Картирование генов свиньи с помощью различных типов межвидовых клеточных гибридов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Иванова, Елена Викторовна

• Иванова, Елена Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Иванова, Елена Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Картирование геномов млекопитающих.

1.1.1. Типы маркеров, использующихся при построении карт геномов.

1.1.2. Сравнительное картирование геномов млекопитающих.

1.2. Методы построения цитогенетических карт.

1.2.1. Картирование с помощью гибридов соматических клеток.

1.2.1.1. Монохромосомные гибриды соматических клеток.

1.2.2. Способы идентификации хромосом и хромосомных перестроек в 25 клеточных гибридах.

1.3. История создания радиационных клеточных гибридов, РГ 27 картирование генома человека.

1.3.1. Эксперименты Госса и Харриса.

1.3.2. Хромосомо-специфичные РГ панели.

1.3.3. Геномные РГ панели.

1.3.4. РГ картирование млекопитающих.

1.3.5. Создание РГ карт.

1.3.5.1. Получение РГ панели.

1.3.5.2. Статистический анализ РГ данных.

1.3.6. Сравнение РГ и других методов картирования.

1.4. Современное состояние картирования генома свиньи, сравнение с 38 другими видами.

1.4.1. Генетическое картирование свиньи.

1.4.2. Цитогенетическое картирование свиньи.

1.4.2.1. Картирование маркеров I типа у свиньи.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Линии клеток.

2.2. Методы работы с культурами клеток.

2.2.1. Получение культуры лейкоцитов периферической крови свиньи.

2.2.2. Культивирование клеточных культур.

2.2.3. Субклонирование клеточных культур.

2.2.4. Получение межвидовых клеточных гибридов свинья - норка 45 методом слияния в монослое.

2.2.5. Получение межвидовых клеточных гибридов свинья - норка 46 методом слияния в суспензии.

2.2.6. Получение радиационных клеточных гибридов.

2.3. Методы цитогенетического анализа.

2.3.1. Фиксация культуры лейкоцитов крови свиньи.

2.3.2. Фиксация культур клеток.

2.3.3. G-трипсин окрашивание метафазныххромосом.

2.3.4. Подготовка препаратов для микродиссекции.

2.4. Методы работы с ДНК.

2.4.1. Выделение суммарной ДНК свиньи.

2.4.2. Мечение зонда биотином (Bio-11-dUTP) или дигоксигенином (Dig- 48 11-dUTP) методом ник-трансляции.

2.4.3. Мечение зонда биотином (Bio-11-dUTP) в Inter-SINE ПЦР.

2.4.4. Получение Cotí ДНК свиньи.

2.4.5. Гибридизация in situ.

2.5. ПЦР - анализ.

2.6 Статистический анализ данных радиационного картирования.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение и анализ гибридной клеточной линии с одной 56 хромосомой свиньи.

3.2. Использование нового подхода для анализа сложных хромосомных 60 перестроек в гибридах соматических клеток.

3.2.1. Хромосомный и генный состав гибридного клона и его субклонов.

3.2.2. Получение хромосом-специфических ДНК-библиотек.

3.2.3. Определение происхождения хромосомного материала 63 перестроенных хромосом.

3.2.4. Анализ сегрегации гена ТК1 и хромосомного материала свиньи.

3.3. РГ картирование хромосомы 2р свиньи.

3.3.1. Получение РГ панели.

3.3.2. Цитогенетический анализ РГ клонов.

3.3.3. Создание РГ карты.

3.3.3.1. Локализация генов на РГ карте.

3.3.4. Сравнение РГ и генетической карт хромосомы 2р свиньи.

3.3.5. Геномная РГ карта свиньи, сравнение ее 2р-района и РГ карты 91 Б8С2р.

3.3.6. Сравнение РГ и цитогенетических карт свиньи и человека.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Картирование генов свиньи с помощью различных типов межвидовых клеточных гибридов»

Актуальность проблемы. В настоящее время картирование хромосом млекопитающих является одним из основных направлений генетики. На сегодня в него вовлечено более 30-ти видов из 8-ми отрядов млекопитающих, а также несколько видов птиц и рыб (Graves, 1998). Однако, интенсивным исследованиям подвергаются геномы примерно 15-ти видов позвоночных, и наибольший прогресс достигнут в картировании геномов человека, мыши, крысы и некоторых сельскохозяйственных и домашних животных (O'Brien et al., 1999; http://www.informatics.jax.org).

Эра интенсивного картирования хромосом млекопитающих началась более 30-ти лет назад с открытия явления сегрегации хромосом в межвидовых гибридах соматических клеток. Для многих видов были созданы специальные наборы клеточных гибридов, названные панелями, и позволяющие картировать на хромосомы маркеры различных типов, проявляющие межвидовой полиморфизм, а гибриды с хромосомными перестройками использовать для субхромосомной локализации генов. Важным элементом картирования с помощью клеточных гибридов является точное выявление в них всего генетического материала исследуемого вида. Однако, часто дифференциальное окрашивание хромосом или даже такие современные подходы, как обратная гибридизация in situ или анализ ПЦР маркеров с известной локализацией, не позволяют решить эту проблему, особенно в случае анализа сложных хромосомных перестроек. Поэтому усовершенствование известных и поиск новых методов идентификации хромосом и хромосомных перестроек картируемого вида в клеточных гибридах не теряет своей актуальности.

