Идентификация и картирование LTR на 19 хромосоме человека и анализ структуры локусов 19 хромосомы человека, содержащих LTR эндогенного ретровируса HERV-K тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Лаврентьева, Ирина Валерьевна

• Лаврентьева, Ирина Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лаврентьева, Ирина Валерьевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

I. ИНТЕГРАЛЬНЫЕ КАРТЫ ХРОМОСОМ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ

В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1. ПРИНЦИПЫ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ

К СОЗДАНИЮ КАРТ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

1.1 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ

1.2. ФИЗИЧЕСКИЕ КАРТЫ

1.3. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ КАРТЫ

2. МАРКЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ

ПОСТРОЕНИЯ КАРТ

2.1. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ STS И EST МАРКЕРОВ

мРНК как источник EST

гяРНК как источник EST

2.2. МЕТОДЫ КАРТИРОВАНИЯ STS/EST

Рестриктные карты

FISH-гибридизация

3. ГЕНОМНЫЕ КЛОНОТЕКИ.

ПОСТРОЕНИЕ КОНТИГОВ

3.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМОСОМНОЙ

МИКРОДИССЕКЦИИ

3.2. КЛОНОТЕКИ ГЕНОМА НА ОСНОВЕ YAC

3.3. КОСМИДНЫЕ КЛОНОТЕКИ ГЕНОМА

3.4. РАДИАЦИОННО-ГИБРИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

3.5. КАРТА 19-Й ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА

4. ЭНДОГЕННЫЕ РЕТРОВИРУСЫ В СОСТАВЕ ГЕНОМА

4.1. СТРУКТУРА ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ

И ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ

4.2. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ

ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ

II. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. МАТЕРИАЛЫ

2. МЕТОДЫ

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Картирование последовательности, гомологичной длинному концевому повтору эндогенного ретровируса

2. Отбор космид, содержащих полноразмерные LTR

3. Картирование LTR на космидах с точностью до

EcoRI фрагмента, гибридизацией по методу Саузерна

4. Локализация изучаемых LTR относительно

известных картированных генов или кДНК

5. Определение первичной структуры картированных LTR

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

з

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

LTR (long terminal repeat) - длинный концевой повтор

HERV (Human Endogenous Retrovirus) - эндогенный ретровирус человека

PCR - полимеразная цепная реакция

RFLP - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

PFGE - электрофорез в пульсирующем электрическом поле

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ

YAC - искусственные хромосомы дрожжей

RH - радиационные гибриды

STS - sequence tagged site

EST - expressed sequence tag

kb - килобаза

Mb - мегобаза

п.о. - пар оснований

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ОЕ - оптических единиц

ДНК - дезоксирибонуютеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная РНК

к ДНК - ДНК копия мРНК

гяРНК - гетерогенно-ядерная РНК

гякДНК - гетерогенно-ядерная кДНК

Трис/TRIZMA base - трис/оксиметил/аминометан

SSC - sodium chloride/sodium citrate buffer

ЭДТА - этилендиаминотетраацетат

SDS - sodium dodecyl sulfate

ПЭГ - полиэтиденгликоль

ПААГ - полиакриламидный гель

ТЕМЕД - Ы^К^К'-тетраметилэтилендиамин

BSA - бычий сывороточный альбумин

dNTP - 2'-дезоксирибонуклеозидтрифосфат

ddNTP - 2',3'-дидезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация и картирование LTR на 19 хромосоме человека и анализ структуры локусов 19 хромосомы человека, содержащих LTR эндогенного ретровируса HERV-K»

ВВЕДЕНИЕ.

Настоящая работа является частью исследований, проводимых в лаборатории Структуры и Функций Генов Человека по структурно-функциональному изучению областей 19-й хромосомы человека, содержащей длинные концевые повторы (long terminal repeat - LTR) эндогенного ретровируса человека HERV-K.

Эндогенные ретровирусы и ретровирусоподобные элементы были обнаружены в геномах млекопитающих, включая приматов и человека. Эндогенные ретровирусы человека представляют собой геномные последовательности, сходные по структуре с ДНК-копиями геномов ретровирусов и передающиеся по наследству как стабильные менделевские признаки. Существует более десятка различных семейств эндогенных ретровирусов человека (HERV - Human Endogenous Retrovirus), представленных в геноме человека от одной до десятков тысяч копий и встречающихся практически на всех человеческих хромосомах. Большое число элементов HERV в геноме человека объясняется интеграцией экзогенных ретровирусов в ДНК зародышевых клеток и последующей ретротранспозицией вирусного генома в новые локусы. В целом до 1% генома человека занимают ретровирусы и ретровирусподобные последовательности. Обилие таких элементов и их консервативность, привели к появлению многочисленных предположений об их функциональном значении. Так, например, неоднократно высказывались предположения об участии эндогенных ретровирусов в регуляции экспрессии клеточных генов, существуют также некоторые экспериментальные данные, подтверждающие такие предположения. [Feuchter et al., 1992, Suzuki et al., 1990, Ting et al., 1992].

Одно из наиболее многочисленных семейств - HERV-K -представлено в геноме не только ретровирусподобными элементами, но и

значительно большим количеством одиночных длинных концевых повторов (ЬТЯ). Количество НЕЯУ-К ЬТ11 оценивается до 25 ООО копий на гаплоидный геном. Наличие в структуре ЬТИ целой группы регуляторных элементов, таких как энхансер, промотор, участок связывания кортикоидных гормонов, сигнал полиаденилирования, позволяет предполагать потенциальную способность ЬТЯ модулировать активности генов, в локусах которых они оказались расположены.

Точное картирование ретровирусных элементов могло бы позволить провести анализ их возможных взаимодействий с близлежащими генами, дать более глубокое понимание их роли в эволюции генома. Тем не менее, до настоящего времени не проводилось систематического картирования НЕЯУ элементов на отдельных хромосомах человека. Молекулярные механизмы участия НЕЯУ ЬТЯ в регуляции активности близлежащих генов остаются мало изученными.

I. ИНТЕГРАЛЬНЫЕ КАРТЫ ХРОМОСОМ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гаплоидный геном человека состоит из 3,5x1п.о. [Bodmer, 1981] и представлен 23 хромосомами. Для него, как и для других эукариотических организмов, характерно не только наличие кодирующих последовательностей, но и нуклеотидных последовательностей, не кодирующих белки. Это нетранслируемые внутригенные последовательности - интроны, регуляторные последовательности, участвующие в транскрипции, репликации, различные семейства повторов (например: семейство Alu-повторов, сателитная ДНК и т.д.).

Общее число генов в геноме человека оценивается на уровне 50.000-100.000 [Antequera and Bird, 1994; Nowak, 1994]. К январю 1998 с помощью различных методов было идентифицировано и картировано около 8.000 генов человека [http:// www.gene.ucl.acuk/ hugol. Их нуклеотидные последовательности были занесены в международную базу данных. Значит, мы имеем достоверные представления лишь о восьми процентах генов человека.

Идентификация генов в геноме, определение положений генов на хромосомах и установление их функций, является главной целью проекта "Геном Человека". Конечная цель проекта -получение полной структурной информации о геноме, о позиции любого гена с помощью сопоставления его генетической, физической и транскрипционной карт. Таким образом, основной задачей проекта "Геном Человека" в настоящее время является создание детальной интегральной карты генома и отдельных хромосом.

К середине 80-х годов бурное развитие молекулярной биологии и генетики человека сделало возможным появление проекта "Геном Человека". Были разработаны методы изучения генов человека, которые и легли в основу этого проекта.

В области молекулярной биологии это были методы быстрого определения первичной структуры ДНК [Sanger et al., 1977], полимеразной цепной реакции (PCR) [Saiki et al., 1988], клонирования протяженных (до нескольких Mb) участков чужеродной ДНК в векторах нового типа, например в искусственных хромосомах дрожжей (YAC) [Burke et al., 1987], разделения больших фрагментов ДНК электрофорезом в пульсирующем электрическом поле (PFGE) [Schwartz and Cantor, 1984].

В области генетики человека были разработаны методы локализации генов с помощью анализа сонаследования признаков с анонимными ДНК-маркерами. Анализ протяженных участков генома по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов. (RFLP) оказался настолько удачным, что позволил к 1987 г. получить первую карту генома человека [Donis-Koler, 1987].

Каждая карта требует своей собственной системы координат или системы маркеров. Еще не так давно картирование и клонирование генов человека, связанных с развитием заболеваний было почти невозможно, т.к. маркеров до начала 80-х годов на хромосомах человека было крайне мало. Доступность таких маркеров и появление новых методов молекулярной генетики в настоящее время позволяет картировать и клонировать гены, связанные с развитием многих болезней человека, изучать продукты этих генов и их функционирование. В результате появляется знание о функционировании генома человека в норме и патологии, понимание причин развития заболеваний на молекулярном

уровне, создаются средства диагностики таких заболеваний и, в перспективе, средства их профилактики и лечения.

К маркерам, необходимым для построения карт относят три основные категории: сами гены, анонимные фрагменты ДНК и т.н. STS и EST маркеры. Анонимные маркеры (D-сегменты) - это фрагменты ДНК, локализованные на генетической карте. Для создания маркера не требуется выяснение функции этого фрагмента, необходимо только наличие надежного метода его идентификации, информация о том, с какими другими маркерами он сцеплен и возможно большая гетерозиготность соответствующих локусов в популяции. STS (sequence tagged site) маркер представляет собой пару олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих специфическую амплификацию единственного участка генома с известным положением на хромосоме. Если уникальная последовательность является транскрибирующейся последовательностью, то она называется EST (expressed sequence tag). Всех их используют как в генетическом, так и в физическом картировании генома.

1. ПРИНЦИПЫ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ КАРТ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА.

Впервые ген был отнесен к определенной хромосоме в 1911 г., когда E.B.Wilson на основании анализа родословных смог отнести ген дальтонизма к Х-хромосоме.

В последующем, по мере открытия новых генов, встала задача определения не только их хромосомной локализации, но и порядка расположения на хромосоме и расстояния между ними. Такие данные являются первым шагом в изучении не отдельных генов, а всего генома в целом. Решение этой задачи стало возможно после открытия явления генетической рекомбинации. Появилась возможность построения генетических карт.

Генетические карты состоят из последовательности генетических маркеров, упорядоченных на основе взаимных частот рекомбинации. Генетические карты несут информацию о взаимной локализации генных локусов, порядке их расположения и относительных расстояниях между ними. Единицей измерения расстояний при генетическом картировании является один сантиморган (сМ), т.е. такое расстояние, при котором вероятность рекомбинации между генами равна 1%. Наиболее существенным недостатком генетических карт является их неаддитивность (т.к. в разных районах генома рекомбинация происходит с разной частотой) и, кроме того, построение генетических карт человека усложняется невозможностью проводить необходимые скрещивания.

Поэтому для успешного картирования необходимы методы быстрого и надежного анализа большего числа генотипов и/или большого числа клонированных фрагментов генома по большему числу признаков. Таким образом, встает задача построения физических карт генома или его участков, которые в отличие от генетических дают

абсолютные расстояния между генетическими элементами, и позволяют локализовать функционально важные участки генома. Единица измерения расстояний на физических картах - число пар нуклеотидов (bp, п.о.).

Для карт любого типа необходимо иметь набор хорошо охарактеризованных маркеров, перекрывающих весь геном или исследуемую область генома с определенной частотой. Расстановка маркеров с высокой плотностью на карте генома, на расстоянии в среднем около 0.1 сМ или 100 т.п.н., необходима для возможности быстрого перехода от одних методов анализа к другим при поиске генов, в частности от анализа генетического сцепления к физическому картированию и, впоследствии, к секвенированию изучаемых районов.

В качестве маркеров можно использовать либо сами гены, либо охарактеризованные каким-либо образом фрагменты ДНК. Вообще говоря, любая характерная особенность того или иного участка генома, отличающая его от любого другого участка, может быть использована в качестве маркера. Это могут быть сайты узнавания рестриктаз, транскрибирующиеся последовательности, регуляторные элементы и тому подобное. В конечном счете, сама последовательность данного участка ДНК является маркером. Одним из важнейших требований к физическим маркерам является их уникальность, т.е. из числа возможных маркеров должны быть устранены повторяющиеся последовательности. Картированные маркеры дают точки отсчета для локализации любых структурных и/или функциональных последовательностей генома.

Получение различного рода маркеров было существенно упрощено благодаря развитию методов, использующих полимеразную цепную реакцию (PCR). PCR позволяет амплифицировать специфические молекулы ДНК in vitro посредством циклического ферментативного синтеза ДНК. Метод PCR позволяет на ДНК-матрице синтезировать

любой заданный фрагмент ДНК, размеры которого определяются специфичной, комплементарной к матрице парой коротких (около 20 нуклеотидов) синтетических "прайм еров". Это позволяет амплифицировать каждый такой фрагмент в миллиард раз, оставляя при этом остальною часть генома в исходной концентрации [Saiki et al., 1985; Saikietal., 1988].

1.1 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ.

Хотя со времен Моргана методы генетического картирования совершенствовались, но основной принцип оставался неизменным. Карты генетического сцепления строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков -генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы.

