящие волокна ЗН (BienA, 1999), четвертые полагают, что ГКС гибнут вторично к уже развившимся изменениям нейроглии, аналогичные тем, что развиваются в головном мозге при нейродегенеративных заболеваниях (Goldblum D., 2007). Пятые обращают внимание, что при глаукоме не менее приоритетным может быть поражение фотосенсорных клеток (Страхов В.В; 2013; Соломатина М.В., 2015;Fan0.N, 2011).

Анатомия глаукомного поражения расширилась. С угла передней камеры, трабекулярной сети с его эндотелием, шлеммового канала, сетчатки и зрительного нерва, мы перешли к хориокапиллярам сосудистой оболочки глаза и структурам мозга, в частности, - к наружным коленчатым телам.Поднявшись с глаза на мозг, мы перешли не только на более высокий системный уровень изучения проблемы, но и на более фундаментальный -молекулярный.

Активно ведется поиск иммуномолекуярных маркеров глаукомы. В качестве таковых предложены (S.C.Joachim, F.H. GrusN. Pfeiffer , 2003; OliverWGramlich, 2013) : пептид амилоид ß и эндотелин-1 (NoskeW., 1997), ферментьгЫЖ, 3aHSD, каспаза 14, NO, PGDS, фосфолипазы А«, Св и Су, синуклеин (Surgucheval, McMahanB., 2002) аминокислотыгомоцистеин и гидроксипролин, протеиныBDNF, анкирин-2, ANGPTL7, аполипопротеин В и D, СD 44Н, цистатин QELAMI, GRP78, HSP60 и HSP90, миогенин, миоцилин, миотрофин, трансферритин, транстиретин, ФНОа, некоторые цитокины, гормоныэритропоэтин игепцидин, антитела к бактерии Helicobacterpylori, Chlamydiapneumonia, к гликозаминогликанам, GST, NSE, HSP, GFAP (NiroKashara, 2015), а-

фодрину, а-кристаллинам (F. Gruz), синуклеину (), к фосфатидилсерину (KremmerS, 2001), к белку MOG(ReindlM., 1999) и MBP (S. Lacroix-Desmazes, 2006; Соломатина М.В.2016)

Поиск иммуномолекулярных маркеров диагностики ПОУГ признан перспективным направлением. Такие маркеры отражают нарушения молекулярного гомеостаза на уровне отдельной клетки, предшествующие нарушениям тканевого гомеостаза. Следовательно, adpriore, представляют более ранний уровень диагностики заболевания.

Установлено, что в поддержании и молекулярного и тканевого гомеостаза большую роль играет иммунная система. ГОН прогрессирует на фоне вялотекущего аутоиммунного воспаления (Schwartz M., 2001; Tezel G., 2004). Аутоиммунные реакции усиливают апоптоз нейронов (Grus F., 2008).Однако к настоящему моменту не раскрыты антигены, вызывающие аутоиммунизацию при глаукоме. Это служит препятствием на пути к разработке иммунной диагностики. Многие эксперты отмечают серьезные трудности при расшифровке результатов. Отчасти они обусловлены отсутствием сведений об антигенном профиле клеточных структур сетчатки и зрительного нерва (Tezel G, Seigel GM, 1998; Tezel G, Hernandez R, 2000). В связи с этим, мы попытались устранить имеющийся дефицит знаний в данной области, проведя собственные исследования.

Целью нашей работы стал поиск и определение иммуномолекулярных маркеров диагностики первичной открытоугольной глаукомы.

Планируя свою работу, мы опирались на известные факты. Сетчатка человека состоит из трех нейронов: фоторецепторов (1 нейрон), биполярных клеток (2 нейрон) и ГКС (3 нейрон). Наряду с ними, в большой пропорции в сетчатке присутствуют глиальные клеточные элементы. Функциональные различия этих типов клеток предполагают различия на молекулярном уровне. Иммунофенотипирование выявило 56 популяций нейронов сетчатки, различающихся экспрессируемым спектром нейроспецифических белков. На сегодняшний день только 20 из этих популяций хорошо изучены(Chidlow, 2011). Благодаря особенностям своего метаболизма, нейроны и глиальные клетки по-разному реагируют на повреждающие факторы, например, на гипоксию или ишемию (Zovein A, Flowers-Ziegler J,.2004;). Активность дыхательной цепи в митохондриях глиальных клеток ингибируется в меньшей степени, чем в митохондриях нейронов (Лукьянова Л.Д., .2004; Kann O, 2007). В связи с чем, одни эксперты полагают, что астроциты более устойчивы к гипоксии (Bambrick L, etal. 2004), другие считают, что, напротив, именно астроциты повреждаются с первых минут ишемии (NaskarR., 2001). Между тем, очередность активации и гибели клеток в условиях действия патогенных механизмов определяет последовательность выхода в кровоток и спектр маркеров ранней диагностики заболевания. Предположительно, в случае первоочередной активации макроглии сетчатки должна усиливаться интенсивность