В последние годы метод межвидовой соматической гибридизации получил буквально «второе рождение» в связи с активным вовлечением в картирование радиационно-индуцированных клеточных гибридов. Несмотря на то, что РГ метод относят к физическим методам картирования, при его использовании, также как и при генетическом анализе, наиболее вероятный порядок маркеров и расстояния между ними устанавливаются с помощью статистических методов, основывающихся на данных по сохранению маркеров в РГ клонах. Метод позволяет проводить локализации с точностью до нескольких сот п.н., не требуя внутривидового полиморфизма маркеров и, таким образом, обеспечивая интеграцию в единую карту высокополиморфных и эволюционно-консервативных локусов и, в итоге, создание консенсусной карты вида.

При проведении картирования хромосом млекопитающих, в том числе видов, важных для хозяйственной деятельности человека видов, ставятся две основные цели. Это, во-первых, построение карт геномов высокого разрешения и их использование для идентификации, молекулярного анализа и выделения локусов, определяющих экономически важные признаки или имеющих биомедицинское значение. В связи с этим ведется поиск полиморфных маркеров, тесно сцепленных с генами, вносящими главный вклад в формирование QTL и, позволяющих более эффективно проводить селекцию по нужному признаку. Большую роль в этом поиске играет построение генетических и радиационных карт, на которые наносят высокополиморфные локусы, в настоящее время, главным образом, микросателлиты.

Второй основной целью картирования является сравнение карт разных видов с целью изучения организации геномов млекопитающих, эволюции их кариотипов и определения предкового кариотипа млекопитающих. Большую роль в сравнительном картировании в настоящее время играет определение границ районов истинной хромосомной гомеологии, для которых характерен не только консерватизм состава, но и порядка генов. Выявление таких районов становится возможным при получении детальных карт геномов, выстраивающих в точном порядке как можно большее число эволюционно-консервативных, т.е. ортологичных локусов. Это особенно важно для применения стратегии позиционного клонирования с целью выделения нужных генов. Активно проводящееся в последние годы сравнение геномов на основе гетерологичного пейнтинга удобно для видов со слабо насыщенными геномными картами и представляет собой скорее первоначальный анализ кариотипов. Однако, для установления минимальных эволюционно-консервативных районов необходимы более высокоразрешающие методы картирования.

Домашняя свинья (Sus seroja domestica L ), принадлежащая к отряду Artiodactyla, относится в настоящее время к интенсивно картируемым видам, как важный сельскохозяйственный вид и как объект для сравнительного картирования. В силу своего физиологического сходства с человеком свинья также является ценным видом для разработки моделей многих болезней человека, особенно заболеваний сердечно-сосудистой системы. Картирование в геноме свиньи QTL, отвечающих за распределение и метаболизм жира, перспективно для понимания таких заболеваний человека, как тучность и ожирение (Andersson et al., 1994).

На сегодняшний день у свиньи имеются достаточно подробные генетические карты. На цитогенетическую карту локализовано около 400 генов (Gellin et al., 2000). Однако, такая ситуация была достигнута только за последние 2-3 года. К началу данного исследования цитогенетическая карта свиньи только начала создаваться. На нее был нанесен 81 ген, и лишь немногие гены были картированы регионально (Yerle et al., 1995). В отличие от цитогенетических карт многих вовлеченных в картирование видов, которые были построены на основе панелей гибридов соматических клеток, большинство локализаций на хромосомы свиньи было сделано с помощью гибридизации in situ. Это было связано с тем, что имеющиеся соматические гибриды свиньи с традиционными партнерами - мышью и китайским хомячком - имели нестабильный хромосомный состав и содержали множественные хромосомные перестройки.

Решение этой проблемы большинство лабораторий, занимающихся цитогенетическим картированием свиньи, нашли в применении современных методов молекулярной цитогенетики для анализа перестроенных гибридов свинья - грызуны. Однако, кроме этого был предложен и другой путь решения проблемы, заключающийся в создании гибридов нового типа. Очевидно, что соматические гибриды свиньи без хромосомных перестроек и со стабильным хромосомным составом пополнили бы арсенал клеточных линий, позволяющих строить физические карты отдельных хромосом этого ценного сельскохозяйственного вида. Кроме того, создание гибридных клеточных линий с одной хромосомой свиньи ускорило бы работы по получению хромосомо-специфических библиотек фрагментов ДНК свиньи и расширило бы применение методов генной инженерии для выделения ценных локусов или локусов количественных признаков (QTL).

