ГЕННОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ИНДУКЦИЯ НЕОАНГИОГЕНЕЗА В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЕЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ ЭТИОЛОГИИ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.26, кандидат медицинских наук Мжаванадзе, Нина Джансуговна

• Мжаванадзе, Нина Джансуговна
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Мжаванадзе, Нина Джансуговна

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Нерешенные проблемы лечения хронической ишемии нижних конечностей

1.2. Общие принципы васкуло-, артерио- и ангиогенеза

1.3. Терапевтический ангиогенез в лечении хронической ишемии:

1.3.1. Общие понятия «терапевтического ангиогенеза»

1.3.2. Применение рекомбинантных факторов роста

1.3.3. Клеточная терапия

1.3.4. Генная терапия:

1.3.4.1. Общие принципы генной терапии хронической ишемии нижних конечностей

1.3.4.2. Методы доставки генов. Сравнительная характеристика геннотерапевтических векторов

1.3.4.3. Выбор оптимального гена

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ И

ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление

AJIT - аланинаминотрансфераза

АНГ - ангиопоэтин

ACT - аспартатаминотрансфераза

ГМК - гладкомышечные клетки

ДБХ - дистанция безболевой ходьбы

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЗББА - задняя большеберцовая артерия

ЗПА - заболевания периферических артерий

ИБС - ишемическая болезнь сердца

КИНК - критическая ишемия нижних конечностей

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛПИ - лодыжечно-плечевой индекс

JICK - линейная скорость кровотока

МНК - мононуклеарные клетки

МНККМ - мононуклеарные клетки костного мозга

МНКПК - мононуклеарные клетки периферической крови

МНР - микроциркуляторное русло

OA - облитерирующий атеросклероз

ПХ - перемежающаяся хромота

ПЭК - прогениторные эндотелиальные клетки

СД - сахарный диабет

СКЖТ - стромальные клетки жировой ткани

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

ТКНК - транскутанное напряжение кислорода

ФР - фактор роста

УЗДС - ультразвуковое дуплексное сканирование

УЗДСММ - ультразвуковая допплеросфигмоманометрия

ХИНК - хроническая ишемия нижних конечностей

ЭК - эндотелиальные клетки

ЭРК - эндометриальные регенеративные клетки

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

СО - кластеры дифференцировки

СХС - подсемейство хемокинов с одной аминокислотой, разделяющей

концевые цистеины

ЕСМ - внеклеточный матрикс

ЕСЯ-1 - фактор раннего ответа -1

РвБ - фактор роста фибробластов

СМ-СББ - гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора

Н1Р-1а - индуцированный гипоксией фактор-1а

НвБ - гепатоцитарный фактор роста

1САМ-1 - межклеточные молекулы адгезии-1

1Ь - интерлейкин

МСР-1 - моноцитарный хемотаксический фактор-1 М-СЗБ - колоние-стимулирующий фактор макрофагов ММРв - матричные металлопротеиназы N0 - оксид азота

РБвР - тромбоцитарный фактор роста

БОИ - стромальный клеточный фактор

ТАР - фактор новообразования сосудов

ТАБС-П - Трансатлантический консенсус

ТСР-Ье1а1 - трансформирующий фактор роста - бета

ТМ^-а - фактор некроза опухоли-альфа

УЕСР - сосудистый эндотелиальный фактор роста

УРР - фактор проницаемости сосудов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ГЕННОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ИНДУКЦИЯ НЕОАНГИОГЕНЕЗА В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЕЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ ЭТИОЛОГИИ»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире. Согласно Информационному бюллетеню Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) за 2011 год, в течение 2008 г. в мире умерло 57 миллионов человек, из них - от ССЗ умерло 17,3 миллиона человек, что составило 30% всех случаев смерти в мире [11]. 10 ведущих причин смерти населения мира составили: ишемическая болезнь сердца - 7,3 миллиона человек (12,8%), инсульт и другие цереброваскулярные болезни -6,2 миллиона человек (10,8%), инфекции нижних дыхательных путей -3.46млн (6.1%), хроническая обструктивная болезнь легких - 3,28млн (5,8%), диарейные заболевания - 2,46млн (4,3%), вирус иммунодефицита человека/синдром приобретенного иммунодефицита - 1,78млн (3,1%), раковые заболевания трахеи, бронхов и легких - 1,39млн (2,4%), туберкулез -1,34млн (2,4%), сахарный диабет - 1,26млн (2,2%), дорожно-транспортные аварии - 1,21млн (2,1%) [10]. Таким образом, ни по одной другой причине ежегодно не умирает столько людей, сколько от ССЗ. Эта проблема в разной степени затрагивает страны с низким и средним уровнем дохода. Более 80% случаев смерти от ССЗ происходит в последних, почти в равной мере среди мужчин и женщин. К 2030 году около 23,6 миллионов человек умрет от ССЗ, главным образом, от болезней сердца и инсульта, которые, по прогнозам, останутся единственными основными причинами смерти [11]. В целом смертность от сердечно-сосудистых заболеваний в России не имеет отчетливой тенденции к снижению: в 70-х годах XX века - 46,3% в структуре общей смертности (412,3 на ЮОтыс населения), в начале 80-х - 52-53%; в 2006 г. - 56,9% (864,7), в 2007 -57% (833); 2008г - 57,1% (835,5 на 100 тыс населения). Помимо болезней сердца и инсультов среди сердечнососудистых заболеваний особое внимание следует уделить хронической артериальной недостаточности, т.е. хронической ишемии в отношении заболевания периферических артерий.

Заболевания периферических артерий (ЗПА) - это некоронарные синдромы, связанные с изменением анатомической структуры и функции артерий мозга, висцеральных органов и конечностей [51]. Общая распространенность ЗПА в целом в популяции составляет 12-14%, достигая 20% среди больных старше 70 лет [282]. К основным факторам возникновения заболеваний ЗПА в настоящее время относят возраст старше 40 лет, курение, сахарный диабет, гиперлипидемию и артериальную гипертензию [23]. Наиболее важными с точки зрения распространенности из заболеваний периферических артерий являются атеросклероз и сосудистые осложнения сахарного диабета [51]. Атеросклероз является причиной заболевания периферических артерий в 80-90% случаев [54]. Ведущим клиническим симптомом хронической ишемии нижних конечностей как проявления окклюзии магистральных артерий служит перемежающаяся хромота (ПХ) [51]. Распространенность ПХ в зависимости от возраста составляет от 0,9 до 7,0 %, причем до 50% больных с ПХ никогда не обращались к врачу по поводу этих симптомов [51]. У больных с ПХ существует высокий риск развития инфаркта миокарда (ИМ) и острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК). По сравнению с обычной популяцией, риск ИМ у них повышен от 20 до 60%, а риск смерти от коронарной патологии от 2 до 6 раз. При ПХ риск развития ОНМК повышается на 40% [51].

В 15-летнем исследовании перемежающейся хромоты показано, что среди больных с данной патологией после 5 лет наблюдения у 28,8% сохранялась боль в ноге, у 8,2% имели место ампутация или реваскуляризация конечности, у 1,4% развились ишемические язвы [248]. Появление болей покоя и язвенно-некротических изменений кожных покровов вплоть до гангрены у пациентов с ПХ свидетельствует о развитии критической ишемии нижних конечностей (КИНК), состояния декомпенсации артериального кровотока. Лечение КИНК требует более агрессивного подхода, как в отношении фармакотерапии, так и

хирургических вмешательств. При наличии запущенной ишемии с развитием инфекционно-токсических осложнений (газовая гангрена, сепсис) необходима первичная ампутация конечности. Притом, в течение первых 6 месяцев после диагностирования КИНК лишь в 40 % случаев конечность может быть сохранена, в то время как 20% больных умрут, остальным будет выполнена большая ампутация. В итоге к концу первого года после верификации диагноза лишь 45% больных имеют шанс сохранения конечности, около 30% продолжают жить после ампутации бедра или голени, 25%-умрут [51].

Более половины больных с зарегистрированными ЗПА составляют пациенты с хронической ишемией П б стадии по классификации A.B. Покровского-Фонтейна [68], то есть являются основными кандидатами на реконструктивные вмешательства, 10-летняя выживаемость после которых не превышает в среднем 50% [118]. Выживаемость же в популяции сопоставимых по возрасту и полу лиц, не страдающих ЗПА, оказалась более чем в 1,5 раза выше, а продолжительность жизни на 10 лет выше, чем у оперированных больных [5, 6]. Осложнения, которые могут встретиться при эндоваскулярных лечебных вмешательствах (ангиопластика, стентирование), такие как атероэмболия, расслоение, разрыв стенки сосуда и его перфорация могут иметь место и при диагностических интервенциях (ангиография) [51]. Проведение открытых реконструкций, например, аорто-бедренного сегмента, в раннем периоде в 6,9% случаев осложняется развитием тромбоза целевого артериального сегмента и в 1,9 % случаев - кровотечением, что является наиболее встречаемыми ранними осложнениями реконструктивных операций [71]. Тромботические осложнения также являются самыми частыми при проведении дистальных реконструкций, например, бедренно-подколенного-берцового шунтирования [66]. Поздние осложнения включают тромбозы, частота которых составляет до 90 % всех отдаленных осложнений, и стенозов анастомозов, частота развития которых может достигать 40% [16, 323]. У более чем 25% больных после проведения артериальных реконструкций в

отдаленном периоде появляются признаки недостаточности кровообращения вследствие прогрессировала атеросклероза без тромбоза зоны первичной реконструкции [25]. Успех реконструктивных вмешательств напрямую зависит от состояния путей оттока [259]. У приблизительно 40% пациентов, нуждающихся в оперативном лечении, артериальные реконструкции не выполнимы вследствие дистального, либо распространенного мультифокального поражения артериального русла [40].

При невозможности выполнения реконструктивного вмешательства, могут быть выполнены операции создания реверсированного кровообращения (артериализации венозного кровотока стопы [39, 40]), нереконструктивные вмешательства (имплантация сальника на сосудистой ножке [46], реваскуляризирующая остеотрепанация костей голени [70]) и паллиативные вмешательства, предпочтение среди которых отдается поясничной симпатэктомии в различных модификациях, дающая противоречивые по данным разных источников эффективность - от 32,1% до 68,1% сохраненных конечностей [60]. В целом большинство из вышеупомянутых вмешательств демонстрируют сомнительную либо умеренную эффективность, а хорошие результаты сохранения конечности демонстрируют лишь немногие центры, имеющие большой опыт подобных вмешательств. В связи с вышесказанным растет интерес к консервативным методам лечения, направленным на улучшение артериального притока, состояния микроциркуляторного русла и тканевого обмена в пораженной конечности.

Терапевтическое лечение показано всем пациентам с ЗПА и назначается пожизненно [51]. При возможности выполнения реконструктивных операций необходимость в пожизненной консервативной терапии также сохраняется. Терапевтическое лечение в первую очередь включает в себя коррекцию факторов риска (отказ от курения, контроль за уровнями липидов (преимущественно статины) и глюкозы крови, контроль артериального давления и эффективную физическую нагрузку - дозированную ходьбу

(Класс доказательности I) [36, 87, 294, 316]. Помимо модификации факторов риска, консервативное лечение имеет следующие основные направления: профилактика тромботических осложнений путем длительного приема тромбоцитарных дезагрегантов (аспирин, клопидогрел), прием фармацевтических препаратов комплексного и метаболического действия (цилостазол, сулодексид, пентоксифиллин), а также препараты, используемые при лечении критической ишемии нижних конечностей (парентеральное введение простагландинов [250], гипербарическая оксигенация, спинальная нейростимуляция [223] и нефармакологические средства, традиционно применяемые в России, включающие в себя лечебную физиотерапию, плазмаферез, квантовую гемотерапию и санаторно-курортное лечение.

Вышеуказанные методы лечения не решают всех проблем в лечении ХИНК. Так, препарат с самыми высокими классом и уровнем доказательности (Класс доказательности I, уровень доказательности А) цилостазол, увеличивающий ДБХ на 50-70 м по сравнению с плацебо [142], на территории Российской Федерации препарат не зарегистрирован. Кроме того, цилостазол противопоказан пациентам с хронической сердечной недостаточностью любого класса по классификации Нью-йоркского общества сердца (NYHA) [153].

Терапия ХИНК, направленная на коррекцию эндотелиальной дисфункции (интермиттирующая пневмокомпрессия, периндоприл, лозартан, небиволол, L-аргинин), состояния, играющего важную роль в развитии атеро-склеротической бляшки, прогрессирования атеросклероза, а также определении характера течения послеоперационного периода, является перспективной, однако в настоящее время находится большей частью на стадии клинических испытаний [30, 42, 274].

Длительное либо пожизненное лечение предполагает соответствующую «комплайентность» больного, то есть четкое соблюдение режима приема препаратов, выполнение нефармакологических лечебных мероприятий,

самодисциплину, регулярное посещение врача. Ее недостаточность приводит к тому, что не все пациенты четко выполняют полученные рекомендации, что в свою очередь приводит к снижению эффективности лечения (используется таюке термин «приверженность к терапии», который означает характеристику поведения пациента, связанную с его лечением) [33, 67, 69].

Несмотря на многочисленные способы лечения ХИНК атеросклеротической этиологии, такие как восстановительные и реконструктивные вмешательства с помощью современных инструментов и сосудистых протезов, использование широкого спектра фармакологических препаратов, сохраняется основная нерешенная проблема: объем оперативных вмешательств при поражении дистальных сосудов крайне ограничен, а консервативная терапия обеспечивает эффект в пределах не более нескольких месяцев. При естественном течении атеросклеротического процесса более трети больных умирают в ближайшие 5-8 лет от начала болезни, а в 25-50% случаев за тот же период времени выполняется ампутация пораженной конечности. Даже в специализированных стационарах число ампутаций достигает 10-20%, а летальность 15% [244]. Существует отчетливая необходимость в поиске новых методов в лечении ХИНК атеросклеротического генеза/ в особенности при поражении дистального артериального русла. В этой связи разрабатываются принципиально новые терапевтические подходы, призванные если не заменить стандартные методы, то повысить их эффективность при использовании в рамках комплексного лечения.

Принципиально новым подходом к лечению ХИНК атеросклеротического генеза в наши дни служит применение геннотерапевтических конструкций, которое с 2013 года относится к высокому классу доказательности ПА [51]. Геннотерапевтический подход направлен на индукцию ангиогенеза, то есть активацию эндотелиальных клеток, экспрессию ими первичных высокопроницаемых сосудистых структур, последующую стабилизацию и «функциональное

ремоделирование» этих гладкомышечных структур и организацию их в сложную сосудистую сеть [121]. Терапевтический ангиогенез представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации [45]. Это сложный процесс, регулируемый тонким взаимодействием множества факторов, их строго скоординированной во времени и пространстве работой. Увеличение числа методик применения ангиогенных факторов, используемых для терапевтического ангиогенеза, а также подбор оптимальных сочетаний и режимов их введения могут способствовать повышению эффективности лечебной тактики в лечении хронической ишемии тканей [286]. Терапевтический ангиогенез развивается по трем магистральным направлениям: использование постгеномных, клеточных и генных технологий. Методы клеточной терапии и постгеномных технологий в лечении ХИНК находятся на преимущественно экспериментальной стадии своего развития. Методы генной терапии в части терапевтического ангиогенеза показали наибольшую эффективность [83]. Для разработки геннотерапевтических препаратов используются гены наиболее известных факторов, в различной степени участвующих в ангиогенезе: сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF, фактор роста фибробластов FGF, гепатоцитарный фактор роста HGF, фактор, полученный из стромальных клеток SDF, ангиопоэтин ANG, индуцированный гипоксией фактор-la HIF-la [45]. Наиболее эффективным в лечении ХИНК из вышеуказанных ангиогенных факторов в клинических испытаниях себя показал VEGF [63], что послужило основанием к государственной регистрации на территории Российской Федерации в 2011 году геннотерапевтического индуктора ангиогенеза - препарата на основе ДНК-плазмид с геном сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF изоформы 165 - p-vegfl65. Успешные результаты экспериментальных исследований в рамках генной терапии создали необходимое подспорье для клинических исследований и внедрения геннотерапевтических методов

лечения ХИНК в практику. Проблема восстановления и поддержания кровообращения в дистальных сегментах при ХИНК сегодня рассматривается в том числе с точки зрения геннотерапевтической индукции ангиогенеза.

С учетом вышеизложенного были определены цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Улучшение результатов лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Па-Ш стадий по классификации A.B. Покровского-Фонтейна при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств.

Задачи исследования

1. Оценить ангиогенные свойства геннотерапевтической конструкции р-vegfl65 в эксперименте на животных.

2. Определить безопасность и эффективность применения геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в комплексной терапии у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Па-III стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну).

3. Оценить отсроченные (2 года) результаты применения геннотерапевтической конструкции p-vegß65 в комплексной терапии у пациентов, вошедших в исследование.

4. Сформулировать и обосновать показания к применению геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в комплексной терапии в различных группах пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии.

Научная новизна

Впервые проведены экспериментальное исследование на модели хронической ишемии задних конечностей у животных и клиническое исследование эффективности и безопасности применения

геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии (Ila-III стадий по A.B. Покровскому-Фонтейну) при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств.

Результатом стало получение государственной регистрации на территории Российской Федерации первого геннотерапевтического препарата на основе ДНК-плазмид с геном VEGF165 «Неоваскулген» в 2011 году.

Научно-практическая значимость работы

1. Результаты исследования позволяют расширить представление о патогенезе хронической ишемии нижних конечностей и процессах новообразования сосудов, что аргументирует разработку новых способов комплексного лечения заболевания, направленных на индукцию неоангиогенеза.

2. Результаты исследования могут быть использованы в разработке новых подходов к комплексному лечению хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротической этиологии при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств;

3. Экспериментальные и клинические данные могут дать предпосылку к применению геннотерапевтической индукции неоангиогенеза в комплексном лечении хронической ишемии нижних конечностей при диабетической ангиопатии и облитерирующем тромбангиите, а также лечении критической ишемии нижних конечностей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Стандартная комплексная терапия хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротической этиологии не является исчерпывающей с позиции влияния на клиническую симптоматику, что требует дополнительных методов лечения.

2. Геннотерапевтическая индукция ангиогенеза плазмидной конструкцией р-vegf165 в комплексном лечении хронической ишемии нижних конечностей

атеросклеротической этиологии способствует значительному приросту дистанции безболевой ходьбы.

3. Геннотерапевтическая индукция ангиогенеза плазмидной конструкцией р-vegß65 не вызывает развития местных, системных воспалительных реакций и новообразований.

4. Геннотерапевтическая индукция ангиогенеза плазмидной конструкцией р-vegf165 в составе комплексного лечения показана пациентам с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Па-Щ стадий по классификации A.B. Покровского-Фонтейна при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств.

Внедрение результатов исследования в практику и учебный процесс

Результаты исследования внедрены в клиническую практику в области ангиологии и сосудистой хирургии на территории Российской Федерации с 2011 года после государственной регистрации геннотерапевтической конструкции p-vegß65 под торговым названием «Неоваскулген» (ОАО «Институт Стволовых Клеток Человека»), в лечебный процесс ГБУ Рязанской Области «Областной клинический кардиологический диспансер», а так же в учебный процесс кафедр сердечно-сосудистой хирургии ГБОУ ВПО Тверской ГМА Минздрава России и ангиологии, сосудистой, оперативной хирургии и топографической анатомии ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов обеспечена выполнением достаточного объема экспериментальных и клинических исследований с применением современных информативных методов исследования (гистологическое, иммуногистохимическое и морфометрическое исследования, ультразвуковая допплеро-сфигмоманометрия, измерение транскутанного напряжения кислорода, ультразвуковое дуплексное сканирование артерий нижних конечностей с определением линейной скорости кровотока, ангиография с контрастированием дистального сосудистого русла).

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на симпозиуме «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (г. Москва, 2012), 23-й (XXVIII) Международной конференции Российского Общества Ангиологов и сосудистых хирургов (г. Санкт-Петербург, 2012), Научно-практической конференции Рязанского Государственного Медицинского Университета имен. акад. И.П. Павлова, посвященной Дню аспиранта (г. Рязань, 2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Здравоохранение: образование, наука, инновации" (г. Рязань, 2013), Инаугуральной Конференции Европейского Общества Сосудистых Хирургов (ЕБУБ) "Сосудистая биология, материалы и инженерия" (г. Франкфурт-на-Майне, Германия, 2013), II Всероссийской Научно-практической конференции с международным участием «Угловские чтения: Инновации в хирургии» (г. Санкт-Петербург, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 5 в центральной печати.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 205 страницах и состоит из следующих разделов: список сокращений, введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, экспериментальной и клинической частей с изложением и оценкой результатов собственных исследований, глав, посвященных оценке эффективности и безопасности применения геннотерапевтической индукции неоангиогенеза в отдаленном периоде, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 84 отечественных и 250 зарубежных источников. Материал иллюстрирован 45 рисунками, 49 таблицами, 11 из которых - в разделе приложение, и 4 клиническими примерами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Нерешенные проблемы лечения хронической ишемии нижних конечностей

Проблема эффективного лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей как основного проявления заболеваний периферических артерий, в т.ч. атеросклеротического генеза, является актуальной проблемой ангиологии и сосудистой хирургии в связи с большой распространенностью патологии, трудностями и длительностью лечения, высокой степенью инвалидизации данной категории пациентов, а, следовательно - в связи с важной медицинской, социальной и экономической значимостью [15]. Не смотря на высокий уровень развития современных методов оперативного вмешательства и лекарственных препаратов, арсенал средств в лечении больных с хронической ишемией нижних конечностей не представляется достаточным [20].

Реваскуляризация конечности является оптимальным методом купирования либо уменьшения ишемического синдрома, вызванного морфофункциональными изменениями артериального русла, и может быть проведена у всех больных с ЗПА при наличии соответствующих показаний и отсутствии противопоказаний к вмешательству [51]. Согласно принципу восстановления кровотока по пораженному сосуду, операции на аорте и артериях могут быть разделены на несколько групп: 1. реконструктивные операции; 2. создание реверсированного кровообращения; 3. нереконструктивные операции; 4. паллиативные операции [58].

Помимо традиционных артериальных реконструкций, т.е. «открытых» операций, выполняемых с целью удаления, замещения или шунтирования окклюзирующего артерии, восстанавливающих магистральный кровоток ниже оперированного сегмента [118], это различные эндоваскулярные вмешательства - реканализация, ангиопластика, эндопротезирование [27], в ряде случаев по эффективности не уступающие открытым артериальным

реконструкциям [22], а также так называемые «гибридные» вмешательства, сочетающие в себе открытые и эндоваскулярные методики.

