Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат медицинских наук Андрющенко, Сергей Валерьевич

• Андрющенко, Сергей Валерьевич
• кандидат медицинских наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Андрющенко, Сергей Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЛИЗОЦИМ-РЕЗИСТЕНТНОСТИ И АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Неспецифические механизмы лизоцимрезистентности бактерий

1.1.1. Экранирование пептидогликана

1.1.2. Модификация пептидогликана

1.1.3. Секреция неспецифических ингибиторов

1.2. Специфические ингибиторы лизоцима белковой природы

1.2.1. Анионный термостабильный ингибитор

1.2.2. Ингибитор лизоцима позвоночных

1.2.3. Периплазматический и мембраносвязанный ингибиторы лизоцима

1.3. Регуляция продукции специфических ингибиторов лизоцима

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе

2.2. Методы исследования профиля генетических детерминант ингибиторов лизоцима у исследуемых энтеробактерий

2.2.1. Методы и средства, использованные для филогенетического анализа и конструирования специфичных праймеров генетических детерминант ингибиторов лизоцима

2.2.2. Метод ПЦР-скрининга генетических детерминант ингибиторов лизоцима

2.2.3. Методики анализа плазмидной ДНК

2.3. Методы изучения ряда биологических свойств энтеробактерий

2.3.1. Определение профиля антибиотикорезистентности

2.3.2. Метод выявления лизоцимрезистентности энтеробактерий

2.3.3. Определение уровня антилизоцимной активности

2.3.3.1. Чашечный метод

2.3.3.2. Фотометрический метод

2.3.3.3. Метод определения сорбционного компонента АЛА

2.4. Способы регуляции антилизоцимной активности бактерий

2.4.1. Методы стимуляции антилизоцимной активности

2.4.2. Методы ингибирования антилизоцимной активности

2.5. Методы статистической обработки полученных результатов

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ СЕКРЕТИРУЕМЫХ ИНГИБИТОРОВ ЛИЗОЦИМА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

3.1. Анализ последовательностей гомологов генов секретируемых ингибиторов лизоцима

3.2. Филогенетический анализ геноврИС и /ууС энтеробактерий

3.3. Конструирование ПЦР тест-систем для выявления генов секретируемых ингибиторов лизоцима

3.4. Анализ распространенности генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима

3.5. Анализ плазмидного профиля исследуемых штаммов энтеробактерий

ГЛАВА 4. ЛИЗОЦИМРЕЗИСТЕНТНОСТЬ И АНТИЛИЗО-ЦИМНАЯ АКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ

ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ 65 4.1. Общая антилизоцимная активность энтеробактерий, чашечный метод)

4.2. Характеристика экскретируемого компонента антилизоцимной активности энтеробактерий (фотометрический метод)

4.3. Характеристика сорбционного компонента антилизоцимной активности энтеробактерий, (фотометрический метод)

4.4. Скрининг лизоцимрезистентности энтеробактерий в комбинированной среде

ГЛАВА 5. РЕГУЛЯЦИЯ АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ С РАЗЛИЧНЫМ ГЕНЕТИЧЕСКИМ ПРОФИЛЕМ

5.1. Изменение антилизоцимной активности и копийности пДНК у штаммов Е. coli, отличающихся по плазмидному профилю под действием хлорамфеникола

5.2. Изменение антилизоцимной активности и копийности пДНК у штаммов Е. coli, отличающихся по плазмидному профилю под действием акридоновых соединений

5.3. Изменение антилизоцимной активности у энтеробактерий, отличающихся по присутствию pliC-мегаплазмид под действием хлорамфеникола и акридинового оранжевого

5.4. Влияние пептидогликанового стресса на уровень антилизоцимной активности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий»

Актуальность работы. В настоящее время у бактерий различных таксономических групп выявлены как специфические, так и неспецифические механизмы, обеспечивающие либо пассивную устойчивость к лизо-циму, либо активное ингибирование его гидролитического эффекта (Callewaert L. et al., 2008). Антилизоцимная активность, являясь одним из ключевых фенотипических маркеров персистентного профиля бактерий, отражает главным образом способность клетки к продукции экскретируе-мых соединений, обеспечивающих инактивацию лизоцима в питательной среде (Бухарин О.В., 1999). В ходе работ по выявлению механизмов анти-лизоцимной активности на примере как грамположительных бактерий рода Bacillus (Кириллов Д.А., Кириллов В.А., 2004), так и грамотрицатель-ных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (Бондаренко В.М. и др., 1994) было установлено, что генетические детерминанты данного признака имеют плазмидную локализацию.

Вместе с тем, в зарубежной литературе рассматривается феномен устойчивости к лизоциму штаммов-продуцентов, кодирующийся у энтеро-бактерий двумя семействами генов: ivyC и pliChnliC (Deckers D. et al., 2008). Функционально-полноценные гомологи гена ivyC среди гамма-протеобактерий распространены достаточно широко и встречаются в хромосомах ряда условно-патогенных микроорганизмов родов Escherichia/ Shigella, Erwinia, Klebsiella, Yersinia и Pseudomonas. Однако у бактерий рода Salmonella гомологи данного гена не выявлены (Abergel С., Monchois V.et al., 2007). Второе семейство белков-ингибиторов, существующее у микроорганизмов рода Salmonella было обнаружено несколько позже: РИС/МПС, периплазматический вариант которого кодируется также в хромосомах представителей родов Salmonella и Pseudomonas (Callewaert L. et al., 2008).

Известно, что продукт гена mliC является мембраносвязанным белком, тогда как у белков РИС и IvyC показана периплазматическая локализация (Callewaert L. et al., 2008). Не смотря на то, что не исключена возможность выхода молекул двух последних типов белков за пределы наружной мембраны грамотрицательной клетки-продуцента, где их ингиби-рующий эффект и может быть реализован в виде антилизоцимной активности, в существующих исследованиях данных белков дистантный аспект их ингибирующего эффекта не анализируется.

После завершения проектов по секвенированию геномов патогенных вариантов К. pneumoniae (Wu К.М. et al., 2011), одна из открытых рамок считывания в нуклеотидных последовательностях плазмид вирулентности была аннотирована как гомолог pliC. Этот факт открыл новый путь к объединению существующих подходов по исследованию механизмов как лизо-цимрезистентности, так и антилизоцимной активности микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - определение связи генетических детерминант ингибиторов лизоцима с фенотипическим проявлением антилизоцимной активности энтеробактерий.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов энтеробактерий, кодирующих секретируемые ингибиторы лизоцима.