В лаборатории генетических основ онтогенеза на протяжении ряда лет велись работы по созданию межвидовых гибридов соматических клеток, которые были бы пригодны для картирования хромосом свиньи. С этой целью были получены новые клеточные гибриды свинья-норка, имеющие достаточно стабильный хромосомный состав и небольшое число перестроек и фрагментации хромосом (Астахова и др., 1994; гЬёапоуа а1., 1994). Среди полученных гибридов выделялся малохромосомный класс, позволяющий создать уникальный набор клеточных линий, содержащих единственную хромосому свиньи ^Мапоуа а1., 1996).

Одной из возможностей использования таких линий, надежно охарактеризованных цитогенетическими и молекулярными методами, является создание на их основе хромосомо-специфичных РГ панелей и проведение радиационного картирования отдельных хромосом свиньи или их районов.

Высокоразрешающий метод РГ картирования, предложенный еще в 1975-м году, нашел свое настоящее применение только в начале 90-х годов при создании карт генома человека и отдельных хромосом мыши, и к началу настоящего исследования только для этих видов существовали РГ панели. Геномная РГ панель свиньи, как и нескольких других видов млекопитающих, была создана позднее, в 1998-м году (Уег1е е! а1., 1998). Она довольно подробна, однако на нее, как и на генетическую карту свиньи, до сих пор нанесены в основном гипервариабельные маркеры, или согласно классификации О'Брайена, маркеры II типа. Создание таких микросателлитных карт важно при нацеленности на маркер-опосредованную селекцию, но оно не предоставляет возможности для проведения сравнительного картирования. Таким образом, насыщение геномной карты свиньи генами, определение их порядка по хромосомам и установление минимальных эволюционно-консервативных районов сегодня является наиболее актуальной задачей.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлось расширение области применения межвидовых гибридов соматических клеток для картирования хромосом свиньи.

Непосредственной задачей исследования было пополнение коллекции монохромосомных клеточных гибридов свиньи, развитие способов идентификации генетического материала картируемого вида в клеточных гибридах, а также создание панели р адиационно-ин ду цир о в анных гибридов для картирования у свиньи маркеров из высоко консервативного района генома человека.

Для достижения цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1). Получить клеточную гибридную линию, содержащую единственную хромосому свиньи на фоне хромосом норки, и провести ее полную цитогенетическую характеристику.

2). Провести идентификацию генетического материала свиньи в гибридном клоне SV36, используя микродиссекцию перестроенных хромосом, создание пейнтинг проб и их супрессионную гибридизацию на хромосомы свиньи. Использовать охарактеризованный клон для региональной локализации нескольких генов и микросателлитов свиньи.

3). Получить радиационную гибридную панель клонов путем слияния облученных клеток гибридной линии, содержащей одну хромосому 2 свиньи, с клетками китайского хомячка.

4). Охарактеризовать полученную РГ панель методами молекулярной цитогенетики для выявления закономерностей сохранения фрагментов хромосомного материала донора в РГ линиях. Отобрать клоны с небольшим числом фрагментов хромосомы 2 свиньи для субхромосомного картирования.

5). С помощью полученной панели локализовать на радиационную карту р-плеча хромосомы 2 свиньи ряд микросателлитных и генных маркеров. Провести сравнение этого района на генетической, радиационной и цитогенетической картах свиньи.

6). Провести сравнительный анализ порядка генов в исследуемом районе генома свиньи и гомеологичном районе генома человека.

Научная новизна и практическая значимость.

1). Впервые получена клеточная линия, содержащая единственную хромосому свиньи 9 на фоне хромосом норки и пополнившая уникальную коллекцию монохромосомных клеточных гибридов свиньи. Линия охарактеризована цитогенетически и с помощью ПЦР-маркера.

2). Впервые для идентификации хромосомных перестроек в клеточных гибридах использован метод микродиссекции перестроенных хромосом с последующей обратной in situ гибридизацей TOPO-DOP ПЦР продукта, позволивший провести региональную локализацию генов ТК1 и UMPH2 и одного микросателлита в 12pter-pl.5 район генома свиньи.

3). Впервые создана РГ6ооо панель для физического картирования хромосомы 2 свиньи, состоящая из 118 РГ клонов. Панель охарактеризована цитогенетически с помощью методов гибридизации in situ с суммарной ДНК свиньи и норки, а также обратной гибридизации in situ. Отобраны 3 клона для регионального картирования.

4). Впервые построена РГ карта 2р-района генома свиньи, включающая 15 микросателлитов и 5 генов. CAPN1, FSHB, LDHA, MYOD1 и РТН.

5). Впервые проведено сравнение порядка пяти генов в 2р-районе генома свиньи и гомеологичном llpter-ql.3 районе генома человека. Установлено сохранение порядка генов с инверсией относительно теломеры и изменением положения центромеры.

Практическая ценность построения радиационой карты, упорядочивающей микросателлитные и генные маркеры, состоит в повышении возможностей позиционного клонирования экономически важных локусов и оптимизации селекционно-генетических работ. Картирование генов LDHA, CAPN1, FSHB, MYOD1 и РТН, дефекты которых вызывают тяжелые наследственные заболевания, связанные с нарушениями обмена веществ, репродуктивных функций и злокачественными новообразованиями у человека имеет большое экономическое значение и у сельскохозяйственных животных.

