Комплексное лечение больных с хронической ишемией нижних конечностей: сочетание реконструктивных операций с генно-инженерными технологиями (клинико-экспериментальное исследование) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.26, доктор медицинских наук Воронов, Дмитрий Александрович

• Воронов, Дмитрий Александрович
• доктор медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Воронов, Дмитрий Александрович

Оглавление

Введение

Глава 1. Обзор литературы

РАЗДЕЛ I. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Глава 2. Экспериментальное изучение возможности стимуляции роста сосудов при использовании генно-инженерных конструкций с генами факторов ангиогенеза

2.1. Создание самоэкспрессирующихся генно-инженерных конструкций, несущих гены факторов ангиогенеза

2.2. Испытание потенциальной ангиогенной активности созданных генно-инженерных конструкций на биологических моделях

2.3. Испытание ангиогенной активности и первичная оценка безопасности созданных генно-инженерных конструкций на модели ишемии конечности млекопитающих

РАЗДЕЛ II. КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Глава 3. Материал и методы

3.1. Общая характеристика пациентов

3.2. Характеристика больных, у которых метод был использован в составе комплексного консервативного лечения

3.3. Характеристика группы комбинированного лечения (хирургическое лечение + генно-инженерные технологии стимуляции ангиогенеза) и методов хирургической реваскуляризации

3.4. Методы обследования и оценки результатов

Глава 4. Результаты использования генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза в качестве самостоятельного метода лечения

Глава 5. Результаты использования генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза в составе комплексного (в сочетании с

хирургическими реваскуляризациями) лечения

Глава 6. Вопросы безопасности использования генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза и прогнозирования результатов

лечения

Обсуждение

Выводы

Практические рекомендации

Список литературы

Список сокращений

Б - Интенсивность боли

БОЕ - бляшкообразующая единица

ГМК - гладкомышечные клетки

Дшах - максимальная проходимая дистанция

ДББХ - дистанция безболевой ходьбы

ЖА - жизненная активность

ЛПИ- лодыжечно-плечевой индекс

JICK (Vs) - линейная (систолическая) скорость кровотока

03 - общее состояние здоровья

ПЗ - психическое здоровье

РФ - ролевое физическое функционирование

РЭФ - ролевое эмоциональное функционирование

СВО - системная воспалительная реакция

СФ - социальное функционирование

ФФ - физическое функционирование

ХИНК - хроническая ишемия нижних конечностей

Ad5 - вектор на основе аденовируса человека 5-го типа

ANG - ангиогенин

CELO - вектор на основе вируса CELO GFP - зеленый флуоресцентный белок PBS - натрий-фосфатный буфер pGEM - векторная система для клонирования VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексное лечение больных с хронической ишемией нижних конечностей: сочетание реконструктивных операций с генно-инженерными технологиями (клинико-экспериментальное исследование)»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Ишемические состояния, обусловленные окклюзионно-стенотическими поражениями магистральных и периферических артерий, по-прежнему занимают значительную часть в структуре болезней системы кровообращения [3, 26, 30]. Лечение хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей и обусловленной ими хронической ишемии нижних конечностей, в т.ч. критической, представляют на сегодняшний день одну из нерешенных проблем ангиологии и сосудистой хирургии [12, 19, 26, 30]. В настоящее время основная роль в лечении окклюзионно-стенотических поражений артерий нижних конечностей отводится хирургическим реконструктивным операциям. Следует отметить, что лечебные эффекты современных методик хирургического лечения данных поражений, в том числе прямых реконструктивных операций, непрямых реконструкций или их сочетаний во многом определяются состоянием дистального артериального русла нижних конечностей. Результаты сосудистых реконструкций, выполненных у пациентов с преимущественно дистальными формами поражений артерий нижних конечностей, являются неудовлетворительными [3, 10, 21, 27, 29, 33]. К настоящему моменту возможности стандартных хирургических методов лечения пациентов с дистальными формами хронической ишемии нижних конечностей практически исчерпаны. Несмотря на имеющиеся в настоящее время достижения в сосудистой хирургии и фармакотерапии сосудистых заболеваний, существует целая группа пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (ХИНК), в отношении которых существующие лекарственные средства малоэффективны, а методы хирургического лечения (даже наиболее современные) не позволяют достичь клинически значимого результата, либо демонстрируют хорошие результаты лечения в ближайшем

5

послеоперационном периоде, но отдаленные их результаты по-прежнему остаются неудовлетворительными. Технически правильно и оптимально наложенный артериальный шунт, к сожалению, не способен функционировать долго в условиях высокого периферического артериального сопротивления, при выраженном диффузном поражении артериального русла конечностей, что в ряде случаев сводит эффективность такого хирургического вмешательства к минимуму. Фармакотерапевтической же альтернативы для этой категории пациентов, т.е. средства, эффективность которого может быть сопоставима с эффективностью успешно выполненной хирургической реваскуляризации, в настоящее время нет [2, 7,9, 11, 20, 26, 29,29, 30,33, 126].

В этой связи ведется поиск новых подходов к решению данной проблемы. В частности, активно обсуждается возможность использования методик стимуляции ангиогенеза в пораженных конечностях, основанных на возможностях генно-инженерных технологий [6, 8, 13, 18, 22, 24, 25, 35, 46, 60, 67, 71, 82, 90, 91, 136, 158]. В 2004 г., выступая на встрече главных кардиохирургов регионов и руководителей сердечно-сосудистых центров страны в преддверии X Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов, главный специалист по сердечно-сосудистой хирургии МЗ РФ академик РАМН Л.А.Бокерия сказал буквально следующее: « ... На современном этапе достичь дальнейшего прогресса в лечении сердечнососудистых заболеваний можно только с использованием новых методов и подходов, одними из которых являются генно-инженерные и клеточные технологии...». Таким образом были обозначены пути дальнейшего развития фундаментальных и прикладных исследований в области лечения сердечнососудистых заболеваний, и в частности, новые подходы к лечению пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. Следует подчеркнуть, что геномные и постгеномные технологии создания лекарственных средств, клеточные технологии и нанотехнологии, т.е. сферы научных изысканий в компетенции которых находится рассматриваемая нами проблема, находятся

6

в Перечне Критических технологий РФ и Приоритетных направлений развития науки, технологий и техники в РФ, утвержденным Президентом РФ 21.05.2006 г.

Соответственно, разработка новых инновационных методов лечения больных с ХИНК, основанных в частности на генно-инженерных методах стимуляции ангиогенеза, позволит вывести проблему лечения этой сложной категории пациентов на принципиально новый уровень. Наиболее интересным при этом представляется комплексное применение реконструктивных сосудистых операций, направленных на восстановление магистрального кровотока, с генно-инженерными методами стимуляции неоангиогенеза, направленных на развитие микроциркуляторного русла и улучшения перфузии дистальных отделов тканей и органов [8].

Исследования ангиогенеза и поиск факторов, влияющих на него, были начаты J.Folkman еще в середине 70-х годов, позднее им были выделены белковые ангиогенные факторы, т.е. факторы, стимулирующие рост кровеносных сосудов [71, 72]. В настоящее время известно несколько десятков таких факторов, из которых в исследованиях наиболее обсуждаемыми с точки зрения клинического использования при ишемии нижних конечностях являются фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF) и ангиогенин (ANG). В целом ряде исследований показана роль этих факторов в неоангиогенезе, возникающем в ответ на гипоксию тканей [88, 97, 98, 105, 108, 129, 140, 148, 159, 169]. Пионером в использовании данной методики в лечении ишемии нижних конечностей был J.Isner (США), который в 1994 году продемонстрировал положительное влияние введенного гена VEGF в формировании коллатеральных сосудов на животных моделях критической ишемии, а затем в 1996 успешно применил ген, кодирующий синтез VEGF, для лечения пациентов с ишемией нижних конечностей [95, 96, 97, 99]. В последующем аналогичные результаты были получены и другими авторами: I.Baumgartner, S. Rajagopalan и др [46,47, 100, 114, 148, 149].

В России имеются отдельные публикации по экспериментальному и клиническому использованию генов VEGF и ANG в лечении хронической ишемии нижних конечностей и ишемической болезни сердца [4, 5, 8, 25, 31, 34]. В этих работах на сравнительно небольшом материале продемонстрирован положительный эффект данной технологии лечения. Работы, всеобъемлюще систематизирующие клинические результаты применения генно-инженерных технологий индукции ангиогенеза у пациентов с ХИНК, экспериментально обосновывающие особенности их использования в различных клинических ситуациях, и соответственно предлагающие конкретный протокол применения данных технологий в клинической практике, в настоящее время отсутствуют.

Цель исследования:

Улучшение результатов лечения больных с хронической ишемией нижних конечностей путем разработки и применения нового метода комплексного лечения на основе сочетания реконструктивных сосудистых операций с генно-инженерными методиками стимуляции ангиогенеза

Задачи исследования:

1. Определить потенциальную ангиогенную активность оригинальных генно-инженерных конструкций с генами фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и ангиогенина (ANG) на биологических моделях.

2. Экспериментально обосновать возможность индукции ангиогенеза при применении конструкций с генами VEGF и ANG на модели ишемии конечности млекопитающих.

3. Определить возможность использования генно-инженерных методов стимуляции ангиогенеза в клинической практике у пациентов с ХИНК.

4. Определить группы больных, в отношении которых применение данных технологий наиболее эффективно

5. Изучить сравнительную эффективность использования различных сочетаний хирургических реконструкций и методов индукции ангиогенеза в зависимости от характера поражения артериального русла нижних конечностей

6. Оценить ближайшие и отдаленные результаты комплексного лечения пациентов с ХИНК использованием генов-индукторов ангиогенеза

7. Оценить безопасность предлагаемых технологий индукции ангиогенеза

Научная новизна

Созданы оригинальные генно-инженерные конструкции с генами-стимуляторами ангиогенеза, способные при введении в ишемизированные ткани стимулировать рост капилляров и развитие микроциркуляторного русла.

Экспериментально обоснована возможность применения созданных генно-инженерных конструкций в клинической практике и определены механизмы, определяющие особенности клинического применения.

Впервые разработан клинический протокол применения генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей.

Впервые разработан и внедрен метод комплексного лечения больных с хронической ишемией нижних конечностей, основанный на сочетании реконструктивных сосудистых операций с генно-инженерными технологиями стимуляции ангиогенеза.

Выделены группы больных, у которых использование методов стимуляции ангиогенеза наиболее эффективно.

Впервые проведена сравнительная комплексная оценка эффективности и безопасности метода в эксперименте и в клинической практике.

Практическая значимость

Применение данных технологий в комплексном лечении пациентов с ХИНК позволит улучшить его результаты, прежде всего в отношении больных с дистальными формами поражения, в отношении которых существующие на сегодняшний день методы фармакотерапии малоэффективны, а результаты хирургического лечения не являются удовлетворительными

Ранее отсутствующая возможность лечения определенных групп пациентов с ХИНК с помощью предлагаемого метода позволит снизить показатели инвалидизации больных и снизить число выполняемых ампутаций.

Предлагаемые критерии отбора пациентов и прогнозирования его эффективности позволяют использовать данный метод как в условиях стационарной, так и амбулаторной практики.

Предложенные экспериментальные модели и выявленные закономерности могут быть использованы в дальнейшем при испытании новых фармакологических агентов, воздействующих на микроциркуляторное русло у пациентов с ХИНК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Созданные оригинальные генно-инженерные конструкции с генами факторов ангиогенеза могут эффективно стимулировать ангиогенез в ишемизированных тканях в эксперименте и в реальных клинических условиях у больных с ХИНК.

2. У пациентов с ХИНК генно-инженерные технологии стимуляции ангиогенеза могут быть эффективно использованы как в качестве компонента комплексного консервативного лечения, так и в виде

комбинированного лечения в сочетании с реконструктивными сосудистыми операциями.

3. Наиболее эффективно использование генно-инженерных конструкций с генами-стимуляторами ангиогенеза при лечении пациентов с ХИНК в случаях изолированного или сочетанного поражения дистального артериального русла нижних конечностей.

4. Комбинация реваскуляризирующих операций с технологиями стимуляции ангиогенеза позволяет достичь лучших результатов в отдаленном периоде наблюдения по сравнению с использованием этих методов по отдельности.

5. Эффективность применения генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза зависит от характера и распространенности поражения артериального русла нижних конечностей, степени ишемии и функционального резерва микроциркуляции нижних конечностей, что позволяет прогнозировать результат использования данных технологий у конкретного пациента.

6. Предложенные технологии лечения хорошо переносимы и безопасны в ближайшем и отдаленном периодах наблюдения.

Внедрение результатов исследования

Разработанный метод комплексного лечения внедрен и используется в практике отделения хирургии сосудов ФГБУ «РНЦХ им. акад. Б.В.Петровского» РАМН.

Апробация работы

Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены:

на IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVII Всероссийских съездах сердечно сосудистых хирургов, 2003, 2004. 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2011 гг.;

на X, XI, XII Ежегодных сессиях Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН, Москва, 2006, 2007, 2008 гг.;

на III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004 г.;

на Научной конференции молодых ученых «Новое в реконструктивной хирургии», Москва, 2004 г;

на V съезде Российского общества медицинских генетиков, Уфа, 2005г.;

на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2005 г.;

на 56th International Congress of The European Society for Cardiovascular Surgery, Venice, Italy, 2007;

на VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 2010 г.;

на 23 (XXVII) Международной конференции «Актуальные вопросы сосудистой хирургии», Санкт-Петербург, 2012 г;

на научной конференции отделения хирургии сосудов ФГБУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» РАМН 21.12.2012 г.