Важнейшим препятствием к успешному восстановлению артериального кровотока при выполнении реконструктивных и эндоваскулярных вмешательств по поводу хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротической этиологии может стать многоуровневый тип поражения артериального русла [4, 65]. Это приводит к тому, что после реваскуляризирующих операций не происходит полной компенсации артериального кровоснабжения и явления хронической ишемии персистируют [106]. Выраженность поражения дистального русла часто оказывается препятствием для реконструктивной операции из-за крайне высокого риска развития ранних тромбозов. 27-43% больных с атеросклеротическими изменениями артерий нижних конечностей присутствует поражение дистального русла, т.е. стенозы или окклюзии основных магистральных артерий, расположенные в различных комбинациях ниже щели коленного сустава [44]. У больных с поражением дистального русла большое значение имеет не только степень поражения артерий путей оттока, но и наличие хорошо развитой сети коллатералей, непосредственно участвующей как в снижении общего периферического сопротивления, так и в тканевой трофике, улучшая тем самым результаты операций [64]. В зависимости от степени поражения дистального русла, сохранение конечностей в пятилетний период после таких вмешательств, составляет 43-82% [8, 12]. Успех подобных операций напрямую зависит от состояния путей оттока. При оценке состояния дистального русла оптимальной может быть классификация путей оттока Rutherford R.B. [267], в которой используется балльная система оценки от 0 до 10, где 0 баллов соответствует неизмененным артериям, а 10 баллов характеризует так называемый «слепой мешок». Существует мнение, что на каждый балл приходится до 10% риска развития тромбозов, которые могут возникнуть в послеоперационном периоде из-за высокого периферического сопротивления в условиях субтотального стеноза

или окклюзии артерий дистального русла [248]. Критическим значением при оценке путей оттока считается 8 баллов [57].

Кроме распространенного многоуровнего и дистального поражения артерий нижних конечностей, на эффективность восстановления кровообращения в конечности после реконструктивных операций влияет степень поражения микроциркуляторного русла в ишемизированных тканях [46, 61]. Выраженные функциональные изменения у больных с ХИНК обнаруживаются именно на микроциркуляторном уровне. В патологический процесс вовлекаются все компоненты микроциркуляцирного русла (МЦР), обусловливая процессы ремоделирования, изменения соотношения просвета сосудов МЦР, замедление неоангиогенеза, нарушение функции эндотелия [37, 72]. МЦР является функциональной системой, которая обеспечивает обменные процессы тканей и органов, соответствие с их физиологическими особенностями и конкретным функциональным состоянием. При облитерирующих заболеваниях сосудов нижних конечностей, как правило, развиваются системные и локальные расстройства микроциркуляции [51]. Расстройства системы микроциркуляции, а также нарушения механизмов регуляции кровотока оказывают влияние на патоморфологическую картину пораженных тканей [75] и коррелируют с клиническими особенностями течения заболевания. У больных с облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей отмечаются характерные особенности структуры капилляров: артериальный и венозный отделы закручены по спирали вокруг друг друга, переходный отдел в большинстве случаев выглядит по типу спичечной головки. Также выявляется полиморфизм в морфологии самих капилляров. Так, в морфоструктуре капилляров превалирует (по классификации морфологической конфигурации капилляров Bollinger А., 1982 [285]) тип «d» (более 50% наблюдений). Комбинации типов «dh» и «bd» встречаются реже [1]. Особенностью облитерирующего атеросклероза также является прогрессирующее уменьшение диаметра капилляров в зависимости от стадии ишемии. Изменения диаметров различных отделов капилляров, плотность

капиллярной сети, состояние периваскулярной зоны и скорость капиллярного кровотока объективно отражают структурно-функциональные изменения в микроциркуляторном русле. По данным компьютерной капилляроскопии нарушения микроциркуляции у больных с хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей выражаются в полиморфизме структуры капилляров, уменьшением размеров отделов капилляра, снижении плотности капиллярной сети на 20-60%, увеличении преваскулярной зоны на 10-30% и снижении скорости капиллярного кровотока на 30-60%, в зависимости от стадии ишемии [2]. У больных хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей происходит гипотрофия мышечных волокон с редукцией окружающих их капилляров [38].

При хронической ишемии, вызванной облитерирующим атеросклерозом, измененяется концентрация такого важного показателя, как сосудистый эндотелиальный фактор роста УЕвР. Показано, что максимальная концентрация УЕвР в сыворотке венозной крови нижней конечности наблюдается при легких стадиях ишемии (I и ПА), что отражает активность неоангиогенеза. Низкий уровень УЖтР определяется у больных с критической ишемией и у 42% пациентов с ПБ стадией ишемии, на фоне активации В№рЗ (проапоптотический белок), что характеризует усиление у этих пациентов катаболических процессов на фоне депрессии ангиогенеза [165]. Подобные изменения у этой группы больных носят стойкий, часто необратимый характер [81]. Вышеуказанные изменения, свидетельствующие об угнетении функции МЦР, можно объеденить под понятием «микроциркуляторная дисфункция». Микроциркуляторная дисфункция, с ее яркими морфо-функциональными изменениями при хронической ишемии, вызванной облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, наряду с изменением концентрации сосудистый эндотелиальный фактор роста УЕвР, является важным показателем, указывающим на тяжесть поражения. При перемежающей хромоте имеет место усиление кровотока в мягких тканях при определенном положении конечности в сравнении со

здоровыми лицами, в то время как кровоток по нутритивным капиллярам остается одинаковым. Данное явление может быть связано с функционированием артерио-венозных шунтов в ответ на ортостатическое положение, что приводит к исчезновению вено-артериального аксонного рефлекса и повышению шунтирующего кровотока [226]. Интересным является тот факт, что хирургическая реваскуляризация восстанавливает микроциркуляторную дисфункцию. Кровоток в мягких тканях при положении нижних конечностей на уровне сердца у больных с перемежающей хромотой до оперативного вмешательства ниже, чем у здоровых лиц. После же операции, кровоток в мягких тканей ускоряется в 1.79 раза, что полностью нивелирует первоначальную разницу [227]. Увеличение показателя шунтирования кровотока и сохранение его высокого значения после окклюзии свидетельствуют об артериовенозном сбросе у пациентов с окклюзионно-стенотическим поражением аорто-бедренного и бедренно-подколенного сегментов [55]. Функциональное состояние микроциркуляции тканей нижних конечностей у больных облитерирующими заболеваниями артерий определяется интегральным воздействием гемодинамических и реологических факторов. Состояние функционального резерва микроциркуляции в большей степени зависит от протяженности окклюзионных поражений артерий нижних конечностей и степени развития коллатерального русла. Среди гемореологических показателей значимое влияние на показатели тканевого кровотока имеет концентрация в крови свободного фибриногена [47]. У больных облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей при наличии критической ишемии отмечается значительное снижение тканевого кровотока в дистальных отделах конечности обусловленное, в большинстве случаев, снижением регионарного кровяного давления. В клинической практике, успешные восстановительные операции на магистральных сосудах сопровождающиеся повышением регионарного систолического артериального давления, приводят к увеличению тканевого кровотока, наиболее выраженного к 5-7 суткам после

операции. Отсутствие клинического улучшения состояния микроциркуляции в дистальном сосудистом русле после восстановительных операций свидетельствует или о неэффективности оперативного вмешательства, или о необратимых морфологических изменений в капиллярном русле [79]. Изменение состояния микроциркуляции у больных атеросклеротическим поражением сосудов нижних конечностей зависит не только от стадии процесса и уровня окклюзии, но также находится в зависимости от вегетативного тонуса. У больных с атеросклеротическим поражением сосудов нижних конечностей наиболее часто встречается симпатикотонический тип регуляции вегетативной нервной системы, при котором регистрируются наиболее плохие показатели микроциркуляции. Наиболее тяжелое поражение микроциркуляторного русла наблюдается у больных с симпатикотоническим типом вегетативной нервной системы в сочетании с гипокинетическим типом центральной гемодинамики [29].

Таким образом, характер и тяжесть поражения микроциркуляторного русла на фоне многоуровневого сосудистого поражения, наличия дистальной окклюзии, не смотря на наличие широкого спектра имеющихся методов хирургического лечения, являются главным препятствием к компенсации кровообращения у больных с ХИНК атеросклеротической этиологии, что обусловливает необходимость в поиске активной терапевтической тактики.

Терапевтический компонент лечения хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротической этиологии показан всем пациентам вне зависимости от локализации и распространенности сосудистого поражения, и назначается пожизненно [14]. После выполнения эндоваскулярных, открытых или гибридных оперативных вмешательств на артериях необходимость в консервативном лечении также сохраняется. В случаях, когда нет возможности достигнуть адекватной компенсации кровообращения хирургическими методами, возможно изолированное использование терапевтического лечения.

Согласно Трансатлантическому консенсусу (ТАБС-Н, 2007) и «Российским Национальным рекомендациям по ведению пациентов с патологией артерий нижних конечностей» (2013), лечебная тактика при лечении ХИНК должна быть в первую очередь обращена на коррекцию факторов риска.

Одним из ведущих направлений коррекции факторов риска является отказ от курения, что включает в себя модификацию поведения, никотин-заместительную терапию, терапию бупропионом) (Класс доказательности I) [51].

Другим направлением является контроль за уровнем липидов крови. Лечение ингибиторами ГМГкоэнзим А редуктазы (статины) показано всем пациентам с заболеваниями ЗПА для достижения целевого уровня липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) менее 100 мг/дл (Класс доказательности I). Лечение дислипидемии снижает риск развития нежелательных сердечно-сосудистых событий у пациентов с атеросклерозом. Однако клиническая картина тяжелого поражения артериального русла нижних конечностей не всегда строго коррелирует с изменениями липидного спектра крови и уровнем холестерина и ЛПНП [51].

Всем пациентам с ЗПА, как с ПХ, так и КИНК показан контроль уровня глюкозы крови (уменьшение уровня гликозилированного гемоглобина до 7%), а при наличии сахарного диабета - интенсивная терапия антигипергликемическими препаратам, либо инсулином, а также тщательный уход за кожей стоп и голеней (Класс доказательности I) [51].

Помимо контроля за уровнем глюкозы, важным направлением в коррекции факторов риска ЗПА является контроль уровня артериального давления (АД). Оптимальным у пациентов без сопутствующей патологии следует считать уровень АД менее 140/90 мм рт.ст., в то время как наличие таких состояний, как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, хроническая сердечная недостаточность, сахарный диабет и почечная недостаточность обусловливают необходимость поддержания цифр АД на

уровне менее 130/80 мм рт.ст. (Класс доказательности I). Целевыми препаратами являются ингибиторы АПФ, достоверно снижающие риск развития ИМ, инсульта и сосудистой смерти у пациентов с ЗПА [291].

Всем пациентам с ПХ показана эффективная физическая нагрузка -дозированная ходьба, то есть ходьба до появление почти максимальной боли (Класс доказательности I). Программа лечебной физкультуры рекомендуется в качестве первоначальной формы лечения пациентов с перемежающей хромотой как основного проявления ХИНК (Уровень доказательности А). Продолжительность занятий лечебной физкультурой составляет от 30 до 45 минут минимум, занятия проходят 3 раза в неделю, минимальный курс - 12 недель. Максимальная эффективность дозированной ходьбы проявляется через 1-2 месяца и сохраняется через 3 и более месяцев. Благоприятный эффект объясняется улучшением метаболизма скелетной мускулатуры, ее гипертрофией, а также улучшением функции эндотелия и в меньшей степени, формированием коллатерального кровообращения [326].

Помимо модификации факторов риска и дозированной ходьбы, консервативное лечение имеет следующие основные векторы: профилактика тромботических и сердечно-сосудистых осложнений (ИМ, инсульт, сосудистая смерть) путем длительного приема антитромбоцитарных агентов, прием фармацевтических препаратов комплексного и метаболического действия, препараты, используемые при лечении КИНК и нефармакологические средства, включающие в себя физиотерапию и санаторно-курортное лечение. Длительный, часто пожизненный прием лекарственных препаратов предполагает четкое соблюдение режима дозирования и приема препаратов, выполнение нефармакологических лечебных мероприятий, а также регулярное наблюдение у врача. «Приверженность к терапии» пациента является ключевым фактором, позволяющим добиться высокой эффективности лечения [69].

Антиагрегантная (антитромблоцитарная) терапия в виде приема аспирина в дозировке 75-325 мг/сутки, либо клопидогреля 75 мг/сутки показана

пациентам с атеросклерозом артерий нижних конечностей для снижения риска сердечно-сосудистых событий (Класс доказательности I). У пациентов с ЗПА пероральные антикоагулянты с целью профилактики нежелательных сердечно-сосудистых ишемических событий применяться не должны [102].

Целесообразным является назначение пациентам с ПХ ингибитора фосфодиэстеразы Ш - цилостазола с вазодилатирующим, метаболическим и дезагрегантным эффектом (Класс доказательности I). В дозировке 100 мг два раза в день препарат увеличивает ДБХ на 50-70 м по сравнению с плацебо по окончании лечения, в зависимости от вида тредмил-теста [142]. Цилостазол, однако, на территории Российской Федерации не зарегистрирован. Другим препятствием к его широкому применению служит необходимость отсутствия у пациента сопутствующей патологии в виде хронической сердечной недостаточности любого класса по классификации Нью-йоркского общества сердца (NYHA) [125].

Сулодексид (250 JIE перорально 2 раза в день), ранее показанный к применению у пациентов с КИНК, в настоящее время рекомендован пациентам с ПХ. У данной когорты пациентов судодексид увеличивает ДБХ до 95% при курсовом применении в сочетании с парентеральным введением (Класс доказательности ПА). Эффективность препарата объясняется комплексным воздействием на основные звенья патогенеза заболевания: коррекция дисфункции эндотелия, нормализация реологии крови и микроциркуляторного русла, повышение фибринолитической активности

[51].

Пентоксифиллин в дозе 1200 мг в сутки может рассматриваться как один из основных препаратов для увеличения МПД у пациентов с ПХ (Класс доказательности IIB). Пентоксифиллин улучшает микроциркуляцию и реологические свойства крови, оказывает сосудорасширяющее действие, блокирует фосфодиэстеразу и способствует накоплению цАМФ в клетках, что способствует минимальному, но статистически значимому увеличению

ДБХ на 21-29 метров и максимально проходимой дистанции на 43-48 метров [1871.

Перспективным направлением в комплексном лечении пациентов с ПХ атеросклеротической этиологии, исследуемым на кафедре ангиологии и сосудистой хирургии Рязанского Государственного Медицинского Университета, является коррекция дисфункции эндотелия, направленная на стимуляцию синтеза оксида азота (N0) клетками эндотелия. Дисфункция эндотелия выражается в повышенной проницаемости и адгезивности, а также увеличенной секреции прокоагулянтных и сосудосуживающих факторов, что может рассматриваться в качестве раннего этапа развития сосудистого поражения [31]. N0 является важным регулятором метаболизма клеток и играет важную роль в патогенезе эндотелиальной дисфункции [34]. Положительное влияние, направленное на коррекцию дисфункции эндотелия может иметь интермиттирующая пневмокомпрессия, в том числе у пациентов с критической ишемией нижних конечностей [76, 41, 85]. Другим вектором коррекции эндотелиальной дисфункции является применение препаратов группы ингибиторов ангиотензин-превращающих ферментов, преимущественно периндоприла [101, 137, 159, 186, 305], блокаторов рецепторов ангиотензина П, преимущественно, лозартана [3, 18, 30, 128, 129, 200, 275, 288], а также Р-адреноблокаторов, преимущественно небиволола [97, 114, 134, 164, 169, 213, 214, 222, 238, 239, 240, 303, 310, 311, 324]. Это особенно важно, учитывая высокую распространенность артериальной гипертензии, а также ишемической болезни сердца и хронической сердечной недостаточности у пациентов с ХИНК. Р-адреноблокаторов являются эффективными антигипертензивными препаратами и не противопоказаны пациентам с заболеванием артерий нижних конечностей [51]. Коррекция дисфункции эндотелия также возможна за счет стимуляции секреции N0 экзогенными факторами системы Ь - аргинин - N0 - гуанилатциклазы, в частности, при использовании предшественника оксида азота Ь - аргинина [49, 94, 140, 150, 299, 304, 334]. Эндотелиотропная терапия, направленная на

коррекцию эндотелиальиой дисфункции, является перспективной, однако требует большего количества контролируемых клинических исследований.

При лечении критической ишемии нижних конечностей (КИНК) при невозможности выполнения артериальной реконструкции, эндоваскулярной, либо открытой, терапевтический подход отличается от такового при лечении ПХ. Простаноиды, препараты простагландина El (PGE1) и простациклина 12 (PGI2), наиболее изучены и эффективны в лечении КИНК. Многочисленные исследования показали, что парентеральное их введение в течение 7-28 дней может уменьшить боли в покое и способствовать заживлению трофических язв, позволяет избежать или отсрочить ампутацию конечности (Класс доказательности ИВ, уровень доказательности А) [51].

Данные по эффективности гипербарической оксигенации, спинальной нейростимуляции, а также применяемых на территории России традиционных видов физиотерапии (лазеротерапия, магнитотерапия) в лечении КИНК являются противоречивыми, в связи с чем четких рекомендаций в отношении их применения не существует. Обнадеживающие данные получены в отношении проведения регионарного катетерного тромболизиса в комплексной терапии КИНК при диабетической ангиопатии. Целью локального тромболизиса у данной когорты пациентов служит лечение и профилактика микротромбообразования, стабилизация коагуляционных свойств крови [51].

Эффективное лечение пациентов с хронической ишемией нижних конечностей является актуальной проблемой практической медицины в связи с высокой морбидностыо, трудностями лечения, а, следовательно -чрезвычайно важной медицинской, социальной и экономической значимостью. Имеющиеся в наличии методы хирургического и терапевтического лечения не являются исчерпывающими. В TASC второго пересмотра (2007) уделяется особое внимания положениям, касающихся генотерапии ХИНК [193]. Международное сообщество (Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease) относит подобные

методики к категории перспективных в будущем способов лечения, чья эффективность на сегодняшний день в должной степени не доказана. Одно из авторитетнейших мировых медицинских сообществ, Американская кардиологическая ассоциация, относит методы генной терапии к классу IIb -нуждающихся в тщательной проверке с осуществлением плацебо-контролируемых исследований [87]. Российские сердечно-сосудистые хирурги и ангиологии в Национальных рекомендациях по ведению пациентов с патологией артерий нижних конечностей, 2013, относят применение геннотерапевтических конструкций к классу доказательности IIA [51]. Таким образом, существует отчетливая потребность в поиске и развитии новых способов лечения, способствующих компенсации кровообращения у больных с хронической ишемией нижних конечностей. 1.2. Общие принципы васкуло-, артерио- и ангиогенеза.

В постнатальном периоде рост сосудов происходит за счет двух разных механизмов: ангиогенез и артериогенез [185]. Несмотря на то, что оба этих процесса описывают формирование кровеносных сосудов из уже имеющихся сосудистых структур, имеет место отличие в действии инициирующих факторов и собственно процессе образования сосудов. В отличие от описанных механизмов, васкулогенез представляет собой образование кровеносных сосудов de novo из прогениторных эндотелиальных клеток (ПЭК). Первоначально полагали, что истинный васкулогенез происходит только в эмбриональный период. Недавно ПЭК были выделены из периферической крови и костного мозга и получены доказательства их участия в формировании новых сосудов во взрослом организме, что изменило взгляд на васкулогенез, как на процесс, относящийся только к эмбриональному развитию [318]. Васкулогенез тесно ассоциирован с ангиогенезом и является обязательным участником формирования новых сосудистых почек и неоваскуляризации [147], как физиологической (в ишемизированных тканях), так и патологической (в

опухолях) [138]. Таким образом, васкулогенез во взрослом возрасте происходит наряду с артерио- [251] и ангиогенезом [105].

Ангиогенез представляет собой образование новых капилляров из уже существующих сосудов, и собственно наличие ишемии является триггерным механизмом для запуска ангиогенеза. Гипоксия или ишемия индуцируют посредством активаторов транскрипции факторов ангиогенеза -индуцируемого гипоксией фактора-1а (ЮТ-1а), экспрессию ангиогенных факторов и прежде всего основного регулятора ангиогенеза - сосудистый эндотелиальный фактор роста УЕвР и его рецепторов.

Ген НШ-1А локализуется на 14 хромосоме (14д21-ц24), состоит из 15 экзонов и кодирует субъединицу ЯШ-1а. НП7 считается ведущим транскрипционным регулятором генов млекопитающих, ответственных за реакцию на недостаток кислорода, таким образом, ЮТ-1а - главный регулятор кислородного гомеостаза [261, 280]. ЮТ-1а вызывает транскрипцию генов, что впоследствии стимулирует адаптацию тканей к ишемии [268]. Он активируется в физиологически важных местах регуляции кислородных путей, обеспечивая быстрые и адекватные ответы на гипоксический стресс, включает гены, регулирующие процесс ангиогенеза, вазомоторный контроль, энергетический метаболизм, эритропоэз и апоптоз. Субъединица НШ-1А является кислородчувствительной, она имеет специфическую функцию в стимулированной гипоксией генной регуляции и является мишенью для кислородчувствительных сигнальных путей. Обе ЮТ-1а и ЮТ-2а субъединицы подвергаются быстрой гипоксической белковой стабилизации и соединяются с идентичной мишенью в последовательности ДНК, а в процессе эмбриогенеза НПМА играет непосредственную роль в контроле над васкуляризацией тканей [59]. Таким образом, при снижении напряжения кислорода в тканях повышается экспрессия фактора ННМа, регулирующего сосудистый эндотелиальный фактор роста УЕвР. Соответственно, НИМ а как правило ассоциируется с ангио-, а не с артериогенезом. Ни НПМа, ни Н1Р-2а - ассоциированная экспрессия УЕвР

не выявляются в тканях, где формируются коллатеральные артерии при экспериментальной ишемии конечностей [271, 301]. Однако, при использовании антагонистов УБвР в модели ишемии, наблюдались полное ингибирование артериогенеза и частичное ингибирование артериогенеза, в то время как повышенное содержание НПМа приводило к усилению формирования коллатерального русла [122, 281]. Таким образом, была продемонстрирована возможная роль ННМа и в артериогенезе.