2. Оценить распространенность известных генетических детерминант сек-ретируемых ингибиторов лизоцима у микроорганизмов видов Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica и определить плазмидный профиль исследуемых штаммов энтеробактерий.

3. Изучить антилизоцимную активность микроорганизмов видов Е. coli, К. pneumoniae, S. enterica с разным профилем генов ингибиторов лизоцима.

4. Выявить изменение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий, различающихся по плазмидному профилю под воздействием неспецифических модификаторов копийности плазмидной ДНК.

Новизна исследования. Проведенный филогенетический анализ внутри- и межвидового распространения генов секретируемых ингибиторов лизоцима pliC и ivyC среди условно-патогенных и патогенных энтеро-бактерий показал высокую частоту случаев горизонтального пути переноса данных генов среди известных геномов различных сероваров Е. coli, S. enterica и К. pneumoniae.

Выявлено наличие хромосомных генетических детерминант исследуемых секретируемых ингибиторов лизоцима среди большинства исследованных штаммов Е. coli и S. enterica, а также вариабельность встречаемости хромосомного гена ivyC и плазмидного гомолога гена pliC у К. pneumoniae.

Наличие генов, кодирующих ингибиторы лизоцима семейств ivyC и pliC, коррелировало с уровнем антилизоцимной активности исследуемых штаммов энтеробактерий. Выявлены различия во вкладе данных генов в общий уровень антилизоцимной активности бактерий, проявляющиеся в преобладающем влиянии гена pliC на уровень секреторной антилизоцимной активности микроорганизмов.

Определено, что уровень лизоцимрезистентности энтеробактерий является преимущественно видовой характеристикой и определяется главным образом несекретируемыми механизмами.

Суббактериостатические концентрации хлорамфеникола вызывают повышение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий при наличии генетических детерминант ингибиторов лизоцима семейства pliC, и, в меньшей степени, ivyC, как плазмидной, так и хромосомной локализации. Напротив, культивирование исследуемых штаммов энтеробактерий в присутствии акридоновых соединений (акридинового оранжевого и акридонуксусной кислоты) в субингибиторных концентрациях приводит к снижению антилизоцимной активности.

Установлено, что наличие в среде культивирования акридонуксусной кислоты не оказывает влияния на копийность плазмидной ДНК энтеробак-терий при выраженном подавлении антилизоцимной активности по сравнению с акридиновым оранжевым.

Культивирование энтеробактерий в условиях пептидогликанового стресса субингибиторными концентрациями ß-лактамного антибиотика не приводило к повышению антилизоцимной активности микроорганизмов, что свидетельствует об отсутствии существенного влияния регуляторной системы Res на фенотипическое проявление данного признака.

Практическая ценность работы. Выявленные консервативные фрагменты нуклеотидных последовательностей генов ингибиторов лизо-цима позволили создать олигонуклеотидные зонды и праймеры широкой специфичности, на основе которых разработана экспериментальная ПЦР тест-система для скрининга генов секретируемых ингибиторов лизоцима с учетом возможной функциональной полноценности и вариабельности выявляемых последовательностей.

Предложена методика неспецифической стимуляции экспрессии данных генетических детерминант при помощи хлорамфеникола для определения функционального резерва антилизоцимной активности микроорганизмов, что может быть использовано для выявления потенциала антилизоцимной активности у бактерий.

Положения, выносимые на защиту: 1. Антилизоцимная активность энтеробактерий - часть общего механизма лизоцимрезистентности микроорганизмов, обусловленная генами экс-кретируемых ингибиторов лизоцима.

2. Молекулярно-генетический подход в виде разработанной экспериментальной тест-системы на основе метода ПЦР выявляет гены секрети-руемых ингибиторов лизоцима в скрининговом режиме.

3. Высокий уровень антилизоцимной активности энтеробактерий сопряжен с наличием гена pliC, тогда как у носителей гена ivyC выявляются низкие значения данного признака.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011); VII Всероссийской конференции «Перси-стенция микроорганизмов» (Оренбург, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Андрющенко, Сергей Валерьевич

ВЫВОДЫ:

1. Филогенетический анализ генов ivy С и pliC среди известных геномов протеобактерий указывает на высокую долю горизонтального пути распространения его гомологов на субвидовом уровне.

2. Выявлены консервативные фрагменты последовательностей генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима и осуществлен подбор праймеров видоспецифичного диапазона для выявления генов pliC и ivy С.

3. Хромосомные гены ivy С E.coli и pliC S. enter ica имеют высокую пенет-рантность (св. 90%). Распространенность данных генов среди вида К. pneumoniae высоковариабельна.

4. Исходно высокий уровень антилизоцимной активности стабильно проявляется у штаммов, имеющих ген pliC как хромосомной, так и плазмид-ной локализации.

5.Установлено, что /?/г'С-позитивные штаммы показали более выраженное изменение антилизоцимного признака под действием хлорамфеникола и акридинового оранжевого.

6.Лизоцимрезистентность энтеробактерий является преимущественно видовым признаком и определяется несекретируемыми механизмами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лизоцим был открыт в 1921 году Александром Флемингом и в течение последующих 80 лет этот белок играл важнейшую роль как модельный фермент во многих разделах современной биологии, включая химию белка, кристаллографию, ядерный магнитный резонанс, энзимологию и иммунологию. Вместе с тем, важнейшим условием выживания бактерий во многих биотопах тела человека является устойчивость к лизоциму С-типа.

Антилизоцимная активность, как один из ключевых фенотипических маркеров персистентного профиля бактерий, отражает главным образом способность клетки к продукции экскретируемых соединений, обеспечивающих инактивацию лизоцима в питательной среде (Бухарин, О.В., 1999). В ходе работ по выявлению наиболее общих механизмов антилизоцимной активности на примере как грамположительных бактерий рода Bacillus (Кириллов Д.А., Кириллов В.А., 2004), так и энтеробактерий (Бондаренко В.М. и др., 1994) было установлено, что генетические детерминанты данного признака имеют плазмидную локализацию.

Старт детализированного изучения молекулярно-генетических механизмов проблемы устойчивости бактерий к действию лизоцима отмечается только с 2001 года, когда был открыт первый специфичный белок-ингибитор лизоцима позвоночных, названный Ivy (Monchois, V., 2001) и кодируемый соответствующим хромосомным геном, выявленным у Е. coli и ряда других протеобактерий за исключением рода Salmonella (Abergel, С. 2007).

Второе семейство белков-ингибиторов - PliC/MliC - было выявлено несколько позже; периплазматический вариант которого - РИС -кодируется также в хромосомах протеобактерий, но выявляется главным образом у представителей родов Salmonella и Pseudomonas (Callewaert, L., 2008).