Публикации

По теме диссертации опубликована 51 научная работа, в т.ч. 18 статей в журналах из перечня ВАК, получено 2 патента на изобретение.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 247 страницах и состоит из введения, 6 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Библиографический указатель включает 182 источника, в т.ч. 35 отечественных и 147 зарубежных.

Диссертация содержит 41 таблицу и 39 рисунков.

В 2006 — 2007 гг. работа частично поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) № 06-04-083Пофи по разделу «Ориентированные фундаментальные исследования»

Автор работы выражает особую благодарность Российскому научному центру хирургии им. акад. Б.В.Петровского РАМН и лично Почетному

директору академику |Б.В.Петровскому|, директорам академику РАМН

Б.А.Константинову! и профессору С.Л.Дземешкевичу за всестороннюю

поддержку работы на всех этапах ее выполнения и обеспечение

возможностей ее реализации; академику РАМН [Н.П.Бочкову| за новаторские идеи, научную и практическую координацию выполнения данной работы; научному консультанту член-корр. РАМН, проф. А.В.Гавриленко за ценные идеи, поддержку исследования и создание автору необходимых условий работы; зам. директора НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН проф. Б.С.Народицкому, зам. директора Института молекулярной генетики РАН проф. В.З.Тарантулу и ст.н.с. того же Института к.б.н. Н.В.Хайдаровой за реализацию молекулярно-генетической части данной работы и неоценимую помощь в проведении экспериментальных исследований; руководителю отделения патологической анатомии РНЦХ

РАМН, проф. [Г.Ф.Шереметьевой! и ст.н.с. того же отделения к.б.н. Е.З.Кочарян за помощь в проведении морфологических исследований; сотрудникам различных служб и подразделений РНЦХ им. акад. Б.В.Петровского РАМН за научную и практическую помощь при выполнении данной работы.

Глава 1 Обзор литературы

1. Введение

Болезни системы кровообращения являются причиной около 17 млн. смертельных случаев ежегодно в мире и в структуре смертности населения развитых стран занимают одно из первых мест. Значительная часть болезней системы кровообращения в свою очередь обусловлена поражением сосудистого русла (чаще всего атеросклеротического генеза), что ведет к возникновению острых и хронических форм ишемической болезни сердца, ишемии нижних конечностей и головного мозга. Лечение и реабилитация этих пациентов требуют привлечения огромных ресурсов. Кроме того, многие из этих заболеваний являются инвалидизирующими, а с учетом того, что болезни системы кровообращения поражают все более молодых людей трудоспособного возраста, эта проблема приобретает еще и большую социальную значимость [3,15,16, 22, 139, 164, 165].

Современная медицина достигла больших успехов в лечении данной категории пациентов. Для лечения ранних форм сердечно-сосудистых заболеваний, а также для их первичной и вторичной профилактики созданы эффективные лекарственные препараты [2, 16, 20, 26, 29]. Однако, при наличии гемодинамически значимых поражений сосудистого русла, наиболее эффективным методом лечения является хирургический: выполнение реконструктивных сосудистых операций, а также эндоваскулярных вмешательств [9, 12, 27, 30, 33]. С каждым годом увеличивается число выполняемых операций коронарного шунтирования, реконструктивных операций на артериях нижних конечностей, стентирований. Следует, однако, подчеркнуть, что данные вмешательства имеют свои ограничения, связанные прежде всего с анатомией поражения сосудов и его распространенностью. В результате, существует значительная группа пациентов, в отношении

которых фармакотерапия малоэффективна, а выполнение реконструктивных операций либо технически невозможно, либо их выполнение обречено на неудовлетворительный результат в отдаленном периоде. К такой категории относятся пациенты с диффузным поражением коронарного русла, а также пациенты с т.н. «дистальными» формами поражения артерий нижних конечностей и коронарных артерий. Кроме того, в ряде случаев адекватно выполненная реваскуляризация не гарантирует стойкого гемодинамического результата. В частности, как при стентировании, так и при шунтирующих операциях, большую проблему представляет неоинтимальная гиперплазия, которая приводит к рестенозу стентов и тромбозу шунтов, эффективной профилактики которой в настоящее время не существует [7, 12, 15, 16,27, 30, 33]. Все эти факты способствуют поиску принципиально новых подходов и технологий лечения, направленных прежде всего на патогенетические звенья. Одним из таких подходов является воздействие на процессы роста и образования сосудов (ангиогенеза) с помощью генно-инженерных технологий [138,140, 145].

Следует отметить, что такие направления развития фундаментальной и

прикладной науки как геномные и постгеномные технологии создания

лекарственных средств, клеточные технологии, нанотехнологии и

наноматериалы и другие отнесены к Критическим технологиям РФ и

Приоритетным направлениям развития науки, технологий и техники в РФ,

утвержденным Президентом РФ 21.05.2006 г. Кроме того, в последнее время

во всем мире в различных отраслях медицины все большее внимание

уделяется т.н. «трансляционным» исследованиям или «трансляционной»

медицине - новому этапу развития молекулярной медицины, основная цель

которого состоит в применении достижений фундаментальных медико-

биологических наук для поиска эффективных методов диагностики и лечения

с точки зрения максимально эффективного перевода результатов

фундаментальных научных исследований в инновации, востребованные на

рынке медицинских услуг. Одним из основных приоритетных направлений

16

развития «трансляционной» медицины (наряду с разработкой инновационных методов молекулярной диагностики, созданием новых медицинских устройств и искусственных органов, тканевой инженерией, инновационными технологиями обработки биомедицинских данных и др) является т.н. «генная терапия» или «генотерапия». В свою очередь одним из наиьолее интересных направлений генной терапии является «терапевтический ангиогенез», представляющий из себя комплекс технологий по стимуляции образования новых сосудов в тканях с помощью генных индукторов для лечения или профилактики патологических состояний, причиной которых являются нарушения кровообращения [6, 8, 13, 24, 32,48,60, 68, 72, 77,91,92, 102, 117, 166, 171].

Интерес к использованию методов генотерапии в лечении болезней системы кровообращения, в том числе ишемии различных тканей (нижних конечностей, миокарда), обусловленных поражениями сосудов вследствие атеросклеротических процессов, сахарного диабета или артериита, существенно возрос за последние 5—7 лет. Так, если среди всех экспериментальных и клинических исследований по генотерапии, проводимых в США в 1999—2003 гг., доля работ по сердечно-сосудистой патологии составляла 2—5%, то в 2003—2008 гг. она уже увеличилась до 15—18% [13, 24, 32].

2. Фундаментальные основы ангиогенеза и принципы его стимуляции при лечении сердечно-сосудистых заболеваний

Для инициирования ангиогенеза требуется активизация эндотелия, например ишемией или циркулирующимим факторами роста [53, 54, 57, 77, 96, 153]. В условиях ишемии нарушаются межклеточные связи эндотелиальных клеток, происходит опосредованное увеличение сосудистой проницаемости вследствие деформации мембраны клеток и перераспределения внутриклеточных молекул. Транссудация плазменных

17

белков создаёт среду для перемещения эндотелиальных клеток [171]. Одна, так называемая «лидирующая клетка» начинает мигрировать, сопровождаемая другими клетками, в область формирования коллатерального сосуда. Местный выход матричных металлопротеиназ и плазминогена разрушает окружающий внеклеточный матрикс, в то время как мигрирующие эндотелиальные клетки начинают формировать сосуд. Новые эндотелиальные клетки восстанавливают межклеточные связи и затем при задействовании клеток гладких мышц и фибробластов создаётся зрелый сосуд [54, 60, 64].

Ангио- и васкулогенез состоит из ряда отдельных и взаимосвязанных этапов, реализуемых на клеточном и биохимическом уровнях, в т.ч.: а) активации эндотелиальных клеток и перицитов; б) деградации базальной мембраны; в) миграции и пролиферации эндотелиальных клеток и перицитов; г) образования просвета в новом капиллярном сосуде; д) появления перицитов вокруг новых капилляров; е) образования новой базальной мембраны; ж) образования капиллярных петель; з) инволюции прежних и дифференцировки новых сосудов; и) образования капиллярной сети, а в конечном счете - формирования больших по размеру сосудов [35, 57,71, 171].

Активация эндотелиальных клеток, их миграция, пролиферация и реорганизация регулируются сложным балансом про- и антиангиогенных механизмов. Исследования ангиогенеза и поиск факторов, влияющих на него, были начаты 1.Ро1ктап еще в середине 70-х годов, позднее им были выделены белковые ангиогенные факторы, т.е. факторы, стимулирующие рост кровеносных сосудов [71, 72]. 1.Ро1ктап вел поиск путем воздействия на опухолевый рост и метастазирование путем попыток использования факторов, ингибирующих ангиогенез. Позднее с развитием генно-инженерного направления в медицине и накоплением новых знаний пришло осознание возможностей воздействия на ангиогенез не только для борьбы с

раком, но и для лечения иных патологических состояний, и прежде всего сердечно-сосудистых заболеваний.

К наиболее важным проангиогенным (стимулирующим) факторам роста относятся: фактор роста фибробластов (БОР), фактор роста эндотелия сосудов (УЕвР), ангиогенин ^N0), тромбоцитозависимый фактор роста, фактор роста гепатоцитов (НОР), трансформирующий фактор роста (ТвРа/р), фактор некроза опухоли (ЮТ-а), плацентарный фактор роста, ангиопоэтин, оксид азота и др. Среди антиангиогенных веществ наиболее изучены эндостатин, ангиостатин, тромбоспондин, тропонин-1, тканевые ингибиторы матричных металлопротеиназ (Т1МР) и др [35, 58, 60, 62, 63, 77, 90,127, 151, 167].

Таким образом, регуляция роста сосудов в организме происходит путем сложных взаимодействий этих и других активных факторов. В этой связи перспективным направлением является возможность регуляции их количества извне. В частности, искусственное повышение концентрации проангиогенных факторов может запустить каскад роста новых сосудов, в т.ч. и в ишемизированных тканях [151, 152]. Однако, в экспериментах попытки введения в ишемизированные зоны непосредственно белковых факторов роста не привели к желаемому результату: они быстро разрушались или «вымывались» из участков тканей, что не позволяло увеличить их концентрацию на достаточный период времени. В этой связи возникла идея введения в зону интереса не собственно самого белкового ростового фактора, а гена, который его кодирует. Общий принцип действия в этом случае выглядит следующим образом: в зону интереса вводится ген, после чего процессы транскрипции происходят непосредственно в организме объекта, что в свою очередь обеспечивает пролонгированный синтез белкового фактора роста и повышение его концентрации в ткани, а следовательно обеспечивает и необходимое воздействие на звенья ангиогенеза [98,117].

Применительно к сердечно-сосудистым заболеваниям наиболее активно изучается возможность использования генов таких проангиогенных факторов, как VEGF, bFGF и ANG [13, 18, 24, 35, 65, 123].

В 1989 году, доктор Н.Феррара сделал инновационное открытие -выделил белковый сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который играет ключевую роль в ангиогенезе [69]. Предполагается, что торможение продукции VEGF смогут использовать при борьбе с раком, слепотой, диабетической ретинопатией, артериальной гипертензией. Наоборот, индукция VEGF сможет помочь при ишемии миокарда, критической ишемии нижних конечностей. Именно сосудистый эндотелиальный фактор роста привлёк к себе наибольший интерес [46, 55, 87, 108, 166].

Роль и свойства VEGF:

• VEGF - многофункциональный цитокин, регулирующий разнообразные биологические функции в клетках эндотелия [180].

• Является важным фактором для образования и развития сосудов в эмбриогенезе [144, 180].

• Играет центральную роль в послеродовом ангиогенезе при патофизиологических состояниях у людей: рак, ревматоидый артрит, сердечно-сосудистые болезни и др [180].

• Семейство VEGF включает несколько групп: А, В, С, D, Е и плацентарный фактор роста [159, 171].

• Известно пять его изоформ VEGF A: VEGF121, VEGF145,

VEGF 165, VEGF 189, VEGF206 (отличаются количеством

аминокислот). Все формы являются митогенными к сосудистым

эндотелиальным клеткам и вызывают разрастание кровеносных

сосудов [4, 53, 59, 76, 148, 159, 171]. VEGF 165 - преобладающая

форма, a VEGF206 - наоборот наиболее редко встречающаяся

разновидность этой группы. Существует предположение, что

VEGF 189 стимулирует исключительно эндотелиальную

20

пролиферацию клеток, тогда как VEGF165 может способствовать сцеплению эндотелиальных клеток и формированию сосуда [171]. Функция каждой из форм сосудистого эндотелиального фактора роста до конца не определены, но все они связываются с эндотелиальными клетками, вызывая их рост, пролиферацию и миграцию.

• Гипоксия стимулирует повышенную продукцию сосудистого эндотелиального фактора роста [59, 60, 129, 180]. Транскрипция VEGF запускается также гипогликемией и ацидозом.

• Играет важную роль в пролиферации эндотелия, его дифференцировки и жизнеспособности [60]

• Тромбоциты - главный источник циркулирующих VEGF [60]

• Взаимодействует с тремя видами рецепторов тирозин-киназы — flt-1, flk-1, flt-4 [59, 60]

• Имеются данные о наличии рецепторов для этого фактора роста только на поверхности эндотелиальных клеток, тогда как рецепторы для большинства других проангиогенных молекул найдены и в других тканях [88, 90].

• Повышает выработку NO и PGI2 (простациклин), вызывая вазодилятацию, антитромботический эффект, снижает адгезию лейкоцитов, повышает противовоспалительные свойства. Эти данные говорят о защитных свойствах фактора роста [66, 180].