96

экспрессии белков макроглии, а, следовательно, именно их белки или антитела к ним (что равнозначно) должны стать ранними маркерами ПОУГ. Какой из типов глиальных клеток реагирует быстрее - астроциты или олигодендроциты - не известно. В случае опережающего вовлечения нейронов сетчатки, приоритет следует отдать маркерам нейрональной дифференцировки или антителам к ним. Поэтому в качестве потенциальных маркеров мы выбрали антитела к МВР, к нейроспецифической энолазе. Предположительно каждый из указанных маркеров отвечал за «свой» отдел зрительного анализатора и клеточный тип.

МВР признан одним из ключевых маркеров ЦНС И ПНС. В его функции входит быстрое проведение нервного импульса по аксонам, контроль и регуляция процесса миелинизации в аксонах нейронов ЦНС и ПНС, участие в питании нервного волокна, защита его структуры. Из-за каталитических функций антител к МВР, нарушение метаболизма этого белка ассоциируется с развитием демиелинизирующего процесса, приводящего к утрате способности аксонов к функциональной регенерации [5].

МВР всегда оказывается в центре лабораторной диагностики нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона; ишемии мозга, черепно -мозговых травм, а также аутоиммунного заболевания, известного как рассеянный склероз. (Чехонин В.П, 1986; 2010; 2012; ZulianiL, 2012 ).

В офтальмологии белок МВР или антитела к нему применяются в качестве маркера демиелинизирующего оптического неврита, ассоциированного с рассеянным склерозом (Кучинскене, 1992; Карлова И.З, 1997). Введение МВР экспериментальным животным сопровождается выработкой АТ к МВР и развитием модели тяжелого демиелинизирующего оптического неврита (Чехонин В.П., 2005). У больных рассеянным склерозом, характеризующихся высоким уровнем антител к МВР, даже без признаков оптического неврита выявлено истончение сетчатки (Еричев В.П. с соавт., 2012, 2013). Косвенно это свидетельствует в пользу гипотезы о каталитической роли этих антител в механизмах нейродегенеративных процессов при глаукоме. Израильские специалисты обнаружили, что препарат Copaxone, применяющийся в лечении рассеянного склероза, оказывает нейропротекторный эффект, сокращая гибель нейронов сетчатки и зрительного нерва с 28 до 4% в экспериментальной модели глаукомы у крыс. Как известно, терапевтический эффект Copaxone обусловлен его способностью блокировки каталитических аутоиммунных реакций, протекающих с участием АТ к МВР и лежащих в основе деструкции миелиновой оболочки аксонов. Этот факт заставляет по-новому взглянуть на процессы миелинизации при ПОУГ. В 2012-2014 году российские ученые провели серию исследований, посвященных этому вопросу, и нашли убедительные доказательства нарушения ремиелинизации на уровне периферического и центрального отделов зрительного анализатора. Морфологические

97

исследования у кроликов с экспериментальной адреналин-индуцированной глаукомой, наряду с уменьшением количества и толщины нервных волокон на срезе зрительного нерва, подтвердили дегенерацию оболочек нервных волокон, проявляющуюся участками неравномерной плотности миелина (Алексеев В.Н., Газизова И.Р.,2014). Авторы отнесли их к атрибутам нейродегенеративных процессов. Они нарастали во времени, в отдаленные сроки выявлялись в СНВС, зрительном нерве, хиазме, зрительном тракте и латеральном коленчатом теле (Алексеев В.Н., Газизова И.Р. 2012; Газизова И.Р. 2012).

МВР отражает нарушения молекулярного гомеостаза на этапе функциональной активации олигодендроцитов (образования белков семейства МВР), а, следовательно, является ранним индикатором патологических изменений при ГОН.