УЕСР в свою очередь запускает пролиферацию эндотелиальных клеток и повышает экспрессию матричных металлопротеиназ (ММРб), которые необходимы для деградации базальной мембраны и окружающего внеклеточного матрикса (ЕСМ). Эндотелиальные клетки пролиферируют в виде либо отдельных ростков, формирующих просвет сосуда, либо выпячиваний капиллярной стенки в просвет сосуда, что заставляет капилляр разделиться на два новых сосуда [119]. Макрофаги могут также выделять матричные металлопротеиназы и таким образом участвовать в ангиогенезе за счет деградации внеклеточного матрикса, что делает возможным включить в процесс эндотелиальные клетки [231]. В свою же очередь артериогенез представляет собой структурное увеличение уже имеющейся артериальной сети до истинных коллатералей за счет активного роста, а не пассивной дилатации, вызываемой повышенным артериальным давлением. Важнейшим стимулятором артериогенеза является увеличение напряжения сдвига выше места окклюзии, обусловленное увеличением кровотока, что способствует экспрессии молекул адгезии клетками эндотелия и последующей аккумуляции моноцитов в стенке сосуда, секретирующих большое количество ФР, из которых основными регуляторами артериогенеза являются сосудистый эндотелиальный фактор роста УЕСР, РСР, а также РООР и СХС-хемокины [198]. Коллатеральным артериям свойственно увеличение в размере путем активной пролиферации и ремоделирования, таким образом, повышается их способность доставлять кровь к ишемизированным участкам. Не смотря на то, что артериогенез может предотвратить или разрешить

ишемию при стенозе или окклюзии проксимальных артериальных сегментов, рост коллатерального русла все же находится в зависимости от гемодинамики как изначального фактора. В процессе стабилизации и "взросления" вновь образованной незрелой сосудистой сети участвуют: 1) ангиопоэтин-1, подавляющий пролиферацию эндотелиальных клеток (ЭК), уменьшающий сосудистую проницаемость, способствующий привлечению перицитов; 2) тромбоцитарный фактор роста (РООБ), привлекающий перициты и гладкомышечные клетки (ГМК); 3) трансформирующий ФР-бета 1 (ТСБ-Ье1а 1), стимулируюший синтез белков матрикса. [56]. Ангиопоэтин-1 - фактор стабилизации сосуда, который регулирует формирование полноценного зрелого сосуда, привлекая гладкомышечные клетки и уменьшая проницаемость сосудов [117]. Ангиопоэтин-1 также подавляет пролиферацию ЭК и способствует привлечению перицитов [127]. В молекулярной биологии тромбоцитарный фактор роста РБСР представляет собой один из факторов роста, или белков, регулирующих рост и деление клеток. В особенности, он играет значительную роль в ангиогенезе, росте сосудов из уже существующих сосудистых клеток. РБвР является мощным митогеном для клеток мезенхимального происхождения, в том числе глиальных и что более интересно, гладкомышечных клеток [181, 183]. Трансформирующий фактор роста-бета 1 (ТвР-Ье1а 1) секретируется в биологически неактивной или латентной форме большинством типом клеток. Его активация происходит под влиянием интегринов и белков экстрацеллюлярного матрикса. Кроме того, ТСР-Ье1а1 является мощным регулятором иммунного ответа в сосудистой стенке, определяющим участие лейкоцитов и эндотелиальных клеток в воспалительных реакциях [313]. ТвР-Ье1а1 может принимать участие в регуляции воспалительных процессов, в том числе и в сосудистой стенке [272]. Уникальность данного ростового фактора состоит в плейотропной природе его действия: в зависимости от типа клеток он может проявлять свои про- или антиапоптотические свойства [189]. ТвР-В! в эндотелиальных клетках потенциирует развитие дозо-

зависимого апоптоза. В отличие же от про-апоптического эффекта ТвР-В 1 в эндотелиальных клетках, ТвР-В1 в гладкомышечных клетках ингибирует апоптоз [260]. В постнатальном организме стабильное состояние сосудов поддерживается тонким балансом между активаторами ангиогенеза и его ингибиторами, описанными ранее. Сдвиг этого баланса в сторону активаторов, как правило, кратковременный, приводит к активации ангиогенеза, например, при воспалении, заживлении ран, ишемии [56].

Таким образом, ангиогенез подразумевает рост сети капилляров из существующих капилляров путем почкования эндотелиальных клетокпри гипоксии. В свою очередь артериогенез подразумевает развитие и рост уже существующих артериол или артериальных анастомозов в стороны более крупных коллатералей при действии напряжения сдвига вследствие окклюзии артерии (рис. 1) [185].

Рис. 1. Схематичное изображение процессов ангиогенеза и артериогенеза по материалам I. Е. Hoefer, N. van Royen, M. M. Jost, 2006, с изменениями [185]: а. - ангиогенез, пусковой механизм гипоксия: 1). почкование сосуда, 2). капиллярная сеть, 3). слой эндотелиальных клеток; б. - артериогенез, пусковой механизм напряжение сдвига "shear stress": 1). окклюзия магистральной артерии, 2). слой эндотелиальных клеток, окруженных гладомышечными клетками

В физиологичных состояниях, небольшое количество крови течет по уже существующим сетям артериол. Закон Пуазейля, гласящий, что при течении вязкой жидкости через тонкую цилиндрическую трубку ее объем, протекающий через поперечное сечение трубки в 1 с, пропорционален разности давлений на единицу длины трубки и 4-й степени ее диаметра [62], показывает, что меньшее количество больших по диаметру коллатеральных артерий способно доставлять большее количество крови, чем многочисленные сосуды малого диаметра [185]. Артериальная окклюзия вследствие эмболии или медленно прогрессирующего стеноза создает градиент давления в сети артериол. Изначальный ответ к снижению перфузионного давления - это опосредованная действием оксида азота (NO) вазодилатация, что кратковремнно позволяет усилить перфузию [145]. Однако процесс артериогенеза также включает в себя структурную перестройку данных артериол в «шунтирующие» артерии. Не смотря на то, что гипоксия - инициирующий фактор в образовании капилляров, состояние коллатерального русла не зависит от наличия ишемии. Так, в эксперименте было установлено, что коллатеральные артерии эпикарда не связаны с ишемизированным эндокардом. Подобным образом, коллатерали образовывались в тканях бедра с неизмененной перфузией, в то время как капилляры формировались в ишемизированных мышцах голени в моделях ишемии на животных [98, 278]. Напряжение сдвига жидкости в данном случае регулирует острую фазу артериогенеза, что характеризуется активация эндотелия и пролиферацией эндотелиальных и гладкомышечных клеток. К примеру, при неизмененном кровотоке, напряжение сдвига в бедренной артерии равно 4.8 * 10л3 кгс/см2. При окклюзии же, кровоток в сети артериол увеличивается в 200 раз, таким образом напряжение сдвига достигает 889 * 10Л3 кгс/см2 [120]. Подобное увеличение напряжения сдвига вызывает активацию эндотелиальных клеток, что приводит к активации факторов транскрипции посредством механизмов реагирования на shear stress промотеров многочисленных генов, ответственных за артериогенез [312].

Далее, повышение напряжения сдвига приводит к стимуляции транскрипционных факторов [132], повышению уровня эндотелиальных молекул адгезии [246, 283], а также кратковременному повышению синтеза гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактора [217]. Тангенциальное напряжение сосудистой стенки, прямо пропорциональное внутрисосудистому давлению и обратно пропорциональное толщине сосудистой стенки, контролирует вторую фазу артериогенеза, а именно рост гладкомышечных клеток. Тангенциальное напряжение сосудистой стенки может быть нормализовано повышением толщины стенки сосуда, что происходит при давлении значительно меньшем, чем, например, в аорте, что в итоге приводит к остановке роста коллатералей еще до разрешения ишемии в дистальном русле [278]. Не смотря на то, что многочисленные коллатерали малого диаметра могут становиться заметными при ангиографическом исследовании спустя несколько дней после лигирования бедренной артерии в эксперименте, лишь немногочисленные коллатерали большего диаметра могут быть зарегистрированы спустя 6 месяцев [185]. Регресс многочисленных малых коллатеральных артерий в пользу развития крупных коллатералей возможно связан и регулируется напряжением сдвига. С ослаблением объемной скорости кровотока в коллатералях, испытывающих свое обратное развитие, возникает активная пролиферация интимы, что в итоге приводит к окклюзии [278]. Ангиогенез максимально может повысить кровоток в ишемизированной зоне в 1.5 - 1.7 раза, что не всегда может компенсировать окклюзию магистральной артерии. В свою очередь, артериогенез запускается напряжением сдвига (shear stress, сила, стремящаяся вызвать деформацию вещества путем сдвига вдоль плоскости, параллельной приложенному усилию [50], имеет место в тканях с нормальным напряжением кислорода и увеличивает скорость кровотока в 10 - 20 раз при обструкции крупных артерий [287]. Следовательно, ангиогенез возникает в зоне ишемии, в то время как артериогенез - в зонах с сохраненной перфузией проксимальнее участкам ишемии.

Таким образом, гемодинамические факторы играют большую роль в процессе роста или регресса коллатерального русла.

Инициация механизмов, реализующихся в ангио- и артериогенез, требует слаженной работы разнообразных клеточных структур, факторов транскрипции генов, хемокинов и их рецепторов, а также тонкого взаимодействия про- и антиангиогенных структур. Воспалительный и иммунный процессы играют важную роль в ангио- и артериогенезе [131, 184]. Взаимодействие моноцитов и макрофагов, Т-киллеров и тучных клеток делает возможным рост сосудов, секрецию факторов роста и монокинов для стимуляции и поддержки образования коллатеральной сети. Роль иммуннокомпетентных клеток широко освещена в научной литературе [230]. Ведущее значение принадлежит моноцитам и макрофагам. Макрофаги секретируют большое количество разнообразных протеаз, факторов роста и монокинов [220]. Циркулирующие в кровотоке моноциты прикрепляются к молекулам адгезии, находящимся на эндотелии, перемещаются на стенку растущей коллатеральной артерии [219] и дифференцируются в макрофаги [207]. Активированные макрофаги секретируют различные промотеры ангио-и артериогенеза, такие как УЕвБ, ¥в¥-2, ТвР-Ь и ЮТ-а [220]. Роль Т-киллеров в артериогенезе исследовалась в многочисленных экспериментах на животных моделях ишемии, результаты которых не были однозначными [191, 295, 314]. Суммируя данные, можно сказать, что подмножество Т-клеток, а именно клетки СБ 8+ вовлекают клетки СО 4+ в новообразование коллатералей путем экспрессии интерлейкина-16 (1Ь-16), что привлекает моноциты, таким образом инициируя процессы артериогенеза [212]. Тучные клетки, представляющие собой базофильные иммунокомпетентные клетки, также задействованы в ангио- и артериогенезе. Тучные клетки выделяют ТвР-Ь, УЕвР, БвР, а также матричные металлопротеиназы (ММРв) [152]. Тучные клетки присутствуют в адвентиции коллатералей в течение 6 недель с момента обструкции магистральной артерии и выделяют вазоактивные вещества, такие как гистамин и серотонин [322].

Другими важными клетками в ангио- и артериогенезе являются прогениторные эндотелиальные клетки (ПЭК), выделенные из костного мозга [149]. Главенствующую роль ЭПК играют в ангиогенезе. Их возможное влияние на артериогенез исследуется. Повышение уровня циркулирующих ЭПК наблюдается при ожогах, остром инфаркте миокарда, шунтирующих операциях на сердце и корелируют с повышенным уровнем VEGF в плазме [229]. ЭПК мобилизуются в ответ на возникшую ишемию и участвуют в пролиферации сосудов в области ишемизированных тканей [292]. В последние годы особый интерес в плане терапевтического ангиогенеза вызывают ПЭК, которые могут быть выделены из костного мозга, периферической и пуповинной крови. Показано, что in vitro они могут дифференцироваться в эндотелиальные клетки и кардиомиоциты, а при введении в зону инфаркта у экспериментальных животных стимулируют неоваскуляризацию и инкорпорируются в сосуды [318]. Другие клетки, выделенные из костного мозга, перициты, играют свою роль в артериогенезе и стимулируют рост сосудов. Они высвобождают VEGF, FGF-2 и MMPs, что способствует выживанию и миграции эндотелиальных клеток в процессе артериогенеза [56]. Среди клеточных механизмов регуляции ангио- и артериогенеза следует упомянуть и гладкомышечные сосудистые клетки (ГМК), распологающиеся между эндотелием и адвентицией артерий. Их пролиферация играет важную роль в артериогенезе. Также ГМК играют роль в стабилизации коллатерального русла путем секреции внеклеточного матрикса, что в конечном счете ингибирует пролиферацию эндотелия.

Другим важным фактором в ангио- и артериогенезе является семейство факторов раннего ответа Egr-1. Они участвуют в процессе структурного увеличения артериол и таким образом вовлечены в процесс артериогенеза [95, 144]. Экспрессия Egr-1 вызывается изменением напряжения сдвига, механическим повреждением, гипоксией, концентрации PDGF, а также факторов роста фибробластов 1 и 2 (FGF-1, FGF-2) [287, 205]. Повышение экспрессии Egr-1 наблюдается в клетках, связанных с артериогенезом,

включая эндотелиальные и гладкомышечные клетки, фибробласты и лейкоциты путем влияния на транскрипцию генов, ответственных за артериогенез, включая FGF-1, FGF-2, колоние-стимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-a), а также интерлейкин-2 (IL-2) и межклеточные молекулы адгезии-1 (ICAM-1) [287]. Таким образом, повышенная экспрессия Egr-1 стимулирует артериогенез [89].

Один из векторов исследований ангиогенеза направлен на стромальный фактор роста 1 (SDF)-1/CXCL12, представляющий собой члена семейства хемокинов с мощными ангиогенными свойствами, в эксперименте продемонстрировавшего мобилизацию эндотелиальных прогениторных клеток, таким образом усиливая ангиогенез в ишемизированных тканях [224]. Исследования (SDF)-lнаходятся на экспериментальном этапе. Хемокины (хемотаксичные цитокины) помимо важной роли в иммунной регуляции, воздействуют на ангио- и артериогенез [96, 284]. Наиболее исследованным хемокином, участвующим в артериогенезе, является моноцитарный хемотаксический фактор-1 (МСР-1). МСР-1 усиливает образование коллатеральной сети, что по-видимому связано с привлечением и накоплением в стенке коллатералей моноцитов и реализацией их действия [232].

В контексте взаимодействия про- и антиангиогенных структур важнейшими среди проангио- и артериогенных струтур являются сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF, фактор роста фибробластов-2 (FGF-2), фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующий фактор роста B1 (TGF-В1), фактор некроза опухоли-а (TNF-а) и гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF). VEGF, который как правило ассоциируется с регуляцией ангиогенеза, также оказывает влияние на артериогенез. VEGF отвечает за пролиферацию и миграцию эндотелия, а также образование просвета сосудов [157]. Рецепторы VEGF располагаются на гемопоэтических стволовых клетках, а также иммуннокомпетентных

клетках [302]. Участие VEGF в усилении артериогенеза выражается в привлечении макрофагов и моноцитов к растущим коллатералям [300]. Фактор роста гепатоцитов HGF представляет собой ангиогенный белок, который активирует фактор транскрипции Ets-1 через рецептор c-Met, что регулирует работу множества генов, вовлеченных в процесс ангиогенеза [234]. Экспрессия HGF, в отличие от экспрессии HIF-la, снижена в пораженных тканях пораженных у больных с хронической ишемией нижних конечностей. В доклинических экспериментах было доказано, что HGF вызывает бурный рост коллатералей при облитерирующем атеросклерозе [308]. Исследования показали, что трансгенная экспрессия ограничивается местом введения HGF. Таким образом, у HGF есть свойства, которые могут быть полезными для индукции ангиогенеза и следовательно улучшения перфузии в пораженной конечности [269]. FGF-2, главным источником которого являются периваскулярные макрофаги [197], реализует свою роль в артериогенезе за счет стимуляции пролиферации эндотелиальных и гладкомышечных клеток [112, 168]. Трансформирующий фактор роста-В1 также участвует в артериогенезе. Его экспрессия определяется в зонах формирования коллатеральных артерий, что влечет за собой активацию эндотелия, гладкомышечных клеток, моноцитов и макрофагов [111].

Еще одним фактором, участвующим в ангио- и артериогенезе, является фактор некроза опухоли-а (TNF-a), один из главных медиаторов воспаления. TNF-a реализует свое артериогенное действие за счет активации различных рецепторов [135]. Кроме того, TNF-a необходим для миграции и адгезии гемопоэтических стволовых клеток костного мозга к сосудистому эндотелию через механизм, опосредованный эндотелиальной NO-синтазой [146]. Говоря о стимуляции пролиферации и дифференциации гемопоэтических клеток, следует отметить важное влияние на этот процесс и гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (GM-CSF) [176]. Помимо этого, GM-CSF мобилизирует ПЭК и повышает выживаемость моноцитов, также участвующих в процессах ангио- и артериогенеза [199].

Среди антиангиогенных факторов естественного происхождения универсальными свойствами обладает ангиостатин [100]. Ангиостатин -природный ингибитор ангиогенеза, который имеет большой период полужизни и действует подобно гормонам, системно ингибируя пролиферацию эндотелиальных клеток. Ангиогенин и плазминоген циркулируют в плазме в высоких концентрациях. Ангиогенин (особенно когда связывается с актином), стимулирует активатор плазминогена тканевого типа с образованием плазмина из плазминогена [188]. Эластаза расщепляет плазминоген с образованием ангиостатина - мощного ингибитора ангиогенеза. Взаимодействие между ангиогенином, плазминогеном, активатором плазминогена, эластазой и ангиостатином, очевидно, представляет собой регуляторную систему, способную обеспечить равновесие между ангиогенезом и анти-ангиогенезом [43].

Другим важным антиангиогенным фактором является тромбоспондин. Тромбоспондин - один из главных ингибиторов ангиогенеза, влияющий на адгезию и рост эндотелиальных клеток [252]. Это гликопротеин внеклеточного матрикса, синтезируемый различными типами клеток, в том числе эндотелиальными и некоторыми опухолевыми. Он играет важную роль в агрегации тромбоцитов, регулирует адгезию и пролиферацию эндотелиальных клеток [325].

Помимо ангиостатина и тромбоспондина, выраженным антиангиогенным действием обладают матриксные металлопротеиназы — семейство внеклеточных цинк-зависимых эндопептидаз, способных разрушать все типы белков внеклеточного матрикса. ММР играют роль в ремоделировании тканей, ангиогенезе, пролиферации, миграции и дифференциации клеток, апоптозе, сдерживании роста опухолей. Матриксные металлопротеиназы задействованы в расщеплении мембранных рецепторов, выбросе апоптозных лигандов, а также в активации и деактивации хемокинов и цитокинов [215].

1.3. Терапевтический ангиогенез в лечении хронической ишемии нижних конечностей

1.3.1. Общие понятия «терапевтического ангиогенеза»

Индукция ангиогенеза - один из современных, принципиально новых по механизмам действия и перспективных для дальнейшего изучения и использования подходов в лечении пациентов с хроническими ишемическими поражениями тканей (в т.ч. с хронической ишемией нижних конечностей). Особое значение здесь отводится терапевтическому ангиогенезу, то есть направленной индукции новообразования капилляров от посткапиллярных венул, активацию эндотелиальных клеток, экспрессию в них протеаз, деградацию внеклеточного матрикса, пролиферацию и миграцию ЭК, образование ими первичных высокопроницаемых сосудистых структур, последующую стабилизацию и "взросление" этих структур с привлечением перицитов и гладкомышечных клеток и организации их в сложную трехмерную сосудистую сеть [56,121].

При различных изменениях в гомеостазе, то есть физиологических и патологических состояниях организма, основным стимулом к ангиогенезу является недостаток кислорода. При многих патологических состояниях наблюдается активизация развития кровеносных сосудов, что может рассматриваться как компенсаторная реакция, направленная на изменение условий кровообращения. При одних заболеваниях активность расширения коллатерального кровообращения играет истинно компенсаторную роль. На определенном этапе эволюции патофизиологического процесса ангиогенез может приобретать черты патологической компенсации [32].

Терапевтический ангиогенез представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации [45]. Это сложный процесс, регулируемый тонким взаимодействием множества факторов, их строго скоординированной во времени и пространстве работой.

У людей существует врожденная способность образовывать коллатеральные сосуды для создания естественных шунтов при артериальных окклюзиях. Имеется большое разнообразие для реализации подобного явления, что может быть легко продемонстрировано неодинаковой реакцией пациентов к окклюзии артерий подвздошного или бедренного сегментов. У некоторых больных может возникать острая, угрожающая потерей конечности или даже жизни, ишемия, требующая немедленного вмешательства, в то время как у других лиц может развиться перемежающая хромота или асимптомное течение заболевания. Эмболия подвздошных или бедренных артерий, как правило, вызывает острую артериальную недостаточность в связи с отсутствием развитого коллатерального русла, с другой стороны при медленном прогрессировании заболевания, от стеноза к окклюзии, существует достаточное количество время для формирования коллатеральной сосудистой сети [179]. Наличие проксимальной окклюзии не делает невозможным наличие периферических пульсов (например, отсутствие пульсации на задних большеберцовых артериях при окклюзии общей бедренной артерии): у некоторых пациентов с высокой окклюзией периферическая пульсация имеет место быть, что связано с выраженным коллатеральным кровотоком. Таким образом, оценка и знание факторов, ответственных за подобного рода явление, являются решающими в разработке новых методов лечения ишемии тканей.

Основные векторы терапевтического ангиогенеза - это применение рекомбинантных факторов роста (постгеномные технологии), клеточная терапия и генная терапия. Геннотерапевтические метода индукции ангиогенеза являются наиболее изученными, в то время как постгеномные и клеточные технологии в лечении ХИНК находятся большей частью на экспериментальной стадии изучения [78]. 1.3.2. Применение рекомбинантных факторов роста

Новые знания, появившиеся за последние 20 лет, дали понимание процессов регуляции ангиогенеза и позволили идентифицировать медиаторы,

ответственные за новообразование сосудов в ишемизированных тканях. Эксперименальные исследования показали, что применение рекомбинантных ангиогенных факторов роста, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF [306] и основный фактор роста фибробластов FGF [151] стимулирует рост коллатералей и способствует реваскуляризации ишемизированных конечностей в экспериментах на животных. Проблематичным являлось поддержание эффективной концентрации рекомбинантных факторов роста в ишемизированных тканях [180].

Первые неконтролируемые клинические исследования у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и больных с ХИНК, в которых использовали рекомбинантные белки (VEGF-165, FGF-1 и FGF-2), дали весьма обнадеживающие предварительные результаты по эффективности. В 2002 году в США были опубликованы результаты применения рекомбинантного фактора роста фибробластов 2 (rFGF-2) у 190 пациентов с перемежающей хромотой. Первичным критерием эффективности послужила динамика пикового времени ходьбы в срок 3 месяца от начала лечения. В результате лечения было зарегистрировано увеличение пикового времени ходьбы на 1,77 минут и 1,54 минуту при одно- и двукратном введении исследуемого препарата соответственно. Применение rFGF-2 было безопасным, однако трансфекция препарата строго ограничивалась местом введения препарата [110].