В связи с популярность эндотелиального фактора роста было

проведено множество экспериментов с целью использования его для

лечебного ангиогенеза [8, 17, 82, 168, 170, 176]. Эксперименты проводились

на животных, у которых моделировались ишемия конечностей и ишемия

миокарда. Эти исследования поставили ряд новых вопросов перед учёными и

главный из них - это рациональность в применении VEGF для лечения

ишемий. Одной из проблем в применении данного фактора роста может стать

то, что он способен провоцировать рост атеросклеротических бляшек и их

21

неустойчивость. Не исключается всё же инициация ангиогенеза и в других органах, что может привести к серьёзным осложнениям. В иностранных работах есть указания на повышение риска развития гемангиом под действием VEGF [101,129].

В свете последних экспериментов способность «изолированного» VEGF формировать полноценную сосудистую сеть ставится под сомнение. Многие склоняются к мысли о необходимости комбинации различных факторов [53, 56, 89,121,180].

Фактор роста фибробластов (bFGF) является несекретируемым фактором роста, который высвобождается только в случае гибели клетки или ишемического её повреждения. Он также является мощным митогеном, но семейство FGF неспецифично для эндотелия. Этот белок способен стимулировать размножение не только эндотелиальных клеток, но и другие клеток, формирующих сосуд [75, 93, 94, 103, 106, 110, 177, 178].

Большой интерес представляет также ангиогенин (ANG), ген которого локализован в 14-й хромосоме и содержит около 800 пар нуклеотидов. В экспериментах было показано, что ангиогенин способствует более физиологичному протеканию процессов заживления острых язв в коже при экспериментальном ожоге, без образования рубцов, а также увеличению плотности капилляров и усилению притока крови в артериолах ишемизированных конечностей [35, 127]. Кроме того, есть основания предполагать, что ангиогенин является одним из конечных факторов в сложной схеме взаимодействия различных факторов ангиогенеза и многие из них (в том числе и те, которые упоминались выше), воздействуют на ангиогенез через влияние на ангиогенин [35, 44, 57].

3. Вектора и системы доставки

Одной из важнейших проблем в генно-инженерных технологиях стимуляции ангиогенеза является стабильность вводимых генных систем и

обеспечение их длительного функционирования (достаточного по времени

22

для синтеза необходимых количеств белковых факторов). На начальных этапах развития генной терапии использовали преимущественно непосредственное введение нативных плазмид [46, 81, 95, 143]. Данная технология привлекает своей относительной простотой, безопасностью и более низкой стоимостью, в связи с чем рядом исследователей она используется и в настоящее время. Однако, основным отрицательным моментом в использовании нативной ДНК является ее низкая устойчивость in vivo: разрушение ДНК соответствующими рестриктазами происходит в течение нескольких дней, а иногда и нескольких часов, что не позволяет обеспечить стабильный синтез белкового фактора на протяжении достаточного количества времени, и, соответственно, требует постоянного повторного введения плазмиды. Поэтому в настоящее время оптимальным признается использование различного рода векторных систем, которые обеспечивают длительную сохранность и функционирование введенных генетических конструкций [36, 41, 130, 175, 182]. Идеальный вектор должен обладать несколькими свойствами: быть нетоксичным для организма, обладать минимальной иммуногенностью, максимальной тропностью к тканям-мишеням, обладать размерами, достаточными для размещения в нем необходимого генетического материала и обеспечивать его длительную сохранность. К сожалению, в настоящее время векторов, обладающих всеми вышеуказанными свойствами, не существует. В качестве наиболее подходящих в настоящее время рассматриваются вирусные векторные системы [74,111,124, 134,141, 175].

Ретровирусы были первыми векторными системами, использованными в генотерапии сердечно-сосудистых заболеваний [124]. Ретровирусы представляют из себя РНК-содержащие вирусы, геном которых способен встраиваться в хромосомы хозяина. Это, с одной стороны, обеспечивает стойкую продолжительную экспрессию необходимого белка. С другой стороны, их способность к мутагенезу в организме хозяина может вести к канцерогенезу. Наиболее хорошо ретровирусы встраиваются в активно

23

делящиеся клетки. В связи с высоким потенциальным риском мута- и канцерогенеза от использования ретровирусов в качестве векторных систем в настоящее время отказываются.

Другая группа вирусов, активно используемых в настоящее время в качестве векторов, - это аденовирусы. Последние в отличие от ретровирусов содержат двухцепочечную ДНК и не обладают способностью встраиваться в геном клетки-хозяина и таким образом не провоцируют возникновение мутаций. Из положительных свойств аденовирусов следует также отметить их хорошую «вместимость» (что позволяет встраивать в один вектор гены больших размеров и даже несколько генов), а также высокую тропность этих вирусов к клеткам сосудистой системы. Отрицательными моментами при использовании аденовирусов является их способность вызывать иммунный ответ (иногда достаточно выраженный), а также способность провоцировать развитие воспалительной реакции, что может снижать эффективность терапевтического воздействия [130, 134, 141, 149, 175].

Перспективными в качестве векторных систем являются также т.н. адено-ассоциированные вирусы, представляющие из себя непатогенные парвовирусы, которые для репликации в клетке нуждаются в присутствии вируса-хелпера (аденовируса). Это вирусы с одноцепочечной ДНК и маленьким геномом. Как и аденовирусы они могут накапливаться в больших количествах в неделящихся клетках. С другой стороны, как и ретровирусы они обладают способностью встраиваться в геном, но при этом обладают низким риском мутагенеза. Еще одно положительное свойство данной группы вирусов - их низкий иммуногенный потенциал и обеспечение длительной и стойкой экспрессии соответствующего белкового фактора. В настоящее время свойства данных вирусов изучаются в клеточных культурах и на животных моделях [42, 55].

Кроме вирусных векторов, имеются работы по использованию невирусных систем (липосомы, микросферы, полимерные системы, гидрогели) а также физических факторов (электропорация) [41, 86, 109, 128,

24

182]. Несмотря на то, что использование данных систем во многом лишено негативных факторов, связанных с использованием вирусных векторов, тем не менее их эффективность по сравнению с последними остается весьма низкой. Таким образом, на данном этапе развития данного направления, наиболее оптимальным признается использование вирусных векторных систем, в первую очередь - аденовирусов.

Кроме векторов, важным моментом в генотерапии, являются способы, пути и системы доставки генных конструкций к соответствующим органам и тканям. При этом возможны следующие варианты [45, 99, 112, 113, 116, 135, 150,157, 181]:

1. Введение в системный кровоток

2. Регионарное или местно-регионарное введение с помощью баллонного катетера или катетер-ассоциированных технологий

3. Непосредственное внутритканевое введение (в частности, интрамиокардиальное, внутримышечное)

4. Использование элюирующих стентов

Введение генных конструкций в системный кровоток в настоящее время не используется, т.к. не позволяет достичь необходимой концентрации генной конструкции в ткани-мишени. Непосредственное инъекционное внутримышечное введение - основной пути доставки генов в мышцы нижних конечностей при лечении их хронической ишемии [74, 91, 135, 147]. В отдельных случаях используется также внутримышечное введение в миокард [73, 181]. В последнем случае, однако, наиболее распространенными являются катетерные технологии. Первыми подобными системами доставки были двухбаллонные катетеры, в пространство между которыми производилась инфузия раствора, содержащего генные конструкции. Однако длительная окклюзия баллонами магистральной артерии сопровождалась высоким риском острой ишемии миокарда. Альтернативным вариантом явились порозные баллоны, через которые возможна подача раствора под высоким давлением, однако эффективность таких систем оказалось низкой.

25

Интересным вариантом является использование гидрогелей, содержащим векторные конструкции, которыми покрываются баллоны катетеров, что обеспечивает их локальную доставку. Наконец современные нанотехнологии сделали принципиально возможным создание элюирующих стентов, содержащих медленно высвобождающиеся генные конструкции с необходимыми генами [49, 51, 52, 70, 85, 118, 172].

4. Стратегии вмешательства в процессы ангиогенеза при лечении

сердечно-сосудистых заболеваний

Как уже указывалось выше, в генотерапии сердечно-сосудистых заболеваний существуют две основные стратегии: терапевтический ангиогенез и профилактика неоинтимальной гиперплазии [13, 24, 102, 158].

Терапевтический ангиогенез

Основными заболеваниями, в отношении которых используются методы терапевтического ангиогенеза, являются ишемическая болезнь сердца и хроническая ишемия нижних конечностей. Наиболее перспективно применение данных методов в отношении пациентов с т.н. дистальными формами поражения артерий нижних конечностей и коронарных артерий, представляющих наиболее тяжелую группу, в отношении которых традиционная фармакотерапия является низкоэффективной, а выполнение реконструктивных сосудистых вмешательств - либо технически невозможным, либо заведомо мало успешным с гемодинамической и клинической точек зрения [5, 8, 32]. Стимуляция ангиогенеза, развитие коллатерального кровообращения и микроциркуляторного русла, позволяет увеличить перфузию ишемизированных тканей миокарда и нижних конечностей, а, следовательно, - снизить степень их ишемии до клинически значимого порога. При этом данные методики могут применяться как в качестве изолированного метода лечения (в основном при ишемии нижних конечностей), так и в сочетании с сосудистыми реконструкциями

26

(шунтирующие операции на артериях нижних конечностей, коронарное шунтирование) [8].

Как уже указывалось выше, для целей терапевтического ангиогенеза наиболее часто используются гены, кодирующие VEGF, bFGF, ANG, HIF (гипоксия-индуцируемый фактор) в виде нативных плазмид или рекомбинантные аденовирусные системы. До момента клинической апробации, конструкции были испытаны во многих исследованиях на различных экспериментальных моделях, в т.ч. на различных млекопитающих: мышах, крысах, кроликах, собаках, свиньях (табл. 1). Трудностью в создании и использовании животных моделей является достижение стойкой хронической ишемии миокарда или конечности, т.к. без использования специальных методов и подходов, при создании модели степень ишемии либо оказывается недостаточной (что приводит к самостоятельной быстрой компенсации кровообращения за достаточно короткое время), либо избыточной, что приводит к острой ишемии и формированию обширного некроза ткани. Кроме того, исследования ангиогенеза в миокарде требует использования более крупных животных (собаки, свиньи, в отдельных случаях - кролики). В то же время положительным моментом животных экспериментальных моделей является возможность не только зарегистрировать функциональный эффект стимуляции ангиогенеза, но также провести в полном объеме морфологические исследования, осуществить непосредственную оценку и подсчет количества вновь образованных сосудов, а также провести в полном объеме биохимические и молекулярно-генетические тканевые исследования.

В подавляющем большинстве экспериментальных исследований [5, 8, 56, 84, 94, 110, 115, 141, 175, 179, 181] были получены положительные результаты, демонстрирующие потенциальную эффективность генотерапии: удалось зарегистрировать неоваскуляризацию, увеличение плотности капиллярного русла, коллатерализацию кровотока, увеличении перфузии, улучшение функционального состояние и отсутствие значимых токсических

27

эффектов (табл. 1). Следует отметить, что в большинстве экспериментальных исследований был использован какой-либо один вид генов. В то же время в экспериментах, где одновременно использовались несколько генов или несколько изоформ одного гена, получены значимо лучшие результаты [43].

Результаты клинических исследований по терапевтическому ангиогенезу [5, 46, 73, 78, 79, 95, 107, 114, 122, 131, 133, 137, 148, 149, 160, 161] являются более противоречивыми, чем экспериментальные (табл. 2).