Известно, что глюкоза является единственным энергетическим источникомнейронов ЦНС и сетчатки. Поэтому, независимо от патогенного фактора воздействия (ишемия, гипоксия, оксидативный стресс и др), наиболее ранние нарушения молекулярного гомеостаза в нейронах проявляются на уровне гликолиза, находящегося под контролем гликолитических ферментов- энолаз. Семейство энолаз состоит из трех типов белков - а, в и у, кодирующихся в разных хромосомах (Abramsonetal., 1989). ^Б -гидроксибутиратэнолаза цитоплазматических ферментов, участвующих в гликолизе (Кгуе1а, 1986Ь; Jennette, 1989). Гамма-энолаза (^Е) имеет уникальную устойчивость к хлоридно индуцированной инактивации и специфична для нейронов ЦНС, а также клеток, обладающих способностью дифференцироваться в нейроны (Nakajimaetal., 1983; Haimotoetal., 1985). Установлено, что NSE присутствует в высоких концентрациях в сетчатке (Магап§ове1а1., 1979). Соответственно, экспрессии №Е, как, впрочем, и £N0-1 теоретически должна отражать интенсивность гликолитических процессов в нейронах сетчатки.

В связи с чем, на первом этапе мы изучали топографическое распределение в структурах глаза маркеров, выбранных нами для молекулярной диагностики ПОУГ. Выбор маркеров - основывался на проработке литературных данных обеих контрольно-регуляторных функциях в тканях ЦНС и глаза (см выше). Это представлялось необходимым для обоснования нашего выбора, понимания их роли и интерпретации нарушений системной продукции маркеров в серологической диагностике.

Морфологические исследования проводили на 30 энуклеированных глазах с инкурабельной болящей терминальной глаукомой. Изучали топографию экспрессии двух нейрональных маркеров ^БЕ и МВР) в сетчатке, проводящем отделе зрительного нерва и ключевых структурах глаз, участвующих в оттоке и секреции - цилиарном теле и его отростках.

Исследования позволили выявить четкие закономерности (см ниже).

98

Фенотип фоторецепторов (1 нейрон зрительного каскада) принципиально отличался от фенотипа 2-го и 3-его нейронов сетчатки. Палочки и колбочки демонстрировали позитивную ИГХ-окраску с маркерами ^Е, но при этом были негативны к МВР. ИГХ-профили наружных и внутренних отделов фоторецепторов различались. Наружные сегменты были «заточены» на фотохимические процессы, внутренние - на энергетический обмен клетки, обеспечивая сохранность палочек и колбочек и их функциональную активность. Морфологически, благодаря таким функциональным различиям, внутренние сегменты отличались густым скоплением митохондрий в цитоплазме и интенсивно окрашивались АТ к NSE, в отличие от наружных ^Е-негативных отделов фоторецепторов.

Биполярные и ганглиозные клетки сетчатки (2 и 3 нейрон) имели идентичный фенотип: интенсивно экспрессировали в цитоплазме NSE, не экспрессировали МВР.

Аксоны ГКС, формирующие слой нервных волоконсетчатки, также интенсивно окрашивались антителами к NSE и были ИГХ-негативны по отношению к МВР.

Астроциты, разбросанные в слое ГКС и СНВС, а также в других слоях сетчатки, были негативны по отношению к МВР.

Глиальные клетки проводящего аппарата органа зрения, представленного зрительным нервом, умеренно экспрессировали МВР.

Аксоны зрительного нерва, покрытые миелиновыми оболочками, окрашивались по контуру АТ к МВР.

ПОУГ ассоциируется с нарушением контроля регуляции гидродинамики, снижением оттока и офтальмогипертензией, в условиях которой ГОН прогрессирует быстрее.Цилиарное тело и цилиарные отростки - ключевые структуры, отвечающие за отток и секрецию водянистой влаги.В связи с чем, наряду с сетчаткой и зрительным нервом, мы также изучали цилиарное тело с отростками и трабекулой. Ракурс наших исследований был смещен в сторону оценки ИГХ-экспрессии нейроспецифических белков - маркеров, отражающих периферическую иннервацию этих структур.

ИГХ-исследования, проведенные на глазах с терминальной стадией ПОУГ, выявили выраженную цитоплазматическую ИГХ-окраску пигментного эпителия (3+) АТ к ^Е, слабую положительную цитоплазматическую окраску беспигментного эпителия (1+) и умеренную окраску (3+) цитоплазмы гладкомышечных клеток ресничного тела.