Дальнейшие контролируемые клинические исследования разнообразных факторов роста, включая VEGF, FGF-1, фактор роста гепатоцитов в лечении больных ХИНК показали, что подобный подход в лечении является безопасным, однако очевидных положительных результатов получено не было.

Более того, сомнительными представлялись "качество" новообразоованных сосудов и возможности пролиферативных свойств несосудистых клеток.

Результаты последующих двойных слепых плацебо-контролируемых исследований также не были оптимистичными [56, 293, 331]. В двух больших исследованиях, в которых тестировали внутрикоронарное введение рекомбинантных ФР (VEGF в исследовании VIVA у 178 больных ИБС, не являющихся оптимальными кандидатами для хирургической или эндоваскулярной реваскуляризации; FGF-2 в исследовании FIRST у 337 аналогичных больных) не удалось обнаружить различий с результатами в группах плацебо, так как и в контрольных, и в опытных группах отмечено значительное повышение толерантности к физической нагрузке (VIVA, FIRST) и перфузии миокарда (FIRST) через несколько месяцев после процедуры.

Дальнейшие поиски были продолжены в ходе исследования TRAFFIC (терпевтический ангиогенез с рекомбинантным фактором роста фибробластов 2 у больных с перемежающей хромотой). В исследовании TRAFFIC изучалась возможность двух интра-артериальных инфузий FGF-2 улучшения перфузии ишемизированных тканей нижних конечностей у больных с перемежающей хромотой. Сто девяносто пациентов с перемежающей хромотой атеросклеротической этиологии были рандомизированы на 3 группы. В группе активной терапии больным проводили интра-артериальные билатеральные инфузии FGF-2 30 мкг/кг веса тела в первый и 30-й день исследования. Вторая группа получала инъекции FGF-2 в двойной дозе (60 мкг/кг), в третьей группе были инфузии плацебо. Первичной конечной точкой исследования был максимальное время безболевой ходьбы на 90-й день исследования. К 90 дню исследования, максимальная дистанция ходьбы увеличилась в первой группе на 1.77 мин, во второй группе - на 1.54 мин, в группе плацебо - на 0,60 мин. Исследователи сделали вывод, что после однократной инфузии FGF-2 отмечалось увеличение времени безболевой ходьбы у получавших FGF-2 в первые 3 мес нивелировалось через 6 мес за счет увеличения времени безболевой ходьбы в группе получавших плацебо. Тем не менее результаты

этого исследования вселили некоторый оптимизм относительно возможности использования рекомбинантного FGF-2 при КИНК [56]. Возможно, неудачи контролируемых исследований по терапевтическому ангиогенезу с помощью рекомбинантных ФР были обусловлены неправильно выбранным способом введения фактора. Рекомбинантные белки имеют короткий период полужизни в кровотоке, к тому же показано, что при внутрисосудистом способе введения очень небольшая часть белка задерживается в мышечной ткани [209]. Для эффективного использования рекомбинантных ФР необходимо их локальное введение в миокард или скелетные мышцы в виде комплексов с матриксными белками, обеспечивающими длительное локальное высвобождение фактора.

В исследовании «Регионарный Ангиогенез с помощью VEGF» (RAVE) выполнялись внутримышечные инъекции VEGF на основе аденовирусного вектора больным с перемежающей хромотой на фоне ЗПА с односторонним поражением. Введение субстанции не оказалось эффективным и ассоциировалось с развитием периферических отеков [262]. Рекомбинантный VEGF индуцирует рост сосудов, которым свойственны гиперпроницаемость и провоспалительные качества; для стабилизации и дальнейшего роста подобных сосудов могут потребоваться дополнительные медиаторы, такие как ангиопоэтины и тромбоцитарный фактор роста [166]. В свою очередь члены семейства FGF оказывают мощное стимулирующее действие на митоз нескольких типов клеток, что может вызывать локальный фиброз и стать причиной роста новообразований.

Увеличение числа методик применения ангиогенных факторов, используемых для терапевтического ангиогенеза, а также подбор оптимальных сочетаний и режимов их введения могут способствовать повышению эффективности лечебной тактики в лечении хронической ишемии тканей [286]. Однако требуются дополнительные исследования в области безопасности и эффективности применения рекомбинантных факторов роста в индукции неоангиогенеза.

1.3.2. Клеточная терапия

Следующее направление терапевтического ангиогенеза в лечении хронической ишемии конечностей — применение клеточной терапии [17, 210, 247]. В большинстве контролируемых испытаний получены достоверные по ее использованию результаты для лечения острого инфаркта миокарда (ИМ), хронической сердечной недостаточности и хронической ишемии нижних конечностей [103, 190, 194, 196, 203, 211, 333]. Основоположниками использования клеточной терапии в лечении сердечно-сосудистых заболеваний в России можно считать академиков РАМН JI. А. Бокерия, Ю. JI. Шевченко, профессора С.А. Матвеева, внесших ценный вклад в становление клеточной терапии и разработку клеточных технологий в лечении ишемической болезни сердца и хронической сердечной недостаточности [7, 9, 52, 77], а также член.-корр. РАМН Хубулава Г. Г., способствовавшего внедрению клеточной терапии в лечение хронической ишемии нижних конечностей [28, 80].

В разные годы экспериментальная клеточная терапия имела различные направления. В 2004 году Н. Haider и соавт. сообщили об эффективности скелетных миобластов в лечении сердечно-сосудистых заболеваний, в частности, в отношении миокардиальной регенерации. Несмотря на положительные результаты, о которых сообщают исследователи, в последующем широкого распространения препарат на основе скелетных миобластов не получил [108], в том числе в отношении лечения хронической ишемии нижних конечностей.

Большинство исследований по экспериментальной и клинической терапии ишемии миокарда и хронической ишемии нижних конечностей основано на использовании прогениторных эндотелиальных клеток (ПЭК). После первого описания ПЭК, сделанного Т. Asahara с соавт. в 1997 г. [202, 167], к настоящему моменту опубликовано уже более 800 научных статей о предполагаемой роли ПЭК в процессе ангиогенеза [148]. В ответ на созданную в эксперименте ишемию конечностей было показано увеличение

числа циркулирующих ПЭК с их внедрением в капилляры и артериолы с дальнейшей дифференцировкой в клетки эндотелия с последующим формированием новых сосудов [199, 229]. В условиях ишемии сосудистый эндотелиальный фактор и фактор роста фибробластов (УБвР, РвР), связываются с рецепторами УЕСР-И2 и УЕСР-Я1 клеток и обеспечивают миграцию ПЭК в зону повреждения. УЕвР, таким образом, активирует пролиферацию и дифференцировку эндотелиальных клеток, реализуя, тем самым, ангиогенный эффект [116, 255]. В неоваскуляризации участвуют ПЭК с маркерами СЭ34+ стволовых клеток периферической крови взрослых после их мобилизации из костного мозга [163].

Перспективным направлением в лечении хронической ишемии является применение мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК), в отношении которых доказан высокий пролиферативный потенциал и способность к самообновлению, а также способность секретировать широкий спектр ангиогенных и анти- апоптотических факторов роста (УЕвР, КЮР, ЬРвР, 8БР-1 и др.) [233]. Использование ММСК, полученных из костного мозга, при внутримышечном, либо внутриартериальном введении, способствовало усилению реваскуляризации ишемизированной конечности в остром эксперименте на мышах [192, 228, 279]. Похожие данные были получены при создании модели ишемии задних конечностей у крыс, которым выполнялась внутриартериальная, либо внутримышечная имплантация ММСК, преинкубированных Ог [273, 332].

Сложности, связанные с проведением клеточной терапии с использованием ПЭК (трудность в получении достаточного количества клеток) и ММСК (болезненность процедуры забора костного мозга), дали основание разработке новых методик проведения клеточной терапии. Одним из таких направлений является использование жировой ткани с выделением из нее клеток стромально васкулярной фракции (стромальные клетки жировой ткани - СКЖТ), способных дифференцироваться не только в адипоциты, но и клетки эндотелия, а также хондробласты, остеобласты и

миобласты [141, 235]. К углубленному изучению и практическому применению этого типа стволовых клеток подошли только в последние годы благодаря усовершенствованию технологий липосакции и клеточных культур, позволивших выделять клетки с мультипотентными свойствами из обработанного липоаспирата [235]. СКЖТ свойственны высокая пролиферативная способность, наличие маркеров стволовых клеток (С034+ для человека) и отсутствие высокоспецифичных маркеров адипоцитов [297]. СКЖТ экспрессируют и секретируют различные митогенные, антиапоптотические и ангиогенные факторы, такие как НвР, ТвБ, РвР, УЕСБ, Аг^-1 [221]. СКЖТ адаптированы к условиям ишемии, причем способность продуцировать вышеуказанные факторы роста в подобных условиях многократно возрастает, что дает возможность использовать данные клетки для индукции ангиогенеза и восстановлению перфузии в ишемизированных тканях [192]. Так, в экспериментальной модели хронической ишемии у тимус-дефицитных мышей линии ЖЮ/БСГО введение СКЖТ в хвостовую вену через сутки после резекции бедренной артерии препятствовало развитию некротических изменений и восстанавливало кровоток в ишемизированной конечности [74].

В 2002 г Е. Та1е18Ы-Уиуата с соавт. были опубликованные данные по использованию аутологичной клеточной трансплантации - мононуклеаров костного мозга (МНК) в качестве метода терапевтического ангиогенеза. В открытом рандомизированном контролируемом исследование были включены 2 группы больных, из аспирата костного мозга которых была выделена фракция МНК С034+, которая далее вводилась в икроножные мышцы ишемизированной конечности. Пациенты были разделены на 2 группы. Пациентам с унилатеральным поражением вводились МНК, выделенные из костного мозга. Пациентам с билатеральным поражением в икроножные мышцы одной конечности вводили МНК из костного мозга, а в мышцы другой вводили гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), полученные из периферической крови больного без стимуляции

гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ). У пациентов первой группы в сроки от 1 до 6 месяцев выявлено купирование болей в покое, увеличение дистанции безболевой ходьбы, транскутанного напряжения кислорода и ЛПИ. У пациентов второй группы на стороне инъекций нестимулированных CK периферической крови положительных эффектов не наблюдалось, что может быть связано со значительно большим содержанием ГСК в костном мозге (содержание CD34+ ГСК составляет до 2,4% от общего числа пересаженных МНК) [307].

Оптимистичные прогнозы в отношении BMMNC подтвердились в последующих исследованиях, где в качестве контроля выступали нестимулированные мононуклеарные клетки периферической крови (PBMNC), показавшие неудовлетворительные результаты.

В дальнейшем количество исследований, посвященных клеточной терапии хронической ишемии увеличивалось, однако большинство из них включало в себя малое число наблюдений, а группы контроля отсутствовали. Однако взятые вместе результаты клеточной терапии свидетельствовали об улучшении перфузии конечности (рост ЛПИ на 0,1-0,2 и ТКНК на 10-20 mmHg 02) и клинической эффективности метода, проявляющейся в заживлении трофических язв и увеличении дистанции безболевой ходьбы на 100-200 м [213].

В то же время достаточно хорошо обоснована концепция артериогенеза, в которой участвуют некоторые дифференцированные, объединенные моноцитарным фенотипом типы клеток костного мозга, мигрирующие в периваскулярные пространства коллатеральных сосудов и обеспечивающие ангиогенез за счет реализации ангиогенных факторов роста.

В 2007 P.P. Huang с соавт. сравненили результаты лечения 2х групп пациентов: первой (72 пациента) вводились G-CSF стимулированные PBMNC, второй (75 пациентов) - BMMNC. В обеих группах получено одинаковое увеличение перфузии и уменьшение ишемии [264]. По современным представлениям, терапевтический эффект лечения ЗПА

основан на применении мобилизированных PBMNCs, С0133+-клеток [253] или высоко очищенной фракции мобилизированных G-CSF С034+-клеток периферической крови [109].

Пуповинная кровь является доступным и полноценным источником стволовых клеток-предшественниц, обладающих высокой пролиферативной способностью [236, 237]. Данные клетки обладают потенциалом для быстрого самовоспроизведения и дифференцировки, а также существует возможность длительного хранения стволовых клеток пуповинной крови в специализированных учреждениях для возможного последующего использования. Несмотря на аллогенность материала, стволовые клетки пуповинной крови обладают меньшим риском иммунного отторжения у реципиента [93]. Выделенные из пуповинной крови клетки CD34+ и CD 133+ способны дифференцироваться в зрелые эндотелиальные и мышечные клетки, и, таким образом, следовательно, стимулировать неоваскуляризацию ишемизированной скелетной мышечной структуры [315].

Одним из новейших направлений в клеточной терапии является использование эндометриальных регенеративных клеток (ЭРК). В 2004 году R.W. Chan и соавт. обнаружили присутствие в ткани эндометрия небольшого количества эпителиальных и стромальных клеток, обладающими клоногенными свойствами [123]. Описанные авторами клетки по набору экспрессируемых (CD9, CD44, CD73, CD105) и отсутствующих (CD45, CD34, CD19) на их мембране маркерных антигенов были отнесены к клеткам с преобладанием свойств мезенхимальных стволовых клеток. В 2008 году группа A.N. Pate, изолировали ЭРК из менструальной крови [156, 245, 258, 266]. В экспериментальных моделях ишемии конечностей у мышей было показана клиническая эффективность ЭРК в группе животных, получавших инъекции ЭРК в целевую конечность по сравнению с группой контроля: на 14 сутки после начала эксперимента у всех животных контрольной группы зарегистрировано развитие некрозов, в то время как конечности животных контрольной группы оставались интактны [92]. Предварительные данные

экспериментальных исследований дают основание предполагать возможность использования ЭРК в стимуляции ангиогенеза у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей.

Несмотря положительные результаты проведенных экспериментальных и клинических исследований, на данный момент клеточная терапия хронической ишемии нижних конечностей не вошла в клиническую практику. Среди причин недостаточной эффективности клеточной терапии -гибель значительного количества клеток после трансплантации в поврежденную и ишемизированную ткань.

Другой проблемой в сфере клеточной терапии являются трудности в получении достаточного количества клеток для клинических целей. Также в настоящее время не полностью изучены механизмы достижения клинических эффектов при использовании клеточной терапии: лечебный эффект может быть обусловлен как дифференцировкой стволовых клеток в зрелые специфичные типы клеток, так и секрецией ими факторов роста, оказывающих специфическое действие, что и определяет ангиогенную эффективность клеточной терапии.

В настоящее время ведутся испытания по созданию генетически модифицированных клеток, что позволяет объединить достоинства методик генной и клеточной терапии. Генные манипуляции с клетками, а именно получение и использование клеток, экспрессирующих и гиперэкспрессирующих лечебные факторы, позволяют уменьшить необходимую для трансплантации терапевтическую дозу клеток и повысить эффективность клеточной терапии [56].

Таким образом, требуются крупные рандомизированные плацебо-контролируемые клинические исследования эффективности и безопасности применения клеточной терапии в лечении хронической ишемии нижних конечностей, которые определят роль и место клеточной терапии в стандартизированной схеме лечения.

1.3.3. Генная терапия

1.3.3.1. Общие принципы генной терапии хронической ишемии нижних конечностей

Британский Консультативный комитет по генной терапии в 2004 году дал следующее определение генной терапии: "Намеренное введение нуклеиновых кислот в соматические клетки с целью лечения, профилактики или диагностики заболеваний". Еще в 1948 году гипотетически было предположено наличие химического «фактора X», ответственного за развитие сосудов при диабетической пролиферативной ретинопатии [225]. В 1963-м году Дж. Ледерберг писал: "Мы можем предвосхитить... замену хромосом и их участков. Это будет лишь вопросом времени... когда возможным станет внедрение полинуклеотидных последовательностей путем химических механизмов".

Позднее в опухолях был обнаружен фактор новообразования сосудов -tumor angiogenesis factor (TAF) [161, 162], а в 1983 в опухолях выделен фактор, обеспечивавший повышение проницаемости сосудистой стенки -«фактор проницаемости сосудов» (VPF - vascular permeability factor) [317]. Фактор VPF не связывали с физиологическими васкуло-, артерио- и ангиогенезом, предполагая, что он играет роль лишь в патологических процессах, однако вскоре после описания «сосудистого эндотелиального фактора роста» (VEGF) было установлено, что и VPF, и VEGF кодируются одним геном и образуются в результате альтернативного сплайсинга [319, 320, 321]. Эксперименты в сфере генетики в 1980-е гг. доказали, что существует возможность лечения генетических нарушений путем введения генной конструкции [204]. Изначально исследования в сфере генной терапии основывались на следующем принципе: если "неисправный" ген вызывает заболевание, то, заменив его на "исправный", возможными станут либо контроль, либо профилактика заболевания [329]. С момента первого клинического испытания по трансферу генов, проведенному в 1989 [172],

было одобрено более 1700 клинических исследований по всему миру, большинство из которых относятся к 1/11 фазам (рис. 2) [254].

□ Фаза I □ Фаза 1/П □ Фаза П □ Фаза II/III

О Фаза III □ Фаза IV ■ Single subject

Рис. 2. Распределение исследований по генной терапии по фазам проведения в 2013 году по данным The Journal of Gene Medicine, © 2013, John Wiley and Sons Ltd [254]

Разработка технологии создания рекомбинантной ДНК в 1990-е сделала возможным применение генной терапии. Вскоре были выявлены заболевания, где возможно применение генной терапии. Одной из таких сфер стали заболевания сердечно-сосудистой системы, относящиеся к мультигенным поражениям. За последние 15 лет, прошедшие с момента первого использования генной терапии у больных с облитерирующими заболеваниями артерий, накоплен определенный опыт лечения геннотерапевтическими методами различных форм хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК) [180]. Методы генной терапии в части терапевтического ангиогенеза показали наибольшую эффективность.

Для разработки геннотерапевтических препаратов в лечении ХИНК используются гены наиболее известных факторов, в различной степени участвующих в ангиогенезе: сосудистый эндотелиапьный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF), гепатоцитарный фактор роста

(HGF); фактор, полученный из стромальных клеток (SDF), ангиопоэтин (ANG), индуцированный гипоксией фактор-1а (HIF-la) [113, 115, 242].

Наиболее исследованным геном на данный момент является ген фактора VEGF. Первое клиническое исследование VEGF было начато в 1994 г. Джеффри Иснером [104]. В этом исследовании плазмидный вектор, кодирующий ген фактора VEGF165, был помещен в полимерный гидрогель, нанесенный на баллон катетера для ангиопластики. В исследование было включено 22 пациента с язвенно-некротической стадией хронической ишемии нижних конечностей. Через 1 месяц после начала лечения у 3-х пациентов, получивших 1000 мкг плазмидной конструкии в гидрогеле, было зафиксировано новообразование сосудов в области нижней трети голени и стопы, с последующим исчезновением болей в покое [201]. Далее было проведено клиническое исследование внутримышечного введения плазмиды, кодирующей ген VEGF 165, максимально близко к зоне ишемии у 9 пациентов с IV стадией хронической ишемии (по А.В.Покровскому -Фонтейну) [136]. Результаты лечения оказались обнадеживающими: у 8 пациентов зарегистрирован рост систолического давления крови в целевой конечности (в среднем с 53+4,8 до 66+4,6 при р=0,008), лодыжечно-плечевого индекса с 0,33+0,05 до 0,48+0,03 на 12-ой неделе наблюдения (р=0,17). У всех пациентов, получивших плазмидную конструкцию p-veg/165, при ангиографии было показано развитие новых коллатералей диаметром до 800 мкм. У 3-х пациентов после лечения боли в покое не регистрировалось, у 4-х произошло заживление язвенно-трофических дефектов [173]. В России на базе ССХ им. А.Н. Бакулева и Института биологии гена РАН во главе с акад. РАМН Бокерия J1. А. в разные годы проводились исследования эффективности и безопасности генной терапии. Так, в 2004 были опубликованы результаты исследования эффективности плазмидной конструкции, содержащей ген VEGF165 человека, у 10 пациентов с хронической ишемией нижних конечностей Нб - IV стадиии заболевания по A.B. Покровскому - Фонтейну с преимущественно односторонним

поражением, при невозможности проведения реконструктивного вмешательства и/или анатомо-функциональной недостаточности коллатерального кровотока. Побочных эффектов при введении генного препарата зафиксировано не было, клинический эффект в виде увеличения дистанции безболевой ходьбы, транскутанного напряжения кислорода, увеличение перфузии ишемизированной конечности по данным лазерной допплерофлоуметрии через 3 месяца от начала лечения был зафиксирован у 100% больных [35].

Российскими учеными проводилось тестирование генно-инженерных конструкций, содержащих гены, кодирующие не только сосудистый эндотелиальный фактор роста, но ангиогенин и фактор роста фибробластов, как изолированно, так и в сочетании с хирургической коррекцией в виде реконструктивных операций на артериях нижних конечностей: в ходе исследований была показана безопасность использования сверхскрученной плазмиды, кодирующей ген УЕСР165, в комплексном лечении пациентов с КИНК в плане улучшения отдаленных результатов реконструктивных вмешательств [13].

В декабре 2011 г. в США завершилась первая фаза клинических испытаний препарата на основе ДНК-плазмид с УБвР-А, показанного для лечения ХИНК, доказавших безопасность препарата [155], что согласуется с результатами целого ряда аналогичных клинических исследований, проведенных за последние 15 лет [21].

Другим терапевтическим геном, включаемым в состав плазмид фармкомпозиций, является ген РвР. В частности, в ряде клинических исследований была доказана безопасность препаратов с ДНК-плазмидами с РСР-1 при их внутримышечном введении в ишемизированную область при ХИНК, в том числе критической [218, 241]. К настоящему времени завершилась 1П фаза клинических испытания генно-терапевтического препарата с РвР-1, проведенных в 32 странах (в том числе Россия, США, Великобритания, Германия, Франция и др.) при лечении пациентов с

критической ХИНК с язвенно-некротическими изменениями. При статистическом анализе результатов на сроке наблюдения в 1 год не было выявлено статистически значимых различий между целевой и контрольной группами в плане выживаемости пациентов и частоты ампутаций [115].

Другие научные группы исследуют эффективность геннотерапевтических препаратов с геном HGF: в США, Корее [277] и Китае [276] проходит П фаза клинических исследований фарм-композиции на основе ДНК-плазмид с геном HGF. Завершилась III фаза клинических исследований аналогичного по составу препарата Collategene (AnGes Inc.), введение которого было выполнено 27 пациентам с критической ишемией нижних конечностей. Через 12 нед. у 70% из пациентов указанной группы наблюдалось статистически значимое снижение болей в покое, уменьшение размеров язвенных поражений кожи, увеличение лодыжечно-плечевого индекса и улучшение качества жизни [263].