Вместе с тем, следует отметить, что в зарубежной литературе изучение данных генетических детерминант рассматривается только в контексте устойчивости к лизоциму самих штаммов-продуцентов. (Deckers D. et al., 2004)

К настоящему времени детально изучены механизмы, детерминируемые хромосомными генами: известно два семейства специфических и один неспецифический ингибитор лизоцима (Callewaert, L., 2008), выявлен механизм сочетанной индукции специфических ингибиторов обоих семейств через бактериальную внутриклеточную регуляторную систему Res в ответ на пептидогликановый стресс не зависимо от его природы (Callewaert L. et al, 2009). Изучены и другие механизмы лизоцимрезистентности: экранирование (Nikaido, H., 2003) и модификация (Pfeffer J.M., 2006; Hébert L., 2007) пептидогликана.

Таким образом, у бактерий различных таксономических групп выявлены как специфические, так и неспецифические механизмы, обеспечивающие либо пассивную устойчивость к лизоциму, либо активное ингибирование его гидролитического эффекта (Callewaert, L., 2008), однако все их генетические детерминанты имеют хромосомную локализаI цию.

Тем не менее, после завершения проектов по секвенированию геномов патогенных вариантов К. pneumoniae (Wu K.M. et al., 2011), одна из открытых рамок считывания в нуклеотидных последовательностях плазмид вирулентности была аннотирована как гомолог pliC. Этот факт открыл новый путь к объединению существующих подходов по исследованию механизмов как лизоцимрезистентности, так и антилизоцимной активности микроорганизмов.

В настоящей работе предпринята попытка определить взаимосвязь генетических детерминант ингибиторов лизоцима с антилизоцимным фенотипом энтеробактерий. Для достижения данной цели мы провели анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов энтеробактерий, кодирующих секретируемые ингибиторы лизоцима, оценили распространенность известных генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима у микроорганизмов видов Е. coli, К. pneumoniae, S. enterica и определили плазмидный профиль исследуемых штаммов энтеробактерий; изучили антилизоцимную активность исследуемых микроорганизмов с разным профилем наличия генов ингибиторов лизоцима и выявили изменение уровня антилизоцимной активности энтеробактерий, различающихся по наличию генетических детерминант ингибиторов лизоцима под воздействием неспецифических модификаторов копийности плаз-мидной ДНК.

На первом этапе, при первичном сопоставлении известных последовательностей генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима нами было обнаружено, что новооткрытый плазмидный гомолог гена pliC клебсиелл имеет большое число расхождений в последовательности нуклеотидов с уже изученным хромомсомным гомологом гена pliC сальмонелл. Тем не менее, сопоставление производных аминокислотных последовательностей и их последующий анализ показал, что ключевые параметры полипептида, кодируемого плазмидой вирулентности К. pneumoniae: наличие функционально-критичных аминокислот в активном центре и отщепляемого сигнального пептида, обеспечивающего секретируемый характер белка, оказались сохранными. Что дало нам основания включить данную плазмидную детерминанту в цикл экспериментальных работ наряду с хромосомными детерминантами.

Выполненный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей показал преобладание невертикального пути переноса генов pliC и ivyC между подвидами и сероварами внутри рассматриваемых видов и в ряде случаев - между близкородственными видами К. pneumoniae и К. variicola. Этот факт свидетельствует в пользу положения о том, что исследуемые генетические детерминанты входят во внутривидовые и надви-довые пулы генов, имеющих важное адаптивное значение для их носителей.

Для достижения данной цели мы использовали 150 штаммов энтеро-бактерий: по 50 культур негемолитических Е. coli, 50 штаммов К. pneumoniae, изолированных из испражнений пациентов с I - II степенью дисбиоза кишечника и 50 вариантов S. enterica, выделенных от больных острой кишечной инфекцией и реконвалесцентных сальмонеллезных бактерионосителей. Все полученные штаммы были идентифицированы по морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам.

ПЦР-скрининг хромосомных генов секретируемых ингибиторов лизо-цима показал высокую распространенность как гена ivyC у штаммов Е. coli, являющихся представителями нормофлоры кишечника человека, так и pliC у вариантов S. enterica - возбудителей сальмонеллеза.

В то же время распространенность как хромосомного гена ivyC, так и гена рНС плазмидной локализации у исследуемых штаммов К. pneumoniae, показал значительную вариабельность наличия данных генетических детерминант, что позволило выделить как /ууС-/?//С-позитивные варианты, так и демонстрирующие негативный результат при выявлении обоих генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима. Этот факт, вероятно, может быть объяснен как наличием дополнительных механизмов лизоцимрезистентности, так и широкой вариабельностью патогенного потенциала данного вида. Кроме того, плазмидный вариант гена pliC также был выявлен у штамма К. pneumoniae 278, описанного ранее как продуцент ингибитора лизоцима (Бухарин О.В. с соавт., 2008), демонстрирующего высокий уровень АЛА.

Таким образом, на первом этапе работы, с одной стороны, было обнаружено широкое распространение хромосомных генов ivyC и pliC, что подтвердило их конститутивность для видов Е. coli и S. enterica, с другой, были выявлены и ivyC- и /?//С-негативные штаммы, ставшие материалом для групп сравнения на последующих этапах работы.

Принимая во внимание существующие данные литературы о существенно более высоком уровне антилизоцимной активности у сальмонелл, продуцирующих только ингибитор РИС по сравнению с Е. coli, способными секретировать только белок-ингибитор IvyC, а также обнаружение плазмидного варианта гена pliC у штамма К. pneumoniae 278, проявляющего высокий уровень антилизоцимной активности позволил предположить более существенный вклад белка РИС в уровень антилизоцимной активности как комплексного фенотипического признака.

Данное предположение было подтверждено в результате проведенного на следующем этапе исследования антилизоцимного фенотипа у штаммов с различным профилем наличия генов секретируемых ингибиторов лизоцима. Так, было показано, что присутствие в геноме гомологов гена ivyC у исследованных штаммов Е. coli соответствует уровню антилизоцимной активности, не превышавшему 2 мкг/мл, тогда как присутствие гомологов данного гена в геноме К. pneumoniae не было сопряжено с уровнем АЛА и выявленные ivyC-негативные штаммы

К. pneumoniae демонстрировали такой же уровень признака как и ivyC-позитивные варианты. Штаммы Е. coli и S. enterica, не содержащие известных гомологов генов секретируемых ингибиторов лизоцима показали минимальный уровень данного параметра, измеряемого как стандартным чашечным так и фотометрическим методом, тогда как наличие плазмидного гена pliC как у сальмонелл, так и у клебсиелл соотносилось с существенно более высоким уровнем антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов.