Результаты подтверждали высокую зависимость от гликолитических процессов жизнедеятельности цилиарных отростков (особенно пигментного эпителия) и цилиарного тела, сопоставимую с таковой у ЦНС и сетчатки. И если, экспрессия ^Е в сетчатке ранее было выявлена Marangosetal. (1979г), то сведений о присутствии ^Е в цилиарном теле и его

99

отростках не представлено. Эксперты полагают, что NSE экспрессируют исключительно клетки, обладающие способностью дифференцироваться в нейроны (Nakajimaetal., 1983; Haimotoetal., 1985).

Мы также обнаружили экспрессию МВР в миоцитах цилиарного тела и аксонах периферических нейронов. Интенсивность экспрессии была высоко вариабельной и обратно коррелировала с продолжительностью заболевания (глава 3). ИГХ-реакция была негативной на глазах с более чем 10-летним anamnesis morbi. Выявленный факт позволил предположить, что нейродегенеративный процесс при ПОУГ в цилиарном теле проявляется также потерей аксонов периферической нервной системы. Неожиданной находкой для нас стала положительная ИГХ-реакция АТ к МВР с гранулярным окрашиванием цитоплазмы в клетках беспигментного эпителия цилиарных отростков. В отличие от олигодендроцитов, эти клетки не отнесены к миелинсинтезирующим структурам. В литературе мы не нашли таких сведений.

Известно, что беспигментный эпителий отростков цилиарного тела, осуществляющий секреторную и всасывательную функцию, играет важную роль в патогенезе ПОУГ. Поэтому, вполне вероятно, что эта структура может претерпевать морфологическую перестройку в виде специфических дистрофических изменений. Одни авторы указывают на гомогенизацию и вакуолизацию беспигментного эпителия отростков цилиарного тела с образованием белкового слоя (Николаенко Г.А., 2016), другие - на уменьшение объема цилиарных отростков и цилиарной мышцы и резкое уплотнение стромы цилиарных отростков с образованием «слипшихся» конгломератов пигментного эпителия (Филина Н.В.,2016). Предположительно контроль регуляции гидродинамики глаза осуществляет периферическая нервная система (Егоркина, С. Б., 2011; Николаенко Г.А.,2016; Филина Н.В. 2016). В аспекте иннервации ресничная мышца не имеет аналогов: каждая ее клетка снабжена нервными окончаниями. При этом, регуляция деятельности цилиарной мышцы осуществляется как парасимпатическим, так и симпатическим отделом вегетативной нервной системы. По данным Деева Л.А., Абросимова С.Ю. и Молоткова И.А. (1996), изучавших гетерогенность распределения адренергических и холинергических нервных терминалей в цилиарной мышце в норме, симпатическая иннервация присутствует не только в меридиональных, но и в радиальных мышечных волокнах. Чувствительная иннервация хорошо выражена и обеспечивается gangl. ciliaris, образованного длинными и короткими ветвями цилиарных нервов (I ветвь тройничного нерва) (Деев Л.А., Абросимов С.Ю., 1996). Парасимпатическая система регулирует сократительную деятельность цилиарной мышцы. Симпатическая система выполняет трофическую функцию и оказывает тормозящее действие на сократительную способность цилиарной мышцы, регулируя просвет Шлеммова канала и

100

трабекулярной сети и, влияя, таким образом, на отток водянистой влаги. Это подчеркивает роль периферической иннервации в развитии офтальмогипертензии. Ее сохранность на клеточном, молекулярном и функциональном уровне, обеспечивает слаженность продукции и оттока, стабильность офтальмотонуса или незначительные суточные флуктуации ВГД.

Нарушение метаболизма МВР связывают с началом развитиядемиелинизирующего процесса, нарушением репаративных процессов в ЦНС и снижением ее пластичности (ThomasBerger.1994) Нарушение миелинизации как признак нейродегенеративного процесса в ПНС, осуществляющей контроль гидродинамики, мог предшествовать потере аксонов ГКС и клинически проявляться офтальмогипертензией. В этой ситуации присутствие МВР в цитоплазме беспигментного эпителия цилиарных отростков может быть объяснено вновь обретенной клеточной специализацией в условиях воздействия патогенных механизмов или. Связь с длительностью анамнеза говорит о том, что со временем эта функция утрачивается.