В качестве целевого гена ряд разработчиков исследуют нуклеотидную последовательность, кодирующую SDF. Механизм действия SDF состоит в привлечении клеточных источников (прежде всего, эндотелиальных прогениторных клеток) из костного мозга, кровотока, «периферических тканей» в целевую область по градиенту концентрации. В настоящее время в США и Индии проходит II фазу клинических испытаний препарат JVC-100, показанный для лечения ХИНК [296].

В клиническом исследовании М.А. Creager с со-авт. (2011) применение гена HIF-la в составе аденовирусного вектора для лечения пациентов с ХИНК оказалось неэффективным. На сроках 3, 6, 12 мес. не было выявлено статистически значимых различий в показателях качества жизни, дистанции безболевой ходьбы и лодыжечно-плечевого индекса между целевой и контрольной группами [143].

Результаты применения геннотерапевтических конструкций с нуклеотидной последовательностью, кодирующей FGF, довольно противоречивы, однако можно утверждать, что в случае лечения пациентов с

ИБС эффект более выраженный, чем при ХИНК. Есть основания полагать, что нуклеиновые кислоты, кодирующие ангиогенные факторы HGF, HEF-1 а наименее перспективны для применения в терапии ХИНК.

Таким образом, большая часть проведенных и проводимых к сегодняшнему дню исследований в сфере генных технологий в России и за ее пределами являются плацебо-контролируемыми, дают достоверные ответы отношении эффективности и безопасности методов терапевтического ангиогенеза [83] и указывают на преимущества гена фактора VEGF в лечении хронической ишемии нижних конечностей по сравнению с генами прочих ангиогенных факторов [48].

1.3.3.2. Методы доставки генов. Сравнительная характеристика геннотерапевтических векторов

Существуют различные методики применения генной терапии: усиление действие гена, ингибирование действия гена, разрушение определенных клеток. Сама по себе генная терапия может применяться ех- и in-vivo, непосредственно в проекции органа/ткани, либо системно [171].

Существуют различные методики доставки генов к целевым клеткам или тканям, основными среди которых являются: вирусные векторы (69%), невирусные биологические векторы (25%); физические (1%, например, баллистические системы доставки) и неклассифицируемые (5%) [327].

Становится очевидным, что не существует идеального вектора [329], и у каждой системы доставки гена есть свои преимущества и недостатки. Учитывая данные обстоятельства, необходимы дальнейшие разработки и исследования для создания лучшего вектора.

Наиболее часто в настоящее время (протоколы клинических испытаний 2007-2010 гг.) в качестве вектора используются следующие типы вирусов: аденовирусы (в 20% протоколов), MVA (модифицированный вирус натуральной оспы - 12%), ретровирусы (11%), и аденоассоциированные вирусы (8%) (рис. 3 ) [327].

□ Аденовирусы

□ Плазмидная ДНК ■Липофскция

■ Поксвирусы

■ Вирус простого герпеса

□ Неизвестный вектор

□ Ретровирусы

□ Вирус вакцинии

□ Адено-ассопиированные вирусы

□ Лентивирусы

□ Другие категории

Рис. 3. Основные векторы, используемые в клинических испытаниях генной терапии в 2013 году по данным The Journal of Gene Medicine, © 2013, John Wiley and Sons Ltd [327]

Основными преимуществами аденовирусных векторов является высокая эффективность переноса ДНК в различные типы как делящихся, так и неделящихся клеток, а также сравнительно низкая патогенность и невозможность возникновения инерционного мутагенеза т.е. данные вирусные конструкции не встраиваются в геном [139]. Однако, несмотря на высокую эффективность аденовирусов как вектора для доставки генетического материала в клетки, существует высокий риск развития воспалительных реакций и токсического поражения различных органов [170, 328, 330]. Также следует учитывать, что немодифицированные аденовирусы не способны инфицировать мышечные волокна и эндотелиальные клетки [182]. В настоящее время наблюдается постепенное угасание интереса к аденовирусам, как к перспективным векторам для генной терапии сердечно-

сосудистых заболеваний. Наибольшей эффективностью доставки трансгена обладают ретровирусные векторы, так как они обладают способностью встраивать терапевтический ген в геном клетки-хозяина и таким образом обеспечивать его долгосрочную и стабильную экспрессию, но использование данного типа носителей сопряжено с высоким риском возникновения побочных эффектов, связанных со случайным встраиванием вирусных генов в геном клетки-хозяина и возможной активацией протоонкогенов [289].

Наиболее безопасной и эффективной стратегией переноса нужного гена в клетки-мишени является использование невирусных систем, в частности плазмид [19]. Плазмиды - небольшие экстрахромосомные кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК, обнаруживаемые в клетках бактерий и давно ставшие одним из самых распространённых инструментов генной инженерии [265]. Однако ДНК обладает большим молекулярным весом и несёт отрицательный электрический заряд, а потому не способна спонтанно проникать сквозь фосфолипидные мембраны клеток, и эффективность трансфекции так называемой «голой», ничем не защищенной, ДНК крайне низка. Плазмидный вектор содержит несколько элементов: код репликации, необходимый для воспроизведения плазмиды в клетке-продуценте (про- или эукариотической); маркерный ген устойчивости к антибиотикам (канамицину, ампициллину и др.), искусственно вносимый в плазмиду для селекции содержащих ее клонов бактерий, а также один или более терапевтических генов (трансгенов), которые должны экспрессироваться в трансфецируемой клетке-мишени (трансгены включают нуютеотидные последовательности интересующих генов, а также все генетические элементы, необходимые для их успешной репликации, -энхансеры, промотеры и др.) [21]. Первым препятствием, которое должна преодолеть плазмида со встроенным терапевтическим геном, является плазматическая мембрана трансфецируемой клетки. Считается, что плазмиды проникают в клетки посредством эндоцитоза, к которому способно большинство типов клеток организма [208]. Ядерная мембрана клетки

является вторым препятствием, которое должна преодолеть плазмида с встроенным в нее терапевтическим геном. В ряде экспериментов было показано проникновение плазмидной ДНК из цитоплазмы в ядра мышечных волокон экспериментальных животных, а также других типов клеток [257], однако тонкий механизм этого процесса остается недостаточно изученным. Плазмиды, в отличие от ретровирусов, не интегрируются в геном клетки-реципиента, а ограниченное время существуют в ядре в виде экстрахромосомной ДНК. Экспрессия терапевтического гена происходит за счет собственных транскрипционных и трансляционных механизмов клетки. Данный механизм лежит в основе подходов, использующихся для регуляции экспрессии терапевтических трансгенов, в том числе и ангиогенных [21].

Исследователи постоянно ищут новые методы повышения эффективности трансфекции, разрабатывая различные «катионные» способы доставки ДНК в клетки в комплексе с такими агентами, как фосфат кальция и диэтиламиноэтилцеллюлоза, создавая липофильные/гидрофобные комплексы, эндоцитируемые клетками [174, 298]. Большинство этих экспериментальных подходов применимо лишь для трансфекции клеток в культурах in vitro, либо они слишком сложны, чтобы войти в рутинную клиническую практику, однако часть из них все же нашли применение и при доставке генов в клетки ишемизированной ткани [133,206]. 1.3.3.3. Выбор оптимального гена

Основными факторами роста, инициирующими и контролирующие ключевой момент неоангиогенеза, то есть миграцию клеток сосудистого эндотелия в межклеточное пространство в направлении закладывающегося сосуда, являются в большей степени различные виды сосудистых эндотелиальных факторов роста VEGF, в меньшей степени фибробластические факторы роста FGF. Перенос этих генов в клетки сосудов ишемизированной ткани может инициировать их рост и развитие [157, 160]. Экзогенное введение VEGF при создании модели ишемии нижних конечностей на животных показало усиление скорости кровотока и

увеличение ЛПИ, в то время как введение антител, нейтрализующих УЕвР, ослабляло кровоток [256, 290, 306]. Сам УЕвР впервые был охарактеризован в 1989 г. как гепарин-связывающий ангиогенный фактор роста, оказывающий высокоспецифическое митогенное воздействие на эндотелиальные клетки [177]. Важно отметить, что практически сразу было продемонстрировано, что фактор УЕвР активирует пролиферацию и дифференцировку эндотелиоцитов синергично с фактором ЬРвР, однако сам по себе ЬРвР не вызывает подобных эффектов [178]. В дальнейшем это было использовано на практике разработчиками методик терапевтического ангиогенеза, которые сочетали в одной конструкции гены нескольких проангиогенных факторов [53, 82]. В экспериментальных работах совместное использование УЕСР и фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1, а также тромбоцитарного ФР (РБСР-ВВ) в сочетании с РвР-2 индуцирует образование сосудистой сети, которая остается стабильной даже через 1 год после прекращения действия этих факторов [99]. Еще одним подходом к более сбалансированной индукции ангиогенеза может быть создание генетических конструкций на основе гибрида геномной ДНК и кДНК форм гена УЕвР, которые содержат экзоны и интроны в различно сплайсирующейся области, что обеспечивает экспрессию нескольких изоформ УЕвР, как это естественно происходит в тканях [90]. Итак, УЕСР влияет на развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и выживание незрелых кровеносных сосудов (сосудистая поддержка), связываясь с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 УЕСР и рецептором-2 УЕвР) и активируя их. УЕСР лиганд запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию. Эндотелиальные клетки участвуют в таких разнообразных процессах, как вазоконстрикция и вазодилатация, презентация антигенов, а также служат очень важными элементами всех кровеносных сосудов - как капилляров, так и вен или артерий. Таким образом, стимулируя эндотелиальные клетки, УЕвР играет центральную

роль в процессе ангиогенеза [84]. VEGF избирательно стимулирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, их предшественников и моноцитов, экспрессирующих рецепторы к нему, увеличивает сосудистую проницаемость, способствуя пропотеванию белков плазмы в околососудистое пространство, которое необходимо для миграции ЭК, индуцирует экспрессию эндотелиальной NO-синтазы и образование N0, что способствует вазодилатации и стимулирует экспрессию протеаз, разрушающих связи между ЭК и внеклеточным матриксом, что необходимо для направленной миграции клеток [56]. VEGF также индуцирует экспрессию антиапоптических белков bcl-2 и А1 в сосудистых эндотелиальных клетках. Вс1-2 принадлежат все увеличивающемуся семейству регулирующих апоптоз генных производных, которые могут быть как антагонистами, так и агноистами клеточной смерти. Вс1-2 являются внутриклеточными белками, расположенными на митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, а также на поверхности ядра. Доказано, что bcl-2 блокируют апоптоз, не вызывая при том клеточной пролиферации. Однако механизмы, участвующие в контроле факторов роста над пролиферацией или угнетением эндотелиальных клеток, до сих пор плохо описаны. Таким образом, Bcl-2 и А1 являются двумя новыми целевыми направлениями воздействия VEGF [175]. К настоящему времени несколько вариантов генов VEGF (VEGF 165 и VEGF121; FGF1 и FGF4 ) прошли в I и П фазы клинических испытаний в качестве терапевтических агентов [241, 262]. Убедительно показано, что как при ишемии конечностей, так и при ишемии миокарда препараты на основе VEGF165 безусловно лидируют как по критериям безопасности, так и оказываются максимально эффективны [48]. В 2011 году государственную регистрацию на территории Российской Федерации получил геннотерапевтический индуктор неоангиогенеза -препарат на основе ДНК-плазмид с геном сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF («Неоваскулген»). Препарат «Неоваскулген» представляет собой высокоочищенную сверхскрученную форму плазмиды

рСМУ-УЕОР165, кодирующей УЕОР под контролем промотора (управляющего участка ДНК). Успешные результаты экспериментальных исследований в рамках генной терапии создали необходимое подспорье для клинических исследований и внедрения геннотерапевтических методов лечения ХИНК в практику. В отсутствие достаточного арсенала средств в лечении ХИНК, в особенности при наличии неоперабельного дистального поражения, проблема восстановления и поддержания кровообращения в дистальных сегментах сегодня рассматривается с точки зрения геннотерапевтической индукции ангиогенеза.

Заключение диссертации по теме «Сердечно-сосудистая хирургия», Мжаванадзе, Нина Джансуговна

ВЫВОДЫ

1. Геннотерапевтическая конструкция p-veg/165 обладает ангиогенными и гистопротекторными свойствами в отношении скелетной мускулатуры в условиях ишемии.

2. Геннотерапевтическая конструкция p-veg/165 эффективна в комплексном лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии IIa-Ш стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) преимущественно за счет достоверного прироста дистанции безболевой ходьбы и безопасна в отношении развития местных, системных воспалительных реакций и новообразований в течение не менее 2 лет от начала лечения.

3. Клиническая эффективность геннотерапевтической конструкции р-vegf165 в отношении показателей дистанции безболевой ходьбы, лодыжечно-плечевого индекса, транскутанного напряжения кислорода и линейной скорости кровотока сохраняется в течение не менее 2 лет от начала лечения: постепенное увеличение дистанции безболевой ходьбы в течение 2 лет до 207,2% от изначального значения (р<0,05), увеличение лодыжечно-плечевого индекса на 13,7% к 6 месяцам от начала лечения с последующей стабилизацией в течение 2 лет (р<0,05), увеличение транскутанного напряжения кислорода в течение 1 года наблюдения до 16,2% с последующей стабилизацией в течение 2 года наблюдения (р<0,05), постепенное увеличение линейной скорости кровотока до 103,4% от изначального значения в течение 2 лет (р<0,05).

4. Применение геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в составе комплексной терапии показано пациентам с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии IIa-Ш стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств и является максимально эффективным у пациентов с 1П стадией заболевания и мультифокальным типом поражения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты показали, что геннотерапевтическая конструкция p-veg/165 обладает ангиогенными и гистопротекторными свойствами в условиях ишемии. Поэтому пациентам с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии На-Ш стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств целесообразным является применение в составе комплексного лечения p-vegß65 с целью индукции ангиогенеза и восстановления перфузии ишемизированных тканей.

2. Полученные результаты показали, что применение геннотерапевтической конструкции p-vegß65 в составе комплексного лечения у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии IIa-Ш стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) вызывает стабильное достоверное увеличение дистанции безболевой ходьбы, лодыжечно-плечевого индекса, транскутанного напряжения кислорода и линейной скорости кровотока в течение не менее 2 лет от начала лечения. Поэтому пациентам с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии IIa-Ш стадий при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств целесообразной является индукция неоангиогенеза при помощи геннотерапевтической конструкции p-vegß.65.

3. Полученные результаты показали, что применение геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в составе комплексного лечения у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-IH стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) не вызывает развития местных, системных воспалительных реакций и новообразований в течение не менее 2 лет от начала лечения. Поэтому применение геннотерапевтической индукции неоангиогенеза конструкцией p-veg/165 следует считать безопасным.

4. Оптимальным режимом введения геннотерапевтической конструкции p-vegß65 с целью индукции неоангиогенеза в составе комплексного лечения у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии IIa-Ш стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств является двукратные инъекции по 1,2мг с интервалом в 14 суток внутримышечно, максимально близко к зоне ишемии.

5. Геннотерапевтическая индукция неоангиогенеза при помощи конструкции p-veg/165 в составе комплексного лечения у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств может применяться у пациентов со Па-Ш стадиями заболеваниями (по A.B. Покровскому-Фонтейну) и различными типами поражением артериального русла, с максимальным клиническим эффектом у пациентов с III стадией заболевания и мультифокальным типом поражения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Мжаванадзе, Нина Джансуговна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Азизов, Г. А. Особенности микроциркуляции у больных облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей по данным лазерной доплеровской флоуметрии [Текст] / Г. А. Азизов, В. А. Дуванский, Е. Н. Гагарин, А. В. Стешин // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: материалы конф. - М., 2011. - С. 15-16.

2. Азизов, Г. А. Оценка микроциркуляции у больных облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей [Текст] / Г. А. Азизов, В. А. Дуванский, Е. Н. Гагарин, О. Б. Тамразова // Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология: материалы Междунар. науч. конф. -Ярославль, 2011. - С. 30.

3. Беленков, Ю.Н. Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента в лечении сердечно-сосудистых заболеваний (Квинаприл и эндотелиальная дисфункция) [Текст] / Ю.Н. Беленков, В.Ю. Мареев, Ф.Т. Агеев. - М.: Москва, 2002. - 86 с.

4. Белов, Ю. В. Оценка результатов хирургического лечения больных с множественным поражением артерий нижних конечностей [Текст] / Ю. В. Белов, А. Б. Степаненко, А. П. Гене, И. Г. Хапило // Хирургия. - 2001. - № 10. - С. 33—36.

5. Белов, Ю. В. Хирургическая тактика лечения послеоперационных тромбозов реконструированных артерий [Текст] / Ю.В. Белов, А.Б. Степаненко // Хирургия. - 1998. - № 11. - С. 4-8.

6. Белов, Ю. В. Повторные реконструктивные операции на аорте и магистральных артериях [Текст] / Ю. В. Белов, А. Б. Степаненко. - М.: ООО «Моск. информ. агентство», 2009. - 176 с.

7. Бокерия, Л. А. Первый опыт применения стволовых клеток костного мозга для регенерационной терапии ишемической болезни сердца [Текст] / Л. А. Бокерия, Ю. И. Бузиашвили, С. Т. Маикеплишвили, Д. X. Камардинов // Кардиология. -2004. - № 9. - С. 12-16.

8. Бокерия, JI. А. Хирургическое лечение больных с атеротромботическим поражением артерий нижних конечностей — выбор трансплантанта при бедренно-подколенном шунтировании [Текст] / Л. А. Бокерия, М. Б. Темрезов, В. И. Коваленко // Анналы хирургии. - 2010. - № 2. -С. 5-8.

9. Возможности использования генных и клеточных технологий для лечения сердечно - сосудистых заболеваний [Текст] / Л. А. Бокерия [и др.] // Бюллетень НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева РАМН. - 2004. - № 3. - С. 19-38.

10. Всемирная Организация Здравоохранения. Информационный бюллетень №310. - Электрон, дан. - 2011. - Режим доступа: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/ru/index.html

11. Всемирная Организация Здравоохранения. Информационный бюллетень №317. - Электрон, дан. - 2011. - Режим доступа: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/ru/index.html

12. Гавриленко, А. В. Отдаленные результаты бедренно-подколенных аутовенозных шунтирований реверсированной веной и по методике «in situ» [Текст] / А. В. Гавриленко, С. И. Скрылев // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2007. - № 3. - С. 120-124.

13. Гавриленко, А. В. Сочетание реконструктивных сосудистых операций с генно-инженерными технологиями стимуляции ангиогенеза: современная стратегия улучшения отдаленных результатов лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей [Текст] / А. В. Гавриленко, Д. А. Воронов, Б. А. Константинов, Н. П. Бочков // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2008. - Т. 14, №4. - С. 49-53.

14. Гавриленко, A.B. Влияние тактических ошибок на результаты хирургического лечения пациентов с критической ишемией нижних конечностей [Текст] / A.B. Гавриленко, А.Э. Котов, Я.Ю. Муравьева // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2010. - № 1. - С. 138-143.

15. Гавриленко, А. В. Комплексное лечение пациентов с хроническое ишемией нижних конечностей с использованием генных индукторов

ангиогенеза: ближайшие и отдаленные результаты [Текст] / А. В. Гавриленко, Д. А. Воронов, Н. П. Бочков // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. 6, № 3. - С. 84.

16. Гиперплазия интимы как причина рестеноза после реконструктивных и эндоваскулярных операций на артериях нижних конечностей [Текст] / П. Г. Швальб [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2007. - Т. 13, №4. - С. 144-146.

17. Гольдберг Е.Д. Современные взгляды на проблему использования стволовых клеток и возможности их использования в медицине [Текст] / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, В. В. Жданов // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - № 4. - С. 184-189.

18. Григорьев, Н.Б. Оксид азота (N0). Новый путь к поиску лекарств [Текст] / Н.Б. Григорьев, В.Г. Граник. - М.: Вузовская книга, 2004. - 360 с.

19. Григорян, А. С. Возможные молекулярные механизмы функционирования плазмидных конструкций, содержащих ген УЕвР [Текст] / А. С. Григорян, К. Г. Шевченко // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. 6, №3. - С. 24-28.

20. Деев, Р. В. Интервью с Президентом Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов академиком РАМН профессором Анатолием Владимировичем Покровским [Текст] / Р. В. Деев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. 6, №3. - С. 13-14.

21. Деев, Р. В. Теоретические и практические аспекты применения препарата на основе нуклеиновой кислоты, кодирующей эндотелиальный сосудистый фактор роста («Неоваскулген») [Электронный ресурс] / Р. В. Деев, Ю. В. Червяков, Р. Е. Калинин, А. А. Исаев. - Электрон, текст, дан. -Электронный журнал ANGIOLOGIA.ru, 2011. - режим доступа к журн.: http://www.angiologia.ru/journal_angiologia/001_2011/

22. Демин, В. В. Эндоваскулярное лечение поражений бедренно-подколенного сегмента: причины неудачи, условия успеха [Текст] / В. В.

Демин, В. В. Зеленин, А. Н. Желудков // Ангиология и сосудистая хирургия. -2000.-Т. 6, № 3. - С. 56-64.

23. Джафф, М. Р. Заболевания периферических артерий [Текст] / М. Р. Джафф, Э. Р. Молер Ш. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 224 с.

24. Диагностическая иммуногистохимия опухолей [Текст] / под ред. Д. Ф. Глузмана. - К.: Морион, 2003. - 193 с.

25. Диденко Ю. П. Причины выполнения повторных оперативных вмешательств в отдаленные сроки после реконструктивных операций на артериях нижних конечностей у больных облитерирующим атеросклерозом [Текст] / Ю. П. Диденко, Г. Н. Горбунов // Вестник Санкт-Петербургского университета. Сер. 11. - 2008. - Вып. 1. - С. 73.

26. Елисеева, И. И. Общая теория статистики [Текст] / И. И. Елисеева, М. М. Юзбашев. - М. : Финансы и статистика, 2005. - 657 с.

27. Затевахин, И. И. Баллонная ангиопластика при ишемии нижних конечностей [Текст] / И. И. Затевахин, В. Н. Золкин. - М. : Медицина, 2004. -158 с.

28. Использование аутологичных стволовых клеток для стимуляции артериогенеза при критической ишемии нижних конечностей [Текст] / А. Б. Белевитин [и др.] // Вестн. Рос. Воен. - мед. академии. - 2008. - № 3. - С. 176-179.