Результаты основных экспериментальных исследований по геннотерапии сердечно-сосудистых заболеваний

Моделируемая патология Автор, год Модель Использованные гены Основной результат

Ишемия конечности Kondoh et al (2004) Ишемия задней конечности, крыса VEGFubFGF Развитие коллатералей. Комбинация эффективнее, чем введение изолированных генов

Ishil et al (2004) Ишемия задней конечности, крыса bFGF Развитие коллатералей

Ohara et al (2001) Ишемия задней конечности, крыса VEGF-165 и Ang-1 Неоваскуляризация. Развитие коллатералей

Whitlock et al (2004) Ишемия задней конечности, крыса VEGF-121, -165, -189 Развитие коллатералей. Комбинация изоформ эффективнее их изолированного введения

ЛА.Бокерия с соавт. (2003) Ишемия задней конечности, крыса VEGF-165 Увеличение количества капилляров

A.B.Гавриленко с соавт. (2003) Ишемия задней конечности, крыса ANG Увеличение количества капилляров

Ишемия миокарда Laguens et al (2002) Клипирование ЛОА, свиньи VEGF-165 Увеличение кол-ва делящихся клеток

Zhang et al (2002) Клипирование ЛОА, мини-свиньи VEGF-165 Уменьшение зоны ишемии и увеличение кол-ва коллатералей

Cao et al (2004) Стресс, свиньи FGF4 Отсутствие токсических эффектов

Heini-Green et al (2005) Клипирование ЛОА, свиньи HlFa Увеличение перфузии

Неоинтимальная гиперплазия Akowuah et al (2005) СШ, свиньи TIMP-3 Увеличение диаметра просвета

Wolff et al (2005) СШ, крысы TGF Уменьшение гиперплазии

West et al (2005) СШ, кролики NOS Уменьшение гиперплазии

Wan et al (2004) СШ, свиньи P53 Уменьшение гиперплазии

Fishbein et al (2006) БАП и стент, крысы NOS Уменьшение степени рестеноза

Johnson et al (2005) БАП и стент, свиньи TIMP-3 Уменьшение степени рестеноза

Walter et al (2004) БАП и стент, кролики VEGF Уменьшение степени рестеноза и увеличение степени реэндотелизации

Примечание: СШ - сосудистый шунт, ЛОА - левая огибающая артерия, БАП - баллонная ангиопластика

Основные результаты клинических исследований по генотерапии сердечно-сосудистых заболеваний

Патология Автор, год Ген Кол-во пациентов Плацебо Оцениваемый исход Результат

Хроническая ишемия нижних конечностей Morishita et al (2004) HGF 6 Нет ДББХ, ЛПИ, заживление язв Улучшение

Baumgartner et al (1998) VEGF 9 Нет ЛПИ, сохранность конечностей Улучшение

Isner et al (1996) VEGF 1 Нет Данные ангиографии и ультразвукового исследования Улучшение

Kim et al (2004) VEGF 9 Нет ДББХ, ЛПИ, данные ангиографии Улучшение

Rajagopalan et al (2001) VEGF 5 Нет Эндотелиальная функция Улучшение

Rajagopalan et al (2003) RAVE VEGF 105 Да ДББХ Нет различий

Kusumanto et al (2006) VEGF 27 Да Число ампутаций через 100 дней Нет различий

Л.А.Бокерия с соавт (2009) VEGF 29 Нет ДББХ, трофические дефекты, качество жизни Улучшение

Ишемическая болезнь сердца Losordo et al (2002) VEGF 19 Да Класс стенокардии Улучшение

Fortuin et al (2003) VEGF 5 Нет Класс стенокардии Улучшение

Grines et al (2002) AGENT I FGF 79 Да Толерантность к физической нагрузке Тенденция к улучшению

Grines et al (2003) AGENT II FGF 52 Да Размер зоны дефекта перфузии Тенденция к улучшению

Л.А.Бокерия с соавт. (2009) VEGF 29 Нет Толерантность к физической нагрузке, размер зоны дефекта перфузии Улучшение

Гиперплазия интимы сосудистого шунта Mann et al (1999) PREVENT I E2F 41 Да Проходимость шунтов Тенденция к улучшению

Crube et al (2001) PREVENT II E2F 200 Да Проходимость шунтов, толщина стенок шунта Улучшение

Conte et al (2005) PREVENT III E2F 1404 Да Повторные вмешательства Нет различий

Alexander et al (2005) PREVENT IV E2F 3014 Да Проходимость шунтов (ангиография) Нет различий

Рестеноз коронарного стента Laitinen et al (2000) VEGF 15 Нет Рестеноз (ангиография) Нет различий

Hedman et al (2003) KATI VEGF 103 Нет Рестеноз (ангиография), перфузия миокарда Нет различий

Степень выраженности эффектов генно-инженерных конструкций в клинических исследованиях колеблется в широких пределах и более того, результаты различных исследований являются подчас прямо противоположными [36, 50, 114, 132, 131]. Новизна самого подхода, трудность стандартизации пациентов, трудность стандартизации критериев эффективности, трудность проведения контролируемых исследований - все это во многом обусловливает трудности проведения клинических исследований по терапевтическому ангиогенезу. Следует, однако, отметить, что внедрение этих технологий в реальную клиническую практику во многом затруднено не столько из-за объективных медицинских проблем, сколько из-за прочих, не связанных непосредственно с наукой и медициной вопросов: несовершенства законодательства, этических проблем, особенностей фармацевтических рынков и т.п. До последнего момента ни в одной стране мира в реальной клинической практике не использовался ни один генотерапевтический препарат! Однако, большим прорывом в этой области явился тот факт, что в 2012 г Еврокомиссия официально разрешила продажу в странах ЕС первого генотерапевтического препарата «С1уЬега» для лечения наследственного дефицита липопротеинлипазы. В России (впервые в Европе) создан, впервые зарегистрирован и в 2012 году был разрешен для клинического применения оригинальный отечественный препарат для терапевтического ангиогенеза «Неоваскулген» на основе плазмиды с геном фактора роста эндотелия сосудов [14, 34].

Пионером в использовании терапевтического ангиогенеза в лечении критической ишемии нижних конечностей был .Шпег (США), который в 1994 году продемонстрировал положительное влияние введенного гена УЕвР в формировании коллатеральных сосудов на животных моделях критической ишемии, а затем в 1996 применил ген, кодирующий синтез УЕвР, для лечения пациентов с ишемией нижних конечностей. При этом было продемонстрировано исчезновение болей в покое, заживление

31

трофических язв, а также были получены объективные подтверждения неоангиогенеза и увеличения перфузии тканей - возрастание лодыжечно-плечевого индекса, увеличение количества капилляров и мелких сосудов, зафиксированное при выполнении магнитно-резонансной ангиографии [95, 99,100].

Baumgartner и соавторы провели опыты по стимулированию коллатерального роста сосудов в конечностях с критической ишемией. Для исследования была выбрана группа из 5 женщин и 4 мужчин с поражёнными 10 конечностями, 7 из которых страдали незаживающими ишемическими язвами и у всех отмечались боли в состоянии покоя, вследствие периферического поражения артерий нижних конечностей. Плече-лодыжечный индекс составлял <0,6 и плече-пальцевой индекс был <0,3. Всем пациентам была введена нативная ДНК дозой 4000мг, кодирующая VEGF165. Введение осуществлялось внутримышечно в голень или дистальный отдел мышц бедра, ишемически поражённой конечности. Участки инъекции были выбраны произвольно. После внутримышечного введения гена отмечался местный дискомфорт до 72 часов после. Спустя 1 -3 недели наблюдалось повышение уровня VEGF, уровень креатинин фосфокиназы оставался в норме. Ни у одного из пациентов не обнаружены антитела к VEGF, а также не выявлены симптомы системных или местных воспалительных реакций. Данных о снижении остроты зрения вследствие прогрессирования диабетической ретинопатии не было. Единственным осложнением, которое отметили исследователи был отёк дистальных отделов конечностей у 6 пациентов. У 4 из них он затронул только поражённую конечность, а у 2 больных отёчность отмечалась и на контрлатеральной конечности, хотя и в меньшей степени. Плече-лодыжечный и плече-пальцевой индекс значительно улучшились от 0,33±0,05 исходно до 0,48±0,03 через 12 недель. С помощью магнитно-резонансной томографии в 8 конечностях зарегистрировано улучшение дистального кровотока. Ишемические язвы зажили или заметно улучшилось их состояние в 4 из 7

32

случаев, включая сохранение конечности у 3 пациентов, которым была рекомендована ампутация на уровне голени. Гистологические препараты, полученные от больного получавшего генную терапию спустя 10 недель показали увеличение количества эндотелиальных клеток [46].

Для лечения поражений периферических сосудов исследуется влияние не только УЕОР, но и БвГ [154, 156, 162]. Опытным путём показано благоприятное влияние РОР-2 на больных с перемежающейся хромотой. Для изучения была выбрана группа из 190 пациентов, которую поделили на три части: 1 - плацебо, 2 - больные, получившие однократную дозу РОР-2 (ЗОмг/кг), 3 - больные, которым вводили РвР-2 дважды с интервалом 30 дней. РвР-2 вводили внутриартериально в бедренную артерию. Плече-лодыжечный индекс на поражённой конечности составлял <0,8. После проведённой терапии РОР-2 значение плече-лодыжечного индекса увеличилось. Ещё одним положительным эффектом терапии явилось увеличение показателя времени безболевой ходьбы. В группе плацебо время безболевой ходьбы увеличилось на 14% от начального. В группе с однократным введением РвР-2 показатель времени безболевой ходьбы увеличился на 34%, в третьей группе - на 20%. Необходимо упомянуть и об отрицательных эффектах, показанных в данном исследовании: преходящая гипотензия, протеинурия. Автор отмечает, что не было признаков инициирования роста опухолей и неблагоприятных эффектов со стороны сетчатки [142].

В ранних клинических исследованиях по генотерапии хронической ишемии нижних конечностей были использованы нативные ДНК, а также ДНК с различными системами доставки, включая катетерные системы с гидрогелевым покрытием. Однако в последующем в большинстве клинических исследований было использовано внутримышечное введение нативных плазмид или вирусных векторных конструкций. Первоначальные исследования, в которых не предусматривалось формирование контрольной группы и которые представляли из себя фактически серии случаев, были

33

получены весьма обнадеживающие результаты: увеличение дистанции безболевой ходьбы, заживление трофических язв, улучшение качества жизни пациентов. Однако результаты последующих более мощных по объему исследований, а также плацебо-контролируемых исследований, были менее оптимистичными. В частности, в плацебо-контролируемом исследовании II фазы RAVE (Regional Angiogenesis with Vascular Endothelial Growth Factor) при внутримышечном введении рекомбинантного аденовируса, содержащего ген VEGF-121, в основной группе пациентов не было выявлено увеличения показателя дистанции безболевой ходьбы и качества жизни по сравнению с контрольной группой [148].

В исследовании, проведенном Y.Kusumanto с соавт. в 2006 г. (внутримышечное введение нативной плазмиды с VEGF-165 пациентам с сахарным диабетом) не было показано различий между основной и контрольной группами по частоте ампутаций через 100 дней наблюдения. В то же время в данном исследовании было показаны различия по заживлению трофических язв и дистанции безболевой ходьбы [114].

В отдельных российских исследованиях показаны статистически значимые различия по показателям дистанции безболевой ходьбы и функционального резерва кровотока конечностей в основной и контрольной группе пациентов, которые были наиболее выражены в случае комбинированного использования двух генов (VEGF и ANG) [4, 5, 8, 14, 31, 34].

В клинических исследованиях по генотерапии ишемической болезни сердца в основном использовались конструкции, содержащие VEGF и FGF, которые вводились путем прямых интрамиокардиальных инъекций (после миниторакотомии или при выполнении коронарного шунтирования), а также с помощью эндоваскулярных катетерных систем (табл. 2). В исследованиях эффективности конструкций с геном VEGF были показаны положительные результаты: уменьшение функционального класса стенокардии, увеличении толерантности к физической нагрузке, а также увеличение перфузии

34

миокарда. Аналогичные данные были получены при испытаниях конструкции с /^бТ7 в плацебо-контролируемых исследованиях (исследования АОЕШЧ и АОЕ>1Т-2) [73, 78, 79, 122, 163].

Ключевым вопросом применения методов генотерапии в клинической практике являются вопросы безопасности. В качестве потенциальных нежелательных эффектов при применении данной методики рассматриваются воспалительные реакции, отек, развитие ретинопатии, прогрессирование атеросклеротического процесса и возникновение опухолей (сосудистых и несосудистых). В проведенных клинических исследованиях реально встречались первые два побочных эффекта, причем в основном при лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. В исследованиях по ИБС ни одного случая миокардита зарегистрировано не было. Аналогично ни в одном из исследований не было к настоящему моменту зарегистрировано случаев развития ретинопатий и гемангиом. В исследовании по ИБС за период наблюдения зарегистрировано два случая развития онкологических заболеваний (колоректальный рак и глиобластома), однако последующий ретроспективный анализ указывал на наличие соответствующего преморбидного фона у данных пациентов. В любом случае вопрос о возможных нежелательных эффектов при использовании генотерапии остается открытым, во многом из-за коротких сроков наблюдения за пациентами в исследованиях [13, 39, 40, 47, 68, 83, 97, 101, 119, 120, 146, 181].

Таким образом, в отношении терапевтического ангиогенеза в экспериментальных работах показано его наличие и эффективность, в клинических исследованиях - результаты неоднородны и противоречивы. Установлено, что генно-инженерные вирусные конструкции показывают лучшие результаты, чем препараты нативной ДНК. В отношении ИБС большое значение приобретают системы доставки. Не вызывает сомнений целесообразность использования нескольких генов одновременно. Вопрос о

безопасности в отдаленном периоде остается открытым, в связи с относительно короткими сроками наблюдения.

Профилактика гиперплазии интимы

Профилактика гиперплазии интимы является вторым главным направлением стратегии генотерапии сердечно-сосудистых заболеваний. Гиперплазия интимы фактически представляет собой адаптивную реакцию, обеспечивающую стабильность имплантированного материала в изменившихся гемодинамических условиях. В соответствии с механизмами, обусловливающими развитие гиперплазии, генотерапия направлена на следующие цели: подавление миграции гладкомышечных клеток (ГМК), изменение их пролиферации, апоптоз ГМК, увеличение степени реэндотелизации и улучшение эндотелиальной функции. Последнее принципиально отличает методы генотерапии от применения стентов с лекарственным покрытием, вещества которых обеспечивают преимущество ингибирование размножения ГМК [52, 70, 104, 174, 180].

Основными факторами, которые идентифицированы как потенциально активные для этих целей, являются тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (TIMP), NO-синтаза (NOS) и белок р53. Гиперпродукция TIMP предотвращает растворение внеклеточного матрикса матричными металлопротеиназами, что необходимо для миграции гладкомышечных клеток. В экспериментах показано, что TIMP (в частности, TIMP-3) индуцирует апоптоз ГМК, блокирует их миграцию и тем самым уменьшает степень гиперплазии. Наряду с блокированием пролиферации и миграции ГМК, NOS также обеспечивает улучшение функции эндотелиальных клеток. Кроме того, показана роль NOS в уменьшении степени воспалительной реакции. Повышающаяся при этом концентрация NO инактивирует супероксидные продукты, что в свою очередь уменьшает повреждение стенки имплантированных структур. Белок р53 также ингибирует миграцию ГМК и индуцирует их апоптоз. Кроме этих факторов, в стратегии

36

профилактики гиперплазии интимы активно изучается VEGF (для активации функции эндотелия), а также Е2Р-связывающие олигонуклеотиды, которые регулируют более 12 генов клеточного цикла, в том числе связанных со стабилизацией функции эндотелия, пролиферацией ГМК и прогрессированием атеросклеротического повреждения [17, 37, 44, 52, 77, 104, 125,173, 174,].