Материалы диссертации используются при чтении учебного курса «Цитогенетика» в Новосибирском государственном университете.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на 12-ом Европейском коллоквиуме по цитогенетике домашних животных (Сарагоса, Испания, 1996), на 10-ом Североамериканском коллоквиуме по генетическому картированию и цитогенетике человека и домашних животных (Апалачикола, США, 1997), на 6-ой Международной конференции по геному человека и животных (Сан-Диего, США, 1998), на 2-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, Россия, 2000), на 8-ой Международной конференции по геному человека и животных (Сан-Диего, США, 2000), на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН.

По материалам диссертации опубликовано 10 работ в отечественной и

14 зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18-тью рисунками и содержит 6 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Иванова, Елена Викторовна

100 выводы

1. Получена и охарактеризована цитогенетически и с помощью ПЦР-маркера гибридная клеточная линия, содержащая единственную хромосому свиньи 9 на фоне хромосом норки. Пополнена уникальная коллекция монохромосомных клеточных линий свинья - норка, являющаяся ценным инструментом в картировании хромосом свиньи.

2. Впервые для идентификации хромосомных перестроек в клеточных гибридах использован метод микродиссекции перестроенных хромосом с последующей супрессионной in situ гибридизацей ПЦР продукта диссектированного материала на хромосомы свиньи. В результате проведена региональная локализация генов ТК1 и UMPH2 и микросателлита SO 143 в pter-pl.5 район хромосомы 12 свиньи.

3. В результате слияния облученной клеточной линии, содержащей хромосому 2 свиньи на фоне хромосом норки, с клетками китайского хомячка получена состоящая из 118 клонов РГ6ооо панель для радиационного картирования хромосомы 2 свиньи.

4. Панель охарактеризована цитогенетически с помощью методов гибридизации in situ с суммарной ДНК свиньи и норки, а также обратной гибридизации in situ. Отобраны 3 клона, которые могут быть использованы для регионального картирования.

5. Построена РГ карта р-плеча хромосомы 2 свиньи, включающая 15 микросателлитов и 5 генов: CAPN1, FSHB, LDHA, MYOD1 и РТН. Проведена интеграция генетической, радиационной и цитогенетической карт этого района.

6. Сравнение полученного порядка генов в 2р-районе генома свиньи с порядком генов в гомеологичном районе генома человека показало их идентичность, а привлечение литературных данных позволило сделать предположение об инверсии этого района, произошедшей относительно теломеры.

101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Генетическое картирование, относящееся к разделу фундаментальных исследований в биологии, первоначально осуществлялось исключительно методами классического гибридологического анализа. В их основе лежали длительные опыты по скрещиванию, что значительно сдерживало интенсивность исследований. Возникновение принципиально нового подхода - межвидовой соматической гибридизацией - наряду с использованием клонированных зондов позволило значительно ускорить темпы картирования. И сегодня, несмотря на огромное разнообразие различных методов построения карт, гибриды соматических клеток не потеряли своего значения. Более 30 тысяч генных маркеров и EST нанесено на геномную карту человека с помощью РГ картирования, одного из видов применения межвидовой соматической гибридизации, и кДНК-клонирования (Deloukas et al, 1998).

Геномные карты исследуемых видов позвоночных, в частности, сельскохозяйственных животных, еще далеки по степени своей насыщенности от таковых у человека, мыши и крысы (табл. 1). Однако, и у этих видов, таких как корова, свинья, овца, коза, собака, курица и др, наблюдается большой прогресс в картировании за последние годы. Он связан с развитием EST-стратегий, метода геномного РГ картирования и созданием YAC и ВАС библиотек видов.

На сегодняшний день маркеры I типа нанесены на цитогенетическую карту свиньи с помощью гибридов соматических клеток (около 55%), гибридизации in situ (около 35%) и примерно 10% генов и EST имеют локализацию, подтвержденную обоими методами (http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/). Такой прогресс в картировании с помощью клеточных гибридов был достигнут только за последние 2-3 года. Из 81 гена, нанесенного на PiGMaP карту к 1995-му году, этим методом были картированы только 19 маркеров I типа (Yerle et al, 1995), а из 160 генов, локализованных на этой же карте к 1997-му году - 41 маркер (Yerle et al, 1997). Часть из них относилась к группе с несовпадающей локализацией. Это происходило вследствие недостоверной идентификации хромосом свиньи в гибридных линиях из-за их сильной спирализации и слабого разрешения GTG -окраски. Кроме того, клеточные гибриды свиньи с традиционными партнерами мышью и китайским хомячком - имели нестабильный хромосомный состав и высокую частоту хромосомных перестроек.