29. Казаков, Ю. И. Изменение состояния микроциркуляции у больных атеросклеротическим поражением сосудов нижних конечностей в зависимости от вегетативного тонуса и метода анестезии во время реконструктивных операций [Текст] / Ю. И. Казаков, С. И. Ситкин, Д. В. Федерякин // Регионарная анестезия и лечение боли: тематический сборник. -М.; Тверь, 2004. - С. 16-23.

30. Калинин, P.E. Методы стимуляции секреции оксида азота у больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей с позиции коррекции эндотелиальной дисфункции [Текст] / P.E. Калинин, A.C.

Пшенников // Вестник Национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирогова. -2011. - № 3. - С. 12-16.

31. Калинин, P.E. Коррекция эндотелиальной дисфункции [Текст] / P.E. Калинин. - Saarbrucken, Germany: LAP Lambert Academic Publishing, 2012. -128 c.

32. Кащенко, В. А. Теоретическое обоснование оценки ангиогенеза в клинической гепатологии [Текст] / В. А. Кащенко // Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2008. - Сер. 11. - С. 83-89.

33. Кириенко, А. И. Амбулаторная ангиология [Текст] / А. И. Кириенко, В. М. Кошкин, В. Ю. Богачев. - М.: Литтерра, 2007. - 327 с.

34. Киричук, В.Ф. Дисфункция эндотелия [Текст] / В.Ф. Киричук, П.В. Глыбочко, А.И. Пономарева.- Саратов: Изд-во Саратовского мед. ун-та, 2008. - 129 с.

35. Комбинированное лечение хронической ишемии нижних конечностей с использованием стимуляторов ангиогенеза [Текст] / Л. А. Бокерия [и др.] // Бюллетень НЦССХ им. А. Н. Бакулева РАМН. - 2004. - Т. 5, № 11. - С. 326.

36. Кошкин, В. М. Эффективность тренировочной ходьбы у больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей [Текст] / В. М. Кошкин, К. И. Синякин, О. Д. Наставшева // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2008. - Т. 25, №1. - С. 58-63.

37. Крупаткин, А. И. Лазерная допплеровская флоуметрия микроциркуляции крови: руководство для врачей [Текст] / А. И. Крупаткин, В. В. Сидоров. -М. : ОАО Издательство «Медицина», 2005. - 256 с.

38. Кузнецов, М. Р. Клинико-морфологические параллели различных степеней хронической артериальной недостаточности нижних конечностей [Текст] / М. Р. Кузнецов, В. П. Черников, С. А. Тепляков, М. Г. Габиева // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2010. - Т. 16, № 3. - С. 152-157.

39. Кунгурцев, В. В. Хирургическое лечение окклюзирующих поражений артерий голени / В. В. Кунгурцев, Д. Г. Киртадзе, М. Д. Дибиров [Текст] // Грудная и сердечно-сосудистая хирургия. - 1996. - № 6. - С. 317.

40. Кунгурцев, В. В. Реконструктивные операции при критической ишемии у лиц пожилого и старческого возраста с бедренно-подколенн-берцовой окклюзией / В. В. Кунгурцев, М. Д. Дибиров, А. И. Шиманко [Текст] // Ангиология и сосудистая хирургия. - 1998. - № 2. - С. 180.

41. Липницкий, Е.М. Применение ритмической пневмокомпрессии для лечения больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей [Текст] / Е.М. Липницкий, Г.Г. Амосов, K.M. Морозов // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2007. - № 3. - С. 22-26.

42. Маянская, С. Д. Эндотелиальная дисфункция и острый коронарный синдром [Текст] / С. Д. Маянская, А. Д. Куимов // Рос. кардиол. журн. - 2001. - № 2.- С. 76-84.

43. Мертвецов, Н. П. Ангиогенин и механизм ангиогенеза [Текст] / Н. П. Мертвецов, Л. Е. Стефанович. - Новосибирск: Наука, 1997. - 78 с.

44. Методы хирургического лечения больных облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей с поражением дистального русла (часть П) [Текст] / А. В. Гавриленко [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия.-2011.-Т. 17,№4.-С. 115-119.

45. Мжаванадзе, Н. Д. Реалии и перспективы применения генной терапии в сердечно-сосудистой хирургии [Текст] / Н. Д. Мжаванадзе, И. Я. Бозо, Р. Е. Калинин, Р. Д. Деев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2012. - Т. 7, № 2. - С. 58-62.

46. Микрососудистая и пластическая хирургия - синергисты в комплексном лечении пациентов с поражениями артерий дистального русла (реконструктивные операции и трансплантация свободных мягкотканых лоскутов) [Текст] / К. М. Морозов [и др.] // Сердечно - сосудистые заболевания: бюл. науч. центра сердечно - сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2006. - Т. 7, № 2. - С. 16-32.

47. Микульская, Е. Г. Зависимость функционального резерва микроциркуляции тканей нижних конечностей у больных облитерирующими заболеваниями артерий от гемодинамических и реологических факторов [Текст] / Е. Г. Микульская, Ю. А. Буров, А. Н. Москаленко // Методология флоуметрии. - 2000. - № 4. - С. 25-31.

48. Мировой опыт и тенденции генотерапии ишемических заболеваний [Текст] / Р. В. Деев [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2011. -Vol. 17, №2.-Р. 145—154.

49. Мишалов, В.Г. Окклюзионная болезнь периферических артерий: что мы можем сделать для пациента уже сегодня? [Текст] / В.Г. Мишалов, В.А. Черняк // Практична ангюлопя. - 2011. - № 1. - С. 12-19.

50. Напряжение сдвига. - Электрон, дан. - 2013. - Режим доступа: Ь«р://с1ю.асааепйс.ги/01с.п8Г/п1е8/2964/НАПРЯЖЕНИЕ

51. Национальные рекомендации по ведению пациентов с патологией артерий нижних конечностей [Текст] // Ангиология и сосудистая хирургия-2013.-Т. 19, №2 (Прил.). - С. 1-67.

52. Новик, А. А. Клеточная терапия [Текст] / А. А. Новик, P.A. Иванов. -М.: Изд-во «МИА», 2008. - 240 с.

53. Новые плазмидные конструкции, предназначенные для терапевтического ангиогенеза и несущие гены ангиогенных факторов роста VEGF, HGF и ангиопоэтина-1 [Текст] / П. И. Макаревич [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - Т. 1. - С. 47-52.

54. Оболенский, В. Н. Хронические облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей - диагностика и тактика лечения / В. Н. Оболенский, Д. В. Яншин, Г. А. Исаев, А. А. Плотников [Текст] // Русский медицинский журнал. - 2010. - № 17. - С. 1049-1054.

55. Оценка состояния системы микроциркуляции и механизмов регуляции тканевого кровотока у больных облитерирующим атеросклерозом при различных уровнях поражения артериального русла [Текст] / В.А. Лазаренко

[и др.] // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». -2011. -№3.~ С. 82-86.

56. Парфенова Е. В. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы [Текст] / Е. В. Парфенова, В. А. Ткачук // Кардиологический вестник. - 2007. - Т. 2. - С. 5-15.

57. Покровский, А. В. Можно ли предсказать исход реконструктивной операции у больных с ишемией нижних конечностей на основании дооперационных исследований? [Текст] / А. В. Покровский, В. Н. Дан, А. В. Чупин, А. Ф. Харазов // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2002. - № 3. -С. 102-109.

58. Покровский, А. В. Клиническая ангиология: руководство: в 2-х т. [Текст] / А. В. Покровский. - М.: Медицина, 2004. - Т. 1-2.

59. Постгеномные и нанотехнологические инновации. НПА (фактор, индуцируемый гипоксией 1 альфа). - Электрон, дан. - 2013. - Режим доступа: http://www.pynny.ru/information/125.html

60. Применение поясничной симпатэктомии в лечении облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей - современный взгляд на проблему [Текст] / А. В. Гавриленко [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. -2004. - Т. 10, № 3. - С. 80-85.

61. Прогнозирование отдаленных результатов оперативного лечения больных с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей [Текст] / М. Р. Кузнецов [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2008. -Т. 14, №1.- С. 106-112.

62. Пуазейля закон. - Электрон, дан. - 2013. - Режим доступа: http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc3p/247218

63. Результаты применения гентерапевтического препарата "Неоваскулген" у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей; 1 год наблюдений [Текст] / Р. В. Деев [и др.] // Вестник Национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирогова. - 2011. - Т. 6, № 4. - С. 20-26.

64. Результаты реконструктивных операций у больных с поражением артерий голени [Текст] / А. В. Троицкий [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2003. - № 1. - С. 102-108.

65. Рифель, А. В. Мультифокальный атеросклероз как причина высоких ампутаций нижних конечностей [Текст] / А. В. Рифель, А. А. Фокин // Український медичний часопис. - 2006. - Т. 52, № 2. - С. 68-70.

66. Родионов, П.А. Ранние тромботические осложнения после бедренно-подколенного-берцового шунтирования большой подкожной веной по методике «in situ» [Текст] / П.А. Родионов // Материалы Девятой ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2005) // Сердечно - сосудистые заболевания: бюллетень НЦССХ им А.Н. Бакулева РАМН. - 2005. - Т. 6, № 3. - С. 256.

67. Савельев, В. С. Критическая ишемия нижних конечностей [Текст] / В. С. Савельев, В. М. Кошкин. - М.: Медицина, 1997. - 160 с.

68. Савельев, В. С. Критическая ишемия как следствие неадекватного лечения больных хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей на амбулаторном этапе [Текст] / В. С. Савельев, В. М. Кошкин, А. С. Кунижев // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2004. - № 1. -С. 7-10.

69. Савельев, B.C. Патогенез и консервативное лечение тяжелых стадий облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей [Текст] / B.C. Савельев, В.М. Кошкин, A.B. Каралкин. - М. : МИА, 2010. - 214 с.

70. Самодай, В.Г. Нестандартная хирургия критической ишемии нижних конечностей [Текст] / В. Г. Самодай, Ю. А. Пархисенко, А. А. Иванов. - М.: ООО «Мед. информ. агентство», 2009. - 240 с.

71. Седов, В. М. Анализ ранних послеоперационных осложнений после реконструктивных операций на артериях аорто-бедренного сегмента [Текст] / В. М. Седов, А. В. Гусинский, В. В. Шломин // Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2008. - Т.11, № 1. - С. 65.

72. Состояние микроциркуляции при IV стадии хронической артериальной недостаточности нижних конечностей атеросклеротического генеза [Текст] / С. В. Лисин [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2008. - Т. 14, № 1. -С. 21-28.

73. Терапевтический ангиогенез в лечении больных с хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей. Ближайшие и отдаленные результаты [Текст] / Ю. В. Червяков [и др.] / Ангиология и сосудистая хирургия. - 2012. - № 3.- С. 19-27.

74. Трактуев, Д. О. Стромальные клетки жировой ткани -мультипотентные клетки с терапевтическим потенциалом для стимуляции ангиогенеза при ишемии тканей [Текст] / Д. О. Трактуев, К. П. Марч, В. А. Ткачук, Е. В. Парфенова // Кардиология. - 2006. - Т. 48, № 2. - С. 53-63.

75. Халепо, О. В. Использование метода лазерной доплеровской флоуметрии для оценки роли микроциркуляторных нарушений при патологии (клинико-экспериментальное исследование) [Текст] / О. В. Халепо, С. Л. Ешкина, В. М. Пугачев, О. А. Лучкина // Вестник восстановительной медицины. - 2008. - № 3. - С. 64-68.

76. Швальб, П.Г. Влияние перемежающейся пневмокомпрессии на выработку оксида азота как основного маркера эндотелиальной дисфункции у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей [Текст] / П.Г. Швальб, P.E. Калинин, A.C. Пшенников, И.А. Сучков//Новости хирургии. - 2011. - № 3. - С. 77-81.

77. Шевченко, Ю. Л. Клеточные технологии в сердечно - сосудистой хирургии [Текст] / Ю. Л. Шевченко, С. А. Матвеев. - М.: Медицина, 2005. -160 с.

78. Шойхет, Я. Н. Клеточные технологии в лечении заболеваний периферических артерий [Текст] / Я. Н. Шойхет, Н. Г. Хореев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. 6, № 3. - С. 15-23.

79. Шор, Н. А. Состояние микроциркуляции в нижних конечностях при облитерирующем атеросклерозе в стадии критической ишемии до и после

восстановительных операций [Текст] / Н. А. Шор, А. А. Тютюнник // Методология флоуметрии. - 2002. - № 6. - С. 69-76.

80. Экспериментальная модель клеточной терапии ишемии нижних конечностей [Текст] / Г. Г. Хубулава [и др.] // Сердечно - сосудистые заболевания. - 2008. - Т. 9, № 6. - С. 291.

81. Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов VEGF в скелетных мышцах при хронической артериальной недостаточности нижних конечностей [Текст] / М. Р. Кузнецов [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2010. - Т. 16, № 4. - С. 224-225.

82. Эффект одновременной экспрессии различных изоформ фактора роста эндотелия сосудов VEGF и основного фактора роста фибробластов FGF2 на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC [Текст] / И. И. Салафутдинов [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - Т. 2. - С. 62-67.

83. Эффективность и безопасность применения препарата «Неоваскулген» в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (26-3 фаза клинических испытаний) [Текст] / П.Г. Швальб [и др.] // КТТИ. - 2011. - № 3. - С. 76-83.

84. VEGF - фактор роста эндотелия сосудов. Информация для медицинских работников. - Электрон, дан. - 2013. - Режим доступа: http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/neovasculgen.html

85. A prospective randomized controlled study with intermittent mechanical compression of the calf in patients with claudication [Text] / J. de Haro [et al.] // J. Vase, and Endovasc. Surg. - 2010. - Vol.51, № 4. - P. 857-862.

86. A study of neovascularization in the rat ischemic hindlimb using Araldite casting and Spalteholtz tissue clearing [Text] / P. E. Westerweel [et al.] // Cardiovasc Pathol. - 2005. - Vol. 14. - № 6. - P. 294-297.

87. ACC/AHA guidelines for the management of patients with peripheral arterial disease [Text] / A.T. Hirsch [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. - 2006. - №6. -P. 1239-1312.

88. ACE inhibition with perindopril and biomarkers of atherosclerosis and thrombosis: results from the PERTINENT study [Text] / C. Ceconi [et al.] // Atherosclerosis. - 2009. - Vol. 204. - № 1. - P. 273-275.

89. Adenoviral-mediated delivery of early growth response factor-1 gene increases tissue perfusion in a murine model of hindlimb ischemia [Text] / Y. S. Lee [et al.] // Mol Ther. - 2005. - Vol. 12, № 2. - P. 328-336.

90. Adenovirus-mediated transfer of a minigene expressing multiple isoforms of VEGF is more effective at inducing angiogenesis than comparable vectors expressing individual VEGF cDNAs [Text] / P. R. Whitlock [et al.] // Mol Ther. -2004. - Vol. 9. - P. 67-75.

91. Al-Khaldi, A. Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model [Text] / A. Al-Khaldi, H. Al-Sabti, J. Galipeau, K. Lachapelle // Ann Thorac Surg. - 2003. -Vol. 75. - № 1. - P. 204-209.

92. Allogeneic endometrial regenerative cells: An «Off the shelf solution» for critical limb ischemia? [Text] / M. P. Murphy [et al.] // J. Transí. Med. - 2008. -Vol. 6. - P. 45.

93. Alloreactivity of umbilical cord blood mononuclear cells: specific hyporesponse to non-inherited maternal antigens [Text] / A. Tsafrir [et al.] // Hum Immunol. - 2000. - Vol. 61. - P. 548—554.

94. Altaany, Z. Crosstalk between hydrogen sulfide and nitric oxide in endothelial cells [Text] / Z. Altaany, G. Yang, R. Wang // J Cell Mol Med. - 2013. -Vol. 17, №7.-P. 879-888.

95. An Egr-1 master switch for arteriogenesis: studies in Egr-1 homozygous negative and wild-type animals [Text] / C. S. Sarateanu [et al.] //J Thorac Cardiovasc Surg. - 2006. - Vol. 131,№ 1. - P. 138-145.

96. Analysis of the role of chemokines in angiogenesis [Text] / G. Bernardini [et al.] // J Immunol Methods. - 2003. - Vol. 273,№ 2. - P. 83-101.

97. Angeli, F. Lowering blood pressure with p-blockers in peripheral artery disease: the importance of comorbidity [Text] / F. Angeli, G. Reboldi, P. J. Verdecchia // J Hypertens. - 2011. - Vol. 29, № 7. - P. 1298-1302.

98. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion [Text] / W. D. Ito [et al.] //Am J Physiol. - 1997. -Vol. 273, № 3. - P. 1255-1265.

99. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF [Text] / R. Cao [et al.] // Nat Med. - 2003. - Vol. 9. - P. 604-613.

100. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by aLewis lung carcinoma [Text] / M. S. O'Reilly [et al.]. // Cell. -1994. - Vol. 79, № 2. - P. 315-328.

101. Angiotensin-(l-7) receptor Mas agonist ameliorates progress of atherosclerosis in apoE-knockout mice [Text] / J. Jawien [et al.] // J Physiol Pharmacol. - 2012. - Vol. 63, № 1. - P. 77-85.

102. Antithrombotic Trialists' Collaboration. Collaborative meta-analysis of randomised trials of antiplatelet therapy for prevention of death, myocardial infarction, and stroke in high risk patients [Text] / AntithrombFotic Trialists' Collaboration // BMJ. - 2002. - Vol. 324, № 7329. - P. 71-86.

103. Aoki, M. Derivation of functional endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood mononuclear cells isolated by a novel cell filtration device [Text] / M. Aoki, M. Yasutake, T. Murohara // Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. -P.994-1002.

104. Arterial gene therapy for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral artery disease [Text] / J. M. Isner [et al.] // Circulation. - 1995. - Vol. 91. - P. 2687-2692.

105. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences [Text] / M. Heil [et al.] //J Cell Mol Med. - 2006. -Vol. 10, № 1. - P. 45-55.

106. Ascher, E. Haimovici's vascular surgery [Text] / E. Ascher. - 5th ed.- New York: Wiley-Blackwell, 2004. - 1260 p.

107. Augmentation of neovascularization in murine hindlimb ischemia by combined therapy with simvastatin and bone marrow-derived mesenchymal stem cells transplantation [Text] / Li Yong [et al.] // Journal of Biomedical Science. -2010.-Vol. 17.-P. 75.

108. Autologous skeletal myoblasts transduced with a new adenoviral bicistronic vector for treatment of hind limb ischemia [Text] / M. I. Niagara [et al.] // J. Vase. Surg. - 2004. - Vol. 40. - P. 774-785.

109. Autologous transplantation of peripheral blood endothelial progenitor cells (CD34+) for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia [Text] / F. A. Kudo [et al.] // Int. Angiol. - 2003. - Vol. 22. - P. 34Ф-348.

110. Aviles, R. Testing clinical therapeutic angiogenesis using basic fibroblast growth factor (FGF-2) [Text] / R. J. Aviles, В. H. Annex, R. J. Lederman // J. Br J Pharmacol. - 2003. - Vol. 140, № 4. - P. 637-646.

111. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors [Text] / M. J. Goumans [et al.] // EMBO J. - 2002. - Vol. 21, № 7.-P. 1743-1753.

112. Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model [Text] / E. F. Unger [et al.] // Am J Physiol. - 1994. - Vol. 266, № 4. -P. H1588-H1595.

113. Baumgartner, I. Local gene transfer and expression following intramuscular administration of FGF-1 plasmid DNA in patients with critical limb ischemia [Text] / I. Baumgartner I., N. Chronos, A. Comerota // Mol. Ther. - 2009. - Vol. 17, №5.-P. 914-921.

114. ß-Blockers in patients with intermittent claudication and arterial hypertension: results from the nebivolol or metoprolol in arterial occlusive disease trial [Text] / C. Espinola-Klein [et al.] // Hypertension. - 2011. - Vol. 58, № 2. - P. 148-154.

115. Belch, J. Effect of fibroblast growth factor NV1FGF on amputation and death: a randomised placebo-controlled trial of gene therapy in critical limb

ischaemia [Text] / J. Belch, W.R. Hiatt, I. Baumgartner // Lancet. -2011. - Vol. 377,№9781.-P. 1929-1937.

116. Bone marrow origin of endothelial progeniror cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization [Text] / T. Asahara [et al.] // Circ. Res. - 1999. - Vol. 85. - P. 221-228.

117. Brindle, N. P. Signaling and functions of angiopoietin-1 in vascular protection [Text] / N. P. Brindle, P. Saharinen, K. Alitalo // Circ Res. - 2006. -Vol. 98. - P. 1014-1023.

118. Burger, D. H. A prospective randomized trial comparing vein with polytetrafluoroethylene in above-knee femoropopliteal bypass grafting [Text] / D. H. Burger, A. P. Kappetein, J. H. Van Bockel, P. J. Breslau // Vase Surg. - 2000. -Vol. 32. - P. 278-283.

119. Burn, P. H. Intussusceptive angiogenesis: its emergence, its characteristics, and its significance [Text] / P. Burri, R. Hlushchuk, V. Djonov // Dev Dyn. -

2004. - Vol. 231, № 3. - P. 474-488.

120. Buschmann, I. The pathophysiology of the collateral circulation (arteriogenesis) [Text] / I. Buschmann, W. Schaper// J Pathol. - 2000. -Vol. 190, № 3. - P. 338-342.

121. Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis [Text] / P. Carmeliet // Nat. Med. - 2000. - Vol. 6, № 4. - P. 389-395.

122. Cellular and molecular mechanisms of hypoxia-inducible factor driven vascular remodeling [Text] / J. Hanze [et al.] //Thromb Haemost. - 2007. -Vol. 97, №5.-P. 774-787.

123. Chan, R.W. Clonogenicity of human endometrial epithelial and stromal cells [Text] / R. W. Chan, К. E. Schwab, С. E. Gargett // Biol. Reprod. - 2004. - Vol. 70.-P. 1738-1750.

124. Chapter I of Title 21 of the Code of Federal Regulations. - Электрон, дан. -2013. - Режим доступа: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm7CFRPart =58&showFR=l

125. Cilostazol: cilostazol prescribing information. - Электрон, дан. - 2013. - Режим доступа: htttp://www.drugs.com/pro/cilostazol.html

126. Clinical trial of naked plasmid DNA encoding vascular endothelial growth factor isoform VEGF165 transfer in patients with stage Па-Ш Fontaine lower limb ischemia due to atherosclerotic peripheral arterial disease: the results of the multicentered, randomized, controlled study [Text] / R. E. Kalinin [et al.] // Vascular biology, Materials and Engineering: ESVS Spring Meeting: book of abstracts. - 2013. - P. 63.