В большинстве экспериментальных исследований [37, 70, 104, 172, 173, 174, 177] были получены положительные результаты: при использовании соответствующих генов продемонстрировано уменьшение степени неоинтимальной гиперплазии, уменьшение степени рестеноза и активация процессов реэндотелизации имплантированных структур (табл. 1).

В клинических исследованиях с использованием E2F (PREVENT-1 и PREVENT-2) [80, 125] в основной группе было показано уменьшение степени клеточной пролиферации и уменьшение частоты окклюзий. В последующих более крупных исследованиях (PREVENT-3 и PREVENT-4) [38, 61], где в качестве основных критериев были использованы ангиографические данные и частота повторных вмешательств, статистически значимых различий в основной и контрольной группе продемонстрировано не было (табл. 2). Аналогичные результаты были получены в исследованиях элюирующих стентов с нанесением на них различных (в т.ч. аденовирусных систем) с геном VEGF, в частности в рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании КАТ (Kuopio Angiogenesis Trial). В исследовании была продемонстрирована безопасность методики, однако различий в частоте развития рестенозов (ангиографически) и в показателях перфузии миокарда выявлено не было [83]. Т.о. пока потенциальную эффективность методов генотерапии по профилактике гиперплазии интимы удалось продемонстрировать только в экспериментальных исследованиях

5. Спорные вопросы в оценке эффективности при проведении отечественных и зарубежных исследований по клиническому использованию генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза при лечении больных с хронической ишемией нижних конечностей

Прежде всего следует отметить некоторые различия и особенности зарубежных и единичных отечественных исследований по данному направлению, которые систематизированы и условно представлены на схеме (рис. 1).

Резюмируя данную схему, следует подчеркнуть, что в отличие от зарубежных, в существующие единичные отечественные исследования по терапевтическому ангиогенезу как правило не включаются пациенты с терминальными степенями ишемии и необратимыми изменениями тканей, а в качестве параметров эффективности наиболее часто используют функциональные тесты, отражающие клиническую динамику и изменение степени ишемии конечности.

Одним из первых клинических исследований по терапевтическому ангиогенезу в мире было приведенное выше исследование 1.Ваит§аг1пег е1 а1., результаты которого были опубликованы в 1998 г. Исследование было неконтролируемым, и в него было включено всего 9 пациентов с критической ишемией нижних конечностей: у всех больных были боли в покое, у 7 - длительно незаживающие трофические язвы. Соответственно большинству из них угрожала ампутация конечности в ближайшее время. Каждому пациенту в икроножные мышцы пораженной конечности была введена генная конструкция с геном фактора роста эндотелия сосудов (УЕвР, изоформа 165). Результаты оценивались через 12 недель. Единственным осложнением был отек дистальных отделов конечностей у 6 пациентов. Лодыжечно-плечевой индекс давления вырос с 0,33±0,05 исходно до 0,48±0,03 через 12 недель (р=0,17). С помощью магнитно-резонансной ангиографии в 8 конечностях было зарегистрировано улучшение дистального

38

кровотока. Ишемические язвы зажили или значимо уменьшился их размер в 4 из 7 случаев, включая сохранение конечности у 3 пациентов, которым была первично рекомендована ампутация на уровне голени. Гистологические препараты отражали увеличение количества эндотелиальных клеток [46].

Анализируемый В зарубежных В отечественных

признак исследованиях исследованиях

Рис. 1. Основные различия в структуре и принципах оценки результатов в исследованиях по клиническому использованию генно-инженерных методов стимуляции ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей за рубежом и в России

Как видно, в этом исследовании были получены весьма обнадеживающие результаты. Однако, уровень доказательности его результатов с современных позиций был весьма невелик. В этой связи встал вопрос о проведении рандомизированных плацебо-контролируемых исследований. Одно из таких исследований, достаточно крупных, было проведено S.Rajagoplan et al, а его результаты были опубликованы в 2003 г. В данное исследование (исследование «RAVE») ,всего в обе группы (основную и контрольную) было включено 105 пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. В качестве генного индуктора была включена генная конструкция с геном того же фактора роста эндотелия сосудов, но почему-то не 165-й изоформы (которая продемонстрировала максимальную эффективность в экспериментальных исследований), а по каким-то причинам (возможно, по мнению авторов более безопасной - ?) его 121-й изоформы, эффективность которой в экспериментальных исследованиях была значительно ниже. Кроме того, в качестве основного критерия эффективности был использован такой показатель как максимальное время ходьбы при тредмил тесте (не дистанция, а именно время!). Время наблюдения в исследовании составило 12 недель. В результате, в исследовании было продемонстрировано отсутствие статистически значимых различий по основному конечному результату (максимальному времени ходьбы). Кроме того, было установлено отсутствие различий по времени до появления перемежающей хромоты, лодыжечно-плечевому индексу и качеству жизни [148].

В другом рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании (Y.Kusumanto et al.), результаты которого были опубликованы в 2006 г, была все же использована плазмида с геном фактора роста эндотелия сосудов 165-й изоформы. Всего в данное исследование было включено 54 пациента с критической ишемией нижних конечностей и сахарным диабетом. Однако срок наблюдения составил всего 100 дней. При этом в качестве основного

40

критерия эффективности было выбрано количество ампутаций конечности через 100 дней наблюдения. Вполне закономерно, что по этому показателю в исследовании не было получено статистически значимых различий. В то же время в исследовании были показаны статистически значимые различия по гемодинамическим показателям, заживлению трофических язв и количеству пациентов с клиническим улучшением на фоне лечения, однако данные параметры не рассматривались как основные критерии эффективности лечения [114].

Проводя параллели с отечественными исследованиями следует отметить, что в них, в отличие от обсуждаемых выше, как правило были включены пациенты с II - III ст. ХИНК; соответственно в качестве основного параметра эффективности рассматривалась дистанция безболевой ходьбы и изменения гемодинамических параметров; сохранность же конечностей, особенно у пациентов со II степенью ХИНК не являлась основным критерием эффективности. Это позволило получить весьма позитивные результаты. В частности, в клинических исследованиях по Неоваскулгену (основа конструкции - ген фактора роста эндотелия сосудов 165-й изоформы) через 12 месяцев наблюдения было продемонстрировано увеличение дистанции безболевой ходьбы при исходной IIA ст. ХИНК на 307% от исходного значения, при IIB ст. ХИНК - на 243%, при III ст. - на 344% [14, 34].

За рубежом испытывались и другие генные конструкции. В частности Palmer-Kazen U. et al. В 2004 г. опубликовали результаты плацебо-контролируемого исследования конструкции с фактором роста фибробластов (FGF-2). В исследование было включено 190 пациентов с ХИНК средних степеней, которые сформировали 3 группы: 1-я — плацебо, 2-я — больные, получившие однократную дозу FGF-2 (30 мг/кг), 3-я — больные, которым вводили FGF-2 дважды с интервалом 30 дней. Отмечено статистически значимое увеличение лодыжечно-плечевого индекса и дистанции безболевой ходьбы в основных группах по сравнению с контрольной. Признаки

инициирования роста опухолей и неблагоприятные реакции сетчатки отсутствовали [142].

Однако, в другом исследовании эффективности FGF в качестве агента для терапевтического ангиогенеза, был констатирован «отрицательный» результат. Речь идет об одном из наиболее крупном исследовании в этой области (исследование «TAMARIS»), результаты которого были опубликованы в 2011 г. Всего в это исследование было включено 525 пациентов (170 центров, 30 стран) с критической ишемией при отсутствии условия для выполнения реваскуляризации. У всех пациентов имелись трофические язвы или начинающаяся гангрена конечности. Срок наблюдения в исследовании составил 1 год. В качестве основного показателя эффективности в исследовании был использован суррогатный параметр: время до выполнения большой ампутации и смерти от сердечно-сосудистых заболеваний. В результате, по данному показателю различия в исследовании достигнуты не были [50].

Возвращаясь к проведению параллелей с отечественными клиническими исследованиями, следует подчеркнуть, что для них характерно исключение пациентов с глубокими необратимыми изменениями тканей, включение пациентов с преимущественно «дистальными» формами поражений артерий конечностей, принципиальная возможность сочетания метода с хирургической реваскуляризацией и принятие во внимание возможности прогрессирования атеросклероза с учетом отсутствия доказанных данных о влиянии терапевтического ангиогенеза на течение атеросклероза как системной патологии (последнее следует отнести в качестве комментария и критики последнего суррогатного показателя исследования TAMARIS [50]). В частности, в уже упомянутых исследованиях по Неоваскулгену были получены статистически значимые (по сравнению с контрольной группой)улучшения дистанций безболевой ходьбы и гемодинамических параметров у пациентов с дистальными формами поражения при исходной II и III ст. ХИНК [34]. В оригинальных

42

исследованиях по терапевтическому ангиогенезу, проведенным в РНЦХ им. акад. Б.В.Петровского РАМН, при использовании генно-инженерных конструкций с фактором роста эндотелия сосудов и ангиогенина были получены результаты, демонстрирующие статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой по основным объективным показателям (дистанция ходьбы, гемодинамические показатели, перфузия мышц, качество жизни и др.) [8]. Следует еще раз отметить отсутствие в отечественных исследованиях концепции изменения естественного течения заболевания при использовании данных методов, несмотря на наличие отдельных косвенных данных по этому вопросу. Так, в исследованиях по терапевтическому ангиогенезу, проведенных в НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН, помимо клинической эффективности конструкции с геном фактора роста эндотелия сосудов («Ангиостимулин») у больных с ХИНК было продемонстрировано и улучшение собственно эндотелиальной функции [4, 5, 18].

Подводя итог нашему обсуждению, следует отметить, что для зарубежных исследований с «отрицательными» результатами характерно: включение преимущественно пациентов с критической ишемией, в т.ч. при наличии необратимых изменений тканей; использование как более, так и менее эффективных по экспериментальным данным генных конструкций; небольшие сроки наблюдения; не всегда оптимальный выбор основного оцениваемого параметра эффективности (в частности, выбор в качестве такового сохранности конечностей во многом обусловлен требованиями обязательного включения в зарубежные исследования фармакоэкономических расчетов; проведение подобных расчетов, опираясь на такие показатели как например дистанция ходьбы, перфузия мышц, скорости кровотока и т.п. весьма затруднительно).

В заключение следует отметить, что основными направлениями дальнейших исследований по обсуждаемым вопросам в ближайшие годы будут являться: анализ механизмов положительных ответов на вводимые конструкции, поиск специфических белков и изучение паракринных механизмов; идентификацию наиболее эффективных ангиогенных факторов; поиск оптимальных способов доставки и путей введения; определение оптимальной дозы и кратности введения рекомбинантных конструкций; проведения клинических исследований, приемлемых с позиций современных принципов доказательной медицины; создание национальных регистров больных, при лечении которых были использованы методы генотерапии.

Имеющиеся на сегодняшний день данные указывают на перспективность обсуждаемых методов и их лечебный потенциал. В большинстве экспериментальных исследований четко продемонстрирована их эффективность, в то же время результаты клинических исследований неоднозначны, а подчас диаметрально противоположны. Следует, однако, обратить внимание, что в подавляющем большинстве исследований изучался лишь один терапевтический ген. Сложность системы регуляции процессов ангиогенеза указывает на необходимость одновременного воздействия на несколько ее звеньев, что в свою очередь свидетельствует о целесообразности одновременного использования нескольких генов. Говорить о возможности изолированного использования данных методов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время скорее всего преждевременно. Наиболее оптимальным на сегодняшний день кажется комбинированный подход: использование методов генной терапии вместе с существующими стандартными методами лечения (хирургическими или терапевтическими) для повышения их эффективности и улучшения отдаленных результатов. Возможность сочетания методов стимуляции ангиогенеза с хирургическими реваскуляризациями кажется наиболее интересной, т.к. с одной стороны, позволит восстановить магистральный характер кровотока за счет хирургической сосудистой реконструкции, а с

44

другой стороны, улучшить микроциркуляцию тканей за счет развития коллатерального кровообращения и образования новых элементов микроциркуляторного русла, снизить периферическое тканевое сопротивление и как следствие всего этого - улучшить фактическую перфузию ишемизированных тканей, компенсировать таким образом существующую ишемию и существенно улучшить отдаленные результаты хирургического лечения, в первую очередь у больных с поражениями «дистального» артериального русла нижних конечностей.

Раздел I

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Заключение диссертации по теме «Сердечно-сосудистая хирургия», Воронов, Дмитрий Александрович

Выводы

1. Созданные оригинальные генно-инженерные конструкции обладают выраженной ангиогенной активностью: при испытании на биологических моделях они увеличивают абсолютное количество сосудов 1-го, 2-го и 3-го порядков в 2 - 4 раза по сравнению с контролем (р<0,0001)

2. При испытании на модели хронической ишемии конечности млекопитающих созданные генно-инженерные конструкции с генами УЕОЕ и АЫСт стимулируют ангиогенез и статистически значимо увеличивают плотность капиллярного русла мышечной ткани. В условиях ишемизированной мышечной ткани действие данных конструкций более выражено (прирост плотности капилляров на 55 -175%) по сравнению с интактной мышечной тканью (прирост плотности на 17 - 28%). Наибольший прирост плотности капилляров (120-175%) наблюдается при использовании рекомбинантных конструкций на основе аденовирусных векторов. Наименьшая неспецифическая реакция тканей на введение конструкции отмечается при использовании нативных плазмид.