Ранее в качестве маркеров использовали только гены, экспрессия которых обнаруживалась по их эффекту. Успехи бурно развивающихся молекулярной биологии и молекулярной генетики привели к созданию новых многочисленных маркеров, первыми из которых, в том числе и на хромосомах человека, стали маркеры типа RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) [Botstein et al. 1980].

RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) основан на том, что изменения последовательности ДНК, вызываемые различными причинами, могут обуславливать изменения в расположении сайтов рестрикции и значит сказываются на длине рестриктных фрагментов. Это может нарушать биологическую функцию, а может и не иметь никаких биологических последствий; в любом случае измененные локусы наследуются в соответствии с законами Менделя. Эти различия можно определить даже в сложных геномах методом Southern-гибридизации [Southern, 1975]. В 1987 году была опубликована первая карта генома

человека, основанная на "полиморфизме длин рестриктных фрагментов" [Donis-Koler, 1987].

Открытие PCR позволило создать новый класс генетических маркеров, которые обладают высокой вероятностью существования в альтернативных формах в различных образцах генома человека. Эти маркеры основаны на присутствии между парой праймеров короткого (ди-, три-, тетра- ) тандемного повтора нуютеотидов (STR - short tandem repeats) - микросателлитах, которые широко распространены в геноме человека. Особенно частый мотив - это (CA)n- [Weber and May, 1989; Litt and Luty, 1989]. Число мономерных звеньев повтора, присутствующего в одном и том же локусе, может варьировать в индивидуальных гомологичных хромосомах, что позволяет различать их между собой по разнице в длине PCR-продуктов, получаемых от одной и той же пары праймеров. Микросателиты обычно мультиаллельны и поэтому представляют собой высокоинформативные генетические маркеры, гетерозиготность которых очень высока (часто более 70%). В настоящее время микросателлитная ДНК является одним из наиболее широко используемых источников STS [Weber, 1990; Weber and May, 1991; Edwards, 1991; Backmann, 1992; Cohen et al., 1993].

Повторы длиннее микросателлитов, называемые минисателлитами, тоже могут быть использованы в качестве маркеров, хотя они являются менее общими и, следовательно, не так удобны для изучения. Примером таких маркеров могут служить VNTR (variable number of tandem repeat) [Nakamura et al., 1987].

В последнее время, благодаря бурно развивающимся методам секвенирования, стало возможным появление SNP (single nucleotide polymorphisms) - маркеров. SNP - самый часто встречаемый вид полиморфизма, проявляющийся в виде точечных замен, делеций или вставок одного нуклеотида [Cavalli-Sforza, 1998].

Другой возможностью построения генетических карт является "позиционное клонирование" генов. [Collins, 1992]. Позиционное клонирование - это стратегия, созданная в 1980х г.г., для того, чтобы позволить определить биологическую основу многих наследуемых болезней, анализ которых невозможен традиционными методами прямого биохимического анализа пораженной ткани (вообще, биохимический анализ пораженной ткани оказывается эффективным, если только генетический дефект изменяет белок, метаболическая роль которого в нормальной ткани уже изучена. Немногие из наследственных заболеваний, вызывающих ментальную ретардацию, психоз, злокачественные опухоли и другие похожие сложные воздействия, подходят под этот критерий.) [Collins, 1992]. Первый шаг в позиционном клонировании заключается в локализации гена болезни путем выполнения исследований по генетическому картированию на семьях с многочисленными пораженными членами. Изучение со-наследования болезни с генетически картированными полиморфными ДНК-маркерами позволяют определить положение гена в кандитатном локусе, размером 2-5 Mb [Schuler et al, 1996]. Для более точной локализации гена в предполагаемой области необходимо наличие библиотеки клонированных фрагментов из данной области генома, физическое картирование, а также функциональные исследования клонированной ДНК. [Trump et al., 1996].

Таким образом, происходит переход от карт генетического сцепления к физическим, а затем и транскрипционным картам. Ориентирами или "якорями" при таком переходе служат PCR-определяемые генетические маркеры, обеспечивая, таким образом взаимосвязь этих двух типов карт (Рис. 1).

Изучение семей

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ

i

ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ

1

Кандидатный ген

СЕКВЕНИРОВАНИЕ

- Cys - Pro - Gin - Leu Ser - Val - Met 5'-TGTCCGCAACTGTCAGTCATG-3'

- Cys - Pro - STOP

5' -TGTCCGTAACTGTCAGTCATG-3'

Рис. 1. Схема построения интегральных карт.

1.2. ФИЗИЧЕСКИЕ КАРТЫ.

Основными видами физических карт генома являются рестрикционные карты (порядок сайтов узнавания рестриктаз на молекуле ДНК и расстояния между ними); карты маркеров (например: STS, CpG-островков, порядок следования маркеров); контиг-карты (порядок перекрывающихся клонов геномной ДНК).

Контиг - это организованный ряд перекрывающихся в известном порядке клонированных последовательностей геномной ДНК друг с другом [Coulson et al., 1986, Olson et al, 1986].

Существуют две основные стратегии создания физических карт -"сверху-вниз" и "снизу-вверх".

Принцип "сверху-вниз" заключается в том, что хромосома делится на участки, строится карта маркеров для отдельных участков, которые затем увязываются друг с другом [Smith et al., 1987]. Рестриктное картирование является исторически первой методикой использующей подход "сверху-вниз".

Принцип "снизу-вверх" тесно связан с картами контигов - он предполагает создание библиотеки клонированных последовательностей для изучаемой области генома, построение карт отдельных клонов, увязывание полученных клонов с помощью тех или иных методов в контиги, объединение контигов в общую карту [Coulson et al., 1986; Olson et al., 1986; Kohara et al., 1987].

Оба метода имеют свои достоинства и недостатки - подход "сверху вниз" позволяет относительно легко и быстро построить карту протяженных областей генома, т.к. не требуется проводить значительную предварительную работу по подготовке экспериментального материала, но получаемая карта отличается низким разрешением. Кроме того, для построения карт требуется набор маркеров, перекрывающих

исследуемую область генома. Другими проблемами в создании, карт методом "сверху вниз" являются, например, неслучайное распределение рестриктных сайтов, метилирование и т.д. Отсутствие клонированной ДНК затрудняет подробный анализ исследуемого участка генома.

Подход "снизу вверх" позволяет получать очень детальные карты и, в качестве промежуточного продукта, упорядоченные библиотеки клонов, дающих прекрасную основу для дальнейших исследований. Этот подход не требует предварительного подбора маркеров, более того, их получают при реализации этого подхода, но требуется проведение предварительной работы по клонированию исследуемого участка генома и построения карты перекрывающихся клонов. К его недостаткам относятся принципиальная трудность построения полных карт, как из-за различий в клонируемости разных участков генома, так и из-за статистических проблем в получении полной представленности исследуемого участка. По этим причинам можно ожидать, что карта контигов человеческой хромосомы будет содержать от 200 до 1000 разрывов (gaps) [Kohara et al., 1987].

В настоящее время оба подхода создания физических карт комбинируют. В комбинированных картах данные рестриктного картирования и других методов прямого анализа неклонированной ДНК используются для определения взаимного расположения контигов. Построение "гибридных" карт, т.е. карт объединяющих свойства обоих типов физических карт, стало возможным благодаря появлению почти одновременно двух технологий: 1) PCR и как следствие создание STS-маркеров [Saiki et al.,1988; Olson et al., 1989]; 2) Клонирование больших фрагментов ДНК от 100 т.п.н. до 1000 т.п.н. в исскуственных хромосомах дрожжей - YAC [Burke et al.,1987], бактериях/бактериофагах - ВАС/РАС [Shepherd et al., 1994; Shizuya et al, 1992] и млекопитающих -MAC [Vos, 1997; Grimes and Cooke, 1998].

Эти методы позволили также связать генетическое картирование и физическое, превратив их в единую систему изучения генома (Рис. 1).

1.3. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ КАРТЫ.

Одним из основных направлений проекта "Геном Человека" является идентификация генов и определения местоположения экспрессирующихся последовательностей на физических и генетических картах, т.е. задача построения транскрипционных карт генома человека, а также секвенирование экспрессирующихся последовательностей хромосом и определение их функциональной роли.

Решение этой задачи сопряжено с определенными трудностями. Они обусловлены, в первую очередь, чрезвычайным многообразием самих экспрессирующихся последовательностей, обнаруживаемых в геноме человека, а потому и необходимостью применения значительного арсенала методических приемов, с помощью которых они могут быть выявлены среди множества других последовательностей тотальной геномной ДНК.

Экспериментальная задача сводится к тому, чтобы для данного локализованного участка геномной ДНК быстро и точно найти все кодирующие регионы. Для этой цели было разработано несколько методов клонирования и идентификации транскрибируемых последовательностей в геномной ДНК {для обзора см. [Hochgeschwender, 1992]}:

а) Поиск CpG островков, известных также под названием Нра2 tini fragments (HTF islands), которые часто локализованы в 5"-концевых областях генов и, следовательно, могут служить маркерами мест потенциального расположения генов [Larsen et al., 1992].

б) "Zoo" блот-гибридизация клонов геномной ДНК различных организмов. Межвидовые консервативные последовательности с большой вероятностью могут относиться к кодирующим [Wei et al, 1996].

в) Идентификация генов с помощью скрининга к ДНК библиотек. Фрагменты геномной ДНК, клонированные в YAC или космидах, можно пометить и использовать как пробы для скринировария Northern blots или кДНК библиотек [Polymeropoulos et al., 1992, Lennon andLehrach, 1991].

г) Скрининг упорядоченных геномных библиотек кДНК-клонами. Используя фрагменты геномной ДНК как мишень, выделяют гибридизующиеся кДНК из одной или нескольких кДНК библиотек и проводят последующее клонирование загибридизовавщихся кДНК вставок, и таким образом ведут прямую к ДНК селекцию. [Lovett, 1991, Lovett et al, 1994, Parimoo et al., 1991].

д) Различные варианты систем типа "exon-trapping" экспериментального метода идентификации экзонов в геномной ДНК. [Duyk, 1990; Buckler, 1991; Andreadis, 1993; Yaspo, 1993]. Основан на идентификации функциональных элементов необходимых для сплайсинга транскрибирующихся РНК и был разработан для предсказания наличия экзонов и выделения их из протяженных участков геномной ДНК. Принцип метода заключается в клонировании фрагмента геномной ДНК в вектор, содержащий один из сайтов, необходимых для осуществления сплайсинга. Для большинства эукариотических генов обнаруживается закономерность структуры ДНК внутри интрона на границе экзон - интрон, которую называют правилом GT-AG. Трансформация такого вектора в эукариотическую клетку обеспечивает транскрипцию исследуемого фрагмента ДНК и возможный сплайсинг РНК Сплайсинг происходит только в том случае, если клонированный в этот вектор геномный фрагмент содержит экзонную последовательность с сайтом сплайсинга комплементарным сайту сплайсинга вектора.

е) Методы, базирующиеся на создании кДНК библиотек из гетерогенно ядерной РНК (hnRNA). кДНК библиотека создается из несплайсированных ядерных РНК соматических клеточных гибридов, содержащих одну из хромосом человека. Стратегия метода основана на получении первой цепи кДНК с помощью праймеров комплементарных к сайтам сплайсинга, к поли-(ёА), к человек-специфичным Alu повторам и др. Специальные методы позволяют создавать высоко специфичные гякДНК библиотеки, представляющие преимущественно транскрипты человеческого компонента соматических гибридов [Corbo et al., 1990; Baens et al., 1993; Borodin et al., 1995]. кДНК соответствующие изучаемому району генома, идентифицируются гибридизацией с тотальной геномной ДНК, Northern blot и др. методами анализа.

ж) Использование гомологичной рекомбинации между фрагментом геномной ДНК и фрагментом из кДНК библиотеки. Метод особенно эффективен для определения в геномных фрагментах тех последовательностей, которые экспрессируются в данной ткани и позволяет получать их кДНК библиотеки [Brookes and Porteous, 1991; Kandral et al., 1994].

з) Вычислительные методы (эти методы не включают прямого клонирования транскрибирующихся последовательностей). При компьютерном анализе используются сиквенс тотальной геномной ДНК и кДНК последовательностей, которые можно сравнивать между собой. Анализ сиквенса тотальной геномной ДНК может идти также по консервативным последовательностям генома. Специальные программы разработаны и введены в INTERNET. В настоящее время существует большое количество различных компьютерных методов поиска генов. Например: методы, основанные на выявлении структурных отличий интронов от экзонов; поиска открытых рамок считывания, энхансеров, промоторов и т.д. {для обзора см. [Fickett, 1996]}.

Каждый из этих методов имеет как свои преимущества, так и недостатки. То, какой метод выделения экспрессирующихся последовательностей применяется в конкретной ситуации, зависит от конечной цели. Тем не менее, ни одним из методов в отдельности не удается построить полную законченную транскрипционную карту. Совместное использование различных методов взаимно компенсирует некоторые отдельные ограничения.