127. Combination of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor gene therapy enhances arteriogenesis in the ischemic myocardium [Text] / A. J. Siddiqui [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. -2003. - Vol. 310. - P. 1002-1009.

128. Combination of fluvastatin and losartan relieves atherosclerosis and macrophage infiltration in atherosclerotic plaques in rabbits [Text] / Y. P. Yang [et al.] // ActaPharmacol Sin. - 2011. - Vol. 32, № 10. - P. 1259-1265.

129. Comparative effects of different modes of renin angiotensin system inhibition on hypercholesterolaemia-induced atherosclerosis [Text] / H. Lu [et al.] // Br J Pharmacol. - 2012. - Vol. 165, № 6. - P. 2000-2008.

130. Contribution of arteriogenesis and angiogenesis to postocclusive hindlimb perfusion in mice [Text] / D. Scholz [et al.] // J Mol Cell Cardiol. - 2002. -Vol. 34, № 7. - P. 775-787.

131. Deindl, E. The art of arteriogenesis [Text] / E. Deindl, W. Schaper// Cell Biochem Biophys. - 2005. - Vol. 43, № 1. - P. 1-15.

132. Deindl, E. Arteriogenesis: A focus on signal transduction cascades and transcription factors [Text] / E. Deindl // Thromb Haemost. - 2007. - Vol. 98. - P. 940-943.

133. Delivery of an Angiogenic Gene into Ischemic Muscle by Novel Bubble Liposomes Followed by Ultrasound Exposure [Text] / Y. Negishi [et al.] // Pharm. Res. - 2011. - Vol. 28, № 4. - P. 712-719.

134. Diehm, C. Effect of nebivolol vs. hydrochlorothiazide on the walking capacity in hypertensive patients with intermittent claudication [Text] / C. Diehm, D. Pittrow, H. Lawall // J Hypertens. - 2011. - Vol. 29, № 7. - P. 1448-1456.

135. Differential functions of tumor necrosis factor receptor 1 and 2 signaling in ischemia-mediated arteriogenesis and angiogenesis [Text] / D. Luo [et al.] // Am J Pathol. - 2006.-Vol. 169,№5.-P. 1886-1898.

136. Direct intramuscular gene transfer of naked DNA encoding vascular endothelial growth factor augments collateral development and tissue perfusion [Text] / Y. Tsurumi [et al.] // Circulation. - 1996. - Vol. 94. - P. 3281-3290.

137. Distinct vascular and metabolic effects of different classes of antihypertensive drugs [Text] / K. K. Koh [et al.] // Int J Cardiol. - 2010. - Vol. 140, № l.-P. 73-81.

138. Dong, C. Endothelial progenitor cells: a promising therapeutic alternative for cardiovascular disease [Text] / C. Dong, P. J. Goldschmidt-Clermont // J Interv Cardiol. - 2007. - Vol. 20, № 2. - P. 93-99.

139. Douglas, J. Adenoviral vectors for gene therapy [Text] / J. Douglas // Mol. Biotechnol. - 2007. - Vol. 36, № 1. - p. 71-80.

140. Drexler, H. Correction of endothelial disfunction in coronary microcirculation of hypercholesterolemic patients by L-arginine [Text] / H. Drexler, A.M. Zeiher, K. Meinzer, H. Just // Lancet. - 1991. - Vol. 338. - P. 15461550.

141. Early translation of adipose-derived cell therapy for cardiovascular disease [Text] / R. Sanz-Ruiz [et al.] // Cell Transpl. - 2009. - Vol. 18. - P. 245-254.

142. Effect of cilostazol on treadmill walking, community-based walking ability, and health-related quality of life in patients with intermittent claudication due to peripheral arterial disease: meta-analysis of six randomized controlled trials [Text] / J. Regensteiner [et al.] // J Am Geriatr Soc. - 2002. - Vol. 50, № 12. - P. 19391946.

143. Effect of hypoxia-inducible factor-1 alpha gene therapy on walking performance in patients with intermittent claudication [Text] / M. A. Creager [et al.]//Circulation.-2011.-Vol. 124, № 16.-P. 1765—1773.

144. Egr-1, a master switch coordinating upregulation of divergent gene families underlying ischemic stress [Text] / S. F. Yan [et al.] //Nat Med. - 2000. -Vol. 6,№ 12.-P. 1355-1361.

145. Endothelial nitric oxide synthase activity is essential for vasodilation during blood flow recovery but not for arteriogenesis [Text] / B. Mees [et al.] // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2007. - Vol. 27, № 9. - P. 1926-1933.

146. Endothelial NOS is required for SDF-lalpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells [Text] / A. Kaminski [et al.] // Lab Invest - 2008. - Vol. 88, № 1. - P. 58-69.

147. Endothelial progenitor cells: characterization, in vitro expansion, and prospects for autologous cell therapy [Text] / D. M. Smadja [et al.] // Cell Biol Toxicol. - 2007. - Vol. 23, № 4. - P. 223-239.

148. Endothelial progenitor cells: identity defined? [Text] / F. Timmermans [et al.] // J. Cell Mol. Med. - 2009. - Vol. 13. - P. 87-102.

149. Endothelial progenitor cells and their potential clinical applications in peripheral arterial disease [Text] / N. Alobaid [et al.] // Endothelium. - 2005. -Vol. 12, №6. -P. 243-250.

150. Endothelium-dependent vasodilation is independent of the plasma L-arginine/ADMA ratio in men with stable angina: lack of effect of oral L-arginine on endothelial function, oxidative stress and exercise performance [Text] / H.A. Walker [et al.] // J Am Col Cardiol. - 2001. - Vol. 38. - P. 499-505.

151. Enhanced angiogenesis and growth of collaterals by in vivo administration of recombinant basic fibroblast growth factor in a rabbit model ofacute lower limb ischemia: dose-response effect of basic fibroblastgrowth factor [Text] / R. Baffour [et al.] // J Vase Surg. - 1992. - Vol. 16.-P. 181-191.

152. Eosinophils: biological properties and role in health and disease [Text] / S. P. Hogan [et al.] // Clin Exp Allergy. - 2008. - Vol. 38, № 5. - P. 709-750.

153. European Medicines Agency recommends restricting use of cilostazol-containing medicines. - Электрон, дан. - 2013. - Режим доступа: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Press_release/2013/03/ WC500140672.pdf

154. Evidence for the importance of angiotensin II type 1 receptor in ischemia-induced angiogenesis [Text] / K. Sasaki [et al.] // J. Clin. Invest. - 2002. - Vol. 109. -P.603-611.

155. EW-A-401 to treat intermittent claudication. - Электрон, дан. - 2011. -Режим доступа: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00080392

156. Feasibility investigation of allogeneic endometrial regenerative cells [Text] / Z. Zhong [et al.] // J. Transl. Med. - 2009. - Vol. 7. - P. 15.

157. Ferrara, N. The biology of VEGF and its receptors [Text] / N. Ferrara, H. P. Gerber, J. Le Couter// Nature Medicine. - 2003. - Vol. 9. - P. 669-676.

158. Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: Basic science and clinical progress [Text] / N. Ferrara // Endocr Rev. - 2004. - Vol. 25, № 4. - P. 581-611.

159. Ferrari, R. Secondary prevention of CAD with ACE inhibitors: a struggle between life and death of the endothelium [Text] / R. Ferrari, G. Guardigli, C. Ceconi // Cardiovasc Drugs Ther. - 2010. - Vol. 24, № 4.- P. 331-339.

160. Ferraro, B. Increased perfusion and angiogenesis in a hindlimb ischemia model with plasmid FGF-2 delivered by noninvasive electroporation [Text] / B. Ferraro, Y. L. Cruz, M. Baldwin, D. Coppola, R. Heller // Gene Therapy. - 2010. -Vol. 17. - P. 763-769.

161. Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications [Text] / J. Folkman // N. Engl. J. Med. - 1971. - Vol. 285, № 21. - P. 1182-1186.

162. Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors [Text] / J. Folkman // Ann. Surg. - 1972. - Vol. 175, № 3. - P. 409-416.

163. Folkman, J. Therapeutic angiogenesis in ischemic limbs [Text] / J. Folkman //Circ. - 1998-Vol. 97-P. 1108-1110.

164. Fonseca, V. A. Effects of beta-blockers on glucose and lipid metabolism [Text] / V. A. Fonseca // Curr Med Res Opin. - 2010. - Vol. 26, № 3. - P. 615629.

165. Fraisl, P. Regulation of angiogenesis by oxygen and metabolism [Text] / P. Fraisl, M. Mazzone, T. Schmidt, P. Carmeliet // Dev Cell. - 2009. - Vol. 16, N 2. -P. 167-179.

166. Frangogiannis, N. Ready for Prime Time? Mediated Angiogenesis for Peripheral Arterial Disease: Derived Factor-1 Stromal Cell [Text] / N. Frangogiannis // Circulation. - 2011. - Vol. 123, № 12. - P. 1267-1269.

167. Functional small-diameter new vessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo [Text] / S. Kaushal [et al.] // Nat. Med. - 2001 - Vol. 7. - P. 1035-1040.

168. Galzie, Z. Fibroblast growth factors and their receptors [Text] / Z. Galzie, A. R. Kinsella, J. A. Smith // Biochem Cell Biol. - 1997. - Vol. 75. - P. 669-685.

169. Gao, Y. Nebivolol: an endothelium-friendly selective pi-adrenoceptor blocker [Text] / Y. Gao, P. M. Vanhoutte // J CardiovascPharmacol. - 2012. - Vol. 59, № l.-P. 16-21.

170. Gene therapy for collateral vessel development [Text] / G. Melillo [et al.] // Cardiovasc. Res. - 1997. - Vol. 35, № 3. - P. 480-489.

171. Gene therapy - potential health and safety implications. Horizon Scanning Intelligence Group. - Электрон, дан. - 2005. - Режим доступа: http://www.hse.gov.uk/horizons/assets/documents/hsigjuly054.pdf

172. Gene transfer into humans - immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction [Text] / S. A. Rosenberg [et al.] // The New England journal of medicine. - 1990. - Vol. 323, № 9. - P. 570-578.

173. Gene transfer of naked DNA encoding for three isoforms of vascular enfothelial growth factor stimulates collateral development in vivo [Text] / S. Takeshita [et al.] // Lab. Invest. - 1996. - Vol. 75. - P. 487-502.

174. Gene transfer with a series of lipophilic DNA binding molecules [Text] / J. S. Remy // Bioconjug. Chem. - 1994. - Vol. 5. - P. 647-654.

175. Gerber, H. - P. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bel-2 and Al in vascular endothelial cells [Text] / H. - P. Gerber, V. Dixit, N. Ferrara // The Journal of Biological Chemistry. - 1998. - Vol. 273, №21.-P. 13313-13316.

176. GM-CSF: A strong arteriogenic factor acting by amplification of monocyte function [Text] /1. R. Buschmann [et al.] // Atherosclerosis. - 2001. - Vol. 159, № 2. - P. 343-356.

177. Gospodarowicz, D. Isolation and characterization of a vascular endothelial cell mitogen produced by pituitary-derived folliculo stellate cells [Text] / D. Gospodarowicz, J. A. Abraham, J. Schilling // PN AS USA. - 1989. - Vol. 86, № 19.-P. 7311-7315.

178. Goto, F. Synergistic effects of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on the proliferation and cord formation of bovine capillary endothelial cell within collagen gels [Text] / F. Goto, K. Goto, K. Weindel, J. Folkman // Lab. Invest. - 1993. - Vol. 69. - P. 508-517.

179. Grundmann, S. Arteriogenesis: basic mechanisms and therapeutic stimulation [Text] / S. Grundmann, J. J. Piek, G. Pasterkamp, I. E. Hoefer // Eur J Clin Invest. - 2007. - Vol. 37, № 10. - P. 755-766.

180. Gupta, R. Human Studies of Angiogenic Gene Therapy [Text] / R. Gupta, J. Tongers, D.W. Losordo // Circ. Res. - 2009. - Vol. 105. - P. 724-736.

181. Hannink, M. Structure and function of platelet-derived growth factor (PDGF) and related proteins [Text] / M. Hannink, D. J. Donoghue // Biochim. Biophys. - 1989. - Vol. 989. № 1. - P. 1-10.

182. Harris, J. D. Strategies for targeted gene therapy [Text] / J. D. Harris, N. R. Lemoine // Trends Genet. - 1996. - Vol. 12. - P. 400-405.

183. Heldin, C. H. Structural and functional studies on platelet-derived growth factor [Text] / C. H. Heldin // EMBO J. - 1992. - Vol. 11, № 12. - P. 4251^259.

184. Helisch, A. Arteriogenesis: The development and growth of collateral arteries [Text] / A. Helisch, W. Schaper//Microcirculation. - 2003. - Vol. 10, № l.-P. 83-97.

185. Hoefer, I.E. Experimental models of arteriogenesis: differences and implications [Text] /1. E. Hoefer, N. van Royen, M. M. Jost // Lab Anim. - 2006.

- Vol. 35, № 2. - P. 36-44.

186. Holecki, M. Effects of angiotensin-converting enzyme inhibitors beyond lowering blood pressure - are they important for doctors? [Text] / M. Holecki, J. Szewieczek, J. Chudek // Pharmacol Rep. - 2011. - Vol. 63, № 3. - P. 740-51.

187. Hood, S.C. Management of intermittent claudication with pentoxifylline: meta-analysis of randomized controlled trials [Text] / S.C. Hood, D. Moher, G.G. Barber // Cmaj. - 1996. - Vol. 155, № 8. - P. 1053-1059.

188. Hu, G. Angiogenin promotes invasiveness of cultured endothelial cells by stimulation of cell-associated proteolytic activities [Text] / G. Hu, J. F. Riordan, B. L. Vallee // Proc Natl Acad Sci. - 1994. - Vol. 91, № 25. - P. 12096-12100.

189. Hu, X. Transforming growth factor: signal transduction pathways, cell cycle mediation, and effects on hematopoiesis [Text] / X. Hu, K. S. Zuckerman // J Hematotherapy Stem Cell Resear. - 2001. - Vol. 10, № 1. - P. 67-74.

190. Impact of intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction: a collaborative systematic review and metaanalysis of controlled clinical trials [Text] / M. J. Lipinski [et al.] // J Am Coll Cardiol. - 2007. - Vol. 50, N 18. - P. 1761-1767.

191. Impaired collateral vessel development associated with reduced expression of vascular endothelial growth factor in ApoE-/- mice [Text] / T. Couffinhal [et al.] // Circulation. - 1999. - Vol. 99, № 24. - P. 3188-3198.

192. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells [Text] / A. Miranville [et al.] // Circulation. - 2004. - Vol. 110.

- P. 349-355.

193. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II) [Text] / L. Norgren [et al.] // Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. - 2007. - № 33.-P. 1-70.

194. Intracoronary autologous bone marrow stem cells transfer for patients with acute myocardial infarction: a meta-analysis of randomised controlled trials [Text] / S. N. Zhang [et al.] // Int J Cardiol. - 2009. - Vol. 136, N 2. - P. 178-185.

195. Intramuscular administration of vascular endothelial growth factor induces dose-dependent collateral artery augmentation in a rabbit model of chronic limb ischemia [Text] / S. Takeshita [et al.] // Circulation. - 1994. - Vol. 90, № 5. - P. Ü228-II234.

196. Intramuscular transplantation of G-CSF-mobilized CD34(+) cells in patients with critical limb ischemia: a phase I/Ha, multicenter, single-blinded, dose-escalation clinical trial [Text] / A. Kawamoto [et al.] // Stem Cells. - 2009. - Vol. 27,N 11.-P. 2857-2864.

197. Involvement of the fibroblast growth factor system in adaptive and chemokine-induced arteriogenesis [Text] / E. Deindl [et al.] / Circ Res. - 2003. -Vol. 92, №5.-P. 561-568.

198. Is there functional collateral flow during vascular occlusion in angiographically normal coronary arteries? [Text] / K. Wustmann [et al.] // Circulation. - 2003. - Vol. 107, № 17. - P. 2213-2220.

199. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization [Text] / T. Takahashi [et al.] // Nat Med . - 1999. - Vol. 5, № 4. - P. 434-438.

200. Islam, M. Z. Comparative study of hydrochlorothiazide and indapamide on the anti-atherogenic potential of losartan in cholesterol fed rat [Text] / M. Z. Islam, M. S. Rahman // Bangladesh Med Res Counc Bull. - 2010. - Vol. 36, № 1. - P. 1419.

201. Isner, J. M. Arterial gene transfer of naked DNA for therapeutic angiogenesis: early clinical results [Text] / J. M. Isner // Adv. Drug Deliv. Rev. -1998.-Vol. 30.-P. 185-197.

202. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis [Text] / T. Asahara [et al.] // Science. - 1997. - Vol. 275. - P. 964-967.

203. Kalka, C. Gene and stem cell therapy in peripheral arterial occlusive disease [Text] / C. Kalka, I. Baumgartner // Vase Med. - 2008. - Is. 13. - P. 157-172.

204. Kantoff, P. W. Prospects for human gene therapy [Text] / P. W. Kantoff, S. M. Freeman, W. F. Anderson // Science. - 1984. - Vol. 226. - P. 401-409.

205. Khachigian, L. M. Inducible expression of Egr-l-dependent genes. A paradigm of transcriptional activation in vascular endothelium [Text] / L. M. Khachigian, T. Collins // Circ Res. - 1997. - Vol. 81, № 4. - P. 457-461.

206. Khan, T. A. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia [Text] / T. A. Khan, F. W. Sellke, R. J. Laham // Gene Therapy. - 2003. - Vol. 10. - P. 285-291.

207. Kim, C. H. Chemokine-chemokine receptor network in immune cell trafficking [Text] / C. H. Kim // Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord . - 2004. - Vol. 4, № 4. - P. 343-361.

208. Klingmiiller, W. Bacterial resistance factors as vectors for gene manipulation and gene therapy [Text] / W. Klingmiiller // MMW Munch. Med. Wochenschr. - 1975. - Vol. 117. - P. 1051-1060.

209. Kornowski, R. Delivery strategies to achieve therapeutic myocardial angiogenesis [Text] / R. Kornowski, S. Fuchs, M. B. Leon, S. E. Epstein // Circulation. - 2000. - Vol. 101. - P. 454-458.

210. Lawall, H. Stem cell and progenitor cell therapy in peripheral artery disease [Text] / H. Lawall, P. Bramlage, B. Amann // Thromb. Haemost. - 2010. - Vol. 103. - P. 696-709.

211. Leeper, Nicholas J. Stem cell therapy for vascular regeneration. Adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells [Text] / Nicholas J. Leeper, Arwen L. Hunter, John P. Cooke// Circulation. - 2010. - Vol. 122. - P.517-526.

212. Leukocyte subpopulations and arteriogenesis: specific role of monocytes, lymphocytes and granulocytes [Text] / I. E. Hoefer, S. Grundmann, N. van Royen [et al.] // Atherosclerosis. - 2005. - Vol. 181, № 2. - P. 285-293.

213. Li, H. Oxidative stress in vascular disease and its pharmacological prevention [Text] / H. Li, S. Horke, U. Forstermann // Trends Pharmacol Sci. -2013. - Vol. 34, № 6. - P. 313-319.

214. Li, H. Uncoupling of endothelial NO synthase in atherosclerosis and vascular disease [Text] / H. Li, U. Forstermann // CurrOpinPharmacol. - 2013. -Vol. 13, №2.-P. 161-167.

215. Lint, P. van. Chemokine and cytokine processing by matrix metalloproteinases and its effect on leukocyte migration and inflammation [Text] / P. van Lint, C. Libert // J. Leukoc. Biol. - 2007. - Vol. 82, № 6. - P. 1375-81.

216. Lloyd, P. G. Arteriogenesis and angiogenesis in rat ischemic hindlimb: role of nitric oxide [Text] / P. G. Lloyd, T. Y. Hsiao, R. L. Teijung // AJP - Heart. -2001. - V. 281. - № 6. - P. H2528-H2538.

217. Long term cultures of human monocytes in vitro. Impact of GM-CSF on survival and differentiation [Text] / A. Eischen [et al.] // J Immunol Methods. -1991. - Vol. 143, № 2. - P. 209-221.

218. Long-term safety of intramuscular gene transfer of non-viral FGF1 for peripheral artery disease [Text] / A. Niebuhr [et al.] // Gene Ther. - 2012. - Vol. 19, № 3. - P. 264—270.

219. Luster, A. D. [Text] /Chemokines—chemotactic cytokines that mediate inflammation / A. D. Luster // N Engl J Med. - 1998. - Vol. 338, № 7. - P. 436445.

220. Macrophages and angiogenesis [Text] / C. Sunderkotter [et al.] //J Leukoc Biol. - 1994. - Vol. 55, № 3. - P. 410-422.

221. Madonna, R. Adipose tissue-derived stem cells: characterization and potential for cardiovascular repair [Text] / R. Madonna, Y. J. Geng, R. De Caterina // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2009. - Vol. 29, N 11. - P. 1723-1729.

222. Maffei, A. Nitric oxide mechanisms of nebivolol [Text] / A. Maffei, G. Lembo // Ther Adv Cardiovasc Dis. - 2009. - Vol. 3, № 4. - P. 317-327.

223. Mangiafico, R. A. Medical treatment of critical limb ischemia: current state and future directions [Text] / R. A. Mangiafico, M. Mangiafico // Curr Vase Pharmacol. - 2011. - Vol. 9, № 6. - P. 658-676.

224. Matrix metalloproteinase activity inactivates the CXCchemokine stromal cell-derived factor-1 [Text] / G. A. McQuibban [et al.] // J Biol Chem. - 2001. -Vol. 276, № 47. - P. 43503- 43508.

225. Michaelson, I. C. The mode of development of the vascular system of the retina with some observations on its significance for certain retinal disorders [Text] /1. C. Michaelson // Trans. Ophtalmolo. Soc. - 1948. - Vol. 68. - P. 137-180.

226. Midttun, M. Blood flow rate during orthostatic pressure changes in the pulp skin of the first toe [Text] / M. Midttun, P. Sejrsen, W. P. Paaske // Eur J Vase Endovasc Surg. - 1997. - № 13. - P. 278-284.

227. Midttun, M. Peripheral blood flow rates and microvascular responses to orthostatic pressure changes in claudicants before and after revascularisation [Text] / M. Midttun, P. Sejrsen, W. P. Paaske// Eur J Vase Endovasc Surg. - 1999. - № 17. - P. 225-229.

228. Miyahara, Y. Monolayered mesenchymal stem cells repair system scarred myocardium after myocardial infarction [Text] / Y. Miyahara, N. Nagaya // Nat. Med. - 2006. - Vol. 12, N 4. - P. 459-465.

229. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction [Text] / S. Shintani [et al.] // Circulation. - 2001. - Vol. 103. - P. 2776-2779.

230. Mochizuki, S. Signaling pathways transduced through the elastin receptor facilitate proliferation of arterial smooth muscle cells [Text] / S. Mochizuki, B. Brassart, A. Hinek // J Biol Chem. - 2002. - Vol. 270, № 47. - P. 44854-44863.

231. Moldovan, L. Role of monocytes and macrophages in angiogenesis [Text] / L. Moldovan, N. I. Moldovan // EXS. - 2005. - Vol. 94. - P. 127-146.

232. Monocyte chemotactic protein-1 increases collateral and peripheral conductance after femoral artery occlusion [Text] / W. D. Ito [et al.] // Circ Res. -

1997. - Vol. 80, № 6. - P. 829-837.

233. More insight into mesenchymal stem cells and their effects inside the body [Text] / Z. Zou [et al.] // Expert Opin Biol Ther. - 2010. - Vol. 10, N 2. - P. 215230.

234. Morishita, R. Hepatocyte growth factor as cardiovascular hormone: role of HGF in the pathogenesis of cardiovascular disease [Text] / R. Morishita, M. Aoki, Y. Yo, T. Ogihara // Endoer J. - 2002. - Vol. 49. - № 3. - P. 273-284.

235. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies [Text] / P. A. Zuk [et al.] // Tissue Eng. - 2001. - Vol. 7, N 2. - P. 211228.

236. Murohara, T. Therapeutic vasculogenesis using human cord blood-derived endothelial progenitors [Text] / T. Murohara // Trends Cardiovasc Med. - 2001. -Vol. 11.-P. 303—307.

237. Myoendothelial differentiation of human umbili-cal cord blood-derived stem cells in ischemic limb tissues [Text] / M. Pesce [et al.] // Circ Res. - 2003. - Vol. 93. -P. 51—62.

238. Nebivolol: haemodynamic effects and clinical significance of combined beta-blockade and nitric oxide release [Text] / O. Kamp [et al.] // Drugs. - 2010. -Vol. 70, № 1.-P. 41-56.

239. Nebivolol in the treatment of cardiacfailure: a double-blindcontrolledclinical trial [Text] / O. Uhlir [et al.] // J. Card. Fail. - 1997. - № 4. - P. 271-276.

240. Nebivolol induces endothelium-dependent relaxations of canine coronary arteries [Text] / Y.S. Gao [et al.] // J. Cardiovasc. Pharmacol. - 1991. - Vol. 17, №6. - P. 964-969.

241. Nikol, S. Viral or non-viral angiogenesis gene transfer - New answers to old questions [Text] / S. Nikol // Cardiovasc. Res. - 2007. - Vol. 73, № 3 - P. 443445.

242. Nikol, S. Therapeutic angiogenesis with intramuscular NV1FGF improves amputation-free survival in patients with critical limb ischemia [Text] / S. Nikol, I. Baumgartner, E. Van Belle // Mol. Ther. - 2008. - Vol. 16, № 5. - P. 972-978.

243. Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in response to tissue ischemia [Text] / T. Murohara [et al.] // J. Clin. Invest. - 1998. - Vol. 101. - P.2567-2578.

244. Norman, P. E. Peripheral arterial disease prognostic significance and prevention of atherothrombotic complications [Text] / P. E. Norman, J. W. Eikelboom, G. J. Hankey // MJA. - 2004. - Vol. 181, № 3. - P. 150-154.

245. Novel cardiac precursor-like cells from human menstrual blood-derived mesenchymal cells [Text] / N. Hida [et al.] // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 1695-1704.

246. Oscillatory shear stress stimulates adhesion molecule expression in cultured human endothelium [Text] / D. C. Chappell [et al.] // Circ Res. - 1998. - Vol. 82, № 5. - P. 532-539.

247. Our top 10 developments in stem cell biology over the last 30 years [Text] / L. Armstrong [et al.] // Stem Cells. - 2012. - Vol. 30, N 1. - P. 2-9.

248. Outcome events in patients with claudication: a 15-year study in 2,777 patients [Text] / S. C. Muluk [et al.] // J Vase Surg. - 2001. - Vol. 33. - P. 251257.

249. Pamela, G. Lloyd. Arteriogenesis and angiogenesis in rat ischemic hindlimb: role of nitric oxide [Text] / G. Lloyd Pamela, T. Yang Hsiao, L. Terjung Ronald // American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. - 2001. - Vol. 281. - H2528-H2538.

250. Parenteral therapy with lipo-ecraprost, a lipid-based formulation of a PGE1 analog, does not alter six-month outcomes in patients with critical leg ischemia [Text] / E. P. Brass [et al.] / J Vase Surg. - 2006. - Vol. 43, №4. - P. 752-759.

251. Peirce, S. M. Microvascular remodeling: a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis [Text] / S. Peirce, T. C. Skalak // Microcirculation. - 2003.-Vol. 10, № 1,-P. 99-111.

252. Peptides derived from two separate domains of the matrix' protein Thrombospondin-1 have anti-angiogenic activity [Text] / S. S. Tolsma [et al.] // J.Cell Biol. - 1993. - Vol. 122, № 2. - P. 497-511.

253. Peripheral endothelial progenitor cells (CD 133+) for therapeutic vasculogenesis in a patient with critical limb ischemia. One year follow-up [Text] / M. C. Canizo [et al.] // Cytotherapy. - 2007. - Vol. 9. - P. 99-102.

254. Phases of gene therapy clinical trials. Gene therapy clinical trials worldwide, provided by the Journal of Gene medicine. - Электрон, дан. - 2013. - Режим доступа: http://www.wiley.com/legacy/wileychi/genmed/clinical/

255. Phelps, Е. A. Update on therapeutic vascularization strategies [Text] / E. A. Phelps, A. J. Garcia // Regen Med. - 2009. - Vol. 4. - P. 65-80.

256. Physiological assessment of augmented vascularity induced by VEGF in ischemic rabbit hindlimb [Text] / C. Bauters [et al.] // Am J Physiol. - 1994. -Vol. 267, № 4. - P. H1263-H1271.

257. Plasmid DNA entry into postmitotic nuclei of primary rat myotubes [Text] / M. E. Dowty [et al.] // PNAS USA. - 1995. - Vol. 92. - P. 4572-4576.

258. Plasticity of human menstrual blood stem cells derived from the endometrium [Text] / J. Lin [et al.] // J. Zhejiang Univ. Sei. В. - 2011. - Vol. 12. -P. 372-380.

259. Prevalence of peripheral arterial disease in high-risk patients using antebrachial index in general practice: a cross-sectional study [Text] / P. Cacoub [et al.] // Int. J. Clin. Pract. - 2009. - Vol. 63, № 1. - P. 63-70.

260. Pollman, M. J. Cell Type-Specific Modulation by Transforming Growth Factor-Bl in Endothelial cells versus smooth muscle cells [Text] / M. J. Pollman, L. Naumovski, G. H. Gibbons // Circulation. - 1999. - Vol. 99. - P. 2019-2026.

261. Pugh, C. W. Regulation of angiogenesis by hypoxia: Role of the HIF system [Text] / C. W. Pugh, P. J. Ratcliffe // Nat Med. - 2003. - Vol. 9, № 6. - P. 677684.

262. Rajagopalan, S. Regional angiogenesis with vascular endothelial growth factor in peripheral arterial disease: a phase II randomized, double-blind, controlled study of adenoviral delivery of vascular endothelial growth factor 121 in patients with disabling intermittent claudication [Text] / S. Rajagopalan, E.R. Möhler III, R.J. Lederman // Circulation. - 2003. - Vol. 108. - P. 1933-1938.

263. Randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial of hepatocyte growth factor plasmid for critical limb ischemia [Text] / H. Shigematsu [et al.] // GeneTher.-2010.-Vol. 17,№9.- P. 1152—1161.

264. Randomised comparison of G-CSF- mobilized peripheral blood mononuclear cells versus bone marrow-mononuclear cells for the treatment of patients with lower limb arteriosclerosis obliterans [Text] / P.P. Huang [et al.] // Thromb.Haemost. - 2007. - Vol. 98. - P. 335-342.

265. Rasmussen, H. S. VEGF gene therapy for coronary artery disease and peripheral vascular disease [Text] / H. S. Rasmussen, C. S. Rasmussen, J. Macko // Cardiovasc. Rad. Med. - 2002. - Vol. 3. - P. 114-117.

266. Recent studies assessing the proliferative capability of a novel adult stem cell identified in menstrual blood [Text] / J. G. Allickson [et al.] // Open Stem Cell J.-2011.-Vol. 3.-P. 4-10.

267. Recommended Standards for reports dealing with lower extremity ischemia: revised version [Text] / R. B. Rutherford [et al.] // J Vase Surg. - 1997. -Vol. 26, № 3. - P. 517-538.

268. Regulators of angiogenesis and strategies for their therapeutic manipulation [Text] / M. Milkiewicz [et al.] // Int J Biochem Cell Biol. - 2006. - Vol. 38, № 3. -P. 333-357.

269. Results of a Double-Blind, Placebo-Controlled Study to Assess the Safety of Intramuscular Injection of Hepatocyte Growth Factor Plasmid to Improve Limb Perfusion in Patients With Critical Limb Ischemia [Text] / D. Henry [et al.] // Circulation.- 2008. - Vol. 118, № 1. - P. 58-65.

270. Rochester, J. R. Characterisation of an experimental model of chronic lower limb ischaemia in the anaesthetised rat [Text] / J. R. Rochester, N. J. Brown, M. W. Reed // Int J Microcirc Clin Exp. - 1994. - Vol. 14. - № 2. - P. 27-33.

271. Role of ischemia and of hypoxia-inducible genes in arteriogenesis after femoral artery occlusion in the rabbit [Text] / E. Deindl [et al.] // Circ Res. - 2001. - Vol. 89, № 9. - P. 779-786.

272. Role of Transforming Growth Factor-] in Cardiovascular Inflammatory Changes Induced by Chronic Inhibition of Nitric Oxide Synthesis [Text] / M. Koyanagi [et al.] // Hypertension. - 2000. -Vol. 35. - № 1. - P. 86.

273. Rosova, I. Hypoxic preconditioning results in increased motility and improved therapeutic potential of human mesenchymal stem cells [Text] / I. Rosova // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 2173-2182.

274. Ross, R. Atherosclerosis: an inflammatory disease [Text] / R. Ross // N. Engl. J. Med. - 1999. - Vol. 340. - P. 115-126.

275. Ruan, L. M. Effects of Losartan on expression of connexins at the early stage of atherosclerosis in rabbits [Text] / L. M. Ruan, W. Cai, J. Z. Chen, J. F. Duan // Int J Med Sei. - 2010. - Vol. 8, № 2. - P. 82-89.

276. Safety and efficacy study using gene therapy for critical limb ischemia. -Электрон. дан. - 2012. - Режим доступа: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01548378

277. Safety and efficacy study using gene therapy for critical limb ischemia. -Электрон. дан. - 2013. - Режим доступа: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01064440

278. Schaper, W. Factors regulating arteriogenesis [Text] / W, Schaper, D. Scholz // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2003. - Vol. 23, № 7. - P. 1143-1151.

279. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells [Text] / J. Rehman [et al.] // Circulation. - 2004. - Vol. 109. - P. 1292-1298.

280. Semenza, G. L. Signal transduction to hypoxia-inducible factor 1 [Text] / G. Semenza // Biochem Pharmacol. - 2002. - Vol. 64, № 6. - P. 993-998.

281. Semenza, G. L.Regulation of tissue perfusion in mammals by hypoxia-inducible factor 1 [Text] / G. L. Semenza // Exp Physiol. - 2007. - Vol. 92,№ 6. -P. 988-991.

282. Shammas, N. W. Epidemiology, classification, and modifiable risk factors of peripheral arterial disease [Text] / N. W. Shammas // Vase Health Risk Manag. -2007. - Vol. 3, № 2. - P. 229-234.

283. Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells [Text] / T. Nagel [et al.] // J Clin Invest. - 1994. - Vol. 94, № 2. - P. 885-891.

284. Shireman, P. K. The chemokine system in arteriogenesis and hind limb ischemia [Text] / P. K. Shireman // J Vase Surg. - 2007. - Vol. 45 ( Suppl. A). -P. 48A-56A.

285. Shore, A. C. Capillaroscopy and the measurement of capillary pressure [Text] / A. C. Shore // Br J Clin Pharmacol. - 2000. - Vol. 50, № 6. - P. 501-513.

286. Shyu, K. - G. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hind limb ischemia [Text] / K. - G. Shyu, H. Chang, J. M. Isner // Life Sciences. -2003. - Vol. 73. - P. 563-79.

287. Silverman, E. S. Pathways of Egr-l-mediated gene transcription in vascular biology [Text] / E. S. Silverman, T. Collins // Am J Pathol. - 1999. - Vol. 154, № 3. - P. 665-670.

288. Simvastatin and losarían differentially and synergistically inhibit atherosclerosis in apolipoproteine(-/-) mice [Text] / B. S. Lee [et al.] // Korean Circ J. - 2012. - Vol. 42, № 8. - P. 543-550.

289. Sinn, P. L. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency [Text] / P. L. Sinn, S. L. Sauter, P. B. McCray // Gene Therapy. - 2005. -Vol. 12.-P. 1089-1098.

290. Site-specific therapeutic angiogenesis after systemic administration of vascular endothelial growth factor [Text] / C. Bauters [et al.] // J Vase Surg. -

1995.-Vol. 21.-P. 314-324.

291. Sleight, P. The HOPE Study (Heart Outcomes Prevention Evaluation) [Text] / P. Sleight // J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. - 2000. - Vol. 1, № 1. - P. 18-20.

292. Soluble factors released by endothelial progenitor cells promote migration of endothelial cells and cardiac resident progenitor cells [Text] / C. Urbich [et al.] // J Mol Cell Cardiol. - 2005. - Vol. 39, № 5. - P. 733-742.

293. Springer, M. A. Balansing act: Therapeutic approaches for the modulation of angiogenesis [Text] / M. A. Springer // Curr Opin Invest Drugs. - 2006. - Vol. 7. -P. 243-50.

294. Stewart, K. Exercise training for claudication [Text] / K. Stewart, W. Hiatt, J. Regensteiner, A. Hirsch // N Engl J Med. - 2002. - Vol. 347. -№ 24. - P. 19411951.

295. Stromal cell-derived factor-1 effects on ex vivo expanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemic neovascularization [Text] / J. Yamaguchi [et al.] // Circulation. - 2003. - Vol. 107, № 9. - P. 1322-1328.

296. Study to Evaluate the Safety and Efficacy of JVS-100 Administered to Adults With Critical Limb Ischemia. - Электрон, дан. - 2013. - Режим доступа: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01410331

297. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells [Text] / S. Gronthos [et al.] // J Cell Physiol. - 2001. - Vol. 189, N 1. - P. 5463.

298. Targeted delivery of the DNA using YEE (GalNAcAH)3, a synthetic glycopeptide ligand for the glycoprotein receptor [Text] / J. R. Merwin [et al.] // Bioconjug. Chem. - 1994. - Vol. 5. - P. 612-620.

299. Tawa, M. Influence of Hypoxia on Endothelium-Derived NO-Mediated Relaxation in Rat Carotid, Mesenteric and Iliac Arteries [Text] / M. Tawa, T. Shimosato, A. Geddawy, T. Imamura // Pharmacology. - 2013. - Vol. 21, №6. - P. 322-330.

300. Tchaikovski, V. The molecular basis of VEGFR-1 signal transduction pathways in primary human monocytes [Text] / V. Tchaikovski, G. Fellbrich, J. Waltenberger // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2008. - Vol. 28, № 2. - P. 322328.

301. Temporal patterns of gene expression after acute hindlimb ischemia in mice: insights into the genomic program for collateral vessel development [Text] / C. W. Lee [et al.] // J Am Coll Cardiol. - 2004. - Vol. 43, № 3. - P. 474-482.

302. The biology of vascular endothelial growth factors [Text] / T. Tammela [et al.] // Cardiovasc Res. - 2005. - Vol. 65, № 3. - P. 550-563.

303. The effects of newer beta-adrenoceptor antagonists on vascular function in cardiovascular disease [Text] / M. Wehland [et al.] // Curr Vase Pharmacol. -2012. - Vol. 10, № 3. - P. 378-390.

304. The effect of oral L-arginine supplementation on fasting glucose, HbAlc, nitric oxide and total antioxidant status in diabetic patients with atherosclerotic peripheral arterial disease of lower extremities [Text] / A. Jablecka [et al.] // Eur Rev Med PharmacolSci. - 2012. - Vol. 16, № 3. - P. 342-350.

305. The effects of perindopril on aortic elasticity and inflammatory markers in hypertensive patients [Text] / C. Koz [et al.] // Med Sei Monit. - 2009. - Vol. 15, № 7. - P.41-45.

306. Therapeutic angiogenesis: a single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model [Text] / S. Takeshita [et al.] // J Clin Invest. - 1994. - Vol. 93. - P. 662- 670.

307. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial [Text] / E. Tateishi-Yuyama [et al.] // Lancet. - 2002. - Vol. 360. - P. 427-35.

308. Therapeutic angiogenesis induced by human recombinant hepatocyte growth factor in rabbit hind limb ischemia model as cytokine supplement therapy [Text] / R. Morishita [et al.] // Hypertension. - 1999. - Vol. 33, № 6. - P. 1379 -1384.

309. Therapeutic angiogenesis with intramuscular NV1FGF improves amputation-free survival in patients with critical limb ischemia [Text] / S. Nikol [et al.] // Mol Ther. - 2008. - Vol. 16, № 5. - P. 972—978.

310. Timing of pre-operative beta-blocker treatment in vascular surgery patients [Text] / W.-J. Flu [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. - 2010. - Vol. 56, № 23. - P. 1922-1929.

311. Toblli, J. E. Nebivolol: impact on cardiac and endothelial function and clinical utility [Text] / J. E. Toblli, F. DiGennaro, J. F. Giani, F. P. Dominici // Vase Health Risk Manag. - 2012. - № 8. - P. 151-160.

312. Topper, J. N. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype [Text] / J. Topper, M. A. GimbroneJr. // Mol Med Today. - 1999. - № 5. - P. 40-46.

313. Topper, J. N. TGF-b in the cardiovascular system: molecular mechanisms of a context-specific growth factor [Text] / J. N. Topper // Trends Cardiovasc Med. -2000.-№ 10.-P. 132-137.

314. Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization [Text] / C. Kalka [et al.] // Proc Natl Acad Sei U S A. - 2000. - Vol. 97, № 7. - P. 3422-3427.

315. Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization [Text] / T. Murohara [et al.] // J Clin Invest. - 2000. -Vol. 105.-P. 1527—1536.

316. Treatment of intermittent claudication with physical training, smoking cessation, pentoxifylline, or nafronyl: a meta-analysis [Text] / B. Girolami [et al.] // Arch. Intern. Med. - 1999. - Vol. 159, № 4. - P. 337-345.

317. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid [Text] / D. R. Senger [et al.] // Science. - 1983. -Vol. 219.-P. 983-985.

318. Urbich, C. Endotelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology [Text] / C. Urbich, S. Dimmler // Circ Res. - 2004. - Vol. 95, № 4. - P. 343-353.

319. Vascular endothelial growth factor : a new member of the platelet-derived growth factor gene family [Text] / E. Tischer [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1989. - Vol. 165. - P. 1198-206.

320. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen [Text] / D. W. Leung [et al.] // Science. - 1989. - Vol. 246. - P. 1306-1309.

321. Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDF [Text] / P. J. Keck [et al.] // Science. - 1989. - Vol. 246. - P. 1309-1312.

322. Vascular remodeling and altered protein expression during growth of coronary collateral arteries [Text] / C. Wolf [et al.] // J Mol Cell Cardiol. - 1998. -Vol. 30, № 11. - P. 2291-2305.

323. Vein versus polytetrafluoroethylene in above-knee femoropopliteal bypass grafting: five-year results of a randomized controlled trial [Text] / P. Klinkert [et al.] // J Vase Surg. - 2003. - Vol. 37. - №. 1. - P. 149-55.

324. Virdis, A. Effects of antihypertensive treatment on endothelial function [Text] / A. Virdis, L. Ghiadoni, S. Taddei // CurrHypertens Rep. - 2011. - Vol. 13, №4.-P. 276-281.

325. Wang, X. Q. The thrombospondin receptor CD47 (IAP) modulates and associates with a2Bl integrin in vascular smooth muscle cells [Text] / X. Q. Wang, W. A. Frazier // Mol. Biol. Cell. - 1998. - Vol. 9. - P. 865-874.

326. Watson, L. Exercise for intermittent claudication [Text] / L. Watson, B. Ellis, G. C. Leng // Cochrane Database of Systematic Reviews. - 2008. - Issue 4.

327. Wiley Gene Therapy Clinical Trials Worldwide. - Электрон, дан. - 2013. -Режим доступа: http://www.wiley.com/legacy/wileychi/genmed/clinical/

328. Williams, P. D. Development of viral vectors for use in cardiovascular gene therapy [Text] / P. D. Williams, P. Ranjzad, S. J. Kakar // Viruses. - 2010. - Vol. 2.-P. 334—371.

329. Wood, K. J. Gene therapy: potential applications in clinical transplantation [Text] / K. J. Wood, J. Fry // Expert Rev Mol Med. - 1999. - Vol. 1999 - P. 1-20.

330. Yang, Y. Clearance of adenovirus-infected hepatocytes by MHC class I restricted CD4+ CTLs in vivo [Text] / Y. Yang, J. M. Wilson // J. Immunol. -1995. - Vol. 155, № 5. - P. 2564-2569.

331. Yla-Herttuala, S. Vascular endothelial growth factors: biology and current status of clinical application in cardiovascular medicine [Text] / S. Yla-Herttuala, Т. T. Rissanen, I. Vajanto I // JMCC. - 2007. - Vol. 49. - P. 1015-1026.

332. Yoshida, M. Intra-arterial bone marrow cell transplantation induces angiogenesis in rat hindlimb ischemia. [Text] / M. Yoshida, H. Horimoto, S. Mieno // Eur. Surg. Res. - 2003. - Vol. 35. - P. 86-91.

333. Zankhana, Raval / Cell therapy of peripheral arterial disease. From experimental findings to clinical trials [Text] // Raval Zankhana, Douglas W. Losordo // Circulation Research. - 2013. - Vol. 112. - P.1288-1302.

334. Ziehe, M. Nitric oxide and angiogenesis [Text] / M. Ziehe, L. Morbidelli // Journal of Neuro-Oncology. - 2000. - Vol. 50, №. 2. - P. 139-148.