Решение этой проблемы было найдено в применении современных методов молекулярной цитогенетики. С помощью обратного пейнтинга (FISH с Inter-SINE ПЦР продуктом ДНК клона на нормальные хромосомы вида) были описаны перестройки в гибридных клонах свинья - грызуны, что позволило использовать гибриды в региональном картировании (Yerle et al., 1996; Robic et al., 1996; Lahbib-Mansais et al., 1999). Однако, несмотря на то, что распределение SINE-повторов по геному свиньи более равномерно, чем у человека и мыши, возможно, что некоторые небольшие районы не будут представлены этими повторами, как было показано при цитогенетическом анализе одного из наших РГ клонов. Поэтому вероятно, что в панели Йерль с соавторами описаны не все содержащиеся в клонах фрагменты генетического материала свиньи, а это может привести к ошибкам или неточностям при региональном картировании маркеров свиньи с помощью данной панели соматических гибридных клеток.

Поэтому полученные в лаборатории генетических основ онтогенеза клеточные гибриды свинья-норка, имеющие достаточно стабильный хромосомный состав и небольшое число перестроек и фрагментации хромосом, являются ценным инструментом цитогенетического и физического картирования этого сельскохозяйственного вида. Уникальный набор клеточных линий, содержащих единственную хромосому свиньи, перспективен для работ по получению хромосомо-специфических библиотек свиньи и применению методов генной инженерии для выделения ценных локусов или QTL.

В настоящее время получены моносомные гибридные клеточные линии свинья - норка, содержащие 2, 5, 8, 12 и t(l;13) хромосомы свиньи. Они использовались для локализации генов свиньи как методами Саузерн-блот гибридизации, так и ПЦР анализа продуктов гибридных клонов, полученных в результате амплификации с праймерами разного типа. В ходе настоящего исследования коллекция была пополнена клеточной линией, содержащей на фоне хромосом норки единственную хромосому свиньи 9.

Несмотря на высокую стабильность и интактность хромосом свиньи в клеточных гибридах свинья - норка, несколько клонов (составивших менее 20% от общего числа) несли хромосомные перестройки или фрагментации. В одном из таких клонов - SY36 - присутствовали две небольшие акроцентрические хромосомы и микрохромосома, содержавшие генетический материал свиньи. Для определения их состава был использован новый метод, заключавшийся в микродиссекции материала перестроенных хромосом, его TOPO-DOP ПЦР амплификации и супрессионной in situ гибридизации на нормальные хромосомы свиньи. Проведенный анализ явился первым случаем такого решения проблемы идентификации сложных хромосомных перестроек и "псевдохромосом" в клеточных гибридах. Детальное описание хромосомного материала гибрида позволило провести региональное картирование нескольких генов и микросателлитов свиньи.

В последние годы область применения гибридов соматических клеток была значительно расширена. На основе этого метода с начала 90-х годов было получено множество хромосомо-специфических и несколько геномных радиационно-индуцированных гибридных панелей человека, а с 1997 года началось конструирование РГ панелей и создание радиационных карт для многих видов позвоночных. Полученные в лаборатории генетических основ онтогенеза и надежно охарактеризованные монохромосомные линии также перспективны для создания хромосомо-специфичных РГ панелей и проведения высокоразрешающего РГ картирования отдельных хромосом свиньи или их районов.

В настоящем исследовании описывается построение РГ6ооо карты 2-р района генома свиньи. Он представляет собой высококонсервативный район, по данным гетерологичного пейнтинга гомеологичный llpter-ql.3 району генома человека. РГ панель была получена на основе гибридной клеточной линии, содержащей единственную хромосому 2 свиньи на фоне хромосом норки. На карту нанесено 15 микросателлитов и 5 генов: РТН, LDHA, MYOD1, FSHB и CAPN1, причем микросателлиты и ген FSHB были ранее локализованы на генетической карте SSC2p, а остальные гены - на цитогенетической. Средняя частота сохранения проанализированных маркеров в панели составила 18.3%.

Проведен цитогенетический анализ восьми клонов РГ панели с помощью методов FISH с суммарной ДНК свиньи или/и норки и обратного пейнтинга. Было продемонстрировано, что хромосомный состав свиньи в половине клонов, а норки

- во всех, гетерогенен, что говорит об идущей сегрегации хромосомных фрагментов донора. Кроме того, фрагменты хромосом свиньи в основном присутствуют в клонах в транслоцированном состоянии, что подтверждается данными о частоте сохранения микросателлитов и результатами, полученными для другой РГ панели свиньи. Вероятно, что фрагменты генетического материала свиньи в первую очередь интегрируют с фрагментами хромосом другого донорского вида - норки.

Из полученных РГ клонов отобраны 3 клеточные линии, использование которых может значительно повысить уровень разрешения регионального картирования хромосомы 2 свиньи. Впервые для генома свиньи получены стабильные РГ клоны с несколькими фрагментами хромосом, охарактеризованными не только методом обратной гибридизации in situ, но и с помощью ПЦР-тестирования микросателлитов.