Проведенные нами ИГХ-исследования раскрыли топографию экспрессии МВР в структурах глаза. ИГХ-окрашивание цилиарной мышцы, оболочек периферических нервов и беспигментного эпителия цилиарных отростков подтвердили диагностический и прогностический потенциал АТ к МВР для ПОУГ.

В аспекте ранней диагностики более приоритетным представлялся маркер NSE. Универсальность этого маркера связана с экспрессией тремя типами нейронов сетчатки и аксонами ГКС. Это означало, что любые количественные изменения в его экспрессии в 1, 2 или 3 нейронах, и аксонах ГКС должны найти отражение в серологических показателях NSE / или антител к NSE. Полученные нами ИГХ-данные согласуются с работами Marangos, продемонстровавшим экспрессию NSE в нейронах сетчатки, а также с исследованиями Chevez, показавшим, что наружные сегменты фоторецепторов и клетки Мюллера NSE-негативны (P.Chevezand R.L. Font, 1993).Усиление диагностического потенциала в серологической диагностике ПОУГ мы видели в тандеме NSE с ENO-1. Гликолитический фермент ENO-1 принимает участие на другом этапе гликолиза и может подтвердить более позднее нарушение гликолиза в нейронах.

В целом выявленные особенности вертикального ИГХ-профиля сетчатки на глазах с терминальной стадией ПОУГ подтверждали пригодность всех трех маркеров для серологической диагностики этого заболевания. Полученные данные облегчали расшифровку серологических данных.

Вовлечение в патологический процесс фоторецепторов подтверждено морфологически, методом ОКТ и электрофизиологически (см выше).В связи с чем, мы расширили спектр маркеров диагностической панели ПОУГ и ввели АТ к родопсину. Его эксспресируют исключительно палочки. Мы полагали, что если палочки первыми

101

вовлекаются в патологический процесс при глаукоме, то введение в панель АТ к родопсину повышает наши шансы на раннюю молекулярную диагностику ПОУГ. Эти антитела отражаютфункциональный статус фоторецепторов, в частности палочек на уровне фотохимических процессов зрительного каскада в самом его начале (!!!). Мы полагали, что молекулярные нарушения в фоторецепторах предшествуют морфометрическим изменениям ГКС.Таким образом, наша диагностическая панель маркеров ПОУГ состояла из АТ к нейрональным белкам МВР, родопсину, ^Е и ENO-1.Ее информативность и надежность мы проверяли на втором этапе наших исследований.

Для доказательства роли АТ в развитии аутоиммунного заболевания обычно применяют критерий Витебски-Роз-Коха в соответствии с которым аутоантитело признают патогенным, если:введение (перенос-трансфер) этого АТ вызывает соответствующее заболевание; аутоАТ найдено в патологических очагах, специфических именно для этого заболевания;заболевание может быть индуцировано иммунизацией соответствующим антигеном. Мы справились с первой задачей, то есть нашли присутствие маркеров в предполагаемых мишенях патогенных механизмов глаукомы (в частности аксонов ГКС) и изучили топографию их экспрессии в сетчатке и зрительном нерве, а также, в цилиарном теле и его отростках.

Вторым этапом работы стали серологические исследования с выбранными маркерами в группе ПОУГ (глава 4) и поиск доказательств связи этих антител с клиническими проявлениями ПОУГ.

Было установлено, что антитела к МВР, родопсину, ^Е и ENO-1 присутствовали в норме, составляя фоновые значения. Частота обнаружения АТ к МВР, родопсину, ^Е и £N0-1 в норме составляла против в группе ПОУГ.

Группа контроля продемонстрировала средне популяционные показатели и коридор их вариабельности. По сравнению с нормой, в группе ПОУГ были снижены средне-групповые показатели системной продукции АТ к (р<0,01), ENO (р<0,001), МВР

(р<0,01) и родопсину (р<0,001). ПОУГ манифестировала на фоне сочетанного системного иммунодефицита АТ к (р<0,05), ENO (р<0,001) и родопсину (р<0.001). При переходе с начальной к развитой стадии (1^3) заболевания углублялся дефицит АТ к ENO-1 и АТ к NSE.Максимальный дефицит АТ к родопсину на первой стадии (в объеме 28,7% от нормы) и прирост антитело продукции(в объеме 33,3% от нормы) на терминальной стадии заболевания свидетельствовал о массивном фотострессе палочек. По-видимому, манифестации ПОУГ предшествовал выброс АГ в кровоток, за ним следовала стимуляция системной продукции АТ к родопсину.