Анализ сорбционного компонента АЛА показал, что у энтеробактерий всех исследованных видов, не зависимо от наличия в их геноме гомологов одного либо другого известного гена секретируемого ингибитора лизоцима, данный фенотипический признак не различался и составлял в среднем 1,2±0,4 мкг/мл инактивированного лизоцима. Максимальные значения, демонстрируемые отдельным штаммами не превысили 2 мкг/мл инактивированного лизоцима.

Полученные данные подтверждают экскреторный характер различий исследуемого фенотипического признака, выявленных с использованием предыдущих методов и указывают на тот факт, что определение антилизоцимной активности у энтеробактерий исследуемых видов чашечным методом также отражает преимущественно экскреторный его компонент.

Попытка определения степени устойчивости к лизоциму штаммов, отличающихся по присутствию в геноме гомологов различных генов секретируемых ингибиторов лизоцима, выявила только межвидовые различия, продемонстрировав существенно более высокий уровень резистентности к комбинации «хелатор+лизоцим» у представителей вида К. pneumoniae не зависимо от наличия генов того или иного семейства ингибиторов лизоцима, что, возможно, связано со способностью к активной продукции секретируемых экзополисахаридов, характерной для большинства представителей этого вида. Это наблюдение подтверждает преимущество неспецифических механизмов для выживания энтеробактерий в лизоцимнасыщенной среде. С другой стороны, положительный результат по применению три-лона Б в качестве хелатора, повышающего проницаемость наружной мембраны энтеробактерий, подводит к возможности создания комбинированных сред для количественного определения лизоцимрезистентности и многих других соединений как биогенного, так и абиогенного происхождения, оказывающих повреждающее действие на наружную мембрану, но не вызывающих при этом денатурацию лизоцима.

Выявленные различия в уровне антилизоцимной активности штаммов, отличающихся по наличию гена pliC и отсутствие существенной разницы в данном фенотипическом признаке между zvyC-позитивными и ivyC-негативными штаммами Е. coli и К. pneumoniae подтверждает предположение о ведущей роли гена pliC в дистантном ингибировании лизоцима, особенно если принять во внимание тот факт, что молекулярная масса белка РИС, в 1,5 раза меньше (менее 10 кДа), чем у IvyC (15 кДа) а, следовательно, увеличивается возможность выхода белка РИС в межклеточную среду из периплазматического пространства и более свободного диффундирования в ней, где его наличие и фиксируется существующими методами как антилизоцимная активность.

Проведенное на заключительном этапе исследование динамики ко-пийности плазмид и антилизоцимной активности в присутствии вышеуказанных плазмид-ассоциированных регуляторных факторов у штаммов Е. coli 252 и К. pneumoniae 278 и 275 показало нарастание числа копий пДНК с увеличением концентрации хлорамфеникола до бактериостатиче-ской в 1,3 раза. Исследование динамики данного показателя у указанных штаммов под воздействием акридинового оранжевого показало снижение копийности плазмид вплоть до полного отсутствия регистрируемых количеств пДНК уже при достижении начальной ингибиторной концентрации препарата. Однако вторичное исследование получаемых клонов показывало сохранность плазмид в бактериальных клетках, что свидетельствовало об адаптированное™ штамма бактерии-хозяина к наличию плазмид с ослабленным контролем репликации (Bouma J.E., Lenski R.E., 1988; Гану-совВ.В., 2001).

Внесение в среду культивирования акридонуксусной кислоты в виде препарата «Циклоферон» в концентрации до 5 мг/мл не вызывало значимого изменения количества плазмид.

Изучение динамики антилизоцимной активности исследуемых видов энтеробактерий с различным профилем наличия генов секретируемых ингибиторов лизоцима выявило существенное изменение признака под воздействием данных препаратов только у штаммов S. enterica и К. pneumoniae, содержащих гомологи гена pliC и незначительную динамику исходных значений антилизоцимной активности энтеробактерий, содержащих в генотипе только гомологи гена ivyC. В то же время под воздействием циклоферона уровень антилизоцимной активности снижался у всех групп энтеробактерий до нулевых значений.

Изучение динамики антилизоцимной активности исследуемого штамма при действии акридинового оранжевого выявило сходную картину: при повышении концентрации акридинового оранжевого до уровня начальной ингибирующей концентрации происходило уменьшение уровня антилизоцимной активности до нулевых значений. Под действием препарата «Циклоферон» также наблюдалось снижение значений антилизоцимного признака вплоть до полного его отсутствия.

Ингибирование числа копий плазмидной ДНК и уровня антилизоцим-ной активности под действием акридинового оранжевого и повышение данных показателей после воздействия хлорамфеникола у исследованных штаммов не зависимо от видовой принадлежности и плазмидного профиля, а также при наличии генов секретируемых ингибиторов лизоцима любого из двух известных типов подводит к выводу о комплексном действии исследуемых препаратов на различные анаболические системы бактериальной клетки, которое реализуется, возможно, через неспецифическое изменение интенесивности синтеза и деградации нуклеиновых кислот аппарата трансляции (J Midgley., W.Gray, 1971; V. Shen, Н. Bremer, 1977).

Уменьшение уровня антилизоцимной активности под действием «Циклоферона» при отсутствии влияния его на копийность плазмид показывает, что механизм регуляции персистентных свойств препаратом «Цик-лоферон» находится не на уровне генотипа и не может быть обусловлен уменьшением «дозы генов», локализующихся в плазмидах с нестрогим контролем репликации.

Попытка стимуляции секреции внеклеточных ингибиторов лизоцима методом пептидогликанового стресса, вызванного ß-лактамным антибиотиком, не привела к достоверному изменению выраженности антилизо-цимного признака, что согласуется с данными как ранних работ посвященных регуляции антилизоцимного фенотипа (В.Ю. Соколов, 1990, О.В. Бухарин, 1999), так и с точки зрения характеристики конкретных секретируемых ингибиторов семейства ivyC, основной пул которого локализуется в периплазматическом пространстве энтеробактерии, и семейства pliC, зависимость продукции которого от стресс-регуляторной системы Res не показана.

Таким образом, результаты проведённой работы позволили выделить три основных момента:

1. Антилизоцимная активность энтеробактерий является частью общего механизма лизоцимрезистентности микроорганизмов и определяется наличием генов секретируемых ингибиторов лизоцима.