По своим параметрам РГ карта, полученная на нашей панели, укладывается в общие рамки, показывая широкий разброс по соотношению сР/сМ, что характерно для многих РГ карт различных видов позвоночных, и имея средний уровень разрешения в 130кб/сР.

Сравнение полученного при статистическом анализе порядка микросателлитов с их порядком на генетической карте показало, что они одинаковы для 15-ти из 17-ти маркеров. На РГ карте разделились две пары маркеров, локализованных на генетической карте в одном месте, и два маркера, напротив, объединились, хотя на генетической карте их разделяло небольшое расстояние в 1сМ. Положение гена FSHB на генетической карте было подтверждено нашими данными. С высокой точностью была определена локализация гена LDHA и достаточно надежно установлен порядок остальных генов, за исключением РТН. Для анализа его положения пришлось прибегнуть к «квази-филогенетическому» методу обсчета необработанных данных (Barendse et al., 2000).

Полученный в итоге порядок генов был сравнен с порядком этих же генов в гомеологичном районе генома человека, установленным также методом РГ картирования. Они оказались идентичными, а привлечение литературных данных о цитогенетических локализациях других генов показало возможные точки разрыва

99 слияния произошедшей инверсии относительно теломеры. Необходимо отметить, что для теломерных районов была показана более высокая скорость эволюционных перестроек, чем для остальных участков генома (Ьэтвеп е1 а1, 1999; ЯцЫвоу е! а1, 2000).

До возникновения метода РГ картирования определение порядка консервативных маркеров по хромосомам было сильно затруднено. В то же время для сравнительного анализа геномов, открывающего перспективы позиционного клонирования генов и изучения эволюции кариотипов, важно именно установление порядка генов. Широко распространенное на сегодня сравнение геномов методом Zoo-FISH обеспечивает только предварительную оценку уровня хромосомной гомологии между видами. Для установления минимальных эволюционно-консервативных районов, сохраняющих в геномах разных видов не только состав, но и порядок генов, необходимы более тонкие методы, одним из которых и, фактически, самым важным на сегодня является метод РГ картирования. Кроме того, способность метода объединять в единую карту как гены, так и полиморфные маркеры, делает его незаменимым при интеграции генетических и цитогенетических карт. РГ карта может служить основой для создания У АС, ВАС или космидных контигов, позволяя точно оценивать физические расстояния или создавать высоко разрешающие карты 8Т8, необходимые для локализации ЕТЪ. Таким образом, РГ картирование является уникальным методом объединения различных типов карт и создания единых консенсусных карт видов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Иванова, Елена Викторовна, 2000 год

1. Астахова Н.М., Жданова Н.С., Кафтановская Е.М., Кузнецов С.Б, Серов O.JI. Предварительная локализация генов ТК1 и UMPH2 на хромосоме 12 свиньи // Генетика. 1994. Т.30. С.832-838.

2. Графодатский A.C., Билтуева JI.C. Гомология G-окрашенных хромосом млекопитающих//Генетика. 1987. Т.23. С.93-103.

3. Жданова Н.С., Урженко A.B., Градов A.A. Получение и хромосомный анализ устойчивых к 5-бромдезоксиуридину клеток клональной культуры американской норки (Mustela Vison) II Цитология. 1984. Т.25. С.177-181.

4. Захаров И. А. Генетические карты высших организмов. Ленинград, 1979. 152с.

5. Захаров И.А., Никифоров B.C., Степанюк Е.В. Гомология и эволюция генных порядков: комбинаторная мера сходства групп синтении и моделирование эволюционного процесса//Генетика. 1992. Т.28. С.77-81.

6. Иванова Е.В., Кузнецов С.Б., Королева И.В., Свищева Г.Р., Аксенович Т.Н., Жданова Н.С. Радиационная карта короткого плеча хромосомы 2 свиньи // Генетика. 2001. Т.37. №2.

7. Кузнецов С.Б., Ларкин Д.М., Кафтановская Е.М., Иванова Е.В., Астахова Н.М., Черяукене О.В., Жданова Н.С. Хромосомная локализация и анализ синтении некоторых генов у свиньи, коровы и овцы (отряд Artiodactyla) // Генетика. 1998. Т.34. С. 1200-1204.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Молекулярное клонирование // М.: Мир. 1984. 480с.

9. Рубцов Н.Б., Плюснина Е.В., Сердюкова H.A., Астахова Н.М., Билтуева Л.С., Кузнецов С.Б., Графодатский A.C., Жданова Н.С. Новые возможности анализа сложных хромосомных перестроек в клеточных гибридах // Генетика. 1998. Т.34. С.46-53.

10. Тихонов В.Н., Горелов И.Г., Никитин C.B., Бобович В.Е., Астахова Н.М. Картирование локуса системы H групп крови на 15-о1 хромосоме домашних свиней // Д.А.Н. СССР. 1983. Т.272. С.486-489.