Наиболее активно используемой стратегией для решения задачи построения карты транскрибирующихся последовательностей является использование EST-маркеров.

2. МАРКЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ПОСТРОЕНИИ КАРТ.

В 1989 г. M.Olson, L.Hood, С.Cantor и D.Botstein предложили новый подход к созданию физических карт, основанный на PCR-амплификации фрагментов ДНК [Olson et al., 1989]. Суть этого подхода заключается в идентификации конкретной области генома при помощи коротких (200500 п.о.) уникальных (т.е. встречающихся только один раз в исследуемом геноме) последовательностей ДНК в качестве маркеров. Такие участки ДНК называют STS ("Sequence Tagged Site") маркерами.

STS-маркеры - это короткие фрагменты ДНК с известной последовательностью, определяемые двумя уникальными по нуклеотидной последовательности праймерами (~20 оснований) для проведения PCR, условиями специфической амплификации данного фрагмента из смеси геномной ДНК и установленным положением на карте генома.

STS - идеальные вехи при конструировании карт из-за легкости, с которой они могут быть определены PCR-анализом. Другим важнейшим преимуществом STS перед другими маркерами является то, что они

могут быть описаны в электронной базе данных в форме, делающей их экспериментально доступными в любой лаборатории: 1) последовательность пары праймеров, 2) длина PCR-продукта, 3) хромосомная локализация. При этом исследователю, который хочет воспользоваться ею, не нужен доступ к тому биологическому материалу, который использовался для получения этой информации. В противоположность этому, сложные физические карты, основанные на рестриктных сайтах, должны быть обеспечены коллекцией клонов, которые могут быть использованы для того, чтобы найти конкретные фрагменты картированной ДНК посредством ДНК-ДНК гибридизации, а исчерпывающие карты генома человека содержат десятки тысяч клонов, каждый из которых должен поддерживаться как отдельный штамм микроорганизмов. Технология STS значительно облегчает интегрирование данных о картировании, полученных из разных источников.

Однако, пробы, изолированные из геномной ДНК и отобранные на основании их одиночной представленности, необязательно попадут в области генома, представляющие непосредственный биологический интерес. С этой точки зрения интересны маркеры, включающие в себя кодирующие последовательности [Larsen et al., 1992, Brown et al., 1986, Lindsay et al., 1987, Bird et al., 1986].

Развитием концепции STS стало понятие EST ("Expressed Sequence Tag"), предложенное в 1991 г. M.Adams с соавт. [Adams et al., 1991] и A.Wilkox с соавт. [Wilkox et al., 1991]. Отличие EST от STS заключается в том, что в качестве маркера используется последовательность идентичная фрагменту кДНК.

2.1. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ STS И EST МАРКЕРОВ.

Различные типы клонированных последовательностей (гены; D-сегменты; кДНК; фрагменты ДНК, содержащие микросателлиты и др.), можно перевести в "язык" STS, при условии, что была определена его первичная структура, подобраны праймеры и условия для специфической амплификации данного фрагмента из смеси фрагментов геномной ДНК и было проведено картирование данного фрагмента, то есть, как минимум установлено его местоположение относительно других маркеров.

В настоящее время наиболее широкое распространение имеют два подхода к получению EST - секвенирование кДНК, получаемой с мРНК, и секвенирование кДНК, получаемой с гетерогенно-ядерной РНК, то есть несплайсированной РНК. Оба этих подхода имеют свои достоинства и недостатки. Очевидно, важным достоинством обоих подходов является получение транскрибируемых последовательностей генома. В случае мРНК получаемые фрагменты совпадают с кодирующей последовательностью, облегчая тем самым идентификацию генов, в случае гяРНК получаемые фрагменты совпадают с последовательностью геномной ДНК, делая возможным прямое картирование. При создании PCR-маркеров из кДНК иногда возникает проблема, т.к. в результате сплайсинга фрагменты, разделенные в геномной ДНК нитронами, могут оказаться в кДНК близкими друг к другу. И амплификация геномной ДНК, созданными праймерами, таким образом, может дать фрагмент гораздо большего размера, и этот фрагмент не всегда может быть успешно амппифицирован.

мРНК как источник EST.

Примером получения EST служит метод прямого секвенирования 3'-концевых участков кДНК, для которого необходима библиотека

клонированных последовательностей кДНК. Использование наиболее вариабельных для транскриптов одного семейства генов 3'-концевых последовательностей позволяет выполнить требование "уникальности" для создаваемых EST. Схема метода: используя векторный праймер, определяют первичную структуру 3' -конца произвольно выбранного клона библиотеки. На основании полученной последовательности синтезируют PCR-праймеры, которые затем используются для поиска потенциальных генов в геноме. На этом методе основана работа M.D. Adams с соавторами, которые одними из первых выдвинули концепцию EST [Adams et al., 1993]. В этой работе сообщается о секвенировании 3400 новых последовательностей из мозга человека. Для секвенирования использовались коммерчески доступные библиотеки из гиппокампуса двухлетнего ребенка и мозга 17-18 недельного эмбриона человека. Эти библиотеки не подвергались никакой нормализации или предварительному отбору клонов для секвенирования. По мнению авторов, это должно дать возможность получить картину распределения транскрипционной активности мозга на разных стадиях развития и в различных отделах мозга. Авторы отмечают, что использование библиотек кДНК, при синтезе которых использовались как oligo-dT, так и случайные праймеры, позволяет получать последовательности не только вариабельных З'-концевых фрагментов мРНК, но и более консервативных внутренних областей.

гяРНК как источник EST.

Другим подходом, как отмечалось, является использование гетерогенной ядерной РНК (гяРНК).

Для получения библиотек гякДНК используют обычно клетки соматических клеточных гибридов человек-грызун, в которых на фоне

генома мыши, китайского хомячка или крысы присутствуют одна или несколько хромосом человека [Fisher et al., 1994].

Одной из первых работ такого рода была работа Liu Р. с соавторами [Liu et al., 1993]. Для обогащения гякДНК экзонными последовательностями при синтезе кДНК авторы использовали праймеры, соответствовавшие 5-консенсусным последовательностям интронов человека (СТТАСС, СТСАСС, ССТАСС, СССАСС). Человек-специфические клоны выделяли путем скрининга полученной библиотеки с тотальной геномной ДНК человека. Очевидно, что такой способ получения библиотек чрезвычайно трудоемок.

Другая группа авторов [Corbo et al., 1990] предложили более эффективный метод получения человек-специфических библиотек из гибридных клеток, суть которого заключается в использовании человек-специфических праймеров для синтеза гякДНК. Авторы использовали праймеры, соответствующие консервативным областям /i/w-повторов человека. В качестве источника гяРНК использовали гибридные клетки человек-хомяк, содержавшие Xq24-qter район Х-хромосомы человека. Было проанализировано более 100 клонов гякДНК. 80 оказались человек-специфическими, 8 клонов содержали гякДНК хомяка, происхождение 12 клонов осталось не установленным. Несколько клонов было картировано на Xq24-qter. Таким образом, было продемонстрировано, что предложенный подход позволяет идентифицировать множество транскрипционно-активных локусов в заданном районе генома.

Последующие усовершенствования методики повысили специфичность получаемых гякДНК библиотек. Baens с соавторами [Baens et al., 1993] сконструировали ранжированную гякДНК библиотеку из гибридных клеток линии М28, содержащих короткое плечо человеческой хромосомы 12. Первая цепь к ДНК с гяРНК была синтезирована с помощью праймера, содержавшего случайный

гексануклеотид на З'-конце. Затем проводили специфическую PCR-амплификацию человеческих последовательностей с помощью Alu-специфических праймеров. Продукты PCR-амплификации были клонированы и полученные библиотеки ранжированы. По оценкам авторов число независимых клонов в библиотеках составляло около 550. Около 80% клонов происходили из плеча 12р хромосомы человека.

Бородин с соавторами [Borodin et al., 1995] сконструировали ранжированную гякДНК библиотеку из гибридных клеток, содержащих одну из человеческих хромосом - 19. Первая цепь кДНК с гяРНК была синтезирована с помощью праймера, комплементарного концевой части yl/м-повтора, и удлинена олиго^О) последовательностью с помощью терминальной дезоксинуклеотидтрансферазы. Полученные фрагменты были амплифицированы с использованием стратегии "сдвинутых праймеров" (nested PCR). Вторая пара праймеров содержала на концах сайты узнавания двух рестриктаз, что позволяло специфически клонировать гякДНК в соответствующий вектор. Благодаря применению двух раундов PCR и направленного клонирования продуктов второго раунда авторам удалось значительно повысить специфичность клонирования человек-специфичной гякДНК. По результатам различных анализов, включая FISH гибридизацию, человек-специфичность полученной библиотеки превышала 98%.

Последовательности этих человек-специфических библиотек гякДНК, полученные описанными выше способами, могут использоваться в качестве STS-маркеров хромосом, т.к. являются геномными последовательностями с интронами и экзонами, а также в качестве EST-маркеров, так как одновременно являются экспрессирующимися последовательностями.

Создание EST-маркеров является наиболее активно используемой стратегией для решения задачи построения карты транскрибирующихся последовательностей.

Кроме EST, для поиска генов, связанных с развитием многих заболеваний человека, а также изучения продуктов этих генов и их функционирования, часто удобно использовать гомологичные гены генетически более изученных организмов. Примером может служить гомология между AD3 гена болезни Альцгеймера и белком, кодируемым геномом нематоды C.elegans [Sherrington et al., 1995] и гомология между DPC4 геном, вовлеченным в панкреатическую карциному и геном Drosophila, участвующим в пути трансформации ростового фактора ß [Hahn et al., 1996]. Расшифровка структуры геномов дрожжей, нематоды, позвоночных (Zebrafish) положила начало сравнительной геномики и, в частности, систематическому поиску генов - гомологов человека [Schuler et al, 1996].

2.2. МЕТОДЫ КАРТИРОВАНИЯ STS/EST.

Существуют две принципиально различные группы методов картирования STS/EST. Одни из них основаны на анализе непосредственно геномной ДНК (методы построения макрорестриктных карт и методы гибридизации in situ). Другая группа методов основывается на анализе клонированной ДНК. Такой подход предполагает создание библиотек последовательностей геномной ДНК изучаемого организма в различного рода векторах: космидах, YAC и т.д., отличающихся размерами клонируемых последовательностей. Эта группа методов будет рассмотрена в п. 3.

Рестриктные карты.

Одними из первых маркеров, используемых для картирования генома, стали сайты узнавания рестриктаз. Принцип построения рестриктных карт был предложен D. Nathans [Nathans, 1979] для построения карты генома вируса SV40. Подход основывался на определении рестриктной карты как списка рестриктных сайтов, встречающихся в данной последовательности с указанием порядка их расположения и расстояний между ними.

Достоинством рестриктных карт является то, что информация, которая в них содержится, может быть использована непосредственно для клонирования интересующих фрагментов генома. Результаты же анализа этих фрагментов можно использовать для получения STS из данной области генома или для упорядочения ранее полученных маркеров.

Открытие редкощепящих рестриктаз [Qiang and Schildkraut, 1989, Nelson, 1990, Tautz et al., 1990] и изобретение метода электрофореза в пульсирующем поле [Schwartz and Cantor, 1984, Southern et al., 1987] значительно упростило получение карт.

Метод электрофореза в пульсирующем поле (PFGE, Pulsed Field Gel Electrophoresis) впервые был описан D.Schwartz с соавторами в 1982 г. Он позволяет проводить разделение фрагментов ДНК практически любого размера. Суть его заключается в том, что молекулы ДНК движутся в геле под воздействием периодически меняющегося по направлению электрического поля. Существуют и широко используются несколько модификаций этого метода. PFGE простой и достаточно надежный метод разделения молекул ДНК размером до 200-300 кб. На практике в агарозных гелях в настоящее время он позволяет разделять фрагменты ДНК размером до 10 Мб. Использование пульс-фореза в

сочетании с применением редкощепящих рестриктаз позволяет строить достаточно протяженные карты хромосомных областей. Интересные результаты были получены, например, D.Vetrie с соавторами [Vetrie et al., 1993а]. Они изучали локус XLA (X-linked agammoglobulinaemia) -наследственное заболевание, характеризующееся отсутствием В-лимфоцитов в крови человека. Ген, ответственный за это заболевание тесно сцеплен с маркером DXS178, который картирован в Xq22. В этом же районе находится ген, отвечающий за болезнь Фабри (Fabry), наследственное заболевание, вызываемое отсутствием а-галактозидазы A (GLA), одного из ферментов лизосом. С помощью пульс-фореза была построена рестриктная карта этого района, которая показала, что GLA и XLA находятся на расстоянии, не превышающем 140 kb, и что между ними находится несколько потенциальных CpG-островков, что указывает на возможное наличие экспресирующихся генов [Oeltjen et al., 1995; Parkar et al., 1994].