2. Применение молекулярно-генетического подхода в виде разработанной экспериментальной тест-системы на основе метода ПЦР позволяет выявлять гены секретируемых ингибиторов лизоцима в скрининговом режиме.

3. Проведенный анализ демонстрирует, что наличие гена /ууС у исследованных штаммов энтеробактерий не сопряжено с высоким уровнем АЛА, тогда как наличие гена рИС (как хромосомной, так и плазмидной локализации) соотносится с высоким уровнем антилизоцимной активности исследуемых микроорганизмов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Андрющенко, Сергей Валерьевич, 2012 год

1. Бондаренко, В.М. Антилизоцимный фактор Klebsiella pneumoniae: природа, биологические функции и генетический контроль / В.М. Бондаренко, В.Г. Петровская, А.Л. Яблочков // Журн. микробиол.- 1994-№1- С. 22-28.

2. Характеристика плазмиды Klebsiella pneumoniae, несущей маркеры лекарственной устойчивости и антилизоцимной активности / В.М. Бондаренко, А.Л. Яблочков, Ю.М. Романова и др. // Журн. микробиол 1988— №3.-С. 28-32.

3. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий / О.В. Бухарин; Екатеринбург, УрО РАН М.: Медицина. 1999 - 365 с.

4. Бухарин, О.В., Скрининг плазмид у бактерий рода Bacillus, обладающих антилизоцимной активностью / О.В. Бухарин, Д.А. Кириллов, В.А. Кириллов //Журн. микробиол -2006-№1-С. 3-6.

5. Влияние циклоферона на биологические свойства бактериальных внутриклеточных патогенов / О.В. Бухарин, Д.А. Кириллов, Н.В. Шеенков и др. // Журн. микробиол. 2005. - №3. - С. 8-10.

6. Ганусов, В.В. Популяционная динамика бактериальных плазмид / В.В. Ганусов, А.В. Брильков, Н.С.Печуркин // Математическое моделирование.-2001.-№13. С. 77-98.

7. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. / С. Гланц // М.: Практика, 1999.- 459 с.

8. Зыкова, Л.С. Этиологическая характеристика пиелонефрита и её значение для экспериментально-клинического обоснования антибактериальной терапии: автореф. дис. . канд. мед. наук: 03.00.07 / Л.С. Зыкова-Челябинск, 1986.-26 с.

9. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М.: Мир, 1984. - 480 с.

10. Петровский, А.С. Структурная модификация ферментных белков для изменения эффективности катализируемых реакций: автореферат дис. .канд. биол. наук: 03.01.06 / А.С. Петровский. Москва, 2012. - 20 с.

11. ПЦР "в реальном времени" // Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов и др. М.: БИНОМ. - 2009. - 223 с.

12. Соколов, В. Ю. Механизм антилизоцимной активности бактерий: автореферат дис. . канд. мед. наук: 03.00.07 / В. Ю. Соколов. Челябинск, 1990.-22 с.

13. Фельдман, С.З., Клиническое значение факторов персистенции возбудителя при сальмонеллезной инфекции у детей / С.З. Фельдман, Ю.Д. Каган, Б.Я. Усвяцов, Л.И. Паршута // Журн. микробиол. 2003. - №4. - С. 59-60.

14. Чайникова, И.Н. Инфектологическая характеристика сальмонеллеза: автореф. дис . док. мед. наук: 03.00.07, 14.00.36 / И.Н. Чайникова. -Оренбург, 2006. 48 с.

15. Черкасов, С.В. Ассоциативный симбиоз как биологическая основа колонизационной резистентности хозяина: дис. . док. мед. наук: 03.02.03/ С.В. Черкасов. Оренбург, 2011. - 258с.

16. Structure and evolution of the Ivy protein family, unexpected lysozyme inhibitors in gram-negative bacteria / C. Abergel, V. Monchois, D. Byrne et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA - 2007. - №15. - P. 6394-6399.

17. Activation of the Salmonella Typhimurium Mrr protein / A. Aertsen, M. Tesfazgi, C.W. Michiels // Biochem Biophys Res Commun. 2008. -№2. -P. 435^439.

18. Akesson, P. Protein SIC, a Novel Extracellular Protein of Streptococcus pyogenes Interfering with Complement Function / P. Akesson, A. Sjoholm, LJ. Bjorck // Biol. Chem. USA 1996. - №271, P. 1081-1088.

19. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins / MM. Babu, M.L. Priya, A.T. Selvan et al. // J. Bacteriol. 2006. №188. - P. 2761-2773.

20. The peptide antibiotic LL-37 / hCAP-18 is expressed in epithelia of the human lung where it has broad antimicrobial activity at the airway surface / R. Bals, X. Wang, M. Zasloff et al. 1998. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA -№95.-P. 9541-9546.

21. Attribution of the Various Inhibitory Actions of the Streptococcal Inhibitor of Complement (SIC) to Regions within the Molecule / M.J.Binks, B.A. Fernie-King, D.J. Seilly et al. // The Journal of Biological Chemistry. 2005. - V.280. - P. 20120-20125.

22. Structure and metal-dependent mechanism of peptidoglycan deacetylase, a streptococcal virulence factor / D.E. Blair, A.W. Schüttelkopf, J.I. MacRae et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA - 2005. - №43. - P. 15429-15434.

23. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 / F.R. Blattner, G. Plunkett, C.A. Bloch et al. // Science. USA - 1997. - №277. - P. 14531462.

24. Blundell, J.K. The peptidoglycan ofNeisseria gonorrhoeae: O-acetyl groups and lysozyme sensitivity. / J.K. Blundell,, G.J. Smith, H.R. Perkins // FEMS Microbiol. Lett. 1980. - №9. - P. 259-261.

25. Boneca, I.G. The role of peptidoglycan in pathogenesis / I.G. Boneca // Cum Opin. Microbiol. 2005. - №8. - P. 46-53.

26. Bouma, J.E. Evolution of a bacteria/plasmid association / J.E. Bouma, R.E. Lenski //Nature. 1988. -№335. - P. 351-352.

27. Brock, T.D. Chloramphenicol. / T.D. Brock // Bacteriol Rev. 1961. №1. -P. 32-48.

28. Global Analysis of Extracytoplasmic Stress Signaling in Escherichia coli / S. Bury-Moné, Y. Nomane, N. Reymond et al. // PLoS Genet. 2009. -№9 P. 1640-1651.

29. Purification of Ivy, a lysozyme inhibitor from Escherichia coli, and characterisation of its specificity for various lysozymes / L. Callewaert, B. Masschalck, D. Deckers et al. // Enzyme Microb Technol. 2005. - №2. -P. 205-211.