Известно, что при массивном фотострессе расщепление родопсина превосходит возможности его ресинтеза. Вслед за экспоненциальным приростом этого АГ нарушается толерантность к его компонентам. Это приводит к стимуляции продукции АТ к родопсину. Антитела связываются с родопсином и в составе иммунных комплексов откладываются в сетчатке, разрушая ее фоторецепторы (1 нейрон зрительного анализатора и участник зрительного каскада). На этом этапе аутоиммунного процесса уровень свободных антител, циркулирующих в кровотоке, падает, а связанных - увеличивается. Полученные серологические данные подтверждали нашу научную гипотезу и объясняли выявленные нами патоморфологические изменения фоторецепторов на глазах с терминальной глаукомой (см главу 3)

Объем дефицита АТ к ENO в группе ПОУГ варьировался от 35,7% до 55,7% от исходных показателей контроля, аналогичный коридор вариабельности дефицита продукции АТ к NSE составил: 16,2 % - 27,7%. В отличие от АТ к БКО,эти антитела на терминальной стадии заболевания демонстрировали небольшой (5,4%) прирост продукции. Растущий дефицит АТ к ENO и №Е (цитоплазматические маркеры, отвечающие за гликолитические, метаболические процессы в нейронах сетчатки) свидетельствовал о нарастающем энергетическом стрессе в нейронах сетчатки, возможной их гибели с выходом антигенов (^Е) и расходом антител на образование иммунных комплексов. Объем гибели экспрессирующихNSE нейронов на 3 стадии, превышал объем 1-2-х стадий. Небольшой прирост АТ к NSE на далеко-зашедшей стадии, по-видимому, можно трактовать как прекращение поступления в системный кровоток антигена в связи с тотальной гибелью нейронов, их экспрессирующих. Нарушение системной продукции антител к гликолитическим ферментам свидетельствовали о нарушении молекулярного гомеостаза в нейронах на уровне гликолиза. Следует подчеркнуть, что глюкоза - единственный источник энергии нейронов; и облигатное условие для поддержания их функций и жизнеспособности. Согласно нашим морфологическим данным, наряду с биполярными клетками и ГКС, №Б экспрессировали и фоторецепторы. Возможно, именно они стали первой мишенью аутоиммунной агрессии, к которой затем присоединились другие нейроны. Данные подтверждают предположение Страхова В.В.(2009, 2015гг). Они также не противоречат утверждениям, что на этапе манифестации ПОУГ снижается плотность макулярного пигмента, которая коррелирует с периметрическим показателем МО (Эскина Э.Н, 2014; Спэлтон Д.Дж., 2007; WeFongSiah, 2014). Макулярные пигменты как, известно, отражают уровень защиты фоторецепторов от фотостресса.

Системная продукция АТ к MBP демонстрировала другие закономерности. Отмечалась некая цикличность: повышение уровня антител на первой и третьей стадии сменялось резким падением на второй и четвертой.

Заметим, серологические показатели АТ к родопсину и ENO не коррелировали с манифестацией заболевания. Это событие, положительно коррелировало с АТ к NSE (коэфф корреляции r=0,28741, p<0,05) и негативно коррелировало с АТ к МВР (коэфф корреляции r= - 0,36583 p<0,01). При этом, характер связи между АТ к МВР на терминальной стадии ПОУГ менялся с негативного на позитивный: коэфф корреляции r= 0,41879 (p<0,001).

Антитела были также связаны между собой. Так, системная продукция АТ к ENO прямокоррелировала с МВР (r=0,32045, р < 0,01). В свою очередь, АТ к МВР прямо коррелировали с АТ к NSE (r=0,38386, p < 0,001). Снижение антител к родопсину обратно коррелировало с АТ к NSE (r= -0,24406, р< 0,05), а снижение АТ к ENO, обратно коррелировало с АТ к МВР: (r=-0,26614, р < 0,05).