В последнее время рестриктное картирование само по себе применяется относительно редко, обычно оно используется в сочетании с клонированием протяженных участков геномной ДНК. Например, эта же группа сконструировала карту проксимальной части участка q22 X хромосомы протяженностью 5,2 Мб [Vetrie et al., 19936]. При этом на первом этапе авторы попытались установить порядок расположения 11 полиморфных и неполиморфных маркеров. В результате были получены 3 рестриктные карты вокруг групп физически сцепленных маркеров, охватывающих около 5 Мб геномной ДНК. Затем YAC клоны из этого района были использованы для объединения полученных карт в одну, размером около 5,2 Мб.

Другим примером такой работы может служить работа C.Wijmenga с соавторами [Wijmenga et al., 1993]. Авторы изучали район 4-ой

хромосомы, содержащий ген FSHD (facioscapulohumeral muscular dystrophy). FSHD является аутосомным доминантным геном, определяющим нервно-мышечное расстройство. Интересно то, что болезнь часто вызывается мутациями, возникающими de novo у больных. Ранее в данном районе было откартировано 4 локуса (D4S163, D4S139, D4F35S1, D4F104S1). По данным генетического картирования район, где были локализованы эти маркеры, занимал около 5 сМ. Физическое картирование с помощью пульс-фореза показало, что общий размер этих локусов около 1 Мб. Для нескольких из этих локусов были получены STS и с их помощью были идентифицированы 4 YAC клона, которые подтвердили данные картирования с помощью пульс-фореза.

FISH-гибридизация.

Другим важным достижением в физическом картировании является FISH-гибридизация (флуоресцентная гибридизация in situ). Гибридизация ДНК-зондов с ДНК лизированных метафазных клеток, содержащих конденсированные хромосомы человека, позволяет локализовать исследуемую пробу на одной из хромосом. Флуоресцентное дифференциальное мечение нескольких ДНК-зондов позволяет визуально определить при помощи светового микроскопа места на деконденсированной хромосоме, с которым связывается зонд. Эта методика является улучшением предыдущих методов гибридизации in situ [Gall et al., 1969], которые зависели от радиоактивно-меченных проб и авторадиографической детекции. Метод FISH-гибридизации позволяет упорядочить и ориентировать контиги на хромосоме [Brandriff et al., 1994].

Развитие метода FISH-гибридизация внесло существенный вклад в крупно-масштабное физическое картирование, т.к. позволило картировать индивидуальные клоны до того, как построение контига

будет завершено. Метод FISH-гибридизация позволяет упорядочить и ориентировать контиги на хромосоме даже в том случае, если существуют случайные разрывы, что случается при составлении карты контигов при отсутствии того или иного участка в коллекции клонов.

3. ГЕНОМНЫЕ КЛОНОТЕКИ. ПОСТРОЕНИЕ КОНТИГОВ.

При создании физических карт важной задачей продолжает быть получение специфических клонотек фрагментов генома - отдельных хромосом, их частей или даже отдельных локусов.

Источником ДНК для создания хромосом-специфических клонотек служат обычно клетки соматических клеточных гибридов, в которых на фоне генома мыши или крысы присутствуют одна или несколько хромосом человека [Fisher et al., 1994]. ДНК хромосом из клеточной линии либо подвергается сразу же процедуре клонирования, а затем отбираются клоны, содержащие ДНК человека, путем гибридизации с суммарной человеческой ДНК; либо после выделения хромосом из гибридных клеток их пропускают через хромосомный сортер и отбирают фракцию со специфической хромосомой, на основе которой затем и создается клонотека.

3.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМОСОМНОЙ МИКРОДИССЕКЦИИ.

Для получения геномных библиотек отдельных областей генома широко используются также фрагменты, полученные методом микродиссекции. Этот метод был предложен в 1981 г. F.Scalenghe с соавторами [Scalenghe et al., 1981] для картирования специфических последовательностей политенных хромосом Drosofila melanogaster. Суть метода заключается в том, что из метафазных хромосом под микроскопом вырезают интересующий участок, который затем

клонируют, получая специфическую для данного района библиотеку. Такой подход использовали в 1984 г. D.Rohme с соавторами [Rohme et al., 1984] для получения проб определенного участка генома млекопитающих, а именно t-комплекса мышей, и в 1985 г. E.Fisher с соавторами для получения проб из проксимального района Х-хромосомы мышей [Fisher et al., 1985]. В 1986 г. G.Bates [Bates et al., 1986] применил его для исследования фрагментов генома человека. Полученная библиотека содержала последовательности дистальной части короткого плеча хромосомы 2 человека в векторе XgtlO. 41% из 257 потенциальных рекомбинантов содержали человек-специфические вставки. Все уникальные последовательности из этой библиотеки были картированы на коротком плече хромосомы 2, подтверждая таким образом, специфичность полученной библиотеки. Примером массированного использования метода микродиссекции может служить работа L.Davies с соавторами [Davies et al., 1990]. Была сконструирована геномная библиотека, состоящая из 20000 клонов, обогащенная последовательностями из района р13 хромосомы И человека. По оценкам авторов библиотека состоит из последовательностей ДНК, происходящих из района протяженностью около 13 Мб со средней плотностью около 1 клона на 37000 пар оснований.

Важным усовершенствованием метода микродиссекции, которое стало возможным после изобретения PCR, было использование в качестве зонда амплифицированных продуктов микродиссекции для скрининга геномных библиотек. Впервые этот подход был использован в 1991 г. M.Djabali с соавторами [Djabali et al., 1991]. Они применили амплификацию материала, полученного при помощи микродиссекции района Х-хромосомы, вовлеченного в синдром умственной недостаточности, связанного с феноменом "хрупкого" сайта. Амплифицированный материал был использован для клонирования, а

также в качестве зонда для скрининга ранжированной космидной библиотеки геномной ДНК. Результаты картирования 8 клонов на панели гибридных клеток показали, что они происходят из узкого района вокруг "хрупкого" сайта.

Использование метода микродиссекции позволило получить маркеры, сыгравшие важную роль в исследовании группы наследственных болезней: лейкемий [Cotter et al., 1991], нейрофиброматоза-2 [Fiedler et al., 1991], синдрома Лангера-Гидеона (Langer-Giedion syndrome) [Ludecke et al., 1991], района APC (adenomatous polyposis coli) [Hampton et al., 1991], синдрома Беквита-Видеманна (Beckwith-Wiedemann syndrome) [Puech et al., 1992] и др.

Отдельные фрагменты геномной ДНК - клоны геномных библиотек, полученных одним из упомянутых методов, - необходимо упорядочить, собрать в контиги и построить, таким образом, физическую карту изучаемого района генома. Этот этап работы отличается значительной трудоемкостью, но после успешного завершения позволяет очень быстро проводить картирование любых типов молекулярно-генетических маркеров.

3.2. КЛОНОТЕКИ ГЕНОМА НА ОСНОВЕ YAC.

Многие созданные к настоящему времени физические карты индивидуальных хромосом или целых геномов содержат YAC клоны [Cohen et al., 1992, Foote et al., 1992]. Такой подход к картированию был выбран в надежде, что он станет промежуточным этапом на пути от длинных участков геномов к индивидуальным бактериальным клонам [Olson and Green, 1993].

Ранние попытки сконструировать карты хромосом человека, на основе космидных клонов, давали относительно малые контиги, разделенные разрывами [Stallings et al., 1990, Tynan et al., 1992]. Введение

искусственных дрожжевых хромосом (YAC) в качестве системы клонирования впервые описано в 1987 году [Burke et al., 1987]. YAC позволяют клонировать большие фрагменты ДНК в виде линейных искусственных хромосом в дрожжи Saccharomyces cerevisae. Даже некоторые из ранних клонов YAC были в 10 раз больше по размеру, чем самые большие из прежде создававшихся клонов.

Основу YAC представляет челночный плазмидный вектор на основе pBR322, имеющий в своем составе все элементы дрожжевой хромосомы: центромеру, две теломерных последовательности, автономно-реплицирующуюся последовательность и два маркерных гена. Векторы такого типа способны нести от 100 kb до 1000 kb чужеродной ДНК. YAC клоны со вставкой около 1000 kb позволяют клонировать целиком практически любой ген человека [Green and Olson, 1990]. Таким образом, для получения представительной библиотеки всего генома человека достаточно 50.000 YAC клонов среднего размера [Bellanne-Chantelot et al, 1992].

После создания YAC клонотек обнаружилась высокая частота химеризма в них (до 50%) [Cohen et al., 1993], т.е. в этих клонотеках почти половина клонов содержит несмежные геномные фрагменты, ко-лигированные при создании клонотек. Другая проблема - это существование в геноме человека большого количества гомологичных последовательностей (повторов различных типов), которые при клонировании в клетках дрожжей могут вызывать нестабильность в структуре YAC, а некоторые даже невозможно проклонировать в YAC [Bellanne-Chantelot et al, 1992; Couch et al., 1995]. Как следствие этого YAC часто содержат делеции и перестановки [Bates et al, 1992; Selleri et al.,1994].

Создание и, главное, анализ клонотек геномов такой сложности требует огромных затрат энергии и времени. Поэтому, в настоящий момент, ученые стремятся пользоваться едиными эталонными клонотеками. Так на основе pYAC4 вектора с сайтом клонирования EcoRI было создано, по меньшей мере, 6 клонотек генома человека, в настоящее время доступны для мирового сообщества. Названия клонотеки получили от мест, где они были сконструированы [Genome digest, v.l, Nol, 1993]:

Библиотека Средний размер вставки Частота ко-лигирования Число клонов ссылка

StXouis 275 kb 40-50% 60.000 Brownstein et al., 1989

ICI 350 kb -10% 35.000 Anand et al., 1989

ICRF 600 kb -25% 16.000 Larin et al., 1991

СЕРН-1 440 kb 30-40% 52.992 Albertsen et al., 1990

СЕРН-2 540 kb 30-40% 17.664 Не опубликована

СЕРН-3 (MegaYAC) 918 kb 30-40% 23.808 Chumakov et al., 1992

Картирование больших регионов вплоть до целых хромосом требует упорядочивания серии перекрывающихся YAC клонов [Giumakov et al., 1992; Nizetic et al., 1994]. YAC клонотеки могут быть скринированы PCR и/или гибридизацией. После выявления всех YAC клонов по выбранным маркерам производится "шагание" и/или создание контига в интересующей зоне хромосом. Для этого используют несколько методов:

а) Alu-PCR - используя праймеры на консервативные части Alu-повтора проводят PCR между двумя Alu расположенными в пределах 1 т.п.н. со всеми YAC-клонами и их дальнейшую перекрестную гибридизацию [Nelson et al, 1989];

б) использование концевых фрагментов YAC - проводят аналогично методу "шагания по хромосоме" используя в качестве

зонда PCR-продукты концевых фрагментов YAC. Для изолирования концевых фрагментов YAC используют PCR методы: IPCR [Ochman et al, 1988; Silverman et al, 1989], Vectorette PCR [Riley et al, 1990], ^/м-вектор PCR [Little et al, 1992];

в) фингерпринтинг - ДНК YAC гидролизуют по нескольким рестриктазам и проводят блот-гибридизацию клонов с человек-специфичными средне-повторяющимися последовательностями типа LI, THE [Bellanne-Chantelot et al, 1992].

г) использование YAC молекулы целиком в качестве зонда для гибридизации на метафазные хромосомы [Holland et al., 1993; Huang et al.,1994].

д) упорядочивание YAC на основе содержания тех или иных маркеров - например определение STS-содержания YAC клонов [Green and Olson, 1990]. В 1992 года были опубликованы полные физические карты, сконструированы посредством картирования по содержанию STS, YAC-контигов 21-ой [Chumakov et al., 1992] и Y [Foote et al., 1992] хромосом человека.

Основываясь на том, что каждый из методов имеет как свои преимущества, так и свои недостатки, основоположники клонотеки СЕРН предложили для картирования генома человека использовать стратегию, включающую в себя три подхода: 1) фингерпринтинг (с зондами LI и THE), 2) перекрестную гибридизацию продуктов ^4/w-PCR полученных от каждого YAC клона и 3) STS картирование. На основании этой стратегии была создана "карта человеческого генома первого поколения" [Cohen et al., 1993]. Авторы использовали библиотеку из 33.000 YAC со средним размером вставки около -900 kb, содержащую около 9 геномных эквивалентов. 2.100 полиморфных генетически картированных STS были использованы для скрининга библиотеки. В

результате скрининга было установлено, что 1.068 STS содержатся в среднем в 5,52 YAC, а 714 - в 2,05. Таким образом, всего картированные STS содержались в 20% клонов библиотеки. Для 25.000 YAC были получены продукты PCR-амплификации ДНК, находящейся между Alu-повторами (Alu-PCR). Продукты амплификации были нанесены на фильтры высокой плотности вместе с продуктами Л/м-PCR геномной ДНК гибридных клеток, содержащих только одну из человеческих хромосом. Полученные фильтры гибридизовали с продуктами Alu-VCR 5.332 YAC клонов. Таким образом, было картировано около 4400 YAC клонов библиотеки. Около 500 YAC были картированы на метафазных хромосомах с помощью FISH-гибридизации. Таким образом, 20-30% генома человека было покрыто упорядоченными YAC клонами и представлена многоуровневая физическая карта.