11. Alexander L.J., Troyer D.L., Rohrer G.A., Smith T.P., Schook L.B., Beattie C.W. Physical assignments of 68 porcine cosmid and lambda clones containing polymorphic microsatellites //Mamm. Genome. 1996. V.7. P.368-372.

12. Amarante M.R., Yang Y.P., Kata S.R., Lopes C.R., Womack J.E. RH maps of bovine chromosomes 15 and 29: conservation of human chromosomes 11 and 5 // Mamm. Genome. 2000. V.ll. P.364-368.

13. Andersson L., Archibald A., Ashburner M., Audun S., Barendse W., Bitgood J., Womack J., et al. Comparative genome organization of vertebrates. The First International Workshop on Comparative Genome Organization // Mamm Genome. 1996. V.7. P.717-734.

14. Andersson L., Haley C.S., Ellegren H., Knott S.A., Johansson M., Andersson K., et al. Genetic mapping of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs // Science. 1994. V.263. P. 1771-1774.

15. Andersson-Eklund L, Marklund L, Lundstrom K, Haley CS, et al. Mapping quantitative trait loci for carcass and meat quality traits in a wild boar x Large White intercross // J. Anim. Sci. 1998. Y.76. P.694-700.

16. Andresen E. Close linkage between the locus for phosphohexose isomerase (PHI) and the H blood group locus in pigs // Anim. Blood Groups Biochem. Genet. 1970. V. 1. P. 171-172.

17. Archibald A.L., Brown J.F., Haley C.S., Fredholm M., Wintero A.K., et al. Linkage mapping in the domestic pig (Sus scrofa). 23rd International Conference on Anim. Genet. (Interlaken) //Anim. Genet. 1992. V.23, suppl. 1. P. 88.

18. Archibald A.L., Haley C.S., Brown J.F., Couperwhite S., McQueen H.A., et.al. The PiGMaP consortium linkage map of the pig (Sus scrofa) // Mammalian Genome. 1995. V.6. P. 157175.

19. Band M., Larson J.H., Womack J.E., Lewin H.A. A radiation hybrid map of BTA23: identification of a chromosomal rearrangement leading to separation of the cattle MHC class II subregions // Genomics. 1998. V.53. P.269-275.

20. Barendse W., Armitage S.M., Aleyasin A., Womack J.E. Differences between the radiation hybrid and genetic linkage maps of bovine chromosome 5 resolved with a quasi-phylogenetic method of analysis // Mamm Genome. 2000. V.ll. P.369-372.

21. Benham F., Hart K., Crolla J., Bobrow M., Francavilla M., Goodfellow P.N. A method for generating hybrids containing nonselected fragments of human chromosomes // Genomics. 1989. V.4. P.509-517.

22. Bielec P.E., Gallagher D.S., Womack J.E., Busbee D.L. Homologies between human and dolphin chromosomes detected by heterologous chromosome painting // Cytogenet. Cell Genet. 1998. V.81. P. 18-25.

23. Boehnke M. Multipoint analysis for radiation hybrid mapping // Ann. Med. 1992. V.24. P.383-386.

24. Boehnke M., Lange K., Cox D.R. Statistical methods for multipoint radiation hybrid mapping//Am. J. Hum. Genet. 1991. Y.49. P.l 174-1188.

25. Caspersson T., Zech L., Modest E.J., Foley G.E., Wagh U., Simonsson E. Chemical differentiation with fluorescent alkylating agents in Vicia faba metaphase chromosomes // Exp. Cell Res. 1969. V.58. P.128-140.

26. Ceccherini I., Romeo G., Lawrence S., Breuning M.H., Harris P.C., et al. Construction of a map of chromosome 16 by using radiation hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P. 104-108.

27. Cepica S., Yerle M., Stratil A., Schroffel J., Redl B. Regional localization of porcine MYOD1, MYF5, LEP, UCP3 and LCN1 genes // Anim. Genet. 1999. V.30. P.476-478.

28. Chaudhary R, Raudsepp T., Guan X.Y., Zhang H., Chowdhary B.P. Zoo-FISH with microdissected arm specific paints for HSA2, 5, 6, 16, and 19 refines known homology with pig and horse chromosomes // Mamm. Genome. 1998. V.9. P.44-49.

29. Chowdhary B.P., de la Sena C., Harbitz I., Eriksson L., Gustavsson I. FISH on metaphase and interphase chromosomes demonstrates the physical order of the genes for GPI, CRC and LIPE in pigs // Cytogenet. Cell Genet. 1995. V.71. P. 175-178.

30. Christensen K., Kaufmann U., Avery B. Chromosome mapping in domestic pigs (Sus scrofa): MPI and NP located to chromosome 7 // Hereditas. 1985. V. 102. P. 231-235.

31. Chudoba I., Plesch A., Lorch T., Lemke J., Claussen U., Senger G. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosomes // Cytogenet. Cell Genet. 1999. Y.84. P. 156-160.

32. Clark M.S. Comparative genomics: the key to understanding the Human Genome Project // BioEssays. 1999. V.21. P. 121-130.