30. A new family of lysozyme inhibitors contributing to lysozyme tolerance in gram-negative bacteria / L. Callewaert, A. Aertsen, D. Deckers et al.// PLoSPathog.- 2008.- №3.-P. 1000-1019.

31. Detection of a Lysozyme Inhibitor in Proteus mirabilis by a New Reverse Zymogram Method / L. Callewaert, L. Vanderkelen, D. Deckers et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2008. -№15. P.4978-4981.

32. The Res Two-Component System Regulates Expression of Lysozyme Inhibitors and Is Induced by Exposure to Lysozyme / L. Callewaert, K.G.A. Vanoirbeek, I. Lurquin et al. // Bacteriol. 2009. - №6. - P. 19791981.

33. Canny, G.O. Bacteria in the Intestine, Helpful Residents or Enemies from Within? / G.O. Canny, B.A. McCormick // Infect Immun. 2008. - №8. -P. 3360-3373.

34. Sequencing and analysis of the large virulence plasmid pLVPK of Klebsiella pneumoniae CG43 / Y.T. Chen, H.Y. Chang, Y.C. Lai et al. // Gene. 2004. - №4. - P. 189-198.

35. Advances in the modulation of microbial ecology of the gut in early infancy / R. Chierici, S. Fanaro, D. Saccomandi et al. // Acta Paediatr. Suppl. -2003.- №91.-P. 56-63.

36. Clarke, A. 0-aeetylated peptidoglycan: its occurence, pathobiological significance, and biosynthesis / A. Clarke, C. Dupont // Can. J. Microbiol. -1992.- №38.-P. 85-91.

37. Clarke, A. Pathways for the O-acetylation of bacterial cell wall polymers / A.J. Clarke, H. Strating, N.T. Blackburn. N.Y.: Plenum Publishing Co., 2000.-P. 187-223.

38. Courvalin, P. Genetics of glycopeptide resistance in gram-positive pathogens. / P. Courvalin // Int. J. Med. Microbiol. 2005. - №294. P. 479- 486.

39. Factors affecting plasmid production in Escherichia colifrom a resource allocation standpoint / D.S. Cunningham, R.R. Koepsel, M.M. Ataai et al. // Microb Cell Fact. 2009. - №8 P. 18-27.

40. Dupont, C. Dependence of lysozyme catalyzed solubilization of Proteus mirabilis peptidoglycan on the extent of O-acetylation / C. Dupont,

41. A.J. Clarke// Eur. J. Biochem. -1991.-№195.-P. 763-769.

42. Recent advances in carbohydrate bioengineering / H.J. Gilbert, G. Davies,

43. B. Henrissat, et al. Cambridge, United Kingdom: The Royal Society of Chemistry, 1999.- 312 p.

44. Daigle, F. Identification of Salmonella typhi genes expressed within macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS) / F. Daigle, J.E. Graham, R. Curtis // Mol. Microbiol. 2001. - №5. - P. 12111222.

45. Periplasmic lysozyme inhibitor contributes to lysozyme resistance in Escherichia coli / D. Deckers, B. Masschalck, A. Aertsen et al. // Cell Mol. Life Sci.-2004.-№10.-P. 1229-1237.

46. The non-enzymatic microbicidal activity of lysozymes / K. Düring, P. Porsch, A. Mahn et al. // FEBS Letters. 1999. - №449 P. 93-100.

47. Ellison, R.T. Killing of gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme / R.T. Ellison, T. J. Giehl //J. Clin. Investig. 1991. -№88. P. 1080-1091.

48. Lactoferrin and transferrin damage of the gram-negative outer membrane is modulated by Ca2+ and Mg2+ / R.T. Ellison, F.M. LaForce, T. Giehl, et al. // J. Gen. Microbiol. 1990. - №136. - P. 1437-1446.

49. Erickson, K.D. The Res phosphorelay system is specific to enteric pathogens/commensals and activates ydel, a gene important for persistent Salmonella infection of mice / K.D. Erickson, C.S. Detweiler // Mol. Microbiol. 2006. - P. 62883-62894.

50. Streptococcal inhibitor of complement (SIC) inhibits the membrane attack complex by preventing uptake of C567 onto cell membranes / Fernie-King, B. A., Seilly, D. J., Willers, C. et al. // Immunology. 2001. -№103, P.390-398.

51. Foster, T.J. Plasmid-Determined Resistance to Antimicrobial Drugs and Toxic Metal Ions in Bacteria / T.J. Foster // Microbiological Rev. 1983. -№3.-P. 361-409.

52. Franken, C. Tissue distribution of antileukoprotease and lysozyme in humans / C. Franken, C.J.M. Meijer, J.H. Dijkman. // J. Histochem. Cytochem. 1989. - №37 - P. 493-498.

53. Ganz, T. Antimicrobial peptides of phagocytes and epithelia / T. Ganz, J. Weiss. Semin. Hematol. - 1997. - №34 - P. 343-354.

54. Garcia, R. 2005. A review of the possible role of oral and dental colonization on the occurrence of health care-associated pneumonia: underappreciated risk and a call for interventions / R. Garcia // Am. J. Infect. Control. -2005.-№33.-P. 527-541.

55. Gaynes, R. Overview of nosocomial infections caused by gram-negative bacilli. / R. Gaynes, J.R. Edwards //Clin. Infect. Dis. -2005. №41. -P. 848-854.

56. GenBank Электронный ресурс.: genetic sequence database / National Library of Medicine. Электрон, база данных. - NCBI, США. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

57. Germaine, G.R. Simple and rapid procedure for the selective removal of lysozyme from human saliva / G.R. Germaine, L.M. Tellefson. // Infect. Immun. 1979. - №26. - P. 991-995.

58. Grinde, B. A lysozyme isolated from rainbow trout acts on mastitis pathogens. / Grinde, B. // FEMS Microbiol Lett. 1989. - №2. - P. 179-182.

59. Grossowicz, N. Methods for determination of lysozyme activity / N. Grossowicz, M. Ariel // Methods Biochem. Anal. 1983. -№29. - P. 435446.

60. Characterization of the Salmonella typhimurium pagC/pagD chromosomal region /J.S. Gunn, C.M. Alpuche-Aranda, W.P. Loomis et al. // J. Bacterid. 1995.-№17.-P. 5040-5047.

61. Hartas, J. Streptococcus pyogenes strains containing emml2 and emm55 possess a novel gene coding for distantly related SIC protein / J. Hartas, K.S. Sriprakash // Microb. Pathog. 1999. - №26. - P. 25-33.