Наличие данных картирования YAC клонов, полученных различными методами, позволяет в принципе проводить перекрестную проверку результатов перекрытия клонов и, таким образом, выявлять и отбрасывать ложные контиги [Gardiner et al., 1995, Gemmill et al., 1995].

3.3. КОСМИДНЫЕ КЛОНОТЕКИ ГЕНОМА.

Космиды - бактериальные векторы, созданные на основе плазмид путем генно-инженерной добавки к последним cos-области фага лямбда, ответственной за упаковку ДНК в фаговые частицы. Любая молекула ДНК, содержащая этот регион и имеющая размер до 50 kb, может быть упакована в фаговую частицу и таким образом введена в E.coli [Bellet et al., 1971; Weil et al., 1975]. Космиды, пригодные для создания клонотек генома человека, сконструированы, в основном, либо на ColEl-подобном репликоне, либо на основе фага лямбда. Наиболее известны космиды серии Cos-ColEl репликон [Evans and Rothenberg, 1989] и серии Loric-репликон фага лямбда [Gibson et al., 1987].

Центры по исследованию генома человека, такие как ICRF, LANL, LLNL, создали хромосом-специфические космидные клонотеки практически для каждой из хромосом человека, которые доступны в настоящее время и используются во многих лабораториях мира [Nizetic et al., 1991; Nizetic et al., 1993; Lamerdin and Carrano, 1993; Fisher et al., 1994; Ashworth et al., 1995]. Эти клонотеки, наряду с YAC клонотеками, созданными в подобных центрах, являются своеобразными рабочими эталонами.

После получения подвыборки космидных клонов, соответствующих YAC клонам начинают построение космидного контига. Принципы большинства методов анализа, которые описаны выше для YAC клонов, исходно были предложены для космид и отработанны на них.

Одним из основных методов построения космидного контига является фингерпринтинг, имеющий ряд модификаций у разных авторов [Stalling et al., 1990; Bellanne-Chantelot et al., 1991].

Существуют также методы, позволяющие проводить "прогулку по хромосоме" от какой-либо стартовой точки. Для этого могут использоваться как целые космиды, так и их концевые фрагменты. Этот метод стал особенно удобен, когда были созданы космидные векторы, в которых к сайту клонирования с двух сторон примыкают последовательности промоторов РНК-полимераз бактериофагов SP6, ТЗ, Т7 [Evans et al., 1989; Cross and Little, 1986] и, таким образом, стало возможным "шагание" с помощью рибозондов [Huang et al., 1994; Fisher etal., 1994].

Очевидно, что необходимо сочетание информации, получаемой при картировании как YAC клонов, так и бактериальных векторных систем. Это может быть достигнуто либо параллельным картированием вставок различных векторных систем, или же последовательно: сначала

построение полноразмерной физической карты на основе YAC клонов, а затем, используя ее, - физической карты на основе бактериальных клонов. Такой тип картирования способствует быстрому анализу регионов, содержащих мутации биологического и медицинского интересов, и позволяет искать гены, локализованные в них.

На сегодняшний день существуют два основных метода перехода от YAC клонов к космидам - это гибридизация ДНК YAC, в качестве зонда, с космидной клонотекой генома/хромосомы [Baxendale et al., 1991; Holland et al., 1993; Huang et al., 1994; Fisher et al., 1994]; или создание космидной выборки, путем субклонирования ДНК YAC клона [Bellanne-Chantelot et al., 1991]. Космиды можно выявлять также напрямую гибридизацией или PCR, где в качестве зондов выступают любые маркеры, локализованные в интересующем исследователя районе хромосомы.

Карты, основанные на YAC, при всей своей ценности, имеют значительно более низкое разрешение, чем карты, созданные на основании бактериальных систем, например, космид, и не дают непосредственно субстратов для детального анализа и сиквенса. В исследованиях по геному человека исторически сложилось, что наиболее распространенными бактериальными системами клонирования стали космиды. Позже были созданы новые векторы на основе бактериофага PI и F фактора E.coli (в которых клонируются фрагменты в 3-5 раз большего размера, чем в космидах) и появились соответствующие клонотеки [Shepherd et al., 1994; Shizuya et al, 1992]. Поэтому, для крупномасштабного тотального секвенирования генома человека, проводимого в рамках программы "Геном Человека", используют космиды, ВАС или РАС.

Секвенирование проводят по так называемой "шотган"-технологии. Этот способ предполагает секвенирование большого числа случайно выбираемых клонов и построение непрерывных последовательностей на основе компьютерной идентификации перекрывающихся фрагментов. В первую очередь секвенируют клоны больших хорошо построенных контигов, с точной локализацией на хромосоме. К январю 1998 года, таким способом было отсеквенировано 110 Mb или 3,3% генома человека [Bentley D.R., 1998].

Для построения контигов и изучения генома важен прямой доступ к клонированной последовательности, соответствующей нативной структуре изучаемой области генома. Склонность YAC к перестановкам различного типа и их химеризм, неклонируемость некоторых областей генома человека в таких векторах, - все это делает необходимость переходить от YAC клонов к другим системам.

3.3. РАДИАЦИОННО - ГИБРИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ.

Радиационно-гибридное картирование, заключается во фрагментации хромосом в культуре клеток высокими дозами рентгеновских лучей, включении полученных фрагментов в стабильные клеточные линии и статистическом анализе распределения маркеров в больших коллекциях таких линий. Каждый независимый гибридный клон содержит 15-20% человеческого генома, т.е. фрагменты хромосом размером 8-10 Mb [Сох, 1995а]. Разрешение радиационно-гибридных карт зависит от дозы рентгеновских лучей и определяется целями картирования. Радиационно-гибридные карты строят на основании статистического измерения расстояния между двумя маркерами. Близко расположенные маркеры имеют большую вероятность встречаться вместе в одной и той же клеточной линии, чем пары маркеров, расположенные на разных хромосомах или далеко друг от друга на одной

хромосоме [Cox et al., 1990, Naylor et al, 1996]. Появление радиационно-гибридных карт позволило картировать теломерные и центромерные области, клонирование которых затруднено из-за большого количества повторов, присутствующих в них.

Созданы и анализируются несколько таких панелей радиационных гибридов. Наиболее известные из них - это:

G3 RH панель, полученная Stanford Human Genome Center (SHGC), состоящая из 83 радиационных гибридов, каждый клон которой содержит около 18% человеческого генома, со средним размером 4 Mb [Сох, 19956].

И Genebridge4RH панель, полученная Goodfellow с сотрудниками, состоящая из 93 радиационных гибридов, каждый клон которой содержит около 32% человеческого генома, со средним размером 10 Mb [Gyapay et al., 1996].

При использовании этих двух панелей радиационных гибридов (покрывающих 100% генома человека) и YAC библиотек, полученной СЕРН (покрывающих 95% генома человека), в 1996 году было завершено построение STS/EST-основанной карты человеческого генома [Schüler et al, 1996]. Использование для картирования различных ресурсов минимизирует влияние артефактов и повышает точность и надежность картирования. Таким образом, было картировано около 30.000 STS, из которых 20.104 являются EST [Schuler et al, 1996].

J* ф ф чЬ

«т« «те л« »J»

Образец построения интегральной карты хромосом человека, можно рассмотреть на примере одной из наиболее изученных хромосом -хромосомы 19 человека.

3.5. КАРТА 19-ОЙ ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА.

При длине в 60 Mb человеческая хромосома 19 составляет около 2% генома и имеет сравнительно высокое GC-содержание [Mayall et al., 1984, Larsen et al., 1992]. Хромосома очень хорошо генетически охарактеризована, к настоящему моменту на хромосоме найдено свыше 250 генов и свыше 130 экспрессируемых кДНК. Она содержит множество генов, представляющих интерес для исследований: гены ДНК-репарации [Lamerdin et al., 1995, Martin-Gallardo et al., 1992, Weber et al., 1990], гены ксенобиотического метаболизма, такие, как семейства цитохромных Р-450 генов [Hoffman et al., 1995], гены заболеваний, как миотоническая дистрофия [Aslanidis et al., 1992], семейная мигрень [Joutel et al., 1993], семейная болезнь Апьцгеймера [Strittmatter et al, 1995], а также ряд семейств генов.

Создание физической карты хромосомы 19 включало фингерпринтинг хромосом-специфичных космид, создание космидных контигов, упорядочивание контигов и заполнение промежутков, оставшихся между контигами. Метрическая карта состоит из "островов" контигов, а также больших клонов, расположенных в порядке от р-теломеры к q-теломере, причем размер "островов" и промежутков между ними известен. Метрическая шкала в kb приведена на основании оценок расстояний между космидами при помощи FISH-анализа [Brandiff et al., 1991], и отличает данную карту от карт, основанных только на STS и не

имеющих метрических размеров по всей длине. В карту включены биологически важные элементы - гены, полиморфные маркеры, STS, EST, и прочие маркеры. Кроме того, созданы рестриктные карты космид и других бактериальных клонов, покрывающие 41 Mb или почти 90% хромосомы.

Пятьдесят один "остров" из космид, YAC, ВАС, РАС, PI клонов включены в метрическую физическую карту хромосомы 19. Эти фрагменты покрывают около 46 Mb или 92% эухроматиновой ДНК хромосомы. Размер описываемых "островов" лежит в пределах от 40 kb до 17 Mb, средний размер составляет примерно 900 kb. Известен порядок расположения "островов" по отношению друг к другу, а также расстояние между "островами". Кроме того, известна ориентация 18 наибольших "островов", что соответствует 40 Mb (87%) клонального покрытия.

33 Mb контигов, включенных в метрическую карту, состоят исключительно из бактериальных клонов, для которых также известны порядок и расстояние. Это примерно 65% эухроматиновой ДНК хромосомы 19. Дополнительно 2.8 Mb (5%) контигов локализованы, но порядок для них окончательно еще не установлен. Сюда входят контиги, картированные на основании гибридизации фрагментов YAC, полученных в результате PCR с праймерами, специфичными к Alu-повторам, с космидными фильтрами. Еще 2.8 Mb были кластеризованы с применением FISH, но к настоящему времени не картированы. Включение всех этих данных позволит довести космидное клональное покрытие хромосомы до 70%.

49 Mb космидных контигов метрической карты были подвергнуты рестриктному картированию с использованием EcoRI и, в гораздо меньшей степени, Bglll [Lamerdin and Carrano, 1993]. Средний размер

рестриктной карты составляет 125 kb, причем 66 рестриктных карт длиннее 200 kb. Для таких рестриктных карт средний размер составляет 385 kb. Четыре из рестриктных карт имеют размер более 1 Mb. В среднем, каждый ЕсоУ^/-фрагмент представлен в 4.2 космидах.

Карта FISH высокого разрешения была создана как для р-плеча, так и для q-плеча и является интегральной частью метрической карты хромосомы [Brandiff et al., 1994, Gordon et al., 1996]. Карта расстояний, измеренных при помощи FISH, состоит из 216 космид со средним расстоянием между ними 230 kb. Дополнительно 57 космид были картированы по отношению к 216 реперным космидным клонам, но расстояние до них пока неизвестно. Космиды с известной локализацией и расстояниями между ними обеспечили сетку, на которой и заякорены 51 "остров" контигов. Порядок, ориентация и расстояния были оценены на основании FISH-карты.

Более 185 генов и кДНК, 168 полиморфных маркеров, 262 STS были локализованы в космидах и нанесены на карту, составив в сумме свыше 450 маркеров. Таким образом, среднее расстояние между двумя маркерами составляет около 110 kb. В этот список не включены гены из семейств - гены семейства KRAB [Bellefroid et al., 1993], НС-2 [Hromas et al., 1991], пробы из семейства обонятельных рецепторов и еще 14 известных, но точно не локализованных генов.

Постоянно обновляемая интерактивная база данных, описывающая современное состояние интегральной карты хромосомы 19, доступна через интернет по адресу: http://www-bio.llnl.gov/genome/html/ chrommap .html.

sL» »Ь ф «Ь

^ Ф ^

При идентификации и картировании функциональных элементов генома, внимание исследователей все больше привлекают не только собственно кодирующие последовательности, но и фрагменты ДНК, определяющие активность экспрессии генов, структурные ДНК-белковые взаимодействия, эволюционную консервативность или вариабельность и т.д. К таким регуляторным последовательностям генома относятся например, многочисленные ретроэлементы.

В геноме позвоночных существует большое количество различных семейств и типов ретроэлементов, способных играть важную роль в эволюции [Baltimore, 1985]. Их активные перемещения по геному и разнообразные воздействия на клетки являются одними из основных источников изменчивости генома. Без участия ретроэлементов и кодируемых ими ферментов темпы эволюции животного мира могли бы значительно замедлиться. Роль ретровирусов и других кодирующих обратную транскриптазу (RT) последовательностей является ключевой в эволюции других ретроэлементов, таких как псевдогены, короткие диспергированные повторы, ^/м-повторы и т.д. Согласно этому, другие ретроэлементы либо являются продуктами обратной транскрипции, т.е. ДНК-копиями (кДНК) клеточных РНК-транскриптов, либо бывшими ретровирусами, давно внедрившимися в геном позвоночных [Wilkinson et al., 1994; Larsson et al., 1989; Leib-Mosch et al., 1990] и потерявшими в ходе рекомбинаций и замен часть своих генов [Lower et al., 1996].