3. Генно-инженерные конструкции с генами-стимуляторами ангиогенеза могут быть эффективно использованы в лечении пациентов с ХИНК, преимущественно в случаях поражения дистального артериального русла конечностей. Применение указанных технологий при изолированных дистальных формах поражения демонстрирует максимальную эффективность. Достигнутые эффекты сохраняются в течение трех лет и более.

4. При сочетании проксимальных и дистальных поражений использование стимуляции ангиогенеза в комплексе с реконструктивными сосудистыми операциями улучшает отдаленные результаты хирургического лечения: интегральный балл по шкале

223

Rutherford при выполнении прямых реваскуляризаций в основной группе от 0 до +3, медиана +2,5, в контрольной группе - от -1 до +3, медиана +1,5; при выполнении непрямых реваскуляризаций в основной группе от 0 до +2, медиана +2, в контрольной группе - от -2 до +2, медиана +1.

5. Комбинация хирургических реваскуляризаций с генно-инженерными методами стимуляции ангиогенеза демонстрирует лучшие результаты по сравнению с их использованием по отдельности, позволяя при наличии оптимальных условий достичь 100% сохранности конечности при выполнении прямых реваскуляризаций и 90% сохранности конечности при выполнении непрямых реваскуляризаций в сроки до 36 месяцев после операции.

6. Наибольшую эффективность показывают генно-инженерные конструкции, имеющие в своем составе несколько проангиогенных генов (комбинация генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов). Использование генно-инженерных методов индукции ангиогенеза наиболее эффективно при наличии остаточного функционального резерва кровообращения конечностей. При наличии необратимых изменений, выраженной ишемии, сопровождающейся декомпенсацией системы микроциркуляции, применение данных технологий нецелесообразно.

7. При использовании в качестве самостоятельного консервативного лечения метод демонстрирует максимальную эффективность в ближайшем и отдаленном периоде наблюдения у пациентов с ИБ ст. ХИНК (в среднем по группе увеличение дистанции безболевой ходьбы на 271%, увеличение перфузии на 160%, уменьшение времени восстановления исходных параметров кровотока на 50%). У пациентов с III ст. ХИНК степень выраженности эффекта и его продолжительность меньше (увеличение дистанции безболевой ходьбы на 250%, увеличение перфузии на 105%, уменьшение времени восстановления исходных параметров кровотока на 28%).

8. При использовании в качестве комплексного метода лечения в сочетании с реконструктивными операциями генно-инженерные технологии индукции ангиогенеза не влияют на ближайшие результаты лечения, однако улучшают отдаленные результаты лечения как у пациентов с ПБ так и с III ст. ХИНК

9. Не установлено влияние на эффективность применения метода пола, возраста больного, длительности анамнеза. Наличие сахарного диабета (г=-0,421), диффузное поражение бедренных артерий (г=-0,392 для поверхностной бедренной артерии и г=-0,601 для глубокой артерии бедра), выраженное снижение функционального резерва кровообращения конечности (увеличение времени восстановления исходных параметров кровотока при тредмил-тесте, г=-0,728) ухудшает прогноз лечения больных с использованием технологий стимуляции ангиогенеза. Напротив, Отсутствие гемодинамически значимых поражений до уровня подколенной артерии (г=0,799), наличие непораженных тибиальных артерий (г=0,523), достаточный функциональный резерв кровообращения позволяют прогнозировать хороший эффект лечения с применением технологий стимуляции ангиогенеза.

Ю.Предложенные технологии лечения хорошо переносимы, все нежелательные явления в ближайшем периоде наблюдения являются транзиторными. В отдаленном периоде наблюдения предлагаемые технологии лечения безопасны.

Практические рекомендации

1. У пациентов с ХИНК при наличии поражений артерий голени необходимо использовать предложенные генно-инженерные методы стимуляции ангиогенеза для повышения эффективности лечения. Методика может быть использована у пациентов любого возраста, пола и вне зависимости от длительности анамнеза ХИНК

2. В качестве самостоятельного метода лечения технологии стимуляции ангиогенеза следует применять в первую очередь у пациентов с ПБ ст. ХИНК, а также при наличии трофических язвенных поражений, обусловленных микроангиопатией.

3. В составе комплексного лечения в сочетании с хирургической реваскуляризацией генно-инженерные методы стимуляции ангиогенеза необходимо использовать у пациентов с. любой степенью ишемии как при выполнении прямых, так и при выполнении непрямых реваскуляризаций.

4. Рекомендовано использовать методы стимуляции ангиогенеза у пациентов с преимущественно дистальными поражениями артериального русла конечностей. В случае сочетания дистальных поражений с проксимальными методы индукции ангиогенеза должны быть использованы совместно с хирургическими методами восстановления кровотока.

5. В первую очередь рекомендовано использовать данные методы у пациентов при отсутствии признаков декомпенсации кровообращения конечности и наличии остаточного функционального резерва кровообращения.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Воронов, Дмитрий Александрович, 2013 год

Список литературы

1. Авдеева С. В. Создание рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены факторов роста кровеносных сосудов и изучение влияния этих вирусов на ангиогенез in vivo: Дис.. канд. биол. наук. Москва. 2005. - 141 с.

2. Алехин Д.И., Михайлова O.A., Сумная Д.Б. Отдаленные результаты применения препаратов простагландина El и иммунотерапии в лечении трофических язв различного генеза. Ангиология и сосудистая хирургия. 2010; 1; 35 -41

3. Барбараш Л.С., Золоев Г.К., Чеченин Г.И. и др. Динамика показателей числа больших ампутаций и летальности при заболеваниях артерий конечностенй в период 1993 - 2007 годы. Результаты популяционного исследования. Ангиология и сосудистая хирургия. 2010; 3; 20 - 25

4. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В. и др. Первые результаты терапевтического ангиогенеза у пациентов с ишемической болезнью сердца с использованием гена VEGF165 человека. Клеточные технологии в биол. и мед. 2005; 3: 123 - 131.

5. Бокерия Л.А., Демидова O.A., Аракелян B.C., Еремеева М.В. Опыт лечения хронической ишемии нижних конечностей с помощью генного препарата сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF165 — ангиостимулина. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания» 2006; 1: 74—81.

6. Бокерия Л.А., Еремеева М. В. Современное состояние и перспективы использования ангиогенеза в лечении ишемической болезни сердца. Грудная и сердечно-сосудистая хирургия. 2000; 2, 57 - 61.

7. Бокерия Л.А., Коваленко В.И., Калитко И.М. и др. Микрохирургическая реваскуляризация голени и стопы в лечении

больных с критической ишемией нижних конечностей. Анналы хирургии. 2009; 6; 91 - 95

8. Бочков Н.П., Константинов Б.А., Гавриленко A.B. и др. Генно-инженерные технологии в лечении хронической ишемии нижних конечностей. Вестник РАМН. 2006; 9—10; 6—11.

9. Бурлева Е.П., Фокин A.A. Пятилетние результаты реконструктивно-восстановительной хирургии при критической ишемии нижних конечностей. Ангиология и сосудистая хирургия. 2005; 3; 115 - 122

Ю.Гавриленко A.B., Скрылев С.И., Николаев А.М. Результаты хирургического и консервативного лечения больных младше 50 лет с-поражением артерий в бедренно-берцовом сегменте. Анналы хирургии. 2007; 2; 49-53.

И.Гавриленко A.B., Кохан Е.П., Абрамян A.B. и др. Применение поясничной симпатэктомии в лечении облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей - современный взгляд на проблему. Ангиология и сосудистая хирургия. 2004; 10; 3; 90 - 95

12.Гавриленко A.B., Скрылев С.И. Хирургическое лечение больных с критической ишемией нижних конечностей, обусловленной поражением артерий инфраингвинальной локализации. Ангиология и сосудистая хирургия. 2008; 14; 3; 111-117

13.Деев Р.В., Григорян A.C., Потапов И.В., Киселев СЛ., Исаев A.A. Мировой опыт и тенденции генотерапии ишемических заболеваний. Ангиология и сосудистая хирургия. 2011; 2; 145 - 154

14.Деев Р.В., Червяков Ю.В., Калинин P.E., Исаев A.A. Теоретические и практические аспекты применения препарата на основе нуклеиновой кислоты, кодирующей эндотелиальный сосудистый фактор роста. Электронный журнал «Ангиология.ру». 2011; 1.

15.Диагностика и лечение больных с заболеваниями периферических артерий. Рекомендации Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов. М., 2007; 135 с.

16.Диагностика и лечение больных с критической ишемией нижних конечностей. Российский консенсус. М., 2002.

17.Ельчанинова С.А., Кореняк H.A., Павловская Л.И. и др. Васкулярный эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов в периферической крови: влияние интервальной гипоксии. Физиология человека. 2004; 30; 6; 93 - 95

18.Еремеева М. В., Голухова Е.З.Факторы ангиогенеза при ишемии. Стимуляция неоангиогенеза в миокарде. Лекции по кардиологии, в 3-х томах, под ред. Бокерия Л.А. и Голуховой Е.З., изд. НЦССХ им. А.Н.Бакулева, Москва, 2001.

19.3атевахин И.И., Золкин В.Н., Горбенко М.Ю. Острый тромбоз артерий нижних конечностей: современные подходы к выработке тактики лечения. Ангиология и сосудистая хирургия. 2010; 2; 135 - 138

20.Кириенко А.И., Кошкин В.М., Богачев В.Ю. Амбулаторная ангиология. М., Литерра, 2009; 328 с.

21.Комаров А.Л., Панченко Е.Л., Деев А.Д., Давлетов К.К., Ешкеева А.Р., Маркова Л.А., Карпов Ю.А. Течение перемежающейся хромоты и прогноз больных атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей. Анализ результатов проспективного наблюдения. Ангиология и сосудистая хирургия. 2000; 2; 9 - 18

22.Концепция развития системы здравоохранения в Российской Федерации до 2020 года. Вопросы хирургии. 2009; 1; 50 - 63

23.Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы. СПб., «Лань», 2001. -464 с.

24.Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы. Кардиологический вестник. 2007; 2; 5—15.

25.Парфенова, Е.В., Цоколаева З.И., Трактуев Д.О.. Поиск новых «инструментов» для терапевтического ангиогенеза. Молекулярная медицина. 2006; 2; 10 - 23.

26.Покровский A.B. Клиническая ангиология. Руководство для врачей. В 2-х томах. М.: Медицина, 2004; 2; 888

27.Покровский A.B., Дан В.Н., Харазов А.Ф. Современные тенденции в реконструкции инфраингвинального сегмента. Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. 2009; 10; 6; 117.

28.Покровский A.B., Дан В.Н., Чупин A.B., Калинин A.A. Применение препарата Алпростан в лечении больных с перемежающей хромотой. Ангиология и сосудистая хирургия. 2006; 12; 2; 29 - 32.

29.Савельев B.C., Кошкин В.М., Каралкин A.B. Патогенез и консервативное лечение тяжелых стадий облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей. М., 2010; 216 с.

30.Савельев B.C., Кошкин В.М. Критическая ишемия нижних конечностей. М., 1997; 160

31.Талицкий К.А., Булкина О.С., Арефьева Т.П. и др. Эффективность терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011; 3; 76—83.

32.Талицкий, К.А., Ю.А. Карпов, Е.В. Парфенова Терапевтический ангиогенез в лечении ишемии нижних конечностей. Кардиология.2007; 12; 81-85.

33.Троицкий A.B., Лысенко Е.Р., Хабазов Р.И., Орехов П.Ю. и др. Результаты реконструктивных операций у больных с поражением артерий голени. Ангиология и сосудистая хирургия. 2003; 1; 102 — 108

230

34.Червяков Ю.В., Староверов И.Н., Нерсееян Е.Г., Исаев А.А., Деев Р.В. Терапевтический ангиогеиез в лечении больных с хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей. Ближайшие и отдаленные результаты. Ангиология и сосудистая хирургия. 2012; 1; 19 — 27

35.Шестенко О.П., Никонов С.Д., Мертвецов Н.П. Ангиогенин и его роль в ангиогенезе. Молекулярная биология. 2001; 35; 3: 349-371.

36.Airenne, K.J. et al. Baculovirus-mediated periadventitial gene transfer to rabbit carotid artery. Gene Ther. 2000; 7, 1499-1504.

37.Akowuah E.F., Gray C., Lawrie A. et al. Ultrasound-mediated delivery of TIMP-3 plasmidDNA into saphenous vein leads to increased lumen size in a porcine inteposition graft model. Gen Ther 2005; 12: 1154—1157.

38. Alexander J.H., Ferguson T.B. Jr., Joseph D.M. et al. The Project of Ex-vivo Vein graft ENgineering via Transfection IV (PREVENT IV) trial: study rationale, design, and baseline patient characteristics. Am Heart J 2005; 150: 643—649.

39.Alitalo K., Ferrara N. Clinical applications of angiogenic growth factors and their inhibitors. Nat. Med. 1999; 5, 1359-1364.

40.Anghel A, Taranu G, Seclaman E et al. Safety of vascular endothelial and hepatocyte growth factor gene therapy in patients with critical limb ischemia. Curr Neurovasc Res. 2011 Aug l;8(3):183-9.

41.Arras M. et al. The delivery of angiogenic factors to the heart by microsphere therapy. Nat. Biotechnol. 1998; 15,159-162.