33. Consigliere S., Stanyon R, Koehler U., Agoramoorthy G., Wienberg J. Chromosome painting defines genomic rearrangements between red howler monkey subspecies // Chromosome Res. 1996. V.4. P.264-270.

34. Cox D.R., Burmeister M., Price E.R, Kim S., Myers R.M. Radiation hybrid mapping: a somatic cell genetic method for constructing high-resolution maps of mammalian chromosomes// Science. 1990. V.250. P.245-250.

35. Cox D.R., Pritchard C.A., Uglum E., Casher D., Kobori J., Myers RM. Segregation of the Huntington disease region of human chromosome 4 in a somatic cell hybrid // Genomics. 1989. V.4. P.397-407.

36. Creagan RP, Ruddle FH. The clone panel: a systematic approach to gene mapping using interspecific somatic cell hybrids // Cytogenet. Cell Genet. 1975. V.14. P.282-286.

37. Cremer T, Lichter P, Borden J, Ward D.C, Manuelidis L. Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in hybridization using chromosome-specific library probes // Hum. Genet. 1988. V.80. P.235-246.

38. Davidson R.L, Gerald P.S. Improved techniques for the induction of mammalian cell hybridization by polyethylene glycol // Somatic Cell Genet. 1976. V.2. P. 165-176.

39. Davies W, Hoyheim B, Skogtvedt S. Alignment of two genetic linkage maps on porcine chromosome 13 //Anim. Genet. 1995. V.26. P. 119-121.

40. Dixkens C, Klett C, Bruch J, Kollak A, Serov O.L, Zhdanova N, Vogel W, Hameister H. ZOO-FISH analysis in insectivores: "Evolution extols the virtue of the status quo" // Cytogenet. Cell Genet. 1998. V.80. P.61-67.

41. Ellegren H, Chowdhary B.P, Johansson M, Marklund L, Fredholm M, Gustavsson I, Andersson L. A primary linkage map of the porcine genome reveals a low rate of genetic recombination // Genetics. 1994. V. 137. P. 1089-1100.

42. Engelen J.J, Loots W.J, Albrechts J.C, Motoh P.C, Fryns J.P, Hamers A.J, Geraedts J.P. Disclosure of five breakpoints in a complex chromosome rearrangement by microdissection and FISH//J. Med. Genet. 1996. V.33. P.562-566.

43. Eppig J.T. Comparative maps: adding pieces to the mammalian jigsaw puzzle // Curr. Opin. Genet. Dev. 1996. V.6. P.723-730.

44. Erlich H.A. Polymerase chain reaction // J. Clin. Immunol. 1989. V.9. P.437-447.

45. Fournier R.E. A general high-efficiency procedure for production of microcell hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Y.78. P.6349-6353.

46. Fridolfsson A.K., Hori T., Wintero A.K., Fredholm M., Yerle M., Robic A., Andersson L., Ellegren H. Expansion of the pig comparative map by expressed sequence tags (EST) mapping//Mamm. Genome. 1997. V.8. P.907-912.

47. Fronicke L., Muller-Navia J., Romanakis K., Scherthan H. Chromosomal homeologies between human, harbor seal (Phoca vitulina) and the putative ancestral carnivore karyotype revealed by Zoo-FISH // Chromosoma. 1997. V.106. P. 108-113.

48. Garcia F., Nogues C., Ponsa M., Ruiz-Herrera A., Egozcue J., Garcia Caldes M. Chromosomal homologies between humans and Cebus apella (Primates) revealed byZOO-FISH // Mamm. Genome. 2000. V.ll. P.399-401.

49. Gellin J., Brown S., Marshall Graves J.A., Rothschild M., Schook L., Womack J., Yerle M. Comparative gene mapping workshop: progress in agriculturally important animals // Mamm. Genome. 2000. V.ll. P. 140-144.

50. Gerhold D., Caskey C.T. It's the genes! EST access to human genome content // Bioessays. 1996. V.18. P.973-981.

51. Glaser T., Rose E., Morse HHousman D., Jones C. A panel of irradiation-reduced hybrids selectively retaining human chromosome 1 lpl3: their structure and use to purify the WAGR gene complex// Genomics. 1990. V.6. P.48-64.

52. Goss S.J., Harris H. New method for mapping genes in human chromosomes // Nature. 1975. Y.255. P.680-684.

53. Goss S.J., Harris H. Gene transfer by means of cell fusion I. Statistical mapping of the human X-chromosome by analysis of radiation-induced gene segregation // J. Cell Sci. 1977a. V.25. P. 17-37.

54. Goss S.J., Harris H. Gene transfer by means of cell fusion. II. The mapping of 8 loci on human chromosome 1 by statistical analysis of gene assortment in somatic cell hybrids // J. Cell Sci. 1977b. V.25. P.39-57.

55. Goureau A., Yerle M., Schmitz A. et al. Determination of correspondences between human and porcine chromosome segments using bidirectional chromosome painting // Genomics. 1996. V.36. P.252-262.61.62,6364,65