4. ЭНДОГЕННЫЕ РЕТРОВИРУСЫ В СОСТАВЕ ГЕНОМА

Эндогенные ретровирусы человека (HERVs - human endogenous retroviruses), представляют собой особый класс ретроэлементов. Они ведут свое происхождение от экзогенных ретровирусов, в частности вирусов, сходных с вирусом рака молочной железы мышей (MMTV-mouse mammary tumor virus). Впервые наличие в геноме человека ретровирусов было показано гибридизацией с радиоактивными ДНК-зондами некоторых экзогенных ретровирусов ряда животных.

Эндогенные ретровирусы и их фрагменты представлены в геноме высших приматов десятками тысяч копий, при этом число представителей различных классов HERVs сильно различается (Табл. 1, 2), составляя в целом приблизительно 0,6-1% [Leib-Mosch et al., 1993] всего наследственного материала. Кроме полноразмерных элементов для ряда классов HERV обнаружено большое число одиночных длинных концевых повторов (LTR), являющихся скорее всего продуктами рекомбинации целого провируса, содержащего два длинных концевых повтора в своем составе. Число LTR может значительно превышать количество полноразмерных HERV (Табл. 1). Естественно, что столь значительный объем вирусной генетической информации в геноме может оказывать существенное влияние на функционирование организма.

По широко распространенной на сегодня точке зрения ретровирусы инфицировали геном неоднократно. В пользу этого говорит наличие их в геноме как беспозвоночных, так и высокоразвитых позвоночных животных [Leib-Mosch et al., 1990]. Ретровирусы внедрялись в геном приматов от 10 до примерно 60 млн. лет назад, путем инфицирования экзогенными ретровирусами и с того времени существуют как стабильно интегрированные, вертикально наследуемые провирусы [Lower et al., 1996].

Таблица 1.

Характеристики ретроэлементов [Lower, Lower, and Kurth, 1996].

Геномная структура Название элемента Примеры Число копий на гаплоидн. геном

ретроэлемент без ЫТ с клеточным промотором Ретроген (псевдоген) фосфоглицераткиназа человека 1-10

ретроэлемент без 11Т с внутренним промотором SINE (Short interspersed element) Alu SINE-R 103-106 103

ретроэлемент с К.Т и внутренним промотором Ретропозон LINE 1 (Long interspersed element) 104-105

ретроэлемент с КГ и Ш Ретротранспозон Tyl у дрожжей, HERV-H со структурой ретропозона 102-104

ретроэлемент с ИЛ\ ЬТЯ и епу Эндогенный ретровирус HERV-H, HERV-R, ERV-9,HTDV/HERV-K 1-Ю2

Т ГГГ> Одиночный длинный концевой повтор (LTR) HTDV/HERV-K 10-Ю4

4.1. СТРУКТУРА ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ И ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ.

Структура эндогенных ретровирусов (Рис. 2) мало отличается от классической структуры экзогенных ретровирусов человека. Так, в их структуру входят гены gag, pro, pol и env, окруженные с обеих сторон длинными концевыми повторами (LTRs), служащими промоторными и энхансерными элементами ретровирусов. 5'-концевой LTR используется как промотор, а 3'-концевой - как сайт полиаденилирования.

LTR

LTR

из R U5 I gag pro pol env

U3 R U5

INT SU РНКаза H

Рис. 2. Структура интегрированного в геном ретровируса. J - праймер связывающий сайт ; fj - полипуриновый тракт ; [j-сигнал у паковки > 5'-3' - направление ;

RT - обратная транскриптаза.; NC - нуклеокапсидный белок; PR - протеаза; INT - интеграза; ТМ - трансмембранный белок; МА- белок матрикса; СА- белок капсида; SU - белок оболочки. U3,R,U5 - функциональные зоны длинного концевого повтора эндогенного peTpoBHpyca(LTR).

LTR ретровирусов варьируют по длине от 415 до 1800 пар оснований (п.о.) для разных семейств HERV [Patience et al., 1997]. На Рис. 3 представлено строение LTR семейства HERV-K. Указаны точка начала транскрипции, консенсусные последовательности энхансера, участок связывания рецептора глюкокортикоидного гормона (HRE) и сайт терминации транскрипции.

На различиях в строении ретровирусов строятся различные классификации эндогенных ретровирусов человека. Одна из самых распространенных основывается на типе молекул тРНК, служащих затравкой (праймером) для обратной транкриптазы. Согласно этой классификации, семейства эндогенных ретровирусов человека обозначаются как HERV-R (аргининовая тРНК), HERV-E (глутаминовая тРНК), HERV-K (CUU-HTDV; UUU-C4: антикодоны лизиновой тРНК; далее HERV-K - обозначение для подсемейства CUU с прототипом HERV-K10) и т.д. Представители различных семейств по-разному распространены в геноме (Табл. 2). Кроме того, существует классификация эндогенных провирусов по типу экзогенного аналога [Callahan et al., 1982], по которой HERV подразделяют на B-тип и С-тип.

4.2. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ РЕТРОВИРУСОВ.

При изучении функциональной активности различных типов провирусов, было обнаружено, что их транскрипты присутствуют в различных мРНК и тотальной РНК.

На пример, ряд HERV-E LTR и епу-содержащих близких к полноразмерным или же субгеномных мРНК экспрессируются в нормальной плаценте и клетках карциномы молочной железы, кишечника и рака легких [Rabson et al., 1985; Tomita et al., 1990]. Отмечено наличие транскриптов, соответствующих HERV-R провирусу, в плаценте [Cohen et al., 1985].

5*

Направление транскрипции.

Ui

о

3'

HRE Энхансер Промотор Сигнал полиаденилирования

Рис. 3. Строение LTR семейства HERV-K(CUU). Указана точка начала транскрипции, консенсусные последовательности энхансера, участка связывания рецептора глюкокортикоидного гормона (HRE - hormon response element) и сайта терминации транскрипции.

Таблица 2.

Краткая сравнительная характеристика некоторых основных семейств эндогенных ретровирусов человека. [Lower, Lower, and Kurth, 1996].

Семейство Число копий на гаплоидн ый геном Характеристика генома. Клетки и ткани, интенсивно экспрессирующие мРНК Экспрессия белков.

HERV-E 30-50 Дефектный провирус и В плаценте, стволовых клетках кроветворения, при раке молочной железы, мозге, опухолевых клеточных линиях. Не зарегистрирована.

HERV-R 1 Дефектный провирус, есть нормальный ген ет>. Очень хорошо в плаценте (доли процента от всей синтезируемой РНК), низкий уровень в нормальной ткани. Эмбриональные ткани. ENV

HERV-I 3-25 Дефектный провирус Нет данных Не зарегистрирована

HERV-H и LTR 1000-10000 Транспозон и/или LTR В плаценте, опухолевых клеточных линиях, тератокарциноме. Не зарегистрирована

HERV-H 50-100 Дефектный провирус В тератокарциноме. Не зарегистрирована

ERV-9 LTRs 30-50 4000 Дефектный провирус Одиночные В тератокарциноме, плаценте. Не зарегистрирована

HERV-P 10-20 Провирус Нет данных Нет данных

HTDV/ HERV-K 30-50 Дефектный провирус (?), все гены представлены Высокий в тератокарциноме, солидных опухолях, низкий в плаценте и нормальных тканях. Высокий GAG, cORF, PRO, POL, ENV

HERV-K(C4) 30-50 Дефектный провирус Нет данных He тестирован

Для ERV9 было показано наличие соответствующих геномных транскриптов в ряде клеточных линий [La Mantia et al., 1991]. Было показано, что LTR ERV9 является активным промотром-энхансером как in vitro, так и in vivo, и обнаружен ряд LTR-содержащих транскриптов [La Mantia et al., 1991; Di Cristofano et al., 1995].

Представители HERV-H семейства эндогенных ретровирусов человека транскрипционно активны в ряде клеточных линий, как нормальных, так и трансформированных, отмечено также наличие гибридных транскриптов, состоящих из фрагментов генома HERV-H и не родственных им клеточных последовательностей [Lower et al., 1993; Wilkinson et al., 1990].

Эндогенные ретровирусы и даже в большей степени их длинные концевые повторы (поскольку они присутствуют в значительно большем количестве в геноме человека) представляют массив потенциально функционально-активных промоторных последовательностей, которые могли бы воздействовать на профиль экспрессии клеточных генов.

Поскольку в составе ретровирусных длинных концевых повторов как правило находится сайт полиаденилирования, играющий непосредственную роль в жизненном цикле вируса, было бы естественно ожидать что диспергированные по геному длинные концевые повторы эндогенных ретровирусов в ряде случаев стали бы функционирующими сайтами полиаденилирования клеточных генов.

Трактовка взаимодействий HERVs с геномом в целом довольно затруднительна, так как они оказываются подчас в зависимости от клеточных промоторов, или других мобильных элементов генома, т.е. на регуляцию их экспрессии главенствующее влияние оказывает внешний промоторно-энхансерный комплекс.

Из изложенных выше данных видно, что эндогенные ретровирусные последовательности не могут быть рассмотрены как молчащие гены, потерявшие их биологическую значимость в процессе эволюции. Несмотря на все нарастающий поток данных о биологической значимости эндогенных ретровирусов, их действительный вклад в биологические процессы требует дальнейшего исследования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. МАТЕРИАЛЫ.

Оборудование и расходные материалы.

В работе было использовано следующее оборудование:

центрифуги GPR Centrifuge (Beckman, США), 2К15 (Sigma, Германия); Eppendorf 5415; УФ-трансиллюминатор (Ultraviolet Products, США); ручной счетчик радиоактивности Minimonitor 125 (США); спектрофотометр DU-65 (Beckman, США); микробиологические качалки (New Brunswick Scientific, США); миксер ВП (Россия); воздушный термостат с циркуляцией воздуха (ГДР); водный термостат UH (ГДР); приборы для горизонтального электрофореза (Pharmacia, Швеция; Hoefer Scientific Instruments, США); источники питания EPS 500/400 (Pharmacia, Швеция), PS 250/АМР 2,5 (Hoefer Scientific Instruments); автоматические PCR-амплификаторы DNA Thermal Cycler, TC-480, PCR System 9600 (Perkin-Elmer Cetus); OmniGene (Hybaid, Англия); Progene (Techne, Англия); гибридизационные бани (Hybaid, Англия, Robbins Scientific, США); автоматические пипетки (Gilson, Франция; Eppendorf, Германия; Ленпипет, Россия).

В работе были использованы следующие расходные материалы:

нейлоновые мембраны Hybond-N (Amersham, Англия); системы для выделения плазмидной ДНК Qiagen Tips, Qiawell, Qiaspin (Qiagen, США); системы очистки продуктов PCR QiaQuick (Qiagen, США); системы для выделения ДНК из агарозы Geneclean I, II (Bio 101, США); QIAEX II (Qiagen, США); набор реактивов для сиквенса fmol DNA sequencing system (Promega, США); Sequenase 2.0 (Amersham-USB, Англия);

Реактивы и ферменты

В работе были использованы следующие реактивы отечественного производства (квалификация «хч» и «осч»):

этиловый спирт, изопропиловый спирт, ацетат аммония, ацетат натрия, изоамиловый спирт, однократно перегнанный фенол, медицинский хлороформ, мочевина, уксусная кислота, хлористый натрий.

И следующие импортные реактивы:

легкоплавкая агароза LMT - Bio-Rad, США; агароза LE Molecular Biology Grade - Promega, США; агароза NuSieve GTG - FMC, США; ацетат натрия - Serva, Германия; бромфеноловый синий - Bio-Rad, США; ксиленцианол - Bio-Rad, США; смесь красителей для нанесения препаратов на агарозный гель - Promega, США; ДНК из спермы лосося (лиофилизированный препарат) - Serva, Германия, Boehringer Mannheim, Германия; дрожжевая тРНК (лиофилизированный препарат) - Boehringer Mannheim, Германия; лизоцим - Calbiochem, Швейцария; дезоксинуклеозидтрифосфаты - Boehringer Manheim, Германия; Pharmacia, Швеция; Perkin Elmer, США; трис-(гидроксиметил)аминометан - Sigma, США (TRIZMA base); глицерин -Life Technologies, США; полиэтиленгликоль 6.000 - Serva, Германия; додецилсульфат натрия (SDS) - Serva, Германия; акриламид - Bio-Rad, США; бис-акриламид - Bio-Rad, США; персульфат аммония - Bio-Rad, США; тетраэтилметилендиамин (TEMED) - Bio-Rad, CUTA; этилендиаминтетраацетат (EDTA) - Sigma, США; Serva, Германия; бакто-триптон - Difco, США; бакто-дрожжевой экстракт - Difco, США, хлорид магния, хлорид кальция, борная кислота - "Merck", ФРГ.

В работе были использованы следующие препараты, меченые радиоактивными изотопами:

[a-32P]dATP (>5000 Ки/ммоль), [у-32Р]АТР (>5000 Ки/ммоль) -Россия.