42.Arsic N. et al. Induction of functional neovascularization by combined VEGF and angiopoietin-1 gene transfer using AAV vectors. Mol. Ther. 2003; 7, 450-459.

43.Asahara T. et al. Synergistic effect of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on angiogenesis in vivo. 1995; Circulation 92(9 Suppl), 1365-1371.

44.Barbato J.E., Tzeng E. Nitric oxide and arterial disease. J. Vase. Surg. 2004; 40: 187—93.

45.Battler A., Scheinowitz M., Bor A., et al. Intracoronary injection of basic fibroblast growth factor enchances angiogenesis in infarcted swine myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 1993; 22,2001-2006.

46.Baumgartner I., Pieczek A., Manor O. et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation 1998; 97: 1114—1123.

47.Baumgartner I., Rauh G., Pieczek A., et al. Lower-extremity edema associated with gene transfer of naked DNA encoding vascular endothelial growth factor. Ann. Intern. Med. 2000; 132(11), 880-884.

48.Bauters C. Growth factors as potential new treatment for ischemic heart disease. Clin. Cardiol. 1997; 20 (11), 52-57.

49.Beeri R., Guerrero J., Supple G., et al. New efficient catheter-based system for myocardial gene delivery. Circulation. 2002; 106(14), 1756-1759.

50.Belch J, Hiatt WR, Baumgartner I et al. TAMARIS Committees and Investigators. Effect of fibroblast growth factor NV1FGF on amputation and death: a randomised placebo-controlled trial of gene therapy in critical limb ischaemia. Lancet. 2011 Jun 4;377(9781): 1929-37.

51.Boekstegers P., von Degenfeld G., Giehrl W., et al. Myocardial gene transfer by selective pressure-regulated retroprfiision of coronary veins. Gene Ther. 2000; 7(3),232-240.

52.Brito L.A., Chandrasekhar S., Little S.R. et al. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed. Eng. Online. 2010; 27(9): 56.

53.Bruick R., McKnight S. Building better vasculature. //Genes & Development. 2001; october 1; 15; 19: 2497-2502.

54.Bryant, M. et al. Tissue repair with a therapeutic transcription factor. Hum. GeneTher. 2000; 11,2143-2158.

55.Bryun J, Heard JM, Huh JE et al. Efficient expression of the vascular endothelial growth factor gene in vitro and in vivo, using an adeno-associated virus vector. //J Mol Cell Cardiol. 2001 Feb;33(2):295-305.

56.Cao R. et al. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2. Nat. Med. 2003; 9, 604-613.

57.Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat. Med. 2000; 6(4): 389—95.

58.Chae, J.K. et al. Coadministration of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor enhances collateral vascularization. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000; 20, 2573-2578.

59.Choksy S, Pockley A, Wajeh Y, Chan E. VEGF and VEGF receptor expression in human chronik critical limb ischemia. //European Journal Vascular and Endovascular Surgery 2004; December; 28: 660-669

60.Collinson D, Donnelly R. Therapeutic angiogenesis in peripheral arterial disease: can biotechnology produce an effective collateral circulation? //European Journal Vascular and Endovascular Surgery 2004; July; 28: 9-23

61.Conte M.S., Lorenz T.J., Bandyk D.F. et al. Design and rationale of the PREVENT III clinical trial: edifoligide for the prevention of infrainguinal vein graft failure. Vase Endovasc Surg 2005; 39: 15—23.

62.Creager M.A., Olin J.W., Belch J.J. et al. Effect of hypoxia-inducible factor-1 alpha gene therapy on walking performance in patients with intermittent claudication. Circulation 2011; 124(16):1765—73.

63.Darling, R.C. Long-term results of revised infrainguinal arterial reconstructions. J. Vase. Surg. -2002; 35; 4; 773-778.

64.Dong-Ik, Kim. Angiogenesis facilitated by autologous whole bone marrow stem cell transplantation for Buerger's disease. Stem Cells. 2006; 24; 11941200.

65.Dor Y. et al. Conditional switching of VEGF provides new insights into adult neovascularization and pro-angiogenic therapy. EMBO J. 2002; 21, 1939-1947.

66.Emanueli C., Minasi A., Zacheo A. Local delivery of human tissue kallikrein gene accelerates spontaneous angiogenesis in mouse model of hindlimb ischemia. //Circulation. 2001; 103: 125.

67.Epstein S., Fuchs S. et al. Therapeutic interventions for enhancing collateral development by administration of growth factors: basic, principles, early results and potential hazards. Cardiovasc. Res. 2001; 49(3), 532-542.

68.Epstein S., Kornowski R. et al. Angiogenesis therapy: amidst the hype, the neglected potential for serious side effects. Circulation 2001; 104,115-119.

69.Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. //J Mol Med. 1999 Jul;77(7):527-43.

70.Fishbein I., Alferiev I.S., Nyanguile O. et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 159—164.

71.Folkman J. Angiogenesis and its inhibitors. In: Hellman S, Rosenberg S. Important Advances in Oncology. Philadelphia: JB Lippincott, 1985: pp. 42 -62.

72.Folkman J. Angiogenesis therapy of human heart. Circulation 1998; 97, 628629.

73.Fortuin F.D., Vale P., Losordo D.W. et al. One-year follow-up of direct myocardial gene transfer of vascular endothelial growth factor-2 using naked plasmid deoxyribonucleic acid by way of thoracotomy in no-option patients. Am J Cardiol 2003; 92: 436—439.

74.Fukumura, M. et al. Gene transfer to skeletal muscle and motor neurons by intramuscular injection of a novel minus strand RNA vector (Sendai virus •vector). J. Gen. Med. 2000; 2 (suppl.), 24.

75.Gao M.H., Lai N.C., McKirnan M.D. et al. Increased regional function and perfusion after intracoronary delivery of adenovirus encoding fibroblast growth factor 4: report of preclinical data. Hum Gene Ther 2004; 15: 574— 587.

76.Gowdak L, Poliakova L, Xiaotong W. Adenovirus-Mediated VEGF121 Gene Transfer Stimulates Angiogenesis in Normoperfused Skeletal Muscle and Preserves Tissue Perfusion After Induction of Ischemia //Circulation 2000, 102, 565.

77.Griffoen A., Molema G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. //Pharmacological Reviews. 2000; June; 52; 2: 237-268.

78.Grines C., Watkins M., Helmer G., et al. Angiogenic gene therapy (AGENT) trial in patients with stable angina pectoris. Circulation 2002; 105, 12911297.

79.Grines C.L., Watkins M.W., Mahmarian J.J. et al. A randomized, doubleblind, placebo-controlled trial of Ad5FGF-4 gene therapy and its effect on myocardial perfusion in patients with stable angina. J Am Coll Cardiol 2003; 42: 1339—1347.

80.Grube E. PRoject of Ex-vivo Vein graft ENgineering via Transfection (PREVENT) II trial (2003). Presented at the annual Amercian Heart Association Scientific Sessions, November 11—14, 2001, Anaheim, California 2001.

81.Gu Y, Zhang J, Guo L et al. A phase I clinical study of naked DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factor to treat patients with critical limb ischemia. J Gene Med. 2011 Nov; 13(11):602-10.

82.Hammond H.K., McKirnan M.D. Angiogenic gene therapy for heart disease: a review of animal studies and clinical trials. Cardiovasc. Res. 2001; 49(3): 561—7.

83.Hedman M., Hartikainen J., Syvanne M. et al. Safety and feasibility of catheter-based local intracoronary vascular endothelial growth factor gene transfer in the prevention of postangioplasty and in-stent restenosis and in the treatment of chronic myocardial ischemia: phase II results of the Kuopio Angiogenesis Trial (KAT). Circulation 2003; 107: 2677—2683.

84.Heinl-Green A., Radke P.W., Munkonge F.M. et al. The efficacy of a 'master switch gene' HIF-1 alpha in a porcine model of chronic myocardial ischaemia. Eur Heart J 2005; 26: 1327—1332.

85.Hendel R., Henry T., Rocha-Singh K., Isner J., et al. Effect of intracoronary recombinant human vascular endothelial growth factor on myocardial perfusion: evidence for dose-dependent effect. Circulation. 2000; 101, 118121.

86.Henry T, Hirsch AT, Goldman J et al. Safety of a non-viral plasmid-encoding dual isoforms of hepatocyte growth factor in critical limb ischemia patients: a phase I study. Gene Ther. 2011 Aug;18(8):788-94.

87.Henry T., Annex B., MeKendall G., et al. (for the VIVA Investigators). Vascular endothelial growth factor in ischemia for vascular angiogenesis (the VIVA trial). Circulation. 2003; 107, 1359-1365.

88.Hershey J. Vascular endothelial growth factor stimulates angiogenesis without improving collateral blood flow following hindlimb ischemia in rabbits. //Heart Vessels 2003; 18: 142-149

89.Hill, J.M. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N. Engl. J. Med. 2003; 348; 593-600.

90.Hirsch D, Pantely G. Therapeutic angiogenesis: just the basic fact(or)s, please. //Journal of American College of Cardiology 1997; 29; 5: 1107-1108

91.Ho T.K. Critical Limb Ischemia. Classification and Therapeutic Angiogenesis. International Journal of Angiology. 2005; 14; 49-59.

92.Huang, P.P. Autologous transplantation of peripheral blood stem cells as an effective therapeutic approach for severe arteriosclerosis obliterans of lowerextremities. Thromb. Haemost. 2004; 91; 606-609.

93.Hughes S, Crossman D, Hall P. Expression of basic and acidic fibroblast growth factor and their receptor in normal and atherosclerotic human arteries.//Cardiovascular Research 1993; 27: 1214-1219.

94.1shii S., Koyama H., Miyata T. et al. Appropriate control of ex vivo gene therapy delivering basic fibroblast growth factor promotes successful and safe development of collateral vessels in rabbit model of hind limb ischemia. J Vase Surg 2004; 39: 629—638.

95.1sner J, Pieczek A, Schainfeld R et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischemic limb. Lancet 1996; 348:370-372.

96.1sner J.M. Angiogenesis for revascularization of ischaemic tissues. 1997; Eur. Heart J. 18(1), 1-2.

97.1sner J.M. Myocardial gene therapy. Nature. 2002; 415, 234-239.

98.1sner J.M., Asahara T. Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularization. J. Clin. Invest. 1999; 103(9),1231-1236.

99.1sner J.M., Walsh K., Symes J. et al. Arterial gene transfer for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral artery disease. Hum Gene Ther 1996;7:959-988.

100. Isner JM, Baumgartner I, Rauh G et al. Treatment of thromboangiitis obliterans (Buerger's disease) by intramuscular gene transfer of vascular endothelial growth factor: preliminary clinical results.//J Vase Surg. 1998 Dec;28(6):964-73; discussion 73-5.

101. Isner JM, Vale PR, Symes JF, Losordo DW. Assessment of risks associated with cardiovascular gene therapy in human subjects. //Circ Res. 2001 Aug 31;89(5):389-400.

102. Isner JM. Therapeutic angiogenesis : a new frontier for vascular therapy. 1996; Vase. Med. 1(1), 79-87.

103. Javerzat S., Auguste P., Bikfalvi A. The role of fibroblast growth factors in vascular development. Trends Mol. Med. 2002; 10, 483-489.

104. Johnson T.W., Wu Y.X., Herdeg C. et al. Stent-based delivery of tissue inhibitor of metalloproteinase-3 adenovirus inhibits neointimal formation in porcine coronary arteries. Arterioscler Thromb Vase Biol 2005; 25: 754—759.

105. Kawamura, A. Clinical study of therapeutic angiogenesis by autologous peripheral blood stem cell (PBSC) transplantation in 92 patients with critically ischemic limbs. J. Artif. Organs. 2006; 9; 226-233.

106. Khurana, R. & Simons, M. Insights from angiogenesis trials using fibroblast growth factor for advanced arteriosclerotic disease. Trends Cardiovasc. Med. 2003; 13, 116-122.

107. Kim H.J., Jang S.Y., Park J.I. et al. Vascular endothelial growth factor-induced angiogenic gene therapy in patients with peripheral artery disease. Exp Mol Med 2004; 36: 336—344.

108. Kipshidze N, Chekanov V, Chawla P et al. Angiogenesis in a patient with ischemic limb induced by intramuscular injection of vascular endothelial growth factor and fibrin platform.//Tex Heart Inst J. 2000;27(2): 196-200.

109. Ko YT, Hartner WC, Kale A, Torchilin VP. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Therapy, 2009; 16, 52-59.

110. Kondoh K., Koyama H., Miyata T. et al. Conduction performance of collateral vessels induced by vascular endothelial growth factor or basic fibroblast growth factor. Cardiovasc Res 2004; 61: 132—142.

111. Kootstra, N.A., Verma, I.M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002; 43,413-439.

112. Koransky M. et al. VEGF gene delivery for treatment of ischemic cardiovascular disease. Trends Cardiovasc. Med. 2002; 2(3), 108-114.

113. Kornowski R., Fuchs S., Leon M., Epstein S. Delivery strategies to achieve therapeutic myocardial angiogenesis. Circulation 2002; 101(4), 454458.

114. Kusumanto Y.H., vanWeel V., Mulder N.H. et al. Treatment with intramuscular vascular endothelial growth factor gene compared with placebo for patients with diabetes mellitus and critical limb ischemia: a double-blind randomized trial. Hum Gene Ther 2006; 17: 683—691.

115. Laguens R., Cabeza Meckert P., Vera Janavel G. et al. Entrance in mitosis of adult cardiomyocytes in ischemic pig hearts after plasmid-mediated rhVEGF165 gene transfer. Gen Ther 2002; 9: 1676—1681.