Нарушения системной продукции в крови АТ к МВР при ПОУГ выявили Bizzaro N и Cohen I.R (Bizzaro N., 2007; Cohen I.R., 2007), при НТГ их изучала Соломатина М.В. (2016г). Представлены доказательства повышения реактивности В-лимфоцитов к МВР при ПОУГ, манифестирующей стойким повышением ВГД и нарушением оттока ВГЖ. Нарушения проводимости зрительного стимула, обусловленной дефектами миелиновых оболочек аксонов ЗН, нашли отражения в электрофизиологических показателях (Маслова Е.В. и Курышева Н.И. (2016г)

Поскольку ПОУГ, наряду с ГОН, клинически ассоциируется с офтальмогипертензией, мы провели корреляционный анализ серологических показателей АТ к МВРс гидродинамическими, морфометрическими и функциональными показателями. Поскольку в нашей группе ПОУГ практически отсутствовали лица с низким ВГД и было мало лиц с показателями, укладывающимися в коридор нормы, для более глубокого корреляционного анализа мы включили группу больных НТГ (как форму ПОУГ). Полученные нами результаты, подтверждали нарушение системной продукции АТ к МВР при глаукоме. Основной массив популяции ПОУГ, имел сниженные уровни и только небольшая пропорция больных с НТГ имела повышенные серологические уровни АТ к МВР на этапе манифестации заболевания.

Как известно, наибольшие сложности в клинико-иммунологических исследованиях составляет интерпретация полученных данных. Долгие годы ориентировались на повышенные уровни антител, а их дефицит расценивали как аберрантный дефект аутоиммунитета. За последние годы произошла переоценка информации. Остались

104

неизменными исключительно канонические представления (Зайчик А.Ш.,1988; Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 2002;Чурилов, Л.П. 2010; Полетаев А.Б., 2010; А.Ш. Зайчик, А.Б.Полетаев, Л.П.Чурилов, 2013). Согласно канонам иммунологии, дефицит АТ может быть объяснен их расходом на связь с АГ - МВР, а повышение АТ - стимуляцией антителопродукции в ответ на выброс АГ. Выброс АГ предшествует стимуляции. В этом аспекте вполне закономерно: повышение антителопродукции к МВР на этапе манифестации ПОУГ и снижение АТ на этапе выраженных нарушений гидродинамики и развитой стадии заболевания

Корреляционный анализ подтвердил тесную связь серологических показателей АТ к МВР с экспертными показателями гидродинамики глаза. Максимальный процент выявления дефицита АТ к МВР пришелся на подгруппу со снижением оттока (1-я подгруппа, С <0,15 мм рт. ст./ мин): 62,9% против 28,95% в группе с сохранным оттоком (р<0,05). Большая часть этих больных (55,6%) имела высокий КБ. Уровень АТ к МВР прямо коррелировал с секрецией водянистой влаги (/=0,20841, р<0,05) и снижением оттока (/=0,27243, p<0,05); обратно коррелировал с повышением офтальмотонуса (/=-0,24046, р<0,05), легкостью оттока (/=-0,21552; р<0,05); и с КБ, отражающим разобщение контроля регуляции гидродинамики (/=-0,21683, p<0,05).

Учитывая каталитические функции АТ к МВР, их участие в процессах ремиелинизации, можно предположить о присоединении деструктивных процессов в оболочках аксонов ПНС на этапе манифестации заболевания. Наши данные согласуются с общими представлениями о роли этих антител. Согласно сложившемуся стереотипу, любое повышение уровня АТ к МВР в СК должно трактоваться в контексте атаки аутоиммунной агрессии по отношению к аксонам зрительного нерва, неизменно приводящей к снижению зрения. Этот факт нашел отражение в публикациях, посвященных оптическому невриту, ассоциированному с рассеянным склерозом (Дронов М.М , 2012). Однако отсутствие миелиновых волокон в сетчатке, высокая острота зрения на начальной стадии глаукомы, ранним проявлением которой являются офтальмогипертензия и/или нарушение оттока водянистой влаги, а также выявленная тесная корреляция этих признаков с нарушениями антителообразования к МВР, свидетельствуют о том, что могут присутствовать и иные объекты агрессии. Возможно, мишенью аутоиммунной агрессии являются аксоны ПНС, что приводит к нарушению контроля регуляции гидродинамики. Информация о нейрорегуляции секреции и оттока скудна. Предположительно, в этом процессе участвует как ЦНС, так и ПНС (Волков В.В.,2001). Морфологические исследования показали, что трабекула и цилиарное тело обильно иннервированы миелинизированными и безмякотными нервными волокнами (Нестеров А.П, 1974, 2012). Некоторые из них выполняют роль баро- и механорецепторов, реагируя на изменения в тонусе ресничной мышцы и/или в