Были использованы следующие ферментные препараты:

эндонуклеазы рестрикции (New England Biolabs, США; Amersham, Англия); ДНК-лигаза фага Т4 (Boehringer Mannheim, Германия; New England Biolabs, США; Life Technologies, США); фрагмент Кленова ДНЕС-полимеразы I Е. Coli (Boehringer Mannheim, Германия; Promega, США); термостабильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus (Россия; Perkin-Elmer; Promega, США, Boehringer Mannheim, Германия), T4 полинуклеотидкиназа (New England Biolabs, США).

Космиды.

Космидные клоны в векторе LAWRIST 16 получены из коллекции лаборатории Lawrence Livermore National Laboratory (США).

Среды и растворы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Лаврентьева, Ирина Валерьевна

ВЫВОДЫ:

1. Впервые была проведена высокоточная локализация LTR HERV-К и составлена карта распределения этих последовательностей на 19 хромосоме человека. Полученные результаты включены в интегральную карту 19 хромосомы человека (http://www-bio.llnl.gov/bbrp/ /genome/genome.html.)

2. Выявлены известные и кандидатные гены человека, содержащие в своем составе LTR последовательности, которые могут модулировать активность данных генов.

3. Определена нуклеотидная последовательность картированных LTR HERV-K. Проведен сравнительный структурный анализ полученных последовательностей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Полученные данные о первичной структуре некоторых ШЫ послужили основой для выделения двух близкородственных групп повторяющихся последовательностей, способных модулировать активности генов человека и иметь эволюционное значение. Выводы о структурных различиях могут быть дополнены результатами исследования функционального потенциала и особенностей обеих обнаруженных групп ЬТИ. Локализация ЬТЯ в локусах некоторых известных генов и, особенно, идентификация ЬТЛ вблизи регуляторных генов, явилась первым шагом в изучении механизмов регуляции экспрессии этих генов человека. Полученные результаты взаимного картирования ЬТЯ НЕЛУ-К и фрагментов "кандидатных" генов могут быть использованы в дальнейших работах по изучению их функций и механизмов регуляции экспрессии. Завершением исследований, частью которых является настоящая работа, должно стать выяснение роли ЬТЯ в функционировании близлежащих участков генома. В частности представляет интерес идентификация генов человека, содержащих в своей структуре ЬТЯ последовательности, и выяснение возможного влияния регуляторных элементов ЬТЯ на экспрессию таких генов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лаврентьева, Ирина Валерьевна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. T. Vinogradova, S. Volik, Yu. Lebedev, Yu. Shevchenko, I. Lavrentyeva, P. Khil, K.-H. Grzeschik, L. K. Ashworth and E. Sverdlov. (1997) Positioning of 72 potentially full size LTRs of human endogenous retroviruses HERV-K on the human chromosome 19 map. Occurrences of the LTRs in human gene sites. Gene v. 199, pp.25 5-264.

2. I. Lavrentieva, P. Khil, T. Vinogradova, A. Akhmedov, A.Lapuk, O. Shahova, Y. Lebedev, G.Monastyrskaya and E. Sverdlov. (1997) Subfamilies and nearest-neighbour dendrogram for the LTRs of human endogenous retroviruses HERV-K mapped on human chromosome 19: physikal neighbourhood does not correlate with identity level. Hum. Genet, v. 102, pp. 107-116.

3. Irina Lavrentieva, Natalia E. Broude, Yuri Lebedev, Irving I. Gottesman, Sergei A. Lukyanov, Cassandra L. Smith and Eugene D. Sverdlov. (in press, 1999) High polymorphism level of genomic sequences flanking insertion sites of human endogenous retroviral LTRs. FEBS letters

4. A.Lapuk, P. Khil, L Lavrentieva, Y. Lebedev and E. Sverdlov. (in press, 1999) A human endogenous retroviral LTR formed more than 10 mln years ago due to an insertion of HERV-H into 5'-LTR of HERV-K LTR endogenous retrovirus is situated on human chromosomes 10, 19 and Y. J. Gene Virol.

5. Adams M.D., Kelley J.M., Cogayne J.D., Dubnick M., Polymeropulos M.H., Xiao H., Merril C.R., Wu A., Olde B., Moreno R.F. et al. // Science, 1991, v. 252, pp. 1651-1656

6. Adams M.D., Kerlavage A.R., Fields C., Venter J.C. IINature Genet., 1993, v. 4, pp. 256-267

7. Andreadis A., Nisson P.E., Kosik K.S., Watkins P.C. II Nucleic Acids Res., 1993, v.21, 2217-2221

8. Antequera F. and A.Bird // Nature Genet., 1994, v. 8, pp. 114

9. Ashworth L.K., Batzer M.A., Brandiff B., Branscomb E., de Jong P., Garcia E., Games J.A., Gordon L.A., Lamerdin J.E., Lennon G., Mohrenweiser H., Olsen A.S., Slezak T., Carrano A.V. // Nature Genet., 1995, v. 11, pp.422-427

10. Aslanidis C. et al. 11 Nature, 1992, v.355, pp.548-551

11. Backmann J.S., and Weber J.L., // Genomics, 1992, v. 12 pp. 627-631

12. Baens M„ Chaffenet M., Cassiman J.-J., van den Berghe H., Marynen P. // Genomics, 1993, v. 16, pp.652-655

13. Baltimore, D., // Cell, 1985, v.40, pp.481-482.

14. Bates G.P., Valdes J, Hummerich H., Baxendale S., et al // Nature Genet., 1992, v. 1, pp. 180-187

15. Bates G.P, Wainwright B J., Williamson R., Brown D. II Mol. Cell Biol, 1986, v.6, pp. 3826-3830

16. Baxendale S., Bates.G.P., et al II Nucleic Acids Res. 1991, v. 19 p. 6651

17. Bellefroid E.J., Marine J.-K., et al., //EMBO J., 1993, v. 12, pp.1363-1374.

18. Bellane-Chantelot C. et al // Cell, 1991 v.70, pp. 1059-1068

19. Bellet A. J., Busse H.G.,and Baldwin R.L. 11 The Bacteriophage lambda, Cold Spring Harbor, NY, 1971, pp 501-503

20. Bentley D R. II Human Genom Meeting, 1998, SI

21. Bird A.P. II Nature, 1986, v.321, pp.209-213

22. Bodmer W., // Amer. J. Hum. Genet. 1981, v 33, pp 664-682

23. Borodin A., Kopantzev E., Wagner L., Volik S., Ermolaeva O., Lebedev Y., Monastyrskaya G., Kunz J., Grzeschik K.-H., Sverdlov E. // Genet. Anal. Biom. Eng., 1995, v. 12. pp.23-31

24. Botstein D., White R.L., Skolnick M., and Davis R.W., II Amer. J. Hum. Genet. 1980, v 32, pp 314-331

25. Brandriff B.F., Gordon L.A., TraskB.J. II Genomics, 1991, v. 10, pp.75-82

26. Brandriff B.F., Gordon L.A., Fertitta A., Olsen A.S., Christensen M., Ashworth L.K., Nelson D.O., Carrano A.V., Mohrenweiser H.W. II Genomics, 1994, 23, pp. 582-584

27. Brookes A.J. and Porteous D.J. II Nucleic Acids Res. 1991, v. 19 pp. 2609-2613.

28. Brown W.R.A., Bird A.P. IINature, 1986, v.322, pp.477-481

29. Buckler A.J., Chang D.D., Graw S.L., Brook J.D., Haber D.A., Sharp P.A., Housman D.E. UProc. Natl. Acad. Sei. USA, 1991, v.88, pp.4005-4009

30. Burke D.T., Carle G.F., Olson M.V. // Science, 1987, v.236, pp. 806-812

31. Callahan, R., Chiu, I.-M., Wong, J., Tronick, S., Roe, B., Aaronson, S. and Schlom, J. // Science, 1985 v.228, 1208-1211.

32. Cavalli-Sforza L.L. // Trends in Genetics, 1998, v. 14, n.2,pp.60-65

33. Chumakov I., Rigault P., Guillou S., Ougen P., Billaut A. etal. II Nature (London), 1992, v. 359, pp. 380-387

34. Cohen D„ Chumakov I.M., Weissenbach J., II Nature Genet., 1993, v. 336, pp. 698-701

35. Cohen, M., Powers, M., O'Connell, C. and Kato, N, // Virol., 1985, v. 147, 449-458.

36. Collins F.S. II Nature Genet., 1992, v. 1, pp. 3-6.

37. Corbo L., Maley J.A., Nelson D.E., Caskey C.T. // Science, 1990, v.246, pp. 813-815

38. Cotter FE., Lillington D., Hampton G., Riddle P., Nasipuri S., Gibbons B., Young B.D. // Genes Chromosom Cancer, 1991, v.3, pp. 8-15

39. Couch F.J., Castilla L.H., Xu J., et all // Genomics, 1995, v. 25, pp. 264-273

40. Coulson A., Sulston J., Brenner S., Karn J. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986, v. 83, pp. 7821-7825

41. Cox D R. // Genom digest, 1995, v. 2, n.2, pp. 14-15

42. Cox D R. // Genom digest, 1995, v. 2, n.4, p. 15

43. Cox D R., Burmeister M., Price E.R., Kim S., Myers R.M. II Science, 1990, v. 250, pp. 245-250

44. Cross S.H., and Little P.F.R., // Gene. 1986, v. 49, pp. 9-22

45. Davies K. II Nature (London), 1992, p. 95

46. Di Cristofano, A., Strazzulo, M., Longo, L. and La Mantia, G., IINAR, 1995, v.23, 28232830.

47. Djabali M., Nguyen C., Biunno I., OostraB.A., Mattei M.G., Ikeda J.E., Jordan B.R. // Genomics, 1991, v. 10, pp. 1053-1060

48. Donis-Koler H., Green P., Helms P., Cartinhour S., Weiffenbach B., Stephens K., Keith T.P., Bowden D.W., Smith D R., Lander E.S. II Cell, 1987, v. 51, pp. 319-337.

49. Duyk G M., Kim S., Myers R.M., Cox D.R. IIProc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, v.87, pp.8995-8999

50. Edwards A., Civitello A., Hammond H.A., and Caskey C.T., 11 Amer. J. Hum. Genet. 1991, v 49, pp 746-756

51. Evans G.A., Lewis K., and Rothenberg B.E., // Gene. 1989, v. 79, pp. 9-20

52. Feuchter A.E., Freeman J.D., Mager D.L. // Genomics, 1992, v. 13, pp. 1237-1246

53. Fickett J.W. // TIG, 1996, v. 12, n. 8, pp. 316-320.

54. Fiedler W., Claussen U., Ludecke H.J., Senger G., Horsthemke B., Geurts Van Kessel A., Goertzen W., Fahsold R. // Genomics, 1991, v. 10, pp. 786-791

55. Fisher E.M.C, Cavanna J.S., Brown S.D.M. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1985, v. 82, pp. 5846-5849.

56. Fisher S.G., Cayanis E., Ruso J.J., et all // Genomics, 1994, v. 21, pp. 525-537

57. Foote S„ Vollrath D., Hilton A., Page D.C. // Science, 1992, v.258, pp. 60-66

58. Gall J G., Pardue M.L. IIProc. Natl. Acadl. Sei. USA, 1969, v.63, pp. 378-383

59. Gardiner K., Graw S., Ichikawa H., Ohki M., Joetham A., Gervy P., Chumakov I. & Patterson D. II Somat. Cell Mol. Genet. ,1995, v.21, pp.399-414

60. Gemmill R.M., Chumakov I., Scott P., Waggoner B., Rigault P., Cypser J., Chen Q., Weissenbach J., Gardiner K., WangH. et. al., //Nature, 1995, v.377, pp.299-319

61. Gibson T.J., Rozental A., Waterston R., // Gene. 1987, v. 53, pp. 283-286

62. Gordon L., et al., // Genomics, 1995, v. , pp.

63. Green E.D., and Olson M.V., //Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 1990b, v.87 , pp. 1213-1217

64. Green E.D., and Olson M.V., // Science, 1990a, v. 250, pp. 94-98

65. Grimes B. and Cooke H. //HumMolec.Genet., 1998, v.7, pp. 1635-1640.

66. Gyapay G. et al. // Hum.Molec.Genet., 1996, v. 5, p. 339

67. Hahn S.A. et al. // Science., 1996, v.271, pp. 350

68. Hampton G., Leuteritz G., Ludecke H.J., Senger G., Trautmann U., Thomas H., Solomon E., Bodmer W.F., Horsthemke B., Claussen U. et al. // Genomics, 1991, v. 11, pp. 247-251

69. Hochgeschwender U. // Trend. Genet., 1992, v. 8, pp. 41-44

70. Hoffman S.M.G., Fernandez-Salguero P., Gonzalez F.J., Mohrenweiser H.W. // J. Molec. Evol., 1996, v.41, pp.

71. Holland J., Coffey, A.J., Giannelli F., and Bentley D.R., // Genomics, 1993, v. 15, pp. 297-304

72. HromasR., et al. //J. bioL Chem., 1991, v.266, pp.14183-14187.

73. Huang M.-E., Chuat J.-C., et. all // DNA Sequence- The Journal of Sequencing and Mapping, v. 4, pp. 293-300

74. Joutel A. et al. //Nature Genet., 1992, v.5, pp.40-45.

75. Kandral R.P., Kandral G. And Weissman S.M. HProc. Natl. Acad.Sci.JJSA, 1994, v.91 , pp. 88-92.

76. Kohara Y., Akiyama K., Isono K. // Cell, 1987, v. 50, pp. 495-508.

77. La Mantia, G., Maglione, D., Pengue, G., Di Cristofano, A., Simeone, A., Lanfrancone, L. andLania, L., IINAR, 1991, v.19, 1513-1520.