62. Enterococcus faecalis Constitutes an Unusual Bacterial Model in Lysozyme Resistance / L. Hébert, P. Courtin, R. Torelli et al. // Infect. Immun. 2007. -№11.-P. 5390-5398.

63. Heukeshoven, J. Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit: Staining of sodium dodecyl sulfate gels / J. Heukeshoven, R. Dernick // Electrophoresis. 1988. - №9. - P. 28-32.

64. Nikaido, H. Molecular Basis of Bacterial Outer Membrane Permeability Revisited / H. Nikaido // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - №4. -P. 593-656.

65. Huang, Y.-H. The role of the Res phosphorelay in Enterobacteriaceae / Y.-H. Huang, L. Ferrières, D. J. Clarke //Res. Microbiol. -2006. №157. -P. 206-212.

66. Processing of lysozyme at distinct loops by pepsin: a novel action for generating multiple antimicrobial peptide motifs in the newborn stomach / H.R. Ibrahim, D. Inazaki, A. Abdou et al. // Biochim. Biophys. Acta. -2005.-№1726.-P. 102-114.

67. Ibrahim, H.R. Ovotransferrin antimicrobial peptide (OTAP-92) kills bacteria through a membrane damage mechanism / H.R. Ibrahim, Y. Sugimoto, T. Aoki // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - №1523. - P. 196-205.

68. Amino acid sequences of lysozymes newly purified from invertebrates implay wide distribution of a novel class in the lysozyme family / Y. Ito, A. Yoshikawa, I. Hotani et al. // Eur. J. Biochem. 1999. - №259. -P. 456-461.

69. Johanson, W.G. Changing pharyngeal bacterial flora of hospitalized patients. Emergence of gram-negative bacilli / W.G. Johanson, A.K. Pierce, J.P. Sanford. //N. Engl. J. Med. 1969. -№281. -P. 1137-1140.

70. Systematic Mutagenesis of the Escherichia coli Genome / Y. Kang, T. Durfee, J.D. Glasner et al. // J. Bacteriol. 2004. - №15. - P. 4921^1930.

71. Kaufmann, E. SDS-PAGE strongly overestimates the molecular masses of the neurofilament proteins / E. Kaufmann, N. Geisler, K. Weber // FEBS Lett. 1984.-№1.-P. 81-84.

72. Structural evidence for lack of inhibition of fish goose-type lysozymes by a bacterial inhibitor of lysozyme / P. Kyomuhendo, I.W. Nilsen, B.O. Brandsdal et al. // Springer-Verlag. 2008. - №1007. P. 309-317.

73. Laemmli, M. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4 / Laemmli, M. // Nature. 1970. - №227 - P.680-685.

74. Lam H-M, Winkler ME. Characterization of the complex pdxH-tyrS operon of Escherichia coli K-12 and pleiotropic phenotypes caused by pdxH insertion mutations. J Bacteriol. 1992;174:6033-6045.

75. Laubacher, M.E. The Res phosphorelay is a cell envelope stress response activated by peptidoglycan stress and contributes to intrinsic antibiotic resistance / M.E. Laubacher, S.E. Ades //J. Bacteriol. -2008. №190. -P. 2065-2074.

76. Pseudomonas aeruginosa and the oropharyngeal ecosystem of tube-fed patients / A. Leibovitz, M. Dan, J. Zinger et al. // Emerg. Infect. Dis. 2003. - №9. - P. 956-959.

77. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAOl: a tool for identifying differentially regulated genes

78. S. Lewenza, R.K. Falsafi, G. Winsor, et al. // Genome Res. -2005. -№15.-P. 583-589.

79. Molecular Basis of Bacterial Defense against Host Lysozymes: X-ray Structures of Periplasmic Lysozyme Inhibitors PHI and PliC / S. Leysen, J.M. Van Herreweghe, L. Callewaert et al. // Journal of Molecular Biology. 2011.-№5.-P. 1233-1245.

80. Lin-Chao, S. Effect of the bacterial growth rate on replication control of plasmid pBR322 in Escherichia coli / S. Lin-Chao, H. Bremer // Mol Gen Genet.- 1986.-№1.-P. 143-149.

81. Lovelady, C.A. Effect of exercise on immunologic factors in breast milk / C.A. Lovelady, C.P. Hunter, C. Geigerman // Pediatrics. 2003. -№111.-P. 148-152.

82. Lycett, G.W. Chloramphenicol releases a block in initiation of chromosome replication in a dnaA strain of Escherichia coli Kl2 / G.W. Lycett, E. Orr, R.H. Pritchard // Mol. Gen. Genet. 1980. - №2. - P. 329-336.

83. Consumption of milk from transgenic goats expressing human lysozyme in the mammary gland results in the modulation of intestinal microflora / A.E. Maga,, R.L. Walker, G.B. Anderson et al. // Transgenic Res. 2006. -№15.-P. 515-519.

84. Majdalani, N. Regulation and mode of action of the second small RNA activator of RpoS translation, RprA / N. Majdalani, D. Hernandez, S. Gottesman // Mol. Microbiol. 2002. - №46. - P. 813-826.

85. Role of RcsF in signaling to the Res phosphorelay pathway in Escherichia coli / N. Majdalani, M. Heck, V. Stout et al. // J. Bacteriol. 2005. №187. -P. 6770-6778.

86. Anti-infective factors in preterm human colostrum / N.B. Marthur, A.M. Dwarkadas, V.K. Sharma et al. // Acta Paediatr. Scand. 1990. -№79.-P. 1039-1044.

87. Mason, D.Y. The distribution of muramidase (lysozyme) in human tissues / D.Y. Mason, C.R. Taylor // J. Clin. Pathol. 1975. - №28. - P. 124-132.

88. Midgley, J.E.M. The control of ribonucleic acid synthesis in bacteria. The synthesis and stability of ribonucleic acid in chloramphenicol-inhibited cultures of Escherichia coli / J.E.M. Midgley, W.J.H. Gray // Biochem J. -1971.-№2.-P. 149-159.

89. Miller, E.M. Escherichia coli electrotransformation / E.M. Miller, J.A. Nickoloff// Methods Mol. Biol. 1995. - №47. - P. 105-113.

90. Miller, J. H. Experiments in molecular genetics / J. H. Miller. -N.Y.: Cold Spring Harbor Press. 1972. - 466 p.

91. Escherichia coli ykfE ORFan Gene Encodes a Potent Inhibitor of C-type Lysozyme / V. Monchois, C. Abergel, J. Sturgis et al. // J. Biol. Chem. -2001.-№276.-P. 18437-18441.