105

офтальмотонусе (Светлова O.B.,2004VonSallmanL.,1955; StefaniF.H. 1994). Цилиарная мышца рассматривается как эффекторный орган, регулирующий отток влаги (Gdlego R., 1974). На глазах животных идентифицированы центростремительные волокна длинных задних и коротких ресничных нервов, отвечающие на изменения ВГД, однако их электростимуляция в эксперименте не влияла на офтальмотонус (Denis Р., 1994). Предпринимались попытки изучить центральный механизм контроля водного внутриглазного гомеостаза (Дронов М.М , 2012). Роль вегетативной нервной системы (ВНС) в этом процессе косвенно анализируют на основании изменений гидродинамических показателей в ответ на лекарственные препараты, стимулирующие и угнетающие ВНС ^ап§ИатМЕ,1996; PerkinsES.,1961). Известно, что ВНС имеет свои представительства в коре головного мозга, ретикулярной формации и полосатом теле. Симпатические волокна верхнего шейного симпатического узла подходят к гладкомышечным волокнам радужки, расширяющим зрачок, к цилиарной мышце и сосудам глаза. Поэтому стимуляция шейного симпатического узла благодаря сужению просвета сосудов цилиарного тела приводит к сокращению объема секреции водянистой влаги и снижению офтальмотонуса, а симпатэктомия - к снижению офтальмотонуса за счет увеличения оттока (Дронов М.М , 2012). Аксоны ПНС и ЦНС различаются медиаторами, регулирующими их деятельность (Морозов В.И., 2010). Вполне закономерна версия, что молекулярный «сценарий» демиелинизации миелинизированных аксонов универсален для аксонов ПНС и ЦНС. Заметим, что гибель аксонов ВНС может протекать синхронно или метахронно, опережая или запаздывая по отношению к аксонам ЦНС или аксонам ГКС. Полагаем, что есть все основания считать нарушение контроля нейрорегуляции секреции и оттока и ГОН звеньями одной цепи.

Вышеуказанные факты позволяют сделать следующие умозаключения. Нарушение процесса ремиелинизации на уровне белковобразовательной функции олигодендроцитов и каталитических реакций с участием АТ к МВР является признаком нейродегенерации и играет важную роль в патогенезе ПОУГ. Мишенью для них могут служить как аксоны ПНС, так и ЦНС. Уровень и глубина поражения могут определять клинические проявления глаукомы.

На третьем этапе исследований мы провели корреляционный анализ серологических показателей с ОКТ-данными. Мы изучали характер связи антител к различных структурным компонентам зрительного каскада с экспертными морфометрическими показателями сетчатки и зрительного нерва.

Было установлено, что дефицит АТ к NSE прямо коррелировал с истончением сетчатки в височно- внутреннем (р<0,05) и височно - наружном (р<0,01), а также, в

106

назально-наружном отделах (р<0,05) макулы. С АТ к NSE коррелировала толщина СНВС (р<0,05) и отношение Э/ДЗН (p < 0,001, глава 4).

Сильная тенденция к сопряженной связи выявлена между АТ к ENO в сыворотке и толщиной сетчатки в фовеа и ее объемом (р= 0,0732 и р=0,0861).

В целом представленные корреляции серологических показателей АТ к NSE с морфометрическими параметрами НРП, сетчатки и толщиной СНВС, подтверждали морфологические данные о вертикальном топографическом распределении NSE в структурах сетчатки. Его экспрессия верифицирована в 1, 2 и 3 нейронах, наружном и внутреннем плексиформных слоях, СНВС и зрительном нерве. Выявленные корреляции подтверждали обоснованность выбора его в качестве маркера диагностики ПОУГ на раннем этапе диагностики ПОУГ, возможно, предшествующем морфометрической перестройке.

Параметры НРП в верхне-височном, височном, носовом и нижне-носовом отделах коррелировали с с АТ к NSE (р<0,01) и с АТ к родопсину (р<0,05).

Индекс отношения экскавации к диаметру ДЗН прямо коррелировал с АТ к родопсину (р<0,01) и обратно - с АТ к МВР (p < 0,01)