78. Lamerdin J.E. et al. // Genomics, 1995, v. 13, pp.547-554

79. Lamerdin J.E., Carrano A.V. //Biotechniques, 1993, v. 15, pp.294-302

80. Larsen F., Gundersen G., Lopez R., Prydz H. // Genomics, 1992, v. 13, pp. 1095-1107

81. Larsson E., Kato N., Cohen M. // Curr. Top. Microbiol. Immunol, 1989, v. 148, pp. 115132

82. Lebedev Y.B., Volik S.V., Obradovic D., Ermolaeva O.D., Ashworth L.K., Lennon G.C., Sverdlov E.D. HMol. Gen. Genet., 1995, v.247, pp.742-748.

83. Leib-Mosch C., Brack R., Werner B., Etile V., Hehlmann R. // Cancer. Res., 1990, v. 50, pp. 5636s-5642s

84. Leib-Mosch C., Haltmeier M., Werner T., Giegl E.-M., Black-Werner R., Francke U., Erfle V., Hehlmann R. II Genomics, 1993, v. 18, pp. 261-269

85. Lennon L.L., Lehrach H. II Trends Genet., 1991, v.7, pp.314-317

86. Lindsay S., Bird A.P. UNature, 1987, v.327, pp.336-338

87. LittM., Luty J.A. II Am. J. Hum. Genet., 1989, v. 44, pp. 397-401

88. Little R.D., Pillia G., et. All, //Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 1992, v.89 , pp. 177-181

89. Liu P., Legerski R., Siciliano M.J. // Science, 1989, v.246, pp.813-81

90. Liu P., Siciliano J., Seong D., Craig J., Zhao Y., de Jong P.J. // Cancer Genet. Cytogenet, 1993, v.65, pp. 93-99

91. Lovett M. // Trends Genet., 1994, v.10, pp.352-357

92. Lovett M., Kere J., HintonL.M. IIProc. Natl. Acad. Sei. USA, 1991, v.88, pp.9628-9632

93. Lower R., Lower J., Kurth R.11 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, v.93, pp.5177-5184

94. Lower, R., Lower, J., Tondera-Koch, C. and Kurth, R„ // Virol., 1993, v. 192, 501-511.

95. Ludecke H.J., Johnson C., Wagner M.J., Wells D.E., Turleau C., Tommerup N., Latos-Bielenska A., Sandig K.R., Meinecke P., Zabel B. et al. II Am. J. Hum. Genet., 1991, v. 49, pp. 1197

96. Martin-Gallardo A. et al II Nature Genet., 1992, v.l, pp.34-39

97. Mayall et al. II Cytometry, 1984, v.5, pp.376-3 85

98. Nakamura Y., LeppertM., et. all, II Science, 1987, v. 235, pp. 1616-1622

99. Nathans D. II Science, 1979, v. 206, p. 903.

100. Naylor S.L., Moore S., Garcia D., Xiang X., Xin X., Mohrer M., Reus B., Linn R., StantonV, O'Connell P. & Leach R.J. // Cytogenet. Cell Genet., 1996, v.72, pp.90-94

101. Nelson D.L., Ledbetter S.A., Corbo L., Victoria M.F., Ramirez-Solis R., Webster T.D., Caskey C.T. II Proc.Nat.Acad.Sei. USA, 1989, v.86, pp. 6668-6690

102. Nelson J.M., Miceli S.M., Lechevalier M.P., Roberts R.J. // Nucleic Acids Res., 1990, v. 18, pp. 2061-2064

103. Nizetic D., Zehetner G., et. all, // Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1991, v.88, pp. 32333237

104. Nizetic D.,Gellen L., et. all, II Hum. Mol. Genet. 1994, v.3, pp. 756-770

105. Nizetic D.,Monard S.S., et. all, // Cytogenetics and cell genetic. 1993, Iss. 2-3, v.62, p. 103

106. Nowak R. // Science, 1994, v. 263, pp. 608

107. Ochman H., Gerberg A.S., and Hartl D.L., // Genetics. 1988, v. 120 3 pp. 621-623

108. Oeltjen J.C., Liu X., Lu J., Allen R.C„ Muzny D.3 Belmont J.V. & Gibbs R. A. // Mamm.Genome, 1995, v.6, pp.334-338

109. Olson M., Hood L., Cantor C., Botstein D. //Science, 1989, v. 245, pp. 1434-1435

110. Olson M.V., Dutchik J.E., Graham M.Y.,. &... //Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986, v. 83, pp. 7826-7830

111. Olson M.V., Green P.A. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1993, v. 58, pp.349-355

112. Parimoo S., Patanjali S.R., Shukla H., Chaplin D.D. IIProc. Natl. Acad. Sei. USA, 1991, v.88, pp.9623-9627

113. Parkar M., Lovering R., Levinsky R.J. & Kinnon C. /1Hum.Genet., 1994, v.93, pp. 89-90

114. Patience, C., Wilkinson, D., Weiss, R. // Trends in Genet., 1997, v. 13, 116-120.

115. Polymeropoulos M.H., Xiao H., Glodek A., Gorski M., Adams M., Moreno R.F., Fitzgerald M.G., Venter J.C., Merril C.R. // Genomics, 1992, v. 12, pp.492-496

116. Puech A., Ahnine L., Ludecke H. J., Senger G., Ivens A., Jeanpierre C., Little P., Horsthemke B., ClaussenU., Jones C. et al.// Genomics, 1992, v. 13, pp. 1274-1280

117. Qiang B.-Q. and Schildkraut I. IIMeth. Enzymol., 1989, v. 155, pp. 15-21

118. Rabson, A.B., Hamagishi, Y., Steele, P.E., Tykocinski, M. and Martin, M.A. // J.Virol., 1985, v.56, 176-182.

119. Riley J., Butler R., et. all, // Nucleic Acid Res., 1990, v. 18, pp. 2887-2890

120. Rohme D., Fox H., Hermann A.B., Frishauf A.-M., Edstrom J.-E., Mains P., Silver L.M., Lehrach H. // Cell, 1984, v. 36, pp. 783-788.

121. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. II Science, 1988, v. 239, pp. 487-489

122. Saiki R.K., Scharf S.J., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. II Science, 1985, v.230, pp. 1350-1354

123. Sanger F., S. Nicklen, A.R. Coulson. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, v. 74, pp. 5463-5468.

124. Scalenghe F., Turco E., Edstrom J.-E., Pirotta V., Melli M.C. // Chromosoma, 1981, v. 82, pp. 205-216

125. Schuler G.D., Boguski M.S., et. al., // Science, 1996, v. 274, pp. 540-546.

126. Schwartz D.C. and Cantor C.R. // Cell, 1984, v. 37, pp. 67-75

127. Sellen M., Giovannini M et. all, II Genomick, 19894, v. 22, pp. 137-147

128. Shepherd N.S., Pfrogner B.D., et. all, II Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 1994, v.91, pp. 2629-2633

129. Sherrington R. et al. II Nature, 1995, 375, 754.

130. Shizuya H., Birren B., et. all, // Proc. Natl. AcadSci. USA, 1992, v.89, pp. 8794-8797

131. Silvermann G.A., Ye R.D., et. all, II Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 1989, v.86, pp. 74857489

132. Smith C.L., Lawrence S.K., Gillespie G.A., Cantor C.R. II In "Methods in Enzymology" (M. Gottesman, Ed.), 1987, v. 151, pp. 461-489

133. Southern E M. II J.M.Biol., 1975, v.98, pp.503-517

134. Southern E.M., Anand R., Brown W.R.A., Fletcher D.S. II Nucleic Acids Res., 1987, v. 15, pp. 5925-5943

135. Stallings R.L., Torney D.C., Hidebrand C.E., Longmire J.L., Deavent L.L., Jett J.H., Doggett N.A., Moyzis R.K. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, v. 87, pp. 6218-6222

136. Strittmatter W.J., Roses A.D. H Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, v.92, pp.4725-4727

137. Suzuki H., Hosokawa Y., Toda H., Nishikimi M., Ozawa T. HJ. Biol. Chem., 1990, v. 265, pp. 8159-8163

138. Tautz N., Kaluza K.L., Frey B., Jarsch M., Schmitz G.G., Kessler C. II Nucleic Acids Res., 1990, v. 18, p. 3087

139. Ting C.N., Rosenberg M.P., Snow S.M., Samuelson L.C., Meisler M.H. // Genes. Dev., 1992, v. 6, pp. 1457-1465

140. Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J., // Nucleic Acids Res., 1994, v.22, pp.4673-4680.

141. Thompson J. and Jeanmougin F, //distributed by the author, 1997, ftp:// www-igbmc.u-strasbr.fr/pub/ClustalX.

142. Tomita, N., Horii, A., Doi, S., Yokouchi, H., Ogawa, M., Mori, T. and Matsubara, K, // 1990, v. 166, pp. 1-10.

143. Trump D., Pilia G., Dixon P.H., Wooding C., Thakrar R., Leigh S.E., Nagaraja R., Whyte MP., Schlessinger D. and ThakkerR.V. 11 Hum. Genet., 1996, v.97, pp.60-68

144. Tynan K., Olsen A., Trask B., de Jong P., Thompson J., Zimmermann W., Carrano A., Mohrenweiser H. //Nucleic AsidsRes., 1992, v. 20, p. 1629-1636

145. Vetrie D., Bentley D., Bobrow M„ Harris A. // Hum. Genet., 1993a, v. 92, pp. 95-99.

146. Vetrie D., Bobrow M., Harris A. // Genomics, 1993b, v. 15, pp. 631-642

147. Vos J.M. //Nat. Biotechnol., 1997, v. 15, pp. 1257-1259.

148. Weber J.L., May P.E. II Am. J. Hum. Genet., 1989, v.344, pp. 388-396

149. Weber, F.,dt Villiers, J. and Shaffner, W. // Cell, 1984, v.36, pp.983-992.

150. Wei M.H., Latif F., Bader S., KashubaV., Chen J. Y., Duh F.M. et al. // Cancer Res., 1996, v.56, pp. 1487-1492

151. Weil L., Wein N., and Casale A., HJ. Virology, v. 63, pp. 352-366

152. Wijmenga C., Wright T.J., Baan M.J., Padberg G.W., Williamson R., van Ommen G.J., Hewitt G.E., Hofker M.H., Frants RR. II Hum. Mol. Genet., 1993, v. 2, pp. 16671672

153. Wilkinson, D A., Goodchild, N.L., Saxton, T.M., Wood, S. and Mager, DL. // J.Virol, 1990, v.64, 2157-2167.

154. Wilkox A.S., Khan A.S., Hopkins J. A., Sikela J.M. II Nucleic Acids Res., 1991, v. 19, pp.1837-1843

155. Yaspo M.L., North M.A., LehrachH II Nucleic Acids Res., 1993, v.21, 2271-2272

156. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.. IIМолекулярное клонирование. М., 1984

157. Хиль П.П. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 1999.

Благодарности.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность всему коллективу Лаборатории Структуры и Функции Генов Человека во главе с Евгением Давидовичем Свердловым и Галиной Сергеевной Монастырской за предоставленную возможность работать в стенах прекрасно оснащенной лаборатории.

Автор выражает сердечную благодарность за бескорыстную помощь и поддержку в трудные минуты Юрию Борисовичу Лебедеву, под чьим непосредственным руководством проводилась эта работа и без чьего внимательного участия, написание этой работы едва ли было бы возможным.

Автор глубоко признателен Татьяне Викторовне Виноградовой за совместную работу, за дружеские советы и помощь в работе.

Благодарю за плодотворное сотрудничество и участие в обсуждении работы всех сотрудников лаборатории структуры и функций генов человека ИБХ РАН, в особенности Льва Григорьевича Николаева, Сергея Борисовича Акопова, Игоря Павловича Чернова, Евгения Валерьевича Снежкова, Евгения Павловича Копанцева, Павла Павловича Хиля, Татьяну Леодоровну Ажикину и Костину Марию Борисовну. Данная работа в значительной степени является результатом поддержки и дружеских советов перечисленных выше коллег.

Автор выражает благодарность Виктору Кузьмичу Потапову и Надежде Васильевне Скапцовой за синтез олигонуклеотидов. Автор сердечно благодарит Наталию Игоревну Медведеву, Зою Борисовну Кравченко, Татьяну Львовну Левитан, обеспечивавших всем необходимым.