92. Cell wall substrate specificity of six different lysozymes and lysozyme inhibitory activity of bacterial extracts / D. Nakimbugwe , B. Masschalck, D. Deckers et al. // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - №1. - P. 41-46.

93. Narita, S.-I. Amino Acids at Positions 3 and 4 Determine the Membrane Specificity of Pseudomonas aeruginosa Lipoproteins / S.-I. Narita, H. Tokuda // J. Biol. Chem. 2007. - №18. - P. 13372-13378.

94. Co-regulation of Salmonella enterica genes required for virulence and resistance to antimicrobial peptides by SlyA and PhoP/PhoQ / W.W. Navarre, T.A. Halsey, D. Walthers et al. // Mol. Microbiol. 2005. - №2. - P. 492508.

95. Urochordates carry multiple genes for goose-type lysozyme and no genes for chicken- or invertebrate-type lysozymes / I.W. Nilsen, B. Myrnes, R.B. Edvardsen et al. // Cell Mol Life Sei. 2003. №60. - P. 2210-2218.

96. Identification and isolation of a bactericidal domain in chicken egg white lysozyme / A. Pellegrini, U. Thomas, N.J. Bramaz et al. // Appl. Microbiol. 1997.-№82.-P. 372-387.

97. Peptidoglycan O-acetylation and autolysin profile of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. / J.M. Pfeffer, H.Strating, J.T. Weadge et al. // J. Bacteriol. 2006. - №3. - P. 902-908.

98. Peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylases from Bacillus cereus, highly conserved proteins in Bacillus anthracis / E. Psylinakis, I.G. Boneca, K. Mavromatis et al. // J Biol Chem. 2005. - №35. - P. 30856-30863.

99. Autotransporter-encoding sequences are phylogenetically distributed among Escherichia coli clinical isolates and reference strains / C. Restieri, G. Garriss, M.C. Locas // Appl. Environ Microbiol. 2007. -№5.-P. 1553-1562.

100. The solution structure of the protein ydhA from Escherichia coli / M. Revington, A. Semesi, A. Yee et al. // J. Biomol. NMR. 2006.- №35-P. 295-300.

101. Antimicrobial proteins and polypeptides in pulmonary innate defence / M.P. Rogan, P. Geraghty, C.M. Greene et al. // Respir. Res. 2006. - №7,-P. 29-39.

102. Improving the accuracy of PSI-BLAST protein database searches with composition-based statistics and other refinements / A.A. Schäffer, L. Ara-vind, T.L.Madden et al.// Nucleic Acids Res.- 2001.- №14.- P.2994-3005.

103. Systemic diseases in association with microbial species in oral biofilm from elderly requiring care / H. Senpuku, A. Sogame, E. Inoshita et al. // Gerontology. 2003. - №49. - P.301-309.

104. Growth characteristics of and virulence factor production by group A Streptococcus during cultivation in human saliva / S.A. Shelburne, C. Ganville, M. Tokuyama, et al. // Infect. Immun. -2005. №73. -P. 4723- 4731.

105. Shen, V. Chloramphenicol-Induced Changes in the Synthesis ofRibosomal, Transfer, and Messenger Ribonucleic Acids in Escherichia coli B/r / V. Shen, H. Bremer // J. Bacteriol. 1977. - №3. - P. 1098-1108.

106. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver stained Polyacrylamide gels / A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann // Anal Chem. -1996.-№68.-P. 850-858.

107. The COG database: an updated version includes eukaryotes / R.L. Tatusov, N.D. Fedorova, J.D. Jackson, A.R. Jacobs, B. Kiryutin, et al. // BMC Bioin-formatics. 2003. - №4. - P. 41.

108. Taylor, P. W. Bactericidal and bacteriolytic activity of serum against gramnegative bacteria / P.W. Taylor // Microbiol. Rev. 1983. - №47. P. 46-83.

109. Tomas, T.J. A simple and rapid method for the elimination of R plasmids from enteric bacteria / T.J. Tomas, W.K. William // Current Microbiology. 1984. -№11.- P. 155-158.

110. Lower respiratory tract lactoferrin and lysozyme arise primarily in the airways and are elevated in association with chronic bronchitis / A.B. Thompson, T. Bohling, F. Payvandi et al. // J. Lab. Clin. Med. 1990. - №115. -P. 148-158.

111. Tokuda, H. Sorting of lipoproteins to the outer membrane in E. coli / H. Tokuda, S-I. Matsuyama // Biochim. Biophys. Acta.- 2004- №1693.-P. 5-13.

112. MDP and other muropeptides direct and synergistic effects on the immune system / S. Traub, S. von Aulock, T.J. Härtung et al. // Endotoxin Res. -2006.-№2. -P. 69-85.

113. Recycling of the anhydro-N-acetylmuramic acid derived from cell wall murein involves a two-step conversion to N-acetylglucosamine-phosphate / T. Uehara, K. Suefuji, N. Valbuena et al. // J. Bacteriol. 2005. -№11.-P. 3643-3649.

114. Vollmer, W. The pgdA gene encodes for a peptidoglycan N-acetylglucos-amine deacetylase in Streptococcus pneumoniae / W.Vollmer, A. Tomasz // 2000. J. Biol. Chem. - №275^ - P. 20496-20501.

115. Vollmer, W. Peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase, a putative virulence factor in Streptococcus pneumoniae / W.Vollmer, A. Tomasz // Infect. Immun. -2002. -№70. P. 7176-7178.

116. Paneth cell antimicrobial peptides: topographical distribution and quantification in human gastrointestinal tissues / J. Wehkamp, H.B. Chu, R. Shen et al. // FEBS Lett. 2006. - №580. - P. 5344-5350.

117. Weinberger, M. Inhibition of protein synthesis transiently stimulates initiation of minichromosome replication in Escherichia coli / M. Weinberger, C.E. Helmstetter // J. Bacteriol. 1989. - №7. - P. 3591-3596.

118. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis / K.M. Wu, L.H. Li, J.J. Yan et al. // J Bacteriol. 2009. - №14. - P. 4492-501.

119. Structural basis for the recognition of lysozyme by MliC, a periplasmic ly-sozyme inhibitor in Gram-negative bacteria / S. Yum, M.J. Kim, Y. Xu et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. - №2. - P. 244-248.

120. Zipperle, G.F. Glucosamine substitution and muramidase susceptibility in Bacillus anthracis /G.F. Zipperle, J.W. Ezzell, R.J. Doyle // Can. J. Microbiol. 1984. - №30. - P. 553-559.