116. Laham R. Chronos N., Pike M., et al. Intracoronary basic fibroblast growth factor (FGF-2) in patients with severe ischemic heart disease: results of a phase I open-label dose esculation study. Am. J. Coll. Cardiol. 2000; 36(7), 2132-2139.

117. Laham R„ Simons M., Sellke F. Gene transfer for angiogenesis in coronary artery disease. Annu. Rev. Med. 2001; 52,485-502.

118. Laitinen M., Hartikainen J., Hiltunen M.O. et al. Catheter-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer to human coronary arteries after angioplasty. Hum Gen Ther 2000; 11: 263—270.

119. Lara-Hernandez R, Lozano-Vilardell P, Blanes P et al. Safety and efficacy of therapeutic angiogenesis as a novel treatment in patients with critical limb ischemia. Ann Vase Surg. 2010 Feb;24(2):287-94.

120. Lasala GP, Silva JA, Gardner PA et al. Combination stem cell therapy for the treatment of severe limb ischemia: safety and efficacy analysis. Angiology. 2010 Aug;61(6):551-6.

121. Lasala GP, Silva JA, Minguell JJ. Therapeutic angiogenesis in patients with severe limb ischemia by transplantation of a combination stem cell product. J Thorac Cardiovasc Surg. 2012 Aug;144(2):377-82.

122. Losordo D.W., Vale P.R., Hendel R.C. et al. Phase 1/2 placebocontrolled, doubleblind, dose-escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer by catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia. Circulation 2002; 105: 2012—2018.

123. Lu Y., Shasky J., DelTatto M., et al. Recomdinant vascular endothelial growth factor secreted from tissue engineered bioartificial muscles promotes localized angiogenesis. Circulation. 2001; 104, 594-599.

124. Maier P., von Kalle C., Laufs S. et al. Retroviral vectors for gene therapy. Future Microbiol. 2010; 5(10): 1507—23.

125. Mann M.J., Whittemore A.D., Donaldson M.C. et al. Ex-vivo gene therapy of human vascular bypass grafts with E2F decoy: the PREVENT single-centre, randomised, controlled trial. Lancet 1999; 354: 1493—1498.

126. Markovic, D.M. Factors which affect long-term patency in femoro-popliteal bypass. Srp. Arh. Celok Lek. 2000; 128; 1-2; 17-23.

127. Marti HH, Risau W. Angiogenesis in ischemic disease.//Thromb Haemost. 1999 Sep;82 Suppl 1:44-52.

128. Marui A, Tabata Y, Kojima S et al. A novel approach to therapeutic angiogenesis for patients with critical limb ischemia by sustained release of basic fibroblast growth factor using biodegradable gelatin hydrogel: an initial report of the phase I-IIa study. Circ J. 2007 Aug;71(8):1181-6.

129. Masaki I., Yonemitsu Y. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia. //Circulation Research 2002; 90: 966.

130. Möhler ER 3rd, Rajagopalan S, Olin JW et al. Adenoviral-mediated gene transfer of vascular endothelial growth factor in critical limb ischemia: safety results from a phase I trial.//Vasc Med. 2003;8(1):9-13.

131. Morishita R, Aoki M, Hashiya N et al. Safety evaluation of clinical gene therapy using hepatocyte growth factor to treat peripheral arterial disease. Hypertension. 2004 Aug;44(2):203-9.

132. Morishita R, Makino H, Aoki M et al. Phase I/IIa clinical trial of therapeutic angiogenesis using hepatocyte growth factor gene transfer to treat critical limb ischemia. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2011 Mar;31(3):713-20.

133. Morishita R, Makino H, Aoki M et al. Phase I/IIa clinical trial of therapeutic angiogenesis using hepatocyte growth factor gene transfer to treat critical limb ischemia. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2011 Mar;31(3):713-20.

134. Naimark WA., Lepore JJ., Klugherz BD., et al. Adenovirus-catheter compatibility increases gene expression after delivery to porcine myocardium. Hum. Gene Ther. 2003; 14(2), 161-166.

135.Niebuhr A, Henry T, Goldman J et al. Long-term safety of intramuscular gene transfer of non-viral FGF1 for peripheral artery disease. Gene Ther. 2012 Mar;19(3):264-70.

136. Niidome T., Huang L. Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors. Gene Ther. 2002; 9(24): 1647—52.

137. Nikol S, Baumgartner I, Van Belle E et al. TALISMAN 201 investigators. Therapeutic angiogenesis with intramuscular NV1FGF improves amputation-free survival in patients with critical limb ischemia. Mol Ther. 2008;16(5): 972-8.

138. Nikol S, Huehns TY. Preclinical and clinical experience in vascular gene therapy: advantages over conservative/standard therapy.//J Invasive Cardiol. 2001 Apr;13(4):333-8.

139. Norgren, L. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease. Eur. J. Vase. Endovasc. 2007; 33 (1); 1-75.

140. Nugent H., Edelman E. Tissue engineering therapy for cardiovascular disease. Circ. Res. 2003; 92(10), 1068-1078.

141. Ohara N., Koyama H., Miyata T. et al. Adenovirus-mediated ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor promotes collateral development in a rabbit model of hind limb ischemia. Gen Ther 2001; 8: 837—845.

142. Palmer-Kazen U, Wariaro D, Luo F, Wahlberg E. Vascular endothelial cell growth factor and fibroblast growth factor 2 expression in patients with critical limb ischemia.//J Vase Surg. 2004; 39(3): 621-8.

143. Perletti G, Marras E, Dondi D et al. Assessment of the biological activity of an improved naked-DNA vector for angiogenesis gene therapy on a novel non-mammalian model.//Int J Mol Med. 2003 Jun;l l(6):691-6.

144. Poltorak Z, Cohen T, Neufeld G. The VEGF splice variants: properties, receptors, and usage for the treatment of ischemic diseases.//Herz. 2000 Mar;25(2): 126-9.

145. Post M., Laham R., Sellke F., Simons M. Therapeutic angiogenesis in cardiology using protein formulations. Cardiovasc. Res. 2001; 49, 522-531.

146. Powell RJ, Goodney P, Mendelsohn FO et al. HGF-0205 Trial Investigators. Safety and efficacy of patient specific intramuscular injection of HGF plasmid gene therapy on limb perfusion and wound healing in patients with ischemic lower extremity ulceration: results of the HGF-0205 trial. J Vase Surg. 2010 Dec;52(6): 1525-30.

147. Powell RJ, Simons M, Mendelsohn F et al. Results of a double-blind, placebo-controlled study to assess the safety of intramuscular injection of hepatocyte growth factor plasmid to improve limb perfusion in patients with critical limb ischemia. Circulation. 2008 Jul l;118(l):58-65.

148. Rajagopalan S., Mohler III E.R., Lederman RJ. et al. Regional angiogenesis with vascular endothelial growth factor in peripheral arterial disease: a phase II randomized, double-blind, controlled study of adenoviral delivery of vascular endothelial growth factor 121 in patients with disabling intermittent claudication. Circulation 2003; 108: 1933—1938.

149. Rajagopalan S., Shah M., Luciano A. et al. Adenovirus-mediated gene transfer of VEGF(121) improves lowerextremity endothelial function and flow reserve. Circulation 2001; 104: 753—755.

150. Rajanayagam M., Shou M., Thirumurti V., et al. Intracoronary basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral perfusion in dogs. J. Am. Coll. Cardiol. 2000; 35(2), 519-526.

151. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 1997; 386, 671-674.

152. Rissanen, T.T., Vajanto, I. & Yla-Herttuala, S. Gene therapy for therapeutic angiogenesis in critically ischaemic lower limb on the way to the clinic. Eur. J. Clin. Invest. 2001; 31, 651-666.

153. Rokutanda T, Izumiya Y, Miura M et al. Passive exercise using whole-body periodic acceleration enhances blood supply to ischemic hindlimb. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2011 Dec;31(12):2872-80.

154. Ruel M., Laham R., Parker J., et al. Long-term effects of surgical angiogenic therapy with FGF-2 protein. J. Thorac Cardiovasc. Surg. 2002; 124,28-34.

155. Rutherford R. Recommended standards for reports dealing with lower extremity ischemia. J. Vase. Surg. 1997; 162-165

156. Sakakibara Y., et al. Toward surgical angiogenesis using slow-released basic fibroblast growth factor. Eur. J. Cardiovasc. Surg. 2003; 24(1),105-112.

157. Sato K., Laham R., et al. Efficacy of intracoronary or intravenous VEGF165 in pig model of chronic myocardial ischeia. J. Am. Coll. Cardiol. 2001; 37(2), 616-623.

158. Sellke F. Gene therapy in cardiac surgery: is there a role? //Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 2003; May: 994-997

159. Sellke F., Ruel M. Vascular growth factors and angiogenesis in cardiac surgery. Ann. Thorac. Surg. 2003; 75(2), S685-690.

160. Shigematsu H, Yasuda K, Iwai T et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial of hepatocyte growth factor plasmid for critical limb ischemia. Gene Ther. 2010 Sep; 17(9): 1152-61.

161. Shigematsu H, Yasuda K, Sasajima T et al. HGF Study Group. Transfection of human HGF plasmid DNA improves limb salvage in

Buerger's disease patients with critical limb ischemia. Int Angiol. 2011 Apr;30(2): 140-9.

162. Shou M, Thirumurti V, Rajanayagam M. Effect of Basic Fibroblast Growth Factor on Myocardial Angiogenesis in Dogs With Mature Collateral Vessels. //Journal of American College of Cardiology 1997; 29; 5: 11021106.

163. Soeki T, Tamura Y, Shinohara H. Role of circulating vascular endothelial growth factor and hepatocyte growth factor in patients with coronary artery disease. //Heart and Vessels 2000; 15: 105-111

164. SoRelle R. 50th Annual Scientific Sessions of the American College of Cardiology. //Circulation 2001; 103, 90-93

165. TASC Working group. International Angiology. 2000; 19;1; 1 - 304.

166. Timar J, Dome B, Fazekas K et al. Angiogenesis-dependent diseases and angiogenesis therapy.// Pathol Oncol Res. 2001;7(2):85-94.

167. Tuomisto TT, Rissanen TT, Vajanto I et al. HIF-VEGF-VEGFR-2, TNF-alpha and IGF pathways are upregulated in critical human skeletal muscle ischemia as studied with DNA array //Atherosclerosis. 2004 May;174(l):l 11-20.

168. Urbich, C. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 2004; 9; 5343-5353.

169. Vale PR, Isner JM, Rosenfleld K. Therapeutic angiogenesis in critical limb and myocardial ischemia.//J Interv Cardiol. 2001 Oct;14(5):511-28.

170. Vincent, K.A. et al. Angiogenesis is induced in a rabbit model of hindlimb ischemia by naked DNA encoding an HIF-1 ex/VP 16 hybrid transcription factor. Circulation. 2000; 102, 2255-2261.

171. Wahlberg E. Angiogenesis and arteriogenesis in limb ischemia. //Journal of Vascular Surgery 2003; July; 38(l):198-203

172. Walter D.H., Cejna M., Diaz-Sandoval L. et al. Local gene transfer of phVEGF-2 plasmid by geneeluting stents: an alternative strategy for inhibition of restenosis. Circulation 2004; 110: 36—45.

173. Wan S., George S.J., Nicklin S.A. et al. Overexpression of p53 increases lumen size and blocks neointima formation in porcine interposition vein grafts. Mol Ther 2004; 9: 689—698.

174. West N.E., Qian H., Guzik T.J. et al. Nitric oxide synthase (nNOS) gene transfer modifies venous bypass graft remodeling: effects on vascular smooth muscle cell differentiation and superoxide production. Circulation 2001; 104: 1526—1532.

175. Whitlock P.R., Hackett N.R., Leopold P.L. et al. Adenovirus-mediated transfer of a minigene expressing multiple isoforms of VEGF is more effective at inducing angiogenesis than comparable vectors expressing individual VEGF cDNAs. Mol Ther 2004; 9: 67—75.

176. Witzenbichler B, Asahara T, Murohara T et al. Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C/VEGF-2) promotes angiogenesis in the setting of tissue ischemia.//Am J Pathol. 1998 Aug; 153(2):381-94.

177. Wolff R.A., Ryomoto M., Stark V.E. et al. Antisense to transforming growth factor-beta 1 messenger RNA reduces vein graft intimai hyperplasia and monocyte chemotactic protein 1. J Vase Surg 2005; 41: 498—508.

178. Yamamoto N., Kohmoto T., Roethy W., et al. Histological evidence that basic fibroblast growth factor enhances the angiogenic effects of transmyocardial laser revascularization. Basic Res. Cardiol. 2000; 95, 55-63.

179. Yamauchi A, Ito Y, Morikawa M et al. Pre-administration of angiopoietin-1 followed by VEGF induces functional and mature vascular formation in a rabbit ischemic model.//J Gene Med. 2003 Nov;5(l 1):994-1004.

180. Zachary I., Mathur A. Vascular protection a novel nonangiogenic cardiovascular role for vascular endothelial growth factor. //Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology. 2000; 20: 1512.

181. Zhang D., Gai L., Fan R. et al. Efficacy and safety of therapeutic angiogenesis from direct myocardial administration of an adenoviral vector expressing vascular endothelial growth factor 165. Chin Med J (Engl) 2002; 115:643—648.

182. Zisch AH, Lutolf MP, Hubbell JA. Biopolymeric delivery matrices for angiogenic growth factors.// Cardiovasc Pathol. 2003 Nov-Dec;12(6):295-310.